CN102423307A - 去氢厄弗酚在制备抗肿瘤及抑制肿瘤新生血管生成药物、保健食品或化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种去氢厄弗酚（dehydroeffusol，化学名为2，7-二羟基-1-甲基-5-乙烯基菲，分子式：C₁₇H₁₄O₂，分子量：250）在制备抗肿瘤和抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用。该发明首次发现中草药灯心草单体去氢厄弗酚具有抑制肿瘤及肿瘤血管生成的活性，利用该发现制备抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物可用于治疗或预防和恶性肿瘤以及与肿瘤血管生成相关的疾病，还可用于肿瘤化疗和/或辅助化疗方面的治疗。本发明巧妙地以肿瘤干细胞、肿瘤细胞和肿瘤血管生成作为靶标，研究并阐明去氢厄弗酚的药用疗效和作用机制，为去氢厄弗酚的抗肿瘤创新中药研发奠定了基础，也为恶性肿瘤的中药治疗提供科学依据和重要信息。

Description

去氢厄弗酚在制备抗肿瘤及抑制肿瘤新生血管生成药物、保健食品或化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及一种去氢厄弗酚在制备抗肿瘤药物及血管生成抑制物或保健食品或化妆品中的应用。

背景技术

据2010年2月卫生部统计资料，每年全球癌症死亡人数达1000万。目前全球四分之一人口死亡的原因是癌症所致，并预测若按目前的趋势发展下去，到2050年将有二分之一的死亡者是由于患了癌症。我国每年有220万人患癌症，更令人瞩目的是恶性肿瘤发病率以每年2.5-5％速度增长，已成为严重危害我国人民生命的元凶。尽管世界各国对肿瘤的治疗已做了很大的努力，对某些肿瘤已取得了一些进展，但从整体而言现有抗肿瘤药物对大部分恶性肿瘤疗效欠佳，其重要原因之一是缺乏有效的抗癌药物。因此，研发有效抗癌新药是目前治疗恶性肿瘤的当务之急。

中医药治疗肿瘤的历史源远流长。长期以来，已有紫杉、喜树、砒霜、绿茶、灵芝、人参、长春花、天门冬、半枝莲、天葵子等用于临床治疗癌症；目前已有多种中药制剂用于中西医治疗恶性肿瘤，包括失笑散加味、二陈汤、海藻玉壶汤、附子理中汤、膈下逐瘀汤、柴芍六君子汤、参苓白术散、八珍汤，参芪扶正注射液、康莱特注射液、岩舒注射液、华蟾素注射液、苦参碱注射液等。中医药治疗在改善癌症病变，减轻放、化疗毒副作用，防止肿瘤转移和复发等方面取得了一些较好的效果，抗癌中草药已在中医医院和中医领域得到广泛应用。然而，迄今中草药尚未在国内外成为首选抗癌药物，现有临床中草药的抗癌疗效亟需进一步提高。长期以来，人们应用传统思维、理念和方法研发抗癌中草药，虽然已取得了进步，但收效甚微。肿瘤细胞仍每时每刻都在危害着成千上万癌症病人的生命，恶性肿瘤已成为严重威胁我国人民生命的罪魁祸首。我国中医中药是一个伟大的宝库，在抗癌治疗方面具有很大的潜力，若采用古为今用、洋为中用的策略，应用现代生物医药科学技术，进行中药有效部位、有效组份、有效成分的创新中药研究，很有可能研发出新型有效抗癌新药。

血管为人体正常组织器官的形态发生与功能维护所必需，它与人体发育失调和多种病因导致的种种疾病密切相关。肿瘤血管生成在肿瘤发生、发展、转移和复发中具有举足轻重的作用。一系列研究表明只要有效地抑制肿瘤血管生成或破坏已有肿瘤血管，就能抑制肿瘤生成、转移与复发。此外，糖尿病和风湿性关节炎等疾病都有血管增生，其血管异常与肿瘤血管非常相似。因此，血管增生抑制剂也可用于治疗糖尿病和风湿性关节炎等血管增生性疾病。

近年来，人们对肿瘤血管生成机制的研究不断深入，五种抗肿瘤血管生成的药物如Avastin、Angiostatin等相继被开发出来，已在临床上推广应用。这类药物不但可以用于大多数实体肿瘤的治疗，还可以用于肿瘤的预防，同时对其他与血管生成有关的疾病如糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等的预防与治疗，都具有一定的理论和现实意义。

去氢厄弗酚(dehydroeffusol，化学名为2，7-二羟基-1-甲基-5-乙烯基菲，分子式：C₁₇H₁₄O₂.分子量：250)为灯心草中特征性的成分之一。灯心草(Juncuseffusus L.)为灯心草科(Juncaceae)灯心草属(Juncus L.)植物灯心草(Juncuseffusus L.)的干燥茎髓或全草，别名灯心草、灯草，又名虎须草、灯心、碧玉草、水灯心、铁灯心等。灯心草分布于全球各地，全国各地均有生产，主产于江苏、四川、云南、贵州等地。性微寒，味甘、淡，归心、肺、小肠经，功能清心火，利小便，可治疗心烦少眠、高热口渴、尿少涩痛、小儿疳积、口舌生疮等症。目前研究表明，灯心草中的菲类成分具有抗菌、抗氧化、抗微生物及抗藻活性。

发明内容

本发明目的在于提供一种去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用，提供了一种用于治疗肿瘤及抑制血管生成的新用途。

本发明人在分离出灯心草抗肿瘤有效组份后，进一步分离纯化出具有抗肿瘤的有效单体，经化学结构分析该活性单体名为去氢厄弗酚(dehydroeffusol)。经文献调研和查新，去氢厄弗酚对肿瘤细胞及肿瘤血管生成的影响，国内外至今未见文献报道。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

本发明人研究证明：去氢厄弗酚具有很好的抗肿瘤和抑制肿瘤血管生成作用。本发明提供一种去氢厄弗酚在制备抑制肿瘤及血管生成的药物或保健食品或化妆品中的应用，并提供了一种新的抑制肿瘤及肿瘤血管生成的防治方案，为研发新型抗肿瘤药物和发现药物作用新的靶点提供科学依据和重要信息，为中医药抗肿瘤治疗提供创新中药。所述去氢厄弗酚来源于天然药物灯心草属植物提取或化学合成。

本发明提供一种去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用。本发明具体的技术方案如下：

灯心草抗肿瘤及肿瘤血管生成有效成分去氢厄弗酚的制备方法是：干燥的灯心草药材压碎，浸提，富集，得去氢厄弗酚粗品，薄层层析(TLC)检识，用体外肿瘤细胞增殖和肿瘤类血管生成模型测定其活性。去氢厄弗酚粗品经反复分离纯化即得去氢厄弗酚纯品，去氢厄弗酚的化学结构和分子式见图1，其纯度达95％以上。去氢厄弗酚用于制备抗肿瘤及抑制肿瘤血管生成药物，可被制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服剂、膏剂、霜剂、乳剂或纳米剂，这些药物含有有效剂量的去氢厄弗酚及常规药用载体和/或赋形剂。

本发明提供了一种去氢厄弗酚在制备抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物或保健食品或化妆品中的应用。去氢厄弗酚的靶标为多种恶性肿瘤，包括各种淋巴瘤、白血病、淋巴细胞白血病、T淋巴细胞瘤、肿瘤干细胞引起的肿瘤、乳腺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、骨髓瘤、卵巢癌和宫颈癌等。

优选的技术方案中包括：所述抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物中含有药学上有效量的去氢厄弗酚及其药学上可接受的载体。

优选的技术方案中包括：所述抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物剂型选自注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服剂、膏剂、霜剂或乳剂。

优选的技术方案中包括：所述抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物用于防治至少一种选自下述之一的疾病：血管瘤、血管纤维瘤、白血病、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变、早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞、视网膜变性、晶体后纤维组织增生、颗粒性结膜炎、血管生成引起的角膜疾病、更年期黄斑和黄斑变性、牛皮癣、老年盘状斑变性、风湿性关节炎、银屑病、毛细管扩张、脓性肉芽肿、伤口愈合中抑制斑痕形成、动脉粥样硬化、脂溢性皮炎和痤疮。

优选的技术方案中包括：所述抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物用于肿瘤或肿瘤转移的化学疗法或辅助治疗。

本发明的用途如下：

(1)本发明的去氢厄弗酚用于防治和或治疗至少一种以上选自下述之一的疾病：癌症(请详见以上第一页权利5所述)和或癌症转移，白血病、淋巴瘤、血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬化，脂溢性皮炎和痤疮。

(2)本发明的去氢厄弗酚有抗肿瘤、肿瘤血管生成及其他与血管生成有关疾病治疗、预防的用途，还有用于肿瘤化疗和/或辅助治疗的用途。本发明的去氢厄弗酚抑制肿瘤及肿瘤血管生成保健食品或化妆品。

(3)本发明的去氢厄弗酚可以单独使用或与其他药物配合制备成灾临床上可以使用的各种不同剂型的药物，例如注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服剂、膏剂、霜剂、乳剂或纳米剂等多种形式。

(4)本发明中去氢厄弗酚可以应用于抗肿瘤、肿瘤血管生成及其他与血管生成有关疾病治疗和预防。更具体地，本发明的去氢厄弗酚用于药物、食品、化妆品。

相对于现有技术中的方案，本发明具有以下特点和优点：

(1)研究的原创性：本专利申请人应用自己创立的肿瘤干细胞和肿瘤新生血管生成模型，从中成药灯心草中分离出活性成分，在国际上首先发现去氢厄弗酚具有很强的抗肿瘤及抗肿瘤新生血管生成的作用，去氢厄弗酚的抗肿瘤和肿瘤血管生成作用在国内外迄今尚未见报道。本研究成果具有原创性。

(2)研究的创新性：本专利申请人打破常规，勇于创新，采用现代高新科学技术发掘中医药宝库，以肿瘤干细胞和肿瘤细胞为靶标，研发中草药抗癌和抗肿瘤新生血管形成药物，发现去氢厄弗酚对肿瘤干细胞和肿瘤细胞具有较强的特异性抑制作用，本研究成果具有创新性和开拓性；研发中草药来源的特异性高的抗癌药物和抗肿瘤血管生成创新性药物具有高科技和中国特色。

(3)发明的实用性：本专利申请人的研究工作已证明去氢厄弗酚具有较强的抗肿瘤作用和抗肿瘤新生血管形成的活性，而且口服有效、高效低毒、价格便宜、稳定性好。利用该发现制备抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物可用于治疗和预防与肿瘤或肿瘤血管生成相关的疾病，还可用于肿瘤化疗和/或辅助化疗方面的治疗。本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点，研究并阐明去氢厄弗酚的药用疗效和机制，为其新用途开发和发现药物作用新的靶点提供科学依据和重要信息。去氢厄弗酚可用于药物、保健品和或化妆品等多种用途。

综上所述，本研究集理论创新、应用创新、技术创新为一体，能获得具有自主知识产权的新药和药用前体物质，在祖国传统医药的二次开发中具有前瞻性、先导性和探索性的前沿技术，能为抗肿瘤治疗另辟蹊径。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为去氢厄弗酚化学结构(C₁₇H₁₄O₂，分子量250)；

图2为去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803增殖的影响；

图3为去氢厄弗酚对人胃癌细胞HGC-27增殖的影响；

图4为去氢厄弗酚对人胶质瘤细胞U251增殖的影响；

图5为去氢厄弗酚对人胃癌细胞AGS增殖的影响；

图6为去氢厄弗酚对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖的影响；

图7为去氢厄弗酚对人脑胶质瘤干细胞系SU2增殖的影响；

图8为去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803类血管生成的影响；

图9为去氢厄弗酚对人胃癌细胞AGS类血管生成的影响；

图10为去氢厄弗酚对小鼠肿瘤干细胞PMKO 102-3类血管生成的影响；

图11为去氢厄弗酚对人脑胶质瘤干细胞SU2类血管生成的影响；

图12为去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803细胞周期的影响；

图13为去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803细胞凋亡的影响；

图14为去氢厄弗酚对人胃粘膜上皮细胞GES-1生长和死亡的影响；其中DAPI染色为蓝色，染细胞核；

图15为去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803生长和死亡的影响(DAPI为蓝色，染细胞核)；

图16为去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803细胞亚细胞结构的扫描电镜观察；

图17为去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803细胞亚细胞结构的透射电镜观察。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1去氢厄弗酚的制备

干燥的灯心草药材压碎，乙醇浸提，醇液减压浓缩至无醇味，上样于已大孔树脂柱，用水、乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱部位，减压回收至干，硅胶拌样，上样于硅胶柱，薄层层析(TLC)检识并富集留份得去氢厄弗酚粗品。去氢厄弗酚粗品再经硅胶柱等反复分离纯化即得去氢厄弗酚纯品(纯度＞90％)，再经制备型HPLC进一步纯化，其纯度达95％以上。去氢厄弗酚的化学结构和分子式见图1。

实施例2去氢厄弗酚对多种肿瘤细胞/肿瘤干细胞增殖的影响：

1、肿瘤细胞株(62株)名称

人成巨核细胞白血病细胞MEG-01、Dami和Daudi、人慢性髓原白血病细胞PBL985和K562、人原髓细胞白血病细胞HL-60、人白血病细胞株NB-4、人红白细胞白血病细胞HEL、人单核细胞白血病细胞THP-1、UC-CUC、SHI-1和SHI-2、人Burkitt′s淋巴瘤细胞Raji、Namalva、人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat、人T淋巴细胞系H9、人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF、人骨髓瘤细胞系8226、My-5、opm2、KMS11和LP-1、人骨肉瘤细胞Saos-2、MG-63、U-2OS和SW1353、人胶质瘤干细胞系SU2、人胶质瘤细胞SHG44、U251、A172和U-87MG、人脐带静脉血管内皮细胞Eahy926、人脐静脉内皮细胞ECV-304、人肺微血管内皮细胞HLMVEC、人卵巢癌细胞系HO-8910PM和Hey1B、人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231、人乳腺浸润性导管癌旁皮肤细胞CCD-1095SK、人肝癌细胞HepG2和HCCC-9810、人肺癌细胞SPC-A-1、95-D和H1299、人结肠癌细胞系HT-29和SW480、人黑色素瘤高转移细胞株C8161和A375、人回盲肠癌细胞CCL-244、人盲肠腺癌细胞(未分化)Hce-8693、人宫颈癌肠转移细胞Caski、人宫颈癌细胞Hela、人肾上腺神经母细胞瘤细胞(脑转移)KP-N-NS、人胃癌细胞MGC803、HGC-27、SGC-7901和AGS、人恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD、人肾透明细胞癌皮肤转移细胞Caki-1、小鼠肿瘤内皮细胞3B11、小鼠脂肪肉瘤细胞SW872、小鼠肿瘤干细胞2C4G2均来自本所实验室细胞库。

细胞培养基RPMI 1640和DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。Alamarblue试剂为INVITROGEN公司产品。

2、受试药物

去氢厄弗酚(按实施例1方法制备)用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用RPMI 1640或DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

3、实验方法

细胞培养：细胞用含体积分数10％小牛血清及双抗(青霉素和链霉素)的RPMI1640或DMEM(高糖)培养液常规培养。每48-72h用0.25％胰酶消化，1∶2～1∶4扩瓶传代。

(1)贴壁细胞

用0.25％胰酶消化贴壁细胞，离心后计数，以合适的浓度接种于96孔板，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，分别加入不同浓度的去氢厄弗酚，另外以单纯的培养液和未经药物作用的细胞作为空白对照和阴性对照，每组设3个复孔，培养46h后，加入AlamarBlue试剂10ul/孔，继续培养2h，用微孔检测仪进行测定荧光下OD560nm/OD590nm，按以下公式计算平均抑制率：

细胞抑制率(％)＝1-(加药孔RFU-空白对照RFU)/(对照组RFU-空白对照RFU)×100％。

(2)悬浮细胞

吸取悬浮细胞悬液，离心计数，以合适的浓度与不同浓度的去氢厄弗酚混合后，接种于96孔板，分别以单纯的培养液和未经药物作用的细胞作为空白对照和阴性对照，每组设3个复孔，37℃、5％CO₂培养箱中培养46h后，加入AlamarBlue试剂10ul/孔，继续培养2h，用微孔检测仪进行测定荧光下OD560nm/OD590nm，按上述公式计算平均抑制率。

4、实验结果

结果表明：去氢厄弗酚对各种淋巴瘤、白血病、淋巴细胞白血病、T淋巴细胞瘤、肿瘤干细胞、乳腺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌等62种肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，且随着药物浓度的增加，对62种肿瘤细胞增殖抑制作用相应地增强，其中去氢厄弗酚对人胃癌细胞增殖的抑制效果最强，见表1所示。

表1去氢厄弗酚对62种肿瘤细胞增殖的影响

实施例3去氢厄弗酚对多种胃癌细胞和正常的胃上皮细胞增殖的影响

1、细胞株：人胃癌细胞SGC-7901、AGS和MGC803，人正常胃粘膜上皮细胞GES-1。

2、受试药物：去氢厄弗酚，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用RPMI 1640或DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

3、实验方法：同实施例2

4、实验结果：去氢厄弗酚对多种胃癌细胞表现出较好的增殖抑制作用，且随着药物浓度的提高，对多种胃癌细胞增殖抑制作用相应地增强，去氢厄弗酚对三种胃癌细胞SGC-7901、AGS和MGC803的半数抑制浓度分别为4.86、8.47和4.17μg/ml左右；同时，去氢厄弗酚对正常的胃粘膜上皮细胞GES-1只有在较高的浓度才表现出抑制作用，其半数抑制浓度为21.56μg/ml(表2)，以上结果提示人胃癌细胞SGC-7901、AGS和MGC803对去氢厄弗酚较敏感，而人正常胃粘膜上皮细胞对去氢厄弗酚敏感性较差，见表2。

表2去氢厄弗酚对胃癌细胞和正常胃粘膜上皮细胞增殖的影响

实施例4去氢厄弗酚对多种肿瘤细胞增殖的影响(瑞-姬氏染色结果)

1、细胞株：人胃癌细胞AGS、HGC-27和MGC803、人胶质瘤细胞SHG44、U251和人胶质瘤干细胞系SU2。

2、受试药物：去氢厄弗酚(按实施例1制备)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用RPMI 1640或DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

3、实验方法：细胞用含体积分数10％小牛血清及1％双抗(抗青霉素和抗链霉素)的DMEM(高糖)培养液常规培养。每48-72h用0.25％胰酶消化，1∶2～1∶4扩瓶传代。

用0.25％胰酶消化贴壁细胞，离心后计数，以合适的浓度接种于24孔板，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，分别加入不同浓度的去氢厄弗酚，以未经药物作用的细胞作为对照，每组设3个复孔，培养48h后，利用瑞-姬氏染色试剂盒进行染色，然后在Olympus FSX-100显微镜下观察细胞形态、数量的变化并拍照。

4、实验结果：瑞-姬氏染色结果显示，去氢厄弗酚对多种胃癌细胞、胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞表现出较好的增殖抑制作用，且随着药物浓度的提高，对肿瘤细胞增殖抑制作用相应地增强，见图2-7。

实施例5去氢厄弗酚对体外肿瘤细胞类血管生成的影响

1、细胞株：人胃癌细胞MGC803和AGS、人胶质瘤干细胞系SU2、小鼠肿瘤干细胞PMKO102-3#。

2、受试药物：去氢厄弗酚(按实施例1制备)，用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用RPMI 1640或DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

3、实验方法：

实验前一天将Matrigel置于冰上过夜，同时实验时用的枪头和孔板均需置于冰上。实验时取150uL融化的BD公司的Matrigel，加入到48孔板中，轻拍使之均匀分布，37℃孵育1h使Matrigel聚合成胶。取合适含量的对数生长期肿瘤细胞，与含不同浓度的去氢厄弗酚等体积混合，以200uL/孔接种在Matrigel上，于37℃、5％CO₂培养箱培养若干小时后，应用瑞-姬氏染液染色后，在Olympus FSX-100显微镜下观察细胞类血管生成的变化并拍照。

4、实验结果：

人胃癌细胞MGC803和AGS、人胶质瘤干细胞系SU2、小鼠肿瘤干细胞PMKO 102-3#在体外均能够形成类血管样结构，去氢厄弗酚对肿瘤细胞的类型管生成表现出较好的抑制作用，且随着药物浓度的提高，对肿瘤细胞的类型管生成抑制作用相应地增强，见图8-11。

实施例6去氢厄弗酚对肿瘤细胞细胞周期的影响

1、细胞株：人胃癌细胞MGC803。

2、受试药物：去氢厄弗酚(按实施例1制备)，用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用RPMI 1640或DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

3、实验方法：

将不同浓度的去氢厄弗酚处理人胃癌细胞MGC80324h后，收集细胞，1000rpm离心5min，室温下PBS离心洗涤2次，去上清，加入体积分数为70％的冷乙醇700μl，4℃固定过夜。离心去上清，PBS离心洗涤，加PBS制成细胞悬液，再加入PI染液混匀，置4℃避光30min后上流式细胞仪(EPICSXL型，Beckman-Coulter公司，美国)检测细胞周期。

4、实验结果：流式细胞仪检测结果显示：随着去氢厄弗酚浓度的增高，人胃癌细胞MGC803细胞G0/G1期明显升高，G2/M期明显降低，且呈剂量依赖性趋势见图12，提示去氢厄弗酚可使人胃癌细胞MGC803的增殖周期阻滞于G0/G1期，从而抑制细胞增殖。

实施例7去氢厄弗酚对肿瘤细胞MGC803细胞凋亡的影响

1、细胞株：人胃癌细胞MGC803。

2、受试药物：去氢厄弗酚(按实施例1制备)，用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用RPMI 1640或DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

3、实验方法：

将不同浓度的去氢厄弗酚处理人胃癌细胞MGC80348h后，常规消化不同浓度、作用不同时间的细胞，离心收集固定后的细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。加入500μl结合缓冲液重悬细胞，立即加入Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)各5μl，100μg/ml的核糖核酸酶A的溶液中重悬细胞沉淀，流式细胞仪(EPICSXL型，Beckman-Coulter公司，美国)检测细胞凋亡率。

4、实验结果：

Annexin V-PI试剂盒进行流式细胞仪检测结果显示：随着去氢厄弗酚浓度的增高，人胃癌细胞MGC803细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例均明显上升，存在着量效关系(图13)，提示去氢厄弗酚可诱导人胃癌细胞MGC803发生细胞凋亡。

实施例8去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803生长和死亡的影响

1、细胞株：人胃癌细胞MGC803，人正常胃粘膜上皮细胞GES-1。

2、受试药物：去氢厄弗酚(按实施例1制备)，用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用RPMI 1640或DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

3、实验方法：

不同浓度去氢厄弗酚处理48h的细胞于3000rpm离心5min后用1％多聚甲醛室温固定20min，PBS离心洗涤2次，去上清，加入1ug/mL DAPI溶液作用10min。离心去上清，然后在Olympus FSX-100荧光显微镜下观察细胞形态、数量的变化并拍照。

4、实验结果：

随着去氢厄弗酚浓度的增加，人胃癌细胞MGC803细胞死亡明显上升，呈剂量依赖性趋势，正常胃上皮细胞GES-1变化不大，见图14-15，提示去氢厄弗酚选择性地作用于肿瘤细胞，而对正常的细胞未见明显影响。

实施例9去氢厄弗酚对胃癌细胞亚细胞结构的影响

1、细胞株：人胃癌细胞MGC803。

2、受试药物：去氢厄弗酚(按实施例1制备)，用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用RPMI 1640或DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

3、实验方法：

不同浓度去氢厄弗酚处理48h的细胞于3000rpm离心5min后用1％多聚甲醛室温固定20min，PBS离心洗涤2次，去上清，2.5％戊二醛固定，然后进行扫描电镜和透射电镜样品制作。

扫描电镜样品制作方法：2.5％戊二醛4℃固定3h以上，PBS洗三次，每次10-15min，饿酸固定1h，PBS洗三次，每次15min，30％叔丁醇(酒精配)10min，50％叔丁醇(酒精配)10min，70％叔丁醇(酒精配)10min，80％叔丁醇(酒精配)10min，90％叔丁醇(酒精配)10min，1000％叔丁醇(酒精配)3次，每次10min，最后一次放入冰箱中。

透射电镜样品制作方法：2.5％戊二醛4℃固定4h以上，PBS洗两次，每次15min，30％丙酮脱水15min，50％丙酮脱水15min，70％丙酮饱和醋酸铀过夜。第二天上午：80％丙酮脱水15min，90％丙酮脱水15min，100％丙酮脱水3次，每次10min，包埋剂∶100％丙酮＝1∶1包埋1h，纯包埋剂浸透2h以上，然后将样品放入模具或胶囊内进行包埋后放入烘箱中聚合。

制作好之后分别在S-4700型冷场发射扫描电镜(日本日立公司)和TecnaiG220高分辨透射电镜(美国FEI公司)下观察去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803亚细胞结构的变化并拍照。

4、实验结果：

扫描电镜结果显示，随着去氢厄弗酚浓度的增加，人胃癌细胞MGC803细胞发生凋亡的细胞明显上升，呈现典型的凋亡细胞特征，且由凋亡早期到凋亡晚期过渡，提示去氢厄弗酚能够诱导细胞发生凋亡，如图16所示。

透射电镜结果显示，随着去氢厄弗酚浓度的增加，人胃癌细胞MGC803细胞发生自噬的细胞明显上升，自噬小体数量明显增加，呈现典型的自噬特征，提示去氢厄弗酚能够诱导细胞发生自噬，如图17所示。

实施例10去氢厄弗酚对人胃癌细胞MGC803荷瘤裸鼠的疗效：

1、实验动物：

品系：裸鼠，雌性。

来源：苏州大学医学院实验动物中心。

合格证：实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。

体重：18-22g。

2、人胃癌细胞MGC803为本所实验室冻存。

3、受试药物去氢厄弗酚(按实施例1方法制备)用吐温-80助溶，生理盐水稀释成所需浓度。

4、实验方法

雌性裸鼠11只，体重18-22g。随机分为2组：模型组(5只)和去氢厄弗酚组(3mg/kg/d，6只)。将准备好的人胃癌细胞MGC803肿瘤细胞悬液以5×10⁶/只接种于裸鼠背部皮下。在接种肿瘤细胞的当天开始给药，去氢厄弗酚组每天腹腔注射3mg/kg/d，模型组灌服等体积的生理盐水。第23天脱臼法处死裸鼠，然后测量裸鼠体重和肿瘤的长径和短径，并计算肿瘤体积。

5、实验结果

荷瘤裸鼠经灌服给药23天后，与模型组相比，经去氢厄弗酚干预后的荷瘤裸鼠体重未见明显减轻，但肿瘤生长明显抑制，肿瘤体积明显缩小(P＜0.01)，见表3-4，提示去氢厄弗酚对荷瘤裸鼠肿瘤的生长具有显著的抑制作用。

表3去氢厄弗酚对荷瘤裸鼠体重的影响

表4去氢厄弗酚对荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响

^**P＜0.01，与模型组相比。

本发明结合实例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员能领会并在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式都同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1. 一种去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用。

2. 根据权利要求1所述的去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制肿瘤新生血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用，其特征在于去氢厄弗酚用于肿瘤的化学治疗或肿瘤的辅助治疗。

3. 根据权利要求1所述的去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用，其特征在于所述抑制肿瘤和/或肿瘤新生血管生成的药物中含有药学上有效量的去氢厄弗酚及其药学上可接受的载体，包括各种纳米载体。

4. 根据权利要求1所述的去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用，其特征在于所述去氢厄弗酚来源于天然药物灯心草属植物提取或化学合成。

5. 根据权利要求4所述的去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用，其特征在于所述抑制肿瘤和/或血管生成的药物剂型选自注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服剂、膏剂、霜剂、乳剂或纳米剂。

6. 根据权利要求4所述的去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用，其中所述的肿瘤包括各种淋巴瘤、白血病、淋巴细胞白血病、T淋巴细胞瘤、肿瘤干细胞引起的肿瘤、乳腺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、骨髓瘤、；卵巢癌、宫颈癌等。

7. 根据权利1所述的去氢厄弗酚在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆品中的应用，其特征在于所述药物用于预防或治疗原发或继发产生的血管瘤、血管纤维瘤、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变、早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞、视网膜变性、晶体后纤维组织增生、颗粒性结膜炎、血管生成引起的角膜疾病、更年期黄斑和黄斑变性、牛皮癣、老年盘状斑变性及风湿性关节炎、银屑病、毛细管扩张、脓性肉芽肿、伤口愈合中抑制斑痕形成、动脉粥样硬化、脂溢性皮炎和痤疮。

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