CN112999205A - 厄弗酚在制备抗白色念珠菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及厄弗酚在制备抗白色念珠菌药物中的应用。具体公开了厄弗酚在制备抗真菌药物中的用途，所述真菌包括白色念珠菌。实验证明，厄弗酚对白色念珠菌的生长有显著的抑制作用，同时对白色念珠菌的粘附性、菌丝形成、生物膜形成和毒力具有很好的抑制效果，表明厄弗酚抗白色念珠菌菌株的作用并不是主要依靠杀死白色念珠菌，而是主要通过抑制白色念珠菌的粘附性、菌丝形成、生物膜形成和毒力来抑制白色念珠菌的侵染能力和致病性的。因此，利用厄弗酚来治疗白色念珠菌引起的感染性疾病不易产生耐药性。综上，厄弗酚在新型抗真菌药物的开发，尤其是在制备预防和/或治疗白色念珠菌感染的药物中具有很好的应用前景。

Description

厄弗酚在制备抗白色念珠菌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及厄弗酚在制备抗真菌，特别是抗白色念珠菌的药物中的应用。

背景技术

念珠菌是真菌中最常见的条件致病菌，又称假丝酵母。它常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠粘膜等处，当机体免疫机能低下或正常寄居部位的微生态环境失调，容易引起念珠菌感染性疾病。念珠菌可引起皮肤粘膜浅层或全身系统性感染，感染不同部位可引起不同的疾患，包括皮肤念珠菌病、念珠菌性口腔炎、阴道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、脑膜炎、菌血症和胆道感染等，总之，念珠菌感染性疾病对人类生命危害很大。

临床上常见的念珠菌主要有白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌和季也蒙念珠菌。其中，白色念珠菌是在人类中广泛传播的致病性真菌，通常会引起急性、亚急性或慢性感染，也是现在医院获得性感染最重要的病原之一。研究发现，在健康人体黏膜表面，如口腔、肠道等，白色念珠菌通常不会引起病害，但在免疫系统受到损害或抑制的病人体内，如化疗病人、器官移植病人或艾滋病人中，会引起严重的系统性感染，其致死率高达40％。

氟康唑是目前用于治疗念珠菌感染性疾病的重要抗真菌药物之一，从1988年上市以来，氟康唑因具有吸收好、抗真菌谱广及毒性小等特点，在临床上得到了广泛应用并取得了良好的治疗效果。但是，氟康唑主要是通过抑制真菌复制起到抑菌的作用的，临床上发现在患有口腔念珠菌感染性疾病的艾滋病患者身上真菌清除不完全，经常复发，长期的反复治疗也因耐药菌株的出现导致艾滋病的临床治疗失败率增加。

因此，亟需研究出一种安全有效的、不易产生耐药性的抗念珠菌感染药物。

发明内容

本发明的目的在于提供厄弗酚在制备抗真菌，特别是抗白色念珠菌的药物中的应用。

本发明提供了厄弗酚在制备抗真菌药物中的用途。

进一步地，所述真菌为念珠菌。

进一步地，所述念珠菌为白色念珠菌。

进一步地，所述药物能够预防和/或治疗真菌感染。

进一步地，所述真菌感染为真菌引起的感染性疾病，优选为念珠菌引起的感染性疾病，更优选为白色念珠菌引起的感染性疾病。

进一步地，所述疾病选自口腔炎、阴道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、脑膜炎、菌血症或胆道白色念珠菌感染。

进一步地，所述药物能够抑制真菌生长，和/或抑制真菌的粘附性，和/或抑制真菌菌丝形成；和/或抑制真菌生物膜形成，和/或降低真菌的毒力。

本发明还提供了一种抗真菌药物，它是以厄弗酚为活性成分，加上一种或多种药学上可接受的载体制成的制剂。

进一步地，所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂中的一种或多种。

进一步地，所述制剂为注射剂、片剂、丸剂或胶囊剂。

厄弗酚的CAS号为73166-28-6，其结构式如下所示：

酵母-菌丝二相性是白色念珠菌(Candida albicans)特有的特性。游离的酵母态在感染期间对于宿主是没有毒性的，主要行使粘附于受体组织的作用，随后进行由酵母态向菌丝态的转变以促进入侵，之后以菌丝态为病原进入侵染组织，进一步发挥毒性作用。酵母-菌丝的形态转变是白色念珠菌发挥毒力的重要过程。本发明以白色念珠菌为供试对象，考察了厄弗酚对白色念珠菌的粘附性、菌丝形成率、生物膜形成以及细胞毒性的影响作用，目的是通过检测厄弗酚对白色念珠菌毒力形成因素的干扰，进一步评价厄弗酚影响白色念珠菌的侵染作用的机制。

结果显示，厄弗酚对白色念珠菌的生长有显著的抑制作用，同时对白色念珠菌的粘附性、菌丝形成、生物膜形成和毒力具有很好的抑制效果，表明厄弗酚抗白色念珠菌菌株的作用并不是主要依靠杀死白色念珠菌，而是主要通过抑制白色念珠菌的粘附性、菌丝形成、生物膜形成和毒力来降低白色念珠菌的侵染能力和致病性的。因此，利用厄弗酚来治疗白色念珠菌引起的感染性疾病不易产生耐药性。而且，厄弗酚本身毒性较小，不影响人类细胞的生长。

因此，厄弗酚在新型抗真菌药物的开发，尤其是在制备预防和/或治疗白色念珠菌感染的药物中具有很好的应用前景。

厄弗酚在制备抗白色念珠菌的药物中的应用，以及在制备预防和/或治疗白色念珠菌引起的感染性疾病的药物中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是厄弗酚抑制白色念珠菌粘附性的结果，DMSO作为对照组；图中数据显示的是4个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差；***表示与DMSO组比较，p＜0.001。

图2是终浓度为100μM的厄弗酚抑制白色念珠菌菌丝生成的显微镜照片，设置DMSO为对照组。

图3是终浓度为100μM的厄弗酚抑制白色念珠菌菌丝形成率的测定结果；图中数据显示的是4次生物学实验的平均结果，误差棒反映了标准差。

图4是厄弗酚抑制白色念珠菌生物膜形成的结果，DMSO作为对照组；图中数据显示的是8个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差；***表示与DMSO组比较，p＜0.001。

图5是终浓度为100μM的厄弗酚对白色念珠菌生长速率的影响结果，DMSO作为对照；图中数据显示的是3个生物学重复的平均结果。

图6：图A是终浓度为100μM的厄弗酚对A549细胞的细胞毒性检测结果；图B是不同浓度的厄弗酚与白色念珠菌共存时对A549细胞的毒性检测结果；图中数据显示的是4个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差；***表示与DMSO组比较，p＜0.001。

图7是厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314小鼠口腔侵染的影响结果，其中，图A是PBS溶液处理小鼠舌头的病理切片图(空白对照组)，图B是白色念珠菌的DMSO菌悬液处理小鼠舌头后的病理切片图(白色念珠菌对照组)，图C含厄弗酚的白色念珠菌悬液处理小鼠舌头后的病理切片图(厄弗酚处理组)，图D是各组的Cfu计算结果。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1厄弗酚抗菌活性检测

1、试验方法：

(1)白色念珠菌菌株的活化：

将白色念珠菌标准菌株SC5314(名称亦为ATCC MYA-2876)于LB固体培养基活化(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)，置于30℃培养箱培养过夜。

(2)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314粘附性的影响：

(a)人非小细胞肺癌细胞系A549细胞的复苏及培养：将冻融的A549细胞转移至含10％(v/v)FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37℃、5％CO₂条件下过夜培养。

(b)A549细胞准备：A549细胞在含10％胎牛血清的高糖培养基DMEM中，以0.5×10³个/孔的细胞浓度于96孔板(聚苯乙烯材质)中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％的时，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。

(c)挑取LB固体平板上的SC5314菌株，接种于GMM培养液(6.7g/L YNB，0.2％葡萄糖)中，30℃，200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀。随后用细胞维持液(含1％FBS的DMEM)调节将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.5。用DMSO溶解厄弗酚，制备浓度为20mM的厄弗酚母液；将厄弗酚母液用DMSO稀释成浓度为10mM、5mM、2.5mM、1.25mM的稀释药液，然后将厄弗酚母液、厄弗酚稀释液分别与含菌的细胞维持液按体积比1:99配比混合，震荡混匀，得到测试液A，厄弗酚在测试液A中的终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM。按100μL/孔加入步骤(b)已培养细胞的96孔板中，每个处理设置4个重复；同时设置只加DMSO的处理，其中，以DMSO和含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合，得到测试液B。将96孔板静置于37℃中孵育，1.5h后弃掉培养液，每孔加入100μL浓度为0.1％(w/v)的结晶紫溶液，室温作用45min。将结晶紫弃掉，并用预冷的ddH₂O洗10次，加入100μL浓度为体积百分比75％的乙醇溶液，室温放置30分钟，测定OD₅₉₀，用GraphPad Prism 6软件处理数据。

(3)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314菌丝的影响：

挑取LB固体平板上(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)的SC5314菌株，接种于GMM培养液(6.7g/L YNB，0.2％葡萄糖)中，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀，用GMM将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.1。取500μL菌液于1.5mL EP管中，加入厄弗酚，终浓度为100μM；同时设置DMSO对照；DMSO对照组中DMSO按厄弗酚处理组的相同体积加入到菌液中得到。震荡混匀，置于37℃水浴锅中孵育，6h后，离心5000rpm，10min，弃上清，加入40μL GMM培养液重悬菌体，于Zeiss Axioplan 2显微镜下观察菌丝的形成，取不同视野拍摄照片。

(4)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314生物膜形成的影响：

挑取LB固体平板上的SC5314菌株，接种于SDA培养液(40g麦芽糖、10g蛋白胨，蒸馏水定容至1L，调pH至6.0±0.2)，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀。随后用SDA培养液将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.1，得到含菌的SDA培养液。将厄弗酚母液用DMSO稀释成浓度为10mM、5mM、2.5mM、1.25mM、的稀释药液，然后将厄弗酚母液、厄弗酚稀释液分别与含菌的SDA培养液按体积比1:99配比混合，震荡混匀，得到测试液C，厄弗酚在测试液C中的终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM。按100μL/孔加入96孔板中，每个处理设置8个重复，同时设置只加DMSO的对照组。将96孔板静置于37℃中孵育，8h后弃掉培养液，加入100μL 0.1％结晶紫，室温作用45min。将结晶紫弃掉，并用冰ddH₂O洗10次，加入100μL 75％乙醇，室温放置30分钟，测定OD₅₉₀，用GraphPad Prism 6软件处理数据。

(5)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314生长影响测定：

挑取菌株SC5314单菌落接种于GMM培养液(6.7g/L YNB，0.2％葡萄糖)，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀，用GMM将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.05。将该菌液与浓度为10mM的厄弗酚药液按体积比99:1混合，按300μL/孔的量加入到100孔板中，每个处理设置3个重复，同时设置只加DMSO的处理。置于生长曲线测定仪中，30℃、200rpm，每2h测定一次OD₆₀₀值，72h后观察实验结果，GraphPad Prism 6处理数据。

(6)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314细胞毒力的影响：

(a)人非小细胞肺癌细胞系A549细胞的复苏及培养：将冻融的A549细胞转移至含10％(v/v)FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37℃、5％CO₂条件下过夜培养。

(b)A549细胞准备：A549细胞在含10％胎牛血清的高糖培养基DMEM中，以1.5×10⁴个/孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％的时候，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。

(c)白色念珠菌准备：挑取新鲜SC5314接种于GMM培养液(6.7g/L YNB，0.2％葡萄糖)中，于30℃、200rpm条件下振荡培养过夜；用细胞维持液(含1％FBS的DMEM)调节至OD₆₀₀＝1.0，再用细胞维持液稀释10倍(≈10⁸cfu/mL)，得到含菌的细胞维持液。

(d)细胞毒力测定：

a)用DMSO溶解厄弗酚，制备浓度为20mM的厄弗酚母液。

b)测定厄弗酚本身对A549细胞的毒力作用：将厄弗酚母液用DMSO稀释到20mM，加入细胞维持液中，厄弗酚的终浓度为100μM，得到测试液D；同时，设置对照组，即以相同体积的DMSO取代厄弗酚母液，得到测试液E。按100μL/孔，将测试液D和测试液E分别加入准备好的A549细胞中，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养8h，每处理4个重复。

c)测定厄弗酚和白色念珠菌对A549细胞的毒力作用：将厄弗酚母液用DMSO稀释成浓度为10mM、5mM、2.5mM、1.25mM的稀释药液，然后将厄弗酚母液和厄弗酚稀释液分别与含菌的细胞维持液按体积比1:99配比混合，得到测试液F，厄弗酚在测试液F中的终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM，测试液F中，DMSO的体积含量基本是相同的；同时设置只加DMSO(二甲基亚砜)、和FLC(氟康唑)作为对照，其中，以DMSO和含菌的细胞维持液按体积比1:99配比混合，得到测试液G；以氟康唑母液(用DMSO溶解得到，浓度为10mM)与含菌的细胞维持液按体积比1:99配比混合，得到测试液H。按100μL/孔，将测试液F～H分别加入准备好的A549细胞中，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养8h，每处理4个重复。

d)参照Promega公司CytoTox

NonRadioactive Cytotoxicity Assay操作方法测定细胞LDH(乳酸脱氢酶)活性，随后用GraphPad Prism 6处理数据。

本实验通过检测LDH的释放量来检测细胞的毒性，在检测白色念珠菌的细胞毒性时，将加入了DMSO组的LDH释放量作为100％，并由此来规范其他加入厄弗酚组的LDH释放比例。

(7)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314小鼠口腔侵染的影响：

(a)小鼠饲养：购于广东省实验动物中心的6～8周龄的雄性BALB/c小鼠，于贵州医科大学实验动物中心饲养。随机分配8只/组，称重记录并给每只小鼠做好标记。

(b)白色念珠菌菌悬液制备：将白色念珠菌标准菌株SC5314于LB固体培养基活化(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)，即置于30℃培养箱培养过夜。取单菌落接种于GMM培养液(6.7g/L YNB，0.2％葡萄糖)中，30℃，200rpm摇床过夜培养。4℃、3000rpm离心5min，预冷的无菌PBS洗涤2次，血细胞计数法计数，制备成浓度为3×10⁶个/ml的菌悬液。取5ml菌悬液，在其中加入25μL厄弗酚母液(浓度为20mM，溶质为DMSO)至厄弗酚的终浓度为100μM，得到含厄弗酚的菌悬液；取5ml菌悬液，在其中加入25μL DMSO，得到DMSO菌悬液。

(c)小鼠口腔侵染实验：小鼠感染前一天称重并每只注射0.1ml/10g的氢化可的松(22.5mg/ml)，接种前，先用10％的水合氯醛麻醉小鼠，被麻醉的小鼠平放在37℃恒温环境中，用无菌棉球浸透含厄弗酚的菌悬液3min后放在小鼠舌头下90min(厄弗酚处理组)；同时设置空白对照组和白色念珠菌对照组，空白对照组使用PBS溶液浸透无菌球棉后放在小鼠舌头下90min，白色念珠菌对照组为使用DMSO菌悬液浸透无菌球棉后放在小鼠舌头下90min。五天后处死小鼠，把小鼠舌头进行解剖并进一步进行病理切片观察，将解剖得到的舌头组织捣碎涂在SDA板(40g麦芽糖、10g蛋白胨，蒸馏水定容至1L，调pH至6.0±0.2，琼脂15g/L)上，放置30℃培养箱3天后计算Cfu(每g样品中的白色念珠菌群落总数)。

2、实验结果

(1)厄弗酚抑制白色念珠菌菌株SC5314的粘附性

如图1所示，以DMSO为参照，经不同浓度的厄弗酚处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯材质的96孔板上的粘附性均显著降低，其中，经终浓度为100μM的厄弗酚处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯材质的96孔板上的粘附性降低了95.8％以上。表明厄弗酚显示出了对白色念珠菌SC5314的粘附性较强的抑制作用。

(2)厄弗酚抑制白色念珠菌菌株SC5314菌丝的形成

图2是在显微镜下观察的白色念珠菌菌丝形成的照片图，其中，白色念珠菌在30℃时是不形成菌丝的。以按厄弗酚处理组的相同体积的DMSO加入到菌液，在37℃培养作为对照，以排除DMSO对白色念珠菌菌丝形成的影响。通过照片计算菌丝形成的抑制率：一个样品拍3张照(3个照片3个重复值)，数照片上的菌丝，以37℃培养下DMSO形成的菌丝为100％。结果如图3所示，厄弗酚对于白色念珠菌SC5314有明显的抑制作用，终浓度为100μM的厄弗酚对白色念珠菌菌丝的抑制率达到了96.8％以上。

(3)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314生物膜形成的影响：

如图4所示，以DMSO为参照，经不同浓度的厄弗酚处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯材质的96孔板上形成的生物膜均显著降低，其中，经厄弗酚(100μM)处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯材质的96孔板上的生物膜形成降低了89.7％左右。表明厄弗酚显示出了对白色念珠菌SC5314的生物膜形成显著的抑制作用。

(4)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314的生长一定的抑制作用

结果如图5所示，以DMSO为对照，厄弗酚的浓度为100μM时对白色念珠菌菌株SC5314的生长有显著更好的抑制效果(p＜0.05)。

上述结果表明厄弗酚抗白色念珠菌菌株SC5314的作用是通过抑制白色念珠菌生长、抑制白色念珠菌的粘附性、以及抑制白色念珠菌菌丝和生物膜的形成来实现的，因此不易产生耐药性。

(5)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314的毒力有很好的抑制作用

细胞毒力实验结果显示，以DMSO为对照，在没有白色念珠菌的条件下，厄弗酚对细胞没有毒性(图6A)。而在加入白色念珠菌SC5314的条件下，以DMSO为对照组，厄弗酚在抑制菌株SC5314对细胞的侵染有很好的保护作用；厄弗酚在100μM的浓度时，白色念珠菌的毒力降低到5.8％左右(图6B)。

上述结果表明厄弗酚本身毒性较小，不影响细胞的生长；而且，厄弗酚能有效降低白色念珠菌对细胞的毒力，抑制白色念珠菌对细胞的浸染。

(6)厄弗酚对白色念珠菌菌株SC5314的小鼠口腔侵染有很好的抑制作用

通过病理切片观察小鼠舌头上白色念珠菌形成情况，发现白色念珠菌对照组的小鼠舌头形成一层厚厚的白色念珠菌菌丝层(7B)，而在空白对照组和厄弗酚处理组小鼠舌头没有白色念珠菌菌丝形成(7A和7C)。另外，Cfu计数的结果显示(图7D)，与白色念珠菌对照组相比，厄弗酚处理组的Cfu数量明显降低，表明厄弗酚能够有效抑制白色念珠菌对小鼠口腔的侵染，能够预防和治疗白色念珠菌感染引起的口腔感染性疾病。

实验结果说明，厄弗酚可以有效抑制白色念珠菌生长、抑制白色念珠菌的粘附性以及菌丝和生物膜的形成，进而有效降低白色念珠菌对细胞的毒力，抑制白色念珠菌的侵染能力和致病性。厄弗酚能够用于预防和治疗白色念珠菌感染引起的感染性疾病。

综上，本发明提供了厄弗酚在制备抗真菌药物中的新用途，所述真菌包括白色念珠菌。实验证明，厄弗酚对白色念珠菌的生长有显著的抑制作用，同时对白色念珠菌的粘附性、菌丝形成、生物膜形成和毒力具有很好的抑制效果，表明厄弗酚抗白色念珠菌菌株的作用并不是主要依靠杀死白色念珠菌，而是主要通过抑制白色念珠菌的粘附性、菌丝形成、生物膜形成和毒力来降低白色念珠菌的侵染能力和致病性的。因此，利用厄弗酚来治疗白色念珠菌引起的感染性疾病不易产生耐药性。厄弗酚在新型抗真菌药物的开发，尤其是在制备预防和/或治疗白色念珠菌感染的药物中具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.厄弗酚在制备抗真菌药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述真菌为念珠菌。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述念珠菌为白色念珠菌。

4.根据权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于：所述药物能够预防和/或治疗真菌感染。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述真菌感染为真菌引起的感染性疾病，优选为念珠菌引起的感染性疾病，更优选为白色念珠菌引起的感染性疾病。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述疾病选自口腔炎、阴道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、脑膜炎、菌血症或胆道白色念珠菌感染。

7.根据权利要求1～6任一项所述的用途，其特征在于：所述药物能够抑制真菌生长，和/或抑制真菌的粘附性，和/或抑制真菌菌丝形成；和/或抑制真菌生物膜形成，和/或降低真菌的毒力。

8.一种抗真菌药物，其特征在于：它是以厄弗酚为活性成分，加上一种或多种药学上可接受的载体制成的制剂。

9.根据权利要求8所述的抗真菌药物，其特征在于：所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂中的一种或多种。

10.根据权利要求8或9所述的抗真菌药物，其特征在于：所述制剂为注射剂、片剂、丸剂或胶囊剂。

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