CN110483660A

CN110483660A - 中药蛴螬葡聚糖及其用途

Info

Publication number: CN110483660A
Application number: CN201910772766.4A
Authority: CN
Inventors: 曹蔚; 王晶梅; 谯雨荷; 任丽
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-08-20
Also published as: CN110483660B

Abstract

本发明属于中药现代化领域，涉及中药蛴螬葡聚糖及其用途。本发明的中药蛴螬葡聚糖分子量为1～4×10⁴Da，单糖组成为葡萄糖，糖含量大于90％。该中药蛴螬葡聚糖与ALDOA有很强的特异性亲和作用，可抑制其活性，从而产生显著的预防或治疗癌症、糖尿病及其并发症、肥胖及其相关代谢性疾病、病毒性脑膜炎、关节炎、心肌肥厚的作用。

Description

中药蛴螬葡聚糖及其用途

技术领域

本发明属于中药现代化领域，具体涉及中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物及其在制备醛缩酶A抑制剂的药物中的用途。

背景技术

葡萄糖可通过两种途径对细胞提供能量，有氧条件下是通过细胞内的线粒体氧化磷酸化，无氧条件下则是以糖酵解的形式供能。葡萄糖通过糖酵解方式分解生成丙酮酸的过程需经过10步酶催化反应；30多种酶参与完成。其中，1，6-二磷酸-D-果糖醛缩酶(ALDO)，是糖酵解的重要代谢酶。在脊椎动物中，ALDO家族由结构上非常相似的基因编码的三种同功酶组成，三种ALDO同工酶以组织依赖性方式表达：ALDOA(主要在肌肉中)，ALDOB(主要在肝脏中)和ALDOC(在神经元组织中表达)。

ALDOA，是一种大分子蛋白质，由16种氨基酸组成。ALDOA能催化6碳的1，6-二磷酸果糖(F1，6BP)裂解为磷酸二羟丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(G3P)。除了糖酵解功能外，ALDOA还参与信号转导、囊泡转运和细胞运动[Chang YC，et al.Roles of AldolaseFamily Genes in Human Cancers and Diseases.Trends Endocrinol Metab.2018]。

快速增殖的癌细胞缺乏代谢灵活性，不同于普通细胞的有氧供能，癌细胞主要是通过糖酵解这一方式获得能量，也被称为瓦氏效应。肿瘤细胞无论在氧气是否充足的环境下都通过糖酵解过程代谢糖分，产生乳酸，获得能量。这一现象早在1927年被Warburg发现。在1988年，有报道指出ALDOA基因在肿瘤细胞系中表达升高[Izzo P et al.Humanaldolase A gene.Eur J Biochem.1988]。某些癌症患者血清中ALDOA的表达显著增加，表明ALDOA可能是肿瘤发展和恶性突变的关键蛋白质。ALDOA的大量表达可以加速糖酵解过程。细胞中ALDOA表达的上调与增殖有关[Zhang CS et al.Fructose-1，6-bisphosphateand aldolase mediate glucose sensing by AMPK.Nature.2017]。ALDOA表达下调可引起糖酵解异常，降低细胞内ATP含量，抑制肿瘤细胞的增殖。截止目前，ALDOA在肺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、骨肉瘤、乳腺癌、肾癌等多种肿瘤细胞中高表达被证实存在。

ALDOA是参与肺癌进展的关键糖酵解酶，在肺癌中影响了葡萄糖代谢[Chang Y etal.2014]，同时通过PHD介导的HIF-1α稳定化和下游的MMP9活化促进肺癌的转移[Chang YC et al.Feedback regulation of ALDOA activates the HIF-1α/MMP9 axis topromote lung cancer progression.Cancer letters.2017]，是肺癌不良临床结果的标志物。

在肝癌组织中，ALDOA的RNA表达水平比正常组织高，并与肝癌患者的预后密切相关[Lee NCW et al.High Expression of Glycolytic Genes in Cirrhosis CorrelatesWith the Risk of Developing Liver Cancer.Front Cell Dev Biol.2018]。有研究发现，与正常肝细胞相比，肝癌细胞中ALDOA的表达水平有不同程度的升高，发现ALDOA影响了肝癌细胞增殖和细胞周期[曾诚，等.醛缩酶A基因促进肝癌细胞增殖.国际药学研究杂志.2016]。

在结直肠癌中，ALDOA是一种缺氧诱导的预后因子，与肿瘤位置、肿瘤临床分期和存活率有关，ALDOA不仅通过影响葡萄糖代谢而且通过与HIF-1和其他上皮间质转换相关的信号传导途径相互作用而影响结直肠癌的发展。沉默ALDOA导致这些信号传导途径活性降低，从而抑制结直肠癌的发展[Kawai K et al.Fructose-bisphosphate aldolase A is akey regulator of hypoxic adaptation in colorectal cancer cells and involvedin treatment resistance and poor prognosis.International journalofoncology.2017]。

在胃癌中，ALDOA的表达与肿瘤大小、分期和预后显著相关，是胃癌预后的潜在生物标志[Jiang Z，et al.Aldolase A as a prognostic factor and mediator ofprogression via inducing epithelial-mesenchymal transition in gastriccancer.J Cell Mol Med.2018]。

ALDOA与胰腺癌细胞的增殖和转移也相关，其作用可能归因于其对c-Myc和HIF-1α的调节，后者是糖酵解和抗氧化反应控制的关键调节因子[Ji S，et al.ALDOA functionsas an oncogene in the highly metastatic pancreatic cancer.Cancerletters.2016]，近期也报道长链非编码RNA与ALDOA调控胰腺癌细胞的增殖和转移作用有关[Cui K，et al.Long noncoding RNA DIO3OS interacts with miR-122 to promoteproliferation and invasion of pancreatic cancer cells through upregulatingALDOA.Cancer Cell Int.2019]。

另外，在骨肉瘤[Long F，et al.Role of aldolase A in osteosarcomaprogression and metastasis：in vitro and in vivo evidence.Oncol Rep.2014]、乳腺癌[Grandjean G，et al.Definition of a novel feed-forward mechanism forglycolysis HIF1α signaling in hypoxic tumors highlights aldolase a as atherapeutic target.Cancer research.2016]、肾癌[Huang Z，et al.High expressionof fructose-bisphosphate aldolase A induces progression of renal cellcarcinoma.Oncol Rep.2018]、膀胱癌[Li J，et al.ALDOLASE A regulates invasion ofbladder cancer cells via E-cadherin-EGFR signaling.J Cell Biochem.2019]、白血病[Son HJ，et al.Promoter Mutation Analysis of ALDOA Gene in Solid Tumors andAcute Leukemias.Pathol Oncol Res.2019]、胆管癌[Xu Z，et al.miR-122-5p Inhibitsthe Proliferation，Invasion and Growth of Bile Duct Carcinoma Cells byTargeting ALDOA.Cell Physiol Biochem.2018]、宫颈癌[Jin K，et al.Mycoepoxydienesuppresses HeLa cell growth by inhibiting glycolysis and the pentosephosphate pathway.Appl Microbiol Biotechnol.2017]、恶性胶质瘤[Sanzey M，etal.Comprehensive analysis of glycolytic enzymes as therapeutic targets in thetreatment of glioblastoma.PLoS One.2015]、黑色素瘤[Sun Y，et a1.Angiopoietin-like 4 promotes melanoma cell invasion and survival through aldolase A.OncolLett.2014]等中均有报道ALDOA与这些癌症的发生发展密切相关。

以上这些研究证实，ALDOA在多种癌症细胞中高表达，影响癌症细胞的生长、增殖、侵袭等，并且增加癌症细胞对放化疗的抵抗，可能成为治疗癌症及癌症放化疗抵抗的药物靶点[Chang YC，et al.Roles of Aldolase Family Genes in Human Cancers andDiseases.Trends Endocrinol Metab.2018]。

糖尿病，包括I型糖尿病和II型糖尿病。糖尿病发展的过程，一般要经历高糖血症、中期糖尿病、后期糖尿病三个阶段。糖尿病与糖代谢障碍密切相关，是一组以糖代谢障碍合并脂肪代谢、蛋白质代谢障碍为特征的内分泌紊乱疾病。血糖高往往会伤害到整个身体，造成器官衰竭、视力模糊甚至失明等，严重危害人们的健康。

糖尿病最明显的一个特点是血糖异常且升高，出现这种情况的原因是糖代谢异常和人体无法主动调节供能物质葡萄糖的代谢。其中，II型糖尿病中的高血糖症的特征在于肝脏和肾脏中葡萄糖的产生增加。肝脏是糖代谢的中枢性器官，在血糖的调节中起至关重要的作用。肝脏的调节作用主要表现在糖异生、糖元合成、贮藏和作为能源的葡萄糖的摄取、利用及释放。当饥饿引起葡萄糖水平下降，细胞内的能量分子ATP含量下降，进而引起另一代表低能量状态的分子AMP水平的上升，并由AMP直接激活AMPK，维持新陈代谢平衡[Zhang CS，et al.Fructose-1，6-bisphosphate and aldolase mediate glucosesensing by AMPK.Nature.2017]。ALDOA作为一种糖酵解酶，是ATP生物合成的关键参与者，从而调控机体能量代谢过程[方志娟，等.mir-122在aldoa介导的ob/ob小鼠肝脏代谢中的作用研究.生物化学与生物物理进展.2014]。通过抑制ALDOA的表达，糖酵解途径被抑制，ATP水平降低，激活AMPK1这一反馈通路[尉林洁.温州医科大学硕士学位论文.2018]。此外，ALDOA也参与了肥胖引起的相关代谢障碍如自发性高血压的发生发展等[Méndez L，etal.Targets of protein carbonylation in spontaneously hypertensive obeseKoletsky rats and healthy Wistar counterparts：a potential role on metabolicdisorders.J Proteomics.2014]。因此，ALDOA作为一个新的药物靶点，在糖尿病及其并发症，包括糖尿病酮症酸中毒、高血压、糖尿病眼病、糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病血管病、糖尿病皮肤病、糖尿病性神经病等，肥胖及其相关代谢疾病，例如高脂血症、高血压、高尿酸血症、脂肪肝、动脉粥样硬化等中有重要的治疗作用。

除此以外，近年研究还发现：抑制ALDOA对脑炎病毒引起的病毒性脑膜炎有治疗作用[Tien CF，et al.Inhibition of aldolase A blocks biogenesis of ATP andattenuates Japanese encephalitis virus production.Biochem Biophys ResCommun.2014]，抑制ALDOA对心肌肥厚也有治疗作用[Li Y，et al.Aldolase promotes thedevelopment of cardiac hypertrophy by targeting AMPK signaling.Exp CellRes.2018]，ALDOA还是关节炎的重要诊断指标[Ganguly A.Levels of C-reactiveprotein，creatine kinase-muscle and aldolase A are suitable biomarkers todetect the risk factors for osteoarthritic disorders：A novel diagnosticprotocol.Caspian J Intern Med.2019]，因此，研发新的可靶向ALDOA的特异性抑制剂，对于多种疾病的治疗具有重要意义。

目前针对抑制ALDOA的小分子化合物报道的很少，仅有4-苯甲基-2-甲基-1，2，4-三唑-3，5-二酮(TDZD-8)。TDZD-8抑制ALDOA的IC₅₀可达20μM，对小鼠乳腺癌移植瘤有明显抑制作用，但TDZD-8同时也是GSK-3β抑制剂，其对GSK-3β的抑制活性更强，IC₅₀仅为1.4μM，故靶点特异性差。采用计算机辅助药物设计的方法对ALDOA抑制剂进行设计，糖类化合物的羟基能模仿底物F1，6BP上的羟基，与ALDOA酶空腔中的氨基酸残基形成氢键，因此，糖类化合物对ALDOA可能具有特殊的抑制作用。

多糖是由10个以上的单糖通过糖键连接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物，广泛存在于动物、植物、微生物中。多糖做为中药的水溶性成分，对疾病的治疗发挥着重要的作用。研究发现，中药多糖具有多种活性，如临床使用的抗肿瘤辅助用药香菇多糖、猪苓多糖、人参多糖等。

蛴螬为金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphalia Bates及同属近缘昆虫的干燥幼虫，是世界性的地下害虫，而在中医学中则有着悠久的应用历史。其最早记载于《神农本草经》，有破血、行瘀、散结、通乳等作用，可治疗折损瘀痛、痛风、癥瘕、破伤风、丹毒、痈疽、痔漏等。多糖是蛴螬的一种成分，根据发明人的资料检索，至今未发现蛴螬多糖作为ALDOA抑制剂的应用报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明解决的问题在于提供一种中药蛴螬葡聚糖(组分)或其硫酸酯化衍生物及其在制备醛缩酶A(ALDOA)抑制剂的药物的用途。本发明中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物通过抑制醛缩酶A的活性产生癌症、糖尿病及其并发症、肥胖及其相关代谢疾病、病毒性脑膜炎、关节炎、心肌肥厚等疾病的预防或治疗作用。

本发明提供的中药蛴螬葡聚糖，其分子量为1～4×10⁴Da，单糖组成为葡萄糖，糖含量大于90％。

所述中药蛴螬葡聚糖为白色或淡黄色，无定型粉末，溶于水，与苯酚-硫酸试剂反应显阳性。

本发明提供的中药蛴螬葡聚糖，其通过包括以下步骤的方法制备而成：

(1)脱脂：将中药蛴螬粉碎后用有机溶剂脱脂，脱脂后的蛴螬药渣干燥；

(2)提取：将上述干燥药渣用水回流提取，将水提液减压浓缩成提取浓缩液，冷却至室温；

(3)除蛋白：将上述浓缩液除去大部分蛋白，离心除去沉淀，保留水溶液；

(4)除色素：将上述水溶液除色素，除色素后的水溶液浓缩；

(5)分离：将步骤(4)浓缩液上离子交换凝胶色谱柱收集中性部分，浓缩后，上尺寸排阻色谱柱、凝胶渗透色谱柱或超滤装置，收集分子量1～4×10⁴Da的组分，浓缩干燥，即得中药蛴螬葡聚糖；

步骤(1)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙醚、石油醚、苯、氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯；脱脂方法为回流、浸渍、索氏提取器提取或渗漉法中的一种或多种；

步骤(3)中，所述除蛋白的方法任选自Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法、反复冻融法、柱层析法中的一种或多种；

步骤(4)中，所述除色素的方法为双氧水法、大孔吸附树脂法、活性碳法、离子交换柱层析法中的一种或多种。

优选地，本发明提供的中药蛴螬葡聚糖，其通过包括以下步骤的方法制备而成：

(1)脱脂：将中药蛴螬粉碎后用相当于其重量2～10倍的乙醇、乙醚或石油醚用加热回流法或索氏提取器法提取2～6h，共提取1～4次，弃提取液，脱脂后的蛴螬药渣干燥；

(2)提取：将上述干燥药渣用相当于其重量2～12倍的水在80～100℃回流2～6h，提取2～4次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/2～1/50的提取浓缩液，冷却至室温；

(3)除蛋白：将上述浓缩液采用Sevag法除蛋白2～10次，离心除去沉淀，保留水溶液；

(4)除色素：将上述水溶液用双氧水法除色素，脱色条件为样品体积8～800倍的30％过氧化氢水溶液60～90℃回流1～5h；水溶液浓缩至相当于原体积1/8～1/1000的浓缩液；

(5)分离：将上述浓缩液先上DEAE-sephadex A-25或DEAE-纤维素柱，用水洗脱完全；水溶液浓缩后继续上Sephadex G-100、Sephadex G-75、Sephadex G-50、Sephacryl S-400或Sephrose CL-6B凝胶柱，用水洗脱，收集分子量1～4×10⁴Da组分的洗脱液，浓缩干燥，即得中药蛴螬葡聚糖。

更具体地，本发明提供的中药蛴螬葡聚糖，其通过包括以下步骤的方法制备而成：

(1)脱脂：将中药蛴螬粉碎后用相当于其重量2～6倍的乙醇或石油醚用加热回流法提取2～5h，共提取2次，弃提取液，脱脂后的蛴螬药渣干燥；

(2)提取：将上述干燥药渣用相当于其重量5～8倍的水在90～100℃回流2～3h，提取2～3次，合并水提液，将其减压浓缩至相当于原体积1/5～1/20的提取浓缩液，冷却至室温；

(3)除蛋白：将上述浓缩液采用Sevag法除蛋白2～8次，离心除去沉淀，保留水溶液；

(4)除色素：将上述水溶液用双氧水法除色素，脱色条件为样品体积10～100倍的30％过氧化氢水溶液60～85℃回流1～3h；水溶液浓缩至相当于原体积1/10～1/400的浓缩液；

(5)分离：将上述浓缩液先上DEAE-sephadex A-25柱，用水洗脱完全；水溶液浓缩后继续上Sephadex G-100或Sephacryl G-75凝胶柱，用水洗脱，收集分子量1～4×10⁴Da组分的洗脱液，浓缩干燥，即得中药蛴螬葡聚糖。

本发明提供中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物，其采用氯磺酸-吡啶法合成，制备方法包括以下步骤：

(1)酯化剂制备：冰盐浴中，将氯磺酸和吡啶按1∶1～1∶10比例混合反应0.5～1.5h；

(2)蛴螬葡聚糖混悬液制备：将蛴螬葡聚糖分散在其重量10～200倍的无水N，N-二甲基甲酰胺或DMSO中，室温搅拌5～120min至均匀的混悬液；

(3)反应：将酯化剂和蛴螬葡聚糖混悬液置40～90℃恒温加热搅拌反应1～6h，形成黄棕色透明溶液；

(4)纯化：将上述反应混合液冷却至室温，置总溶液体积的0.5～5倍水中溶解、调节溶液pH至中性，乙醇沉淀、透析、过滤或凝胶柱层析中的一种或多种方法纯化，冻干得中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物。

更具体地，本发明提供的中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物，其制备方法包括以下步骤：

(1)酯化剂制备：冰盐浴下，将氯磺酸和吡啶按1∶2～1∶6比例混合反应1h；

(2)蛴螬葡聚糖混悬液制备：将蛴螬葡聚糖分散在其重量20～150倍无水N，N-二甲基甲酰胺或DMSO中，室温搅拌15～60min呈均匀的混悬液；

(3)条件：将酯化剂和蛴螬葡聚糖混悬液置60～80℃恒温加热搅拌反应1～3h，形成黄棕色透明溶液：

(4)纯化：将上述反应混合液冷却至室温，置总溶液体积的1～3倍水中溶解、1～3mol/L NaOH调节溶液pH至中性，加3～4倍体积无水乙醇沉淀，4℃放置4～24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于水中，透析48～72h，透析袋内液过滤，滤液减压浓缩后，冷冻干燥得中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物。

本发明提供所述中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物的制备方法，该制备方法与上述产物所使用的制备方法相同。

本发明提供所述中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物在制备醛缩酶A(ALDOA)抑制剂的药物中的用途。

进一步地，所述中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物作为ALDOA抑制剂在制备预防和/或治疗癌症、糖尿病及其并发症、肥胖及其相关代谢疾病、病毒性脑膜炎、关节炎、心肌肥厚的药物中的用途。

其中，所述癌症包括但不限于：肝癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、白血病、胆管癌、宫颈癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤。

所述糖尿病及其并发症包括但不限于：糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高血压、糖尿病眼病、糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病血管病、糖尿病皮肤病、糖尿病性神经病。

所述肥胖及其相关代谢疾病包括但不限于：高脂血症、肥胖型高血压、高尿酸血症、脂肪肝、动脉粥样硬化。

本发明提供一种药物组合物，其包含所述中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物以及药学上可接受的辅料。

所述药物组合物以药用制剂的形式使用。所述的药用制剂以含中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物作为活性成分与药学上可接受的载体/载体(如适宜于胃肠内或胃肠外给药的无机或有机固体或液体赋形剂)混合，该药用制剂可以是固体形式如粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂，也可以是液体形式如注射剂、乳剂等。

所述药用制剂中可含有辅助物质、填充剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂、崩解剂等其它常用的添加剂，如乳糖、淀粉、柠檬酸钠、硬脂酸镁、滑石粉、抗坏血酸、蔗糖、柠檬酸、聚乙二醇、丙二醇、糊精、羧甲基淀粉钠、甘露醇、明胶、花生油等。

所述药用制剂可按照各种制剂常规制备工艺制成。

本申请中，中药蛴螬葡聚糖、蛴螬葡聚糖、蛴螬葡聚糖组分和多糖组分在某些情况下具有相同的含义。

本申请中，蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物和蛴螬葡聚糖硫酸酯在某些情况下具有相同的含义。

本发明具有以下有益效果：本发明提供的中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物与ALDOA有较强的特异性亲和，对ALDOA有很好的抑制活性；并且对蛴螬葡聚糖进行硫酸酯化修饰后，发现其衍生物抑制ALDOA的活性进一步增强。说明本发明中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物可以作为ALDOA抑制剂成为重要相关疾病的治疗药物。

附图说明

图1为中药蛴螬葡聚糖的单糖组成GC图。

图2为中药蛴螬葡聚糖与ALDOA的结合曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但不以任何形式构成对本发明的限制。

实施例1：中药蛴螬葡聚糖的制备

称取5kg干燥蛴螬药材，粉碎为粗粉；用15000mL乙醇回流提取2h，滤出乙醇提取液并弃去，把蛴螬药渣按上述方法再处理1次，滤出乙醇提取液并弃去，残渣挥干乙醇，50℃干燥后，用25000mL蒸馏水100℃回流提取，共提取3次，每次3h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至10000mL；采用Sevag法(即V多糖溶液：V氯仿：V正丁醇＝20∶4∶1混合30min，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复5次，离心弃去沉淀。用水层80倍体积的30％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流3h。将以上得到的水溶液70℃旋转蒸发仪减压浓缩至2000mL。将浓缩液10000g离心10min，上DEAE-sephadex A-25(100cm×5cm，i.d.)柱，用去离子水以流速1.5mL/min洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；将洗脱液浓缩至600mL，上Sephadex G-100(100cm×5cm，i.d.)凝胶柱，用蒸馏水洗脱，分管收集，示差折光检测器测定洗脱液的纯度，并采用标准曲线法测定各洗脱部分的分子量，收集分子量10～40kD的洗脱液并合并，减压浓缩、冷冻干燥，得到蛴螬多糖14.1g。

糖显色反应：苯酚-硫酸法显色呈黄色。

总糖含量测定∶以不同浓度的葡萄糖为标准制作标准曲线；准确称取本实施例得到的多糖，配制100mg/L的样品水溶液。分别精密吸取标准溶液和样品液2.0mL于试管中，加入6％苯酚溶液2.0mL及浓硫酸6.0mL，混匀，室温放置20分钟后于490nm波长处测吸光度值，以标准曲线计算本实施例得到的多糖总糖含量为95.47％。

纯度及重均分子量测定：采用Waters 2690高效液相色谱仪及工作站，Waters2414示差折光检测器，Shodex sb-803HQ和sb-804HQ串联柱，0.1mol/L硫酸钠水溶液为流动相(流速0.5mL/min)测定。Dextran系列标准葡聚糖溶液进样10μL，分别求得洗脱体积Ve；蓝色葡聚糖2000000及葡萄糖同法上样，分别求得柱的空体积V₀和总体积Vt。根据公式Kav＝(Ve-Vo)/(Vt-Vo)计算各标准葡聚糖的分配系数(Kav)值，以Kav为横坐标，lg M为纵坐标，得到分子量测定标准曲线。本实施例得到的蛴螬多糖同上法制备，进样，为单一对称峰，表明其为均一性组分；计算得重均分子量为1.8×10⁴Da。

单糖组成分析：采用TFA全水解、乙酰化法制备本实施例单糖残基的衍生物，采用GC测定，色谱柱为HP-5毛细管柱；FID检测器；根据单糖的保留时间及峰面积确定本实施例的蛴螬多糖单糖组成为：葡萄糖(结果见图1)；因此本实施例的多糖为葡聚糖。

实施例2：中药蛴螬葡聚糖的制备

称取1kg干燥蛴螬药材，粉碎为中粉；用4000mL乙醇回流提取3h，滤出乙醇提取液并弃去，把蛴螬药渣按上述方法再处理1次，滤去乙醇提取液，药渣挥干乙醇，50℃干燥后，用8000mL水100℃回流提取2次，每次3h；合并水提液，65℃旋转蒸发仪减压浓缩至800mL，反复冻融8次后，离心，弃去沉淀；采用Sevag法(即V多糖溶液：V氯仿：V正丁醇＝20∶4∶1混合10min，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复2次，离心弃去沉淀；然后用样品体积10倍的30％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度85℃，回流2h；65℃旋转蒸发仪减压浓缩至400mL。将浓缩液8000g离心15min后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×4cm，i.d.)柱，用去离子水以流速1.5mL/min洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；将洗脱液浓缩至150mL，上SephacrylG-75凝胶柱，用水以流速1.5mL/min洗脱，分管收集，示差折光检测器测定洗脱液的纯度，并采用标准曲线法测定各洗脱部分的分子量，收集分子量10～40kD的洗脱液并合并，减压浓缩、冷冻干燥，得到蛴螬多糖2.71g。

糖显色反应：苯酚-硫酸法显色呈黄色。

总糖含量测定：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；以标准曲线计算本实施例得到的多糖总糖含量为91.49％。

纯度及重均分子量测定：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；样品进样测定后为单一对称峰，表明其为均一性组分；计算得重均分子量为2.2×10⁴Da。

单糖组成分析：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；本实施例的蛴螬多糖单糖组成为：葡萄糖；因此本实施例的多糖为葡聚糖。

实施例3：中药蛴螬葡聚糖的制备

称取10kg干燥蛴螬药材，粉碎为粗粉；用40000mL无水乙醇回流提取2h，滤出乙醇提取液弃去，把蛴螬药渣按上述方法再处理1次，滤出乙醇提取液，药渣挥干乙醇，40℃干燥后，用60000mL水溶液100℃回流提取，3次，每次2h，合并水提液，60℃旋转蒸发仪浓缩至10000mL，冷却至室温后采用Sevag法(即V多糖溶液：V氯仿：V正丁醇＝20∶4∶1混合振荡30min，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复4次，离心，弃去沉淀。将水溶液用样品体积50倍的30％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流2h；将以上得到的水溶液减压浓缩至2500mL，将浓缩液8000g离心15min后，上DEAE-sephadex A-25(100cm×7cm，i.d.)柱，用去离子水以流速1.5mL/min洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；将洗脱液浓缩至1200mL，上Sephadex G-100凝胶柱，用水洗脱，分管收集，示差折光检测器测定洗脱液的纯度，并采用标准曲线法测定各洗脱部分的分子量，收集分子量10～40kD的洗脱液并合并，减压浓缩、冷冻干燥；得到蛴螬多糖23.2g。

糖显色反应：苯酚-硫酸法显色呈黄色。

总糖含量测定：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；以标准曲线计算本实施例得到的多糖总糖含量为93.18％。

纯度及重均分子量测定：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；样品进样测定后为单一对称峰，表明其为均一性组分；计算得重均分子量为2.8×10⁴Da。

实施例4：中药蛴螬葡聚糖的制备

称取1kg蛴螬，粉碎为粗粉；用2000mL乙醇润湿；用10000mL乙醇进行渗漉，滤出乙醇提取液弃去，药渣挥干乙醇，40℃干燥后，用6000mL的水100℃回流提取2次，每次3h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至1000mL，反复冻融8次，离心，弃去沉淀。水溶液上D101大孔吸附树脂除色素，水洗脱溶液65℃旋转蒸发仪减压浓缩至200mL。将浓缩液10000g离心10min后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm，i.d.)柱，用水以流速1.0mL/min洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集水洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至100mL。浓缩液8000g离心10min后，上Sephadex G-75(100cm×5cm，i.d.)凝胶柱，用水洗脱，分管收集，示差折光检测器测定洗脱液的纯度，并采用标准曲线法测定各洗脱部分的分子量，收集分子量10～40kD的洗脱液并合并，减压浓缩、冷冻干燥；得到蛴螬多糖2.29g。

糖显色反应：苯酚-硫酸法显色呈黄色。

总糖含量测定：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；以标准曲线计算本实施例得到的多糖总糖含量为90.64％。

纯度及重均分子量测定：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；样品进样测定后为单一对称峰，表明其为均一性组分；计算得重均分子量为1.4×10⁴Da。

实施例5：中药蛴螬葡聚糖的制备

称取500g干燥蛴螬药材，粉碎为细粉；置于索氏提取器中用2000mL石油醚回流提取5h，残渣挥干石油醚，40℃干燥后，用3000mL水90℃回流提取3次，每次2h。合并水提液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至500mL，采用反复冻融6次，离心，弃去沉淀，再用Sevag法(即V多糖溶液：V氯仿：V正丁醇＝20∶4∶1混合振荡30min，离心，静置分层，取水层)除蛋白，反复3次，离心弃去沉淀；水溶液反复冻融2次，离心，弃去沉淀；然后用样品体积100倍的30％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流1h。溶液65℃旋转蒸发仪减压浓缩至100mL。将浓缩液10000g离心12min后，上DEAE-sephadex A-25(60cm×3.5cm，i.d.)柱，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集水洗脱液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至50mL。浓缩液8000g离心10min后，上Sephadex G-75(80cm×3cm，i.d.)凝胶柱，用水洗脱，分管收集，示差折光检测器测定洗脱液的纯度，并采用标准曲线法测定各洗脱部分的分子量，收集分子量10～40kD的洗脱液并合并，减压浓缩、冷冻干燥，得到蛴螬多糖1.03g。

糖显色反应：苯酚-硫酸法显色呈黄色。

总糖含量测定：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；以标准曲线计算本实施例得到的多糖总糖含量为96.60％。

纯度及重均分子量测定：本实施例得到的多糖组分测定方法同实施例1；样品进样测定后为单一对称峰，表明其为均一性组分；计算得重均分子量为3.1×10⁴Da。

实施例6：中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物的制备

将吡啶1.5mL加入附有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶，置于冰浴中，搅拌使吡啶充分冷却，用玻璃滴管缓慢滴加0.3mL氯磺酸，约30min滴加完毕，搅拌1h，冰上孵育1h，待烧瓶中出现大量淡黄色物质。将100mg中药蛴螬葡聚糖混悬于10ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温下磁拌20min呈均匀混悬液，加入三颈瓶。迅速将加入酯化剂混合物和多糖混悬液的三颈瓶移入80℃恒温水浴中，搅拌反应2h，反应完毕，冷却至室温，将反应液倒入12.5ml水中，形成黄棕色透明溶液，用2.5mol/L NaOH调节溶液pH至中性，加入3～4倍体积的无水乙醇，4℃放置12h，离心收集沉淀，将沉淀溶于水中，透析72h，透析袋内液过滤，滤液减压浓缩后，滤液冷冻干燥得到淡黄色蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物80mg。

IR鉴定蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物：采用傅里叶红外吸收光谱法，即KBr压片法，在400-4000cm^-1用红外光谱仪扫描；对比多糖硫酸酯化前后的图谱，3500-3000cm^-1羟基吸收峰明显减弱，说明多糖中的羟基被取代，硫酸酯化后多糖在1240cm^-1出现-O-SO₃的不对称的S＝O伸缩振动峰，在900-700cm^-1出现S-O键伸缩振动峰。

UV鉴定蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物：本实施例得到的样品在250-270nm出现S-O和SO₃的吸收峰，表明有硫酸酯基团。

¹H-NMR鉴定蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物：精密称取本实施例得到的样品15mg，D₂O置换3次，采用Bruker Avance III 500核磁共振仪(瑞士Bruker BioSpin公司)(TMS内标)扫描。4.4-5.4ppm之间有峰，说明与之对应的H被取代。酯化后σ为8ppm有峰，说明有硫酸酯基团。

实施例7：中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物的制备

将带有搅拌装置和冷凝管的三颈烧瓶，置于冰盐浴中，加入20mL无水吡啶，缓慢滴加5mL氯磺酸，并剧烈搅拌，于40min内加完，搅拌反应1h后，撤去冰浴和搅拌装置，制得酯化试剂。精确称取经纯化的中药蛴螬葡聚糖500mg溶于25mL无水N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，搅拌15min呈均匀混悬液，加入到装有酯化试剂的三颈烧瓶中，立即将三颈烧瓶置入80℃恒温水浴进行反应1.5h。反应液冷却至室温，用50mL蒸馏水溶解，用2.5mol/L的NaOH溶液调至中性，加入3倍体积的无水乙醇，4℃放置12h，析出沉淀，离心分离。沉淀加少量的水溶解后装入透析袋，蒸馏水透析72h，透析袋内液过滤，滤液减压浓缩后，冷冻干燥得到蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物420mg。

IR鉴定蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物：本实施例得到的样品测定方法同实施例6；对比多糖硫酸酯化前后的图谱，3500-3000cm^-1羟基吸收峰明显减弱，说明多糖中的羟基被取代，硫酸酯化后多糖在1240cm^-1出现-O-SO₃的不对称的S＝O伸缩振动峰，在900-700cm^-1出现S-O键伸缩振动峰。

¹H-NMR鉴定蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物：本实施例得到的样品测定方法同实施例6。4.4-5.4ppm之间有峰，说明与之对应的H被取代。酯化后σ为8ppm有峰，说明有硫酸酯基团。

实施例8：中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物的制备

将带有搅拌装置和冷凝管的三颈烧瓶，置于冰盐浴中，加入10mL无水吡啶，缓慢滴加5mL氯磺酸，并剧烈搅拌，于40min内加完，搅拌反应1h制得淡黄色酯化剂溶液；将中药蛴螬葡聚糖500mg溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(30mL)中并搅拌1h呈均匀混悬液。将混悬液逐滴加入酯化剂中，并在微波辅助反应设备(MG08S-2B，Huiyan，Nanjing，China)固定频率(2450±50MHz)和低微波功率(100W)将反应保持在60℃，反应时间为15～180min。当反应停止时，将混合液冷却至室温后，用50mL蒸馏水溶解，1mol/L NaOH溶液调节pH至中性，加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置24h，析出沉淀，离心分离。沉淀加少量的水溶解后装入透析袋，用自来水透析48h和蒸馏水透析24h，透析袋内液过滤，滤液减压浓缩后，冷冻干燥，得到蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物400mg。

实施例9：本发明多糖体外结合ALDOA蛋白的作用

采用微量热泳动(MST)法测定本发明蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物(以实施例1和6所得样品为例)与ALDOA蛋白的结合能力。方法如下：

1)荧光标记：用蛋白标记试剂盒(Monolith NT^TM)对目标蛋白进行标记。Buffer交换A柱去掉尾部，套上EP管，3000rpm离心30s；将300μl Labelling buffer加于A柱，离心平衡(3000rpm，30s)，重复两次；将50μl ALDOA(浓度为10μM)转移至A柱，离心脱Tris盐；47μlLabelling buffer与脱Tris的ALDOA混匀，加荧光染料3μl，避光孵育半小时，得100μl蛋白-染料混合液；PBS注满纯化柱Column B，静置过柱，平衡3-5次；将上述蛋白-染料混合液全部转至Column B，待其全部进入填料，补加150μl蛋白buffer，弃掉Column B柱流出的第一滴流出液，收集洗脱液，即得到荧光标记的ALDOA，浓度约为2μM，-80℃储存待用。

2)Protest测试：用蛋白buffer稀释上述荧光标记蛋白ALDOA。打开MST和NTcontrol软件，用毛细管(型号K002)吸取蛋白，然后进行荧光信号的初始化扫描。根据测试结果，调整浓度和激发功率，在保证蛋白浓度≥200nM的前提下使蛋白标记荧光值为200-1500之间。

3)Affinity测试：用蛋白buffer溶解各样品，配制配体母液，浓度为1mM。连续倍比稀释法(1∶1)将配体稀释为16个浓度梯度，每个梯度体积为10μl，第1个梯度浓度即为1mM，依次类推。荧光标记蛋白ALDOA-多糖配体梯度1∶1稀释混匀，4℃离心10min去除沉淀，常温避光静置20min。用毛细管吸取混合好的样品，上样检测。观察荧光值的时间轨迹，收集数据，拟合热泳动剂量-响应曲线，计算亲和力Kd值。

实验结果：分析收集数据，获取ALDOA蛋白与本发明实施例1和6所得蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物的Kd分别为3.67μM(结合曲线见图2)和2.28μM。以上表明本发明所得蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物与ALDOA蛋白有显著的亲合作用。

实施例10：本发明多糖对ALDOA蛋白的特异性结合作用

采用表面等离子共振(SPR)法测定本发明蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物(以实施例1和6所得样品为例)与ALDOA和ALDOB蛋白的结合能力。方法如下：

1)开机和清洗：按照标准程序，在OpenSPR仪器上安装COOH传感芯片。运行PBS缓冲液(pH7.4)，达到信号基线后，分别注入80％的异丙醇、ddH₂O进行排气泡，达到基线后，缓冲液冲洗样本环，注入10mM的HCl清洗芯片表面，运行1min。

2)配体和芯片的偶联：减慢缓冲液流速至20μl/min。取100μl EDC和100μl NHS混合注入到仪器中。与传感器相互作用5min。待相互作用结束，用PBS冲洗上样口并用空气排空。用激活缓冲液稀释用于固定的配体蛋白ALDOA或ALDOB，浓度为30μg/mL，体积为200μl。稀释后立即将配体注入仪器。在EDC/NHS完成抽吸后，用缓冲液冲洗上样口并用空气排空，注入250μl封闭液。冲洗和清除样品回路。通过比较EDC/NHS活化前与闭锁后的信号，测量配体结合量。

3)相互作用的检测：稀释样品至100nM，注入200μl到仪器中，作用5min。根据信号强弱调整分析物浓度，直至探索到适宜的样品浓度。与ALDOA结合实验以探索到的适宜的浓度10μM为基准，制备100μM、50μM、10μM、1μM浓度的样品溶液。与ALDOB结合实验以探索到的适宜的浓度250μM为基准，制备1mM、500μM、250μM、100μM浓度的样品溶液。分别注入仪器，相互作用5min，进行检测。每个浓度检测完毕后，需要使用10mM的盐酸进行清洗。

4)再生将流速调到150μl/min，注入再生缓冲液初始化配体表面。将流速调到20μl/min，注入高浓度的样品以确认配体活性，并确认表面的近似的最大结合能力。清洗及排空样本环。调整流速为150μl/min，注入250μl再生缓冲液以去除分析物。

实验结果：SPR验证本发明蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物与ALDOA结合的Kd值分别为9.76μM和3.78μM；与ALDOB结合的Kd值分别为2.42mM和392μM。Kd值越小，亲和力越大，可见中药蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物与ALDOA的亲和力显著高于ALDOB，表明中药蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物对ALDOA有特异性亲合作用。

实施例11：本发明多糖对ALDO酶活性的影响

采用ALDO酶活性测定试剂盒测定本发明蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物(以实施例1和6所得样品为例)对ALDO酶活性的影响。方法如下：

1)样品准备：肝癌细胞SMMC7721接种到多个60mm细胞培养皿，待细胞贴壁后，换为含有10mM葡萄糖和不同浓度中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物的完全培养液，其浓度分别为0、1、3、10μM。加药48h后，按照ALDO酶定量检测试剂盒说明书，弃去培养液，加入3ml清理液，覆盖生长表面，弃去清理液，用细胞刮小心将细胞刮下收集，加入3ml清理液混匀细胞，转入预冷的离心管后4℃离心，弃去上清，加入500μl裂解液，混匀震荡15s，冰上裂解30min。4℃离心，吸取上清至新的离心管，进行蛋白定量，调整上清蛋白浓度为4mg/mL。

2)样品测定：96孔板每孔吸取195μl缓冲液，25μl底色液，25μl反应液，室温孵育3min，分别加入5μl阴性液或5μl待测样品，轻轻摇动96孔板，立即放入酶标仪检测(340nm)。背景/样品读数＝0分钟读数-5分钟读数。

实验结果：中药蛴螬葡聚糖可剂量依赖性地抑制SMMC7721细胞ALDO酶的活性，1、3、10μM的中药蛴螬葡聚糖对ALDO酶的抑制率分别为15.55±0.35％、30.71±1.47％、63.02±3.21％；其硫酸酯化衍生物对ALDO酶的抑制率分别为18.24±0.89％、27.09±2.18％、59.65±4.06％。

实施例12：本发明多糖对癌细胞增殖的抑制作用

采用MTT法测定本发明蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物(以实施例1和6所得样品为例)对不同癌细胞增殖的影响。方法如下：

1)细胞铺板：取对数生长期的人肝癌细胞HepG2、MHCC-97L、SMMC-7721、肺癌A549，结肠癌SW480细胞经胰酶消化后重悬为2～4×10⁴/ml的单细胞悬液，每孔接种100μl细胞悬液，放入培养箱培养。设置空白组(不接种细胞)、对照组(加不含药培养液，接种细胞)和多个实验组(加不同浓度的蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物培养液，接种细胞)，每组设8个平行孔。

2)细胞给药：细胞培养过夜后，确认细胞贴壁良好，吸掉原来的培养液，换为含0、0.3、1、3、10、30和100mg/L不同浓度蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物的培养液，培养48h。

3)吸光度值测定：每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，继续培养4h，弃上清，加入二甲基亚砜150μL，振荡10min后于酶标仪上测490nm吸光值。

4)数据处理：根据公式计算蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物对细胞增殖的抑制率：抑制率(％)＝(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100％。

实验结果：见表1，中药蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物对不同肿瘤细胞均有一定的体外直接增殖抑制作用。

表1 蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物对不同肿瘤细胞的增殖抑制率

实施例13：本发明多糖对裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

采用裸鼠皮下移植瘤模型测定本发明蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物(以实施例1和6所得样品为例)对肿瘤的体内抑制作用。方法如下：

1)细胞培养：人肝癌细胞SMMC-7721于37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养。

2)荷瘤裸鼠模型的建立：将1)中肝癌细胞SMMC-7721培养至所需的数目时，用胰酶消化并离心收集细胞，用PBS制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁷个/mL。用1mL无菌注射器取0.2mL人肝癌细胞悬液接种裸鼠右背部皮下。

3)实验分组及给药：待瘤块长到100～300mm³大小时开始给药。将18只荷瘤小鼠按瘤块大小随机分成3组(n＝6)：空白对照组，给予无菌生理盐水，0.2mL/只；蛴螬葡聚糖，50mg/kg；蛴螬葡聚糖硫酸酯，20mg/kg。每组给予腹腔注射处理6次/周，共4周。

实验结果：3组荷瘤小鼠瘤体质量、初始和结束时瘤体积及抑瘤率如表2所示，蛴螬葡聚糖抑瘤率达49.64％，蛴螬葡聚糖硫酸酯抑瘤率60.56％，同时两种药物治疗组均未表现出明显的毒副作用。

表2 蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物对裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率

实施例14：本发明多糖降血糖的作用

实验方法：Balb/c小鼠(雄性，体重18～22g)适应喂养5天，禁食12h后，模型组和治疗组动物注射链脲佐菌素150mg/kg(用pH4.5的柠檬酸钠溶液配制)，正常对照组注射相同体积柠檬酸钠溶液。72h后，尾部动脉取血测定血糖，血糖大于11.1mmol/L认为造模成功。选取造膜成功的小鼠18只，随机分3组，即模型组、实施例1得到的蛴螬葡聚糖50mg/kg和实施例6得到的蛴螬葡聚糖硫酸酯20mg/kg治疗组；另设正常对照组(6只小鼠)。试验中采用给受试动物腹腔注射的给药方法，每2天给药一次。正常组和模型组给予生理盐水作对照。自由进食、饮水。实验周期4周，每周尾静脉采血，测空腹血糖。实验第4周末，小鼠腹主动脉采血，测定血清胰岛素水平。

实验结果：结果见表3。糖尿病模型小鼠的血糖含量明显高于正常组小鼠的血糖含量；与模型对照组比较，4周时，蛴螬葡聚糖给药组小鼠的血糖含量是模型对照的55.0％，蛴螬葡聚糖硫酸酯给药组小鼠的血糖含量是模型对照的82.3％，降糖效果显著。

表3 蛴螬葡聚糖及其硫酸酯化衍生物对糖尿病小鼠血糖含量的影响

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.中药蛴螬葡聚糖，其分子量为1～4×10⁴Da，单糖组成为葡萄糖，糖含量大于90％。

2.中药蛴螬葡聚糖，其通过包括以下步骤的方法制备而成：

(4)除色素：将上述水溶液除色素，除色素后的水溶液浓缩；

3.根据权利要求2所述的中药蛴螬葡聚糖，其特征在于，其通过包括以下步骤的方法制备而成：

4.根据权利要求3所述的中药蛴螬葡聚糖，其特征在于，其通过包括以下步骤的方法制备而成：

5.中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物，其采用氯磺酸-吡啶法合成，制备方法包括以下步骤：

(2)蛴螬葡聚糖混悬液制备：将权利要求1～4所述的蛴螬葡聚糖分散在其重量10～200倍的无水N，N-二甲基甲酰胺或DMSO中，室温搅拌5～120min至均匀的混悬液；

6.根据权利要求5所述的中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

(2)蛴螬葡聚糖混悬液制备：将权利要求1～4所述的蛴螬葡聚糖分散在其重量20～150倍无水N，N-二甲基甲酰胺或DMSO中，室温搅拌15～60min呈均匀的混悬液；

(4)纯化：将上述反应混合液冷却至室温，置总溶液体积的1～3倍水中溶解、1～3mol/LNaOH调节溶液pH至中性，加3～4倍体积无水乙醇沉淀，4℃放置4～24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于水中，透析48～72h，透析袋内液过滤，滤液减压浓缩后，冷冻干燥得中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物。

7.权利要求1～4所述的中药蛴螬葡聚糖或者权利要求5～6所述的中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物在制备醛缩酶A抑制剂的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，为所述中药蛴螬葡聚糖或其硫酸酯化衍生物作为醛缩酶A抑制剂在制备预防和/或治疗癌症、糖尿病及其并发症、肥胖及其相关代谢疾病、病毒性脑膜炎、关节炎、心肌肥厚的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症包括但不限于：肝癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、白血病、胆管癌、宫颈癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤；

所述糖尿病及其并发症包括但不限于：糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高血压、糖尿病眼病、糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病血管病、糖尿病皮肤病、糖尿病性神经病；

10.一种药物组合物，其包含权利要求1～4所述的中药蛴螬葡聚糖或者权利要求5～6所述的中药蛴螬葡聚糖硫酸酯化衍生物以及药学上可接受的辅料。