CN109758551B - 一种治疗足癣和外阴阴道念珠菌病的中药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种治疗足癣和外阴阴道念珠菌病的中药组合物，该中药组合物由有效成分和医学上可接受的辅料组成，其中所述的有效成分为以下重量份原料药制成的水提物：丁香19‑21份，广藿香15‑17份，黄连19‑21份，龙胆草14‑16份，百部14‑16份，枯矾2‑4份，薄荷9‑11份，冰片0.5‑1.5份。本发明所述的药物可以是洗剂、栓剂或乳膏剂三种外用制剂，经临床验证具有疗效确切、缓解症状迅速、安全性良好的优点。

Description

一种治疗足癣和外阴阴道念珠菌病的中药组合物

技术领域

本发明涉及医用配置品，具体涉含来自植物的未确定结构的药物制剂。

背景技术

本发明治疗的疾病主要为：足癣、外阴阴道念珠菌病。

真菌病按照其侵犯部位可以简单分为浅部真菌病和深部真菌病。浅部真菌病主要指真菌侵犯表皮、黏膜、甲板和毛发所致的感染。浅部真菌病是皮肤科的重要疾病之一，其中足癣和外阴阴道念珠菌病都是临床最常见的病种之一。

足癣(tinea pedis)是指由皮肤癣菌引起的足部皮肤真菌感染，主要累及足趾、趾间及侧缘，严重时可波及足背及踝部。足癣的致病菌主要为皮肤癣菌，包括毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属，其中致病菌以毛癣菌属为主，按目前新的分类方法，最常见的是红色毛癣菌复合群中的红色毛癣菌和须癣毛癣菌复合群中的指(趾)间毛癣菌。足癣是最常见的浅表真菌感染，从区域流行病学调查数据来看，全球自然人群发病率在10％以上，如欧洲平均发病率约14％，其他大部分地区的发病率为18-39％。足癣的发病率高，约84％的患者每年发作2 次以上。足癣对有些患者的健康、工作、社交及日常生活有明显的影响，如超过半数的患者因为瘙痒而影响睡眠甚或工作及生活。目前，两者的治疗主要使用局部外用抗真菌药物，此疗法具有方便、经济、毒副作用小等特点，但单纯外搽药膏容易遗漏病灶，疗效欠佳、复发率高，且随着广谱抗真菌药物的普遍应用，临床常用的抗真菌药物在高效、广谱、低毒和耐药性等方面存在明显不足之处。口服抗真菌药则存在较大的肝肾的毒副作用、价格昂贵，患者依从性较差。

外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是临床上妇科及皮肤性病科门诊常见的黏膜真菌感染性疾病，临床表现为反复发作的外阴瘙痒、灼痛，外阴红肿，白带增多，还可伴有尿痛以及性交痛等症状。据统计，每年全世界约有1000万人因患此病而就诊。复发性外阴阴道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)，是指妇女患VVC后经过治疗，临床症状和体征消失，真菌学检查阴性后又出现症状，经真菌检查又显阳性，每年发作≥4次。研究资料显示，约5-10％的妇女VVC反复发作。VVC有较高的发病率，约10％-15％的无症状女性中阴道有念珠菌的定植，70％-75％的女性一生中至少患过一次外阴阴道念珠菌病，其中50％经历过一次以上的复发，约5％-10％则可能演变为RVVC。由于VVC患病率高，尤其是RVVC病情反复，严重影响患者生活质量和心理生理健康。目前，临床常用口服和外用抗真菌制剂，但口服氟康唑、伊曲康唑等药物存在肝肾毒性，外用克霉唑、制霉菌素等容易引起耐药和局部皮肤刺激症状。

外治法是中医药的优势疗法，在中医治疗中占有非常重要的地位，具有作用迅速、疗效显著、副作用少、运用方便、操作简单、取材容易、能够直接观察、随时掌握等多种优点，其实在治疗皮肤疾病方面，通过疏通经络、调和气血、解毒化瘀、扶正祛邪等作用，改善皮肤局部症状，使之恢复正常，起到以外治内，祛邪扶正，治愈疾病的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的治疗足癣和外阴阴道念珠菌病的药物，该药物具有抗真菌疗效确切、改善症状迅速、副作用小的优点。

本发明解决上述问题的技术解决方案是：

一种治疗足癣和外阴阴道念珠菌病的中药组合物，该中药组合物由有效成分和医学上可接受的赋形剂组成，其中所述的有效成分为以下重量份原料药制成的水提物：丁香19-21份，广藿香15-17份，黄连19-21份，龙胆草14-16份，百部14-16份，枯矾2-4份，薄荷9-11 份，冰片0.5-1.5份。

上述中药组合物，其中所述原料药的最佳配比为：

丁香20份，广藿香16份，黄连20份，龙胆草15份，百部15份，枯矾3份，薄荷10 份，冰片1份。

上述中药组合物的剂型可以常见的外用药，如洗剂、栓剂或乳膏剂。

上述中药组合物由以下方法制得：

(1)取冰片粉碎，得冰片粉；

(2)按取除冰片外的原料药用水提取2-4次，每次加8-12倍水，煎煮1-3h，然后，合并煎煮液，过滤，最后将滤液浓缩至50-55℃下相对密度为1.0-1.3的浸膏；加入适量的医学上可接受的赋形剂和所述冰片粉，按常规方法制成洗剂、栓剂或乳膏剂。

本发明中丁香、广藿香芳香化浊，黄连燥湿止痒，共为君药；龙胆草善清肝胆下焦湿热，百部、枯矾能杀虫燥湿止痒，共为臣药；佐以薄荷、冰片清凉杀虫止痒；诸药合而外用，共奏清热燥湿、杀虫止痒之功效。适用于足癣，中医辨证为湿热蕴肤证，症见趾间或掌跖部位的水疱、浸渍或皲裂、角化、鳞屑性皮疹，伴瘙痒；也适用于外阴阴道念珠菌病，中医辨证为湿热下注证，症见白带增多，外阴阴道肿胀、灼热刺痛瘙痒。

下面通过临床试验和体外实验来证明本发明具有的有益效果。

一、治疗足癣的临床研究

1资料与方法

1.1临床资料病例分别来源于2010年3月至2012年3月在广东省中医院，海南省皮肤病医院，云南省中医院，湖北省中医院，广州中医药大学第一附属医院和暨南大学第一附属医院的门诊患者。使用前瞻性、多中心、随机、单盲、平行对照临床试验方法，采用第三者评价、第三方分析方法。共纳入356例患者，去除脱落病例，治疗组168例，对照组177 例，共345例列入统计病例。治疗组男性78例，女性90例；对照组男性88例，女性89例。两组患者在性别、年龄、病程、主症积分差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2疾病诊断标准：参照中华医学会相关标准。

1.3纳入标准:(1)年龄：18-60岁；(2)符合诊断标准；(3)能按要求完成试验并签署知情同意书者。

1.4排除标准：(1)近3个月内接受过系统抗真菌药物或近2周内接受过局部抗真菌药物治疗者；(2)长期接受皮质类固醇、免疫抑制剂治疗者；(3)哺乳及怀孕期妇女；(4)近 2周内接受过放疗、抗病毒、抗细菌、抗蠕虫治疗者；(5)合并甲真菌病，合并丹毒等细菌感染者；(6)合并心血管、肝、肾、脑和造血系统等严重原发性疾病者；患有精神疾病、恶性肿瘤、糖尿病、肾病及自身免疫性疾病。

1.5试验用药：本发明中药组合物的实施例1洗剂、实施例2乳膏剂；1％特比萘芬乳膏 (齐鲁制药有限公司，产品批号905012PA)。

1.6治疗方法：试验组病人每天用10％的实施例1洗剂，浸泡20分钟，每天1次；同步配合外搽实施例2乳膏剂，每天2次；对照组病人外搽1％特比萘芬乳膏，每天2次；疗程均为4周。

1.7观察指标及评分标准

1.7.1临床症状与体征评价指标包括瘙痒、红斑、丘疹、水疱、渗出、鳞屑、角化和皲裂等。评分标准：0－3级评分法，即0为无，1为轻，2为中，3为重。由研究者在0、1、2、 3、4和6周，分别进行评分。

1.7.2病原学检查:真菌镜检、真菌培养，采用清除、未清除二级标准评价。清除：真菌镜检和培养均阴性；未清除：真菌镜检和(或)培养阳性。在0、4、6周对足癣患者的靶部位进行真菌镜检和真菌培养。

1.7.3患者生活量表自评分(皮肤病生活质量量表)(Dermatology Life QualityIndex. A Y Finlay,G K Khan,April 1992.)评价时点：0、1、2、3、4周各评价1次。

1.7.4安全性指标:治疗前后监测患者的血、尿常规；肝功2项、肾功2项、心电图；局部皮肤有无接触性过敏；如实记录患者用药过程中出现的各种不适反应。治疗前(0周)和治疗结束后(第4周)各评价1次。

1.8疗效判定标准：

1.8.1主要疗效：以治愈和未愈2级标准评定，-临床疗效服从真菌学疗效，以停药后2 周为最终疗效。治愈为真菌培养阴性和临床体征总积分≤3；未愈为不符合治愈条件者。

1.8.2次要疗效

1.8.2.1临床体征、症状疗效评价：

观察体征、症状总积分改善情况在停药后2周进行评估，根据疗效指数计算疗效分为痊愈、显效、进步、无效四级。疗效评价时，治愈与显效病例合计为有效病例，计算有效率。

疗效指数＝(治疗前总积分－治疗后总积分)/治疗前总积分％。

痊愈：临床症状和体征完全消失；

显效：疗效指数≥60％；

进步：疗效指数20％－59％；

无效：疗效指数＜20％或恶化。

1.8.2.2真菌学疗效评价：在停药后2周，计数真菌镜检转阴率，真菌培养清除率。

1.9统计分析方法

用SPSS18.0统计软件建立数据库，多个观察时点疗效分析采用重复测量方差分析；组间比较采用χ²检验(或确切概率计算法)。数据统计人员不参与临床试验。

2结果

2.1两组治愈率的情况，见表1。

表1两组患者痊愈情况[例(％)]

两组患者各观察时点治愈人数呈增多趋势，主要疗效指标治愈率在结点时间第6周比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2次要疗效指标

2.2.1临床体征、症状疗效评价：

表2第6周两组患者临床体征、症状疗效评价[例(％)]

第6周对两组治疗后临床体征、症状的有效率比较差异有统计学意义(χ²＝21.277， P<0.000)。

2.2.2两组真菌转阴率的情况，见表3、4。

两组各观察时点真菌镜检转阴率差异无统计学意义(P>0.05)。

表3两组患者真菌镜检情况

表4两组患者真菌培养情况

2.3安全性分析：两组患者治疗前后血常规、尿常规、肾功能检查、肝功能、心电图检查结果分析无异常，未见皮肤过敏等不良反应。

3.讨论

本研究采用前瞻性、单盲、随机、多中心平行对照的临床试验，验证了实施例1的洗剂、实施例2乳膏剂的临床疗效和安全性。结果显示停药2周后(即6周)显示治疗组痊愈率为85.7％，西药特比奈芬组为80.2％，统计学上二组之间差异无显著性。从次要疗效上评价，治疗组有效率分别为94.1％，对照组有效率76.3％；对比分析均有显著性差异，提示治疗组外用治疗足癣改善症状方面有优势。在真菌清除率方面，无论从真菌镜检，还是真菌培养方面，两组真菌清除率均无显著性差异，这说明本研究涉及的中药组合物在临床上有良好的杀菌、抑菌作用。在整个研究过程中，实施例1的洗剂、实施例2的乳膏剂组未有患者不良反应发生，包括局部皮肤的过敏反应或刺激反应，以及对肝、肾功能的影响，说明实施例1的洗剂、实施例2的乳膏剂外用是安全的。

本发明涉及的中药组合物实施例1的洗剂和实施例2的乳膏剂是一种治疗足癣安全、有效的药物，疗效与西药特比奈芬乳膏相当，在改善症状方面优于后者，且安全性好。

二、治疗外阴阴道念珠菌病的临床研究

(一)实施例1的洗剂和实施例2的乳膏剂治疗外阴阴道念珠菌病

1.资料与方法

1.1临床资料本组58例均为妇科门诊患者，年龄18-45岁，已婚53例，未婚5例(均有性生活史)，病程3天-6年，其中1月以内的46例。所有病人均有外阴瘙痒的临床表现，其中伴外阴潮红的40例，豆渣或凝乳样分泌物的44例，奶黄色分泌物的8例。

1.2观察药物：实施例1的洗剂和实施例2的乳膏剂

1.3观察方法诊断标准为病人具有外阴瘙痒、外阴潮红、阴道分泌物增多、呈豆渣凝乳样或奶黄色等典型临床表现，阴道分泌物直接镜检念珠菌阳性。对就诊前2周内未使用有关药物治疗，可以追踪观察的病人纳入临床观察。有严重全身性疾病、慢性消耗病、妊娠期以及伴有外阴阴道其它疾病的病人不纳入观察。观察病例分为治疗组和对照组。治疗组病人用实施例1的洗剂稀释成10％冲洗外阴、阴道，每天1次，同时阴道内外涂搽实施例2乳膏剂；对照组病人用0.02％高锰酸钾溶液清洗浸泡外阴，每天1次，同时每天用3％苏打水冲洗阴道1次，并在阴道内外涂搽3％克霉唑霜或制霉菌素糊。两组病人均以12天为1疗程，1疗程结束时判定疗效。

2.疗效标准

痊愈为皮损和自觉症状全部消失，阴道分泌物直接镜检念珠菌阴性；显效为皮损和自觉症状减轻60％以上，阴道分泌物直接镜检念珠菌阴性；进步为皮损和自觉症状减轻30％-50％，阴道分泌物镜检念珠菌阴性或阳性；无效为皮损和自觉症状减轻＜30％，阴道分泌物镜检念珠菌阳性。

3.结果

治疗组的总有效率为89.7％，对照组为84.2％(P＞0.05)，详见表1。

表1本发明药物疗效结果(例)

4.结论

本组观察结果显示，实施例1的洗剂和实施例2的乳膏剂对外阴阴道念珠菌病有较好疗效，且治疗过程中病人普遍反映该药气味芳香、止痒效果好，未发现皮肤黏膜过敏反应和其它毒副作用。

(二)实施例3的栓剂治疗复发性外阴阴道念珠菌病

(一)研究方案

1.1病例选择

研究病例来自广东省中医院、云南省中医院、湖北省中医院、广州中医药大学第一附属医院、广东省第二中医院5个分中心的门诊RVVC患者。

1.1.1诊断标准：参照2003年中华妇产科学分会感染性疾病协作组制定《外阴阴道念珠菌病诊治规范》的RVVC诊断标准。

1.1.2纳入标准：(1)年龄：18-50岁，已婚或已有性生活史。(2)符合诊断标准； (3)能按要求完成试验并签署知情同意书者。

1.1.3排除标准：(1)近3个月内接受过系统抗真菌药物或近2周内接受过局部抗真菌药物治疗者；(2)长期接受皮质类固醇、免疫抑制剂治疗者；(3)哺乳及怀孕期妇女；(4)近2周内接受过放疗、抗病毒、抗细菌、抗蠕虫治疗者；(5)不能按要求接受、完成治疗者；(6)对治疗药物过敏者；(7)合并心血管、肝、肾、脑和造血系统等严重原发性疾病者；患有精神疾病、恶性肿瘤、糖尿病、肾病及自身免疫性疾病。

1.1.4中止标准：有不良事件发生；患者要求退出试验；违反治疗方案者。

1.2方法

1.2.1随机分组方法

采用双盲双模拟、多中心、随机对照试验研究方案。临床研究分成2组，用密码封(委托广州中医药大学DME中心制作)根据卡号的分组情况进行分组治疗，试验组病例：对照组病例＝1：1。

1.2.2试验药物

实施例3的栓剂(含生药量88.7％，批号：20100225，广东省中医院制剂室生产)、硝酸咪康唑栓模拟剂(批号：20100305，广东省中医院制剂室生产)、硝酸咪康唑栓(生产批号：110429818，400mg/粒，西安杨森制药有限公司生产)、实施例3的栓剂模拟剂 (批号：20100225，由广东省中医院制剂室生产)。

1.2.3用药方法

试验组为实施例3栓剂组，对照组为硝酸咪康唑栓组。试验组：每天清洁外阴后，用实施例3的栓剂+硝酸咪康唑栓模拟剂塞入阴道内；对照组：每天清洁外阴后，用硝酸咪康唑栓+实施例3的栓剂模拟剂塞入阴道内。

1.2.4疗程

两组治疗均分为2阶段：强化治疗每天一次，连续6天；巩固治疗，每月月经干净后，每天一次，连续3天，共6个月。【备注：强化治疗结束，停药9±1d天后行真菌镜检， (+)则视为无效病例，无需进入巩固治疗；(–)则进入巩固治疗。每次巩固治疗后9 ±1d，再行真菌镜检，若(+)无需进入下一次巩固治疗；若(–)则进入下一次巩固治疗，直至第6次巩固治疗。若能完成第6次巩固治疗，则在停药后7-14d行真菌学镜检，若(+)，不再进行随访；若(–)则继续随访。】

1.2.5疗效评定标准

(1)主要疗效：以治愈和未愈2级标准评定，临床疗效服从真菌学疗效，以停药后 2周为最终疗效判定时点。治愈为真菌镜检阴性和主要症状体征总积分≤3；未愈为不符合治愈条件者。临床症状体征积分指瘙痒、疼痛、分泌物、阴道壁充血水肿4项，评分标准：0－3级评分法，即0为无，1为轻，2为中，3为重。真菌学疗效：在每次停药9 ±1d天后行真菌镜检转阴率。真菌镜检：采用悬滴法，进行真菌镜检，发现菌丝者为阳性；反之为阴性。清除：真菌镜检阴性；未清除：真菌镜检阳性。

(2)次要疗效：包括临床症状体征评价、真菌学疗效评价、复发率评价、生活质量评价4方面。

A、临床症状体征评价：在0周及每次治疗后的第1周、第1、2、3、4、5、6月行评分，观察主要症状体征总积分改善情况。根据疗效指数计算疗效分为痊愈、显效、进步、无效四级。疗效评价时，治愈与显效病例合计为有效病例，计算有效率。疗效指数＝(治疗前总积分－治疗后总积分)/治疗前总积分％；痊愈：临床症状和体征完全消失；显效：疗效指数≥60％；进步：疗效指数20％－59％；无效：疗效指数＜20％或恶化。

B、真菌学疗效评价：观察各时点真菌学转阴率。

C、复发率评价：对各观察时点治愈的患者进行随访3个月，计算复发率。

D、生活质量评分：在0、1周，第1、2、3、4、5、6、7月，对比生活质量得分提高率。

1.2.3安全性评价指标：治疗前后皆监测患者的血、尿常规、肝功2项、肾功2项、心电图；局部皮肤粘膜有无过敏反应；如实记录患者用药过程中出现的各种不适反应。

1.2.4统计学方法

(1)描述性分析：两组治疗前后临床特征的分析，计量资料采用：

中位数(四分位间距)、最大值、最小值，各项计量资料分布的正态性检验；计数资料采用构成比及率。

(2)推断性分析：①计量资料：各组治疗前后比较采用配对t检验(或配对符号秩和检验)，两组间比较采用t检验，包括95％可信区间的计算，非正态分布或方差不齐时采用秩和检验(Mann-Whitney U)。如果组间基线不一致时采用协方差分析或分层分析，多个观察时点的比较采用重复测量方差分析(不满足条件者，采用校正的检验(Greenhouse-Geisser)或秩和检验)等。②计数资料：计算各指标的构成比及率，复发率、总有效率组间比较采用四格表卡方检验(或精确概率法)，多组间比较采用R×C卡方检验。③等级资料：两组间比较采用秩和检验(Mann-Whitney U)。

2结果

2.1一般资料

共纳入248例RVVC患者，实际至少完成一次病例观察的患者235例，两组治疗前的婚育状况、年龄、病程、主要症状体征评分、患者自评量表积分组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，两组治疗前基线平衡，具有可比性。

2.2疗效

2.2.1主要疗效

两组患者在治疗后各时点两组治愈、未愈构成比比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1两组患者主要疗效指标评分比较

注：“治愈”指：真菌镜检(-)，且主要症状体征评分≤3分，可进入下一时点继续观察。“未愈”包括两种情况：1.真菌镜检(+)，中止试验，不可进入下一时点继续观察； 2.真菌镜检(-)，主要症状体征评分≥3分，可进入下一时点继续观察。

2.2.2次要疗效

(1)临床症状体征评价

实施例3的栓剂外用治疗RVVC有效率两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，进行两组有效率的等效性检验，取Δ＝0.2，α＝0.05，两组有效率的等效性检验，差异有统计学意义(χ²＝12.26，P＝0.00)，可以认为两组有效率等效，提示两组疗法疗效相当。见表2。

表2两组患者临床症状体征评价情况

(2)真菌学疗效评价

两组真菌镜检阴转率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3两组患者真菌镜检情况

(3)复发率评价

疗后第1个月两组复发率比较，差异有统计学意义(χ²＝5.299，P＝0.022),其余观察时点两组复发率比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4两组各观察时点复发率(％)情况

*采用确切概率法

(4)生活质量评价

两组治疗后各观察时点的生活质量评分比较，在第1月对照组评分低于试验组，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，其余各观察时点两组比较差异均无统计学意义 (P>0.05)，经重复测量方差分析两组差异无统计学意义(F＝0.520，P＝0.475)，见表5。

表5两组患者生活质量评分比较

2.3安全性评价

治疗后第7个月，两组患者血尿常规、BUN、Cr、ALT、AST、心电图检测结果判定结果正常、异常构成比两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。部分异常结果对研究进程未造成影响，分析后考虑与患者基础疾病有关，与治疗药物无关，整个研究期间两组均未发生不良事件。

3结论

本研究采用实施例3的栓剂进行临床疗效观察，结果显示：实施例3的栓剂与硝酸咪康唑栓外用治疗RVVC在治疗后各时点两组治愈、未愈构成比比较差异均无统计学意义，实施例3的栓剂有效率37.1％与硝酸咪康唑栓38.7％相当，差异无显著性意义，实施例3 的栓剂与硝酸咪康唑栓疗效相当。且对缓解患者症状体征、提高患者生活质量方面具有相同作用。实施例3的栓剂治疗RVVC无明显不良反应，有较好的安全性。另外，从卫生经济学角度，实施例3的栓剂与硝酸咪康唑栓相比，在疗效相当的情况下，实施例3栓剂的费用明显低于硝酸咪康唑栓，二者的经济学效益显然益见，对患者是一个较佳的选择，具有广阔的应用开发前景。

三、抗真菌体外实验研究

(一)实施例1的洗剂对40株白念珠菌的药敏分析

1资料与方法

1.1一般资料实验菌株选择我院2009年6月皮肤性病门诊和妇科门诊中符合外阴阴道念珠菌病诊断标准的患者白带常规标本，并经分离、培养、鉴定后确定为白色念珠菌的40例标本。

1.2标准菌株质控菌株克柔念珠菌ATCC6258由第二军医大学长海医院提供。

1.3培养基RPMI-1640培养液:含有L-谷氨酰胺、酚红指示剂及MOPS缓冲液，不含碳酸氢钠，按全国临床检验操作规程配制:取10.4gRPMI-1640粉剂加入900ml蒸馏水中，再加34.53gMOPS(终浓度0.165mol/L)，于25℃搅拌使其溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节 PH值至7.0±0.1，加蒸馏水使培养液终体积达1L，过滤除菌后4℃保存。

沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA，含葡萄糖2％，蛋白胨1％，琼脂2％)和科玛嘉念珠菌显色培养基均购自广州市迪景微生物科技有限公司。

1.4仪器电子分析天平仪，真菌培养箱，比浊仪。

1.5药物实施例1的洗剂:120mL/瓶，含生药浓度100％，批号粤Z20071446，使用前过滤除渣，其原液浓度为1 000mg/mL。氟康唑粉末:由海南曼克星制药厂提供，纯度99.82％，批号070501，用无菌蒸馏水溶解配制成1 280μg/mL的母液作为储存液。

1.6方法

1.6.1培养鉴定菌株在SDA平板28℃培养24-48h后，经科玛嘉显色板转种培养48h，筛选出显绿色或翠绿色的白色念珠菌，再转种于SDA平板孵育24h以保证菌株的纯度和活力。质控菌株移种在SDA平板上28℃培养24-48h。

1.6.2菌液制备于每例菌株上各挑取数个直径＞1mm的菌落于5ml的0.85％氯化钠溶液中制成菌悬液，用比浊仪调整菌悬液浊度以适应0.5麦氏浊度。

1.6.3 MIC测定用RPMI-1640按1：1 000比例稀释菌液，再于96孔板上各孔依次添加培养液、药液、菌液，各含药孔按2倍浓度等比稀释。每板35℃孵育48h后，按M27-A 方案标准进行各孔评分，肉眼观察各孔和对照孔的生长比较，MIC值判定取≤2分的最低药物浓度。评分后氯化钠溶液洗涤＞MIC值各孔的药液并接种培养于不含药物的SDA平板上， 28℃孵育48h后，MFC值取无菌生长的最低药物浓度。

1.6.4 MFC测定将实施例1的洗剂药物浓度大于MIC值的各孔内培养液混匀，各取100μL，分装于无菌离心管内，加入10ml无菌生理盐水洗涤，振荡混匀，在离心机上离心后，静置15s，吸去上清液以清除培养液内的药液，继续重复洗涤培养液2次。洗涤后，用消毒接种环将培养液接种于不含药物的SDA平板上，置于28℃恒温箱孵育48h，若仍无菌生长，表示菌已被杀死，菌仍未生长的最低药基浓度为实施例1的洗剂对临床白念珠菌的 MFC。

1.7统计学方法用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理，采用描述性分析:x±s、Min、Max、MIC值组间的比较采用配对t检验，检验水平α＝0.05。

2结果

2.1 MIC测定结果孵育48h后，菌株生长良好，MIC终点清楚，标准菌株在质控范围内。两种药物的MIC值差异无显著性(P＞0.05)。各菌株的MIC值统计结果见表1。

表1氟康唑组与实施例1的洗剂组的最低抑菌浓度范围分析

2.2 MFC测定结果实施例1的洗剂组的MFC为31.3-125.0mg/ml，中位MFC为62.5mg/ml，平均MFC为(53.1±25.7)mg/ml，P25、P50、P75分别为31.3、62.5、62.5mg /ml。

3讨论

实施例1的洗剂对白念珠菌有较好的抑杀作用，抑菌作用程度与氟康唑差别不大，其 MIC为(3.20±2.83)mg/ml，MFC为(53.1±25.7)mg/ml，在抑菌程度上差异无显著性(p＞0.05)，且有明显的杀菌作用，值得临床推广。

(二)实施例1的洗剂诱导白念珠菌耐药菌株恢复对氟康唑的敏感性

白念珠菌菌是外阴阴道念珠菌最常见的病原体，它的耐药性是目前临床上抗真菌治疗失败的主要原因之一。本试验通过实施例1的洗剂体外诱导耐药的白念珠菌恢复对氟康唑的敏感性，采用微量肉汤稀释法测定MIC，以确定耐药菌株对氟康唑恢复敏感的代数。

1材料与方法

1.1药物实施例1的洗剂，120ml/瓶，含生药浓度100％，批准文号:粤Z20071446，批号08101737。氟康唑原药粉末:海南曼克星制药厂提供，批号070501，纯度99.82％，有效期3年(至2010年4月)。

1.2试验菌种白念珠菌SC5314标准菌株(Ted White教授馈赠)，近平滑假丝酵母菌ATCC22019、克柔假丝酵母菌ATCC6258质量控制菌株(第二军医大学长海医院赠送)。

1.3培养基SDA培养基(萨布罗培养基)、RPMI1640培养基及无菌96孔U型塑料板(购自广州市迪景微生物科技有限公司)。

1.4体外耐药菌株恢复敏感性诱导取耐药白念珠菌SC5314在含实施例1洗剂的RPM1640培养基中连续传代48h，将每代菌株以微量肉汤稀释法测定MIC。观察耐药菌株恢复对药物的敏感性所需代数。实施例1洗剂对原代耐药白念珠菌的MIC作为第一代的诱导浓度，以后每代的MIC作为下一代的诱导浓度。取耐药白念珠菌SC5314菌株在不含实施例1 洗剂的RPM1640培养基中连续传代，将各代菌株，将各代菌株以微量肉汤稀释法测定MIC，观察耐药菌株恢复敏感性所需代数。

1.5微量肉汤稀释法进行体外药敏试验

1.5.1药物的配制配制所需药物剂量可根据下述公式进行计算:药物量(mg)＝稀释剂用量(ml)×贮存液浓度(μg/ml)/药物有效力(μg/ml)。氟康唑以无菌蒸馏水溶解，贮存液浓度为1280μg/ml，药物稀释剂为试验用培养基。实际应用浓度范围为0.125-128μg/ml；实施例1的洗剂原液浓度为1000mg/ml，实际应用浓度范围为0.2442-250mg/ml(药物贮存液置无菌聚乙烯小瓶-70℃保存)。

1.5.2菌悬液的制备取原代、培养的每代耐药白念珠菌SC5314菌株在SDA培养基上转种，35℃孵箱中过夜培养(48h)；取数个直径＞1mm的菌落用0.85％的无菌生理盐水制成菌悬液，漩涡振荡器混匀。调菌悬液浊度达到0.5麦氏浊度，相当于(l×10⁶-5×10⁶)CFU/ml，血细胞计数板镜下计数确定其在此范围。用上述制备好的RPMI1640培养基1：20倍稀释后再1：50倍稀释至最终浓度为(5×10²-2.5×10³)CFU/ml，作为最终接种菌悬液。

1.5.3接种药物为氟康唑:无菌96孔U型塑料板上一排为一组，在第1孔加入160μlRPMI1640液体培养基，其余每孔加入100μl，在第1孔加入40μl的氟康唑药物贮存液并振荡混匀；然后吸取100μl到第2孔，混匀后吸取100μl到第3孔；连续倍比稀释至第 11孔，第11孔吸取100μl弃去；第12孔为不含药物的生长对照。最后在每孔中加入菌悬液100μl。此时从第1-11孔的药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125μg/ml。

药物为实施例1的洗剂:按照上述方法，无菌96孔U型塑料板上一排为一组，每孔加入 100μlRPMI1640液体培养基；第1孔加入100μl实施例1的洗剂并混匀；吸取100μl到第2孔，混匀后吸取100μl到第3孔，连续倍比稀释至第11孔；将第11孔吸取100μl弃去；第12孔为不含药物的生长对照。最后在每孔中加入制备好的菌悬液100μl。此时从第 1-11孔的药物浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、 0.24mg/ml，35℃孵育48h观察并记录结果。每试验平行做4次。

1.5.4质量控制用近平滑假丝酵母菌标准菌株ATCC22019、克柔假丝酵母菌标准菌株 ATCC6258按上述方法进行MIC测定。

1.5.5结果判读MIC终点判定，与对照孔按下列标准比较，0:肉眼观察清晰；(1)轻度模糊；(2)浊度显著减低(约50％被抑制)；(3)浊度轻度减低；(4)浊度不减低。两性霉素B以肉眼观察清晰不混浊孔为MIC判定终点，唑类药物取(2)浊度显著减低为MIC判定终点^[3]。

2结果

2.1质控结果质控菌株ATCC22019和ATCC6528的MIC结果分别在0.5-0.25μg/ml、8-4 μg/ml，符合CLSI推荐的M27-S3的48h标准，结果在控。表明试验条件、操作等均在控。

2.2氟康唑对原代耐药白念珠菌SC5314MIC结果氟康唑对原代耐药白念珠菌SC5314的 MIC结果为＞128μg/ml，表明试验菌株白念珠菌SC5314为耐药菌株。

2.3实施例1的洗剂对耐药白念珠菌SC5314MIC经做4次平行试验，实施例1的洗剂对原代耐药白念珠菌SC5314MIC其结果为0.98mg/ml，以此实施例1的洗剂MIC为诱导第一代菌株的试验浓度，此后的第二-五代的试验实施例1的洗剂MIC都是非常稳定地维持在0.98mg/ml的诱导浓度。

2.4耐药菌株白念珠菌SC5314恢复对氟康唑的敏感性结果经实施例1的洗剂作用后，耐药白念珠菌SC5314于第六代恢复对氟康唑敏感，其实施例1洗剂的MIC为0.25μg/ml；同步对照组，无实施例1的洗剂作用于第十六代才恢复对氟康唑敏感，两者差异有统计学意义。实施例1洗剂作用的第6代菌株和无实施例1洗剂作用的第十六代菌株都是骤然变成敏感株。

3讨论

经实施例1的洗剂作用后，耐药白念珠菌SC5314菌株于第六代恢复对氟康唑敏感；同步对照组，无实施例1的洗剂作用于第十六代才恢复对氟康唑敏感，二者差异无统计学意义。在试验过程中发现:耐药菌株SC5314恢复对氟康唑的敏感性是骤然变化的，无论有无实施例 1的洗剂诱导都有这种趋势，实施例1的洗剂作用的第6代菌株和无实施例1的洗剂作用的第16代菌株都是骤然变成敏感株；但经实施例1的洗剂诱导后，耐药菌株恢复对氟康唑药物的敏感性所经历的时间较未经该药物诱导作用所需的时间及传代数明显缩短；同时，实施例1的洗剂对诱导后每代耐药白念珠菌SC5314MIC测定过程中，其MIC浓度均在0.49-0.98 mg/ml范围内，提示实施例1的洗剂对耐药菌株作用浓度相对稳定。

(三)实施例1的洗剂对硝酸咪康唑抗白念珠菌增效作用的体外实验研究

白念珠菌是外阴阴道念珠菌病最常见的致病菌，硝酸咪康唑被美国疾病控制中心列为首选药物，但临床耐药率也逐年上升，联用增强硝酸咪康唑敏感性的药物是降低其耐药性、增强其药敏性的方法之一。本试验采用微量肉汤稀释法，对比实施例1的洗剂联用硝酸咪康唑与分别单用硝酸咪康唑和实施例1的洗剂抗白念珠菌的药物最小作用浓度(minimum inhibitory con-Centration，MIC)，以了解实施例1的洗剂对硝酸咪康唑抗白念珠菌抗菌增效作用。

1材料与方法

1.1药物

实施例1的洗剂:120mL/瓶(含生药浓度100％,批准文号:粤220071446)。硝酸咪康唑溶液:上海世康特制药有限公司，规格:20mL(含硝酸咪康唑0.4g，浓度为2％，国药准字号:H31022700)。

1.2试验菌种

来源于广东省中医院妇科门诊单纯性VVC患者的阴道分泌物，经真菌科玛嘉显色培养确证为白念珠菌菌株，共12株；质量控制菌株:近平滑假丝酵母菌ATCC 22019、克柔假丝酵母菌ATCC6258(第二军医大学长海医院赠送)。

1.3培养基

科玛嘉显色培养基、SDA培养基(萨布罗培养基)、RPMI1640培养基及无菌96孔U型塑料板(购自广州市迪景微生物科技有限公司)。

1.4白念珠菌的鉴定

取临床确诊为单纯性VVC的患者阴道分泌物，用棉签蘸取适量标本涂抹于SDA培养基上，再用消毒接种环按四个不同方向在该平板上均匀涂划标本。标本接种后，置于37℃恒温箱孵育24-48小时，可见菌落后，将呈奶油色、光滑菌落分离，转种于真菌显色板上，筛选出绿色或蓝绿色显色明显的菌落，经YBC酵母菌鉴定卡鉴定该菌株为白念珠菌后，将白念珠菌二次转种在SDA培养基上37℃培养24-48小时，以保证试验菌株的纯度和活力。转种24-48小时后放置10℃冰箱保存备用。

1.5微量肉汤稀释法进行体外药敏试验

参照美国临床和实验室标准协会(clinicaland laboratory standardsinstitute CLSI) 提出的标准(M27-A方案)，采用肉汤微量稀释法进行试验。

1.5.1药物的配制

所需药物剂量根据下述公式进行计算:药物量(mg)＝稀释剂用量(mL)·贮存液浓度(g/mL)/ 药物有效力(g/mg)。因CLSI提出的标准中，缺乏硝酸咪康唑的相关研究，因此参照氟康唑的药物配制方法。硝酸咪康唑溶液以培养液来稀释，贮存液浓度为1280g/mL，药物稀释剂为试验用培养基。实际应用浓度范围为0.125-128g/mL；实施例1的洗剂原液浓度为100mg/mL，实际应用浓度范围为0.2442-250mg/mL(药物贮存液置无菌聚乙烯小瓶-70℃保存)。

1.5.2菌悬液的制备

取二次转种在SDA培养基上37℃培养24-48小时的白念珠菌菌株，再次转种在SDA培养基上，37℃孵箱中培养48小时；取数个直径＞1mm的菌落用0.85％的无菌生理盐水制成菌悬液，漩涡振荡器混匀。调菌悬液浊度达到0.5麦氏浊度，相当于(1×10⁶-5×10⁶)CFU/mL，血细胞计数板镜下计数确定其在此范围。用上述制备好的RPMI1640培养基1:20倍稀释后再1:50 倍稀释至最终浓度为(1×10³-5×10³)CFU/mL，作为最终接种菌悬液。

1.5.3接种单用硝酸咪康唑溶液

无菌96孔U型塑料板上一排为一组，每孔加入100μL RPMI 1640液体培养基，在第1孔加入40μL的硝酸咪康唑药物贮存液和60μL的RPMI 1640液体培养基并振荡混匀；然后吸取100μL到第2孔，混匀后吸取100μL到第3孔；连续倍比稀释至第11孔，第11孔吸取100μL弃去；第12孔为不含药物的生长对照。最后在每孔中加入菌悬液100μL。此时从第1-11孔的药物浓度分别为128、64、32、16，8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，37℃孵育48h观察并记录结果。

单用实施例1的洗剂:无菌96孔U型塑料板上一排为一组，在每孔加入100μL RPMI1640 液体培养基，在第1孔加入100μL的实施例1的洗剂并振荡混匀，其余步骤同单用硝酸咪康唑溶液。此时从第1-11孔的药物浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24mg/mL，37℃孵育48h观察并记录结果。

硝酸咪康唑溶液联用实施例1的洗剂:按照上述方法，无菌％孔U型塑料板上一排为一组，每孔加入100μL RPMI1640液体培养基；第1孔加入60μL实施例1的洗剂并混匀，接着加入40μL硝酸咪康唑药物贮存液混匀；其余步骤同单用硝酸咪康唑溶液。此时从第1一11孔的药物含香莲洗液浓度分别为150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.35、1.18、0.59、0.30、0.15mg/mL，含有硝酸咪康唑溶液浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125mg/mL，37℃孵育48h观察并记录结果。三组试验均平行做3次。

1.5.4质量控制

用近平滑假丝酵母菌标准菌株ATCC 22019、克柔假丝酵母菌标准菌株ATCC6258按上述方法进行MIC测定1.5.5结果判读

MIC终点判定，与对照孔按下列标准比较，0:肉眼观察清晰；1:轻度模糊；2:浊度显著减低(约50％被抑制)；3:浊度轻度减低；4:浊度不减低。唑类药物取2，浊度显著减低为MIC 判定终点。

1.6联合用药效果评价

试验结果以联合抑菌指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)来判断两者的联合效应。FICI＝MIC^A联合/MIC^A单独+MIC^B联合/MIC^B单独。当FICI≤O.5时为协同作用；0.5＜ FICI≤1时为相加作用；1＜FICI≤4时为无关作用；当FICI＞4时为拮抗作用。

2结果

2.1质控结果

质控菌株ATCC 22019和ATCC 6528的MIC结果分别在0.5-0.25μg/mL和2-4μg/mL，符合CLSI推荐的M27S3的48h标准，结果在控，表明试验条件、操作等均在控。

2.2单用硝酸咪康唑溶液、实施例1的洗剂及二者联用作用于临床12株白念珠菌的MIC 结果经做3次平行试验，单用硝酸咪康唑溶液作用于临床12株白念珠菌MIC结果分别为:16、 16、16、16、6、6、5、4、4、2、2、2μg/mL，平均MIC值为(7.92±6.13)μg/mL。单用实施例1的洗剂作用的MIC结果分别为:15.63、15.63、7.81、3.91、3.91、3.91、3.91、3.91、 3.91、3.91、1.95、0.97mg/mL，MIC均值为(5.78±4.66)mg/mL。二者联合应用时，硝酸咪康唑MIC结果分别为:4、4、2、2、1、1、0.5、0.5、0.5、0.13、0.13、0.13μg/mL，平均 MIC值为((1.32±1.41)μg/mL，实施例1的洗剂MIC结果分别为:4.69、4.69、2.35、2.35、 1.18、1.18、0.59、0.59、0.59、0.3、0.3、0.3mg/mL，平均MIC值为(1.59±1.62)mg/mL。见表1。

表1单用和联用硝酸咪康唑、实施例1的洗剂时作用于临床菌株的平均MIL±s

2.3联合用药效果

两者的FICI＝0.46≤0.5。加用实施例1的洗剂后，硝酸咪康唑对白念珠菌的平均MIC值由(7.92±6.13)μg/mL降到(1.32±1.41)μg/mL，其敏感度由中介变为敏感(参照氟康唑对假丝酵母菌体外敏感性试验结果解释标准。表明实施例1的洗剂与硝酸咪康唑联用二者为协同作用，实施例1的洗剂对硝酸咪康唑抗白念珠菌有较好的抗菌增效作用。

3讨论

本研究表明硝酸咪康唑溶液联用实施例1的洗剂后，联合应用作用效果优于单独使用硝酸咪康唑溶液或单独使用实施例1的洗剂。两者联用的FICI为0.46，考虑与二者间的协同作用有关，此协同作用明显降低了白念珠菌对硝酸咪康唑的耐药率，增强了白念珠菌对硝酸咪康唑的敏感性。本研究表明硝酸咪康唑对白念珠菌的MIC为7.92μg/mL，但是其标准差为6.13，离散程度较大，表明其MIC各观察值的分布不均匀，差异较大(MIC波动范围在16-2 μg/mL)，说明不同白念珠菌株对硝酸咪康唑的敏感性不稳定，存在较大差异。联合实施例1 的洗剂之后，硝酸咪康唑抗白念珠菌MIC降至1.32μg/mL，其MIC标准差变为1.43，MIC明显降低，离散程度明显变小，说明联用实施例1的洗剂之后，不但增加了白念珠菌对硝酸咪康唑的敏感性，而且使其敏感性相对较稳定，差异相对较小，减少了耐药性。

综上，实施例1的洗剂对硝酸咪康唑溶液抗白念珠菌有增效作用，在抑制白念珠菌的生长方面，明显优于单用硝酸咪康唑溶液的作用，提示临床上治疗外阴阴道念珠菌病时，可在外用硝酸咪康唑的同时配合应用中药复方实施例1的洗剂以增强抑菌效果，提高临床疗效。

具体实施方式

实施例1(洗剂)：

1、处方

丁香1900g，广藿香1500g，黄连2100g，龙胆草1600g，百部1400g，枯矾300g，薄荷1100g，冰片100g(共10kg)。

2、制备方法

(1)按上述处方称取原料药，加水过药面10厘米，浸泡1小时后煎煮3次；

(2)第一次煮沸后武火煎60分钟，第二次煮沸后武火煎45分钟，第三次煮沸后武火煎 45分钟，分别收集煎煮液；

(3)合并煎液，浓缩至50-55℃下相对密度为1.10的浓缩液，室温放冷，以95％乙醇醇沉至含醇量为60％，静置48小时，过滤，回收乙醇至尽，浓缩成洗剂至10L(含生药量为1g/mL)；

(4)冷藏保存，最后分装成100-120ml/瓶的洗剂。

实施例2(乳膏)

1、处方

丁香2000g，广藿香1600g，黄连2000g，龙胆草1500g，百部1500g，枯矾300g，薄荷1000g、冰片100g(共10kg)。

2、制备方法

(1)按上述处方称取原料药，加水过药面10厘米，浸泡1小时后煎煮3次；

(2)第一次煮沸后武火煎60分钟，第二次煮沸后武火煎45分钟，第三次煮沸后武火煎 45分钟，分别收集煎煮液；

(3)合并煎液，浓缩至相对密度为1.10的浓缩液，室温放冷，以95％乙醇醇沉至含醇量为60％，静置48小时，过滤，回收乙醇至尽；

(4)加入辅料浓缩成乳膏(含生药量为4g/mL)，冷藏保存，最后分装成15-20g/支的乳膏。

实施例3(栓剂)

1、处方

丁香2100g，广藿香1700g，黄连1900g，龙胆草1400g，百部1600g，枯矾200g，薄荷1000g，冰片100g(共10kg)。

2、制备方法

(1)按处方重量份配比称取原料药，加水过药面10厘米，浸泡1小时后煎煮3次；

(2)第一次煮沸后武火煎60分钟，第二次煮沸后武火煎45分钟，第三次煮沸后武火煎 45分钟，分别收集煎煮液；

(3)合并煎液，浓缩至相对密度为1.10的浓缩液，室温放冷，以95％乙醇醇沉至含醇量为60％，静置48小时，过滤，回收乙醇至尽；

(4)加入辅料浓缩成浸膏(含生药量为4g/mL)，冷藏保存，最后分装成5g/支的栓剂。

Claims (1)

1.一种治疗足癣和外阴阴道念珠菌病的中药组合物，该中药组合物由有效成分和药学上可接受的辅料组成，其特征在于，所述的有效成分为以下重量份原料药制成的水提物：丁香2000g，广藿香1600g，黄连2000g，龙胆草1500g，百部1500g，枯矾300g，薄荷1000g，冰片100g；

所述的中药组合物由以下方法制得：

（1）称取原料药，加水过药面10厘米，浸泡1小时后煎煮3次；

（2）第一次煮沸后武火煎60分钟，第二次煮沸后武火煎45分钟，第三次煮沸后武火煎45分钟，分别收集煎煮液；

（3）合并煎液，浓缩至相对密度为1.10的浓缩液，室温放冷，以95%乙醇醇沉至含醇量为60%，静置48小时，过滤，回收乙醇至尽；

（4）加入辅料浓缩成含生药量为4g/mL的乳膏，冷藏保存，最后分装成15-20g/支的乳膏。