CN111773324A - 鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属制药技术领域，涉及鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用。具体涉及鲜石斛水提物对脂肪酸以及甘油三酯合成的调节。实验结果证明本发明制备的鲜石斛水提物不仅能够明显抑制固醇调控元件结合蛋白1、二酰基甘油酰基转移酶以及微粒体三酰甘油转运蛋白的mRNA表达水平，有效调节甘油三酯的生物合成，而且能够明显抑制乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶以及硬脂酰辅酶A去饱和酶的mRNA表达水平，有效调节脂肪酸的合成，同时还能够抑制FABP4的mRNA的表达水平，改善外周的胰岛素抵抗,保护胰岛β细胞功能，提高胰岛素的敏感性，从而抑制与FABP4相关的代谢性疾病的发生；因此，本发明制备的鲜石斛水提物能够作为药物用于代谢性疾病的治疗。

Description

鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用。

背景技术

代谢活动是人体基本的生命活动，是维持机体功能的基础。随着人们生活环境及生活习惯的变化，代谢性疾病的发病率越来越高，人体的代谢活动受到各方面因素的影响，包括环境因素、饮食因素、作息因素等。代谢性疾病即因代谢问题引起的疾病，包括代谢障碍和代谢旺盛等原因。代谢性疾病并不是特指某一个疾病，它是一类疾病的总称。一般是指人体中一些物质，比如脂肪、糖、蛋白质、嘌呤等代谢的异常，而导致的营养物质累及或缺乏所引起的疾病。常见的代谢性疾病主要包括胰岛素抵抗、2型糖尿病、动脉粥样硬化、高脂血症、非酒精性脂肪肝、肥胖症等。其中，糖尿病是最常见的代谢性疾病之一，发病率很高。糖尿病是胰岛细胞功能异常导致的疾病，主要特征是高血糖。糖尿病的典型症状有多饮、多尿、多食等，患者经常会感觉到口渴，身体明显消瘦。肥胖症是指体内储存过多的脂肪,表现为脂肪细胞体积的增大和脂肪细胞数量的增多。高血脂是体内脂质代谢异常的疾病，与长期高脂肪饮食有关。高血脂常常与其它的疾病联系在一起，可引发心血管疾病。

目前，关于上述代谢性疾病的治疗，虽然人们已经在血糖控制、疾病改善性质及心血管发病率及死亡率减少方面已经取得较好功效而同时显示改善安全特征的方法、药剂及药物组合物的医学需要仍未得到满足。

石斛是常用名贵中药材，性味甘淡微咸，寒，归胃、肾，肺经。始载《神农本草经》，品种众多，其中霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛和马鞭石斛是石斛中的上品。又名林兰(《神农本草经》)、千年润(《本草纲目》)等，其具有较高的观赏价值和药用功能，在李时珍《本草纲目》中记载，石斛有“补五脏、劳贏瘦、滋阴益精、久服厚肠胃、平胃气、长肌肉、定志除惊、轻身延年”等功效。

根据我们的文献调研，尚未发现石斛或者石斛提取物在治疗代谢性疾病方面的应用和研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用，是石斛提取物的一种新用途。目前没有任何报道表明石斛提取物可以应用于治疗代谢性疾病。

本发明提供了鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用，所述鲜石斛水提物由石斛药材经提取得到。

进一步的，所述石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。

进一步的，所述鲜石斛水提物的制备步骤为：将新鲜石斛，去根、叶后保留茎部，粉碎后，加入5-8倍重量份的蒸馏水浸没，于75-85℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取,合并提取液，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

进一步的，所述鲜石斛水提物可制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式，例如可以为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂、口服液剂中的一种；

本发明有益效果如下：

（1）本发明制备的石斛水提物能够明显抑制FABP4的mRNA的表达水平，进而改善外周的胰岛素抵抗,保护胰岛β细胞功能，提高胰岛素的敏感性，从而抑制与FABP4相关的代谢性疾病的发生；

（2）本发明制备的鲜石斛水提物能够明显抑微粒体三酰甘油转运蛋白、二酰基甘油酰基转移酶以及固醇调控元件结合蛋白的mRNA表达水平，从而能够有效调节甘油三酯（TG）的生物合成；

（3）本发明制备的鲜石斛水提物能够明显抑制乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶以及硬脂酰辅酶A去饱和酶的mRNA表达，从而能够有效调节脂肪酸（FA）的合成；

因此，本发明制备的鲜石斛水提物能够作为药物用于代谢性疾病的治疗，在治疗代谢性疾病方面会具有良好的发展前景。

附图说明

图1为鲜石斛水提物抑制脂肪酸结合蛋白的基因表达；

其中，数据以means±SD表示，FABP4：脂肪酸结合蛋白，^**P＜0.01，^***P<0.05；给药组vs空白对照组；FWE：Fresh Dendrobium Water Extraction鲜石斛水提物；fold：倍数。

图2为鲜石斛水提物抑制HuH7细胞中TG合成相关基因微粒体三酰甘油转运蛋白、二酰基甘油酰基转移酶以及固醇调控元件结合蛋白1的表达；

其中，数据以means±SD表示，MTTP：微粒体三酰甘油转运蛋白，^****P＜0.01，^##P<0.01；DGAT1：二酰基甘油酰基转移酶，^****P＜0.01，^####P<0.01；SREBP1：固醇调控元件结合蛋白1，^#P<0.05，^**P＜0.01；给药组vs空白对照组；FWE：Fresh Dendrobium Water Extraction鲜石斛水提物；fold：倍数。

图3为鲜石斛水提物抑制HuH7细胞中FA合成相关基因乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶以及硬脂酰辅酶A去饱和酶的表达；

其中，数据以means±SD表示， ACC1：乙酰辅酶A羧化酶，^**P＜0.01；FASN：脂肪酸合成酶，^**P＜0.01，^***P<0.05；SCD1：硬脂酰辅酶A去饱和酶，^**P＜0.01，^***P<0.05；给药组vs对照组；FWE：Fresh Dendrobium Water Extraction鲜石斛水提物；fold：倍数。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

脂肪酸结合蛋白( fatty acid-binding protein, FABP4)是一族多源性低分子量胞内蛋白,广泛分布于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、心、脑和骨骼肌等多种细胞内,具有组织特异性。研究显示，脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白4已被证实在脂质代谢过程和炎症反应中发挥重要作用。FABP4主要表达在脂肪细胞和巨噬细胞，通过可逆结合脂肪酸及其他疏水性配体影响其在细胞内定位，还能通过蛋白间直接相互作用形成脂肪酸信号的传感器，成为调节胰岛素敏感性以及联系炎症与胰岛素信号的关键因子。FABP4敲除小鼠的研究结果表明，高脂饮食下的FABP4缺陷小鼠可以明显抵抗肥胖诱导的高胰岛素血症和胰岛素抵抗、有效控制小鼠血糖并减少脂肪组织炎症；FABP4缺陷的肥胖糖尿病模型小鼠糖脂代谢得到了改善，胰岛素敏感性提高。有研究结果表明，FABP4作为脂肪细胞因子，受营养状态等的调控由脂肪细胞分泌入血，对肝脏的葡萄糖生成和β细胞的胰岛素分泌等过程起着重要的调节作用。大量流行病学研究结果也证实，血清FABP4水平在多种病理状态下显著升高，与肥胖程度、机体代谢状况、内皮功能、肝脏病变和多种心血管疾病密切相关，可能作为多种代谢性疾病临床诊断的重要指标。综上所述，FABP4是具有极大潜力的治疗2型糖尿病等代谢性疾病的药物靶标。

甘油三酯(缩写为TG）为生物能量储存的主要形式，当人体摄入的能量超过其消耗的能量时，过剩的能量便以TG的形式储存在脂肪组织，同时过多的TG会在胰岛β细胞、肝细胞等组织沉积，最终导致患糖尿病、肥胖症和脂肪肝等代谢性疾病。因此，抑制上述组织内TG的合成可作为治疗上述代谢性疾病的新策略。

二酰基甘油酰基转移酶(Diacylgycerol acyltransferase, DGAT) 是催化TG合成途径的关键酶，其表达水平的高低直接影响着最终TG的含量。DGAT是一种内质网膜整合蛋白，有两种亚型： DGAT1和DGAT2 两种类型, 研究表明, 抑制 DGAT1 的活性可以降低TG 的合成, 改善机体对胰岛素和瘦素敏感性, 增加葡萄糖摄取率和能量消耗, 抵抗高脂饮食导致的肥胖等, 可作为治疗肥胖症和糖尿病等代谢综疾病的靶标。

固醇调节元件结合蛋白( sterol regulatory element-binding proteins ,SREBPs)作为脂质体内平衡的主要调节剂，是膜结合的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子，包括3个家族成员SREBP- 1a、SREBPl和SREBP2。其中，SREBPl是调控脂质合成的重要转录调控因子，通过调节脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因参与脂肪酸(FA)、三酰甘油(TG)合成。SREBP-1及其靶基因的异常表达能够引起胰岛素抵抗、糖尿病和脂肪肝等一系列代谢性疾病。

微粒体三酰甘油转运蛋白（MTTP)是一种主要存在于肝细胞和肠上皮细胞的内质网及微粒体中的蛋白复合物，其主要生理功能是将内质网外的甘油三酯（TG)、胆固醇酯、磷脂酰胆碱转运至内质网腔，参与含有载脂蛋白B(apoB)的脂蛋白合成，是肝细胞内极低密度脂蛋白（VLDL)及肠上皮细胞内乳糜微粒(CM)的合成及分泌不可或缺的脂质转运蛋白。研究结果固醇调控元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP1)表明，降低MTTP活性，细胞内TG积聚能够被抑制。MTTP表达水平的高低可通过影响脂类和脂蛋白的代谢，从而导致许多疾病，如脂类代谢障碍、代谢性疾病及心血管疾病等。

研究表明，脂肪酸合成与癌症、肥胖、心血管疾病等慢性代谢性疾病密切相关，在脂肪酸合成过程中脂肪酸合成的关键酶有：乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase1，ACC1）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl-CoAdesaturase， SCD1）。乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）存在于胞浆中含有生物素的变构羧化酶,是脂肪酸代谢过程中的限速酶,其使乙酰辅酶A羧化成丙二酰辅酶A。研究发现，肿瘤代谢在肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药过程中起着重要的作用,而腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）和ACC1在肿瘤代谢中发挥着核心作用。脂肪酸合成酶（FASN）是生物体内源性脂肪酸合成过程的关键酶，近年来发现FASN已成为治疗肿瘤、肥胖及与肥胖有关的代谢性疾病的新靶点。

本发明通过对上述相关mRNA的表达水平进行检测，来研究鲜石斛水提物作为药物应用于代谢性疾病治疗的效果。

由于现有药用石斛的种类跟多，这里本发明实施例以霍山石斛为例，研究鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用效果，但本发明中的石斛并不限于霍山石斛，也可以是其他同属的药用石斛，例如铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛或者鼓槌石斛等。

霍山石斛，原产于我国安徽霍山等地，是国家现代中药重大专项200多个濒危稀缺品种中首位保护品种，是药用石斛中的极品，也是霍山县独有的、拥有原产地地理标志的名贵中药材，历史上被誉为“中华九大仙草之首”、“健康软黄金”，《神农本草》、《本草纲目》均有记载。霍山石斛所含有的多糖能大幅度提高人体内SOD(延缓衰老的主要物质)，在增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老和促进癌细胞凋亡等方面有明显作用，从而达到保健益寿的功效。

实施例1

制备鲜石斛水提物，具体如下：

鲜石斛水提物的制备：称取100g新鲜采摘的霍山石斛，去根、叶后保留茎部，粉碎后，加入500ml蒸馏水浸没霍山石斛药材，在80 ℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取3次,每次1h， 合并3次提取液。将合并后的提取液在55 ℃下减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，进行冷冻干燥至恒重，得到质量体积浓度为100 mg/ml的鲜石斛水提物。

将上述实施例1中制备质量浓度为100 mg/ml的鲜石斛水提物在试验前均用0.22μm的滤膜过滤除菌，然后稀释，制备成一系列质量浓度依次为10μg/mL, 100μg/mL, 1000μg/ml的鲜石斛水提物的工作液，作为药物，备用。

（Ⅰ）检测鲜石斛水提物对RAW264.7细胞中的胰岛素抵抗相关基因FABP4的mRNA的表达

RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)采用DMEM完全培养基（之中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素) 在37℃、体积分数 5％CO₂的培养箱中培养，细胞同步化12h，随机分成2大组，即：①空白对照组：不给药（0μg/ml）；②给药组：（1）鲜石斛水提物高剂量给药组(1000μg/mL）；⑥鲜石斛水提物中剂量给药组(100μg/mL)；⑦鲜石斛水提物低剂量给药组(10μg/mL)；给药作用12h，荧光定量 PCR：使用 RNAiso Plus 提取 RAW264.7 细胞的总RNA，通过 Oligo dT18 将 1μg总RNA 逆转录为 cDNA，通过定量PCR 技术，使用 Toyobo 公司 ThunderBirdSYBR qPCR Mix 试剂按照说明书对引物进行 PCR 扩增。每组样品 3 个复孔，以保证实验数据的有效性。使用 GAPDH为内参，检测目的基因FABP4（脂肪酸结合蛋白）mRNA相对于内参基因（GAPDH）的表达变化来定量。采用Graphpad7分析数据 (即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数)。所用引物为：FABP4（mFABP4-F：AAATCACCGCAGACGACAGG；mFABP4-R：AACTCTTGTGGAAGTCACGCC）。

结合附图1的实验结果可知，由本发明制备的鲜石斛水提物相对空白对照组（给药浓度为0μg/mL），中剂量和高剂量鲜石斛水提物的给药均能够抑制脂肪酸结合蛋白(FABP4)的mRNA表达水平。由此可知，鲜石斛水提物能够明显抑制脂肪酸结合蛋白(FABP4)的mRNA表达水平，进而改善外周的胰岛素抵抗,保护胰岛β细胞功能，提高胰岛素的敏感性，抑制与FABP4相关的代谢性疾病的发生。因此，鲜石斛水提物可以作为药物用于治疗代谢性疾病。

（Ⅱ）检测鲜石斛水提物对体外HuH7细胞中TG合成以及FA合成相关基因的mRNA的表达

分组：HuH7细胞复苏后，采用DMEM完全培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下培养，细胞同步化12h，随机分组，即：①空白对照组：不给药（0μg/ml）；②给药组：鲜石斛水提物高剂量给药组(1000μg/mL)；鲜石斛水提物中剂量给药组(100μg/mL)；鲜石斛水提物低剂量给药组(10μg/mL)；给药作用12h，荧光定量 PCR：使用 RNAiso Plus 提取 HuH7细胞的总RNA，通过Oligo dT18 将 1μg总RNA 逆转录为 cDNA，通过定量PCR 技术，使用 Toyobo 公司ThunderBirdSYBR qPCR Mix 试剂按照说明书对引物进行 PCR 扩增。每组样品 3 个复孔，以保证实验数据的有效性。使用 GAPDH为内参，检测目的基因微粒体三酰甘油转运蛋白（MTTP)、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)、固醇调控元件结合蛋白1（SREBP1）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶（FASN）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA分别相对于内参基因（GAPDH）的表达变化来定量。采用Graphpad7分析数据 (即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数 )。所用引物为：SREBP1（hSREBP1-f：GGATTGCACTTTCGAAGACATG；hSREBP1-r：AGCATAGGGTGGGTCAAATAGG）、DGAT1（hDGAT1-f：GGTGCCCTGACGGAGCAGGC；hDGAT1-r：CAGTAAGACCACAGCCGCTG）、MTTP（hMTTP-f：GAGCTTGTACAGCCGGTCAT；hMTTP-r：CAGTTGAGGATTGCTGGTCA）、ACC1（h-ACC1-F：GCCATTGGGATTGGGGCTTAC；h-ACC1-R：CCCGCCCGAGGACTTTGTTG）、FASN（hFASN-f：AACTCCAAGGACACAGTCACCAT；hFASN-r：CAGCTGCTCCACGAACTCAAA）、SCD1（hSCD1-f：TGGGTTGGCTGCTTGTG；hSCD1-r：GCGTGGGCAGGATGAAG）。

结合附图2的实验结果可知，由本发明制备的鲜石斛水提物相对空白对照组（给药浓度为0μg/mL），高剂量鲜石斛水提物的给药能够抑制固醇调控元件结合蛋白1(SREBP1)、二酰基甘油酰基转移酶（DGAT1）以及微粒体三酰甘油转运蛋白（MTTP)的mRNA表达水平，且呈浓度依耐性。由此可知，鲜石斛水提物能够有效调节TG的生物合成。因此，鲜石斛水提物可以作为药物用于治疗代谢性疾病。

结合附图3的实验结果可知，由本发明制备的鲜石斛水提物相对空白对照组（给药浓度为0μg/mL），高剂量鲜石斛水提物的给药能够明显抑制乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶（FASN）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA表达水平，低剂量和中剂量鲜石斛水提物的给药能够明显抑制脂肪酸合成酶（FASN）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA表达水平。由此可知，鲜石斛水提物能够有效调节脂肪酸（FA）的合成。因此，鲜石斛水提物可以作为药物治疗代谢性疾病。

综上所述，本发明制备的鲜石斛水提物不仅能够明显抑制固醇调控元件结合蛋白1(SREBP1)、二酰基甘油酰基转移酶（DGAT1）以及微粒体三酰甘油转运蛋白（MTTP)的mRNA表达水平，有效调节TG的生物合成，而且能够明显抑制乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶（FASN）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的mRNA表达水平，有效调节FA的合成，同时还能够明显抑制脂肪酸结合蛋白（FABP4）的mRNA的表达水平，进而改善外周的胰岛素抵抗,保护胰岛β细胞功能，提高胰岛素的敏感性，从而抑制与FABP4相关的代谢性疾病的发生；因此，本发明制备的鲜石斛水提物能够作为药物用于代谢性疾病的治疗。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用，其特征在于，所述鲜石斛水提物由石斛药材经提取得到。

2.根据权利要求1所述的鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用，其特征在于，所述石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。

3.根据权利要求1所述的鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用，其特征在于，所述鲜石斛水提物的制备步骤为：将新鲜石斛，去根、叶后保留茎部，粉碎后，加入5-8倍重量份的蒸馏水浸没，于75-85℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取,合并提取液，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

4.根据权利要求1-3任一项所述的鲜石斛水提物在制备治疗代谢性疾病药物中的应用，其特征在于，所述鲜石斛水提物可制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式。

Images