CN104628661A

CN104628661A - 一类喹喔啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构、制备方法及用途

Info

Publication number: CN104628661A
Application number: CN201510059169.9A
Authority: CN
Inventors: 朱长进; 马兵; 秦祥宇
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2015-02-05
Publication date: 2015-05-20

Abstract

本发明提供了式Ⅰ所示化合物结构、制备方法、及其药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途，这类化合物作为醛糖还原酶抑制剂和抗氧化剂，通过抑制醛糖还原酶的活性，有效地清除自由基和抑制脂质过氧化物的生成，从而达到预防和/或治疗糖尿病并发症的作用。本发明还提供了包含此类化合物的具有预防和/或治疗糖尿病并发症作用的药物组合物。

Description

一类喹喔啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及有机化学、药物化学及药物治疗学领域，具体涉及到一类新颖的醛糖还原酶抑制剂的结构、制备方法、对醛糖还原酶(Aldose Reductase，ALR2)的抑制作用以及在预防和/或治疗糖尿病并发症方面的应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)已是世界性的严重危害人类健康的疾病，糖尿病的危害性主要在于其并发症。糖尿病并发症包括肾病、视网膜病、神经性疾病和心脑血管疾病等代谢功能综合症。由于糖尿病并发症的高致残率和高致死率，它已成为世界上大多数国家居民健康和寿命的主要威胁之一。但是，目前在世界范围内针对糖尿病并发症的药物几乎是一片空白。依帕司他(Epalrestat)是目前唯一的上市药物，但仅限于日本市场，近期被引入中国。

大量动物和临床实验已证明醛糖还原酶抑制剂对治疗糖尿病并发症非常有效。过去30年中，至少有14种醛糖还原酶抑制剂被证明非常有效并且已通过II期临床。其中最有效的是在日本已上市的依帕司他、和已进入或通过III期临床的非达司他(Fidarestat)和AS-3201。而其中非达司他被证明比已上市的依帕司他更有效，它在体内的抑制效果要远远高于依帕司他。尽管如此，很多醛糖还原酶抑制剂仍存在生物利用度低，治疗效果不佳或严重的副作用和过敏性反应等问题，甚至有的已经上市的药物由于致敏作用而撤市。因此，开发更为安全有效的治疗糖尿病并发症的药物是当务之急。

同时，能够直接抑制活性氧或氧化应激的抗氧化剂，也是应对糖尿病并发症的重要候选物。作为天然抗氧化剂的黄酮类化合物曾被发现具有醛糖还原酶抑制活性，只是其活性强度不足未能获得进一步的发展。基于上述背景，本发明以喹喔啉酮作为母体结构，设计并合成了一系列新型多功能化合物，并评价、确定了这类化合物作为醛糖还原酶抑制剂在体外对ALR2的抑制作用，以及这类化合物作为抗氧化剂在体外对自由基和脂质过氧化物的抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新的对ALR2具有较强抑制能力，同时对自由基具有较强抑制能力的化合物及其制备方法，并通过提取大鼠晶状体的醛糖还原酶进行这类化合物在大鼠体外对ALR2的抑制活性实验，通过配制1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液和提取大鼠的脑匀浆进行化合物在大鼠体外对自由基和脂质过氧化物的抑制活性实验，证明了这类化合物是高效的醛糖还原酶抑制剂，能够明显的抑制ALR2的活性，同时能够有效抑制脂质过氧化物和自由基的生成，从而达到预防和/或治疗糖尿病并发症的作用。

因此，本发明的第一个方面，提供了式Ⅰ所示化合物结构、制备、药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途，

其中，R₁为H、卤素、硝基、C₁--C₄的直链或支链的烃基、C₁--C₄卤代烷基；

R₂为H、C₁--C₄烷基氰基、酯基、羧基，酰胺、含有一个至四个氧或氮的C₄--C₇杂环或杂环烷基、取代或未取代的芳基、芳烷基，其中所述的取代基选自卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其包含：治疗有效量的式Ⅰ所示的喹喔啉酮类化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。

本发明的第二方面，提供了一种具有式Ⅰ结构的化合物的制备方法，包括步骤：

(i)以式Ⅰa为原料，用草酸作为酰胺化试剂，经过1步操作形成式Ⅰb化合物：

(ⅱ)以式Ⅰb为原料，发生氯化反应，从而形成式Ⅰc化合物：

(ⅲ)以式Ⅰc为原料，在碱存在下，通过水解反应,从而形成式Ⅰd化合物：

(ⅳ)以式Ⅰd为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-N键的生成在1位N上偶联上基团R₂,从而形成式Ⅰe化合物：

(ⅴ)以式Ⅰe为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-C键的生成在3位C上偶联上3-甲氧基-4-羟基苯乙烯,从而形成式Ⅰf化合物：

(ⅵ)以式Ⅰf为原料，发生脱甲基反应，形成式Ⅰg化合物；

(ⅶ)以式Ⅰg为原料，形成所需的衍生物，包括酯，酸，酰胺，含氮和/或氧的杂环化合物；

其中，R₁–R₂的定义如上中所述。

本发明的第三方面，提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其包含：治疗有效量的是如权利要求1-3中任一条所述的用途，其特征在于：所述化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为的醛糖还原酶抑制剂在制备预防或治疗糖尿病并发症药物上的应用。

本发明的主要优点在于:

经过广泛而深入的研究，合成了一类新型的具有结构式Ⅰ的喹喔啉酮类衍生物，并经过体外实验证实了此类化合物对ALR2和自由基有很好的抑制作用，且对醛还原酶(Aldehyde Reductase，ALR1)没有明显的抑制作用，说明本发明的喹喔啉酮类衍生物是高效的、高选择性的多功能醛糖还原酶抑制剂，具备用于制备预防和/或治疗糖尿病并发症的药物的用途。

基团定义

如本文所用，术语“C₁--C₄烷基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或类似基团。

术语“C₁--C₄烷氧基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基或类似基团。

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“C₁--C₄卤代烷基”指被相同或不同的1-6个上述卤原子取代的上述C₁--C₄烷基，如三氟甲基、五氟乙基或类似基团。

术语“C₄--C₇的杂环”指骨架结构由4-7个C和N或O或S构成的芳香或非芳香杂环，如四氮唑，恶二唑酮，哒嗪，嘧啶或类似基团。

术语“芳基”指单环至三环的芳簇烃基，如苯，萘或类似基团。

术语“芳烷基”指被上述芳基取代的C₁--C₄烃基，如苄基，萘甲基或类似基团。

活性成份

如本文所用，术语“活性成分”、“活性化合物”、“本发明的化合物”、“新型的醛糖还原酶抑制剂”可以互换使用，这些术语所指的均为本发明的具有结构式Ⅰ所示的喹喔啉酮化合物、药学上可接受的盐或它们的混合物。

药物组合物

本发明还提供了预防和/或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其包含：

(a)预防和/或治疗有效量的式Ⅰ所示的喹喔啉酮化合物、药学上可接受的盐或它们的混合物作为活性成分；

(b)药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由…组成”和“由…组成”都包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、和过敏反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的活性物质或其生理上可接受的盐传送给人和/或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是固体或液态。

本发明所述的药物组合物所含活性成分占所述药物组合物总重量的0.01-99.9％；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂，其中组合物的总重量为100％。

附图说明

图1为本发明实施例的一类啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构及其制备方法流程图。

具体实施方式

以下将详细说明本发明实施例一类喹喔啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构及其制备方法。这些实施例仅用于举例说明本发明，但不可以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数及说明，除另外说明外，都是以质量为依据。实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

请参阅图1，本发明实施例提供一类一类喹喔啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构及其制备方法，其包括以下步骤：

S2:所述反应中用到的氯化试剂除了二氯亚砜，还可以是三氯氧磷、五氯氧磷等，反应温度40℃-50℃；

S3:所述反应中用到的碱，除了氢氧化锂，还可以是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等，反应温度55℃-75℃；

S5:所述反应中用到的催化剂，除了醋酸钯与三邻甲基苯基膦，还可以是四三苯基膦钯，醋酸钯与三苯基膦，氯化钯与三苯基膦，氯化钯与三临甲基苯基磷等；所述反应中用到的碱，除了三乙胺，还可以是二乙胺、叔丁醇钠等；所述反应中用到的溶剂，除了N,N-二甲基甲酰胺外，还可以是甲苯、二甲基亚砜等；反应温度90℃-120℃；

S6：所述反应中用到的脱甲基试剂，除了三溴化硼，还可以是三氯化铝、苯硫酚等。

实施例一：制备2-(3-(3，4-二羟基苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸

(化合物1)

将10.8g(100mmol)邻苯二胺，13.5g(150mmol)草酸放入圆底烧瓶中，再加入100mL水和10mL浓盐酸，加热搅拌回流6小时，待恢复到室温后，将反应液过滤，反复水洗，干燥，得到喹喔啉-2,3(1H,4H)-二酮(无色晶体，产率96％，15.6g):¹H NMR(400MHz,[D₆]DMSO):δ7.063(d,2H,J＝6.4Hz),7.114(d,2H,J＝6.4Hz),11.893(s,2H)。

将8.1g(50mmol)喹喔啉-2,3(1H,4H)-二酮，11.9g(100mmol)二氯亚砜，5mL DMF加入到装有50mL二氯甲烷的圆底烧瓶中，加热回流搅拌至TLC监测原料点消失。将反应液冷冷却至室温，小心的倒入冰水中，待冰水完全融化后，用200mL二氯甲烷分4次萃取，合并有机相。再用K₂CO₃溶液清洗有机相3到4次(中和残留的酸液)，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，柱层析，得到2,3-二氯喹喔啉(无色晶体，产率94％，9.3g):¹H NMR(400MHz,[D₆]DMSO):δ7.827(d,2H,J＝6.4Hz),8.045(d,2H,J＝6.4Hz)。

将362mg(20mmol)2,3-二氯喹喔啉，96mg(40mmol)LiOH加入到装有50mL THF与20mL H₂O的烧瓶中，加热回流搅拌24h至TLC监测原料点完全消失。待冷却室温后，往反应液中加入30mL饱和NH₄Cl水溶液，分3次加入60mL四氢呋喃萃取，合并有机相。有机相用饱和NH₄Cl水溶液清洗两到三次，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，柱层析，得到3-氯-喹喔啉-2(1H)-酮(白色固体，产率90％，325mg)：¹H NMR(400MHz,[D₆]DMSO):δ12.924(s,1H),7.735(d,1H,J＝7.2Hz),7.576(d,1H,J＝7.2Hz),7.352(m,2H)。

往圆底烧瓶中加入3-氯-喹喔啉-2(1H)-酮(20mmol)，碳酸钾(8.3g),溴乙酸甲酯(3.2g,21mmol)和乙腈(180mL)，65℃下反应2h，旋蒸除去溶剂后过滤，用水反复洗涤，干燥。粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到白色晶体2-(3-氯-喹喔啉-2(1H)-酮)乙酸甲酯(白色固体，产率83％，4.2g):¹H NMR(600MHz,CDCl₃):δ7.693(d,1H,J＝7.8Hz),7.507(d,1H,J＝7.8Hz),7.253(s,1H),5.021(s,2H),3.832(s,3H)。

将2-(3-氯-喹喔啉-2(1H)-酮)乙酸甲酯(252mg,1mmol)，醋酸钯(11.2mg，5mol％)和三邻甲基苯基膦(21.3mg，7mol％)加入圆底烧瓶中，在氮气保护条件下加入10ml二甲基甲酰胺，室温下搅拌20min，然后加入225mg (1.5mmol)3-甲氧基-4-羟基苯乙烯和3ml三乙胺，保持氮气环境下100℃回流12h后TLC检测反应至原料点消失。反应液冷却至室温后加入适量水并用乙酸乙酯反复萃取3次，收集有机相并加入无水MgSO₄干燥，过滤得滤液并减压浓缩，柱层析，得到2-(3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(黄色固体，产率70％，235mg)：¹H NMR(400MHz,[D₆]DMSO)δ9.96(s,1H),7.97(t,J＝23.0Hz,1H),7.84(d,J＝8.0Hz,1H),7.67-7.30(m,5H),6.84(d,J＝8.5Hz,1H),5.16(s,2H),3.72(s,6H)。

将2-(3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(366mg，1mmol)溶于冰浴且含有20mL的无水二氯甲烷烧瓶中，N₂保护，待烧瓶中温度降到0℃后，加入一定量的BBr₃，室温反应，待TCL监测反应结束后，将反应液加入40mL冰水中，用一定量的二氯甲烷萃取，得到有机相，除水，减压蒸馏去除溶剂，柱层析得到产物2-(3-(3，4-二羟基苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯；将2-(3-(3，4-二羟基苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(366mg，1mmol)溶于适量四氢呋喃(5ml)中，搅拌20min后加入适量氢氧化锂饱和溶液(10ml)继续搅拌3h；TLC检测原料点消失后加入质量浓度为10％的稀盐酸调节pH至2～3，待沉淀析出后过滤并反复洗涤，干燥沉淀得目标产物2-(3-(3，4-二羟基苯乙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(白色固体，产率77％，178mg)：熔点：289-291℃；¹H NMR(400MHz,[D₆]DMSO)δ12.31(s,1H),10.06(s,1H),8.36-8.18(m,2H),7.87(d,J＝7.9Hz,1H),7.61-7.55(m,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.39(t,J＝7.5Hz,1H),6.88(dd,J＝8.7,1.0Hz,2H),5.05ppm(s,2H)，3.70(s,3H)。

化合物对ALR2和ALR1体外抑制作用实验

实验中用到了ALR2测定用磷酸盐缓冲溶液、ALR1测定用的磷酸钠缓冲液1、磷酸钠缓冲液2、NADPH溶液以及D,L-甘油醛溶液、D-葡萄糖醛酸钠溶液，它们的配制方法如下：

(1)配制0.1M,pH＝6.2的ALR2测定用磷酸盐缓冲溶液

溶液A：3.12g NaH₂PO₄·2H₂O溶于100ml水配成0.2M的溶液；

溶液B：3.58g Na₂HPO₄·12H₂O溶于50ml水配成0.2M的溶液。

取A 81.5ml，B 18.5ml，用水稀释至终体积为200ml，调节pH至6.2，即得。

(2)配制10mM,pH＝7.2的ALR1测定用的磷酸盐缓冲溶液1

0.3801g磷酸钠，8.5513g蔗糖，0.0809g EDTA二钾盐，0.0175mLβ-巯基乙醇溶于100mL水中，调节pH至7.2，即得。

(3)配制10mM,pH＝7.2的ALR1测定用的磷酸盐缓冲溶液2

0.3801g磷酸钠，0.0809g EDTA二钾盐，0.0140mLβ-巯基乙醇溶于100mL水中，调节pH至7.2，即得。

(4)配制0.104mM NADPH溶液(以缓冲溶液作为溶剂)

0.0043g NADPH溶于50ml缓冲溶液配制成。

(5)配制10mM D,L-甘油醛溶液(以缓冲溶液作为溶剂)

0.045g D,L-甘油醛溶于50ml缓冲溶液配制成。

(6)配制20mM D-葡萄糖醛酸钠溶液(以缓冲溶液作为溶剂)

0.2341g D-葡萄糖醛酸钠溶于50ml缓冲溶液1中配制成。

(7)处理透析袋：

把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段，剪三段。在大体积的2％(W/V)NaHCO₃和1mM EDTA二钾盐(pH＝8.0)中将透析袋煮沸10min。再用蒸馏水彻底清洗透析袋，放在1mM EDTA二钾盐(pH＝8.0)中，将之煮沸10min。冷却后，存放在4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内，从此时取用透析袋时必须带手套。用前在透析袋内装满水，然后排出，将之清洗干净。

(8)ALR2的提取：从正常杀死的老鼠眼球中迅速提出晶状体，然后加入3倍(0.4ml/lens)于其体积的冷去离子水(0-4℃)，再用Glas-Potter匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以12000×g转速，0-4℃的温度，离心30min。最后取上清液，即为ALR2的水溶液，用于酶活测试。

(9)ALR1的提取：将大鼠断颈处死，迅速取出肾脏，然后加入3倍(3ml/g肾脏)于其体积冷却的10mM磷酸钠缓冲液1(pH＝7.2，内含0.25M蔗糖，2.0mM EDTA二钾盐，2.5mMβ-巯基乙醇)(0-4℃)，再用Glas-Potter匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以12000×g转速，0-4℃的温度，离心30min。取上清液，加入饱和硫酸铵溶液，形成饱和度为40％的硫酸铵溶液，0-4℃下搅拌30min，12000×g转速低温离心15min。取上清液重复上述步骤，分别使硫酸铵的饱和度达到55％，然后是75％的盐溶液。75％饱和度的硫酸铵溶液离心后的沉淀用50体积10mM磷酸钠缓冲液2(pH＝7.2，内含2.0mM EDTA二钾盐，2.0mMβ-巯基乙醇)溶解，并用此缓冲液透析过夜。透析后的即为ALR1的水溶液，用于酶活测试。

(10)在30℃的温度下，在1ml测试比色皿中分别加入0.25mL 0.104mM NADPH,0.25mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.2),0.1mL所提取的酶液，0.15mL去离子水。参照比色皿中加入0.25mL 0.104mM NADPH,0.50mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.2),0.1mL所提取的酶液，0.15mL去离子水。然后把含有上述混合液的两个比色皿放在30℃条件下，保温10min。最后向测试比色皿中加入0.25mL 10mM底物开始反应，用紫外分光光度计在340nm监测5min。从所得数据，以吸光度为纵轴，时间为横州，可得一直线，求得此直线的斜率，记为I₀，代表酶活。酶的活性最佳值是处于NADPH吸光度变化在0.01±0.0010(ALR2)或0.015±0.0010(ALR1)吸光度单位/min的范围内，如果不在此范围，通过稀释酶液来使其达到这一范围。对测试比色皿要加对照比色皿是为了校正由于非酶因素(比如空气中氧气也会氧化NADPH)所导致的NADPH的氧化。

(11)化合物抑制百分数的测试同测酶活的方法相似，只是在未加底物时，要在测试比色皿和参照比色皿中各加入5μL的被测化合物溶液。所得直线的斜率记为I_x。然后根据下面的公式计算可得该浓度下的抑制百分数。

I％＝(|I₀-I_x|/|I₀|)×100％

重复测量不同浓度的化合物溶液，分别计算出相应浓度的抑制百分数，可得到“抑制百分数”对“浓度对数”的直线，然后从图中读出抑制百分数为50％对应的浓度对数，反对数即可得IC₅₀。

化合物在体外抑制ALR2和ALR1活性的能力如表1所示。

表1 化合物1体外对ALR2和ALR1的抑制活性

^aIC₅₀(μM)(95％C.L.)是在本发明所实施的实验体系中所测得值

^b在浓度10^-4M下的抑制率

实验证实，化合物1在体外对醛糖ALR2有明显的抑制作用，IC₅₀为220nM，且该化合物对ALR1没有明显的抑制作用，说明这些化合物具有高选择性。

DPPH法测定化合物体外抗氧化活性

(1)0.025mg/mL DPPH溶液的配制

0.025g DPPH溶于1000mL甲醇中，搅拌完全溶解即得。

(2)化合物甲醇溶液的配制

不同化合物分别配制成100μM、50μM、10μM、5μM、1μM等不同浓度。

(3)化合物DPPH自由基清除率的测定

化合物对DPPH自由基清除能力的测定步骤，如表2所示，取0.1mL化合物溶液，加入到1mL的DPPH溶液中，用甲醇补足至3mL。将混合溶液摇匀，室温反应2h后，在517nm波长处测定各样品的吸光度值，每个样品平行测定3次，取平均值，计算抑制率，Trolox为对照样，化合物DPPH自由基清除率测定结果，如表3所示。

化合物DPPH自由基清除率测定公式如下：

K＝[1-(A_i-A_j)/A_c]^＊100％

其中A_i为加入化合物后的吸光度值；A_j为未加DPPH，只加化合物的吸光度值；

A_c为未加化合物，只加DPPH的吸光值。

表2 化合物DPPH自由基清除率的测定步骤(单位mL)

表3 化合物DPPH自由基清除率测定结果

^a IC₅₀(μM)(95％C.L.)是在本发明所实施的实验体系中所测得值

实验证实，化合物在体外对DPPH自由基有明显的抑制作用，尤其是化合物1，IC₅₀为24μM，说明化合物具有很强的体外抗氧化活性。

MDA法测定化合物体外抗氧化活性

1.溶液的配制

(1)20μM/mL三氯化铁溶液的配制

将0.0027g三氯化铁(FeCl₃·6H₂O)，溶于10mL双蒸水中，再取1mL该溶液，加9mL双蒸水，稀释10倍，然后再取1mL该稀释液，加4mL双蒸水，搅拌完全溶解即得。

(2)100μM/mL维生素C溶液的配制

将0.0088g维生素C，溶于10mL双蒸水中，取1mL该溶液，加9mL双蒸水，稀释10倍，然后再取1mL该稀释液，加4mL双蒸水，搅拌完全溶解即得。

(3)化合物甲醇溶液的配制

不同化合物配制成浓度为100μM/mL的甲醇溶液，搅拌完全溶解即得。

2.脑匀浆液制备

(1)大鼠灌流处死，迅速取出脑组织，用滤纸吸湿后，称取湿重，每次实验称取2克，加入到手动匀浆器中；

(2)向匀浆器中加入一定体积的冷生理盐水，冰浴氛围下手动匀浆10分钟；

(3)将匀浆液倒入离心管中，于4℃，3000r/min条件下，离心10min，取上清液，-20℃保存。

3.化合物与脑匀浆液共孵育

取出制备好的匀浆液以及其他各溶液，按表4依次将脑匀浆液，药液，三氯化铁，维生素C等共0.5mL，加入到1.5mL离心管中，混匀，对于空白管和对照管需加入甲醇或双蒸水补足反应体系的体积为0.5mL。

将离心管置于37℃水浴锅中，孵育30分钟，期间不断摇晃离心管2-3次，使化合物与脑匀浆液充分作用；取出离心管置于冰水中，按试剂盒进行接下来的操作。

表4 三氯化铁维生素C体系诱导的脑匀浆中脂质过氧化反应(单位mL)

4.脑匀浆中脂质过氧化物MDA含量的测定

(1)试剂盒组成与溶液的配制：

试剂一：液体，20ml一瓶，室温保存备用；

试剂二：为12ml液体，用时每瓶按试剂盒说明书加一定量的双蒸水，充分混匀，置于4℃冰箱保存；

试剂三：为粉剂，用时将粉剂加入到90-100℃的热双蒸水中，充分溶解后，按试剂盒说明，用双蒸水补足体积，再按说明书加入冰醋酸，充分混匀，避光，置于4℃冰箱保存；

标准品：10n mol/mL四乙氧基丙烷，4℃冰箱保存。

(2)实验步骤

1、取离心管若干，每个样品做三个平行管，按表5进行加样；

表5 脑匀浆中脂质过氧化物MDA含量测定加样表(单位mL)

2、摇动几下试管架，混匀。再按表6加入其他试剂；

表6 脑匀浆中脂质过氧化物MDA含量测定加样表(单位mL)

3、旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95度水浴，或煮沸40min；

4、取出，流水冷却，3500-4000转/分的速度离心10分钟，然后取上清，532nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度值；

5、MDA含量计算公式：

5.化合物对脑匀浆中脂质过氧化物的抑制率

测定结果如表7所示，

表7.化合物对脑匀浆中脂质过氧化物的抑制率

实验证实，化合物对脑匀浆中的脂质过氧化物有明显的抑制作用，尤其是化合物1对脂质过氧化物的抑制百分率更是高达57.7％，抗氧化活性很强，说明本发明的喹喔啉酮衍生物是高效的、高选择性、多功能的醛糖还原酶抑制剂，具备用于制备预防和/或治疗糖尿病并发症的药物的用途。

在本发明提及的所有参考文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。另外，本领域技术人员还可在本发明精神内作其它变化，当然这些依据本发明精神所作的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围内。

Claims

1.一种用于糖尿病并发症的化合物，其结构式为

其中，式(Ⅰ)中，R₁为H、卤素、硝基、C₁--C₄的直链或支链的烃基、C₁--C₄卤代烷基；

R₂为H、C₁--C₄烷基氰基、酯基、羧基，酰胺、含有一个至四个氧或氮的C₄--C₇的杂环或杂环烷基、取代或未取代的芳基、芳烷基，其中所述的取代基选自卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基。

2.如权利要求1所述的用于糖尿病并发症的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式为：

3.如权利要求1所述用于糖尿病并发症的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(ⅱ)以式Ⅰb为原料，发生氯化反应，从而形成式Ⅰc化合物：

(ⅵ)以式Ⅰf为原料，发生脱甲基反应，形成式Ⅰg化合物；

其中，R₁–R₂的定义如权利要求1中所述。

4.如权利要求1-3中任一条所述的用途，其特征在于：所述化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为的醛糖还原酶抑制剂在制备预防或治疗糖尿病并发症药物上的应用。

5.一种用于预防或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：治疗有有效量的权利要求1-4中任一项所述的化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、悬浮剂或气雾剂，其所含活性成分占所述药物组合物总重量的0.01-99.9％。