CN102389440B - 环烯醚萜类化合物在制备抗骨质疏松药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及一种环烯醚萜类化合物在制备抗骨质疏松药物中的应用。本发明的通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物在制备治疗和/或预防骨质疏松症药物中的应用。实验发现，以UMR106细胞中ALP活性为指导对具有通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物的提取物进行跟踪分离，并对提取物和分离所得各成分在成骨细胞增殖、抗氧化活性方面进行了研究，表明具有通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物具有显著促进碱性磷酸酶活性的作用，促成骨细胞分化的作用，因此该类化合物具有抗骨质疏松作用，可以用于制备治疗或预防骨质疏松症的药物。其中特女贞苷和化合物G13成分具有显著促进碱性磷酸酶活性的作用，促成骨细胞分化的作用，特女贞苷还具有明显促进UMR-106细胞增殖作用，其用于抗骨质疏松作用时其效果更佳。

Description

环烯醚萜类化合物在制备抗骨质疏松药物中的应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及环烯醚萜类化合物在制备抗骨质疏松药物中的应用。

背景技术

骨质疏松症是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高为特征的一种全身骨代谢障碍的疾病。骨质疏松已成为影响我国人民身体健康和社会医疗保障的重要问题，成为造成老年人死亡的第二大病因，仅次于心脑血管疾病。按调查估算全国2006年在50岁以上人群中，约有6944万人（男1534万，女5410万）患有骨质疏松症，约有21390万人存在低骨量（男10043万，女11347万）。

骨重建周期中，由破骨细胞引起的“骨吸收”与成骨细胞引起的“骨形成”间的动态平衡是维持骨结构完整性及合适骨强度的关键环节。骨质疏松症的发生与成骨细胞和破骨细胞的功能偶联失衡有关，目前临床的药物大多数是针对抑制破骨细胞活性，如双膦酸盐类和降钙素等，而针对促进成骨细胞活性，促进骨重建的药物较少，多为stain类药物。因此，发现新的促进成骨细胞活性的药物对治疗骨质疏松具有重要的意义。进一步研究发现，衰老自由基学说认为活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是引起衰老的重要原因，ROS刺激破骨细胞的活化和分化，抑制成骨细胞的分化，并直接参与骨基质的降解，在原发性骨质疏松症的发病机制中发挥了重要作用。

关于环烯醚萜类化合物在“《环烯醚萜类化合物的研究进展》(万进、方建国)”中有记载，环烯醚萜类化合物的主要生物活性包括：抗肿瘤作用、对糖尿病及其并发症的影响、增强免疫作用、保肝作用、抗炎作用、抗氧化作用、对神经细胞的作用等。现有文献中并没有关于环烯醚萜类化合物具有抗骨质疏松作用的记载。

女贞子为木犀科植物女贞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果实，是中医常用的扶正固本药物，具有滋补肝肾、明目乌发的功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等。研究表明女贞子可以促进成骨细胞分化和抗雌激素缺乏导致的骨质疏松，调节体内钙离子的平衡，具有抗骨质疏松的作用。女贞子中的化学成分主要含有三萜类、醚萜类、苯乙醇类、苯丙素类、黄酮类等，其中水溶性活性成分环烯醚萜类化合物具有保肝利胆、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等广泛的药理作用。

目前关于女贞子抗骨质疏松活性的研究多集中于女贞子粗提物，如CN200710073273.9公开的女贞子的医药新用途及其药物制剂中，记载了女贞子在制备预防或治疗骨质疏松症药物中的应用，但是并没有深入研究女贞子中具体的活性成分，也不知道是女贞子中的哪一种活性物质能够起到预防或治疗骨质疏松的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种环烯醚萜类有效成分在抗骨质疏松方面的作用，进一步提供一种具有通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物在制备治疗和/或预防骨质疏松症药物中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物在制备治疗和/或预防骨质疏松症药物中的应用

Ⅰ。

具体地，所述R₁为-H或

。

所述R₂为

。

所述R₃为-OH。

进一步地，所述通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物分离自女贞子中的环烯醚萜类化合物。所述通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物为特女贞苷或女贞苷G13。

所述女贞子中用于制备治疗和/或预防骨质疏松症药物的化合物的测定方法包括下述步骤：

（1）将干燥的女贞子药材经粉碎后用水加热提取，减压浓缩除去水后得到浸膏，即女贞子水提物，将女贞子水提物悬浮于40~55 ℃热水中，然后依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别浓缩萃取液得浸膏：氯仿部分（A），乙酸乙酯部分（B），正丁醇部分（C），水层（D）；以ALP活性作为评价其是否具有促成骨细胞分化能力的指标，用DMSO作为空白对照，雌二醇E2作为阳性对照，测定女贞子水提物及萃取后A、B、C、D各部分对UMR-106细胞分化的影响，选择促成骨细胞分化的能力最强的D部分进行下一步分析；

（2）女贞子水提物萃取后水层（D）上大孔树脂柱，经水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，分成对应的5个部分D1-D5，以ALP活性作为评价其是否具有促成骨细胞分化能力的指标，用DMSO作为空白对照，E2作为阳性对照，测定D1-D5部分对UMR-106细胞ALP活性的影响，选择促成骨细胞分化的能力最强的D2部分进行下一步分析；

（3）活性最强的20%乙醇洗脱部分（D2）用少量水溶解分散后加入甲醇至含甲醇浓度为95%，静置过夜；滤液蒸干得浸膏D21，D21上硅胶层析柱，分别用10:1，5:1，3:1，1:1， 1:4，0:1的氯仿-甲醇各1000mL进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成标识为Fr.1-6的6段，Fr.1部分上硅胶层析柱，分别用10:1，5:1，3:1，1:1，0:1的氯仿-丙酮各100mL进行梯度洗脱，根据薄层情况合并将其分成标识为Fr.1.1-1.3的3段，Fr.1.1经纯化得化合物2，Fr.1.2经纯化得化合物1，Fr.1.3经纯化得化合物3；Fr.2经纯化得化合物5和6，Fr.3上硅胶层析柱分别用20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，0:1氯仿-甲醇各500mL进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成标识为Fr.3.1-3.3的3段，Fr.3.3经纯化得化合物4；Fr.4用C₁₈柱层析，10:90的甲醇-水洗脱得化合物7；Fr.5上硅胶层析柱，分别用5:1，3:1，1:1，0:1氯仿-甲醇各1000mL进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成标识为Fr.5.1-5.3的3段，Fr.5.2经纯化得化合物8；

（4）鉴定步骤（3）中1-8化合物的波谱数据，通过波谱数据确定1-8化合物的化学结构，并通过ALP活性检测对比试验确定女贞子中用于制备治疗和/或预防骨质疏松症药物的化合物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、采用跟踪UMR-106成骨细胞碱性磷酸酶活性的方法对通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物进行研究，结果表明通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物具有显著促进碱性磷酸酶活性的作用，促成骨细胞分化的作用，同时还具有明显促进UMR-106细胞增殖作用。

2、特女贞苷和女贞苷G13均属于通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物结构，实验表明，特女贞苷和女贞苷G13均具有显著促进碱性磷酸酶活性的作用，促成骨细胞分化的作用。特女贞苷还具有明显促进UMR-106细胞增殖作用。

3、通过检测DPPH自由基的清除能力的方法，结果表明通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物具有一定的抗氧化能力。

附图说明

图1：女贞子水提物对UMR-106细胞ALP活性的影响；

      其中：纵坐标—相对的ALP活性百分比值（%）

            横坐标—对照、E2(0.1 μM)、女贞子水提物浓度（μg/mL）

图2：D1-D5部分对UMR-106细胞ALP活性的影响；

      其中：纵坐标—相对的ALP活性百分比值（%）

            横坐标—对照、E2(0.1 μM)、D1-D5部分浓度（μg/mL）

图3：化合物1-8对UMR-106细胞ALP活性的影响；

      其中：纵坐标—相对的ALP活性百分比值（%）

            横坐标—对照、E2(0.1 μM)、化合物1-8浓度（μg/mL）

图4：女贞子各提取物及化合物1-8对UMR-106细胞增殖的影响

      其中：纵坐标—与DMSO的比值

            横坐标—对照、E2(0.1 μM)、女贞子提取物及D2和各化合物浓度（μg/mL）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1抗骨质疏松活性成分的跟踪分离

UMR-106细胞属大鼠骨肉瘤细胞系，具有成骨细胞的多种特性。许多研究已经证明，UMR-106细胞是一种很好的细胞模型，可以用来研究各种调控骨质疏松的激素和生长因子在细胞水平上的作用机理。对UMR-106细胞碱性磷酸酶（ALP）活性以及细胞增殖有促进作用的化合物，则表明其具有促进成骨细胞功能的作用。雌二醇被发现能够促进UMR-106细胞ALP的活性，因此在这里用作阳性对照。

1.1  UMR-106细胞的体外培养

成骨细胞UMR-106在4.5 × 9 cm的细胞培养瓶中以无菌RPMI-1640培养液加10%新生小牛血清（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）培养于37 ℃，恒定5% CO₂的细胞培养箱中。每48 h将细胞培养瓶从细胞培养箱中取出，置于倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，然后在无菌操作台中用无菌生理盐水冲洗细胞后，加入新鲜细胞培养液继续培养。

1.2  促UMR-106细胞分化作用

1.2.1 原理

碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。根据前期实验对细胞培养上清液和细胞裂解液的比较，用细胞裂解液对碱性磷酸酶的活性进行检测比用上清液更灵敏，所以采用细胞裂解液对碱性磷酸酶的活性进行检测。

1.2.2  UMR-106细胞的接种及加样

细胞以2×10⁴个/孔接种于24孔板，待细胞完全贴壁后换为无酚红、2％活性炭处理血清的培养基并设对照组、女贞子各浓度组及各化合物加入待测样品，每组设4个复孔，置37℃培养箱中继续培养。

1.2.3  UMR-106细胞碱性磷酸酶活性的检测

(1) 细胞培养48 h后弃去上清液，PBS清洗、加入200 mL裂解液（50 mM Tris-HCl/ 1% Triton-100）、置震荡器上摇晃15 min，再用移液枪吹打各孔细胞使其裂解更彻底，吸入EP管中漩涡仪震荡混合均匀后离心取上清液即得样品。

(2) 根据待测样品数量摆放并标记好1.5 mL EP管，另加1个空白对照管和1个标准管；空白对照管中加入10 mL无菌蒸馏水 (SDW)、标准管中加入10 mL酚标准液 (0.1 mg/mL)、测定管中加入2 mL细胞裂解液并用SDW补足10 mL。

(3) 向各管中加入试剂1 (缓冲液) 100 mL和试剂2 (基质液) 100 mL，混匀后置37℃孵育15 min。 

(4) 向各管中加入显色剂300 mL摇匀，然后各吸取200 mL转入96孔板，用酶标仪 (全波长扫描式多功能读数仪) 检测各孔在波长520 nm处的吸光度，并减去空白对照。 

1.2.4  数据处理

(1) 单位定义：每克组织蛋白在37℃与基质作用15分钟产生1 mg酚为1单位。

(2) 碱性磷酸酶活性单位计算公式

1.2.5  蛋白质定量

为排除碱性磷酸酶活性升高可能是由于细胞增殖所产生的因素，将每组细胞各自进行蛋白质定量。

(1) BCA工作液配制。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

(2) 蛋白标准工作液配置：根据样品数量配置相应体积的蛋白标准工作液。将蛋白质标准储备液用双蒸水5倍稀释，配成1 mg/mL的工作液。

(3) 标准曲线绘制。取一块酶标板，按以下表格数据加入试剂：

 (4) 振荡混匀后，37℃放置30分钟。

(5) 用酶标仪测定A562，以不含BCA的光吸收值为空白对照。

(6) 以蛋白含量 (g) 为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。

(7) 样品测定：取待测蛋白样品（细胞裂解液）4 mL用去离子水补足20 mL，加入200 mL BCA工作液，混匀后37℃放置30分钟，然后以0号孔为对照，测定样品吸收值A562。

(8) 根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。

(9) 计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积4 mL即可得到待测样品的实际浓度 (mg/ mL)，此蛋白浓度乘以2除以10⁶即为碱性磷酸酶活性单位计算公式中取样量的蛋白克数。

1.3  具有通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物提取物的跟踪分离

1.3.1  粗提物及萃取分段后各部分促UMR-106细胞ALP活性

1.3.1.1  活性检测

干燥的女贞子药材经粉碎后用水加热提取（60 L/3 h × 3），减压浓缩除去水后得到浸膏（AFLL）。将女贞子水提物悬浮于热水（约50 ℃）中，然后依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别浓缩萃取液得浸膏：氯仿部分（A），乙酸乙酯部分（B），正丁醇部分（C），水层（D）。以ALP活性作为评价其是否具有促成骨细胞分化能力的指标，用DMSO作为空白对照，雌二醇E2（17β-estradiol，0.1 μM）作为阳性对照，测定女贞子水提物（AFLL）及萃取后各部分对UMR-106细胞分化的影响。

1.3.1.2  结果

分别测定了女贞子水提物50 μg/mL、100 μg/mL和150 μg/mL三个浓度及萃取后各部分1 μg/mL、10 μg/mL和50 μg/mL三个浓度对UMR-106细胞ALP活性的影响（见图1、表1所示），结果表明女贞子水提物与空白对照相比能明显促进UMR-106细胞碱性磷酸酶的活性并呈现出一定的剂量依赖关系，具有促成骨细胞分化的能力，表明女贞子水提物中含有抗骨质疏松活性的成分。以UMR-106细胞ALP活性实验为指导选择女贞子水提物进一步跟踪分离，结果表明女贞子水提物正丁醇萃取部分和水溶性部分与空白对照相比均有明显的活性，但水溶性部分促成骨细胞分化的能力更强，D部分（50 μg/mL）与空白对照组比较最大增幅为27%，因此选择女贞子水提物萃取后水溶性部分进一步跟踪分离。

表1  女贞子水提物及萃取后各部分对UMR-106细胞ALP活性的影响

空白对照ALP活性为6.4 ±0.8 U/mg protein，结果用空白对照的百分比表示， ^* p＜0.05, ^** p＜0.01 vs. control (n=3)。

1.3.2  D部分用D101大孔树脂分段后的各部分促UMR-106细胞ALP活性

1.3.2.1  活性检测

女贞子水提物萃取后水溶性部分（D）上D101大孔树脂柱，经水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，分成对应的5个部分D1-D5。以ALP活性作为评价其是否具有促成骨细胞分化能力的指标，用DMSO作为空白对照，E2（17β-estradiol，0.1 μM）作为阳性对照，测定D1-D5部分对UMR-106细胞ALP活性的影响。

1.3.2.2  结果

分别测定了各部位（D1-D5）1 μg/mL、10 μg/mL和50 μg/mL三个浓度对UMR-106细胞增殖的影响（见图2、表2所示），结果表明D2部分与空白对照相比具有显著性促成骨细胞分化的能力，因此进一步选择D2部分跟踪分离。

表2  D1-D5部分对UMR-106细胞ALP活性的影响

空白对照ALP活性为4.6±0.6 U/mg protein，结果用空白对照的百分比表示，^* p＜0.05, ^** p＜0.01 vs. control (n=3)。

1.3.3  D2化学成分分离及其活性检测

1.3.3.1  D2中化合物的分离

活性最强的20%乙醇部分（D2）用少量水溶解分散后加入甲醇至含甲醇浓度为95%，静置过夜，滤液蒸干得浸膏D21。D21上硅胶层析柱（600 g，160-200 mesh，Φ8 × L 40 cm），用氯仿-甲醇（10:1，5:1，3:1，1:1， 1:4，0:1，各1000 mL）进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成6段（Fr.1-6）。Fr.1部分上硅胶层析柱（50 g，200-300 mesh，Φ1.5 × L 60 cm），用氯仿-丙酮（10:1，5:1，3:1，1:1， 0:1，各100 mL）梯度洗脱，根据薄层情况合并将其分成3段（Fr.1.1-1.3）。Fr.1.1经HPLC（甲醇-水，50:50）纯化得化合物2，Fr.1.2经HPLC（甲醇-水，40:60）纯化得化合物1，Fr.1.3经HPLC（甲醇-水，30:70）纯化得化合物3。Fr.2经HPLC（甲醇-水，35:75）纯化得化合物5和6。Fr.3上硅胶层析柱（150 g，200-300 mesh，Φ8 × L 15 cm，），用氯仿-甲醇（20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，0:1，各500 mL）进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成3段（Fr.3.1-3.3）。Fr.3.3经HPLC（甲醇-水，10:90）纯化得化合物4。Fr.4（18.3 g）用C₁₈柱层析，甲醇-水（10:90）洗脱得化合物7。Fr.5（10.9 g）上硅胶层析柱（350 g，200-300 mesh，Φ8 × L 15 cm），用氯仿-甲醇（5:1，3:1，1:1，0:1，each 1000 mL）进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成3段（Fr.5.1-5.3）。Fr.5.2取少量经HPLC（甲醇-水，50:50）纯化得化合物8。本段中的各1000 mL是指梯度洗脱时各个不同的比例构成的洗脱液分别用1000ml进行洗脱，各100 mL、各500 mL表达的意思与各1000 mL相同。

1.3.3.2  D2中具有通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物的理化及波谱数据

      

特女贞苷(nuezhenide)：白色粉末。ESI-MS m/z：709[M+Na]⁺；分子式：C₃₄H₄₂O₁₇；¹H-NMR (600 MHz，CD₃OD)：δ 7.58（1H，s，H-3），7.12（2H，dd，J = 8.5，1.9Hz，H-4′′′和H-8′′′ ），6.76（2H，dd，J = 8.5，1.9 Hz，H-5′′′和H-7′′′ ），6.15（1H，q，J = 6.8 Hz，H-8），5.98（1H，br.s，H-1），4.87（1H，d，J = 7.4 Hz，H-1′），4.37（1H，d，J =7.4 Hz，H-1′′），4.28（1H，dd，J = 11.9，5.8 Hz，H-1′′′），4.27（1H，m，H-5），3.94（1H，dd，J = 12.2，5.8 Hz，H-1′′′），4.42-3.39(10H，m，sugars)，3.75（3H，s，-OCH3），3.61(1H，m，H-5)， 2.91（2H，m，H-2′′′），2.82（1H，dd，J = 14.3，4.9 Hz，H-6），2.55（1H，dd，J = 14.3，4.9 Hz，H-6），1.66（3H，d，J = 7.2 Hz，H-10）；¹³C-NMR (150 MHz，CD₃OD)：δ 173.2（C-7），168.9（C-11），156.9（C-6′′′），153.6（C-3），131.1(C-4′′′，C-8′′′)，130.7(C-8)，125.1（C-9），116.3(C-5′′′，C-7′′′)，109.6（C-4），104.5（C-1′′），101.0（C-1′），95.3（C-1），78.5（C-5′），78.1（C-3′），78.0（C-3′′），75.3（C-5′′），75.1（C-2′），74.9（C-2′′），71.7（C-4′），72.3（C-4′′），71.6（C-1′′′），65.2（C-6′′）， 62.8（C-6′），52.1（OMe），41.5（C-6），36.5（C-2′′′），31.9（C-5），13.9（C-10）。D2中化合物7其NMR数据与nuezhenide的数据一致。

G13：白色粉末。ESI-MS m/z：1095[M+Na]⁺；分子式：C₄₈H₆₄O₂₇；¹H-NMR (600 MHz，CD₃OD)：δ 7.58（1H，s，H-3），7.52（1H，s，H-3′′′′），7.29（2H，dd，J = 8.5，1.9 Hz，H-4′′和H-8′′），6.99（2H，dd，J = 8.5，1.9 Hz，H-5′′和H-7′′），6.18（1H，q，J = 6.8 Hz，H-8），6.09（1H，q，J = 6.8 Hz，H-8′′′′），6.03（1H，br.s，H-1），5.92（1H，br.s，H-1′′′′），4.28（1H，dd，J = 11.9，5.8 Hz，H-1′′），3.94（1H，dd，J = 12.2，5.8 Hz，H-1′′），4.42-3.39 (15H，m，sugars)，3.74（3H，s，-OCH ₃），3.69（3H，s，-OCH₃），2.95（2H，m，H-2′′），3.19（1H，dd，J = 14.3，4.9 Hz，H-6），2.97（1H，dd，J = 14.3，4.9 Hz，H-6），2.73（1H，dd，J = 14.3，4.9 Hz，H-6′′′′），2.50（1H，dd，J = 14.3，4.9 Hz，H-6′′′′），1.76（3H，d，J = 7.2 Hz，H-10），1.72（3H，d，J = 7.2 Hz，H-10′′′′）；¹³C-NMR (150 MHz，CD₃OD)：δ 173.2（C-7′′′′），171.8（C-7），168.9（C-11′′′′），168.8（C-11），155.5（C-3′′′′），155.4(C-3)，150.7（C-6′′），138.1（C-3′′），131.2(C-4′′，C-8′′)，130.8(C-8′′′′)，130.7(C-8)，125.3（C-9′′′′），125.1（C-9），122.6(C-5′′′，C-7′′′)，109.6（C-4′′′′），109.5（C-4），104.6（C-1′′′），101.2（C-1′′′′′），101.0（C-1′），95.5（C-1′′′′），95.3（C-1），78.5（C-5′），78.5（C-5′′′′′），78.1（C-3′），78.1（C-3′′′′′），78.0（C-3′′′），75.3（C-5′′′），75.1（C-2′′′），74.9（C-2′），74.9（C-2′′′′′），71.7（C-4′），71.7（C-4′′′′′），72.3（C-4′′′），71.6（C-1′′），65.2（C-6′′′），62.8（C-6′），62.8（C-6′′′′′），52.2（OMe），52.2（OMe），41.4（C-6′′′′）， 41.2（C-6），36.7（C-2′′），31.9（C-5′′′′），31.9（C-5），13.9（C-10′′′′），13.8（C-10）。D2中化合物8其NMR数据与G13的数据一致。

采用同样的方法，测得化合物1-8的化学式分别如下：

1.3.3.3  化合物1-8促UMR-106细胞ALP活性

1.3.3.3.1  活性检测

以UMR-106细胞ALP活性作为评价其是否具有促成骨细胞分化能力的指标，检测化合物1-8的活性，用DMSO作为空白对照，E2（17β-estradiol，0.1 μM）作为阳性对照。

1.3.3.3.2  结果

分别测定了各化合物1 μg/mL、10 μg/mL和50 μg/mL三个浓度对UMR-106细胞分化的影响（见图3、表3所示），与空白对照相比化合物3、4、7、8表现出较强的促进ALP的活性，化合物8在浓度为50 μg/mL时促进ALP的活性可以达到139.5%，表现出比阳性对照E2还强的活性。化合物1、2、5、6表现出相对较弱的促进ALP的活性。

表3  化合物1-8对UMR-106细胞ALP活性的影响

空白对照ALP活性为5.3±0.7 U/mg protein，结果用空白对照的百分比表示， ^* p＜0.05, ^** p＜0.01 vs. control (n=3)。

本实施例的通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物是从女贞子中提取分离得到，详细介绍了一种女贞子中抗骨质疏松化合物的提纯方法和鉴别方法，通过该方法确定出女贞子中起到抗骨质疏松的物质为式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物。

实施例2 促UMR-106细胞增殖的作用

    运用Am-blue细胞增殖与活性检测试剂对UMR-106成骨细胞的增殖进行检测，与空白对照(只添加等量溶剂DMSO)做对照，检测各部分浸膏及化合物对UMR-106细胞增殖的作用。

2.1  Am-blue细胞增殖检测法的原理

Alamar Blue细胞增殖检测法是最新开发出来的一种细胞增殖检测方法，其原理是在细胞增殖过程中，细胞体内的环境由氧化环境变成还原环境，呼吸链中的NADPH/NADP，FADH/FAD，FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高。Alamar Blue被细胞内吞后，在细胞质中被以上这些代谢中间体还原，最后释放到胞外。被还原Alamar Blue的积累使培养基从无荧光的靛青蓝转变成有荧光的粉红色，通过普通分光光度仪或荧光光度仪来检测培养基中OD值或荧光强度的变化从而分析细胞增殖的情况。

2.2  溶剂对细胞增殖的影响

由于女贞子各提取物及化合物均以DMSO溶解，为了避免溶剂影响实验结果的准确性，在增殖实验之前，我们首先检测了DMSO对UMR-106细胞增殖的影响。结果显示当DMSO在细胞培养液中的终浓度为1‰以下时，对UMR-106细胞的增殖没有影响。

2.3  UMR-106细胞的接种及加样

取对数生长期生长状态良好的UMR-106细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后加10%新生小牛血清的无酚红RPMI-1640培养基制成细胞悬液，并稀释细胞浓度至4×10⁴ 个/mL，取每孔100 μL接种于96孔板，待24 h细胞完全贴壁后，换成100 μL 2% 新生小牛血清的培养基并设对照组、女贞子及其各单体提取物各浓度组加入待测样品，取物每组设8个复孔，另取8个复孔设为空白组(不加细胞，只加等量培养基)，继续在37 ℃，5% CO₂条件下培养48 h待检测。重复上述操作三次。

2.4  UMR-106细胞增殖的检测

(1) 细胞培养满48 h后每孔加入Am-Blue细胞增殖与活性检测试剂(SunBio^TM)10 mL并于培养箱中孵育2～6小时。

(2) 当培养基的颜色由靛青蓝变成粉红色后用荧光酶标仪测定各孔相对荧光单位(RFU值)，激发光波长560 nm，发射光波长590 nm^[44]。所得结果以表示，采用 t 检验对数据进行统计学分析。

2.5  实验结果

根据预实验的结果设置女贞子提取物（AFLL）1 μg/ mL、10 μg/ mL、100 μg/ mL三个浓度，D2和各化合物1 μg/ mL、10 μg/ mL、50 μg/ mL三个浓度检测（见图4、表4所示），结果表明雌激素对UMR-106细胞增殖没有影响，D2部分和化合物5、6、7与空白对照相比有明显促UMR-106细胞增殖的作用，AFLL和其它化合物有抑制作用或没有促进UMR-106细胞增殖的作用。

表4  女贞子各提取物及化合物1-8对UMR-106细胞增殖的影响

结果用空白对照的百分比表示，^* p＜0.05, ^** p＜0.01，^*** p＜0.01vs. control (n=3)

实施例3  清除DPPH自由基的能力

将不同浓度的各化合物分别与DPPH自由基反应后检测到的吸光值A_i，各自的对照管吸光值A_j，空白管吸光值A_b及标准管吸光值A₀代入公式(1)计算出各化合物各浓度对DPPH自由基的清除率，以清除率为纵坐标，各化合物浓度为横坐标作图求出回归方程，计算出各化合物对DPPH的半数自由基清除浓度IC₅₀，在浓度达到500 mg/L对DPPH自由基的清除率达不到50%时，结果则选择用在浓度为500 mg/L时最大的DPPH自由基的清除率来表示，其结果见表5。化合物1和3有很强的清除DPPH自由基的能力，化合物2次之，其它化合物具有较弱的清除DPPH自由基的能力。

表5化合物1-8清除DPPH自由基的能力

通过上述实验发现，以UMR106细胞中ALP活性为指导对具有通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物的提取物进行跟踪分离，并对提取物和分离所得各成分在成骨细胞增殖、抗氧化活性方面进行了研究，表明具有通式为Ⅰ的环烯醚萜类化合物具有显著促进碱性磷酸酶活性的作用，促成骨细胞分化的作用，因此该类化合物具有抗骨质疏松作用，可以用于制备治疗或预防骨质疏松症的药物。其中特女贞苷和化合物G13成分具有显著促进碱性磷酸酶活性的作用，促成骨细胞分化的作用，特女贞苷还具有明显促进UMR-106细胞增殖作用，其用于抗骨质疏松作用时其效果更佳。

如上所述，可以较好的实施本发明。 

Claims (3)

1.环烯醚萜类化合物在制备治疗和/或预防骨质疏松症药物中的应用，其特征在于，所述环烯醚萜类化合物为特女贞苷或女贞苷G13 。

2.根据权利要求1所述环烯醚萜类化合物的应用，其特征在于，所述环烯醚萜类化合物为分离自女贞子中的环烯醚萜类化合物。

3.根据权利要求2所述环烯醚萜类化合物的应用，其特征在于，所述环烯醚萜类化合物的测定方法包括下述步骤：

（1）将干燥的女贞子药材经粉碎后用水加热提取，减压浓缩除去水后得到浸膏，即女贞子水提物，将女贞子水提物悬浮于40~55℃热水中，然后依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别浓缩萃取液得浸膏：氯仿部分（A），乙酸乙酯部分（B），正丁醇部分（C），水层（D）；以ALP活性作为评价其是否具有促成骨细胞分化能力的指标，用DMSO作为空白对照，雌二醇E2作为阳性对照，测定女贞子水提物及萃取后A、B、C、D各部分对UMR-106细胞分化的影响，选择促成骨细胞分化能力最强的D部分进行下一步分析；

（2）女贞子水提物萃取后水层（D）上大孔树脂柱，经水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，分成对应的5个部分D1-D5，以ALP活性作为评价其是否具有促成骨细胞分化能力的指标，用DMSO作为空白对照，E2作为阳性对照，测定D1-D5部分对UMR-106细胞ALP活性的影响，选择促成骨细胞分化能力最强的D2部分进行下一步分析；

（3）活性最强的20%乙醇洗脱部分（D2）用少量水溶解分散后加入甲醇至含甲醇浓度为95%，静置过夜；滤液蒸干得浸膏D21，D21上硅胶层析柱，分别用10:1，5:1，3:1，1:1，1:4，0:1的氯仿-甲醇各1000mL进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成标识为Fr.1-6的6段，Fr.1部分上硅胶层析柱，分别用10:1，5:1，3:1，1:1，0:1的氯仿-丙酮各100mL进行梯度洗脱，根据薄层情况合并将其分成标识为Fr.1.1-1.3的3段，Fr.1.1经纯化得化合物2，Fr.1.2经纯化得化合物1，Fr.1.3经纯化得化合物3；Fr.2经纯化得化合物5和6，Fr.3上硅胶层析柱分别用20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，0:1氯仿-甲醇各500mL进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成标识为Fr.3.1-3.3的3段，Fr.3.3经纯化得化合物4；Fr.4用C₁₈柱层析，10:90的甲醇-水洗脱得化合物7；Fr.5上硅胶层析柱，分别用5:1，3:1，1:1，0:1氯仿-甲醇各1000mL进行梯度洗脱，根据薄层层析情况将其分成标识为Fr.5.1-5.3的3段，Fr.5.2经纯化得化合物8；

（4）鉴定步骤（3）中1-8化合物的波谱数据，通过波谱数据确定1-8化合物的化学结构，并通过ALP活性检测对比试验确定女贞子中用于制备治疗和/或预防骨质疏松症药物的化合物。