CN104232644B - 一种特异抑制XOR基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异抑制XOR基因表达的siRNA及其应用，特异抑制XOR基因表达的siRNA为由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列组成的双链RNA；对其进行修饰得到的修饰后RNA；体外试验结果表明，本发明提供的RNA可以特异高效地抑制XOR基因表达，降低脂滴和抑制甘油三酯的沉积。本发明可以应用于非酒精性脂肪性肝病的发病机制研究和非酒精性脂肪肝潜在治疗。本发明具有重要价值。

Description

一种特异抑制 XOR 基因表达的 siRNA 及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异抑制XOR基因表达的siRNA及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)在细胞内特异降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptiona1 gene silencing，PTGS)。RNAi技术已成功应用于多种生物基因功能的研究。针对目的基因构建siRNA，利用RNAi技术关闭该基因的表达，根据表型的改变可以分析基因的功能。基因敲除技术需要较长时间永久性地关闭某个基因的表达，而RNAi技术则可在1周内，甚至2天内可控性地关闭10个基因，因此RNAi可以较灵活、快速得用于造模及后续的机制研究。籍此，RNAi技术已经广泛运用于疾病发病机制的研究。

裸siRNA（未修饰的siRNA）容易降解，其半衰期短，难以摄取，靶向性的缺乏诱发哺乳动物天然免疫反应，严重者可导致细胞和试验动物死亡，故应用范围不广。而化学修饰的siRNA可以使其具有良好的热力学稳定性、细胞穿透力、靶基因沉默活性以及药物代谢学特征，具有不可比拟的优势。

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是指除外酒精和其他明确肝损因素所致的以肝细胞脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。随着生活水平的提高和膳食结构的改变，NAFLD患病率近年来逐年增高，我国已达到15%左右，西方发达国家更是高达20%-30%，成为最常见的慢性肝病之一，构成日益严重的社会健康问题。

NAFLD包括一系列相互联系的病理改变，从单纯性脂肪肝到脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）、肝纤维化和肝硬化。总的来说，单纯性NAFLD是一种良性疾病，而NASH却可以逐渐向肝硬化、肝癌等终末期肝病进展。目前NAFLD发生发展机制尚未完全明确。“二次打击”学说认为，胰岛素抵抗引起的外周脂肪分解增加和高胰岛素血症，是导致肝细胞脂肪变性的首要因素；脂肪变性的肝细胞对内、外源性损害因子的敏感性增加，发生线粒体功能障碍、氧化应激和脂质过氧化损伤等，进一步导致炎症、肝细胞坏死和纤维化。然而“二次打击”学说并不能完全解释NAFLD的发生发展机制，提示还存在其他机制参与NAFLD的发生发展。

肝脏是重要的代谢器官，从代谢功能变化切入或许可为认识NAFLD发生发展提供新的线索。尿酸是机体嘌呤代谢的终末产物，主要在肝脏中产生并经肾脏排泄。通过大样本横断面研究发现，血清尿酸水平升高与NAFLD患病率呈正相关；这一发现已相继在美国、日本、韩国等人群中得到证实[8-10]。我们继而开展了为期3年的前瞻性研究以分析血清尿酸水平变化与NAFLD的因果联系，结果发现，血清尿酸水平升高显著增加NAFLD的发病风险；该结果也在韩国人群中的得到证实。动物实验结果还显示，降尿酸治疗显著改善NAFLD模型沙鼠肝脏脂肪变性程度和血清胆固醇代谢。以上研究从三个不同角度提示尿酸代谢与NAFLD存在密切联系。然而，目前尿酸代谢与NAFLD关系研究中仍有两个重要问题尚未解决，其一是从微观角度来看，尿酸代谢具体通过何种分子机制参与NAFLD的发生发展尚不清楚；其二是从宏观角度来看，改善尿酸代谢是否对NAFLD患者同样具有积极作用尚有待临床研究证实。

深入认识尿酸代谢参与NAFLD发生发展的分子机制可为相关临床研究的开展提供更多依据。从代谢通路分析，血清尿酸水平升高主要与肝脏合成增加和肾脏外排减少有关。黄嘌呤氧化还原酶（xanthine oxidoreductase，XOR）是催化黄嘌呤和次黄嘌呤生成尿酸的限速酶，其表达具有器官特异性，其中肝脏是XOR表达最丰富的器官之一。我们预实验发现，NAFLD模型动物(ob小鼠)肝脏XOR mRNA和蛋白表达水平显著上调，且XOR活性亦明显增加。NAFLD肝脏中XOR表达及活性变化趋势和血清尿酸水平变化一致，提示尿酸代谢与NAFLD联系的深层机制可能与尿酸合成的限速酶XOR有关。

XOR属于含钼脱氢酶黄素蛋白家族，在人体中以黄嘌呤脱氢酶(XDH)和黄嘌呤氧化酶(XO)两种可互相转换的形式存在，两者都是人体2号染色体p22位点同一基因转录表达产物。对XOR功能的认识曾一度停留在参与嘌呤代谢这一层面，但近年来越来越多的研究表明，XOR具有很多其他的生物学功能。首先，XOR催化合成尿酸的同时也产生活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS），XOR通过参与ROS生成而在组织氧化损伤中起重要作用。动物实验表明在缺血/再灌注损伤等氧化性组织损伤过程，XOR活性增强导致的ROS积聚是造成组织损伤的直接原因之一；而运用别嘌呤醇(allopurinol)抑制XOR活性，能显著减轻缺血/再灌注损伤。XOR还影响NADH的活性，调节ROS的生成。其次，XOR对免疫和炎症反应具有调节作用：Gibbings等发现，XOR可调节单核吞噬细胞的炎症反应；Ohtsubo等发现，XOR表达升高增加尿酸的合成，并进一步增加环氧合酶-2(COX-2)的表达，参与炎症反应的调节。新近，XOR在脂质代谢中的调节作用开始受到关注：Cheung等观察到脂肪细胞XOR表达和活性显著升高，且XOR表达水平与脂肪组织大小呈正相关，而通过小干扰RNA(siRNA)降低XOR的表达能有效抑制脂肪细胞分化；进一步研究发现，XOR对脂肪细胞脂质代谢的调节作用与其对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的调节有关。

在NAFLD中XOR是否发挥调节作用，目前尚未见文献报道。我们推测，XOR可能通过以下三方面参与NAFLD的发生发展，具体包括：（1）调节ROS合成参与氧化损伤：XOR的表达和活性上调，导致ROS生成增加，加重肝脏氧化损伤；（2）调节COX-2表达参与炎症反应：XOR通过调节尿酸的合成间接对COX-2的表达具有调节作用，而COX-2可进一步介导炎症反应参与NAFLD的发生发展。（3）调节PPARγ表达参与肝脏脂质代谢：PPARγ是脂质代谢的关键转录因子；XOR表达上调使得PPARγ表达增加，并由此导致肝脏脂质蓄积，可能是XOR参与NAFLD发生发展的主要机制之一。采用RNAi技术进行XOR在NAFLD发病中机制的研究是对NAFLD发病机制的重要补充

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种特异抑制XOR基因表达的siRNA及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种特异抑制XOR基因表达的siRNA，由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列组成的双链RNA。

一种对siRNA进行修饰得到的修饰后RNA，所述修饰具体为：用甲氧基修饰所述siRNA中的嘧啶核苷酸的核糖的2'羟基。

一种siRNA或修饰后RNA在抑制XOR基因表达中的应用。

所述XOR基因序列如SEQ ID NO.3所示。

一种siRNA或修饰后RNA在非酒精性脂肪肝潜在治疗的应用。

一种siRNA或修饰后RNA在非酒精性脂肪性肝病发病机制研究中的应用。

一种研究降低被诱导成NAFLD体外模型的人肝L02细胞的脂变，其特征在于，是将权利要求1或2所述的RNA导入目的细胞，得到脂滴下降。

本发明的有益效果是，本发明提供能够特异高效抑制XOR基因表达的siRNA及对其进行修饰得到的修饰后RNA。体外试验结果表明，本发明提供的RNA可以特异高效地抑制XOR基因表达，降低脂滴和抑制甘油三酯的沉积。本发明可以应用于非酒精性脂肪性肝病发病机制的研究，具有重大价值。

附图说明

图1为Western blotting检测转染siRNA后HepG2细胞中XOR的表达水平的扫描图。

图2为Western blotting检测转染siRNA后HepG2细胞中XOR的表达水平半定量。

图3为转染siRNA后各组HepG2细胞脂变情况的油红O染色图。

图4为转染siRNA后各组HepG2细胞脂变情况的甘油三酯定量图。

具体实施方式

本发明特异抑制XOR基因表达的siRNA，它是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列组成的双链RNA。将所述siRNA进行修饰后得到的修饰后RNA。对合成的siRNA进行化学修饰，能增加siRNA的稳定性，同时有效抑制目的基因的表达。siRNA的化学修饰主要有三类：磷酸骨架修饰、核糖修饰和碱基修饰。其中，核糖修饰是siRNA化学修饰最重要的方式。为提高siRNA在体内抵抗核酸酶水解的能力，本发明中对XOR siRNA的核苷酸序列进行2'- O-甲基（2'- O Me）修饰。2'- O-甲基这种修饰方式能增强其在血清中的稳定性，降低免疫刺激反应强度。具体如下：用甲氧基修饰所述siRNA中的嘧啶核苷酸的核糖的2'羟基，得到的修饰后RNA。

所述siRNA或所述修饰后RNA在抑制XOR基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。所述XOR基因序列如SEQ ID NO.3所示。

所述siRNA或所述修饰后RNA可应用于改善脂肪肝。

所述siRNA或所述修饰后RNA可应用于非酒精性脂肪性肝病发病机制研究。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

统计学方法：采用SPSS11.5统计分析软件分析，各样本均数的比较采用Student t test分析。

人正常肝脏细胞株HepG2，购于美国模式培养物研究所（ATCC）。

高脂饲料和正常对照饲料购自浙江省实验动物中心。兔抗人XOR一抗、兔抗人GAPDH一抗购自ProtienTech公司。抗兔IgG二抗、苏木素购自北京中杉金桥公司。油红O购自广州奥凯公司。甘油三酯测定试剂盒、RIPA裂解液购自普利莱公司。BCA法蛋白测定试剂盒购自Thermo。Lipofectamine™ 2000购自Invitrogen。油酸钠和软脂酸钠购自sigma公司。PBS购自HyClone公司。化学发光剂Supersignal West Pico购自Thermo。

实施例 1 、 siRNA 设计合成

通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中获取人XOR mRNA的序列全长（NM_000379.3），跟据RNAi原理，结合设计软件，在实验的基础上，设计合成并针对4个转录本筛选出有效的针对人XOR基因的一段21nt的siRNA。进行BLAST比对检查以保证和其他基因没有同源性。

XOR siRNA序列为：

5’-CGGAAGAGUGAGGUUGACAAGUUCA-3’（正义链）

5’-UGAACUUGUCAACCUCACUCUUCCG-3’（反义链）

由上海英潍捷基贸易有限公司（厂址：上海市东三环北路2号南银大厦1711，邮编：200051）进行化学合成：以NTP为原料，利用ABI3900核酸合成仪分别化学合成单链RNA，最后在退火缓冲液的条件下各单链RNA退火形成双链RNA。为提高siRNA在体内的稳定性，在各链化学合成之前，利用化学反应将各链合成原料中的嘧啶核苷酸的核糖进行2'羟基的甲氧基替代修饰。

实施例 2 、 XOR siRNA 在体外对 L02 细胞 XOR 基因表达的影响

一、分组转染

将L02细胞均匀铺在6孔板中，分为4组：

高脂实验组：含有10%（体积百分含量）灭活的新生牛血清、666μmol/L的油酸钠和333μmol/L的软脂酸钠的DMEM/F12培养基；转染200pmol实施例1的XOR siRNA。

高脂对照组：含有10%（体积百分含量）灭活的新生牛血清、666μmol/L的油酸钠和333μmol/L的软脂酸钠的DMEM/F12培养基；转染200pmol实施例1的阴性对照 siRNA。

正常实验组：含有10%（体积百分含量）灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基；转染200pmol实施例1的XOR siRNA。

正常对照组：含有10%（体积百分含量）灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基；转染200pmol实施例1的阴性对照 siRNA。

四组细胞先常规培养48h，然后根据组别进行转染（按Lipofectamine™ 2000试剂说明书操作），转染后继续培养36h后换液一次，72小时后根据组别换相应的培养基，继续培养24h后进行实验；培养条件：置于37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。

二、Western blotting 检测XOR蛋白的表达

吸弃6孔板中的培养基，用冷的PBS洗涤2次，每孔加120μl预冷的PBS和40μl 4×Loading Buffer [1.0M Tris-HCL (PH 6.8) 2.4ml， 十二烷基磺酸钠（SDS）0.8g，二巯基苏糖醇（DTT）0.6g，甘油4ml]，充分裂解后收集裂解液，于95℃加热变性5分钟，4℃、12000g离心5min后收集上清液，每个样品取8μl上样，行12%的SDS-PAGE电泳，蛋白充分分离后，转移到NC膜上，于含5%脱脂奶粉TBST的封闭液中，室温封闭1h，取出膜用TBST溶液洗涤5min×5次，将膜在合适的分子量处剪开，分别用XOR一抗（1：200稀释）和内参GAPDH一抗（1：1000稀释）室温孵育2h，然后TBST洗膜5min×5次，与抗兔IgG二抗（1：5000稀释）室温孵育1h，将膜与化学发光试剂孵育5min进行显色反应，在暗室中压X胶片曝光，洗胶片。对条带进行光密度扫描。检测各组ECHS1蛋白和内参GAPDH蛋白所对应条带A值，然后将AECHS1/AGAPDH的比值进行统计学分析（Quantity One软件）。

结果如图1、图2。与阴性对照组比较，XOR siRNA转染后细胞中XOR基因表达显著下调（P<0.01）。

实施例 3 、 XOR siRNA 在体外对 L02 细胞脂变的影响

一、分组转染

将L02细胞均匀铺在6孔板中，分为4组。具体分组同实施例2的步骤一。

二、XOR siRNA在体外对L02细胞脂变的影响

分别将步骤一后的细胞进行如下1或2的实验。

1、油红染色

在6孔板中加入4%多聚甲醛在4℃固定30min，蒸馏水洗两次后加入油红O稀释液（油红O 0.5g溶于异丙醇100ml配成的饱和液与蒸馏水按3：2稀释，静置5-10min后过滤使用），避光染色10-15min，水洗一次后用60%乙醇镜下分化至间质清晰，水洗两次后Mayer氏苏木素复染核8s，水洗两次后在自来水中反蓝30min。对染色后的细胞显微照相。

油红O能够特异性地将脂滴染成鲜红色，直观得反应细胞中脂滴形成情况。结果如图3所示，油红O染色显示高脂实验组的脂滴明显低于高脂对照组，有显著性差异（P＜0.05）。这表明： XOR siRNA能改善L02细胞的脂变。

2、甘油三酯测定

按照甘油三酯测定试剂盒说明书进行操作。具体如下：将6孔板细胞用冷PBS洗涤2次，每孔加入试剂盒裂解液200μl，振荡裂解细胞30min，取50μl裂解液采用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定，其余50μl裂解液转移到600μl离心管，70℃加热30min，室温2000g离心5min，上层清液用于酶学测定。96孔酶标版中将标准品和待测样品与工作液按说明书中列表所示体积混匀，37℃反应10min后用酶标仪在490nm波长下检测，用Excel作图分析数据，结合蛋白浓度以每mg蛋白浓度校正甘油三酯含量。

甘油三酯是脂变细胞中脂滴的主要成分，测定甘油三酯能够将细胞的脂变情况进一步量化。结果如图4所示，高脂实验组的甘油三酯低于高脂对照组，有显著性差异（P<0.05）。这表明：XOR siRNA能降低L02细胞甘油三酯的沉积，与油红O染色结果相符。

以上两个结果共同说明在体外L02细胞中，XOR siRNA可降低脂滴和抑制甘油三酯的沉积。由此可见，XOR在体外促进L02细胞脂肪变中的关键地位。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种特异抑制XOR基因表达的siRNA及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 1

cggaagagug agguugacaa guuca 25

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 2

ugaacuuguc aaccucacuc uuccg 25

<210> 3

<211> 5717

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtcacagagc agtgataact acctgccagt gtctcttagg agtgaggtac ctggagttcg 60

gggaccccaa cctgtgacaa tgacagcaga caaattggtt ttctttgtga atggcagaaa 120

ggtggtggag aaaaatgcag atccagagac aacccttttg gcctacctga gaagaaagtt 180

ggggctgagt ggaaccaagc tcggctgtgg agaggggggc tgcggggctt gcacagtgat 240

gctctccaag tatgatcgtc tgcagaacaa gatcgtccac ttttctgcca atgcctgcct 300

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caagacgagg ctgcatcctg tgcaggagag aattgccaaa agccacggct cccagtgcgg 420

gttctgcacc cctggcatcg tcatgagtat gtacacactg ctccggaatc agcccgagcc 480

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gaataatcca aattgctgca tgaaccagaa gaaagaccac tcagtcagcc tctcgccatc 660

tttattcaaa ccagaggagt tcacgcccct ggatccaacc caggagccca tttttccccc 720

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gcatctgcct cccgatgccc ctggtggcat ggtggacttc cggtgcaccc tcaccctcag 1620

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ccacgccaag atcaagtcca tagatacatc agaagctaag aaggttccag ggtttgtttg 1980

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gagctttgtt gcaaaaatgt tgggggttcc agcaaaccgg attgtggttc gagtgaagag 2460

aatgggagga ggctttggag gcaaggagac ccggagcact gtggtgtcca cggcagtggc 2520

cctggctgca tataagaccg gccgccctgt gcgatgcatg ctggaccgtg atgaggacat 2580

gctgataact ggtggcagac atcccttcct ggccagatac aaggttggct tcatgaagac 2640

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catccggggc actgggcggc tgtgcaaaac caaccttccc tccaacacgg ccttccgggg 2820

ctttgggggg ccccagggga tgctcattgc cgagtgctgg atgagtgaag ttgcagtgac 2880

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aagctctcag tatcatgctc ggaagagtga ggttgacaag ttcaacaagg agaattgttg 3060

gaaaaagaga ggattgtgca taattcccac caagtttgga ataagcttta cagttccttt 3120

tctgaatcag gcaggagccc tacttcatgt gtacacagat ggctctgtgc tgctgaccca 3180

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tctgaaaatc cccacctcta agatttatat cagcgagaca agcactaaca ctgtgcccaa 3300

cacctctccc acggctgcct ctgtcagcgc tgacctcaat ggacaggccg tctatgcggc 3360

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cagctatggg gtggcttgct ctgaagtaga aatcgactgc ctaacaggag atcataagaa 3600

cctccgcaca gatattgtca tggatgttgg ctccagtcta aaccctgcca ttgatattgg 3660

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ttcccccgag gggagcctgc acacccgtgg ccctagcacc tacaagatcc cggcatttgg 3780

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catcaaagat gccatccgtg cagctcgagc tcagcacaca ggtaataacg tgaaggaact 3960

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caattcccct tcctgtgatc cattttactg caaacataag ggttgcagta aagggttgtc 5340

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tcccttttat tgctccaaat ggtgatttaa tccctacatg gtgctgggtg gacaatgtgt 5580

cactgtcaca tgccttcact gtataaatcc aaccttctgc cagagagaat ctgtggttct 5640

ggccatggag ggaggatagt ggaaatgata tagttggact ggtgcttgat gtcactaata 5700

aatgaaactg tcagctg 5717

Claims (4)

1.一种特异抑制XOR基因表达的siRNA，其特征在于，它是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列组成的双链RNA。

2.一种对权利要求1所述siRNA进行修饰得到的修饰后RNA，其特征在于，所述修饰具体为：用甲氧基修饰所述siRNA中的嘧啶核苷酸的核糖的2′羟基。

3.一种权利要求1所述特异抑制XOR基因表达的siRNA或权利要求2所述修饰后RNA在制备抑制XOR基因表达的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述XOR基因序列如SEQ ID NO.3所示。