CN109793739A - 一种喹喔啉酮衍生物的结构、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种喹喔啉酮衍生物(如式Ⅰ所示化合物)的结构、制备方法、及其药学上可以接受的盐在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途，这种化合物作为醛糖还原酶抑制剂和抗氧化剂，通过抑制醛糖还原酶的活性，同时有效地清除自由基、脂质过氧化物以及抑制活性氧，从而达到预防和/或治疗糖尿病并发症的作用。

Description

一种喹喔啉酮衍生物的结构、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及有机化学、药物化学及药理学领域，具体涉及到一种新颖的喹喔啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构、制备方法、对醛糖还原酶(Aldose Reductase，ALR2)的抑制作用和对DPPH自由基清除作用，在预防和/或治疗糖尿病并发症方面的应用，以及在降低患糖尿病机体内葡萄糖含量、脂质过氧化物丙二醛(MDA)方面以及8-异前列腺素(8-ISO)含量方面的应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是当前威胁全球人类健康的最主要的慢性病之一，并且日趋严重，危害性主要在于其并发症。糖尿病并发症包括肾病、视网膜病、神经性疾病和心脑血管疾病等代谢功能综合症。由于糖尿病并发症的高致残率和高致死率，它已成为世界上大多数国家居民健康和寿命的主要威胁之一。但是，目前在世界范围内针对糖尿病并发症的药物几乎是一片空白。依帕司他(Epalrestat)是目前唯一上市的糖尿病并发症治疗药物，但仅限于日本市场，近期被引入中国和印度。

大量动物和临床实验已证明醛糖还原酶抑制剂对治疗糖尿病并发症非常有效。过去30年中，至少有14种醛糖还原酶抑制剂被证明非常有效并且已通过 II期临床。其中最有效的是在日本已上市的依帕司他、和已进入或通过III期临床的非达司他(Fidarestat)和AS-3201，且非达司他被证明比已上市的依帕司他更有效，它在体内的抑制效果要远远高于依帕司他。尽管如此，很多醛糖还原酶抑制剂仍存在生物利用度低，治疗效果不佳或严重的副作用和过敏性反应等问题，甚至有的已经上市的药物由于致敏作用而撤市。因此，开发更为安全有效的治疗糖尿病并发症的药物是当务之急。

同时，能够直接抑制活性氧或氧化应激的抗氧化剂，也是应对糖尿病并发症的重要候选物。作为天然抗氧化剂的黄酮类化合物曾被发现具有醛糖还原酶抑制活性，只是其活性强度不足未能获得进一步的发展。

另外，在预防或者治疗糖尿病并发症的同时，能够降低患糖尿病机体内血糖水平，提高患有糖尿病机体对血糖浓度的调节能力，对于治疗糖尿病也是一个重要的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的对ALR2具有较强抑制能力，同时对自由基和脂质过氧化物具有较强抑制能力的化合物及其制备方法，通过提取大鼠晶状体的醛糖还原酶进行这类化合物对ALR2的抑制活性实验，并通过配制1,1- 二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液和提取大鼠的脑匀浆进行化合物在大鼠体外对自由基的清除实验，证明了此化合物是高效的醛糖还原酶抑制剂，能够明显的抑制ALR2的活性，同时能够有效抑制自由基的生成，从而达到预防和/或治疗糖尿病并发症的作用。

另外本发明对这种喹喔啉酮衍生物在链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠机体内进行了血糖测试(Glu)、葡萄糖糖耐量实验(GTT)和脂质过氧化物(MDA) 实验，在Leptin瘦素受体和LDL敲除的糖尿病db/db小鼠进行了葡萄糖糖耐量实验(GTT)、脂质过氧化物(MDA)和8-异前列腺素(8-ISO)实验，发现了这种化合物在体内对于患糖尿病小鼠血糖降低的作用，以及对脂质过氧化物的清除作用和对活性氧的抑制作用,同时进一步印证了化合物在患糖尿病小鼠的体内疗效。

因此，本发明的第一个方面，提供了式Ⅰ所示化合物结构、合成、药学上可以接受的盐在制备、预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途，以及在患糖尿病小鼠血糖降低方面的用途。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病并发症及降低患糖尿病机体血糖含量的药物，其包含：治疗有效量的式Ⅰ所示的喹喔啉酮类化合物、药学上可以接受的盐作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。

本发明的第二方面，提供了一种具有式Ⅰ结构的化合物的制备方法，包括步骤：

(ⅰ)以式Ⅰa为原料，用草酸作为酰胺化试剂，经过1步操作形成式Ⅰb化合物：

(ⅱ)以式Ⅰb为原料，发生氯化反应，从而形成式Ⅰc化合物：

(ⅲ)以式Ⅰc为原料，在碱存在下，通过水解反应,从而形成式Ⅰd化合物：

(ⅳ)以式Ⅰd为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-N键的生成在1位N上偶联上乙酸甲酯，从而形成式Ⅰe化合物：

(ⅴ)以式Ⅰe为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-C键的生成在3位C上偶联上3-甲氧基-4-羟基苯乙烯，从而形成式Ⅰf化合物：

(ⅵ)以式If为原料，发生脱甲基反应，形成式Ig化合物；

(ⅶ)以式I g为原料，发生脱甲基反应，形成式I h化合物；

本发明的第三方面，提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病并发症的药物化合物，其包含：治疗有效量的是如权利要求1、2、3中任一条所述的用途，其特征在于：所述化合物，药学上可以接受的盐作为的醛糖还原酶抑制剂在制备预防或治疗糖尿病并发症和降低患糖尿病机体血糖含量药物的应用。

发明的主要优点在于:

经过广泛而深入的研究，合成了一种新型的具有结构式Ⅰ的喹喔啉酮衍生物，并经过体外实验证实了此类化合物对ALR2和自由基有很好的抑制作用，且对醛还原酶(Aldehyde Reductase，ALR1)没有明显的抑制作用，说明本发明的喹喔啉酮衍生物是高效的、高选择性、低毒的多功能醛糖还原酶抑制剂，具备用于制备预防和/或治疗糖尿病并发症的药物的用途。经过对该化合物在患糖尿病小鼠体内的糖耐量实验(GTT)、脂质过氧化物实验(MDA)和8-异前列腺素(8-ISO)实验，发现了这种化合物在体内对于患糖尿病小鼠血糖降低的作用，以及对脂质过氧化物的清除作用和对活性氧的抑制作用。

活性成份

如本文所用，术语“活性成分”、“活性化合物”、“本发明的化合物”、“新型的醛糖还原酶抑制剂”可以互换使用，这些术语所指的均为本发明的具有结构式Ⅰ所示的喹喔啉酮化合物，药学上可接受的盐。

药物组合物

本发明还提供了预防和/或治疗糖尿病并发症以及用于患糖尿病机体降糖作用的药物组合物，其包含：

(a)预防和/或治疗有效量的式Ⅰ所示的喹喔啉酮化合物，药学上可接受的盐作为活性成分；

(b)药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由…组成”和“由…组成”都包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、和过敏反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的活性物质或其生理上可接受的盐传送给人和/或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是固体或液态。

本发明所述的药物组合物所含活性成分占所述药物组合物总重量的 0.01-99.9％；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂，其中组合物的总重量为 100％。

附图说明

图1本发明实施例的一种喹喔啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构及其制备方法流程图。

以下将用实施例进一步说明本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，但不可以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数及说明，除另外说明外，都是以质量为依据。实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

请参阅附图1，本发明实施例提供一种喹喔啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构及其制备方法，其包括以下步骤：

S2:所述反应中用到的氯化试剂除了二氯亚砜，还可以是三氯氧磷、五氯氧磷等，反应温度40℃-50℃；

S3:所述反应中用到的碱，除了氢氧化锂，还可以是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等，反应温度55℃-75℃；

S5：所述反应中用到的催化剂，除了醋酸钯与三邻甲基苯基膦，还可以是四三苯基膦钯，醋酸钯与三苯基膦，氯化钯与三苯基膦，氯化钯与三临甲基苯基磷等；所述反应中用到的碱，除了三乙胺，还可以是二乙胺、叔丁醇钠等；所述反应中用到的溶剂，除了N,N-二甲基甲酰胺外，还可以是甲苯、二甲基亚砜等；反应温度90℃-120℃；

S7：所述反应中用到的脱甲基试剂，除了三溴化硼，还可以是三氯化铝、苯硫酚等。

实施例一：制备2-(3-(3,4-二羟苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸的合成(化合物1)

将4.475g邻苯二胺与6.752g草酸加入到250mL烧瓶中混合，加入50mL 水使其溶解，再加入5mL浓盐酸酸化，加热至100℃，搅拌6h，用薄层层析法 (TLC监测)判断原料物邻苯二胺全部消失后停止反应。待反应液降温至常温，真空泵抽滤，水洗滤液直至测定pH呈中性，用无水MgSO₄干燥后再次过滤，得到化合物喹喔啉-2,3(1H,4H)-二酮(白色晶体，产量7.476g，产率为92％)¹H NMR(400MHz,[D₆]DMSO):δ7.065(d,2H,J＝6.4Hz),7.115(d,2H,J＝6.4Hz), 11.894(s,2H)。

称取4.054g喹喔啉-2,3(1H,4H)-二酮，量取3.63ml SOCl₂两者混合加入到250mL烧瓶中，再分别量取3mL DMF和30mL CH₂Cl₂使其溶解。加热至 45℃，搅拌3h，用TLC监测判断原料物喹喔啉-2,3(1H,4H)-二酮全部消失后停止反应。等待反应液降温至常温后，倒入冰水中搅拌冷却，待冰全部融化后，用CH₂Cl₂多次萃取至上层水相呈无色后合并有机相。再用饱和K₂CO₃溶液清洗用以中和残留的酸，用无水MgSO₄干燥后，真空泵抽滤，减压旋干，柱层析(洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯按照5:1的比例混合)提纯得化合物2,3-二氯喹喔啉(无色晶体，产量4.629g，产率为93％)：¹H NMR(400MHz, [D₆]DMSO):δ7.826(d,2H,J＝6.4Hz),8.046(d,2H,J＝6.4Hz)。

称取0.724g 2,3-二氯喹喔啉与0.192g LiOH加入到盛有10mL THF和4 mL H₂O(THF：H₂O＝5：2)的100mL烧瓶中混合溶解，加热至65℃，搅拌24h，用TLC监测判断原料物2,3-二氯喹喔啉全部消失后停止反应。等待反应液降温至常温后，加入60mL NH₄Cl的饱和水溶液到反应液中，分4次加入四氢呋喃萃取反应液，每次加入15mL，合并有机相后再用NH₄Cl的饱和水溶液清洗3至4次，用无水MgSO₄干燥后用真空泵抽滤，减压旋干，柱层析(洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯按照2:1的比例混合)提纯得到化合物3- 氯-喹喔啉-2(1H)-酮：(白色固体，产量0.657g，产率91％)¹H NMR(400MHz, [D₆]DMSO):δ12.923(s,1H),7.736(d,1H,J＝7.2Hz),7.575(d,1H,J＝7.2Hz), 7.353(m,2H)。

将2.915g 3-氯-喹喔琳-2(1H)-酮加入到盛有15mL C₂H₃N的250mL烧瓶中震荡溶解，再分别称量4.476g K₂CO₃与1.494mL溴乙酸甲酯加入混合，加热至65℃，搅拌2至3h，用TLC监测原料物3-氯-喹喔琳-2(1H)-酮全部消失后停止反应，烧瓶内为淡黄色产物。等待反应液降温至常温后，用硅藻土和脱脂棉作为过滤介质用真空泵抽滤，减压旋干，用少量乙酸乙酯加热溶解将所得固体产物，再加入石油醚，最后冷藏静置得重结晶出纯净化合物2-(3-氯-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(乳黄色絮状固体，产量3.346g，产率为82％)。¹H NMR(400MHz,[D₁]CDCl₃):δ7.837(m,2H),6.798(d,1H), 5.132(s,2H),3.824(s,3H).

将0.504g 2-(3-氯-2-酮喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯加入到100mL的两口圆底烧瓶中，再分别称取0.022g含量为5mol％的醋酸钯和0.043g含量为10mol％的三邻甲基苯基膦加入混合。在氮气保护条件下，加入20 mlN,N-二甲基甲酰胺，室温条件搅拌30min至其完全溶解。之后称量0.450 g 3-甲氧基-4-羟基苯乙烯，量取6ml三乙胺，加入反应体系后保持氮气保护环境下，加热至100℃，搅拌回流12h，用TLC监测判断原料物2-(3-氯-2-酮喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯全部消失后停止反应。待反应液降温至常温后，加入少量水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水MgSO4干燥，真空泵抽滤，减压旋干，所得固体用柱层析(洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯按照3:1的比例混合)提纯后，得到化合物2-(3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯：(黄色固体，产量0.414g，产率为 64％)¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(s,1H),7.89(d,J＝7.7Hz,1H),7.58(d,J＝ 16.0Hz,1H),7.48(s,1H),7.37(s,1H),7.08(d,J＝8.4Hz,1H),6.94(d,J＝7.9Hz,1H), 5.81(s,1H),5.09(s,2H),3.96(s,3H),3.79ppm(s,3H).

将0.300g 2-(3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯加入到100mL两口圆底烧瓶中，再量取20mL脱水的CH₂Cl₂溶剂，超声使化合物完全溶解。将两口圆底烧瓶放入冰槽，并在氮气环境保护条件下冰浴搅拌20分钟。用干燥的CH₂Cl₂溶解1当量的BBr3，用1mL注射器抽取，并逐滴缓慢加入至烧瓶中。常温条件下反应2到4h，用TLC监测判断原料物2-(3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯全部消失后停止反应。向反应液加入少量CH₂Cl₂适当稀释，倒入冰水中进行淬灭，搅拌30min，分液萃取，收集有机相。无水MgSO₄干燥，真空泵抽滤，减压旋干，所得固体用柱层析(洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯按照 2:1的比例的混合液)提纯后，得到化合物2-(3-(3,4-二羟苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯：(紫黑色固体，产量0.162g，产率为54％)。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(s,1H),7.89(d,J＝7.7Hz,1H),7.58(d,J＝16.0Hz, 1H),7.48(s,1H),7.37(s,1H),7.08(d,J＝8.4Hz,1H),6.94(d,J＝7.9Hz,1H), 5.15(s,1H),5.09(s,2H),3.71(s,1H),3.79ppm(s,3H).

将0.704g 2-(3-(3,4-二羟苯乙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯于50mL烧瓶中，配制10mL LiOH饱和水溶液，加入8mL四氢呋喃形成混合溶剂体系后一并加入烧瓶，常温条件下搅拌反应2h。用TLC监测判断原料物2-(3-(3,4-二羟苯乙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯全部消失后停止反应，用10％HCl酸化反应液至pH为2至3，此时有紫黑色固体析出，过滤后水洗沉淀，真空条件下干燥沉淀，用乙酸乙酯溶解沉淀物，石油醚重结晶后得到化合物2-(3-(3,4-二羟苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸 (紫黑色固体，产量0.359g，产量为51％)：¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ 12.202(s,1H),δ7.89(s,1H),7.56(d,J＝7.7Hz,1H),7.504(d,J＝16.0Hz,1H), 7.418(s,1H),7.29(s,1H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),6.94(d,J＝7.9Hz,1H),5.09(s, 2H),3.71(s,1H),3.79ppm(s,1H).

化合物对ALR2和ALR1体外抑制作用实验

实验中用到了ALR2测定用磷酸盐缓冲溶液、ALR1测定用的磷酸钠缓冲液 1、磷酸钠缓冲液2、NADPH溶液以及D,L-甘油醛溶液、D-葡萄糖醛酸钠溶液，它们的配制方法如下：

(1)配制0.1M,pH＝6.2的ALR2测定用磷酸盐缓冲溶液

溶液A：3.12g NaH₂PO₄·2H₂O溶于100ml水配成0.2M的溶液；

溶液B：3.58gNa₂HPO₄·12H₂O溶于50ml水配成0.2M的溶液。

取A 81.5ml，B 18.5ml，用水稀释至终体积为200ml，调节pH至6.2，即得。

(2)配制10mM,pH＝7.2的ALR1测定用的磷酸盐缓冲溶液1 0.3801g磷酸钠，8.5513g蔗糖，0.0809g EDTA二钾盐，0.0175mLβ-巯基乙醇溶于100mL水中，调节pH至7.2，即得。

(3)配制10mM,pH＝7.2的ALR1测定用的磷酸盐缓冲溶液2 0.3801g磷酸钠，0.0809g EDTA二钾盐，0.0140mLβ-巯基乙醇溶于100mL水中，调节pH至7.2，即得。

(4)配制0.104mM NADPH溶液(以缓冲溶液作为溶剂) 0.0043gNADPH溶于50ml缓冲溶液配制成。

(5)配制10mM D,L-甘油醛溶液(以缓冲溶液作为溶剂) 0.045g D,L-甘油醛溶于50ml缓冲溶液配制成。

(6)配制20mM D-葡萄糖醛酸钠溶液(以缓冲溶液作为溶剂) 0.2341g D-葡萄糖醛酸钠溶于50ml缓冲溶液1中配制成。

(7)处理透析袋：

①把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段，剪三段。在大体积的2％(W/V)NaHCO₃和1mM EDTA二钾盐(pH＝8.0)中将透析袋煮沸10min。

②用蒸馏水彻底清洗透析袋，放在1mM EDTA二钾盐(pH＝8.0)中，将之煮沸10min。

③冷却后，存放在4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内，从此时取用透析袋时必须带手套。用前在透析袋内装满水，然后排出，将之清洗干净。

(8)ALR2的提取：从正常杀死的老鼠眼球中迅速提出晶状体，然后加入3倍(0.4ml/lens)于其体积的冷去离子水(0-4℃)，再用Glas-Potter匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以12000×g转速，0-4℃的温度，离心30min。最后取上清液，即为ALR2的水溶液，用于酶活测试。

(9)ALR1的提取：将大鼠断颈处死，迅速取出肾脏，然后加入3倍(3ml/g 肾脏)于其体积冷却的10mM磷酸钠缓冲液1(pH＝7.2，内含0.25M蔗糖，2.0 mM EDTA二钾盐，2.5mMβ-巯基乙醇)(0-4℃)，再用Glas-Potter匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以12000×g转速，0-4℃的温度，离心30min。取上清液，加入饱和硫酸铵溶液，形成饱和度为40％的硫酸铵溶液，0-4℃下搅拌30min，12000×g转速低温离心15min。取上清液重复上述步骤，分别使硫酸铵的饱和度达到55％，然后是75％的盐溶液。75％饱和度的硫酸铵溶液离心后的沉淀用50体积10mM磷酸钠缓冲液2(pH＝7.2，内含2.0mM EDTA二钾盐， 2.0mM β-巯基乙醇)溶解，并用此缓冲液透析过夜。透析后的即为ALR1的水溶液，用于酶活测试。

(10)酶活性的测试：在30℃的温度下，在1ml测试比色皿中分别加入0.25mL0.104mM NADPH，0.25mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.2)，0.1mL所提取的酶液，0.15mL去离子水。参照比色皿中加入0.25mL 0.104mM NADPH，0.50mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.2)，0.1mL所提取的酶液，0.15mL去离子水。然后把含有上述混合液的两个比色皿放在30℃条件下，保温10min。最后向测试比色皿中加入0.25mL 10mM底物开始反应，用紫外分光光度计在340nm监测5min。从所得数据，以吸光度为纵轴，时间为横轴，可得一直线，求得此直线的斜率，记为I₀，代表酶活。酶的活性最佳值是处于NADPH吸光度变化在 0.01±0.0010(ALR2)或0.015±0.0010(ALR1)吸光度单位/min的范围内，如果不在此范围，通过稀释酶液来使其达到这一范围。对测试比色皿要加对照比色皿是为了校正由于非酶因素(比如空气中氧气也会氧化NADPH)所导致的 NADPH的氧化。

(11)化合物抑制百分数的测试：同测酶活的方法相似，只是在未加底物时，要在测试比色皿和参照比色皿中各加入5μL的被测化合物溶液。所得直线的斜率记为I_x。然后根据下面的公式计算可得该浓度下的抑制百分数。

I％＝(|I₀-I_x|/|I₀|)×100％

重复测量不同浓度的化合物溶液，分别计算出相应浓度的抑制百分数，可得到“抑制百分数”对“浓度对数”的直线，然后从图中读出抑制百分数为50％对应的浓度对数，反对数即可得IC₅₀。

表1化合物1体外对ALR2和ALR1的抑制活性

^aIC₅₀(μM)(95％C.L.)是在本发明所实施的实验体系中所测得值

^b在浓度10^-5M下的抑制率

实验证实，化合物1在体外对ALR2有明显的抑制作用，IC₅₀值为17.9nM，且该化合物对ALR1没有明显的抑制作用，说明该化合物具有高选择性。

DPPH法测定化合物体外抗氧化活性

(1)0.025mg/mL DPPH溶液的配制

0.025gDPPH溶于1000mL甲醇中，搅拌完全溶解即得。

(2)化合物甲醇溶液的配制

不同化合物分别配制成100μM、50μM、10μM等不同浓度。

(3)化合物DPPH自由基清除率的测定

化合物对DPPH自由基清除能力的测定步骤，如表2所示，取0.1mL化合物溶液，加入到1mL的DPPH溶液中，用甲醇补足至3mL。将混合溶液摇匀，室温反应2h后，在517nm波长处测定各样品的吸光度值，每个样品平行测定 3次，取平均值，计算抑制率，Trolox为对照样，化合物DPPH自由基清除率测定结果，如表3所示。

化合物DPPH自由基清除率测定公式如下：

K＝|1-(A_i-A_j)/A_C]×100％

其中A_i为加入化合物后的吸光度值；A_j为未加DPPH，只加化合物的吸光度值；A_c为未加化合物，只加DPPH的吸光值。

表2化合物DPPH自由基清除率的测定步骤(单位mL)

表3化合物1DPPH自由基清除率测定结果

实验证实，化合物1在体外对DPPH自由基有明显的抑制作用，尤其是在 100μM浓度下DPPH自由基清除率为96.7％，说明这些化合物具有很强的体外抗氧化活性。

动物体内实验(STZ诱导的小鼠)

(1)实验动物及分组

链脲佐菌素(STZ)作为一种广谱性抗生素，不仅具有抗菌、对神经内分秘肿瘤细胞的毒性作用，还广泛应用于糖尿病小鼠的诱导实验中。本实验采用的糖尿病小鼠模型为STZ诱导糖尿病小鼠。

遵从随机分组的原则，将造模成功的糖尿病小鼠，平均分成四组，每组10 只，分别为空白组、低剂量药物组、高剂量药物组、二甲双胍阳性对照组。

实验期间，小鼠饲养在北京理工大学制药工程专业化学实验中心，实验仪器用具和食物均进行灭菌操作。遵循SPF级动物饲养条件，温度设置在24℃，通风，12小时交替照明，小鼠自由采食、进水，并保持鼠笼的干燥和洁净。

(2)药物和试剂

0.5％CMCNa溶液的配制：准确称取CMCNa 0.05g，分多次缓慢加入到100 ml、90℃的去离子水中，加热不断搅拌5小时，至羧甲基纤维素钠完全溶解。待溶液将至室温，倒入150ml的离心管中，用封口膜密闭封好，置于4℃冰箱中冷藏待用。小鼠的灌胃量在0.1-0.3ml/10g的体积范围，实验选择0.15ml/kg 进行灌胃，剂量选择为：低剂量组-100mg/kg，高剂量组-200mg/kg，阳性对照组-250mg/kg，空白组按照相应体重灌胃不同体积CMCNa。

低剂量组：准确称取化合物2的质量为0.333g，置于研钵中，研磨至均匀细小粉末状，无明显可见大颗粒，然后将化合物缓慢加入到50mlCMCNa溶液中，搅拌均匀，即得到浓度为6.67mg/ml的溶液(100mg/kg小鼠重量)

高剂量组：准确称取化合物2的质量为0.666g，置于研钵中，研磨至均匀细小粉末状，无明显可见大颗粒，然后将化合物缓慢加入到50mlCMCNa溶液中，搅拌均匀，即得到浓度为13.32mg/ml的溶液(200mg/kg小鼠重量)

阳性对照组：将两片0.5g/片的二甲双胍置于研钵中，研磨至均匀细小粉末状，无明显可见大颗粒，然后将二甲双胍粉末缓慢加入到60mlCMCNa溶液中，搅拌均匀，即得到浓度为16.65mg/ml的溶液(250mg/kg小鼠重量)

血糖测试(Glu)

常见的便携式血糖仪有三种分析方法，分别为葡萄糖氧化酶电化学法、葡萄糖氧化酶光化学法和葡萄糖脱氢酶电化学法，该实验选用的血糖仪为葡萄糖脱氢酶电化学法。葡萄糖脱氢酶能特异的催化β-D葡萄糖和NAD+(NADP+)生成 D-葡萄糖酸内酯和NADH(NADPH)，根据反应前后电流的变化，体现血糖值的大小。

对造模成功的糖尿病小鼠，根据分组给药，分别在第7天，第14天，第21 天，禁食10小时(禁食不禁水)，剪尾测血糖。挤血时注意不要过度用力，以防止部分组织液进入血液中，对血液造成稀释，测量数据失准。用碘伏在剪尾处进行消毒，防止小鼠感染。

表4 STZ诱导小鼠葡萄糖含量实验结果

在小鼠成功造模后，即第0天，四组糖尿病小鼠的血糖值均在16.2mmol/L 附近。实验进行至第7天，各组小鼠血糖值均有一定程度的下降，其中L-dose 组和H-dose组血糖分别降低了28％和13.9％，Ctrl组血糖值下降了20.2％，相比于Ctrl组，L-dose组下降比例更大，但总体来看，L-dose组和H-dose组降糖效果不明显。由数据分析得出，二甲双胍具有明显的降糖功效(P＜0.05)，血糖值由开始的16.4mmol/L，降低至9.41mmol/L，相比于第0天降低了42.6％，作为上市药物，二甲双胍的降糖作用明显具有优势。第14天，各组血糖值均较第7天有所上升，初步分析血糖的上升与小鼠糖尿病病情的恶化有关，随着实验的进行，小鼠胰岛β细胞受损程度加深，机体对葡萄糖的利用率下降。Ctrl 组、L-dose组、H-dose组对模型鼠血糖无明显降低作用。但通过SPSS.17检验，二甲双胍组仍有明显的降糖作用，即P＜0.05。进一步说明二甲双胍的降糖效果。第21天，糖尿病小鼠病情进一步加重，四组实验模型鼠的血糖值均上升。通过 3周的给药和血糖测试，说明醛糖还原酶抑制剂对糖尿病模型鼠的降糖效果不明显，二甲双胍具有良好降糖效果。

葡萄糖糖耐量实验(GTT)

(1)小鼠过夜禁食16小时。

(2)称重，取0点血。

(3)腹腔注射20％葡萄糖2g/Kg体重，分别记录每只动物注射的具体时间。

(4)按不同动物的具体注射时间分别在0、15、30、60、90、120min时间点进行血糖测定。结果如表5。

表5 STZ诱导小鼠糖耐量实验结果

由表可知，四组糖尿病模型鼠在注射葡萄糖30min内，血糖值急剧升高， 30min时，Metformin组血糖值达到33.6mmol/L，L-dose组达到41.5mmol/L，Ctrl组达到45.1mmol/L。H-dose组在60min达到41.4mmol/L。30min-60min，除H-dose组，其它三组血糖均不同程度降低，60min时，Ctrl组降至36.44mmol/L， L-dose组降至39.76mmol/L，Metformin组降至30.89mmol/L。通过与 Ctrl组对比，醛糖还原酶抑制剂对血糖的调节无明显作用，葡萄糖的吸收和分解，降低血液中的葡萄糖含量。60min-90min各组血糖下降趋于缓慢，Ctrl组、L-dose 组、H-dose组血糖值均降至35mmol/L附近，Metformin组继续保持较好的调节效果，血糖值降至30.89mmol/L。90min-120min血糖下降趋势趋于平稳，由于糖尿病小鼠胰岛β细胞受损严重，120min时，各实验组小鼠的血糖仍高于初始值，但各药物对血糖的调节趋势已经可以表征其治疗效果。

分析上述数据可知，二甲双胍对于糖尿病模型鼠的血糖恢复效果较好，葡萄糖耐量明显改善，说明二甲双胍对小鼠的糖耐量受损具有一定修复作用。通过与空白对照组比较，醛糖还原酶抑制剂对糖尿病小鼠的血糖恢复无明显作用。

血浆中脂质过氧化物MDA含量的测定

1)试剂盒组成与溶液的配制：

试剂一：液体，20ml一瓶，室温保存备用；

试剂二：为12ml液体，用时每瓶按试剂盒说明书加一定量的双蒸水，充分混匀，置于4℃冰箱保存；

试剂三：为粉剂，用时将粉剂加入到90-100℃的热双蒸水中，充分溶解后，按试剂盒说明，用双蒸水补足体积，再按说明书加入冰醋酸，充分混匀，避光，置于4℃冰箱保存；

标准品：10n mol/mL四乙氧基丙烷，4℃冰箱保存。

2)实验步骤

(1)取离心管若干，每个样品做三个平行管，按表6进行加样；

表6血浆中脂质过氧化物MDA含量测定加样表(单位mL)

(2)摇动几下试管架，混匀。再按表6加入其他试剂；

表7血浆中中脂质过氧化物MDA含量测定加样表(单位mL)

(3)旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95度水浴，或煮沸40min；

(4)取出，流水冷却，3500-4000转/分的速度离心10分钟，然后取上清，532nm 处，蒸馏水调零，测各管吸光度值；

(5)MDA含量计算公式：

通过以上方法，得出的数据如下：

表8 STZ诱导小鼠MDA实验数据

本实验利用MDA试剂盒，对给药21天后糖尿病小鼠的肝脏组织进行MDA 含量测试，通过肝脏中MDA的含量，体现药物的抗氧化能力及治疗效果。以上各组测定值均为给药21天后的测定值，其中正常组和空白组表示分别灌胃相应剂量的羧甲基纤维素钠溶液。分析上表得出，21天时，正常组小鼠MDA值为0.557nmol/mgprot，Ctrl组为0.993nmol/mgprot，L-dose组为0.694nmol/mgprot， H-dose组为0.666nmol/mgprot。通过统计软件SPSS.17.0分析得出，L-dose组和 H-dose组相较于Ctrl组均有显著性差异(p<0.05)；二甲双胍组为0.808 nmol/mgprot，L-dose和H-dose相对于二甲双胍组对MDA的降低显著(p<0.05)。说明该醛糖还原酶抑制剂在氧化应激过程中，对丙二醛的有明显抑制作用。

动物体内实验(db/db小鼠)

(1)实验动物及其分组

为了准确探究醛糖还原酶在动物体内的药效，使用北京大学医学部同一批次的Leptin瘦素受体和LDL敲除的糖尿病db/db小鼠16只，小鼠出生八周左右，体重为40-50g，雌雄各半，随机分成四组，分别是：空白组、药物治疗低剂量组、药物治疗高剂量组、普罗布考阳性对照组，每组4只。

实验期间，小鼠饲养在北京大学医学部实验动物中心的层流柜中，所有器具及食物均消毒，无菌操作，遵循SPF级动物饲养条件。环境温度稳定为24℃，相对湿度为45％，通风，12h交替照明，小鼠自由进食、进水，保持垫料干燥。

(2)药物和试剂

0.5％CMCNa(羧甲基纤维素钠)溶液的配制：准确称取CMCNa 0.100g，慢慢加入到200ml、70℃的去离子水中，同方向不断搅拌7h左右，直至CMCNa 全部溶解，停止水浴加热，将得到的混悬剂降至室温，用封口膜封好后放入4℃冰箱中冷藏待用。

化合物1溶液的配制：

1)药物治疗低剂量组：准确称取0.153g化合物54，研钵研磨均匀无可见大颗粒，溶解于11ml配置好的CMC钠中，震荡摇匀待用，即得到了浓度为 50mg/kg的药液。

2)药物治疗高剂量组：准确称取0.764化合物54，研钵研磨均匀无可见大颗粒，溶解于11ml配置好的CMC中，震荡摇匀待用，即得到了浓度为250mg/kg 的药液。

阳性对照组：

普罗布考治疗组：将0.125g/片的普罗布考片溶解于4.5ml CMC中，静置15 分钟后，震荡摇匀，全部溶解后即得到了100mg/kg的普罗布考阳性对照药液。

每天灌胃给药前称量体重，小鼠灌胃体积为200μl/50Kg，每周从小鼠眼眶后静脉取血，EDTA抗凝，分离血浆、血清于-20℃冰箱保存待测。

葡萄糖糖耐量实验(GTT)

(1)小鼠过夜禁食16小时。

(2)称重，取0点血。

(3)腹腔注射20％葡萄糖2g/Kg体重，分别记录每只动物注射的具体时间。

(4)按不同动物的具体注射时间分别在0、15、30、60、120min时间点进行血糖测定。实验结果如表9所示。

表9化合物1在db/db小鼠糖耐量实验结果

首先，Ctrl组小鼠作为空白对照组，随着时间的增加，小鼠的糖尿病病情会比第八周开始实验时有所加重，在注射高剂量的葡萄糖时，机体血糖水平急剧增加在15min时达到最高60mmol/L，15-120min范围内血糖值下降的十分缓慢，120min时血糖值只降到了48mmol/L，说明空白对照组小鼠的糖耐量严重受损。红色曲线代表的高剂量组在高血糖的情况下能很快讲体内的血糖降低，说明高剂量组的小鼠体内的药物发挥了作用。其次，Pro和L-Dose组小鼠作为糖尿病治疗组，在注射高剂量的葡萄糖时机体血糖值增加，在30min时达到最高 55mmol/L，30-120min范围内血糖值下降，120min时血糖值降到了40和48 mmol/L，相对于空白对照组小鼠，血糖增加速度降低，机体整体的血糖值降低，说明治疗组小鼠的糖耐量有所修复。最后，红色线条代表的H-Dose组在注射高剂量的葡萄糖时机体血糖值增加更为缓慢，在15min时只达到40mmol/L，30min 时升高到42mmol/L，30-120min内血糖值下降较快，120min时血糖值降到了 30mmol/L，较阳性对照组和药物治疗低剂量组，糖耐量有了明显的改善，说明醛糖还原酶药物对db/db小鼠有明显的治疗作用，减轻了小鼠的糖尿病病情。

脂质过氧化物含量测定实验(MDA)

本实验利用MDA试剂盒，对给药14天后糖尿病小鼠的肝脏组织进行MDA 含量测试，通过肝脏中MDA的含量，体现药物的抗氧化能力及治疗效果。糖尿病小鼠给药14天后肝脏中MDA含量检测数据如表10所示。

表10 db/db小鼠MDA实验数据结果

由表分析可以发现由0天、7天到14天的灌胃给药过程中小鼠的MDA含量逐渐降低，0天是四组的MDA含量为48-55μM之间，7天时四组的MDA含量降到了40μM上下，14天时四组的MDA含量下降到20μM左右，但是十四天时L-dose和H-dose组较Pro组略高，说明醛糖还原酶抑制剂在降低MDA方面发挥了比较显著的作用，但是可能由于剂量或者药物本身的原因，还没有达到普罗布考发挥的药效，还需要后续继续进行反复实验验证。

异前列腺素测定(8-ISO)

(1)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

(2)弃去液体，甩干，每个孔中加入DetectionAb工作液100μl(在使用前15 分钟内配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

(3)弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

(4)每孔加HRP Conjugate工作液(临用前15分钟内配制)100μl，加上覆膜， 37℃温育1小时。

(5)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

(6)每孔加底物溶液100μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右(根据实际显况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止)。

(7)每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

(8)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

(9)实验完毕后将未用完的试剂按规定保存温度放回冰箱保存至有效期结束。

实验结果如表11所示。

表11 db/db小鼠8-异前列腺素实验

由表分析可以发现0天时四组小鼠的8-ISO值为100pg/ml左右，实验进行 7天时测定值降低，其中，L-dose和H-dose组降低的最多，说明此时药物发挥的抗氧化的作用最明显，但是随着时间的延长小鼠糖尿病病情的加重，可能是药物剂量的关系或者是小鼠体内其他因子的影响，8-ISO值在14天和21天时明显上升了很多，抗氧化能力基本降低为0。

两种不同患糖尿病小鼠的体内实验都说明了化合物1在降低患糖尿病机体内葡萄糖含量、脂质过氧化物丙二醛(MDA)方面以及8-异前列腺素(8-ISO) 含量方面有着显著地效果。

在本发明提及的所有参考文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。另外，本领域技术人员还可在本发明精神内作其它变化，当然这些依据本发明精神所作的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围内。

Claims (8)

1.一种喹喔啉酮衍生物(如式Ⅰ所示化合物)的结构、制备方法、其药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途。

2.如权利1所述化合物(Ⅰ)，所述化合物(Ⅰ)在降低患糖尿病机体内葡萄糖含量药物中的用途。

3.如权利1中所述化合物(Ⅰ)，所述化合物(Ⅰ)在降低患糖尿病机体内脂质过氧化物丙二醛(MDA)药物和8-异前列腺素(8-ISO)药物中的用途。

4.如权利要求1、2、3所述的用途，其特征在于，所述化合物的结构式为：

5.如权利1、2、3所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(ⅰ)以式Ⅰa为原料，用草酸作为酰胺化试剂，经过1步操作形成式Ⅰb化合物：

(ⅱ)以式Ⅰb为原料，发生氯化反应，从而形成式Ⅰc化合物：

(ⅲ)以式Ⅰc为原料，在碱存在下，通过水解反应,从而形成式Ⅰd化合物：

(ⅳ)以式Ⅰd为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-N键的生成在1位N上偶联上乙酸甲酯，从而形成式Ⅰe化合物：

(ⅴ)以式Ⅰe为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-C键的生成在3位C上偶联上3-甲氧基-4-羟基苯乙烯，从而形成式Ⅰf化合物：

(ⅵ)以式If为原料，发生脱甲基反应，形成式Ig化合物；

(ⅶ)以式Ig为原料，发生脱甲基反应，形成式Ih化合物；

6.如权利要求1、2、3中任一条所述的用途，其特征在于：所述化合物、药学上可以接受的盐作为醛糖还原酶抑制剂在制备、预防或治疗糖尿病并发症，降低患糖尿病机体内葡萄糖含量、脂质过氧化物丙二醛(MDA)方面以及8-异前列腺素(8-ISO)方面的应用。

7.一种用于预防或治疗糖尿病并发症,提高糖尿病机体内葡萄糖耐受力、降低糖尿病机体内脂质过氧化物丙二醛(MDA)以及8-异前列腺素(8-ISO)方面的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：治疗有效量的权利要求1、2、3中任一项所述的化合物、药学上可以接受的盐作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、悬浮剂或气雾剂，其所含活性成分占所述药物组合物总重量的0.01-99.9％。