CN103446100A

CN103446100A - 牛蒡子苷元的舌下含服制剂

Info

Publication number: CN103446100A
Application number: CN2013102020202A
Authority: CN
Inventors: 赵志全; 郝贵周; 陈凯; 姚景春
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2013-12-18

Abstract

本发明请求保护牛蒡子苷元舌下含服制剂及该制剂用于制备疾病治疗药物的用途，属于医药领域。本发明牛蒡子苷元舌下含服制剂通过加入生物黏性材料和促吸收剂有效地改善了其含服制剂的吸收特征；采用本发明所述的牛蒡子苷元舌下含服制剂用于肿瘤治疗时，可以显著提高药物的抑瘤率，并可改善患者的生存质量。本发明所提供的牛蒡子苷元舌下含服制剂生物利用度高，患者的用药依从性高，因此具有良好的医学应用前景。

Description

牛蒡子苷元的舌下含服制剂

技术领域

本发明涉及一种含有牛蒡子苷元的药物制剂，具体涉及牛蒡子苷元舌下含服制剂及其用于相关疾病治疗的应用，属于医药领域。

背景技术

牛蒡子为菊科二年生草本植物牛蒡的干燥成熟果实，又名大力子、鼠粘子、恶实等。牛蒡子属于常用中药，中医认为它具有疏散风热、宣肺透疹、利咽散结、解毒消肿之功效，用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痄腮丹毒、痈肿疮毒。西医认为它除了具有利尿、消积、祛痰止泄等药理作用外，还用于便秘、高血压、高胆固醇症的食疗。牛蒡主要含有木质素类化合物，以牛蒡子苷和牛蒡子苷元为主。根据实验研究发现，牛蒡子苷元比牛蒡子苷具有更强的生理活性，牛蒡子苷在体内被分解为牛蒡子苷元而产生众多药理作用。目前，已有文献报道牛蒡子苷元具有如下药理活性：1）抗炎及免疫调节作用；2）抗病毒作用，包括HIV-1与流感病毒；3）诱导肿瘤细胞凋亡的作用；4）肾病及糖尿病、糖尿病并发症治疗作用；5）热休克反应抑制作用；6）神经保护作用；7）扩张血管作用；8）血小板活化因子拮抗作用；9）抗老年性痴呆的作用；10）抑制K⁺挛缩的作用等。比如，Cho J Y,et al.Immunomodulatory effect of arctigenin,a lignan compound on tumor necrosis factor-α and nitricoxide production,and lymphocyte proliferation[J].Pharm Pharmcol.1999;51(11):1267-1273.公开了牛蒡子苷元具有抗炎及免疫调节作用；Gao Y,et al.Activity of in vitro anti-influenza virus ofarctigenin[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs(中草药).2002;33(8):724-726.公开了牛蒡子苷元具有抗病毒的作用；Kim S H,et al.Hepatoprotective dibenzylbutyrolactone lignans ofTorreya nucifera against CCl4-induced toxicity in primary cultured rat hepatocytes[J].Biol PharmBull.2003;26(8):1202-1205.公开了牛蒡子苷元具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

日本企业津村株氏会社早在1987年就已经介入了牛蒡子苷元的开发工作，如其在日本专利申请JP1031717公开了牛蒡子苷元治疗肿瘤的药物用途，其在日本专利申请JP1031716公开了牛蒡子苷元治疗心血管疾病的药物用途，其在日本专利申请JP2142723公开了牛蒡子苷元制备肾脏疾病改善药物中的用途。其对于牛蒡子苷元的大力开发更是引导了众多的科技工作者和公司投入到牛蒡子苷元的新药开发研究中。但二十余年来始终没有以牛蒡子苷元为单一药物活性成分的药物上市。因此，研究新的制剂类型，以期改善牛蒡子苷元的吸收特征并提高药物在体内的疗效具有十分重要的意义。

近年来，黏膜给药系统受到越来越多医药研发者的关注，其给药系统制剂的开发越来越完善。目前已经研究上市的舌下给药制剂包括草过敏免疫治疗剂舌下速溶片、低分子肝素舌下含片、鲑鱼降钙素口腔喷剂、硝酸甘油舌下片、单硝酸异山梨酯舌下片、麦角胺、劳拉西泮等。口腔黏膜给药按吸收部分又可分为舌下黏膜给药与颊黏膜给药。其中舌下黏膜给药法是将药物置舌下自然溶解，通过舌下黏膜吸收进而分布于全身的一种给药方法。由于舌下黏膜血管丰富，舌下腺位于舌下黏膜，分泌、积存的唾液多，药物在这里溶解吸收，疗效发挥迅速，尤其适用于救治某些急症病人。

与其他给药途径相比，舌下给药时药物吸收迅速，在很大程度上避免首过消除。但目前专门用于舌下给药的制剂还不普遍，这主要是由于不同药物的物理化学性质的不同，并非所有的药物都可以制备成舌下给药制剂；另外舌下给药本身在给药剂量、药物的吸收、给药剂型等方面还存在着明显的不足，将药物开发成合适的舌下给药制剂需要付出大量的药效学以及药剂学的探索。本发明致力于一种牛蒡子苷元的舌下含服制剂的开发及其用于相关疾病的治疗的用途。

陈黎等（《舌下给药研究进展》中国药物应用与监测2008年第5卷第6期）中发现舌下治疗晚期癌症患者的疼痛时，其镇痛起效时间相对于肌肉注射更短，且用药量减少，不良反应大大低于肌肉注射。

发明内容

关于牛蒡子苷元的单体药物研究已经进行了二十多年，但到现在为止仍然没有以牛蒡子苷元为药物活性成分的药物上市，申请人一直紧跟牛蒡子苷元的最新研究，致力于牛蒡子苷元的新药开发工作，申请人通过众多的药理实验和药剂实验发现：虽然牛蒡子苷元具有显著的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗PAF受体的作用，但是牛蒡子苷元的口服吸收较差，绝对生物利用度不高，影响药物药效的发挥；含有牛蒡子苷元注射剂则由于注射频率较高，且用药安全风险较高，严重影响着患者的用药依从性。普通的牛蒡子苷元药物制剂很难改变牛蒡子苷元的这一吸收特征，牛蒡子苷元的药物制剂研究已经成为困扰牛蒡子苷元上市的最后的难关。为了克服牛蒡子苷元现有口服制剂吸收差且生物利用度低、而注射制剂的用药不良反应大且用药依从性低的现有技术的不足，本发明提供一种含有牛蒡子苷元的舌下含服制剂，该药物制剂的生物利用度相对于口服制剂显著提高，且吸收迅速、用药安全系数和患者的用药依从性高，有效地解决了传统药物存在的不足，具有十分广阔的临床应用前景。

本发明致力于开发一种牛蒡子苷元的舌下含服制剂用于相关疾病的治疗的用途。其中所述疾病可以为本发明申请日前所公开的所有疾病，优选为肿瘤。本发明实施例8证明牛蒡子苷元舌下给药对大鼠肝癌模型的治疗效果，结果显示牛蒡子苷元舌下含服制剂在抑制癌结节数以及肝脏肿大、改善肝脏酶指标以及改善大鼠生存质量方面不仅显著优于阳性药物卡培他滨组，也显著优于牛蒡子苷元口服给药组。本发明实施例9证明了牛蒡子苷元舌下给药对SD大鼠脑胶质瘤模型的治疗效果，结果显示牛蒡子苷元对脑胶质瘤的治疗取得了意想不到的治疗效果，其抑瘤率达到或优于阳性药物卡培他滨，特别是牛蒡子苷元舌下给药组的抑瘤率与阳性药物抑瘤率具有极显著性差异，与牛蒡子苷元口服给药组相比也具有显著性差异。

本发明所述的舌下含服制剂，其以牛蒡子苷元为单一药物活性成分。本发明利用舌下黏膜未角质化，毛细血管丰富、血流速度快的特点，将牛蒡子苷元开发成舌下含服制剂，改变了传统牛蒡子苷元起效过缓或过快、生物利用度不高的缺点。本发明中牛蒡子苷元通过舌下黏膜吸收，通过颈静脉和上腔静脉直接进入血液循环，起效迅速；还能避免口服给药时的首过效应，显著提高生物利用度，保证了药物的治疗效果。本发明药物制剂服药时无需用水，置于舌下含化，服用方便，口感较好。

上述所述的舌下含服制剂含有牛蒡子苷元、促吸收剂以及生物黏附性材料，所述的促吸收剂选自依地酸盐、水杨酸钠、脱氧胆酸钠、油酸、辛酸、月桂氮卓酮、壳聚糖等，优选为壳聚糖。

常规的舌下制剂由于动物吞咽等动作已造成药物溶解后通过消化道进入肝脏内，对药物药效以及药物药效评估造成了困难。为了增加药物在舌下的滞留时间，控制药物的释放速度与释药量，使药物得到充分吸收，上述所述的舌下含服制剂中，包括生物黏附性材料将药物制成黏附制剂。所述生物黏附性材料包括天然高分子材料和合成高分子材料两大类。天然高分子材料可以为明胶、果胶、阿拉伯胶、海藻酸钠中的一种或其组合，合成高分子材料有卡波姆、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基纤维素(HEC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)中的一种或其组合。

本发明所述的舌下含服制剂中，其还可以包含至少一种药学上的崩解剂，其促进与活性剂混合的载体颗粒在舌下粘膜上分散。所述的崩解剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羧甲基淀粉、天然淀粉、微晶纤维素、纤维素树脂或其组合。

牛蒡子苷元对心血管系统具有一定调节作用，快速释放容易引发心血管不良反应，因此本发明上述所述的舌下含服制剂在舌下崩解时限大于10min，优选为15min-25min。本发明所述的舌下含服制剂为片剂、贴膜剂、喷雾剂、水凝胶、粉剂、溶液、黏附剂、脂质体及毫微粒载体等，优选为贴膜剂、黏性片。上述所述的舌下含服制剂中，每一制剂中牛蒡子苷元的含量为0.1mg-100mg，优选为1mg-10mg。

本发明优选提供一种牛蒡子苷元舌下含片，该舌下含片含有主药牛蒡子苷元、崩解剂和填充剂。所述崩解剂选自微晶纤维素、交联羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、淀粉、吐温、十二烷基磺酸钠中的任一种或多种。所述填充剂选自微晶纤维素、微晶纤维素-甘露醇、微晶纤维素-微粉硅胶、乳糖、改性淀粉-1500、甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藓糖、预胶化淀粉、糖粉、葡萄糖、糊精、硫酸钙中的任一种或多种。该舌下含片中还可以根据需要加入矫味剂或粘合剂或润滑剂，其中所述矫味剂选用甜菊苷、糖粉、甘草甜素、阿斯帕坦、三氯蔗糖、甜蜜素、索马甜、糖精中的任一种或多种；所述粘合剂选用纯化水、乙醇、淀粉浆、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆、糊精、明胶浆、阿拉伯胶浆、海藻酸钠和糖浆中的任一种或多种；所述润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、十二烷基磺酸钠、富马酸硬脂酸钠中的任一种或多种。

本发明所述舌下含服制剂用于相关疾病治疗时，与现有技术相比具有以下治疗优势：

1）本发明所述的舌下含服制剂用于相关疾病特别是肿瘤的治疗时，其治疗效果优于现有的牛蒡子苷元制剂，而且可以显著改善患者的生活质量。本发明实施例8证明牛蒡子苷元舌下含服制剂在抑制癌结节数以及肝脏肿大、改善肝脏酶指标以及改善大鼠生存质量方面显著优于阳性药物卡培他滨组和牛蒡子苷元口服给药组。本发明实施例9证明了牛蒡子苷元舌下给药对SD大鼠脑胶质瘤模型的治疗效果，显示牛蒡子苷元舌下给药组的抑瘤率与阳性药物抑瘤率具有极显著性差异，与牛蒡子苷元口服给药组相比也具有显著性差异。

2）本发明所述的舌下含服制剂配方清楚，用于相关疾病特别是肿瘤的治疗时，可以大大提高患者的用药依从性，从而可以最大程度上发挥牛蒡子苷元抗肿瘤的药物效果。

3）本发明将牛蒡子苷元制备成舌下含服制剂，大大提高了牛蒡子苷元在动物体内生物利用度，增强了药物的治疗效果，且本发明通过制剂技术保证了舌下含服制剂的平稳缓慢释放，降低了药物的心血管不良事件。

具体实施例

为了使本领域技术人员能够清楚知晓本发明内容，以下通过具体实施例进一步描述本发明。

实施例1牛蒡子苷元舌下含片

牛蒡子苷元	2.5g
		糖粉	40g
乳糖	20g
		羧甲基纤维素钠	2g
硬脂酸镁	1g

制备工艺：将主药及各辅料成分烘干、粉碎过筛预处理，将主药与糖粉、乳糖、羧甲基纤维素钠混匀，以纯水作为粘合剂将混匀的物料制备软材，过20目筛制粒并于60℃下干燥制备干颗粒，将硬脂酸镁加入到上述干颗粒总混，压片即得。

实施例2牛蒡子苷元舌下含片

牛蒡子苷元	10g
		乳糖	30g
微晶纤维素	30g
		三氯蔗糖	2g
交联聚乙烯吡咯烷酮	3g
		脱氧胆酸钠	5g
微粉硅胶	1g
		硬脂酸镁	1g

制备工艺：上述组分烘干、粉碎过筛预处理后混匀直接压片制得。

实施例3牛蒡子苷元贴膜剂

牛蒡子苷元3%，氮酮2.5%，丙二醇5%，加入丙烯酸酯共聚物乳液至100%，研磨均匀后涂布在80μm厚的PVC薄膜上，70±5℃干燥成透明固体分散薄片，即牛蒡子苷元的透皮贴膜剂。

实施例4牛蒡子苷元水凝胶剂

牛蒡子苷元

1.5g

泊洛沙姆	200g
		醋酸盐缓冲液3.8	77.34g
羟丙基-β-环糊精	5g
		依地酸钠	5g
海藻糖	3g

制备方法：将牛蒡子苷元用适量醋酸盐缓冲液磁力搅拌（500rpm-800rpm）溶解，同时将羟丙基-β-环糊精和海藻糖溶于处方量的泊洛沙姆中。将上述两种混合物混合，并加入处方余量的醋酸盐缓冲液并减慢磁力搅拌转速至100-200rpm，混匀后即可得到牛蒡子苷元水凝胶剂。

实施例5牛蒡子苷元舌下含片

牛蒡子苷元	10g
		糖粉	50g
乳糖	20g
		羧甲基纤维素钠	2g
依地酸钠	5g
		硬脂酸镁	1g

实施例6牛蒡子苷元舌下含片

牛蒡子苷元	5g
		糖粉	40g
乳糖	20g
		羧甲基纤维素钠	2g
羟乙基纤维素	3g
		脱氧胆酸钠	2g
硬脂酸镁	1g

实施例7牛蒡子苷元舌下粉剂

牛蒡子苷元	5g
		β环糊精	80g
吐温80	20g
		依地酸钠	20g
乳糖	140g
		10%淀粉浆	适量
丙二醇	20g

制备工艺：称取处方量的牛蒡子苷元溶于10mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液中得牛蒡子苷元溶液。称取处方量β环糊精分散于适量水中，加入处方量依地酸钠及吐温80，磁力搅拌器充分搅拌3h后冷冻干燥得到结合物。上述结合物与处方量乳糖及适量10%淀粉浆混合均匀后，缓慢地滴加牛蒡子苷元溶液，充分搅拌均匀将所得混合物冷冻干燥得固体粉末。将处方量丙二醇加入到固体粉末中，搅拌使液体充分被固体吸收后即可得到牛蒡子苷元舌下粉剂。

实施例8牛蒡子苷元制剂对大鼠原发性肝癌的治疗作用

有文献表明：大鼠肝对化学试剂敏感，鼠龄3个月内体重200g以下易诱发肝癌。通常情况下雄性大鼠较雌性大鼠更易被诱发肝癌，主要是雄性激素在肝癌发生过程中起重要作用。因此本实验中采用雄性SD大鼠作为造模对象。

1材料与方法

1.1动物分组选取健康雄性SD大鼠（由山东新时代药业有限公司实验动物中心提供）70只，体重100～120g，随机分为7组(每组10只):正常组、模型组、牛蒡子苷元口服高组、牛蒡子苷元口服低组、牛蒡子苷元舌下含片高组、牛蒡子苷元舌下含片低组、卡培他滨治疗组。

动物模型制备：正常组（S组）双后肢皮下交替注射3ml·kg^-1（花生油、中性菜籽油或橄榄油），每周2次，共4次，试验期间饮用灭菌纯水；其余各组大鼠按3ml·kg^-1于双后肢皮下交替注射50%CCl₄溶液（花生油、中性菜籽油或橄榄油配制），每周2次，共4次，休息2周。第5周开始使用灭菌纯水配制浓度为95μg·ml^-1的二乙基亚硝胺（DEN）溶液（避光保存，新鲜配制），供实验大鼠自由饮用，每天更换1次，连续饮用90d。

1.2给药方法及给药剂量

正常组和模型组灌胃给予相同体积生理盐水；

卡培他滨组：灌胃给予300mg/kg/d的卡培他滨药物溶液，卡培他滨剂量的选择以临床化疗剂量为依据，按人与大鼠间体表面积折算的等效剂量比值表计算得出；

牛蒡子苷元舌下给药高组：舌下给药1mg/kg/d的牛蒡子苷元舌下含片；

牛蒡子苷元舌下给药低组：舌下给药0.1mg/kg/d牛蒡子苷元舌下含片；

牛蒡子苷元口服给药高组：灌胃给予10mg/kg/d的牛蒡子苷元微乳浓缩液；

牛蒡子苷元口服给药低组：灌胃给予1mg/kg/d的牛蒡子苷元微乳浓缩液；

牛蒡子苷元微乳浓缩液按CN102210653A说明书第6页实施例1制备工艺制备。牛蒡子苷元舌下含片按本发明实施例2所述制备工艺制备。各给药组均自饮用DEN后第36天开始给药，每天给药1次，连续给药60d。其中舌下给药的方法为：大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，然后将动物固定在手术板上，手术结扎动物的食管。向大鼠舌下给予受试药物，维持动物俯卧姿势，使药物停留在舌下区域并不溢出口腔外。

1.3常规检查称体重，解剖大鼠，取出肝脏，称肝重，计算肝重比体重，记录肝表面癌结节数。

1.4生化检测断头取血，收集血清，用放射免疫测定法检测血清甲胎蛋白（AFP）的分泌量，用7170A型自动生化分析仪(由日本岛津公司制造)测γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、碱性磷酸酶（ALP）的含量。

表1牛蒡子苷元对大鼠肝癌结节、体重、肝重、肝/体重比的影响

分组	癌结节数（个）	体重（g）	肝重（g）	肝重/体重（%）
					正常组	0	310.40±14.58	9.94±0.64	3.20±0.17
模型组	25.30±5.34	200.14±15.24	20.15±1.49	10.06±0.48
					卡培他滨组	16.24±6.34^*	234.26±12.65^*	18.24±1.64	7.78±0.42^*
牛蒡子苷元舌下高组	11.48±5.14^**&&	271.59±11.42^**&&	13.26±1.23^**&&	4.88±0.24^**&&
					牛蒡子苷元舌下低组	14.26±3.24^**&	288.65±13.54^**&&	11.42±1.09^**&&	3.95±0.19^**&&
牛蒡子苷元口服高组	18.27±6.24^*	238.56±14.23^*	15.26±1.02^*&	6.39±0.21^*&

牛蒡子苷元口服低组

20.25±3.99^*

251.38±14.39^**&

12.36±0.95^**&&

4.91±0.19^**&

与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与卡培他滨组相比，^&P＜0.05,^&&P＜0.01

由表1可以看出，各治疗组相对于模型组均体现出了明显的治疗效果（P＜0.05），其中牛蒡子苷元舌下治疗组治疗效果要优于阳性药物卡培他滨组，卡培他滨治疗组优于牛蒡子苷元口服给药组,其具体表现在：

1）由各给药组治疗后的癌结节数可以看出，无论是牛蒡子苷元舌下高组还是牛蒡子苷元舌下低组，其肝组织上癌结节数均显著少于牛蒡子苷元口服给药组，也少于阳性药物组，这表明牛蒡子苷元舌下含片相对于牛蒡子苷元口服给药更能防止肿瘤细胞的转移和侵袭。

2）由各给药组的体重可以看出，无论是牛蒡子苷元舌下给药组还是牛蒡子苷口服给药组，其体重均高于卡培他滨组，其中牛蒡子苷元舌下给药组体重要大于牛蒡子苷元口服给药组体重。这表明牛蒡子苷元作为天然植物中提取的天然药物，其可以降低对动物机体的毒副作用，改善动物生存质量。牛蒡子苷元舌下给药组毒副作用相对于口服给药更小。

3）由各给药组肝重及肝重/体重比可以看出，卡培他滨组可以显著引发肝肿大，牛蒡子苷元各给药组引发的肝肿大不明显，其中牛蒡子苷元舌下给药组的肝重/体重比要显著小于牛蒡子苷元口服给药组，这提示牛蒡子苷元舌下给药的安全性更高。

表2牛蒡子苷元各给药组对大鼠血清中AFP、γ-GT、ALP的影响

分组	AFP（ng/ml）	γ-GT（U/L）	ALP（U/L）
				正常组	3.25±0.56	0.78±0.31	124.21±31.17
模型组	120.45±25.34	199.14±35.24	310.06±50.44
				卡培他滨组	76.24±6.34^*	144.26±22.65^*	277.78±42.45^*
牛蒡子苷元舌下高组	31.48±5.14^**&&	71.59±31.43^**&&	204.88±27.28^**&&
				牛蒡子苷元舌下低组	54.26±11.44^**&	98.65±23.55^**&&	213.95±24.62^**&&
牛蒡子苷元口服高组	78.27±16.35^*	118.52±27.28^*&	266.39±30.21^*
				牛蒡子苷元口服低组	70.25±13.98^*	141.38±34.36^*	234.91±31.18^**&

由表2可以看出，各治疗组相对于模型组均体现出了明显的治疗效果（P＜0.05），其中牛蒡子苷元舌下治疗组治疗效果要优于阳性药物卡培他滨组以及牛蒡子苷元口服给药组,其具体表现在：

1）由各给药组治疗后的AFP值可以看出，无论是牛蒡子苷元舌下高组还是牛蒡子苷元舌下低组，其AFP均显著少于牛蒡子苷元口服给药组，也少于阳性药物组，这表明牛蒡子苷元舌下含片对肿瘤细胞的增殖抑制效果比牛蒡子苷元口服给药更强。

2）由各给药组的γ-GT和ALP可以看出，无论是牛蒡子苷元舌下给药组还是牛蒡子苷口服给药组，γ-GT和ALP均小于卡培他滨组，其中牛蒡子苷元舌下给药组γ-GT和ALP要小于牛蒡子苷元口服给药组。这表明牛蒡子苷元作为天然植物中提取的天然药物，其可以降低对动物机体的毒副作用，改善动物生存质量。与牛蒡子苷元口服给药组相比，牛蒡子苷元舌下给药组对肝组织的损伤更小。

实施例9牛蒡子苷元对SD大鼠脑胶质瘤细胞C6的抑制作用

1、细胞培养

C6细胞使用含有10%小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，5%的CO₂培养箱中常规培养。当细胞处于对数生长期时，用胰蛋白酶适量消化3～5min后，弃去消化液。用PBS液吹打冲洗1～2次形成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml细胞的悬液用于接种。

2、颅内接种造模

0.4%戊巴比妥钠（10ml/kg）腹腔麻醉大鼠，剪去头顶部毛发，碘伏消毒。选取内眦连线与头部正中矢状面交点向后纵向切开头皮约1cm，确定右尾状核靶点，于冠状缝前1mm，中线右旁开3mm，用微量注射器在颅骨上钻孔6mm深度，后退1mm，深达硬脑膜表面而不伤及脑组织。沿骨孔缓慢匀速注射注入10μL细胞悬液（1×10⁷个/ml），用时10min，注射完毕后留针5min，缓慢退针。碘伏消毒注射部位。麻醉复苏后单笼常规饲养14d。

3、实验分组

SD大鼠，体重250g左右，雄性，70只，随机分为正常组、模型组、卡培他滨组、牛蒡子苷元舌下高组、牛蒡子苷元舌下低组、牛蒡子苷元口服高组、牛蒡子苷元口服低组，共7组，每组10只。除对照组外其他各组均按照上述颅内接种造模方法造脑胶质瘤模型。术后3天后各给药组分别给予下述治疗药物，给药直至模型组开始出现死亡。

正常组和模型组灌胃给予相同体积生理盐水；

其中牛蒡子苷元微乳浓缩液按CN102210653A说明书第6页实施例1制备工艺制备得到，牛蒡子苷元舌下含片按本发明实施例2所述制备工艺制备。

4、试验纪录

模型组自颅内接种脑胶质瘤日第21d死亡。因此各给药组于接种后第21日解剖，于接种后的第24d解剖大鼠,经活体左心室灌注4%多聚甲醛,固定肿瘤的全脑标本。按垂直和水平方向测量肿瘤大小。肿瘤最大横径测量：于肿瘤接种24d取大鼠全脑，10%甲醛溶液固定后沿肿瘤中心作冠状切面，水平方向测量每个肿瘤最大横截面面积(包括坏死等病变组织)。组织病理学检查：所有脑标本固定，脱水，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察。肿瘤体积=πa²b∕6(π为圆周率，a为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径)。抑瘤率计算公式为：抑瘤率=(对照组肿瘤平均体积-实验组肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积×100%。

表3牛蒡子苷元各治疗组对大鼠脑胶质瘤模型的治疗效果

分组	体重	瘤体积（mm³）	抑瘤率（%）
				正常组	305.40±14.27	——	——
模型组	210.14±11.35	120.45±25.34	0
				卡培他滨组	234.26±12.65^*	56.24±6.34^*	53.31±4.78^*
牛蒡子苷元舌下高组	281.59±11.25^**&	12.48±3.14^**&&	89.64±2.54^**&&
				牛蒡子苷元舌下低组	287.65±14.36^**&	21.26±3.44^**&	82.35±2.67^**&
牛蒡子苷元口服高组	249.56±14.23^*	50.27±8.35^*	58.26±4.21^*
				牛蒡子苷元口服低组	251.38±14.39^*	65.25±7.98^*	45.83±3.16^*

由上表可以看出，在牛蒡子苷元对SD大鼠脑胶质瘤的体内抑制实验中，不论是牛蒡子苷元低治疗组还是牛蒡子苷元高治疗组，与模型组相比均极显著（P＜0.01）的降低了大鼠的肿瘤体积；其中牛蒡子苷元舌下高组和牛蒡子苷元舌下低组的抑瘤率不仅与阳性药物卡培他滨治疗组存在显著差异，与牛蒡子苷元口服治疗组也存在明显的差异，这表明舌下给予牛蒡子苷元的生物利用度更高，治疗效果更好。实施例9的实验结果还表明，牛蒡子苷元舌下治疗组还可以显著增加用药期间大鼠的体重，这表明牛蒡子苷元舌下给药可以显著改善大鼠的生活质量，在临床上改善患者的生活质量可以大大提高患者的用药依从性和药物的有效性，因此牛蒡子苷元舌下含服制剂具有十分广阔的应用前景。

实施例10牛蒡子苷元舌下含服制剂的生物利用度研究

1、实验材料

1.1药品与试剂

牛蒡子苷元舌下含片(按照本发明实施例2所述制备工艺制得)；牛蒡子苷元乳剂(制备工艺同CN101036643A说明书第4页实施例3)；牛蒡子苷元微乳剂（制备工艺同CN102210653A说明书第6页实施例1）；牛蒡子苷元对照品（纯度99.5%）；内标苯海拉明由天津金耀氨基酸有限公司提供；甲醇（色谱纯）购自美国Fisher Scientific公司；甲酸（色谱纯）、二氯甲烷（色谱纯）、甲基叔丁基醚（色谱纯）购自天津康科德科技有限公司；甲酸铵（分析纯）购自上海润捷化学试剂有限公司；娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团生产。

1.2实验仪器

Waters ACQUITY TQD^TM UPLC-MS/MS型液质联用仪，配有Masslynx4.1数据处理软件，美国Waters公司；TurboVAP蒸发仪，美国Caliper公司；Targin^TM VX-II型多管涡旋振荡器，Targin Tech有限公司；AB54-S型分析天平，瑞士梅特勒－托利多仪器公司；3K15型低温高速离心机，德国Sigma公司；B600型低速自动平衡离心机，白洋离心机厂

2、实验方法

2.1UPLC-MS/MS分析条件

色谱条件：BEH C₁₈（100mm×2.1mm,i.d.,1.7μm）色谱柱；柱温40°C；流动相甲醇－10mM甲酸铵（0.2%甲酸，10%甲醇）（65：35，v/v），流速0.2mL/min。进样器温度10°C。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）正离子扫描模式，毛细管电压：0.8kV，待测物锥孔电压：35V，内标（苯海拉明）锥孔电压：20V，离子源温度：110℃，去溶剂气温度：350°C，去溶剂气（N₂）流速：500L/h，锥孔气（N₂）流速：30L/h，碰撞气流速：0.12mL/min。采用多反应监测（MRM）模式，监测反应质荷比：牛蒡子苷元m/z373.2→137.1（碰撞能：28eV），内标m/z256.1→167.0（碰撞能：12eV），驻留时间：0.1s。

2.2标准溶液配制

精密称取牛蒡子苷元标准品10mg于10mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得浓度为1mg/mL的标准贮备液。随后用甲醇梯度稀释成浓度为1、2、5、20、100、500、800、1000ng/mL的标准溶液。精密量取苯海拉明（内标）注射液（20mg/mL），用甲醇稀释配制成200μg/mL的储备液，并进一步用甲醇稀释为12.5ng/mL标准溶液。所有溶液置于4℃冰箱保存备用。

2.3血浆样品处理

大鼠血浆100μL，加入100μL甲醇，100μL内标甲醇溶液，2.5mL提取溶剂（甲基叔丁基醚：二氯甲烷=4:1），涡旋振荡2min，3000rpm条件下离心10min；取上清液2mL，40°C氮气流吹干，加流动相100μL复溶，涡旋振荡1min，4°C14000rpm条件下离心5min，10μL上清液进样UPLC/MS/MS系统分析。

3绝对生物利用度研究

3.1血浆样品采集

40只Wistar大鼠(270±30)g，雌雄各半，由山东新时代药业有限公司实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(鲁)20060019。在温度20～22°C，相对湿度45%～65%，光照/黑暗12h/12h条件下饲养，自由饮食、饮水。实验时自由分为四组，每组10只：牛蒡子苷元微乳制剂灌胃给药、牛蒡子苷元乳剂灌胃给药、牛蒡子苷元注射液静脉注射给药、牛蒡子苷元舌下含片舌下含服给药。

微乳灌胃给药：将已禁食12小时自由饮水的健康Wistar大鼠10只，雌雄各半，单次灌胃给药，给药剂量为10mg/kg，给药体积0.8mL/100g。给药前12h禁食，自由饮水。分别于给药前(0h)、给药后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12和24h眼眶后静脉丛取血300μL左右，肝素抗凝，4°C12000rpm条件下离心5min，分离血浆，保存于-20°C低温冰箱中。实验期间自由饮水，灌胃后2h进食。

乳剂灌胃给药：给药方法及给药剂量同微乳灌胃给药。

静脉给药：将已禁食12小时自由饮水的健康Wistar大鼠10只，雌雄各半，分别尾静脉注射给予牛蒡子苷元注射液，给药剂量为2.5mg/kg。分别于给药前(0h)、给药后0.033、0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12和24h眼眶后静脉丛取血300μL左右，肝素抗凝，4°C12000rpm条件下离心5min，分离血浆，保存于-20°C低温冰箱中。实验期间自由进食与饮水。

舌下给药：将已禁食12小时自由饮水的健康Wistar大鼠10只，雌雄各半，舌下给予按本发明实施例2制备成的舌下片剂，给药剂量为1mg/kg。分别于给药前(0h)、给药后0.033、0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12和24h眼眶后静脉丛取血300μL左右，肝素抗凝，4°C12000rpm条件下离心5min，分离血浆，保存于-20°C低温冰箱中。实验期间自由进食与饮水。舌下给药的给药方法为：大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，然后将动物固定在手术板上，手术结扎动物的食管。向大鼠舌下给予受试药物，维持动物俯卧姿势，使药物停留在舌下区域并不溢出口腔外。

3.2血浆样品测定

所有血浆样品按2.3项下的“血浆样品处理”方法操作，进行UPLC-MS/MS定量分析，测定血浆药物浓度。每天至少建立一条标准曲线，同时配制血浆低、中、高三个浓度（分别为2，20和800ng/mL）的质控（QC）样品。QC样品的样本数大于当天测试样品数的6%，根据当日标准曲线计算未知样品和质控样品的浓度。上述QC样品中最多允许1/3超出理论值的±15%（最低点为±20%），且超标点不允许发生在同一浓度，否则此批数据不被接受。

3.3药代动力学参数计算

将测定的血药浓度－时间数据用DAS软件（Drug and Statistics，中国数学药理学会，孙瑞元等编制）计算药动学参数。达峰浓度（C_max）、达峰时间（t_max）为实测值，所有药代参数按照统计矩法计算，主要参数计算公式如1至3。其中C_t为最后可测定样本浓度，t为最后可实测药物浓度的采样时间。

AU C_{0 &RightArrow; t} = Σ_{i = 1}^{n} \frac{(C_{i} + C_{i - 1})}{2} (t_{i} - t_{i - 1}) - - - (1)

AU C_{0 &RightArrow; \infty} = AU C_{0 &RightArrow; t} + \frac{C_{t}}{k_{e}} - - - (2)

F = \frac{D_{iv} \times AU C_{oral (0 &RightArrow; t)}}{D_{oral} \times AU C_{iv (0 &RightArrow; t)}} - - - (3)

4.实验结果

4.1UPLC-MS/MS定量分析方法

4.1.1专属性

UPLC-MS/MS色谱图显示，牛蒡子苷元和内标苯海拉明的保留时间分别为1.80min和1.64min，未见血浆中有内源性杂质干扰。

4.1.2标准曲线

以进样量(ng)为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果所示，大鼠血浆中牛蒡子苷元在1～1000ng/mL范围内线性关系良好，相关系数（r²）均大于0.99，标准曲线各浓度点的相对偏差均小于15%。典型的线性回归方程为：y=0.0059x+0.0013，r²=0.996

4.1.3准确度与精密度

在2ng/mL及800ng/mL浓度下，牛蒡子苷元在大鼠血浆样品中的精密度分别为10.06%和4.19%；准确度分别为-1.82%和4.25%。表明本方法准确可靠，重现性良好，可满足体内药代动力学研究的要求。

4.1.4回收率和基质效应

牛蒡子苷元在高、低两个浓度的相对回收率所示，本方法测定条件下血浆中内源性物质的离子抑制或增强作用可忽略不计，对目标化合物和内标的质谱响应没有明显影响。

4.1.5稳定性

牛蒡子苷元的稳定性考察结果表明其血浆样品室温放置1h、2h、6h均不稳定，相对偏差超过40%；血浆样品-20°C冻存5天后，相对偏差接近30%左右；处理后的血浆样品在自动进样器（10°C）放置24h稳定，相对偏差均小于15%；牛蒡子苷元的水样室温放置4h稳定，相对偏差均小于15%。

4.2各给药组给药后主要药动学参数测定结果

表4牛蒡子苷元各给药组给药后的主要药动学参数

参数	乳剂组	微乳剂组	静脉注射组	舌下含服组
					Ke/h^-1	0.8888±0.0747	0.8206±0.0786	0.7974±0.0887	0.6894±0.0754
T_1/2/h	0.7798±0.0689	0.7980±0.0556	0.8694±0.0962	1.0542±0.0742
					Tmax/h	1.5645±0.1826	1.2633±0.1012	——	0.4542±0.0035
Cmax/μg·ml^-1	0.5013±0.0502	0.6222±0.0627	——	0.4574±0.0389
					AUC/μg·ml^-1·h	1.4978±0.1280	4.6520±0.5201	1.8978±0.5680	1.6547±0.4107

表4为牛蒡子苷元各给药组给药后的主要药动学参数。根据表4，分别计算牛蒡子苷元乳剂灌胃给药、牛蒡子苷元微乳剂灌胃给药、牛蒡子苷元舌下含服的绝对生物利用度F。结果见表5。牛蒡子苷元制备成舌下含服剂舌下给药后，其绝对生物利用度高达87.19%，显著高于乳剂或微乳剂口服的绝对生物利用度。

表5牛蒡子苷元各给药组给药后的绝对生物利用度

组别	给药剂量（mg/kg）	AUC（μg·ml^-1·h）	AUC/D	F（%）
					静脉注射组	1	1.8978	1.8978	——
舌下含服组	1	1.6547	1.6547	87.19
					乳剂组	10	1.4978	0.1498	7.89
微乳剂组	10	4.6520	0.4652	24.51

在上述说明书中，已参考各种实施例各优选实施方案描述了本发明，但是，对于本领域技术人员而言，显然本发明的范围不限于这些实施例和实施方案，在不偏离本发明思想下进行的进一步的修改和变化均属于本发明的范围。

Claims

1.一种含有牛蒡子苷元的药物制剂，其特征在于所述药物制剂为舌下含服制剂。

2.如权利要求1所述的药物制剂，其特征在于所述舌下含服制剂包括牛蒡子苷元、促吸收剂和生物黏附性材料。

3.如权利要求2所述的药物制剂，其特征在于所述促吸收剂依地酸盐、水杨酸钠、脱氧胆酸钠、油酸、辛酸、月桂氮卓酮或壳聚糖中的一种或多种。

4.如权利要求2所述的药物制剂，其特征在于所述生物黏附性材料选自明胶、果胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇中的一种或多种。

5.如权利要求2所述的药物制剂，其特征在于所述舌下含服制剂还可以包括崩解剂。

6.如权利要求2所述的药物制剂，其特征在于所述崩解剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉、羟丙基纤维素、天然淀粉、微晶纤维素或纤维素树脂中的一种或多种。

7.如权利要求2所述的药物制剂，其特征在于所述舌下含服制剂为片剂、贴膜剂、喷雾剂、水凝胶、粉剂、溶液、黏附剂、脂质体或毫微粒载体。

8.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于舌下含服制剂为贴膜剂、黏性片。

9.如权利要求1所述的药物制剂，其特征在于所述舌下含服制剂为缓释制剂。

10.如权利要求1所述的药物制剂，其特征在于所述舌下含服制剂的崩解时限大于10min。

11.如权利要求1所述的药物制剂，其特征在于所述舌下含服制剂的崩解时限为15min-25min。

12.如权利要求1-10任一所述的药物制剂，其特征在于所述每一制剂中牛蒡子苷元的含量为0.1mg-100mg。

13.如权利要求12所述的药物制剂，其特征在于所述每一制剂中牛蒡子苷元的含量为1mg-10mg。

14.权利要求1所述含有牛蒡子苷元的药物制剂在制备疾病治疗药物中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于所述疾病为肿瘤。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于所述肿瘤为肝癌或脑胶质瘤。