CN112138017A - 淫羊藿苷的酶解产物及其主要组分宝藿苷i的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了淫羊藿苷的酶解产物及其主要组分宝藿苷I的一种医药用途，具体是淫羊藿苷的酶解产物及其主要组分宝藿苷I在制备治疗骨骼肌萎缩药物中的应用。本发明通过体内外实验证明了淫羊藿苷的酶解产物或宝藿苷I可显著降低骨骼肌萎缩的程度，包括增大肌纤维横截面积、腓肠肌湿重/体质量比值和有氧运动能力，并能通过调节自噬体系上调骨骼肌蛋白含量，极具应用前景。

Description

淫羊藿苷的酶解产物及其主要组分宝藿苷I的医药用途

技术领域

本发明属于医药及中药技术领域，涉及淫羊藿苷的酶解产物及其主要组分宝藿苷I的医药用途，具体涉及一种淫羊藿苷的酶解产物及其主要组分宝藿苷I用于制备治疗骨骼肌萎缩的药物中的应用。

背景技术

淫羊藿是临床常用中药，全草供药用，又名仙灵脾、刚前，《神农本草经》列为中品，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效，用于肾阳虚衰所致阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛。淫羊藿苷(Icariin，ICA)为淫羊藿主要化学成分，具有抗骨质疏松、免疫调节、抗肿瘤和改善心血管系统功能等多种药理活性。淫羊藿苷抗骨质疏松活性明确，其药效主要通过降低钙流失、刺激成骨细胞增殖、抑制骨吸收、促进骨形成等途径发挥。宝藿苷I是淫羊藿苷的主要代谢物，淫羊藿苷脱去一分子葡萄糖后生成宝藿苷I。研究发现，宝藿苷Ⅰ可以促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向成骨分化，与淫羊藿苷相比，宝藿苷Ⅰ增加碱性磷酸酶活力的效能更为显著，宝藿苷Ⅰ对大鼠破骨细胞的分化有较好的抑制作用，其抑制作用优于淫羊藿苷好。近年来关于宝藿苷Ⅰ的药理学研究主要聚焦于对成骨细胞的作用。宝藿苷Ⅰ可以延长细胞生长周期，调节免疫和内分泌系统，改善机体代谢功能，从不同方面延缓老化进程和防止老年病的发生。宝藿苷Ⅰ能靶向Nrf2信号传导，抑制小胶质细胞活性，缓解神经炎症；有效保护激素诱导的的兔早期股骨头坏死；促进成骨细胞增殖；诱导小鼠脂肪干细胞分化为成骨细胞；促进软骨细胞增殖。

随着老龄化的进展，骨骼肌萎缩也是老年人常见疾病，发生骨骼肌萎缩的概率越来越高，70岁以下人群中有13～24％遭受肌肉萎缩之苦，80岁以上肌肉萎缩则超过50％，严重影响老年人运动系统功能，降低生活质量，并诱发或加剧代谢综合症、慢性心衰、慢性阻塞性肺病及肿瘤等。因此研制防治骨骼肌萎缩的药物，能在较短时间内产生较显著的社会效益和经济效益。尽管近来对淫羊藿及其化学成分对骨质疏松症的治疗作用报道较多，但是未见淫羊藿苷的酶解产物及其主要成分宝霍苷I用于防治骨骼肌萎缩症方面的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种淫羊藿苷的酶解产物及其主要组分宝藿苷I的医药新用途，具体为用于制备治疗骨骼肌萎缩药物中的应用。灌胃淫羊藿苷的酶解产物或宝藿苷I可显著降低地塞米松注射后小鼠肌萎缩的程度，包括增大肌纤维横截面积、腓肠肌湿重/体质量比值和有氧运动能力，并能通过调节自噬体系上调骨骼肌蛋白含量。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

淫羊藿苷的酶解产物(Icarisid M)及其主要组分宝藿苷I(Icarisid II)在制备治疗骨骼肌萎缩药物中的应用。宝藿苷I的分子式为C₂₇H₃₀O₁₀，结构式如下式所示：

作为优选的技术方案：

如上所述的应用，所述淫羊藿苷的酶解产物是通过β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷获得的。酶解方法为：淫羊藿苷和β-葡萄糖苷酶于pH＝4、38～42℃条件下反应，萃取取有机相，干燥、浓缩、结晶得宝霍苷I粗品；重结晶得宝霍苷I精制品。

具体的制备方法为：将使用的淫羊藿苷和β-葡萄糖苷酶分别溶于0.2M pH＝4.0的醋酸缓冲液中，40℃搅拌8h，反应液用适量乙酸乙酯萃取3次，收集上层溶液，用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，浓缩液转移至4℃冰箱静置结晶；结晶在40℃下真空干燥3h，得宝霍苷I粗品；甲醇重结晶得宝霍苷I精制品。

如上所述的应用，所述淫羊藿苷的酶解产物中宝藿苷I的含量为40～98wt％。

如上所述的应用，所述制备治疗骨骼肌萎缩的药物的剂型包括：片剂、注射剂、胶囊和口服液(颗粒剂、混悬或脂质体等)中的一种以上。本发明的保护范围并不仅限于此，此处仅列举部分可行的技术方案，其可采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、腹腔注射、肌肉注射等中的一种或多种)进行肌少症及其相关疾病的预防、保护、治疗或科学研究。

本发明还提供一种制备治疗骨骼肌萎缩的药物，所述药物含有有效量的有效组分，所述有效组分包括淫羊藿苷的酶解产物和宝藿苷I中的至少一种。

有益效果：

本发明以淫羊藿苷的酶解产物(Icarisid M)和/或宝藿苷I(Icarisid II)作为制备治疗骨骼肌萎缩药物的活性组分，研究发现，Icarisid M及Icarisid II对地塞米松诱导C2C12肌管细胞萎缩均能起到保护作用，其中以1000nM的Icarisid II和8000nM的IcarisidM的保护作用最为显著，Icarisid M及Icarisid II对地塞米松诱导小鼠骨骼肌萎缩均能起到保护作用，Icarisid M和Icarisid II的最小有效剂量分别为1mg/kg和0.5mg/kg，即说明了Icarisid M或Icarisid II能够有效治疗骨骼肌萎缩的药物，同时其有效作用剂量较小且效果良好，在骨骼肌萎缩治疗领域具有较为广阔的应用前景。

附图说明

图1为淫羊藿次苷I(ICAI)、淫羊藿次苷II(ICAII)、淫羊藿苷(ICA)和淫羊藿素(AICT)对照品HPLC色谱图；

图2为本发明的淫羊藿苷的酶解产物的HPLC色谱图；

图3为不同浓度的宝藿苷I及淫羊藿苷酶解物(即淫羊藿苷的酶解产物)对模型细胞增殖率的影响；

图4为宝藿苷I对肌管细胞MyHC免疫荧光化学染色及肌管直径的影响；

图5为宝藿苷I对模型细胞myhc mRNA相对表达的影响；

图6为宝藿苷I对模型细胞MyHC蛋白表达的影响；

图7为宝藿苷I对模型细胞超微结构的影响；

图8为宝藿苷I及淫羊藿苷酶解物(即淫羊藿苷的酶解产物)对模型小鼠肌力的影响；

图9为宝藿苷I及淫羊藿苷酶解物(即淫羊藿苷的酶解产物)对模型小鼠腓肠肌湿重/体质量比的影响；

图10为宝藿苷I对模型小鼠腓肠肌形态学的影响；

图11为宝藿苷I对模型小鼠腓肠肌横截面积的影响；

图12为宝藿苷I对模型小鼠myhc mRNA表达的影响；

图13为宝藿苷I对模型小鼠MyHC蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步阐述。

实施例1

一种淫羊藿苷的酶解产物(主要组分为宝霍苷I)的制备方法，其具体步骤如下：

称取淫羊藿苷和β-葡萄糖苷酶各约50mg溶于10mL 0.2M pH＝4.0的醋酸缓冲液中40℃搅拌8h，反应液用50mL乙酸乙酯萃取3次，收集上层溶液，用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，浓缩液转移至4℃冰箱静置结晶；结晶在40℃下真空干燥3h，得宝霍苷I粗品；甲醇重结晶得宝霍苷I的精制品(宝霍苷I的粗品及精制品均为淫羊藿苷的酶解产物)。

采用HPLC检测淫羊藿苷的酶解产物(宝霍苷I的粗品及精制品)中宝霍苷I的含量，具体为以如图2所示的淫羊藿苷的酶解产物的HPLC色谱图，参考如图1所示的对照品HPLC色谱图，测得宝霍苷I的粗品中宝霍苷I的含量为63.4％，宝霍苷I的精制品中宝霍苷I的含量为94.2％。

实施例2

测试淫羊藿苷的酶解产物及宝藿苷I对地塞米松诱导C2C12肌管细胞萎缩的保护作用：

对宝藿苷I通过提前用药预防对地塞米松诱导肌管细胞萎缩模型的预防作用进行试验。

(1)试验方法

A.使用100μM Dex(地塞米松)处理C2C12细胞24h进行造模，作为模型组(地塞米松组)。另设不同浓度的中药单体组，具体方法为：在加入地塞米松提前12h加入不同浓度的宝藿苷I(Icarisid II)，使其终浓度为100、200、500、1000nM，以及不同浓度淫羊藿苷酶解产物(Icarisid M)，使其终浓度为300、800nM。

结果：与地塞米松组比较，各浓度Icarisid II及Icarisid M对细胞增殖均有促进作用，以1000nM浓度Icarisid II最明显(P<0.01)。后续实验以100μM的Dex和1000nM的Icarisid II为干预方案。

B.C2C12细胞诱导分化后，随机分组：(1)正常对照组(简称Control)：细胞诱导成肌分化成功后，继续以含2％马血清DMEM高糖培养基进行培养；(2)地塞米松组(简称Dex)：分化成功后，加入终浓度为100μM Dex，继续以含2％马血清DMEM高糖培养基进行培养；(3)宝藿苷I+地塞米松组(简称Dex+Icar)：分化成功后，加入宝藿苷I，终浓度为1000nM，培养12小时，继而加入终浓度为100μM的Dex，继续以含2％马血清DMEM高糖培养基进行培养。然后观察以下指标：

①免疫荧光法检测细胞MyHC表达。兔抗小鼠MyHC一抗(1:500)4℃孵育过夜，Cy3标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗在室温下1h，避光。二抗稀释比例为1：200。DAPI室温孵育10min。

②倒置显微镜拍摄后，随机选择10个视野，共50条肌管，应用Image J软件进行肌管直径检测与分析。

③透射电镜检测细胞超微结构。2.5％戊二醛固定，离心，1％osmic acid固定，梯度脱水，环氧树脂(EpON812)中包埋，乙酸双氧铀及柠檬酸铅进行双染色，电镜下进行观测，着重观察细胞核，自噬体，线粒体状态。

④抽提总RNA，逆转录。qRT-PCR检测myhc基因mRNA表达。抽提蛋白，Westernblot检测MyHC蛋白表达。

(2)试验结果

①宝藿苷I和淫羊藿苷酶解物促进Dex模型细胞增殖能力的量效关系

结果详见图3。与正常组细胞比较，加入100μM地塞米松后细胞增殖率显著下降，有统计学差异(P<0.01)。与地塞米松组比较，各个浓度宝藿苷I(Icarisid II)和淫羊藿苷酶解物(Icarisid M)对细胞增殖均有促进作用，以1000nM的宝霍苷I和8000nM淫羊藿苷的酶解物的效果最明显(P<0.01)。

②对模型肌管细胞MyHC免疫荧光化学染色及肌管直径的影响

结果详见图4(其中DAPI对应的是细胞核，以确定位置，Merge对应的是MyHC与DAPI的融合，以鉴定不同荧光标记是否处于同一个位置)。与正常组比较，Dex组肌纤维变细，同时MyHC荧光信号减弱。与Dex组比较，宝藿苷I组肌纤维直径增宽，荧光信号增强。

③对模型细胞MyHC mRNA相对表达的影响

结果详见图5。与正常组比较，Dex组MyHC表达水平减低，差异有统计学意义(P<0.01)。与Dex组比较，宝藿苷I组MyHC表达水平增高，差异有统计学意义(P<0.01)。

④对模型细胞MyHC蛋白表达的影响

结果详见图6。与正常组比较，Dex组MyHC表达水平减低，差异有统计学意义(P<0.01)。与Dex组比较，宝藿苷I组MyHC表达水平增高，差异有统计学意义(P<0.01)。

⑤对模型细胞超微结构的影响

结果详见图7。正常组细胞可见细胞核(☆所示)核膜清晰，染色质均匀，镜下可见丰富线粒体(→所示)，形态饱满，线粒体嵴清晰，视野下少见自噬体；模型组细胞胞体伪足萎缩，核肿胀，镜下见较多自噬体(*所示)，线粒体形态不一，部分有肿胀；宝藿苷I组细胞可见核饱满，染色质均匀，线粒体多见，线粒体嵴较清晰，自噬体少。

实施例3

测试淫羊藿苷的酶解产物及宝藿苷I对地塞米松诱导小鼠骨骼肌萎缩的保护作用：

对淫羊藿苷的酶解产物及宝藿苷I通过灌胃用药预防对地塞米松诱导小鼠骨骼肌萎缩模型的治疗作用进行试验。

(1)试验方法

正常组(简称Normal)：腹腔注射生理盐水，同时灌胃0.1％乙醇50μl，连续14天，1次/day。模型组(简称Dex)：地塞米松溶液，腹腔注射，1mg/kg.day,同时灌胃0.1％乙醇50μl，连续14天，1次/day。宝藿苷I组(简称Dex+Icarisid II)腹腔注射地塞米松溶液，1mg/kg.day,同时按体重0.005mg/10g宝藿苷I溶液50微升注入胃中，连续灌注14天，1次/day。淫羊藿苷的酶解产物组(简称Dex+Icarisid M)：腹腔注射地塞米松溶液，1mg/kg.day,同时按体重0.01mg/10g淫羊藿苷酶解物50微升注入胃中，连续灌注14天，1次/day。然后观察以下指标：

①小鼠肌力检测：先对小鼠进行三次转棒的适应性训练。检测时，将小鼠放置于转棒上，从0m/s开始按匀加速的速度开始，当小鼠疲劳从转棒上掉下，电脑自动记录每只小鼠握住转棒的时间，作为力竭时间(Time-to-exhaustion，TTE)进行统计分析，评估小鼠的肌力。

②腓肠肌湿重称量：小鼠称重。腹腔取血后，分离下肢腓肠肌，在电子天平上，称取腓肠肌湿重。计算腓肠肌湿重/体质量比值。

③新鲜组织以手术刀片切成0.5×0.5×0.5大小的块状，迅速置于10倍体积的4％的多聚甲醛溶液中，置于4℃，用于病理切片。OCT包埋，切片，HE染色法观察腓肠肌形态。

④肌纤维横截面积的测量：每一组随机选择20个视野，采用Image J软件(4.16版)测量横截面积，测量单位为μm2。对得到的所有图像的结果进行分析统计。

⑤抽提总RNA，逆转录。qRT-PCR检测myhc基因mRNA表达。抽提蛋白，Westernblot检测myhc基因蛋白表达。

(1)试验结果

①宝藿苷I及淫羊藿苷酶解物对模型小鼠肌力的影响：

结果详见图8。与正常组比较，模型组小鼠肌力显著减弱(P<0.05)。与模型组比较，宝藿苷I组和淫羊藿苷酶解物组小鼠的肌力显著增强(P<0.05)，握杆时间分别增强了27.2％和25.5％。

②宝藿苷I及淫羊藿苷酶解物对模型小鼠腓肠肌湿重/体质量比的影响：

结果详见图9。与正常组比较，模型组小鼠腓肠肌湿重/体质量比例减小(P<0.05)。与模型组比较，宝藿苷I组和淫羊藿苷酶解物组小鼠的腓肠肌湿重/体质量比例显著增大(P<0.05)，分别增大了12.7％和14.5％。

③宝藿苷I对模型小鼠腓肠肌形态的影响

结果详见图10。正常组小鼠肌纤维均匀，饱满，横截面大，肌纤维间隙紧密，无炎症及坏死反应，细胞核分布于靠近细胞边缘的位置，贴近细胞膜处。与正常组比较，模型组腓肠肌肌纤维变细，肌纤维间隙较疏松，部分细胞出现细胞膜缺损；宝藿苷I组小鼠较模型组腓肠肌肌纤维增粗，肌纤维间隙较为致密，细胞核多见。

④宝藿苷I对模型小鼠腓肠肌横截面积的影响

结果详见图11。与正常组比较，模型组腓肠肌肌纤维横截面积变小，有显著统计学差异(P<0.01)；而宝藿苷I组小鼠较模型组腓肠肌肌纤维横截面积增大，有显著统计学差异(P<0.05)。

⑤宝藿苷I对小鼠骨骼肌myhc mRNA水平的影响

结果详见图12。与正常组比较，模型组myhc mRNA的表达显著下调；与模型组比较，宝藿苷I干预可显著上调myhc mRNA的表达。

⑥宝藿苷I对小鼠骨骼肌MyHC蛋白水平的影响

结果详见图13。与正常组比较，模型组MyHC蛋白的表达显著下调；与模型组比较，宝藿苷I干预可显著上调MyHC蛋白的表达。

实施例4

一种淫羊藿苷的酶解产物或宝藿苷I的制剂的制备：

(1)淫羊藿苷的酶解产物颗粒剂的制备：

取适量淫羊藿苷的酶解产物，加适量β环糊精、蔗糖和可溶性淀粉(淫羊藿苷的酶解产物：糊精：蔗糖：可溶性淀粉的质量比为1:2:3:4)，用乙醇制软材，16目筛制颗粒，60℃以下干燥，得淫羊藿苷的酶解产物颗粒剂，可用于肌少症及骨骼肌萎缩症得治疗。

(2)宝藿苷I颗粒剂的制备：

取适量宝藿苷I，加适量β环糊精、蔗糖和可溶性淀粉(宝藿苷I：糊精：蔗糖：可溶性淀粉的质量比为1:2:3:4)，用乙醇制软材，16目筛制颗粒，60℃以下干燥，得宝藿苷I颗粒剂，可用于肌少症及骨骼肌萎缩症得治疗。

(3)淫羊藿苷的酶解产物片剂的制备：

称取处方量淫羊藿苷的酶解产物、淀粉、糊精、酒石酸混合均匀。用胶头滴管逐滴加入50％乙醇，边加边搅拌，至出现明显的颗粒为止。用16目筛制粒，于60℃条件下干燥15分钟后继续用16目筛进行整粒。将处方量的硬脂酸镁与整粒的颗粒混合均匀，再用单冲压片机压片，使每片片重0.2～0.5g。

(4)宝藿苷I片剂的制备：

称取处方量宝藿苷I、淀粉、糊精、酒石酸混合均匀。用胶头滴管逐滴加入50％乙醇，边加边搅拌，至出现明显的颗粒为止。用16目筛制粒，于60℃条件下干燥15分钟后继续用16目筛进行整粒。将处方量的硬脂酸镁与整粒的颗粒混合均匀，再用单冲压片机压片，使每片片重0.2～0.5g。

(5)淫羊藿苷的酶解产物胶囊的制备：

称取处方量淫羊藿苷的酶解产物，粉碎成细粉，过筛，装入1号空心胶囊，即得淫羊藿苷的酶解产物胶囊剂，装量量为0.4克。

(6)宝藿苷I胶囊的制备：

称取处方量宝霍苷I，粉碎成细粉，过筛，装入1号空心胶囊，即得宝藿苷I胶囊剂，装量量为0.4克。

(7)淫羊藿苷的酶解产物口服液的制备：

取淫羊藿苷的酶解产物，粉碎成细粉，称取10克，加入500倍量水，混匀，加入矫味剂0.2％甘露醇、0.3％甜菊糖，防腐剂0.1％山梨酸钾，加蒸馏水定容到10000ml，混匀，灭菌，分装，20ml/瓶。

(8)宝藿苷I口服液的制备：

取宝霍苷I，粉碎成细粉，称取10克，加入500倍量水，混匀，加入矫味剂0.2％甘露醇、0.3％甜菊糖，防腐剂0.1％山梨酸钾，加蒸馏水定容到10000ml，混匀，灭菌，分装，20ml/瓶。

(9)宝藿苷I纳米脂质体的制备：

称取400mg宝霍苷I溶于200ml甲醇中，称取3835mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1510mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶于100ml氯仿溶液中，超声溶解，合并上述溶液于圆底烧瓶中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底烧瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。DSPC、DSPE-PEG2000和宝霍苷I的摩尔比为9:1:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入100ml 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45-50℃水浴条件下水化1小时，得到宝霍苷I脂质体粗悬液。将宝霍苷I粗悬液于高压均质仪中分散，20000PSI条件下循环3次，即得到宝霍苷I纳米脂质体。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。

Claims (6)

1.淫羊藿苷的酶解产物在制备治疗骨骼肌萎缩药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿苷的酶解产物是通过β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷获得的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿苷的酶解产物中宝藿苷I的含量为40～98wt％。

4.宝藿苷I在制备治疗骨骼肌萎缩药物中的应用。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述制备治疗骨骼肌萎缩的药物的剂型包括：片剂、注射剂、胶囊或口服液。

6.一种制备治疗骨骼肌萎缩的药物，其特征在于，所述药物含有有效量的有效组分，所述有效组分包括淫羊藿苷的酶解产物和宝藿苷I中的至少一种。

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