CN108125997A - 刺山柑乙酸乙酯部位在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,具体涉及刺山柑乙酸乙酯部位在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明也提供了刺山柑乙酸乙酯部位的制备方法:(1)取刺山柑粉末,经醇类水溶液回流提取后,过滤,减压浓缩得浸膏;(2)将得到的浸膏用水分散后,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取,浓缩后烘干得到乙酸乙酯部位。本发明制备的乙酸乙酯部位发挥抗肿瘤作用的可能是总生物碱;其对移植性H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制率达到38.2%;能明显延长腹水瘤小鼠寿命;HE染色结果显示肿瘤组织细胞排列稀疏,出现大面积坏死区,较多细胞质发生空泡化;同时对免疫器官,肝肾功能,血常规没有明显影响,有开发成为抗癌新药的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及刺山柑乙酸乙酯部位在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
维药刺山柑为白花菜科植物野西瓜(Capparis spinosa L.)的果实,又名老鼠瓜、野西瓜。刺山柑在维吾尔医药中应用历史悠久,临床用于痛风、风湿性关节炎等疾病的治疗,疗效显著。恶性肿瘤是一类威胁人民健康、危及人民生命的严重疾病。寻找低毒、高效的天然抗肿瘤药物一直是近年研究的热点。某些生物碱的抗肿瘤作用机理已初步得以阐明,并被应用于临床。如紫杉醇、羟基喜树碱等。刺山柑总生物碱中含有水苏碱、甜菜碱、脱氢甜菜碱、刺山柑碱等,其中水苏碱是含量最高的水溶性生物碱。台湾学者报道从其根部水溶物中分离出的物质有显著的抗癌功效,对肺癌、卵巢癌、肠癌、乳腺癌和鼻咽癌均有作用。目前对野西瓜的抗肿瘤活性报道较多,但其抗肿瘤药效物质基础及抗肿瘤作用机制尚不明确。本发明对刺山柑乙酸乙酯部位抗肿瘤作用及其一般毒性深入研究,从而为刺山柑的临床应用提供理论依据。
发明内容
针对现有技术中存在的不足,本发明的目的在于提供了刺山柑乙酸乙酯部位在制备抗肿瘤药物中的应用,特别是提供了刺山柑乙酸乙酯部位在制备治疗肝癌药物中的应用,具体通过以下技术方案来实现:
一种刺山柑乙酸乙酯部位的制备方法,包括以下步骤:
(1)取刺山柑粉末,经醇类水溶液回流提取后,过滤,滤液减压浓缩得浸膏;
(2)将得到的浸膏用水分散后,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取,将石油醚、氯仿萃取液丢弃或作其他用途,将乙酸乙酯萃取液浓缩烘干得到乙酸乙酯部位。
进一步的,所述步骤(1)中的醇类水溶液为70~95%(v/v)的乙醇。
进一步的,所述步骤(1)醇类水溶液回流提取的过程为:用95%(v/v)乙醇浸泡过夜,然后用95%(v/v)乙醇加热回流提取4次(第一次直接用浸泡过夜的95%(v/v)乙醇提取),每次2h,抽滤,合并滤液得滤液1,然后用75v/v%乙醇回流提取3次,每次2h,抽滤,合并滤液得滤液2;合并滤液1和滤液2。
进一步的,所述刺山柑粉末、95%(v/v)乙醇、75%(v/v)乙醇的用量比为1Kg:(8~10)L:(8~10)L,优选为1Kg:8L:8L。
进一步的,所述步骤(2)所述浓缩烘干是指在旋转蒸发仪中分别蒸去并回收萃取剂,温度不高于60℃。
与现有技术相比,本发明具有以下优点和效果:
本发明制备的乙酸乙酯部位生物碱含量为301.0mg/g,刺山柑乙酸乙酯部位发挥抗肿瘤作用的可能是总生物碱;乙酸乙酯部位对人肝癌细胞HepG2抑制的IC50值为56.7μg/mL;100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg剂量的刺山柑乙酸乙酯部位对移植性H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制率分别13.7%,24.6%,38.2%;与空白组相比,给药组能明显延长腹水瘤小鼠寿命;HE染色结果显示高剂量组肿瘤组织细胞排列稀疏,出现大面积坏死区,较多细胞质发生空泡化;给药组对免疫器官,肝肾功能没有明显影响。刺山柑乙酸乙酯部位对H22荷瘤小鼠的肿瘤有明显抑制生长作用并且没有明显毒副作用,有开发成为抗癌新药的潜力。
附图说明
图1为刺山柑乙酸乙酯部位对人肝癌细胞HepG2增殖抑制率时效-量效图;
图2为刺山柑乙酸乙酯部位对H22肝癌对腹水瘤小鼠存活时间的影响;
图3为刺山柑乙酸乙酯部位对肝癌H22实体瘤小鼠瘤重的影响;
图4为刺山柑乙酸乙酯部位对肝癌H22实体瘤小鼠瘤体外观的影响;
图5为刺山柑乙酸乙酯部位对肝癌H22实体瘤小鼠肾功能指标(BUN、Cr、UA)的影响;
图6为刺山柑乙酸乙酯部位对肝癌H22实体瘤小鼠肝功能(AST、ALT)的影响。
图7为刺山柑乙酸乙酯部位对肝癌H22实体瘤小鼠的肝脏、胸腺、脾脏指数的影响。
图8为刺山柑乙酸乙酯部位对肝癌H22小鼠实体瘤HE染色结果的影响。
具体实施方式
申请人将结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。应理解,以下内容不应以任何方式解释为对本发明请求保护范围的限制。
本发明实施例中所用重要的试剂和材料等的来源如下:
实验所用小鼠为昆明种小鼠:雄鼠,体重(18-22)g,由湖北省疾病控制中心提供,许可证号:SCXK(鄂):2012-0033。
H22腹水瘤细胞由中南民族大学陈旅翼老师惠赠,保存于-80℃的冰箱中。人肝癌细胞(HepG2)购自武汉大学典藏中心(该细胞系为贴壁生长)。
刺山柑药材购于新疆阿克苏药材公司,将果实烘干后打碎成粉末备用;
5-氟尿嘧啶(5-Fu)(阿拉丁公司);DMEM培养基:美国Gibco公司;胎牛血清:杭州四季青公司,于56℃灭活30min备用;所用PBS缓冲液为:1×PBS缓冲液(0.01mol/L,pH 7.2~7.4);DMSO:Biotech公司。
0.25%胰蛋白酶:称0.25g胰酶蛋白粉和0.02g EDTA混合,然后加入100mL PBS缓冲液37℃水浴配成,用滤膜过滤,按10mL/支分装放入冰箱-20℃保存,用时解冻;5mg/mL的MTT(甲基噻唑基四唑):250mg MTT加入50mL PBS缓冲液中使其完全溶解,微孔滤膜过滤后,放入冰箱-20℃保存,用时解冻。
实施例1刺山柑乙酸乙酯部位的制备
1.1刺山柑乙酸乙酯部位的制备,包括如下步骤:
称取刺山柑粉末7kg,用56L的95%乙醇(V/V,本说明书中所述乙醇的百分比浓度均指体积百分比浓度,后文不赘述)浸泡过夜,然后用95%乙醇加热连续回流提取4次(第一次直接用浸泡过夜的95%乙醇提取),每次2h,抽滤,合并滤液后得滤液1,然后继续用56L的75%乙醇回流提取3次,每次2h。抽滤,合并滤液后得滤液2,将滤液1和滤液2合并后减压浓缩,得浸膏368g,向浸膏中加入少量水后加热、超声使其混合形成悬浮液后,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取,每次萃取后的有机相置于旋转蒸发仪中蒸干萃取剂(温度不高于60℃)后得到不同萃取部位,称重。得石油醚部位粉末28.5g,氯仿部位粉末34.9g,乙酸乙酯部位粉末46.5g。
1.2刺山柑乙酸乙酯部位中总生物碱含量测定
1.供试品的制备
称取1.1制备的刺山柑乙酸乙酯部位粉末1g,加甲醇定容至500mL。
2.刺山柑乙酸乙酯部位中生物碱的含量测定
精密吸取甜菜碱对照品适量,加甲醇,超声使其溶解后,将其稀释至刻度,使得对照品溶液浓度为0.94mg/mL。精密吸取甜菜碱对照品溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL,分别置于10mL的容量瓶中,分别向其中加入新制的2%C4H10CrN7S4溶液2.0mL,加0.1mol/LHCl溶液定容至10mL,摇匀,制成不同浓度的含有C4H10CrN7S4的对照品溶液。将含C4H10CrN7S4的对照品溶液冰浴放置1h,用干燥滤纸过滤,弃去粗滤液,留取续滤液。在波长为520nm处测定各续滤液的吸光度,以0.1mol/L HCl溶液为空白对照,然后分别用空白试剂吸光度减去测定溶液的吸光度,以吸光度的差值(A)为纵坐标,以甜菜碱对照品的质量浓度C(mg/mL)为横坐标,得标准曲线A=1.112C-0.028(相关性R=0.9997)。
精密吸取供试品溶液1.0mL,置于10mL的容量瓶中,加入新制的2%C4H10CrN7S4溶液2.0mL,加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度,摇匀,冰浴放置1h,用干燥滤纸过滤,弃去粗滤液,留取续滤液,以0.1mol/L HCl溶液为空白对照,在波长为520nm处测定供试品续滤液的吸光度。利用标准曲线A测定并计算乙酸乙酯部位中生物碱含量,结果如表1所示。
表1供试品溶液吸光度及其生物碱的含量
实验结果以(x±s)表示,所有数据经SPSS软件做t检验分析,P≤0.05为有显著性差异,P≤0.01为极显著性差异。
计算出1mL供试品中所含的总生物碱的量平均为0.602mg/mL,换算得刺山柑乙酸乙酯部位中生物碱含量为301.0mg/g。
实施例2刺山柑乙酸乙酯部位对人肝癌细胞HepG2的细胞增殖抑制作用
1.肝癌细胞的培养
本实施例中所称乙酸乙酯部位药物为实施例1制备的乙酸乙酯部位粉末以PBS缓冲液配制而成,助溶剂为体积比1:1的DMSO和PEG400混合液。
将处于对数生长期的人肝癌细胞株HepG2置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,于37℃、5%CO2、相对湿度100%的恒温培养箱中进行培养,每日观察细胞生长情况,定期换液,过程中对生长密度超过80%瓶底面积的细胞进行消化传代,每次传代的比例为1:3。用PBS缓冲液冲洗2次后,向其中加入0.25%胰蛋白酶2mL进行消化,置37℃下约1~2min,倒置于显微镜下观察细胞,若胞质回缩,细胞间连接消失,表明此时细胞消化适度,吸取上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液2mL,反复吹打,将细胞吹打均匀,得到人肝癌细胞HepG2。
2.MTT实验
选用对数生长期的贴壁人肝癌细胞HepG2,用0.25%胰蛋白酶消化,再用含10%胎牛血清的DEME培养基配成细胞悬浮液,接种在96孔培养板中(细胞密度为8×104个/mL),每孔接种100μL,将96孔板按列分成4组,每组6个复孔:给药组100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL剂量以及空白对照组:不加药,每个实验组设置四或六个平行实验,在细胞贴壁生长融合至60~70%时分别加入不同浓度的药物,在37℃、5%CO2条件下分别培养24h、48h、72h后,加入5mg/mL的MTT 15μL,置于培养箱中继续培养3h,然后弃去各孔中的上清液,再加入150μLDMSO,用微型振荡器混匀20min,待各孔中的紫色结晶完全溶解后,置于酶标仪下(波长为490nm)测定各孔的OD值。按下式计算肿瘤细胞增殖抑制率(IR):
抑制率%=(1-给药组OD值/对照组OD值)×100%;
结果如图1所示,可以看出实施例1制备的刺山柑乙酸乙酯部位对人肝癌细胞HepG2抑制的IC50值为56.7μg/mL,在100μg/mL~400μg/mL剂量范围内及给药24h、48h、72h时对HepG2均有不同程度的增殖抑制作用,并呈现良好的时效-量效关系。
实施例3刺山柑乙酸乙酯部位对H22肝癌实体瘤模型小鼠的抑瘤作用及对腹水瘤小鼠寿命的影响
本实施例中所称乙酸乙酯部位药物为实施例1制备的乙酸乙酯部位粉末以0.5%CMC-Na(羧甲基纤维素钠)水溶液配制而成。
将生长良好的H22腹水瘤细胞用生理盐水配制成浓度为106个/mL的细胞悬液后注入健康小鼠的腹腔中,传至3代后将小鼠颈椎脱臼处死,无菌环境下抽取其腹腔瘤液(略呈乳黄色),用生理盐水稀释成细胞悬液(细胞浓度约106个/mL),然后在每只健康小鼠同侧的腋窝下方处皮下接种0.2mL该细胞悬液(无菌条件下迅速进行),建立H22实体瘤模型,接种24h后将小鼠随机分组,实体瘤实验项目6只为一组。按照同样方式将相同量的瘤液接种在小鼠腹腔,即得腹水瘤小鼠,腹水瘤实验项目每组10只,接种24h后将小鼠随机分组。H22实体瘤和腹水瘤两个项目,共9组。实体瘤项目设模型对照组Model:0.5%CMC-Na(羧甲基纤维素钠)、阳性组(5-Fu,20mg·kg-1)、给药组:实施例1制备的乙酸乙酯部位组CSE(剂量分别为:100、200、400mg·kg-1),腹水瘤项目设模型组Model(0.5%CMC-Na)、阳性组(5-Fu,20mg·kg-1)、给药组:实施例1制备的乙酸乙酯部位组CSE(100、200mg·kg-1)。各组均按0.1mL/10g体重的剂量给小鼠灌胃给药,每日1次,连续10d。末次给药后处死实体瘤实验小鼠,分别取出其实体瘤、肝脏、胸腺、肾脏和脾脏,称重并记录,按照以下公式计算免疫器官指数。腹水瘤小鼠继续喂养,记录生存状态及生存时间。
肝脏指数=肝脏质量(mg)/体重(g);
脾脏指数=脾脏质量(mg)/体重(g);
胸腺指数=胸腺质量(mg)/体重(g);
肝功能指标(ALT、AST),肾功能指标(BUN、Cr、UA)。
具体结果见图2-8,图2为H22肝癌腹水瘤小鼠数目随时间变化曲线,从图2可以看出,刺山柑乙酸乙酯部位在200mg/kg剂量下对H22肝癌腹水瘤小鼠存活时间有一定的延长作用,与模型组有显著性差异,与一线抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)接近。图3为刺山柑乙酸乙酯部位对肝癌H22小鼠肿瘤重量的影响,图4为取出的实体瘤体外观图,从图3和图4可以看出,刺山柑乙酸乙酯部位各剂量组与模型组相比:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,其对肝癌H22小鼠实体瘤生长均有抑制作用,量效关系明显,抑瘤率与药物浓度也呈正相关,剂量为100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的刺山柑乙酸乙酯部位对移植性H22荷瘤小鼠的抑瘤率分别为13.7%,24.6%,38.2%。图5为肾功能指标检测结果,其中Normal组表示正常的健康小鼠,从图中可以看出:刺山柑乙酸乙酯部位对肾功能没有明显影响。图6肝功能指标检测结果显示:刺山柑乙酸乙酯部位对肝功能没有明显影响。图7为检测得到的肝脏、胸腺、脾脏指数结果,刺山柑乙酸乙酯部位对小鼠主要脏器没有明显影响。但是可以明显看出一线抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)对小鼠的肝、肾功能均有比较大的影响。
对实体瘤肿瘤组织进行HE染色检测,HE染色结果如图8所示:模型对照组小鼠肿瘤组织排列较密集,低剂量组(100mg/kg)肿瘤组织排列欠规则并出现较小坏死区,高剂量组(400mg/kg)肿瘤组织细胞排列稀疏,出现大面积坏死区,较多细胞质发生空泡化,肿瘤细胞周围及间质内有较多的炎性细胞,凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。
实验表明本发明得到的刺山柑乙酸乙酯部位对移植性H22荷瘤小鼠的免疫器官指数、肝肾功能没有明显影响。刺山柑乙酸乙酯部位对H22荷瘤小鼠的肿瘤有明显抑制生长作用并且没有明显毒副作用,有开发成为抗癌新药的潜力。
Claims (7)
1.刺山柑乙酸乙酯部位在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抗肿瘤药物为治疗肝癌药物。
3.一种权利要求1或2所述刺山柑乙酸乙酯部位的制备方法,其特征在于所述制备方法依次包括以下步骤:
(1)取刺山柑粉末,经醇类水溶液回流提取后,过滤,减压浓缩得浸膏;
(2)将得到的浸膏用水分散后,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取,将乙酸乙酯萃取液浓缩烘干得到乙酸乙酯部位。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的醇类水溶液为70~95v/v%的乙醇。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)醇类水溶液回流提取的过程为:用95 v/v%乙醇浸泡过夜,然后用95 v/v %乙醇加热回流提取4次,每次2 h,抽滤,合并滤液得滤液1,然后用75 v/v%乙醇回流提取3次,每次2 h,抽滤,合并滤液得滤液1,合并滤液1和滤液2。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述刺山柑粉末与95 v/v%乙醇、75v/v%乙醇的用量比为1Kg:8~10L:8~10L。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述浓缩烘干的步骤是:于旋转蒸发仪中,温度不高于60℃,蒸去并回收乙酸乙酯。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180608 |
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