CN102264377A - 含具有黄嘌呤氧化酶抑制效果以及炎症诱发酶抑制效果的朝鲜当归提取物的治疗痛风用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗痛风用组合物。该组合物含有对痛风有疗效的朝鲜当归提取物，能够抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)的产生，降低血液或尿液中的尿酸，并且，本发明还涉及一种预防痛风炎症用组合物。该组合物含有对炎症诱发酶Cox-2有抑制效果的朝鲜当归提取物。本发明的朝鲜当归提取物是以98重量％以上的紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯为主要成分的液体浓缩物。为便于人服用，本发明的朝鲜当归提取物在提取过程中，只采用水和乙醇作为溶剂。并且为了提高纯度，还采用了利用温度和溶解度差异的精制方法。

Description

含具有黄嘌呤氧化酶抑制效果以及炎症诱发酶抑制效果的朝鲜当归提取物的治疗痛风用组合物
技术领域
本发明涉及一种含具有治疗痛风效果的朝鲜当归提取物的治疗痛风用组合物。本发明通过抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)来降低血液或尿液中的尿酸。
并且，本发明还涉及一种预防痛风炎症用组合物。该组合物含有对炎症诱发酶Cox-2有抑制效果的朝鲜当归提取物。
背景技术
朝鲜当归的原产地为韩国，主要用于韩方药剂中的补血剂。最近的研究结果表明，韩国产当归的指标物质紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯具有改善血液循环和抗幽门螺杆菌的作用。本发明的发明人等通过动物实验证明，纯精制的紫花前胡素可以抑制肾脏毒性，预防糖尿并发症引发的肾功能衰竭，对糖尿性高血压有疗效(PCT/KR1999/00632)。
并且，本发明人等已经就朝鲜当归的提取方法注册过专利(韩国注册专利10-0509843)，并经过改善，曾对将主要成份含量提高至95重量％的朝鲜当归提取物的提取方法以及利用该物质的抗氧化效果申请过专利(韩国专利申请号10-2007-45441)。
不仅如此，还对具有改善脂质代谢效果的朝鲜当归以及土当归提取物及其提取方法申请了专利(韩国专利申请号10-2008-4122)。
并且，本发明人还掌握了比传统的方法更简便，还能提高提取量的浓缩方法。还在动物实验中证实，将此制作成药剂口服时容易被脏器所吸收。
紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯属于同分异构体，到目前为止还没被广泛认知。但是，本发明人等一直致力于研究其作用，也确立并阐明了其分析方法(韩国注册专利10-0509843)。
紫花前胡素可以在室温中以固体的形态存在，紫花前胡醇当归酯在零下70度也保持液体状态。本发明人还发现朝鲜当归中紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯的比例约为57∶43。通过质谱分析发现精制物质准确的含量和比率是，紫花前胡素为50～54.5％，紫花前胡醇当归酯为40～42％，紫花前胡醇为0.1～0.3％，紫花前胡醇衍生物约2～3％，其他为1～2％。
痛风(Gout)是血液中的尿酸长期维持在高水平形成的尿酸结晶体无法排到体外，堆积在各个组织中诱发各种症状的代谢性疾病。血液中的尿酸增加的情况是由于产生大量尿酸，且通过肾脏排泄的过程出现异常，导致尿酸无法正常排出而形成的。但是，血液中的尿酸值高并不意味着会马上发病，而是高尿酸值下容易形成尿酸结晶体，沉积在各个组织的状态维持10～20年时，在诱发因素的作用下引发痛风。主要在40～50岁的男性中发病，但是随着饮食习惯和环境的变化，发病年龄呈现出年轻化的趋势。在女性闭经以后或脏器移植手术后长期服用免疫移植药物，或长期服用利尿剂导致肾功能下降的女性人群中发病率高。
从痛风的发病原因来看，构成我们身体的大部分细胞都有细胞核，细胞核是由承载着基因信息的核酸组成。核酸是由嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)构成，细胞寿命完结破坏时，核内的嘌呤体被分解，制造大量的尿酸(uric acid)，尿酸钠的结晶沉积在组织中引发炎症的疾病。据说会引发高尿酸血症、痛风性关节炎、痛风性肾脏疾病、痛风性肾结石症等(Yagi K.，Chem.Phys.Lipids，45，p337，1987)。
嘌呤体的代谢过程中，腺嘌呤会经过次黄嘌呤(Hypoxanthine)和黄嘌呤(xanthine)形成尿酸，鸟嘌呤(guanine)会直接代谢成黄嘌呤(xanthine)分解成尿酸。研究表明，黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)会参与这个过程。黄嘌呤氧化酶将黄嘌呤转换为尿酸时，由于大量生成超氧自由基阴离子(superoxide radical)，给周边的细胞造成氧化压力，不仅诱发痛风，还伴随高血压、高血脂、动脉硬化、糖尿病等并发症(Storch J et al.，Anal.Biochem.，169，p262，1988)。
Figure BPA00001390620200031
尿酸根据形成的途径大体上分为外源性尿酸(来自摄入的食物中含有的嘌呤体)和内源性尿酸(来自身体内破坏的细胞)。这样生成的大部分尿酸在肾脏经过复杂的过程通过小便排出体外，但是当生产和排出的均衡被打破时会发生问题。正常男性的血液中尿酸浓度为7～8mg/dl以下，正常女性的血液中尿酸浓度为6mg/dl以下。
虽说有个体差异，但是血液中尿酸的浓度超过8mg/dl时会发生疼痛，存在心脏、肾脏或脑血管障碍危险，超过10mg/dl时会发作。痛风的最常见的症状是关节炎，但是也有可能引发急性或慢性的肾功能下降。
治疗痛风时，主要使用秋水仙碱(colchicine，不能确诊时使用)、非甾体类抗炎药(没有并发症，可以确诊时使用，但是消化性溃疡、肾功能障碍、浮肿恶化等副作用可能性大)、类固醇(单发性关节炎中注射在关节腔内或肌肉)。
但是，现代医学还没有根治痛风的药物。作为抗高尿酸剂有尿酸生成抑制剂“别嘌呤醇(allopurinol)”和尿酸肾脏排泄促进剂“丙磺舒(probenecid)”等。以别嘌呤醇为例，存在皮肤发疹、胃脏障碍、骨髓抑制、瘙痒、呕吐、肌肉痛等严重的副作用。因此，亟待开发出安全、副作用少，可以预防和治疗痛风的药物。
发明内容
由于现有的痛风治疗药物存在很多副作用，所以本发明的目的在于提供一种没有副作用，可以治疗和预防的新的痛风治疗用组合物。
为了实现上述的目的，本发明旨在于提供含有以紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯为有效成分的朝鲜当归提取物的治疗痛风用组合物和预防痛风炎症用组合物。该物质可以抑制黄嘌呤氧化酶(xanthin oxidase)的活性，抑制炎症诱发酶Cox-2的效能，还可以降低体内被氧嗪酸钾(Potassium oxonate)增加的尿酸量。
本发明的朝鲜当归提取物有通过抑制黄嘌呤氧化酶(xanthinoxidase)的活性，来降低痛风时增加的体内尿酸量，抑制痛风炎症诱发酶Cox-2的活性的效果。
附图说明
图1为精制提取的紫花前胡素以及紫花前胡醇当归酯含量达到98重量％的朝鲜当归提取物；
图2为精制提取的紫花前胡素以及紫花前胡醇当归酯含量达到98重量％的土当归提取物；
图3为正常对照组(normal control，正常对照)、高尿酸血症对照组(Model control，模型对照)、别嘌呤醇给药组(positive control，阳性对照)、朝鲜当归提取物给药组(Decursin 50，紫花前胡素50)的血液以及尿液中浓度的图表；
图4为正常对照组(normal control)、高尿酸血症对照组(Modelcontrol)、别嘌呤醇给药组(positive control)、朝鲜当归提取物给药组(Decursin 50)的炎症诱发酶Cox-2(cyclooxygenase-2，环氧合酶-2)的抑制效果图。
具体实施方式
本发明涉及一种对痛风有治疗效果的朝鲜当归提取物，本发明利用黄嘌呤氧化酶的抑制(xanthine oxidase inhibition，XOI)作用来降低血液或尿液中的尿酸。并且，本发明还涉及一种具有炎症诱发酶抑制效果的朝鲜当归提取物。
本发明的朝鲜当归提取物是根据本发明人等曾申请的韩国专利申请10-2007-45441的方法制造的。
1.朝鲜当归提取物的制造
将原料韩国产以及朝鲜产的当归粉碎成40目(40mesh)以下的大小，烘干至水分含量5％以下，添加粉碎朝鲜当归2～4倍的药典用乙醇或酒精乙醇，经过12小时充分提取后过滤并定量。这时，浓缩物内所含的紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯含量为33％。
对上述浓缩物进行蒸发干燥得到了粘性更高的物质。在每公斤该物质中添加药典用乙醇或酒精乙醇一升溶解主成分，在零下20度放置10个小时后，对所生成的沉淀物进行离心分离获得了上层液。对上层液进行蒸发干燥获得了浓缩物。
向该浓缩物添加50升60％的乙醇进行了析出。此时，浓缩物中含有的紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯为330克，可以在60％乙醇50升中溶解的主要成分的量也为330克。
析出后经过离心分离，只获得了60％乙醇层。对此进行蒸发干燥后获得了浓缩物。将该浓缩物溶解于99％的乙醇中，取上层液获得了最终浓缩物(见图1)。
对这样浓缩的朝鲜当归提取物进行高效液相色谱法(HPLC)分析的代表性结果是，紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯的总含量达到了98重量％。采用该提取物实施了下面的实验。
2.黄嘌呤氧化酶的抑制效果(Xanthine Oxidase inhibition)实验
本实验中将黄嘌呤作为底物，黄嘌呤氧化酶作为酶，进行了酶-底物反应实验。黄嘌呤氧化酶的抑制活性是按照Stripe等的方法(Stripe F.et al.，J.Biol.Chem，244.，p3855-3863，1969)进行了测定。
混合50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)250μl、朝鲜当归提取物溶液(利用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)分别稀释并制造了紫花前胡素以及紫花前胡醇当归酯最终浓度为1、5、10、17.5、20、50μg/ml的溶液)385μl、黄嘌呤溶液330μl，制造了反应液。
在上述的反应液中添加35μl的黄嘌呤氧化酶溶液(最终浓度0.4U/ml)，在37℃的培养基中反应15分钟，然后测定了295nm的吸光度(absorbance，Ab)。
并且，使用各个浓度(紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯的最终浓度为1、5、10、17.5、20、50μg/ml)的朝鲜当归提取物，制备了没有添加黄嘌呤氧化酶溶液的反应液。此外，在没有朝鲜当归提取物的情况下，制作了添加黄嘌呤氧化酶溶液的和没有添加黄嘌呤氧化酶溶液的反应液。这时，相应于朝鲜当归提取物以及黄嘌呤氧化酶的量，添加50mM的磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，使最终反应液的体积达到了1ml。
本发明的黄嘌呤氧化酶的抑制率是按照下列公式测定和计算的，其结果如表1所示。
抑制率(％)＝(1-B/A)x100
A：没有组合物时吸光度的变化(有酶时的吸光度-无酶时的吸光度)
B：有组合物时吸光度的变化(有酶时的吸光度-无酶时的吸光度)
表1
并且，将与朝鲜当归提取物的浓度相同的别嘌呤醇作为标准抑制剂使用，测定抑制效果的结果IC50为38.0μg/ml。
即，作为黄嘌呤氧化酶抑制剂广为人知的别嘌呤醇的IC50为38.0μg/ml，但是本发明的朝鲜当归提取物的IC50为18.2μg/ml。并且，现存的文献显示，别嘌呤醇的IC90为80～100μg/ml，本发明的朝鲜当归提取物的IC90显示为约44.7μg/ml。由此可见，本发明组合物的黄嘌呤氧化酶抑制效果更加优秀。
上述的IC50表示抑制50％的黄嘌呤氧化酶的点。并且，分别对100μg/ml的绿茶提取物、西洋山楂子提取物、海带提取物、酸枣仁提取物、银杏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率进行测定的结果分别为92％、85％、68％、64％、78％(韩国注册专利第10-0492470号)，30μg/ml的长生红桔梗对黄嘌呤氧化酶的抑制率显示为63.6％(韩国注册专利第10-0662206号)，咸草提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率IC50值为21μM(韩国注册专利第10-0569244号)。比较可见，本发明的组合物的抑制率比任何物质都高。
3.在引发痛风的动物模型中进行降低血液以及尿液中尿酸的实验
为了确认本发明朝鲜当归提取物的抗痛风活性，给药尿酸分解酶抑制剂-氧嗪酸钾(potassium oxonate)诱导高尿酸血症后，针对朝鲜当归提取物对降低血液中尿酸的效果进行了实验。在阳性对照组中，对服用了尿酸合成抑制剂别嘌呤醇(allopurinol，三一制药)的患痛风疾病的模型实施了比较实验。
实验动物选用了湿度维持在50±5％，温度维持在24～26℃的饲育场(SPF chamber)中喂养的9周龄的雄性大鼠(sprague-dawley rat，male，250-280g，samtako公司)，充分供应水和饲料进行喂养，在实验室环境中适应一个星期后用于实验。
在本实验中，在喂给试料的前一天，将尿酸分解酶抑制剂氧嗪酸钾(150mg/kg)喂给到腹腔内，诱导了高尿酸血症。喂给氧嗪酸钾后，为了确认高尿酸血症的诱导与否，测定并比较了氧嗪酸钾喂给前后的尿酸含量。
氧嗪酸钾是利用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na，含0.1M醋酸钠的0.5％CMC(pH 5))进行悬浮使用。
将被高尿酸血症诱发的实验动物分为正常对照组(Normalcontrol)、高尿酸血症对照组(Model control)、别嘌呤醇给药组(Positivecontrol)、朝鲜当归提取物给药组(Decursin 50)等四组，每组7只，进行了实验。
高尿酸血症对照组是利用相同量的溶剂替代朝鲜当归提取物进行喂给，别嘌呤醇和朝鲜当归提取物是在含有0.1％聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯的0.01M磷酸盐缓冲生理盐水中进行悬浮，诱发高尿酸血症后3天口服给药。
别嘌呤醇给药组按市面销售药物的给药量50mg/kg进行给药，朝鲜当归提取物也以50mg/kg的浓度口服了三天。从最终口服的时间点开始2个小时以内，收集各个实验动物的小便(尿)，直接解剖并分离出血清，测量血液和尿液中尿酸的浓度，以便评估尿酸浓度(检查装备：DRI-CHEM，FUJIFILM，Model No.3200)。
血液以及尿液中的尿酸浓度呈现比高尿酸血症对照组(Modelcontorl)较低的水平(见图3)。
朝鲜当归提取物给药组(Decursin 50)的血液以及尿液中的尿酸浓度与对照药物别嘌呤醇的给药组(Positive control)相比，尿酸降低能力略微差一些，但是考虑到目前市面上销售的别嘌呤醇的各种副作用时，这是非常有意义的结果。
4.痛风诱发动物模型的肝细胞中炎症诱发抑制效果的实验
为了确认本发明的朝鲜当归提取物对炎症诱发酶Cox-2的抑制效果，进行尿酸分解酶抑制剂氧嗪酸钾(potassium oxonate)的给药，诱导高尿酸血症后，作为朝鲜当归提取物的血液中尿酸加强效果的阳性对照组，采用进行尿酸合成抑制剂别嘌呤醇给药的痛风疾病模型，实施了比较实验。作为对照组采用了β-肌动蛋白。
实验动物选用了在维持湿度50±5％，温度24～26℃的饲育场(SPF chamber)中喂养的9周龄的雄性大鼠(sprague-dawley rat，male，250-280g，samtako公司)，充分供应水和饲料进行喂养，在实验室环境中适应一个星期后用于实验。
在本实验中，在试料给药的前一天，将尿酸分解酶抑制剂氧嗪酸钾(150mg/kg)给药到腹腔内，诱导了高尿酸血症。给药氧嗪酸钾后，为了确认高尿酸血症的诱导与否，测定并比较了氧嗪酸钾给药前后的尿酸含量。
氧嗪酸钾是利用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na，含0.1M醋酸钠的0.5％CMC(pH 5))进行悬浮使用。将诱发高尿酸血症的实验动物分为正常对照组(control)、高尿酸血症对照组(Model contorl)、别嘌呤醇给药组(Positive control)、朝鲜当归提取物给药组(Decursin 50)等四组，每组分配7只，进行了实验。
高尿酸血症对照组是利用相同量的溶剂替代朝鲜当归提取物进行给药，别嘌呤醇给药组和朝鲜当归提取物给药组是分别在含0.1％吐温80的PBS中进行悬浮，高尿酸血症诱发后3天口服给药。别嘌呤醇给药组是按市面销售药物的给药剂量50mg/kg安排给药，朝鲜当归提取物也按50mg/kg的浓度口服给药。
经过三天口服给药后，让实验动物绝食一个晚上，然后用干冰进行麻醉并开腹取出肝脏(liver)，测定其重量后进行快速冷冻，在-80℃的温度条件下进行冷冻保管。在整个肝脏中取100mg，使用细胞裂解液分离蛋白质，然后利用蛋白浓度测定法测定了蛋白质。利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对相同量的蛋白质进行分离后，转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。为了切断非特异性蛋白质，将完成转移的PVDF膜与含5％脱脂奶粉的PBST(0.01％的聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯-0.01M磷酸盐缓冲生理盐水)进行了一个小时左右的反应。继续与一级抗体(primary antibody)反应一个晚上后，再与各抗体的二级抗体(secondary antibody)抗山羊IgG和抗兔IgG分别反应了1个小时。各个反应之间用PBST进行每次五分钟共五次的冲洗。最后的冲洗结束后，利用化学发光底物(supersignal west pico chemiluminescent substrate(Pierce，Rockford，IL，USA))对各抗体的对应蛋白质带进行了表达。
其结果，如图4所示，朝鲜当归提取物给药组与别嘌呤醇给药组相比，在肝组织中更能抑制Cox-2蛋白质的表达。尤其是，以阳性对照组别嘌呤醇给药组为例，与高尿酸血症对照组(Modelcontrol)相比，反而增加了Cox-2的表达，发明人判断这是别嘌呤醇的副作用之一。因此，通过上述的实验结果，可以确认朝鲜当归提取物对因痛风引发的炎症反应有抑制效果。
并且，本发明的实施方式中利用朝鲜当归提取物进行了实验，但是很显然也可以利用土当归提取物进行实验(图2)。

Claims (9)

1.一种治疗痛风用组合物，其特征在于，含有通过抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)而具有治疗痛风效果的朝鲜当归提取物。
2.根据权利要求1所述的治疗痛风用组合物，其特征在于，朝鲜当归提取物含有98重量％以上的紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯。
3.根据权利要求1所述的治疗痛风用组合物，其特征在于，黄嘌呤氧化酶50％抑制效果(IC50)为18.2μg/ml，黄嘌呤氧化酶90％抑制效果(IC90)为44.7μg/ml。
4.一种预防痛风炎症用组合物，其特征在于，含有抑制炎症诱发酶Cox-2效果的朝鲜当归提取物。
5.根据权利要求4所述的预防痛风炎症用组合物，其特征在于，朝鲜当归提取物含有98重量％以上的紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯。
6.一种治疗痛风用组合物，其特征在于，含有通过抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)而具有治疗痛风效果的土当归提取物。
7.根据权利要求6所述的痛风治疗用组合物，其特征在于，土当归提取物含有98重量％以上的紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯。
8.一种预防痛风炎症用组合物，其特征在于，含有抑制炎症诱发酶Cox-2效果的土当归提取物。
9.根据权利要求8所述的预防痛风炎症用组合物，其特征在于，土当归提取物含有98重量％以上的紫花前胡素和紫花前胡醇当归酯。
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