CN105560261B - 知母皂苷n在制备防治糖尿病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及知母皂苷N在制备防治糖尿病药物中的应用。本发明首次发现该化合物在体内外表现出了很好的抗糖尿病活性，有可能成为未来治疗糖尿病的有效药物。

Description

知母皂苷N在制备防治糖尿病药物中的应用
技术领域
本发明属于制药技术领域，涉及知母皂苷N在制备防治糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病，古称消渴症，即消瘦烦渴之意，现代医学发现它是一种常见的内分泌疾病，是由于人体内胰岛素绝对或相对缺乏而引起的血中葡萄糖浓度升高，进而糖大量从尿中排出，并出现多饮、多尿、多食、消瘦、头晕、乏力等症状。进一步发展则引起全身各种严重的急、慢性并发症，威胁身体健康。糖尿病通常分为1型糖尿病和2型糖尿病两种。在糖尿病患者中，II型糖尿病占了大多数。糖尿病患者如得不到很好地控制，进一步发展则引起全身各种严重的急、慢性并发症，可导致眼、肾、神经、皮肤、血管和心脏等组织、器官的慢性并发症，以致最终发生失明、下肢坏疽、尿毒症、脑中风或心肌梗死，严重威胁身体健康。
糖尿病是一种常见病，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率在逐年增加。近年来，我国糖尿病患病率显著升高，患者人数达9000多万。
糖尿病的治疗是一个漫长的过程,其治疗方法有很多种,包括糖尿病中医治疗,西医治疗,胰岛素治疗等。目前国内常用的口服降糖药物分为促胰岛素分泌剂类、胰岛素增敏剂、α-糖苷酶抑制剂和高糖损伤修复剂等，如格列本脲、二甲双胍类、阿卡波糖和羟苯磺酸钙等。合成的各类型药物或疗效有限，或毒副作用明显，近年来，中药在糖尿病的临床治疗中显示出很大优势。但现有中成药或大多有效成分不清，或作用机理不明了，急待开发出有效成分明确、作用机理清楚、质量稳定可控的中药制剂。
中药知母清热泻火，生津润燥，主要具有抗菌、抗病毒、解热、降血糖等作用。到目前为止，已有了知母皂苷BII、知母皂苷AIII和芒果苷抗糖尿病方面的活性，对知母皂苷N的活性报道较少，Yokosuka等在其文章【Steroidal glycosides from the undergroundparts of Yucca glauca and their cytotoxic activities.Phytochemistry.2014(101):109-115】中报道了它对HL-60细胞和A549细胞毒作用；尚未见知母皂苷N[分子式为C45H76O30，分子量为936，化学名为(25S)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-羟基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷]治疗糖尿病方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供知母皂苷N在制备防治糖尿病药物中的应用。经体内、外药理试验，所得知母皂苷N具有多种不同途径的显著性降糖作用。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
知母皂苷N在制备防治糖尿病药物中的应用。
所述的药物为能够提高高糖损伤细胞的细胞活力和NO分泌量的药物。
所述的药物为能够提高机体胰岛素的分泌能力的药物。
所述的药物为能够提高机体葡萄糖消耗量，改善胰岛素抵抗作用的药物。
所述的药物为能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性的药物。
所述的药物包括知母皂苷N和药学上可接受的载体或者常规食用辅料。所述药物剂型为口服剂型。
所述的知母皂苷N可以采用现有技术中已经公开的方法(例如，马百平，知母中的两种新呋甾皂苷，药学学报，2006，41(6)：527-532)进行制备，也可以采用其他方法自行制备。
本发明采用上述方法提取得到的知母皂苷N首先进行体内、体外药效实验：知母皂苷N对高糖诱导的HUVEC损伤模型细胞活力和NO分泌量的影响实验，结果表明知母皂苷N对高糖诱导的HUVEC损伤模型细胞活力有明显的增强作用，对NO分泌量有显著性的提高作用；知母皂苷N对RIN细胞胰岛素分泌的影响实验，结果显示知母皂苷N能显著增加RIN细胞胰岛素的分泌能力，其作用与格列本脲相当；知母皂苷N对棕榈酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响实验，结果显示知母皂苷N能限制性地促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗量，具有改善胰岛素抵抗的作用；体外α-葡萄糖苷酶抑制实验，观察该化合物对α-葡萄糖苷酶抑制率来得出其抑制效果，结果表明，知母皂苷N体外抑制α-葡萄糖苷酶的活性作用显著。体内试验：结果表明知母皂苷N对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠具有显著性降糖作用。
本发明的有益效果：
该发明首次发现该化合物在体内外表现出了很好的防治糖尿病活性，有可能成为未来治疗糖尿病的有效药物。
附图说明
图1为大鼠胰岛素ELISA试剂盒标准曲线
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
实验材料
细胞株：RIN-m5F大鼠胰岛瘤细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)；人脐静脉内皮细胞(HUVEC，来源ATCC)；HepG2人肝癌细胞(来源ATCC)。
试药：4-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷(alfa aesar，批号：110906)；α-葡萄糖苷酶(日本TCI，批号：120527)；阿卡波糖片(拜耳医药保健有限公司，批号：117893)；1640培养基(Gibco，批号：1229728)；高糖DMEM培养基(Gibco，批号：991030)；格列本脲(天津太平洋制药有限公司，批号：110706)；大鼠胰岛素ELISA试剂盒(Merckmili pore，批号：1311756)；胰蛋白酶(Amresco，批号：27250018)；FBS(Thermo Fisher，批号：NVM0344)；MTT(Ameresco，批号：M21128)；DMSO(Solarbio，批号：302A034)；青霉素(Solarbio，批号：119A031)；链霉素(Solarbio，批号：423A054)Na2HPO4·12H2O(南京化学试剂有限公司，批号：090902)；KH2PO4(南京化学试剂有限公司，批号：090922)；NaCl(南京化学试剂有限公司，批号：09060310494)；KCl(南京化学试剂有限公司，批号：060960239)；阿卡波糖片(北京拜耳医药保健有限公司，批号：117893)；羟苯磺酸钙(利君制药有限公司，批号：1202023)；盐酸二甲双胍(京丰制药有限公司，批号：120915)；知母(产地河北，购于中国中药材配送网，经鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎)；知母皂苷N(自制，纯度为95％)。
仪器：Cell 150型细胞培养箱(Thermo Electron Corporation,USA)；RT-6000型酶标仪(深圳雷杜生命科技有限公司)；超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司)；COIC XDS-1B型倒置光学显微镜(重庆光电仪器有限公司)；BS124S型万分之一电子天平(Sartorius,USA)；YXQ·SG41·280型高压灭菌锅(上海华线医用核子仪器有限公司)；79-1型磁力搅拌器(深圳国华仪器有限公司)；0412-1型离心机(上海医疗器械有限公司)；微量移液器(Thermo Electron Corporation，USA)；96孔细胞培养板(Caster公司)。
知母皂苷N的制备过程：
取知母药材2.0千克，以20升90％(v/v)乙醇回流提取三次，每次回流2小时，过滤，合并滤液。回收乙醇，减压浓缩至5L，再加水15L稀释浓缩液，至体积浓度为0.1g生药/mL，溶液进行过滤，滤液待上样。将预先处理好的大孔吸附树脂HP20(北京绿百草科技发展有限公司)装柱(5L)，放置平衡后，滤液上样。上样之后依次用6倍柱体积(6BV)的水洗脱除杂，用6BV的30％(v/v)乙醇洗脱除杂、用6BV的50％(v/v)乙醇洗脱，最后用3BV的95％(v/v)乙醇洗脱下柱，经检测知母皂苷N主要集中于50％(v/v)乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积，真空干燥得知母皂苷N粗样品146g。
取粗样品其中140g溶解于200m1水溶液，通入50％(v/v)甲醇平衡好的ODS柱(5L)，用50％甲醇(20000m1)洗脱，收集洗脱液，每份1000mL,HPLC检测各份纯度，将8-15份合并，回收甲醇，浓缩至小体积，干燥得知母皂苷N 5.8g。产品收率为知母药材的0.29％，HPLC检测纯度为95％。知母皂苷N的结构鉴定：利用质谱和核磁等手段进行了结构鉴定，结果如下：HR-ESI-MS(negative mode)m/z:935.4959[M-H]-(calcd.935.4852),1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ5.27(1H,d,J＝7.7Hz,Glc 1H),4.94(1H,d,J＝7.6Hz,gal 1-H),4.80(1H,d,J＝7.7Hz,Glc 1-H),1.02(3H,d,J＝5.9Hz,27-CH3),0.95(3H,s,19-CH3),0.85(3H,s,).其中δ5.27(d,J＝7.7Hz,1H),4.94(d,J＝7.6Hz,1H),4.80(d,J＝7.7Hz,1H)为3个六碳糖端基质子的信号。13C-NMR中δ105.9，104.9，103.0，分别为3个六碳糖的端基碳的信号。δ110.4，是连有羟基的C-22的特征信号。
主要相关诱导液和阳性药的配制：
10％BSA的PBS溶液：称取0.5502g的BSA于10mL容量瓶中，加入PBS缓冲溶液5mL，搅拌溶解1h，于超净台中过滤除菌，得11％BSA的PBS母液。取455μL该母液加45μL的PBS缓冲溶液混匀，即得10％BSA的PBS溶液0.5mL。
阳性药(盐酸二甲双胍)溶液：精密称取0.00190g盐酸二甲双胍粉末于10mL容量瓶中，加高糖DMEM培养基溶解并定容至10mL，于超净台中用0.22μL微孔滤膜过滤除菌，即得浓度为150μg/mL的盐酸二甲双胍溶液。
0.1mol/L棕榈酸母液的配制：称取0.05128g棕榈酸颗粒，加入2mL无水乙醇，40℃水浴溶解，于超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
11％BSA溶液的配制：称取0.5501g BSA于10mL烧杯中，加入PBS缓冲溶液5mL,磁力搅拌2h，于超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得含11％BSA的PBS溶液。
1％FBS、10％BSA，3.5mmol/L棕榈酸诱导液的配制：取1.82mL 11％BSA溶液，加入20μL FBS，90μL PBS，混合均匀，逐滴加入70μL 0.1mmol/L的棕榈酸母液，涡旋使混合均匀，即得2mL所需溶液。因有絮状沉淀生成，诱导液需现用现配，加样时并注意随时振摇。
1％FBS、10％BSA溶液的配制：取455μL 11％BSA溶液，加入5μL FBS，40μL PBS缓冲溶液，混合均匀，即得0.5mL所需溶液。
含10-9mol/L的胰岛素和1％FBS的低糖培养基：胰岛素注射液的规格为10ml中含有400IU的胰岛素，28000IU相当于1g的胰岛素，则按如下公式计算配置10-7mol/L的胰岛素母溶液所需胰岛素注射液的体积。
胰岛素注射液的体积＝所配制体积×所配制浓度÷胰岛素注射液的浓度
取8μl的胰岛素于一盐水瓶中，加19.992mL的低糖培养基，混匀，得胰岛素浓度为10-7mol/L；取该溶液1mL至100mL容量瓶中，加1mL血清，再用低糖培养基定容至100mL，过0.22μm滤膜除菌，即得所需溶液100mL。
实验方法及结果
实施例1：知母皂苷N对高糖诱导的HUVEC损伤模型细胞活力和NO分泌量的影响实验
本实验采用造模与给药同时进行的方法给药，具体方法如下：
培养瓶内孵育细胞长至90％融合时，倒掉培养基，用PBS清洗2遍；将细胞以0.25％的胰蛋白酶消化约1min，倒掉胰酶，加入含10％血清的培养基终止消化，倒掉培养基，加入新的含10％FBS的培养基4mL，轻轻吹打细胞；进行细胞计数，将细胞稀释至3×104cells/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL。
将接种细胞后的96孔板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至90％融合时，换用含1％(v/v)FBS的低糖DMEM培养基培养24h使细胞同步化。将同步化后细胞分为：空白对照组：含1％(v/v)FBS的低糖DMEM培养基培养；模型对照组：用葡萄糖浓度为33mmol/L的并含有1％FBS的DMEM培养基培养；给药组：用葡萄糖浓度为33mmol/L的并含有1％FBS的DMEM培养基培养的同时给予不同样品的药液。培养72h后，将含药培养液取出，每孔加入新鲜的培养基180μL，再加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4h，然后将孔内液体吸除，每孔中加入200μL DMSO并振摇10min，于492nm下检测每孔的吸光值，结果见表1和表2。
按照如下公式计算浓度为0.25mg/mL时，知母皂苷N对HUVEC损伤模型细胞活力的增加率，结果见表1。
表1知母皂苷N对高糖诱导的HUVEC损伤模型细胞活力的增加率(mean±sd，n＝6)
结果显示：知母皂苷N对高糖诱导的HUVEC损伤模型细胞活力有明显的增强作用。
知母皂苷N对高糖诱导的HUVEC损伤模型NO分泌量的影响：按照上述的方法消化细胞，铺板，造模并给药72h，给药结束后每孔取40μL培养基，将培养液取出，4000rpm离心10min，取上清液按照试剂盒说明书的方法测定NO含量。按照如下公式计算知母皂苷N对HUVEC细胞活力的增加率，结果见表2。
表2知母皂苷N对高糖诱导的HUVEC损伤模型NO分泌量的影响(mean±sd，n＝6)
注##P<0.05vs.空白组；*P<0.05vs.模型组，**P<0.05vs.模型组。
由表2可知，与空白组比较模型组的细胞NO分泌能力显著降低，说明造模成功。结果显示：知母皂苷N能够显著增加HUVEC损伤模型的NO分泌能力。
实施例2：知母皂苷N对RIN细胞胰岛素分泌的影响实验
分组与给药：取对数生长期的细胞经0.25％胰蛋白酶消化后吹打成单个细胞悬液，血球计数板计数，加入1640培养液调整细胞的浓度为1×105cells/mL左右。将调整好浓度的细胞加入到96孔培养板中，每孔200μL，将细胞分为空白对照组、阳性对照组和1-9给药组，每组设立6个平行孔，细胞置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
细胞培养24小时后，吸弃原培养液，空白对照组加入新的细胞培养液，阳性对照组加入含1μmol/L格列本脲的培养液，各给药组分别加入含0.25mg/mL的不同样品药液的细胞培养液200μL。继续培养48h后，吸出培养液，备用。
采用ELISA法测定胰岛素含量：
(1).将样品室温下解冻，3000rpm离心10min，取上清液，待用。
(2).将胰岛素测定试剂盒取出，室温平衡20min，取出所需板条。
(3).设置标准孔和样本孔，标准孔加入不同浓度的标准品50μL。
(4).待测样品孔先加入样品10μL，再加样品稀释液40μL，空白孔不加。
(5).除空白孔外，标准品孔和样品孔每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温孵育60min。
(6).每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光恒温孵育15min。
(7).每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm处检测各孔的OD值。
(8).根据试剂盒提供的标准品浓度及其吸光值计算标准曲线，图1。
根据图1得到的标准曲线，计算每孔中胰岛素的含量，并按照如下公式计算药物对RIN细胞胰岛素分泌量的增加率：
表3知母皂苷N对RIN细胞胰岛素分泌量的影响(mean±sd，n＝6)
注：*P<0.05vs.空白组；**P<0.01vs.空白组。
结果显示，知母皂苷N能够显著增加RIN细胞胰岛素的分泌能力。
实施例3：知母皂苷N对棕榈酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响实验
造模及给药：培养瓶内孵育细胞长至80％-90％融合时，倒掉培养基，用PBS清洗2遍；将细胞以0.25％的胰蛋白酶消化约1min，胰酶倒掉，加入含10％血清的培养基终止消化，倒掉培养基，加入新的含10％FBS的培养基，轻轻吹打细胞；进行细胞计数，将细胞稀释至8×104cells/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL，周围每孔加入200μL的D-Hank's溶液。
待96孔板中的细胞长至80％融合时，加诱导液进行造模。具体操作方法，吸除各孔的培养基，再按细胞分组情况加入不同培养基、药液和造模剂。细胞各组造模剂和药液加法如下：
空白组：180μL高糖DMEM和20μL含1％FBS、10％BSA溶液。
模型组：180μL高糖DMEM和20μL含1％FBS、10％BSA和3.5mmol/L棕榈酸的诱导液。
阳性药组：160μL高糖DMEM，20μL 150μg/mL盐酸二甲双胍药液以及20μL 1％FBS、10％BSA和3.5mmol/L组成的棕榈酸诱导液。
样品组：160μL高糖DMEM，20μL 0.5mg/mL样品液以及20μL 1％FBS、10％BSA和3.5mmol/L组成的棕榈酸诱导液。
待孵育12h后，将含药培养液取出，用PBS清洗1次，每孔加入新鲜的含10-9mol/L胰岛素和1％FBS的低糖培养基200μL，继续培养。培养12h后，每孔取20μL细胞培养液用于测培养液中葡萄糖含量。
葡萄糖消耗量的测定：按照试剂盒说明书测定各孔中葡萄糖的含量，并按照如下公式计算葡萄糖消耗量：
葡萄糖消耗量(mmol)＝C0h×V－C12h×V
式中：C0h表示消耗前培养液中葡萄糖含量；
C12h表示消耗12h后培养液中葡萄糖含量；
V表示消培养基体积。
实验结果见下表4。
表4知母皂苷N对胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响(mean±sd，n＝6)
注：##P<0.01vs.空白组；*P<0.05vs.模型组，**P<0.01vs.模型组。
实验结果显示，知母皂苷N能够显著性促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗量，具有改善胰岛素抵抗的潜在作用。
实施例4：知母皂苷N对α-葡萄糖苷酶的抑制率的影响实验
样品液的配制：精密称取适量待测样品置于10mL容量瓶中，加水定容至刻度并超声溶解，3800rpm离心15min，取上清液即得浓度为30mg/mL待测样品液，并稀释得到0.5mg/mL、0.75mg/mL和1.5mg/mL的药液(测定时样品溶液与酶溶液体积比1：2混合，即样品溶液被稀释了3倍)。
给药浓度的确定：本实验分别考察了样品浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL时对α-葡萄糖苷酶的抑制率，以选择合适的药液浓度。测定方法如下：将α-葡萄糖苷酶100μL与样品溶液50μL混合，在37℃水浴中孵育10min后加入50μL底物PNPG，37℃反应45min后，加入100μL浓度为0.3mol/L的Na2CO3，终止反应。于405nm处测定在酶作用下从PNPG中释放出的对硝基苯的吸光度值。
由于药液本身有颜色，本实验设立模型空白组(以PBS代替酶)、样品空白组(以PBS代替酶)，以消除药液本身颜色对实验结果的影响(表5)。
表5α-葡萄糖苷酶活性测定反应系统
按照如下公式计算各组药物对α-葡萄糖苷酶的抑制率，结果见表6。
表6不同浓度样品药液对α-葡萄糖苷酶的抑制率(mean±sd，n＝6)
注：*P<0.05vs.模型组，**P<0.01vs.模型组。
实验结果显示，知母皂苷N对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用。
实施例5：知母皂苷N与多类阳性对照药对四氧嘧啶诱导1型糖尿病小鼠的药效比较实验研究
在体外模型实验中，显示了知母皂苷N具有显著性降糖作用。本实验将采用尾静脉注射四氧嘧啶的方法制备1型糖尿病小鼠模型，考察知母皂苷N以及阳性对照药对该模型血糖等指标的影响，判断知母皂苷N在体内是否具有显著性降糖作用。选择目前应用最广的中药和化药降糖药物消渴丸和盐酸二甲双胍片作为阳性对照药。
实验材料
动物：ICR小鼠，雄性，18-22g，购于南通大学实验动物中心，动物质量许可证号：苏SCKX2008-0010。喂养环境维持12h光/暗周期并保持恒定温度23±2℃，使其自由饮食饮水。本研究所有程序均依照实验动物保护原则进行。
试药：四氧嘧啶(sigma-alorich公司，批号：BCBH2116V)；二甲双胍(京丰制药有限公司，批号：120915)；消渴丸(广州白云山中一药业有限公司，批号：R01252)；知母(产地河北，购于中国中药材配送网，经本人鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根茎)；羧甲基纤维素钠盐300-800(中国医药上海化学试剂公司，批号：30036361)。
仪器：BSA124S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Epoch型酶标仪(Biotek公司)；80-2型电动离心机(江苏金坛市金城国圣实验仪器厂)；移液器(Dragon MedicalLimited)等。
实验方法与结果：
小鼠的饲养：将ICR小鼠饲养于温度为23±2℃的动物房中，动物房保证每天光照和非光照时间均为12h，小鼠可以自由饮水和摄食。
四氧嘧啶诱导的1型糖尿病小鼠模型的制备：将ICR小鼠适应性喂养1周后，将所有小鼠禁食(不禁水)17h，称量各小鼠的重量。随机选取12只小鼠为空白组，按10mL/kg的剂量尾静脉注射生理盐水溶液，剩余小鼠按10mL/kg尾静脉注射新配制的6mg/mL四氧嘧啶生理盐水溶液。静脉注射4.5h后，每只小鼠灌胃给予50％葡萄糖水溶液20mL/kg，防止低血糖造成死亡。尾静脉注射四氧嘧啶72h后，将小鼠禁食(不禁水)12h，每只小鼠眼底静脉丛取血0.2mL，将取好的血样室温下静置1h，然后以4000r/min的速度离心10min以分离得到血清。取10μL血清于样品管中按照试剂盒说明的操作方法测定小鼠的空腹血糖值。空腹血糖值≥11.1mmol/L的小鼠视为糖尿病模型小鼠，可用于后续实验。
糖尿病模型小鼠的分组：为了使各组模型小鼠血糖值接近，将血糖值小于16mmol/L或大于36mmol/L的小鼠剔除，然后将剩余的90只模型小鼠根据血糖值进行调整，分为9组(模型组，消渴丸组，二甲双胍组，知母药材低剂量组、知母药材中剂量组和知母药材高剂量组，知母皂苷N低剂量组、知母皂苷N中剂量组和知母皂苷N高剂量组)，每组10只。分组后，除空白组外各组小鼠血糖均值接近，均在30mmol/L左右。
给药：
知母药材的给药剂量：低剂量组5g/kg、中剂量组10g/kg、高剂量组20g/kg。
知母皂苷N的给药剂量：低剂量组13mg/kg、中剂量组26mg/kg、高剂量组52mg/kg。
消渴丸的给药剂量：消渴丸说明书规定，其成人一般每日最大给药量为7.5g。按照体表面积法换算，则小鼠给药剂量为：7.5g÷60kg×9.01＝1.126g/kg。本实验按1.2g/kg给药。
盐酸二甲双胍的给药剂量：盐酸二甲双胍片说明书规定，成人一般每日最大给药量为1.5g。按照体表面积法换算，则小鼠给药剂量为：1.5g÷60kg×9.01＝0.225g/kg。本实验按0.23g/kg给药。
药液的配制
知母药材药液的配制：小鼠给药体积为20mL/kg，则知母药材高剂量组的药液浓度为20g生药/kg÷20mL/kg＝1g生药/mL；知母药材中剂量组的药液浓度配制为0.5g生药/mL；知母药材低剂量组的药液浓度配制为0.25g生药/mL。
知母皂苷N药液的配制：小鼠给药体积为20mL/kg，则知母皂苷N高剂量组的药液浓度为58mg知母皂苷N/kg÷20mL/kg＝2.9mg知母皂苷N/mL(相当于1g生药/mL)；知母药材中剂量组的药液浓度为1.45mg知母皂苷N/mL(相当于0.5g生药/mL)；知母药材低剂量组的药液浓度为0.725mg知母皂苷N/mL(相当于0.25g生药/mL)。
消渴丸药液的配制：小鼠给药体积为20mL/kg，则消渴丸水溶液浓度为：1.2g/kg÷20mL/kg＝60mg/mL。称取研为细粉的消渴丸6g，加0.4％CMC-Na溶液研磨，定容至100mL，得到60mg/mL消渴丸混悬液。
盐酸二甲双胍药液的配制：小鼠给药体积为20mL/kg，则盐酸二甲双胍片水溶液浓度为：0.23g/kg÷20mg/kg＝11.5mg/mL，按12mg/mL配制。称取研为细粉的盐酸二甲双胍片1.2g，加0.4％CMC-Na溶液研磨，定容至100mL，得到12mg/mL盐酸二甲双胍混悬液。
灌胃给药：各给药组按20mL/kg的剂量灌胃给予配制好的药液，空白组和模型组给予20mL/kg的CMC-Na溶液。每3天称量一次小鼠体重，并根据体重的变化调整给药剂量，连续给药7天。
各种实验样品液对糖尿病小鼠血糖值的影响测定结果：血糖的变化能够直接反映出药物的降血糖作用，本实验在末次给药前小鼠禁食9h，给药继续禁食3h，然后眼底取血测定了小鼠的血糖值，结果见表7。
表7各种样品及阳性对照药对糖尿病小鼠血糖值的影响(mean±sd，n＝10)
注：与.空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实验结果显示，四氧嘧啶造模后，小鼠血糖值显著性高于空白组(P<0.01)，说明模型制备成功。知母药材、知母皂苷N、消渴丸和二甲双胍均显著性降低模型小鼠的血糖值。知母皂苷N的剂量为58mg/kg，按知母皂苷N的得率(0.29％)计算在与知母药材相同生药剂量的情况下，知母皂苷N的降糖效果与药材相当，显示知母皂苷N的降糖作用显著。
结论
由上述实验结果可知，知母皂苷N具有体内、外降糖的确切活性。

Claims (7)

1.知母皂苷N在制备防治糖尿病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为能够提高高糖损伤细胞的细胞活力和NO分泌量的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为能够提高机体胰岛素的分泌能力的药物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为能够提高机体葡萄糖消耗量，改善胰岛素抵抗作用的药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性的药物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物包括知母皂苷N和药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为口服剂型。
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知母降糖有效部位的提取工艺优选及成分分析;芮雯等;《中国实验方剂学杂志》;20131120;第19卷(第22期);第4-8页，参见摘要和表2 *

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