CN109718232A

CN109718232A - 一种间苯三酚化合物bf-2在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用

Info

Publication number: CN109718232A
Application number: CN201910141539.1A
Authority: CN
Inventors: 严明; 汪豪; 蔺小兵; 安晓飞; 张陆勇
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-05-07
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN109718232B

Abstract

本发明涉及抗类风湿性关节炎领域，具体为一种间苯三酚化合物BF‑2在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，本发明首次发现BF‑2具有抗类风湿关节炎活性，并从体内外实验做了验证，拓宽了该化合物的临床应用。

Description

一种间苯三酚化合物BF-2在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及BF-2对白三烯B4受体-1(BLT1)拮抗剂的抗类风湿性关节炎用途。

背景技术

白三烯B4受体-1(BLT1)是一种重要的G蛋白耦联受体(GPCR)，高表达于中性粒细胞，也表达于巨噬细胞，平滑肌细胞，内皮细胞，活化的T细胞和肥大细胞等免疫细胞。炎性脂质LTB4是一种脂质介质，来源于质膜中的花生四烯酸，其能够与受体BLT1结合，诱导免疫细胞向炎症部位迁移，然后脱颗粒。

类风湿性关节炎(RA)，是一种慢性、进行性、多发性、侵袭性的炎症性自身免疫疾病，主要影响滑膜关节，其特征是炎性细胞浸润到关节中，免疫系统攻击多个环节，导致软骨和骨质破坏。如果没有得到有效的治疗，将会导致不可逆的关节破坏，导致严重残疾，心血管风险增加等。目前，用于治疗RA的药物和疗法多种多样，如非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素及中药制剂和生物制剂等，但是对许多患者仍然没有达到良好的效果，并且使感染风险增加，因此开发新的靶点药物和疗法对于治疗类风湿关节炎具有重要意义。

动物模型解剖性关节炎的致病机制研究表明LTB₄和BLT1在小鼠炎症性关节炎发病机制中具有关键作用，并且研究表明RA患者血清，滑液和滑膜组织中LTB₄水平显著升高。研究表明BLT1基因敲除的动物能够完全抵制关节炎。几家制药公司已经开发的BLT1抑制剂(CP-105696，LY29311a和CGS25019C)能够治疗和改善关节炎。因此，阻断LTB₄-BLT1 信号是一种治疗RA的重要策略，使用BLT1抑制剂对治疗类风湿性关节炎具有重要意义。所以建立BLT1拮抗剂筛选模型对治疗类风湿性关节炎等免疫相关性疾病具有重要意义。

桃金娘科植物岗松(Baeckea frutescen L.)，为我国岭南地区民间常用中药，用于治疗急性胃肠炎、风湿性关节炎、滴虫性阴道炎、毒蛇咬伤等炎症性疾病，疗效确切。岗松枝叶富含挥发油、萜类、间苯三酚衍生物、黄酮、环戊烷衍生物等，其中间苯三酚衍生物为主要成分。间苯三酚衍生物类成分结构多变、骨架新颖，并具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗HIV等，近年来已成为国际热点研究方向，但有关间苯三酚衍生物的BLT1抑制活性尚未见报道。

发明内容

本发明是以中国岭南民间药用植物岗松(Baeckea frutescens L.)为原料，经溶剂提取和多种色谱方法分离纯化得到目标单体化合物。通过核磁共振氢谱、碳谱和质谱分析，确定该化合物的结构，命名为BF-2，其化学结构如式I所示：

化学名：5,7-dihydroxy-8-(1-(2-hydroxy-4-methoxy-3,3,5-trimethyl-6-oxocyclohexa-1,4-dien-1-yl) -2-methylpropyl)-6-methyl-2-phenylchroman-4-one

间苯三酚类化合物(BF-2)的理化常数及波谱数据如下：

淡黄色结晶性固体，易溶于氯仿、甲醇；香草醛-浓硫酸反应显黄色～橘红色；ESI-MS m/z:505 [M-H]-,507[M+H]+，分子式为C30H34O7。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:12.30,12.40, 11.23,11.14(1H×4,s,7'-OH)；12.32,12.32,12.33,12.37(1H×4,s,5'-OH)；7.81,7.87,8.51, 8.47(1H×4,s,5-OH)；3.87,3.86,3.86,3.84(3H×4,s,3-OMe)；2.08(3H×4,s,6'-Me)；0.73, 0.72,0.82,0.88(3H×4,d,J＝6.0Hz,Me-9)；0.74,0.74,0.72,0.77(3H×4,d,J＝6.0Hz, Me-10)；1.90(3H×4,s,Me-11)；1.28,1.22,1.27,1.30(3H×4,s,Me-12)；1.25,1.31,1.26,1.21 (3H×4,s,Me-13)；3.18,3.21,3.28,3.18(2H×4,dd,J＝17.0,12.0Hz,H-3'a)；2.86,2.78,2.77, 2.78(2H×4,dd,J＝17.0,3.0Hz,H-3'b)；5.44(1H×4,dd,J＝13,3Hz,H-2')；3.49,3.52,3.93, 3.94(1H×4,d,J＝11.0Hz,H-7)；3.11(1H×4,m,H-8)。13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:191.6, 191.8,191.9,191.4(C-1)；194.8,194.7,195.3,195.1(C-4')；116.6,116.6(C-2)；174.4,174.2 (C-3)；174.4,174.5(C-5)；113.0,113.1(C-6)；39.7,39.6(C-7),26.2,26.4,27.2,27.6(C-8)； 22.0,21.7,21.9,22.1(C-9)；22.2,22.1,21.8,22.0(C-10)；10.3,9.8(C-11)；24.0,23.8,23.9, 23.4(C-12)；23.7,23.6(C-13)；81.5,80.5,81.9,81.1(C-2')；43.3,43.1,42.8(C-3')；160.6, 160.4(C-5')；107.7,107.8(C-6')；164.4,164.2,164.7(C-7')；107.9,108.1,108.2(C-8')；156.1, 155.7,155.6(C-9')；101.8,101.7,102.2,101.9(C-10')；129.2,129.1(C-3",5")；126.8,127.1,126.6(C-2",6")；129.7,129.6,130.0(C-4")；61.9,61.8(3-OMe)；43.7,43.6,43.5(C-4)；7.4,7. 7(6'-Me).

本发明采用白三烯B4受体-1(BLT1)高通量筛选模型，通过功能性验证寻找先导化合物，发现了BLT1拮抗剂BF-2，为新型的抗类风湿性关节炎开发提供先导化合物。本发明可为此类临床抗抗类风湿性关节炎治疗药物的开发提供先导化合物，为新型抗类风湿性关节炎药物开发提供线索和实验依据。

本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染白三烯B4受体-1(BLT1)，建立BLT1靶向拮抗剂高通量筛选模型，初筛，复筛，构效关系分析，得到具有抗类风湿性关节炎作用的候选药物。具体步骤如下：

步骤一：建立白三烯B4受体-1(BLT1)高通量筛选模型。

步骤二：通过阳性药验证模型。

步骤三：使用白三烯B4受体-1(BLT1)高通量筛选模型对化合物进行BLT1拮抗剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。

步骤四：进行体内实验验证。

有益效果

本发明首次发现BF-2具有抗类风湿性关节炎作用，是BF-2的新用途，扩大了临床应用。

附图说明：

图1：LY293111量效曲线

图2：化合物BF-2量效曲线

图3：实施例3对类风湿关节炎小鼠足趾肿胀的实验结果

图4：BF2对类风湿关节炎小鼠足趾肿胀的影(Mean±SEM，n＝5)

具体实施方式

BF-2购自成都普瑞法。

实施例1白三烯B4受体-1(BLT1)活性筛选

实验材料

(1)完全培养：(Ham‘s F 12nutrient medium；10％FBS；100U/mL Penicillin；100μg/mL Streptomycin。

(2)选择培养：2μL/mL Hygromycin。

(3)Stimulation Buffer(SB)：含1mM IBMX的F12。

(4)主要仪器：CO₂培养箱；384孔板；Paradigm^TM Detection Platform。

(5)细胞株：CHO-K1/Ga15/BLT1。

实验步骤

1.细胞培养

(1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80％，达到对数生长期。

(2)弃去培养基后用1mL PBS冲洗细胞一次。

(3)用3mL 0.5mM EDTA消化细胞5min，然后用3mL培养基终止消化。

(4)1000rpm离心5min。

(5)弃去上清液后用适量培养基重悬细胞，对细胞计数。

(6)用培养基稀释细胞悬液，使细胞密度达到3×10⁶cells/mL，将此细胞悬液移入T25 培养瓶中，在37℃/5％CO₂环境下培养细胞。

(7)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选BLT1拮抗剂试验的CHO-K1细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mM EDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。

2.标准曲线的测定及最佳细胞数确定

(1)配制IP-one标准稀释液：将IP₁按照4倍梯度在SB中逐级稀释8个浓度，其中第一个最终反应浓度为11000nM。

(2)配制激动剂LTB₄梯度稀释液：将LTB₄按照5倍梯度在SB中逐级稀释10个浓度，其中第一个最终反应浓度为1485nM。用BLT1激动剂LTB₄刺激细胞产生IP₁，根据最终拟合曲线得到的EC₅₀和窗口值确定最佳细胞数。

(3)配制不同浓度的细胞稀释液：用IP₁ Stimulation Buffer(SB)将1.(7)中重悬好的细胞稀释为2000cells/μL、4000cells/μL、6000cells/μL。

(4)加样：a：将2.(1)中稀释好的IP₁溶液加入384白板中，每孔10μl，3个复孔； b：将2.(2)中稀释好的LTB₄溶液按每个浓度3个复孔，每孔5μl加入384孔板中，接着向其中分别加入2.(3)配制好的不同浓度的细胞稀释液5μl/孔。此时标准曲线和反应孔反应体积均为10μl。将TopSeal-A膜贴于板面并37℃孵育1h。

(5)终止试剂：用Lysis buffer(LB)将IP₁-d₂及Anti-IP₁稀释33倍，按1：1混匀平衡室温后加入各孔，每孔10μL。将384孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育1h。

(6)检测：孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm^TMDetection Platform上检测。处理数据，确定最佳细胞数(4000cells/μL)。

3.拮抗剂验证

(1)配制BLT₁拮抗剂LY293111(购自Cayman Chemical(AnnArbor,MI,USA))梯度稀释液：将LY293111按照5倍梯度在SB中逐级稀释9个浓度，其中第一个最终反应浓度为11500nM。

(2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将1.(7)中重悬好的细胞稀释为2.(6)中得到的最佳细胞浓度(4000cells/μL)。

(3)加样：将3.(1)中稀释好的LY293111溶液按每个浓度3个复孔，2.5μL每孔加入384孔板中。将3.(2)配制的细胞溶液按每孔5μL加入384孔板中。将384孔板在 500rpm下离心5s，使7.5μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育30min。

(4)将LTB₄母液稀释成2.(6)中测定的EC₈₀，每孔2.5μl加入对应的384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使14μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37℃/5％CO₂下使之孵育45min。

(5)按2.(5)配制终止试剂。向每孔加入10μL IP₁-d₂/Anti-IP₁溶液(1：1)。将384孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育1h。

(6)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm^TMDetection Platform上检测。处理数据，确定拮抗剂的IC₅₀。

4.采用摸索的最佳检测条件在稳转细胞中对BLT1拮抗剂进行初筛与复筛。处理数据，计算所筛选化合物IC₅₀。对筛选出的有效的化合物进行构效关系分析。

5.实验结果如下

实施例2研究BF2的抗类风湿性关节炎作用

1、实验材料

实验试剂：弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，甲氨蝶呤，Ⅱ型胶原，羧甲基纤维素钠(CMCNa)，化合物BF2

实验耗材：1mL注射器，20mL注射器

2、实验方法

关节炎模型诱导

胶原诱导型(CIA)：使用ICR小鼠，尾巴根部皮下注射完全弗氏佐剂(含Ⅱ型胶原，2mg/mL)免疫诱导类风湿性关节炎模型，对照组仅注射生理盐水，其他各组注射含Ⅱ型胶原的完全弗氏佐剂，体积均为100μL，在第一次免疫后7天，注射含Ⅱ型胶原的不完全弗氏佐剂(1：1)进行二次免疫。

注：选择3点注射，左后足底，尾根部及背部共计100μL，皮内注射。

动物分组及给药方法

分对照组，模型组(Model)，甲氨蝶呤MTX(1mg/kg)，BF2-H(100mg/kg)，BF2-M(50mg/kg)及BF2-L(25mg/kg)，每组5只，在第1次免疫后22天，开始给药，每天一次，连续给药8天，对照组及模型组给予等体积的CMC-Na。

足趾肿胀测量

排水法：首先在每只小鼠的关节处做一标记，其次向内径2cm的20mL注射器注入纯净水，液面与量筒最高刻度平齐。用最小刻度为0.1mL的1mL注射用针管吸取注射器内的纯净水约1mL。再把小鼠足跖缓缓伸入注射器内，使标记与注射器最高刻度平齐。再用已吸入1mL水的针管向注射器内慢慢注入水液，使液面再次与最高刻度及标记平齐。从1mL注射器上的刻度处读出其内部剩余液体体积，即为小鼠的足趾体积，重复2次取其均值。

4、实验结果

小鼠足趾肿胀的比较，在第1次造模后7天，观察到各组与对照组相比，足趾明显增厚且关节红肿，之后部分小鼠炎症症状有所缓解。第7天二次免疫之后，在第14-22天观察到更加严重的红肿及部分小鼠足趾出现溃烂，且关节肿胀致屈伸困难。第22天给药之后4天，给予治疗药组足趾肿胀明显下降，与模型组相比呈显著性差异(P<0.01，P<0.001)；给药8天后，BF2中剂量和低剂量组足趾肿胀更加显著(P<0.001)，但与MTX相比，无显著性差异。具体实验结果见表1，见图3和图4。

表1 BF2对类风湿关节炎小鼠足趾肿胀的影响(Mean±SEM，n＝5)

注：与Control相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与Model相比，##P<0.01，###P<0.001 。

Claims

1.一种间苯三酚化合物BF-2在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，所述的化合物BF-2的结构式如下：