CN101972291B - 沙生蜡菊花提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了沙生蜡菊花提取物及其制备方法和用途。本发明通过大量的动物试验发现:沙生蜡菊花提取物能有效降低动物肝细胞中的中性脂肪含量,还能够显著降低高血脂大鼠血中总胆固醇及甘油三酯的含量,具有降低血脂的功效。此外,沙生蜡菊花还具有抗动脉粥样硬化作用。药效学试验表明,沙生蜡菊花提取物能用于肥胖、高血脂、动脉粥样硬化及相关并发症的辅助治疗。本发明所述沙生蜡菊花提取物可以是将沙生蜡菊花用醇类物质进行加热回流后所提取得到醇提取物,加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的载体后,可将其按常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取物,尤其涉及一种沙生蜡菊花提取物及其制备方法,本发明还涉及该沙生蜡菊花提取物用于肥胖、高血脂、动脉粥样硬化及相关并发症的辅助治疗中的用途,属于沙生蜡菊花提取物的医药用途领域。
背景技术
高脂血症是指血浆中的脂类物质尤其是总胆固醇、甘油三酯的浓度超出正常的范围所引起的疾病。血脂升高主要是由于饮食不当、脏气衰减和肝肾阴虚所造成的脂肪、胆固醇等物质在体内蓄积过多所致,可导致脂肪肝、肝硬化、胆石症、周围血管疾病以及高尿酸血症。动脉粥样硬化是指动脉内膜脂质沉积、单核细胞和淋巴细胞浸润以及低密度脂蛋白被氧化、血管平滑肌细胞的迁移和增生等,形成泡沫细胞和纤维斑块,进而引起血管壁硬化、官腔狭窄和血栓的形成。主要是由于环境因素与遗传因素相互作用的多因素、多基因表达异常所致。动脉粥样硬化是心及脑血管疾病的主要病理学基础,可导致冠心病、脑溢血、心肌梗塞等一系列心脑血管系统疾病。
高血脂与动脉粥样硬化之间的关系极为密切,高血脂常作为动脉粥样硬化形成的重要危险因素之一。据统计,中国目前患有高脂血症的患者已高达1.6亿,该疾病形成并发症后将会严重影响人们的生活质量,危害人类的生命健康。因此,防治高血脂及动脉粥样硬化对于防治心脑血管系统疾病及相关并发症具有重要的意义。
目前治疗高血脂及动脉粥样硬化的药物主要包括羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂、抗氧化剂及多烯脂肪酸等。其中具有代表性的他汀类、胆汁酸结合树脂类药物在降血脂及抗动脉粥样硬化方面疗效较为确切,但不可回避的是上述药物均存在不同程度的毒副作用,常可引起胃肠道、肝脏、皮肤等方面的不良反应甚至可引起肌炎和横纹肌溶解。例如德国拜耳制药公司生产的西立伐他汀钠在全球共引起52例因服用此药导致死亡的事件。此外,全世界报道因服用此药发生致死性横纹肌溶解症者共有480例,其中包括中国6例。西立伐他汀事件使人们对于调血脂药物的合理应用产生了重视,传统的西药类调血脂药疗效虽然确切但其引起的毒副作用却不容忽视。因此,进行中药防治高血脂及动脉粥样硬化的实验性研究,开发低毒、有效的调血脂药物已经成为当前的迫切需要。
经研究发现中药材沙生蜡菊花具有调血脂及抗动脉粥样硬化作用。沙生蜡菊花是菊科蜡菊属(Helichrysum Mill.)植物沙生蜡菊(Helichrysumarenarium(L.)MOENCH)的花,为多年生草本植物,广泛分布于欧洲、苏联和蒙古,在中国主要分布于新疆北部。沙生蜡菊在欧洲地区作为民间用药具有悠久历史,主要作为利胆剂、利尿剂,花的汁液能够治疗消化系统疾病,沙生蜡菊还具有抗炎作用,能用于治疗肾炎、膀胱炎、风湿病等症(Czinner,E.;Kursiinszki,L.;Baumann,D.;Hamburger,M.;Kery,A.;Szoke,E.;Lemberkovics,E.Proceedings of the Phytochemical Society of Europe,2002,47,99-109.)。文献报道其中主要的化学成分为黄酮类化合物。经文献调研,对其生物活性方面的研究报道也较多,E.Czinner等人研究发现沙生蜡菊水层冻干提取物具有抗氧化作用(Vrkoc J.,Dolejs L.,Vasickova S.,Methylene-bis-2H-pyran-2-ones and phenolic constituents from the root ofHelichrysum arenarium.Phytochemistry,1975,14,1383-1384);沙生蜡菊花的汁液能够治疗消化系统疾病,能刺激胃液分泌、调节胆囊中的胆汁分泌(Krivenko,V.V.,Potebnia G.P.,Experience in treating digestive organ diseaseswith medicinal plants.Vracebnoe Delo,1989,3,76-78);2001年,殷德孝等人申请的专利报道,将沙生蜡菊经水提醇沉制成蜡菊口服液,可用于治疗急慢性肾炎(发明名称:蜡菊口服液;公开号:CN 1395941A);中国科学院新疆理化技术研究所的阿吉艾克拜尔等人在2006年申请专利《沙生蜡菊总皂苷在药物中的应用》中表明沙生蜡菊的活性成分总皂苷可用于治疗糖尿病(发明名称:沙生蜡菊总皂苷在药物中的应用;公开号:CN1947737A)。但目前还没有开发成药物应用;巴哈尔古丽黄尔汗等人申请的专利《利胆保健茶》是以沙生蜡菊的新鲜花晒干后用于消积结石,疏肝利胆(发明名称:利胆保健茶;公开号:CN 101485373A)。
迄今为止,有关中药沙生蜡菊花及其总提物的降血脂及抗动脉粥样硬化作用未见文献和史料记载。
发明内容
本发明目的之一是提供一种中药沙生蜡菊花提取物的一种新的医药用途。
本发明目的之二是提供一种制备上述中药沙生蜡菊花提取物的方法;
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的:
本发明通过大量的动物试验发现:沙生蜡菊花提取物能有效降低动物肝细胞中的中性脂肪含量且呈一定的剂量依赖关系;沙生蜡菊花还能够显著降低高血脂大鼠血中总胆固醇及甘油三酯的含量,具有降低血脂的功效。口服沙生蜡菊总提物与空白组比较,在不影响大鼠进食量的同时,能够降低大鼠的体重增长率;沙生蜡菊花总提物及各部分能够显著性降低高血脂家兔血中TC、TG的含量,证明沙生蜡菊花总提物及各馏分具有降血脂功效。此外,沙生蜡菊花总提取物及各部分给药组动物主动脉粥样斑块面积百分比显著小于模型组动物,证明沙生蜡菊花具有抗动脉粥样硬化作用。
上述药效学试验结果表明沙生蜡菊花提取物能用于肥胖、高血脂、动脉粥样硬化及相关并发症的辅助治疗。
本发明所述的“沙生蜡菊花提取物”可以是将沙生蜡菊花用醇类物质进行加热回流后所提取得到醇提取物;其中,所述的醇类物质优选是甲醇或乙醇,更优选的,所述的甲醇是浓度为100%的甲醇,所述的乙醇优选是体积百分比为30-75%的乙醇;
本发明所述的“沙生蜡菊花提取物”也可以是将上述醇提取物进行如下处理后所得到的提取物:将醇提取物经有机萃取物质萃取脱脂分别得到有机萃取部分和水层部分;其中,所述的有机萃取物质可以是乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷等有机萃取物质;
本发明所述的“沙生蜡菊花提取物”还可以是将所得到水层部分进行如下处理所得到的提取物:水层部分经大孔吸附树脂吸附,分别以水和醇类物质洗脱,收集醇洗脱物即得;其中,所述的大孔吸附树脂优选为HP-20大孔吸附树脂;所述的醇类物质优选为乙醇或甲醇,更优选为体积百分比为90%乙醇或100%甲醇。
本发明所述的“沙生蜡菊花提取物”可以加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形剂或载体后,以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂,例如可以是注射剂(粉针、冻干粉针、水针、输液等)、片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸等;其中,所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等;所述的药学上可接受的载体是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1沙生蜡菊花提取物的制备
将沙生蜡菊干燥花用75%乙醇加热回流提取得到乙醇提取物(即:沙生蜡菊花总提取物),将乙醇提取物经乙酸乙酯萃取脱脂后,分别得到乙酸乙酯萃取物部分和水层部分;水层部分经HP-20大孔吸附树脂,分别以水和体积分数为90%乙醇洗脱,得到90%乙醇洗脱物。
实施例2沙生蜡菊花提取物的制备
将沙生蜡菊干燥花用30%乙醇加热回流提取得到乙醇提取物(即:沙生蜡菊花总提取物),将乙醇提取物经乙酸乙酯萃取脱脂后,分别得到乙酸乙酯萃取物部分和水层部分;水层部分经HP-20大孔吸附树脂,分别以水和体积分数为90%乙醇洗脱,得到90%乙醇洗脱物。
实施例3沙生蜡菊花提取物的制备
将沙生蜡菊干燥花用50%乙醇加热回流提取得到乙醇提取物(即:沙生蜡菊花总提取物),将乙醇提取物经乙酸乙酯萃取脱脂后,分别得到乙酸乙酯萃取物部分和水层部分;水层部分经HP-20大孔吸附树脂,分别以水和体积分数为90%乙醇洗脱,得到90%乙醇洗脱物。
实施例4沙生蜡菊花提取物的制备
将沙生蜡菊干燥花用100%甲醇加热回流提取得到甲醇提取物(即:沙生蜡菊花总提取物),将甲醇提取物经氯仿萃取脱脂后,分别得到氯仿萃取物部分和水层部分;水层部分经HP-20大孔吸附树脂,分别以水和体积分数为100%甲醇洗脱,得到100%甲醇洗脱物。
实施例5沙生蜡菊花提取物的制备
将沙生蜡菊干燥花用45%乙醇加热回流提取得到乙醇提取物(即:沙生蜡菊花总提取物),将乙醇提取物经二氯甲烷萃取脱脂后,分别得到二氯甲烷萃取物部分和水层部分;水层部分经HP-20大孔吸附树脂,分别以水和体积分数为90%乙醇洗脱,得到90%乙醇洗脱物。
试验例1、沙生蜡菊花各提取物对小鼠肝脏中肝细胞中脂肪含量的影响试验
一、试验材料
1、供试样品:实施例1-5所制备的沙生蜡菊花总提取物;乙酸乙酯萃取物;醇洗脱物和水层部分;
2、其它试验材料:ddy系小鼠(35~40g),雌雄不限。pH计(PHS-2ST,数显酸度计)、离心机、二氧化碳细胞培养箱(NuAir,USA),48孔培养板(Nunc,Denmark),超声仪(MISONIX,MicrosonTM Ultrasonic cell disruptor),酶标仪(Tecan,Austria),显微镜(Leica,Germany),流式细胞仪(BectonDickinson,USA)。戊巴比妥钠,HEPES((2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid),羟乙基哌嗪乙磺酸),EGTA(ethylene glycol bis(β-aminoethyleaster)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid,乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、胶原酶IV(sigma-Aldrich),FCS(胎牛血清,life technologies),Williams′E培养基(美国sigma公司),甘油酸酯,盘尼西林(life technologies)。
二、试验方法
将ddy系雄性小鼠(35~40g),用戊巴比妥钠(50mg/ml)腹腔注射麻醉(0.1ml/只),经翻正反射消失证明麻醉后,开腹,利用Seglen、Oka的胶原酶灌流法。门静脉插管后,在37℃恒温条件下用肝脏灌流液(pH 7.2,137mMNaCl;5.4mM KCl;0.34mM Na2HPO4;0.44mM KH2PO4;4.2mM NaHCO3;10mMHEPES;0.5mM EGTA;5.6mM glucose;56mM phenol red)灌流,流速为5ml/min,在2min内灌流使肝脏失血,然后用胶原酶溶液(pH 7.5,0.5mg/ml;137mM NaCl;5.4mM KCl;0.34mM Na2HPO4;0.44mM KH2PO4;4.2mM NaHCO3;10mM HEPES;0.5mM CaCl2;5.6mM glucose;56mM phenol red)交换肝脏灌流液,当肝脏开始消化的时候停止灌流,取出肝脏,得肝细胞置于含有10%FCS(胎牛血清),100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的Williams′E的培养基中,纱布滤过。
将滤液中的肝细胞离心(700rpm,1min,4℃),弃去上清液后,用10ml的培养液将细胞清洗,离心,得到的细胞置于10ml细胞培养液中培养,细胞的存活是通过台盼蓝活细胞计数实验进行确认的,将肝细胞液调成细胞密度为6.67×105cells/ml,然后将细胞接种于48孔板中,每孔150μl/well,37℃以5%CO2培养箱中培养4小时,然后将不同浓度样品的DMSO溶液在每孔添加50μl,DMSO的浓度为0.5%(v/v)。将加入待测样品的培养板置于5%CO2的培养箱中37℃培养20小时,除去上清液,每孔再加入100μl的蒸馏水,超声,使细胞破碎,然后再在每孔中加入蒸馏水100μl(计200μl/well),所得细胞破碎液中的脂肪浓度是根据标准物甘油酸酯来定量的,给药组的数值是用相对于对照组脂肪浓度的百分比来表示的,利用Dunnette法比较分析,p<0.05为显著性差异。
三、试验结果
表1沙生蜡菊花各部分提取物对小鼠肝脏中甘油三酯(TG)含量的影响
*p<0.05,**p<0.01与对照组比较
试验结果表明,与对照药物脂必妥比较,沙生蜡菊花的总提取物(即:醇提取物)在浓度≥3μg/mL时,随着药物浓度的增大,肝细胞中的中性脂肪含量呈显著降低的趋势;乙酸乙酯萃取物、醇洗脱物的浓度≥10μg/mL时,随着药物浓度的增大,肝细胞中的中性脂肪含量呈显著降低的趋势;而水层洗脱物对肝细胞中的中性脂肪含量影响不大。
参考文献
1.P.O.Seglen.Preparation of isolated rat liver cells.Methods Cell Biol.1976;13:29-83;
2.Masato Oka,Sumio Maeda,Nobumitsu Koga.et al.A modified colorimetric MTTassay adapted for primary cultured hepatocytes:application to proliferation andcytotoxicity assays.Biosci.Biotech.Biochem.1992;56(9):1472-1473.
试验例2沙生蜡菊花各部分提取物对高血脂大鼠的降脂作用试验
一、试验材料
1、供试样品:实施例1-5所制备的沙生蜡菊花醇总提取物;乙酸乙酯萃取物;醇洗脱物和水层部分;
2、其它试验材料:成年wistar雄性大鼠70只(200±20)g,购自哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心。总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒,中生北控生物科技股份有限公司;血脂康,北京维信生物科技有限公司。HITACH717全自动生化分析仪,上海安泰分析仪器有限公司;恒温培养箱BD720,德国Binder公司;高速冷冻离心机5810R,德国Eppendorf公司。
3、高血脂动物模型的制备:将实验动物适应性喂养7d后,饲喂高脂饲料(基础饲料80%,蛋黄粉15%,猪油4.5%,胆固醇0.5%),喂养25d于造模前后分别取血,测定其血清中TC、TG的含量,待血清中TC、TG含量明显高于造模前(P<0.01)时,说明高血脂动物模型制备成功。
二、供试样品对高血脂大鼠血中TC、TG含量影响的试验方法
将70只大鼠随机分成7组(每组10只)分别为:沙生蜡菊花总提物组、乙酸乙酯萃取物组、醇洗脱物组、水层组、阳性药对照组、模型组以及空白对照组。空白对照组大鼠喂以正常饲料,其余6组大鼠均喂以高脂饲料,整个实验周期为28d。实验期间自由进食与饮水。于实验前和实验第28d分别空腹眼眶取血,测定其血清中TC、TG,以上指标均采用中生北控生物科技有限公司生产的相关试剂盒,用HITACH717全自动生化分析仪在480~520nm进行比色测定。
三、数据处理
表3沙生蜡菊花各部分提取物对大鼠血中TC、TG含量的影响(n=10)
*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较,△p<0.05,与模型组比较
试验结果表明,沙生蜡菊花的各提取物能够显著降低高血脂大鼠血中总胆固醇及甘油三酯的含量,具有降低血脂的作用。并且口服沙生蜡菊总提物与空白组比较,在不影响大鼠进食量的同时,能够降低大鼠的体重增长率。
试验例3沙生蜡菊花各部分提取物对高脂血家兔的降血脂及抗动脉粥样硬化作用
一、试验材料
1、供试样品:实施例1-5所制备的沙生蜡菊花醇总提取物;乙酸乙酯萃取物;醇洗脱物;水层部分;
2、其它试验材料:2-2.25kg大耳白兔50只,雌雄各半,购自哈尔滨医科大学附属第二医院动物中心。HITACH717全自动生化分析仪(上海安泰分析仪器有限公司);脂必妥片(成都地奥九泓制药厂),批号0612034,规格:0.35g/片;沙生蜡菊花(哈尔滨药材总公司);胆固醇、猪油、蛋黄粉(北京索莱宝科技有限公司哈尔滨分公司)。
二、试验方法
取家兔70只,随机分为7组,每组10只,沙生蜡菊花总提物组、乙酸乙酯萃取物组、醇洗脱物组、水层组、阳性药对照组、模型组以及空白对照组。除空白对照组外,其它动物均喂以高脂饲料(基础饲料80%,蛋黄粉15%,猪油4.5%,胆固醇0.5%)。空白对照组喂以正常饲料。各给药组家兔每日灌胃给药1次,模型组与空白组给等体积生理盐水。每周称量体重1次,调整剂量。在给药后第6周末,实验前禁食不禁水12h,末次给药2h后用20%乌拉坦腹腔麻醉,颈动脉插管放血,取全血3ml,4℃静置24h,分离血清,用HITACH717全自动生化分析仪检测,用相应试剂盒检测血中主要脂类成分的含量。迅速开胸,分离主动脉,取降主动脉3cm,用4%多聚甲醛固定24h。Herxheimers液[苏丹(g)∶70%乙醇(ml)∶丙酮(ml)=1∶100∶100]进行大体染色20min,取出后用80%乙醇分色20min,自来水冲洗1h,最后用8%多聚甲醛保存。拍照后用HPIAS-1000彩色病理图文分析系统对相片进行处理,最后计算出斑块面积占总表面积的百分比。
三、数据处理
表4沙生蜡菊花提取物对高血脂家兔血中TC、TG含量的影响(n=10)
*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较
表5沙生蜡菊花提取物对高血脂家兔主动脉斑块面积的影响
p<0.01,与模型组比较
试验结果表明,沙生蜡菊花总提物及各部分能够显著性降低高血脂家兔血中TC、TG的含量,证明其具有降血脂作用。此外,沙生蜡菊花总提取物及各部分给药组动物主动脉粥样斑块面积百分比显著小于模型组动物,证明沙生蜡菊花提取物及各部分均具有抗动脉粥样硬化作用。
Claims (3)
1.沙生蜡菊花提取物用于制备辅助治疗高血脂、高血脂并发症、动脉粥样硬化或动脉粥样硬化并发症的药物中的用途,所述沙生蜡菊花提取物的制备方法包括:沙生蜡菊花用醇类物质进行加热回流后所提取得到醇提取物,所述的醇类物质是浓度为100%的甲醇或体积百分比为30-75%的乙醇;
将醇提取物经有机萃取物质萃取脱脂后分别得到有机物萃取部分和水层部分,所述的有机萃取物质是乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷;
将所得到水层部分经大孔吸附树脂吸附,分别以水和体积百分比为90%乙醇或100%甲醇洗脱,收集醇洗脱物即得。
2.按照权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的大孔吸附树脂为HP-20大孔吸附树脂。
3.按照权利要求1或2所述的用途,其特征在于:所述沙生蜡菊花提取物按照中药制剂方法制备成临床上可接受的口服制剂或注射制剂。
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