CN102753185B

CN102753185B - 一种芒果苷小檗碱盐及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN102753185B
Application number: CN201080026190.4A
Authority: CN
Inventors: 滕厚雷; 吴巍; 林喆
Original assignee: Hainan Deze Drug Research Co Ltd
Current assignee: Changzhou Deze Medical Science Co ltd
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-03
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2030-06-03
Also published as: JP5799011B2; EP2444094A1; US20120094941A1; CN101921270A; JP2012530078A; US8673864B2; CN102753185A; WO2010145192A1; EP2444094A4

Abstract

本发明提供了一种芒果苷小檗碱盐及其制备方法。另外亦提供该芒果苷小檗碱盐用作AMPK激活剂的用途。

Description

一种芒果苷小檗碱盐及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种芒果苷小檗碱盐及其制备方法及作为AMPK激活剂的用途。

背景技术

芒果苷(mangiferin)是天然多酚类化合物，分子式：C₁₉H₁₈O₁₁，分子量：422。其化学结构如下：

小檗碱(berberine)为异喹啉类生物碱。分子式：[C₂₀H₁₈NO₄]⁺，分子量：336.37。其化学结构如下：

广西中医学院李学坚课题组公开的专利说明书【公开号：CN101066275A；发明名称：芒果苷-小檗碱组合物】之发明内容第一段论到：“芒果苷呈酸性，而小檗碱(或其盐类)呈碱性，可在一定条件下反应生成芒果苷-小檗碱组合物——定位为组合物，是因为两者的结合并不十分牢固，只是分子间范德华力作用的结果。这种组合物在浓度较大，或在体内消化时，又互相分开而独立存在，这也为它们发挥各自的药理作用创造了条件。”第五段论到：“试验结果表明，浓度在2.5％以下的芒果苷-小檗碱组合物溶液十分稳定，即使置于5℃环境中保存，也不会析出结晶；如是2.5-5％的溶液，即配即用，在8个小时内不会析出结晶；如是5-10％的溶液，即配即用，在3个小时内不会析出结晶”。

分析上述技术方案可知：首先其阐述的物质基础是“溶液状态下的组合物”，其次，由于该物质基础为溶液状态下的组合物，故存在着以下缺陷：

1、稳定性差；根据上述专利说明书中公开的内容可见，该组合物的稳定性为数小时，而符合药物特性的稳定性至少需达1年以上，可见该技术方案中阐述的组合物的稳定性较差。

2、不易贮存；

3、无法制备固体制剂。上述专利说明书中公开的内容仅为将该组合物制备成液体制剂或半固体制剂，未见有固体制剂的内容。

我们已公开的关于芒果苷与小檗碱的组合物【公开号：WO/2008/043246；发明名称：具有2型糖尿病及其慢性并发症治疗作用的药物组合物】则仅为芒果苷与小檗碱两个化合物按一定比例组合的组合物，并未涉及化合物间的反应或结合。

CN101066275A公开的专利申请中提供的芒果苷小檗碱溶液状态下的组合物的制备方法，尽管芒果苷呈弱酸性，而小檗碱(或其盐类)呈弱碱性，但在其所公开的反应条件下，无法获得芒果苷小檗碱盐。该说明书中亦论到“芒果苷呈酸性，而小檗碱(或其盐类)呈碱性，可在一定条件下反应生成芒果苷-小檗碱组合物——定位为组合物，是因为两者的结合并不十分牢固，只是分子间范德华力作用的结果。”

综上可见，上述公开文献皆未给出将芒果苷与小檗碱通过反应可结合为芒果苷小檗碱盐的技术启示。

磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种在细胞内行使能量代谢调节的蛋白激酶。随着对AMPK研究的日益深入，AMPK在代谢性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、炎症性疾病、肿瘤、肌肉系统疾病的发病中发挥至关重要的作用，AMPK正成为疾病治疗新靶点，但目前尚未有上市的AMPK激活剂，故研究开发AMPK激活剂具有重要的临床意义【李忌.AMPK：糖尿病与心血管疾病治疗新靶点.中国医学论坛报，2009，(1149)；任俊芳.AMPK与心血管重构.国际病理科学与临床杂志，2008，28(1)：33-36；RicardoLage，Carlos Dieguez，Antonio Vidal-Puig.et al.AMPK：a metabolic gaugeregulating whole-body energy homeostasis.Trends Mol Med，2008，14(12)：539-49；符庆瑛，高钰琪.蛋白激酶AMPK的研究进展.生命科学，17(2)：147-152；陈奇，梁后杰，邹岚，等.一磷酸腺苷活化蛋白激酶对环氧合酶-2表达与5-氟尿嘧啶治疗结肠癌敏感性的关系.实用医院临床杂志，2008，5(3)：56-58等】。

发明内容

我们通过大量的研究创造性地获得芒果苷小檗碱盐。该芒果苷小檗碱盐的物质基础为芒果苷与小檗碱通过离子键结合的化合物，其相较于CN101066275A所公开的芒果苷-小檗碱组合物具有以下特点：

1、稳定性好。

2、可制成固体、液体等各种制剂。

3、易于贮存。

另外，该芒果苷小檗碱盐更表现出以下意想不到的技术效果：

我们的研究发现该芒果苷小檗碱盐在较强酸性溶液溶解，pH值越小溶解越好，在pH值1-3的酸液中，芒果苷小檗碱盐浓度低于2mg/ml的溶液中12小时内仅有微量沉淀析出；在芒果苷小檗碱盐浓度大于4mg/ml，溶解后会很快析出沉淀。由于人体胃液的pH值为1-3，芒果苷小檗碱盐的上述性质可使其很好的溶解在胃液中，这非常有利于药物在体内的吸收。而芒果苷小檗碱任何比例的组合物在酸水中不能增加溶解度。

具体技术方案如下：

本发明提供一种芒果苷小檗碱盐，其特征在于：

①所述芒果苷小檗碱盐具有下式(Ⅰ)的结构；

②所述芒果苷小檗碱盐的熔点为176℃-178℃。

本发明所述的芒果苷小檗碱盐，还具有以下特征：所述芒果苷小檗碱盐的碳谱数据具有以下特征：小檗碱C₆，C_13a，C_8a，C_12a碳原子的化学位移由于屏蔽作用而发生显著改变。

本发明所述的芒果苷小檗碱盐，还具有以下特征：所述芒果苷小檗碱盐的碳谱数据具有以下特征：芒果苷C₃，C₇碳原子的化学位移由于去屏蔽作用而发生显著改变。

本发明提供所述芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：

①将芒果苷与碱性钠(钾)盐反应制备成芒果苷单钠(钾)盐；

②将芒果苷单钠(钾)盐与小檗碱反应生成芒果苷小檗碱盐。

本发明所述的芒果苷小檗碱盐可以采用的制备方法如下：

①在反应器中加入反应溶媒和芒果苷混悬得混悬液，将碱性钠(钾)盐水溶液加入混悬液中，反应至澄清，滤过，得溶液A。

②将小檗碱加入水中溶解，滤过，得溶液B。

③将溶液A滴加入搅拌状态下的溶液B中，滴加完毕继续搅拌，使反应完全，产生大量沉淀，过滤，固体物干燥，得芒果苷小檗碱盐。

本发明所述的芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：所述芒果苷与碱性钠(钾)盐的摩尔配比为1∶0.5-1。

本发明所述的芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：所述芒果苷单钠(钾)盐与小檗碱摩尔配比为1∶1。

本发明所述的芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：所述碱性钠(钾)盐可以选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钠、醋酸钾中的一种或两种以上的混合物。

上述制备方法中所述反应溶媒为水与乙醇、甲醇、丙酮等可与水混溶的有机溶剂中一种或两种以上的混合物，其中水的体积比10-90％(v/v)。

本发明所述的芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：所述小檗碱也可以是盐酸小檗碱、硫酸小檗碱、鞣酸小檗碱或小檗碱其他医学上可接受的盐。优选小檗碱、盐酸小檗碱、硫酸小檗碱。

芒果苷小檗碱盐的理化性质：

芒果苷小檗碱盐，橙色粉末状物，熔点：176-178℃，几乎不溶于水，在沸水中略溶。结构式如下：

芒果苷小檗碱盐的结构确证：

芒果苷小檗碱盐与芒果苷、小檗碱¹³CNMR(400MHz)数据如下表：

芒果苷小檗碱盐与芒果苷、小檗碱¹HNMR(400MHz)数据如下表

上述数据分析如下：

芒果苷小檗碱盐的碳核磁数据与芒果苷、小檗碱碳核磁数据比较：小檗碱基团的C₆，C_13a，C_8a，C_12a等碳原子的化学位移由于屏蔽作用改变显著，其他碳原子的化学位移都有不同程度的改变。芒果苷基团的C₃，C₇碳原子的化学位移由于去屏蔽作用而发生显著改变，其他碳原子的化学位移由于屏蔽作用均有不同程度的改变。

芒果苷小檗碱盐的氢核磁数据与芒果苷、小檗碱氢核磁数据比较：小檗碱基团的H₅，H₁₂，H₁₃等氢原子的化学位移由于屏蔽作用而改变显著，其他氢原子的化学位移都有不同程度的改变。芒果苷基团的端基质子H₁’和三个芳香质子H₄，H₅，H₈等氢原子的化学位移由于屏蔽作用改变显著。

上述核磁数据化学位移的变化表明：芒果苷基团与小檗碱基团中各原子的化学环境发生了变化，说明小檗碱基团与芒果苷基团结合形成了芒果苷小檗碱盐。

本发明的另一目的是提供一种药物，该药物由上述芒果苷小檗碱盐与药学上可接受的药用辅料组合，并按相应的制药方法，即可制成临床适用的任何一种口服制剂、外用制剂或注射剂，例如片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂、凝胶剂、冻干粉针等临床可接受的剂型。

本发明提供所述芒果苷小檗碱盐在制备AMPK激活剂中的用途。

本发明提供以芒果苷小檗碱盐为活性成分制备的药物在制备AMPK激活剂中的用途。

鉴于现代医学对AMPK在疾病发生发展中所起重要作用的揭示，本发明提供一种芒果苷小檗碱盐在制备AMPK激活剂中的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于预防或治疗下述疾病中的任何一种或几种：糖尿病、糖尿病各种慢性并发症(包括冠心病、动脉粥样硬化、脑血管病等大血管病变；糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变等微血管病变；神经病变；糖尿病足；黄斑病、白内障、青光眼、屈光改变、虹膜睫状体病变等眼的其他病变等)、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、X综合征、心肌肥大、心律失常、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心力衰竭、高血压、上呼吸道感染、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、肝炎、脂肪肝、酒精肝、肝纤维化、肝硬化、前列腺炎、胰腺炎、肾炎、肾病综合征、慢性肾功能不全、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨性关节炎、炎症性肠病、阿尔茨海默氏病、记忆障碍、梗塞性痴呆、帕金森氏症、肿瘤(包括肿瘤放疗、化疗不敏感；肿瘤放疗、化疗产生的毒性反应)、肌肉萎缩、肌肉无力症。

本发明提供一种芒果苷小檗碱盐在制备AMPK激活剂中的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于运动替代。

本发明提供的芒果苷小檗碱盐用作AMPK激活剂的有效剂量范围为0.1-30mg/kg/日/人。以上用量是根据体外试验及动物实验结果推算的，因动物与人体之间的差异，各种疾病之间的差异、体内外差异，故允许实际临床应用剂量有所调整。用法可根据具体疾病进行选择，以口服为优选。

下面给出具体实施方式对本发明作进一步说明，但不限于此。

附图说明

图1芒果苷小檗碱盐的差热分析(DSC)曲线图。

图2芒果苷小檗碱盐对肿瘤细胞毒性的影响。纵坐标为细胞死亡率(％)。(注：与单独给药组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01)

图3芒果苷小檗碱盐对KK-ay小鼠胰岛素敏感指数与血脂等的影响(注：与模型组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)

图4芒果苷小檗碱盐对KK-ay小鼠肝酶的影响(注：与模型组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01)

图5芒果苷小檗碱盐对痴呆大鼠学习记忆力影响。纵坐标为潜伏期(EL)。(注：与模型组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01)

图6芒果苷小檗碱盐对类风湿性关节炎模型大鼠的影响。(注：与模型组比较：^*P＜0.05，**P＜0.01)

具体实施方式

本发明所述的芒果苷采用市售品(广西百色天星科技开发有限公司，具有相应提取设备的厂家均可以生产)。盐酸小檗碱、小檗碱等均为市售品(西安小草植物科技有限公司)。碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾试等剂均采用市售品。

实施例1：芒果苷小檗碱盐的制备

在反应器中加入芒果苷42.2g(0.1mol)、水1800ml、乙醇600ml充分混悬，将碳酸氢钠8.4g(0.1mol)加水制成0.5％(w/v)溶液，缓慢加入搅拌状态的混悬液中，反应至澄清，滤过，得反应液A；取小檗碱33.6g(0.1mol)加沸水1500ml溶解，滤过，得溶液B。将反应液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌，静置12小时，有沉淀析出，过滤，沉淀物用纯水充分洗涤，固体物低于60℃真空干燥，得棕色固体芒果苷小檗碱盐53.4g，收率为70.5％。样品纯度经HPLC测定为98.6％。

实施例2：芒果苷小檗碱盐的制备

在反应器中加入芒果苷42.2g(0.1mol)、水2000ml、乙醇800ml充分混悬，将碳酸钠5.3g(0.05mol)加水制成1％(w/v)溶液，缓慢加入搅拌状态的混悬液中，反应至澄清，滤过，得反应液A；取盐酸小檗碱37.3g(0.1mol)加沸水2500ml溶解，滤过，得溶液B。将反应液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌，静置12小时，有沉淀析出，过滤，沉淀物用纯水充分洗涤，固体物低于60℃真空干燥，得棕色固体芒果苷小檗碱盐53.3g，收率为67.4％。样品纯度经HPLC测定为98.5％。

实施例3：芒果苷小檗碱盐的制备

在反应器中加入芒果苷42.2g(0.1mol)、水1600ml、甲醇800ml充分混悬，将碳酸钾6.9g(0.05mol)加水制成0.2％(w/v)溶液，缓慢加入搅拌状态的混悬液中，反应至澄清，滤过，得反应液A；取硫酸小檗碱43.2g(0.1mol)加水2500ml溶解，滤过，得溶液B。将反应液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌，静置12小时，有沉淀析出，过滤，沉淀物用纯水充分洗涤，固体物低于60℃真空干燥，得棕色固体芒果苷小檗碱盐51.8g，收率为60.6％。样品纯度经HPLC测定为98.6％。

实施例4：芒果苷小檗碱盐的制备

在反应器中加入芒果苷42.2g(0.1mol)、水1000ml、甲醇1000ml充分混悬，将碳酸氢钾10.0g(0.1mol)加水制成2％(w/v)溶液，缓慢加入搅拌状态的混悬液中，反应至澄清，滤过，得反应液A；取小檗碱33.6g(0.1mol)加沸水2500ml溶解，滤过，得溶液B。将反应液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌，静置12小时，有沉淀析出，过滤，沉淀物用纯水充分洗涤，固体物低于60℃真空干燥，得棕色固体芒果苷小檗碱盐49.5g，收率为65.3％。样品纯度经HPLC测定为98.5％。

实施例5：芒果苷小檗碱盐的制备

在反应器中加入芒果苷42.2g(0.1mol)、水3000ml、丙酮300ml充分混悬，将碳酸钠5.30g(0.05mol)加水制成5％(w/v)溶液，缓慢加入搅拌状态的混悬液中，反应至澄清，滤过，得反应液A；取小檗碱33.6g(0.1mol)加沸水2500ml溶解，滤过，得溶液B。将反应液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌，静置12小时，有沉淀析出，过滤，沉淀物用纯水充分洗涤，固体物低于60℃真空干燥，得棕色固体芒果苷小檗碱盐50.9g，收率为67.2％。样品纯度经HPLC测定为98.5％。

实施例6：芒果苷小檗碱盐的制备

在反应器中加入芒果苷42.2g(0.1mol)、水300ml、乙醇3000ml充分混悬，将碳酸钠5.30g(0.05mol)加水制成0.2％(w/v)溶液，缓慢加入搅拌状态的混悬液中，反应至澄清，滤过，得反应液A；取小檗碱33.6g(0.1mol)加沸水3000ml溶解，滤过，得溶液B。将反应液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌，静置12小时，有沉淀析出，过滤，沉淀物用纯水充分洗涤，固体物低于60℃真空干燥，得棕色固体芒果苷小檗碱盐51.6g，收率为68.1％。经HPLC测定纯度为98.6％。

实施例7：芒果苷小檗碱盐片剂的制备

称取上述方法制备的芒果苷小檗碱盐粉末333g，过100目筛，加入微晶纤维素200g、药用淀粉300g作为稀释剂组成制剂配方，混匀，加入粘合剂制软材，用24目筛制粒，干燥后整粒，加入适量润滑剂，压片，制成10000片，包衣，即得，含药量为33.3mg/片。

实施例8：芒果苷小檗碱盐颗粒的制备

称取上述方法制备的芒果苷小檗碱盐粉末10g，过100目筛，加入羧甲基纤维素490g、木糖500g，混匀，加入粘合剂制软材，用24目筛制粒，干燥后整粒，制成1000g，即得，含药量为10mg/g。

实施例9：芒果苷小檗碱盐胶囊的制备

称取上述方法制备的芒果苷小檗碱盐粉末333g，过100目筛，加入微晶纤维素100g、药用淀粉600g作为稀释剂组成制剂配方，混匀，加入粘合剂制软材，用24目筛制粒，干燥后整粒，加入适量润滑剂，分装胶囊，即得，含药量为33.3mg/粒。

实施例10：芒果苷小檗碱盐混悬剂的制备

称取上述方法制备的芒果苷小檗碱盐粉末10g，研成极细粉，备用；取羧甲基纤维素钠、羟苯乙酯适量，加适量水制成胶浆，分别加入芒果苷小檗碱盐，单糖浆适量，随加随搅拌，加水至1000ml，搅匀，分装，即得含药量为10mg/ml。

试验例1：芒果苷小檗碱盐溶解度测定

分别精密称取研成细粉芒果苷小檗碱盐5mg，置于25℃±2℃50ml蒸馏水中，每隔5分钟强力振摇30秒钟；观察30分钟内的溶解情况。芒果苷小檗碱盐仍有可见溶质颗粒，其水溶解度小于0.1mg/ml，属水几乎不溶物质。

试验例2：芒果苷小檗碱盐在不同pH酸水中的溶解情况

取纯净水，加盐酸分别调pH值为1、3、5；分别取不同pH值的水各50ml，分别精密称取研成细粉的芒果苷小檗碱盐50mg加入，振摇；观察溶解情况。芒果苷小檗碱盐在pH值1的水中在数秒钟内迅速溶解，在pH值3的水中5分钟内溶解，在pH值5的水中不能完全溶解。

另取pH值1、3的水各50ml，分别精密称取研成细粉的芒果苷小檗碱盐100mg加入，振摇；观察溶解情况。芒果苷小檗碱盐在pH值1的水中在1分钟内溶解，在pH值3的水中不能完全溶解。

另取pH值1的水50ml，分别精密称取研成细粉的芒果苷小檗碱盐200mg加入，振摇；观察溶解情况。芒果苷小檗碱盐在pH值1的水中在仍能溶解，但很快有沉淀物析出。

取pH值1的水50ml三份，分别精密称取研成细粉不同比例芒果苷-小檗碱组合物(摩尔比：1∶1，1∶3，1∶5)各50mg，加入，振摇；观察溶解情况。不同比例芒果苷-小檗碱组合物均仅有微量溶解。

将上述溶液标记后室温静置，观察24小时内的现象。在pH值1、3的酸液中，芒果苷小檗碱盐浓度1mg/ml、2mg/ml的溶液中12小时内仅有微量沉淀析出；在pH值1的酸液中，芒果苷小檗碱盐浓度4mg/ml的溶液中12小时沉淀析出较多。

试验例3：芒果苷小檗碱盐的初步稳定性考察试验

取芒果苷小檗碱盐数份置玻璃瓶内，密闭，置药品稳定性试验箱内，设置为加速试验条件：40℃±2℃/75％RH+5％RH.分别在0、1、2、3月取样，采用高效液相法测定芒果苷小檗碱盐的含量。试验结果显示芒果苷小檗碱盐在加速试验条件下三月内含量无明显变化，提示本品在常温条件下的稳定性大于1年。

为了说明发明内容中所述芒果苷小檗碱盐的药理活性，本发明人采用体内外相结合、以具代表性的疾病模型作为各类疾病代表的方式进行实验研究。即用体外方式研究芒果苷小檗碱盐对AMPK磷酸化的影响及对肿瘤细胞的化疗增敏作用；又分别以KK-ay小鼠、类风湿性关节炎大鼠、阿尔茨海默氏病大鼠来代表糖脂代谢紊乱性疾病、自身免疫疾病、神经变性疾病。以期说明芒果苷小檗碱盐作为AMPK激活剂、用以治疗各种疾病的可行性。详细阐述如下：

试验例4：芒果苷小檗碱盐对AMPK激活作用

1、材料

按上述实施例制备芒果苷小檗碱盐，以DMSO溶解。临用前以培养基或HBS缓冲液稀释。DMSO终浓度≤0.2％。

L6细胞购自ATCC。高糖DMEM培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自Hyclone公司。抗AMPK兔源多克隆抗体、抗ACC兔源多克隆抗体、抗AMPK苏氨酸172位点磷酸化兔源多克隆抗体、抗ACC丝氨酸79位点磷酸化兔源多克隆抗体购自Cell Signal Technology公司。

2、实验方法

2.1细胞培养与分化：

分化前的L6细胞用高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清，100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，置于含有的5％CO2的培养箱内37℃培养。L6细胞的分化是在细胞长满60％左右时，换成含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基，每两天更换一次培养基，直到L6细胞分化至90％左右。

2.2化合物处理及样品收集：

先将6孔板中的细胞在无血清的高糖DMEM培养基中饥饿。受试物以不同的浓度梯度加到无血清的高糖DMEM培养基中，DMSO含量0.2％。受试物与细胞孵育3h，然后，用冰冷的1×PBS洗2次，加入200μl 1×SDS电泳缓冲液(50mMTris·HCL，100mM DTT，2％电泳级SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)裂解细胞10min。收集裂解液，超声15秒钟，在100℃煮样品10min。

2.3免疫印迹检测：

裂解液经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，再在转膜仪中以100V，1-2h转移到PVDF膜上。将凝胶中的蛋白质半干转移到硝酸纤维薄膜上，丽春红S(Ponceau S)确定条带。在封闭液(3％脱脂奶粉，0.1％Tween，TBS溶解)中封闭1小时，加入1∶1000稀释一抗4℃过夜，TBS洗涤3×15min，加入1∶1000稀释二抗，室温孵育1小时，TBS洗涤3×15min，置于ECL中冲洗5-10min，用X光片压片显影。

3、结果

结果表明：1.25-5μmol/L芒果苷小檗碱盐呈剂量依赖性地显著增强了AMPK磷酸化水平，同时显著增强ACC磷酸化水平。

试验例5：芒果苷小檗碱盐对肿瘤细胞的化疗增效作用

1、材料：

按实施例方法制备芒果苷小檗碱盐(简称BM)。顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、紫杉醇(TAXOL)由市场购得。实验样品者皆用DMSO溶解后使用。

2、分组：

阴性对照组为DMSO组、芒果苷小檗碱盐组(20μmol/L)、顺铂组(1μmol/L)、阿霉素组(1μmol/L)、紫杉醇组(1μmol/L)、芒果苷小檗碱盐(20μmol/L)+顺铂组(1μmol/L)、芒果苷小檗碱盐(20μmol/L)+阿霉素组(1μmol/L)、芒果苷小檗碱盐(20μmol/L)+紫杉醇组(1μmol/L)。

3、实验方法：

将体外培养的人肝癌Bel-7402细胞系，按照10³-10⁴/孔，每孔200μl接种到96孔细胞培养板中，24小时后加入各受试物，其中加入两个样品的组别，需在加入芒果苷小檗碱盐后与细胞共同培养3h后，再加入顺铂或阿霉素或紫杉醇，培养72h，然后采用四氮唑盐还原法(MTT法)检测细胞毒性。试验重复两次。

4、结果：

芒果苷小檗碱盐联合顺铂或阿霉素或紫杉醇组的细胞毒性显著高于单独应用顺铂或阿霉素或紫杉醇组。表明芒果苷小檗碱盐对化疗具有增加其细胞毒作用(见附图2)。

试验例6：芒果苷小檗碱盐对KK-ay小鼠的影响

1、药物：

按实施例方法制备芒果苷小檗碱盐，用3‰羧甲基纤维素钠混悬后使用。盐酸罗格列酮为浙江万马药业有限公司生产。

2、动物：

雄性KK-ay小鼠，16周龄。

3、分组及给药

将KK-ay小鼠随机分为8组，即模型组(n＝10)，芒果苷小檗碱盐低剂量组[20mg/kg，n＝10，简称BML组]，芒果苷小檗碱盐中剂量组[40mg/kg，n＝10，简称BMM组]，芒果苷小檗碱盐高剂量组[80mg/kg，n＝10，简称BMH组]，二甲双胍组[500mg/kg，n＝10]。每日固定时间以灌胃给药的方式进行。空白组给予等量的生理盐水。共给药30天。

4、观察指标

血糖与血脂：试验结束时采血标本，血糖(mmol/L)、血脂[包括甘油三酯(TG，mmol/L)、胆固醇(TC，mmol/L)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL，mmol/L)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL，mmol/L)]、肝酶[包括丙氨酸转氨酶(ALT，U/L)、天门冬氨酸转氨酶(AST，U/L)]采用GF-D800型半自动生化分析仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司生产)检测。

胰岛素：放射免疫法，γ计数器计数，胰岛素放免分析试剂盒，山东潍坊市三维(3V)生物公司生产。

胰岛素敏感指数(ISI)计算：ISI＝Ln(1/FPG×1/INS)。

尿微量白蛋白：于代谢笼中收集24h尿液并记录尿量，尿液离心取上清-80℃保存备用。随意尿于每周周一13:00用提尾反射法收集。采用竞争ELISA法检测尿微量白蛋白，计算尿白蛋白排泄率(尿白蛋白排泄率＝尿微量白蛋白浓度(mg/L)×尿液的总量(ml)/收集总量的时间(分钟)＝μg/分钟，UAER)，图中单位以mg/24h表示。

5、统计学分析：

计量资料值以均数标准差表示。两组间比较采用t检验。

6、结果

芒果苷小檗碱盐40mg/kg即能显著改善KK-ay小鼠的血糖、血脂、胰岛素、尿白蛋白排泄率、肝酶等各项指标，显著提高胰岛素敏感指数(见附图3-4)。

试验例7：芒果苷小檗碱盐对痴呆大鼠的活性作用

1试验材料

1.1动物：

SD雄性大鼠，SPF级，体重250～300g，自由饮水进食，实验前在实验环境中适应2-3d，实验室温度控制在25℃，相对湿度为40％-80％。

1.2药品、试剂及设备：

芒果苷小檗碱盐：按实施例方法制备。

凝聚态β淀粉样肽1～40片段(A_β1-40)：购自美国Sigma公司。

实验动物脑立体定位仪(SN2型)：为日本成茂公司产品。

水迷宫：中国医学科学院药物研究所研制。

2分组与给药

将SD鼠随机分为5组，每组10只，具体如下：(1)假手术对照组：即海马内注射等量生理盐水；(2)A_β1-40处理模型组；(3)芒果苷小檗碱盐低剂量组(20mg/kg，简称BML组)；(4)芒果苷小檗碱盐中剂量组(40mg/kg，简称BMM组)；(5)芒果苷小檗碱盐高剂量组(80mg/kg，简称BMH组)。

给药方法：各组动物于造模前一周开始灌胃给药，每天1次，连续4周。迷宫训练期间，于训练前0.5h给药。

3试验方法

3.1A_β1-40诱导大鼠AD样病变模型的制备：

应用凝聚态β淀粉样肽1～40片段(A_β1-40)注入大鼠海马内建立AD样病变的动物模型。具体如下：

SD大鼠经麻醉后于立体定位仪下以A_β1-40行双侧海马内注射，每侧各1μl(预先将A_β1-40溶于无菌生理盐水10μg/μl，用前37℃下孵育1周)。注射部位为：前囟后3.5mm，脑正中线旁开2.0mm，其深度为2.7mm。

3.2观察指标与方法

空间学习记忆力测试：采用Morris水迷宫法。平台设于迷宫东北象限正中，水平面高出平台1.5cm，水温保持在19℃～20℃，大鼠连续训练5d，每天2次，设定最长游动时间为70s，以秒表记时，记录大鼠找到平台所需时间(潜伏期，EL)。

4.结果：

随训练天数增加，各组大鼠平均EL逐渐缩短。与假手术组比较，模型组大鼠EL明显延长，第4天开始差异显著，说明造模成功。以第5d潜伏期为例，比较实验各组的EL，结果：芒果苷小檗碱盐中高剂量组大鼠EL皆明显缩短，表明芒果苷小檗碱盐能显著改善A_β1-40诱导的大鼠空间学习记忆障碍(见附图5)。

试验例8：芒果苷小檗碱盐对类风湿性关节炎动物模型的影响

1材料

Wistar大鼠，雌性，100±20g。牛源性Ⅱ型胶原蛋白(Collagen Ⅱ)，酸可溶性，美国Sigma公司产品；弗氏不完全佐剂，美国Sigma公司产品。TNF-α试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2造模

将酸溶性Ⅱ型胶原蛋白(C Ⅱ)用弗氏不完全佐剂配成C Ⅱ浓度为2.5mg/ml的乳剂，按每只大鼠100μl乳剂含C Ⅱ250μg，于右后足跖皮内注射致炎。

正常对照组：每只大鼠注射不含C Ⅱ的弗氏不完全佐剂制成的乳剂100μl。

3给药与分组

将大鼠随机分为6组，每组10只，具体如下：(1)正常对照组；(2)模型组；(3)芒果苷小檗碱盐低剂量组(10mg/kg，简称BML组)；(4)芒果苷小檗碱盐中剂量组(20mg/kg，简称BMM组)；(5)芒果苷小檗碱盐高剂量组(40mg/kg，简称BMH组)；(6)阳性对照组：地塞米松磷酸钠组(0.1mg/kg，简称Dexa组)。

给药方法：初次免疫2周后开始灌胃给药，每天1次，连续4周，正常对照组与模型组给予同等体积的生理盐水。

4观察指标

4.1足肿胀度：用毛细管放大测量法测右后足体积，求出肿胀增长百分率[(给药后值-给药前值)/给药前值]×100％。

4.2细胞因子的检测：实验结束时大鼠股动脉取血，提取血清，冷藏待测。TNF-α按ELISA试剂盒说明进行检测。

5结果

芒果苷小檗碱盐中高剂量组可显著抑制模型大鼠足肿胀与细胞因子TNF-α的分泌。表明芒果苷小檗碱盐对类风湿性关节炎模型大鼠具有治疗作用(见附图6)。

Claims

1.一种芒果苷小檗碱盐，其特征在于：

①所述芒果苷小檗碱盐具有下式（Ⅰ）的结构；

②所述芒果苷小檗碱盐的熔点为176℃-178℃。

2.根据权利要求1所述的芒果苷小檗碱盐，其特征在于：所述芒果苷小檗碱盐的碳谱数据具有以下特征：小檗碱C₆，C_13a，C_8a，C_12a碳原子的化学位移由于屏蔽作用而发生显著改变。

3.根据权利要求2所述的芒果苷小檗碱盐，其特征在于：所述芒果苷小檗碱盐的碳谱数据具有以下特征：芒果苷C₃，C₇碳原子的化学位移由于去屏蔽作用而发生显著改变。

4.权利要求1所述的芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：

①将芒果苷与碱性钠盐或碱性钾盐反应制备成芒果苷单钠盐或芒果苷单钾盐,

②将芒果苷单钠盐或芒果苷单钾盐与小檗碱反应生成芒果苷小檗碱盐；

步骤如下：

①在反应器中加入反应溶媒和芒果苷混悬得混悬液，将碱性钠盐或碱性钾盐水溶液加入混悬液中，反应至澄清，滤过，得溶液A，

②将小檗碱加入水中溶解，滤过，得溶液B，

③将溶液A滴加入搅拌状态下的溶液B中，滴加完毕继续搅拌，使反应完全，产生大量沉淀，过滤，固体物干燥，得芒果苷小檗碱盐；

其中所述反应溶媒为水与可与水混溶的有机溶剂中一种或两种以上的混合物；所述芒果苷与碱性钠盐或碱性钾盐的摩尔配比为1:0.5-1；所述芒果苷单钠盐或芒果苷单钾盐与小檗碱摩尔配比为1：1。

5.根据权利要求4所述的芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：所述反应溶媒中水的体积比为10－90％(v/v)。

6.根据权利要求4所述的芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：所述碱性钠盐或碱性钾盐选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钠、醋酸钾中的一种或两种以上的混合物；所述小檗碱由其医学上可接受的盐替代。

7.根据权利要求6所述的芒果苷小檗碱盐的制备方法，其特征在于：所述小檗碱医学上可接受的盐选自盐酸小檗碱、硫酸小檗碱或鞣酸小檗碱。

8.权利要求1-3任一所述的芒果苷小檗碱盐在制备AMPK激活剂的应用，其特征在于：所述AMPK激活剂可用于预防或治疗下述疾病中的任何一种或几种：糖尿病、糖尿病各种慢性并发症、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、肝炎、脂肪肝、酒精肝、肝纤维化、肝硬化、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨性关节炎、阿尔茨海默氏病、记忆障碍、梗塞性痴呆、肿瘤化疗不敏感。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述糖尿病各种慢性并发症具体指糖尿病并发冠心病、动脉粥样硬化、脑血管病、糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变、神经病变、糖尿病足、黄斑病、白内障、青光眼、屈光改变、虹膜睫状体病变中的一种或几种。

10.一种药物，其特征在于：所述药物由权利要求1所述的芒果苷小檗碱盐与可药用辅料组成。

11.权利要求10所述的药物，其特征在于：所述药物制成临床适用的片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂、凝胶剂、冻干粉针。