CN101919839A - 芒果苷钙盐作为ampk激动剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种芒果苷钙盐制备AMPK激活剂的用途。所述芒果苷钙盐结构式如下。

Description

芒果苷钙盐作为AMPK激动剂的用途

技术领域

本发明涉及一种芒果苷钙盐作为AMPK激活剂的用途。

背景技术

磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种在细胞内行使能量代谢调节的蛋白激酶。众多研究已证实，AMPK影响糖、脂肪及蛋白质代谢，AMPK在糖尿病及肥胖症等人类代谢性疾病的发病中发挥至关重要的作用。最近研究还发现，AMPK基因突变可导致心肌肥大及心律失常。在心肌及血管平滑肌受缺血/缺氧或心血管活性物质刺激时，AMPK激活还能通过影响细胞周期及物质代谢抑制细胞增殖，在高血压及动脉粥样硬化的防治中起重要作用。因此AMPK有望成为代谢性疾病及心血管疾病重要的治疗新靶点。

研究者们还认为，AMPK与衰老、AMPK与神经系统的能量代谢调控领域在未来可能会有重要突破。有实验结果初步揭示，AMPK在老年性疾病发生过程中发挥重要调控作用。此外，已有实验室着手研究AMPK在下丘脑能量代谢调节中是否也扮演着关键角色。

AMPK激活剂AICAR可抑制致炎细胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS等)的表达、减轻NF-κB的激活等研究结果显示出AMPK在细胞前炎性调节过程中的作用，提示AMPK系统是一个新型的抗炎信号途径，AMPK的活化在治疗炎症性疾病中具有重要价值。

AMPK对于肿瘤细胞的基本物质代谢及能量代谢具有十分重要的意义，它的激活可以阻止肿瘤细胞的物质合成和生长。有文献报道AMPK还能诱导细胞凋亡。陈奇等报道AMPK的激活可能下调COX-2的表达，并可能提高以5-氟尿嘧啶治疗为基础的结肠癌的化疗敏感性。

AMPK与运动的关系亦显示出AMPK激活剂在肌肉系统疾病及作为运动替代方面的潜力。

综上，AMPK激活剂的研究开发具有重要的临床意义，但目前尚未有上市的AMPK激活剂【李忌.AMPK：糖尿病与心血管疾病治疗新靶点.中国医学论坛报，2009，(1149)；任俊芳.AMPK与心血管重构.国际病理科学与临床杂志，2008，28(1)：33-36；Ricardo Lage，Carlos Dieguez，Antonio Vidal-Puig.et al.AMPK：a metabolic gauge regulating whole-body energy homeostasis.Trends MolMed，2008，14(12)：539-49；符庆瑛，高钰琪.蛋白激酶AMPK的研究进展.生命科学，17(2)：147-152；陈奇，梁后杰，邹岚，等.一磷酸腺苷活化蛋白激酶对环氧合酶-2表达与5-氟尿嘧啶治疗结肠癌敏感性的关系.实用医院临床杂志，2008，5(3)：56-58等】。

Dolores Giro′n等报道芒果苷(mangiferin)可提高AMPK磷酸化【

Dolores Giro′n，Natalia Sevillano，Rafael Salto，et al.Salacia oblongaextract increases glucose transporter 4-mediated glucose uptake in L6 rat myotubes：Role of mangiferin.Clinical Nutrition(2009)：1-10】。

芒果苷化学结构如下：

发明内容

虽有关于芒果苷提高AMPK磷酸化的报道，但仅一篇，且本发明人所发明的化合物芒果苷钙盐(结构式如下)是否同样具有该作用却不得而知。

另外，本发明人在对上述芒果苷钙盐的作用靶点的研究过程中，发现芒果苷与芒果苷钙盐不但皆具有促进AMPK磷酸化的活性，而且产生以下几点意想不到的结果：

1、芒果苷钙盐对AMPK的激活活性高于芒果苷。

2、在与AMPK相关的几种具代表性的疾病模型中，芒果苷钙盐具有相应的药理活性，且活性高于芒果苷。

为此，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种芒果苷钙盐在制备AMPK激活剂中的应用。

本发明提供一种芒果苷钙盐在制备AMPK激活剂中的应用。其特征在于：所述芒果苷钙盐具有以下结构式：

鉴于现代医学对AMPK在疾病发生发展中所起重要作用的揭示，本发明所提供的芒果苷钙盐在制备AMPK激活剂中的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于预防或治疗下述疾病中的任何一种或几种：糖尿病、糖尿病各种慢性并发症(包括糖尿病性心脏病、2型糖尿病并发脑梗塞、2型糖尿病并发非酒精性脂肪肝、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病性周围神经病变等)、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、X综合征、心肌肥大、心律失常、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心力衰竭、高血压、上呼吸道感染、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、肝炎、脂肪肝、酒精肝、肝纤维化、肝硬化、前列腺炎、胰腺炎、肾炎、肾病综合征、慢性肾功能不全、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨性关节炎、炎症性肠病、阿尔茨海默氏病、记忆障碍、梗塞性痴呆、帕金森氏症、肿瘤(包括肿瘤放疗、化疗不敏感；肿瘤放疗、化疗产生的毒性反应)、肌肉萎缩、肌肉无力症。

本发明所提供的芒果苷钙盐在制备AMPK激活剂中的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于运动替代。

本发明提供的芒果苷钙盐用作AMPK激活剂的有效剂量范围为0.05-10mg/kg/日/人，优选用量为0.5-2mg/kg/日/人。以上用量是根据体外试验及动物实验结果推算的，因动物与人体之间的差异，各种疾病之间的差异、体内外差异，故允许实际临床应用剂量有所调整。用法可根据具体疾病进行选择，各种给药途径皆可。

下面给出具体实施方式对本发明作进一步说明，但不限于此。

附图说明

图1芒果苷钙盐对肿瘤细胞毒性的影响。纵坐标为细胞死亡率(％)。(注：与单独给药组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01)

图2芒果苷钙盐(20mg/kg)与芒果苷(40mg/kg)对KK-ay小鼠胰岛素敏感指数与血脂等的影响(注：与模型组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)

图3芒果苷钙盐(20mg/kg)与芒果苷(40mg/kg)对KK-ay小鼠肝酶的影响(注：与模型组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01)

图4芒果苷钙盐对痴呆大鼠学习记忆力影响。纵坐标为潜伏期(EL)。(注：与模型组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01)

图5芒果苷钙盐对类风湿性关节炎模型大鼠的影响。(注：与模型组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01)

具体实施方式

本发明所述的芒果苷可以采用市售品(具有相应提取设备的厂家均可以生产，如广西昌洲天然产物开发有限公司)，亦可以由知母或芒果叶等植物中提取分离后得到。碳酸钠、氯化钙、乙醇等均采用市售品。芒果苷对照品(供含量测定用)由中国生物制品所提供。

实施例1：芒果苷的制备

100kg知母饮片加80％乙醇回流提取两次，每次1小时，减压回收乙醇，大孔树脂吸附，水洗后，用20％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得粗品新芒果苷；再用40％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得粗芒果苷。粗品芒果苷经重结晶精制获得芒果苷纯品，芒果苷样品经与芒果苷对照品进行鉴别，确定所获得样品为芒果苷，纯度经HPLC测定大于95％。

实施例2：芒果苷钙盐的制备

按照本发明人申请的专利【PCT/CN2008/001008】中所载制备方法皆可制备芒果苷钙盐。本处仅提供一种方法用以说明芒果苷钙盐的获得。

在反应器中加入芒果苷42.2g(0.1mol)、水100ml、乙醇900ml充分混悬，将碳酸钠5.30g(0.05mol)加水制成0.1％(w/v)溶液，缓慢加入搅拌状态的混悬液中，反应至澄清，过滤，向溶液中加入丙酮适量，充分搅拌，有大量沉淀析出，静置，抽滤，固体物低于60℃干燥，得淡黄色固体芒果苷钠盐34.5g，收率为81.7％。样品纯度经HPLC测定为95％。

将芒果苷钠盐4.44g(0.01mol)水1500ml制成的水溶液，将无水氯化钙0.44g(0.004mol)加水100ml制成溶液，在搅拌状态下缓慢滴加氯化钙溶液，使产生沉淀，滴加完毕继续搅拌，使反应完全，4℃冷藏3小时以上，过滤，固体物低于60℃干燥，得淡黄绿色固体芒果苷钙盐3.07g，收率为69.2％。经HPLC测定纯度大于98％。

为了说明发明内容中所述芒果苷钙盐的药理活性，本发明人采用体内外相结合、以具代表性的疾病模型作为各类疾病代表的方式进行实验研究。即用体外方式研究芒果苷钙盐对AMPK磷酸化的影响及对肿瘤细胞的化疗增敏作用；又分别以KK-ay小鼠、类风湿性关节炎大鼠、阿尔茨海默氏病大鼠来代表糖脂代谢紊乱性疾病、自身免疫疾病、神经变性疾病。以期说明芒果苷钙盐作为AMPK激活剂、用以治疗各种疾病的可行性。详细阐述如下：

试验例1：芒果苷钙盐对AMPK激活作用

1、材料

按实施例2制备芒果苷钙盐，按实施例1制备芒果苷，二者皆以DMSO溶解。临用前以培养基或HBS缓冲液稀释。DMSO终浓度≤0.2％。

L6细胞购自ATCC。高糖DMEM培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自Hyclone公司。抗AMPK兔源多克隆抗体、抗ACC兔源多克隆抗体、抗AMPK苏氨酸172位点磷酸化兔源多克隆抗体、抗ACC丝氨酸79位点磷酸化兔源多克隆抗体购自Cell Signal Technology公司。

2、实验方法

2.1细胞培养与分化：

分化前的L6细胞用高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清，100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，置于含有的5％CO2的培养箱内37℃培养。L6细胞的分化是在细胞长满60％左右时，换成含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基，每两天更换一次培养基，直到L6细胞分化至90％左右。

2.2化合物处理及样品收集：

先将6孔板中的细胞在无血清的高糖DMEM培养基中饥饿。受试物以不同的浓度梯度加到无血清的高糖DMEM培养基中，DMSO含量0.2％。受试物与细胞孵育3h，然后，用冰冷的1×PBS洗2次，加入200μl 1×SDS电泳缓冲液(50mMTris·HCL，100mM DTT，2％电泳级SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)裂解细胞10min。收集裂解液，超声15秒钟，在100℃煮样品10min。

2.3免疫印迹检测：

裂解液经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，再在转膜仪中以100V，1-2h转移到PVDF膜上。将凝胶中的蛋白质半干转移到硝酸纤维薄膜上，丽春红S(Ponceau S)确定条带。在封闭液(3％脱脂奶粉，0.1％Tween，TBS溶解)中封闭1小时，加入1∶1000稀释一抗4℃过夜，TBS洗涤3×15min，加入1∶1000稀释二抗，室温孵育1小时，TBS洗涤3×15min，置于ECL中冲洗5-10min，用X光片压片显影。

3、结果

结果表明：芒果苷与芒果苷钙盐皆显著增强了AMPK磷酸化水平，同时显著增强ACC磷酸化水平，芒果苷起效浓度为2μmol/L，芒果苷钙盐为0.5μmol/L，可见芒果苷钙盐活性高于芒果苷。

试验例2：芒果苷钙盐对肿瘤细胞的化疗增效作用

1、材料：

按实施例2制备芒果苷钙盐(MGG)。顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、紫杉醇(TAXOL)由市场购得。实验样品者皆用DMSO溶解后使用。

2、分组：

阴性对照组为DMSO组、芒果苷钙盐组(5μg/ml)、顺铂组(1μmol/L)、阿霉素组(1μmol/L)、紫杉醇组(1μmol/L)、芒果苷钙盐(5μg/ml)+顺铂组(1μmol/L)、芒果苷钙盐(5μg/ml)+阿霉素组(1μmol/L)、芒果苷钙盐(5μg/ml)+紫杉醇组(1μmol/L)。

3、实验方法：

将体外培养的人肝癌Bel-7402细胞系，按照10³-10⁴/孔，每孔200μl接种到96孔细胞培养板中，24小时后加入各受试物，其中加入两个样品的组别，需在加入芒果苷钙盐后与细胞共同培养3h后，再加入顺铂或阿霉素或紫杉醇，培养72h，然后采用四氮唑盐还原法(MTT法)检测细胞毒性。试验重复两次。

4、结果：

芒果苷钙盐联合顺铂或阿霉素或紫杉醇组的细胞毒性显著高于单独应用顺铂或阿霉素或紫杉醇组。表明芒果苷钙盐对化疗具有增加其细胞毒作用(见附图1)。

试验例3：芒果苷钙盐对KK-ay小鼠的影响

1、药物：

按实施例2制备的芒果苷钙盐，按实施例1制备芒果苷，二者皆用3‰羧甲基纤维素钠混悬后使用。盐酸罗格列酮为浙江万马药业有限公司生产。

2、动物：

雄性KK-ay小鼠，16周龄。IVC笼具饲养，每笼2只，温度22℃。

3、分组及给药

将KK-ay小鼠随机分为8组，即模型组(n＝10)，芒果苷低剂量组[20mg/kg，n＝10]，芒果苷中剂量组[40mg/kg，n＝10]，芒果苷高剂量组[80mg/kg，n＝10]，芒果苷钙盐低剂量组[20mg/kg，n＝10]，芒果苷钙盐中剂量组[40mg/kg，n＝10]，芒果苷钙盐高剂量组[80mg/kg，n＝10]，二甲双胍组[500mg/kg，n＝10]。每日固定时间以灌胃给药的方式进行。空白组给予等量的生理盐水。共给药30天。

4、观察指标

血糖与血脂：试验结束时采血标本，血糖(mmol/L)、血脂[包括甘油三酯(TG，mmol/L)、胆固醇(TC，mmol/L)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL，mmol/L)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL，mmol/L)]、丙氨酸转氨酶(ALT，U/L)、天门冬氨酸转氨酶(AST，U/L)采用GF-D800型半自动生化分析仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司生产)检测。

胰岛素：放射免疫法，γ计数器计数，胰岛素放免分析试剂盒，山东潍坊市三维(3V)生物公司生产。

胰岛素敏感指数(ISI)计算：ISI＝Ln(1/FPG×1/INS)。

尿微量白蛋白：于代谢笼中收集24h尿液并记录尿量，尿液离心取上清-80℃保存备用。随意尿于每周周一13:00用提尾反射法收集。采用竞争ELISA法检测尿微量白蛋白，计算尿白蛋白排泄率(尿白蛋白排泄率＝尿微量白蛋白浓度(mg/L)×尿液的总量(ml)/收集总量的时间(分钟)＝μg/分钟，UAER)，图中单位以mg/24h表示。

5、统计学分析：

计量资料值以均数标准差

表示。两组间比较采用t检验。

6、结果

芒果苷钙盐20mg/kg即能显著改善KK-ay小鼠的血糖、血脂、胰岛素、尿白蛋白排泄率、肝酶等各项指标，显著提高胰岛素敏感指数。而芒果苷40mg方能显著改善上述指标。可见芒果苷钙盐较芒果苷起效剂量降低，活性增强(见附图2、3)。

试验例4：芒果苷钙盐对痴呆大鼠的活性作用

1试验材料

1.1动物：

SD雄性大鼠，SPF级，体重250～300g，自由饮水进食，实验前在实验环境中适应2-3d，实验室温度控制在25℃，相对湿度为40％-80％。

1.2药品、试剂及设备：

芒果苷钙盐：按制备例方法制备。

凝聚态β淀粉样肽1～40片段(A_β1-40)：购自美国Sigma公司。

实验动物脑立体定位仪(SN2型)：为日本成茂公司产品。

水迷宫：中国医学科学院药物研究所研制。

2分组与给药

将SD鼠随机分为5组，每组10只，具体如下：(1)假手术对照组：即海马内注射等量生理盐水；(2)A_β1-40处理模型组；(3)芒果苷钙盐低剂量组(5mg/kg，简称MGGL组)；(4)芒果苷钙盐中剂量组(10mg/kg，简称MGGM组)；(5)芒果苷钙盐高剂量组(20mg/kg，简称MGGH组)。

给药方法：各组动物于造模前一周开始灌胃给药，每天1次，连续4周。迷宫训练期间，于训练前0.5h给药。

3试验方法

3.1A_β1-40诱导大鼠AD样病变模型的制备：

应用凝聚态β淀粉样肽1～40片段(A_β1-40)注入大鼠海马内建立AD样病变的动物模型。具体如下：

SD大鼠经麻醉后于立体定位仪下以A_β1-40行双侧海马内注射，每侧各1μl(预先将A_β1-40溶于无菌生理盐水10μg/μl，用前37℃下孵育1周)。注射部位为：前囟后3.5mm，脑正中线旁开2.0mm，其深度为2.7mm。

3.2观察指标与方法

空间学习记忆力测试：采用Morris水迷宫法。平台设于迷宫东北象限正中，水平面高出平台1.5cm，水温保持在19℃～20℃，大鼠连续训练5d，每天2次，设定最长游动时间为70s，以秒表记时，记录大鼠找到平台所需时间(潜伏期，EL)。

4.结果：

随训练天数增加，各组大鼠平均EL逐渐缩短。与假手术组比较，模型组大鼠EL明显延长，第4天开始差异显著，说明造模成功。以第5d潜伏期为例，比较实验各组的EL，结果：芒果苷钙盐中高剂量组大鼠EL皆明显缩短，表明芒果苷钙盐能显著改善A_β1-40诱导的大鼠空间学习记忆障碍(见附图4)。

试验例5：芒果苷钙盐对类风湿性关节炎动物模型的影响

1材料

Wistar大鼠，雌性，100±20g。牛源性Ⅱ型胶原蛋白(Collagen Ⅱ)，酸可溶性，美国Sigma公司产品；弗氏不完全佐剂，美国Sigma公司产品。TNF-α试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2造模

将酸溶性Ⅱ型胶原蛋白(C Ⅱ)用弗氏不完全佐剂配成C Ⅱ浓度为2.5mg/ml的乳剂，按每只大鼠100μl乳剂含C Ⅱ250μg，于右后足跖皮内注射致炎。

正常对照组：每只大鼠注射不含C Ⅱ的弗氏不完全佐剂制成的乳剂100μl。

3给药与分组

将大鼠随机分为6组，每组10只，具体如下：(1)正常对照组；(2)模型组；(3)芒果苷钙盐低剂量组(5mg/kg，简称MGGL组)；(4)芒果苷钙盐中剂量组(10mg/kg，简称MGGM组)；(5)芒果苷钙盐高剂量组(20mg/kg，简称MGGH组)；(6)阳性对照组：地塞米松磷酸钠组(0.1mg/kg，简称Dexa组)。

给药方法：初次免疫2周后开始灌胃给药，每天1次，连续4周，正常对照组与模型组给予同等体积的生理盐水。

4观察指标

4.1足肿胀度：用毛细管放大测量法测右后足体积，求出肿胀增长百分率[(给药后值-给药前值)/给药前值]×100％。

4.2细胞因子的检测：实验结束时大鼠股动脉取血，提取血清，冷藏待测。TNF-α按ELISA试剂盒说明进行检测。

5结果

芒果苷钙盐中高剂量组可显著抑制模型大鼠足肿胀与细胞因子TNF-α的分泌。表明芒果苷钙盐对类风湿性关节炎模型大鼠具有治疗作用(见附图5)。

Claims (10)

1.一种芒果苷钙盐在制备AMPK激活剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述芒果苷钙盐具有以下结构式：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于预防或治疗下述疾病中的任何一种或几种：糖尿病、糖尿病慢性并发症、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、X综合征、心肌肥大、心律失常、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心力衰竭、高血压、上呼吸道感染、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、肝炎、脂肪肝、酒精肝、肝纤维化、肝硬化、前列腺炎、胰腺炎、肾炎、肾病综合征、慢性肾功能不全、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨性关节炎、炎症性肠病、阿尔茨海默氏病、记忆障碍、梗塞性痴呆、帕金森氏症、肿瘤。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于运动替代。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肿瘤放疗、化疗不敏感；肿瘤放疗、化疗产生的毒性反应。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述糖尿病慢性并发症为糖尿病性心脏病、2型糖尿病并发脑梗塞、2型糖尿病并发非酒精性脂肪肝、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病性周围神经病变。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于预防或治疗下述疾病中的任何一种或几种：糖尿病、糖尿病慢性并发症、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、X综合征、心肌肥大、心律失常、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心力衰竭、高血压、上呼吸道感染、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、肝炎、脂肪肝、酒精肝、肝纤维化、肝硬化、前列腺炎、胰腺炎、肾炎、肾病综合征、慢性肾功能不全、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨性关节炎、炎症性肠病、阿尔茨海默氏病、记忆障碍、梗塞性痴呆、帕金森氏症、肿瘤。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于运动替代。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肿瘤放疗、化疗不敏感；肿瘤放疗、化疗产生的毒性反应。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述糖尿病慢性并发症为糖尿病性心脏病、2型糖尿病并发脑梗塞、2型糖尿病并发非酒精性脂肪肝、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病性周围神经病变。

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