CN103965279A - 一种新人参皂苷酸降解化合物、其制备方法及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新人参皂苷酸降解化合物、其制备方法及其医药用途，涉及天然药物领域，具体涉及化学名称为：(20S，22S)-达玛-22，25-环氧-3β，12β，20-三醇{(20S，22S)-dammar-22，25-epoxy-3β，12β，20-triol}。分子式为：C₃₀H₅₂O₄，分子量为：477.3938。本发明提供的新人参皂苷酸降解化合物的制备方法包括：酸降解过程及其分离纯化过程。本发明新人参皂苷酸降解化合物具有抗肿瘤活性。该制备方法简单可靠，可操作性强，效率高，可进行工业化大生产，有利于大推广应用，具有良好的应用前景。

Description

一种新人参皂苷酸降解化合物、其制备方法及其医药用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种人参皂苷酸降解化合物的制备方法及其纯化步骤，以及该酸降解化合物抗肿瘤治疗方面的应用。

背景技术

人参为我国药典收载品种，为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物人参(Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥根及根茎，主产于我国东北地区，是驰名中外、老幼皆知的名贵药材。《神农本草经》将人参列为上品，有人参“补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目、开心、益智，久服轻身延年”的记载。另外，人参在韩国、日本以及其他一些国家也有着广泛的应用历史，人参进入药品、食品等各个领域，目前更有人参饮料、饼干、糖、茶等多种制品流通市场。

人参皂苷是人参的标志性成分。目前，已分离并鉴定了超过50种人参皂苷成分，按照苷元结构，人参皂苷可分为达玛烷型和齐墩果烷型，达玛烷型又可分为原人参二醇型和原人参三醇型。研究表明，人参皂苷是人参的主要药理活性物质，具有特殊的药理作用和功效，主要有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、抑制肿瘤细胞长、提高机体免疫力、改善心脑血管等作用。

肿瘤的防治是人类至今未能攻克的一大世界难题，人类一直在寻找治疗肿瘤的有效药物。目前治疗肿瘤除了传统的手术、放疗和化疗外，还有生物疗法和热疗等，虽然这些方法取得了一定进展，但是仍不能达到彻底根治肿瘤的目的。从中草药中寻找抗肿瘤药物已经成为研究热点之一，近年来许多专家和学者对人参皂苷的抗肿瘤作用进行了深入研究，发现人参皂苷及各单体化合物的抗肿瘤作用和机制较为广泛，可能是直接作用于肿瘤细胞，促进肿瘤细胞凋亡、分化以及增强机体免疫力的结果。

近年来研究发现人参的主要活性成分人参皂苷具有较强的抗肿瘤活性。其中人参皂苷Rg₃已成为第一个被开发上市的一类抗癌新药，20(S)-25-甲氧基-达玛烷-3β，12β，20-三醇[20(S)-25-OCH₃-PPD]、20(R)-达玛烷-3β，12β，20，25-四醇(25-OH-PPD)、20(R)-原人参二醇(PPD)具有更强的抗癌活性，25-OCH₃-PPD细胞毒活性尤为突出，其体外细胞毒活性比人参皂苷Rg₃强10～100倍。

人参皂苷作为天然、廉价、低毒的抗肿瘤药物，已经受到了广泛关注。对活性较低的人参皂苷进行有目的的结构修饰，制备活性较高的人参皂苷衍生物，改善其药代动力学性质，增加其抗肿瘤活性的研究，具有广阔的应用前景和发展前途。发明人在人参皂苷酸降解化合物中发现一种新化合物，具有良好的抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人参皂苷酸降解化合物。

本发明还提供了这种人参皂苷酸降解化合物制备方法。

本发明同时还提供了这种人参皂苷酸降解化合物的抗肿瘤活性研究结果。

本发明新人参皂苷酸降解化合物结构如下：

化学名称为：(20S，22S)-达玛-22，25-环氧-3β，12β，20-三醇{(20S，22S)-dammar-22，25-epoxy-3β，12β，20-triol}。分子式为：C₃₀H₅₂O₄，分子量为：477.3938。

白色无定形粉末，[α]_D ²⁰+0.838(c0.1，MeOH)，易溶于甲醇，丙酮等。

本发明的碳13核磁图谱数据见表1：

表1核磁图谱(400MHz，pyridine-d5，ppm，J/Hz)

本发明提供了新人参皂苷酸降解化合物的制备方法，包括酸降解和纯化步骤，人参总皂苷在有机溶剂的酸性溶液中进行，所得酸降解粗品过色谱柱，重结晶得到酸降解终产物。

其制备方法是：取人参皂苷10g置于容器中，加入15％～85％V/V乙醇100mL，加入浓度为5～25％的酸10mL，于60～90℃恒温磁力搅拌器中水浴加热回流2～24h。反应完毕，反应液加入碱性溶液调pH7.0，回收乙醇，加水使悬浮，乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯，干燥，得人参皂苷酸降解化合物粗品；将酸降解化合物粗品用少量有机溶剂溶解，加入适量硅胶搅拌均匀，挥去溶剂，采用正相层析硅胶干法装柱，经过洗脱体系氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水洗脱，甲醇-水重结晶，得新人参皂苷酸降解化合物。

本发明制备酸降解化合物的方法中，人参总皂苷可以是人参茎叶总皂苷、或人参根总皂苷、或人参二醇组皂苷、或西洋参总皂苷、或西洋参茎叶总皂苷、或西洋参二醇细皂苷。

本发明制备酸降解化合物的方法中，酸可以是盐酸、硫酸、冰醋酸、草酸、柠檬酸之一种，浓度范围最佳为5～15％；酸降解在有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、丁醇中进行，浓度范围为30～70％V/V：原料量为有机溶剂的4％～12％；反应在搅拌，加热，冷凝回流的容器中进行。酸降解温度为60～90℃；水解时间为2～24h。碱可以为碱金属氢氧化物、碱金属盐、低级醇钠之一种，浓度范围为5％～15％。

本发明的洗脱体系为氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水的下层溶液，洗脱剂的比例可以为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝(1～10)∶(1～5)∶(1～10)∶(1～5)。

本发明的新人参皂苷酸降解化合物，可单独或与其它中药及中药提取物配成复方载体，采用食品可以接受的添加剂，如赋形剂、香味剂、甜味剂等，制成任何剂型包括淀粉制品、饮品、乳制品、豆制品、烘焙制品等食品。

本发明的新人参皂苷酸降解化合物，可单独或与其它中药及中药提取物配成复方药物，与药学上可接受的赋形剂混合，采用中药制剂的常规制备方法制成任何剂型包括颗粒剂、冲剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、片剂、口服液等，也可与其他营养品混合制成保健食品。

通过以下的测试结果对人参皂苷酸降解化合物抗肿瘤效果进行说明：

(一)体内实验：

小鼠S180肉瘤试验：无菌抽取S180肉瘤接种腹腔积液，用生理盐水洗涤并稀释瘤细胞含量至2×10⁷mL^-1，注射于小鼠左腹股沟处皮下，每只0.2mL，建立移植瘤模型。小鼠按体重随机分为5组：阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(阿霉素0.1g·kg^-1·d^-1)和实验组(本发明药物低、中、高剂量组分别为2.5g·kg^-1·d^-1、5.0g·kg^-1·d^{- 1}、10.0g·kg^-1·d^-1)，每组12只，雌雄各半。常规饲养，自由饮水，实验室温度22～25℃，相对湿度60％～70％，并保持良好的光照和通风条件。接种96h后，开始腹腔给药，每天1次，连续给药7d，每天观察小鼠一般行为表现。停药2d后处死小鼠，完整剥离皮下肿瘤，称重，并计算瘤重系数及抑瘤率。

瘤重系数＝瘤重/小鼠体重；

肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％；

统计学处理：以SPSS10.0软件进行统计分析，体重与肿瘤重量的实验数据以X±S表示，以单因素方差分析比较各给药组与阴性、阳性对照组的差异，结果见表2。

表2本发明化合物小鼠S180肉瘤试验研究(x±s，n＝12)

注：与阴性对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。

小鼠移植瘤抑瘤率接种肿瘤96h后连续给药7d，在给药过程中，每天仔细观察小鼠，发现阴性对照组肿瘤增长较快，并且小鼠消瘦、倦怠。停药2d脱颈处死小鼠，完整剥离肿瘤并称重计算抑瘤率。结果表明随着本发明化合物浓度的增加，肿瘤的重量较对照组减小，抑瘤率分别为17.19％、34.38％、51.56％，阳性对照阿霉素组抑瘤率79.369％。

(二)体外抗肿瘤活性的研究：

器材与药品：SW-CJ-2F超净工作台、DNM-9602酶标仪、CO₂细胞培养箱、QB-600振荡混合器、IX70-S8F倒置相差显微镜、人结肠癌细胞SW1116、人结肠癌细胞HCT116、人肺腺癌细胞A549(吉林大学生物工程实验室供)；高糖DMEM培养液(GIBCO)；MTT；DMSO；新生牛血清(GIBCO)；抗生素；细胞计数板；96孔细胞培养板。

具体方法为：肿瘤细胞的培养将人结肠癌细胞SW1116、人结肠癌细胞HCT116、人肺腺癌细胞A549分别置于含10％新生牛血清的DMEM培养基中，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育72h后，用0.25％的胰消化酶消化，进行分瓶传代培养。取正处于对数生长期的三种细胞，经0.25％的胰消化酶消化后，加入高糖DMEM培养液进行稀释，在细胞计数板上计数并调整细胞密度为7×10⁴～10×10⁴/mL。将稀释好的SW1116、HCT116、A549细胞悬浮液接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育24h。

本发明化合物用DMSO溶解，浓度为50mg/mL。用高糖DMEM培养液分别稀释成640μg/mL，采用倍比稀释法分别配制出320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL，共5种样品浓度。

肿瘤细胞增殖抑制实验将受试样品每个浓度3孔，每孔100μL，加入到接种有SW1116的96孔细胞培养板中，空白对照加入等体积的高糖DMEM培养液，溶剂对照加入等体积的DMSO。于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育72h后，每孔加入MTT20μL进行染色。于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4h后，弃去上清液，每孔加入DMSO150μL，用振荡器摇匀，用酶标仪在492nm波长处测定各孔光密度值(OD₄₉₂值)。抑制率＝(对照组OD₄₉₂平均值-加药组OD₄₉₂平均值)/对照组OD₄₉₂平均值×100％。见表3。

表3本发明化合物体外抗肿瘤活性研究

实验结果

表3结果表明，本发明化合物对三株癌细胞均有抑制作用，抑制率均表现出剂量依赖性，与对照组相比，随着本发明化合物浓度的增加，SW1116细胞、HC1116细胞和A549细胞的凋亡率均增高。

本发明的有益效果在于：本发明资源丰富，反应条件温和，成本低廉，质量可控，周期短，收率高，生产提取工艺简单易行，适合工业化生产，可制成各种食品及保健食品，无毒副作用，可长期服用或食用，易于推广。

具体实施方式

通过以下实施案例进一步描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

取人参皂苷10g，溶于40～60％乙醇100mL中，加入浓盐酸7～12mL，于60～90℃恒温水浴加热回流3小时，加入5％氢氧化钠溶液调pH为7.0，回收乙醇，除盐，干燥，得酸降解化合物粗品，将酸降解化合物粗品用少量丙酮溶解，加入适量硅胶搅拌均匀，挥去溶剂，采用正相层析硅胶干法装柱，经过洗脱体系氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(5∶1∶3∶1)洗脱，甲醇-水重结晶，得新人参皂苷酸降解化合物。

实施例2

取人参皂苷10g，溶于40～60％乙醇100mL中，加入浓盐酸7～12mL，于60～90℃恒温水浴加热回流10小时，加入氢氧化钠溶液调pH为7.0，回收乙醇，除盐，干燥，得酸降解化合物粗品，将酸降解化合物粗品用少量甲醇溶解，加入适量硅胶搅拌均匀，挥去溶剂，采用正相层析硅胶干法装柱，经过洗脱体系氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(2∶1∶3∶1)洗脱，甲醇-水重结晶，得新人参皂苷酸降解化合物。

实施例3

取人参皂苷10g，溶于40～60％乙醇100mL中，加入浓盐酸7～12mL，于90℃恒温水浴加热回流3～10小时，加入氢氧化钠溶液调pH为7.0，回收乙醇，除盐，干燥，得酸降解化合物粗品，将酸降解化合物粗品用少量甲醇溶解，加入适量硅胶搅拌均匀，挥去溶剂，采用正相层析硅胶干法装柱，经过洗脱体系氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(5∶2∶3∶2)洗脱，甲醇-水重结晶，得新人参皂苷酸降解化合物。

实施例4

取人参皂苷10g，溶于75％乙醇100mL中，加入浓盐酸7～12mL，于60～90℃恒温水浴加热回流3～10小时，加入氢氧化钠溶液调pH为7.0，回收乙醇，除盐，干燥，得酸降解化合物粗品，将酸降解化合物粗品用少量无水乙醇溶解，加入适量硅胶搅拌均匀，挥去溶剂，采用正相层析硅胶干法装柱，经过洗脱体系氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(2∶2∶3∶1)洗脱，甲醇-水重结晶，得新人参皂苷酸降解化合物。

实施例5

取人参皂苷10g，溶于40～60％乙醇100mL中，加入硫酸7～12mL，于60～90℃恒温水浴加热回流5小时，加入氢氧化钠溶液调pH为7.0，回收乙醇，除盐，干燥，得酸降解化合物粗品，将酸降解化合物粗品用少量甲醇溶解，加入适量硅胶搅拌均匀，挥去溶剂，采用正相层析硅胶干法装柱，经过洗脱体系氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(3∶1∶5∶1)洗脱，甲醇-水重结晶，得新人参皂苷酸降解化合物。

实施例6

将上述制备的人参皂苷酸降解化合物50mg，用10mL0.3％的食用梭甲基纤维素钠溶解，加入500mL牛奶中制成食品。

实施例7

将上述制备的人参皂苷酸降解化合物50mg，加入5mg异麦芽糖制成溶液，分装成保健食品。

实施例8

将上述制备的人参皂苷酸降解化合物50g，淀粉100g糊精50g，用适量50％乙醇作润湿剂，制成软材，按常规方法制粒，加入质量硬脂酸镁混匀，经压片机制成0.2g/片，每片含新人参二醇50mg。

实施例9

将上述制备的人参皂苷酸降解化合物50mg，用适当的辅料及赋形剂制成合适剂型的药品。

Claims (9)

1.一种新人参皂苷酸降解化合物：其特征在于：所述化合物具有如下结构：

其化学名称为：(20S，22S)-达玛-22，25-环氧-3β，12β，20-三醇{(20S，22S)-dammar-22，25-epoxy-3β，12β，20-triol}；分子式为：C₃₀H₅₂O₄，分子量为：477.3938。

2.根据权利要求1所述的新人参皂苷酸降解化合物的制备方法，其具体步骤如下：

(1)人参总皂苷置于容器中，加入有机溶剂，搅拌，溶解：

(2)加酸，加热，回流反应；

(3)反应完毕，反应液用碱中和后，蒸除有机溶剂，除盐，干燥，得酸降解化合物粗品；

(4)将酸降解粗品重结晶，过正相色谱柱，经过洗脱体系洗脱后，重结晶，得酸降解终产物。

3.根据权利要求2所述的新人参皂苷酸降解化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述的人参总皂苷，是人参茎叶总皂苷、或人参根总皂苷、或人参二醇组皂苷、或西洋参总皂苷、或西洋参茎叶总皂苷、或西洋参二醇组皂苷。

4.根据权利要求2所述的新人参皂苷酸降解化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的有机溶剂是甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇，浓度范围为30～70％V/V，原料量为有机溶剂的4％～12％。

5.根据权利要求2所述的新人参皂苷酸降解化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述的酸是盐酸、或硫酸、或冰醋酸、或草酸、或柠檬酸中的一种，浓度范围为5～15％。

6.根据权利要求2所述的新人参皂苷酸降解化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中酸降解温度为60～90℃，水解时间为2～24h。

7.根据权利要求2所述的新人参皂苷酸降解化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的碱是碱金属氢氧化物、或碱金属盐、或低级醇钠中的一种，浓度范围为5％～15％V/V。

8.根据权利要求2所述的新人参皂苷酸降解化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的洗脱体系为氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水的下层溶液，洗脱剂的比例为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝(1～10)∶(1～5)∶(1～10)∶(1～5)。

9.根据权利要求1所述的新人参皂苷酸降解化合物在抗肿瘤方面的应用。