CN111658683A - 诃子提取物在制备马拉色菌抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了诃子提取物在制备马拉色菌抑制剂中的应用,还包括诃子提取物在制备治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的药物中的应用;所述马拉色菌感染相关皮肤疾病包括花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎和脂溢性皮炎等疾病;提供了一种包含诃子提取物的马拉色菌抑制剂以及治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的药物。本发明研究显示,所述诃子提取物及其主要成分对马拉色菌具有很好的抑制作用,同时对马拉色菌感染相关疾病具有良好的预防与治疗作用,并且该诃子提取物安全无刺激、无副作用,可用于相关药物的制备。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,更具体地,涉及诃子提取物在制备马拉色菌抑制剂中的应用。
背景技术
马拉色菌(Malassezia)是一组常见的条件致病菌,广泛存在于人类及温血动物皮肤油脂分泌旺盛的部位,是人体正常菌群之一,与机体处于共生状态。马拉色菌在皮肤病发病中的相关作用机制仍然存在着争议,在人体皮肤上的定植,不仅可以引起非炎症性皮肤疾病如花斑糠疹(过去称花斑癣,俗称汗斑),也与炎症性皮肤病如脂溢性皮炎、特应性皮炎、毛囊炎等疾病有一定的相关性。研究发现红斑鳞屑伴皮脂分泌增多患者头皮上的马拉色菌的数量是寄居在正常人群头皮上马拉色菌总量的1.5~2.0倍,一些抗真菌药物的应用可以直接减少红斑鳞屑伴皮脂分泌增多的发生。
目前,临床上通常采用酮康唑等抗菌药物作为的抗真菌剂治疗马拉色菌过度增殖引起的相关皮肤疾病。但近年来,由于酮康唑、氟康唑等抗真菌药物的广泛使用,真菌对临床抗真菌药物产生不同程度的耐药性,使得常用抗真菌药物对真菌诱发脂溢性皮炎等皮肤疾病的治疗能力大大降低,已经不能满足广大消费者追求健康、绿色和可持续的愿望。因此,开发一种的具有治疗因马拉色菌过度增殖引起的皮肤疾病的且不具有皮肤刺激性和致敏问题的马拉色菌抑制剂将具有广阔的应用前景。
诃子(Terminalia chebula Retz.),使君子科植物诃子的干燥成熟果实,具有涩肠止泻,敛肺止咳,降火利咽之功效。常用于久泻久痢,便血脱肛,肺虚喘咳,久嗽不止,咽痛音哑。现代药理表明,诃子具有广泛的抗菌活性,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、幽门螺杆菌以及部分真菌均有一定的抑制作用,但目前未见有对马拉色菌的抑制作用的相关研究。
由于现有临床抗马拉色菌药物存在耐药性及副作用等问题,因此,开发一种中草药来源、安全有效的马拉色菌抑制剂具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。因此,本发明提出诃子提取物在制备马拉色菌抑制剂中的应用,能够提供一种安全的天然中药提取物有效抑制马拉色菌的生长繁殖,诃子提取物对限制性马拉色菌具有较强的抑制作用,并且对人体更加安全无刺激、无副作用,可用于抑制马拉色菌过度增殖引起的感染相关皮肤外用产品的制备。
本发明还提出诃子提取物在制备治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的药物中的应用。
本发明还提出一种马拉色菌抑制剂。
本发明还提出一种治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的药物。
在本发明的一个方面中,提供了诃子提取物在制备马拉色菌抑制剂中的应用。
在本发明的另一个方面中,提供了诃子提取物在制备治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的药物中的应用。
进一步地,所述马拉色菌感染相关皮肤疾病包括花斑糠疹(过去称花斑癣,俗称汗斑)、马拉色菌毛囊炎和脂溢性皮炎等。
进一步地,所述诃子提取物为诃子的水提取物或乙醇提取物。
优选地,所述诃子提取物为诃子的水提取物。
进一步地,所述诃子提取物包含莽草酸、诃子酸、石榴皮鞣质、新诃子鞣酸、新诃子酸、诃子次酸、没食子酸甲酯中的至少一种。
优选地,所述诃子提取物包含以质量百分数计的下列组分:莽草酸6%~10%、诃子酸 3%~8%、石榴皮鞣质4%~9%、新诃子鞣酸2%~6%、新诃子酸8%~12%、诃子次酸2%~6%、没食子酸甲酯1%~4%。
更优选地,所述诃子提取物包含以质量百分数计的下列组分:莽草酸7%、诃子酸4%、石榴皮鞣质5%、新诃子鞣酸3%、新诃子酸11%、诃子次酸4%、没食子酸甲酯2%。
在本发明中,研究发现诃子提取物对马拉色菌具有显著抑制作用,并进一步对诃子提取物成分分析发现,莽草酸、诃子酸、石榴皮鞣质、新诃子鞣酸、新诃子酸、诃子次酸、没食子酸甲酯对马拉色菌均有不同程度的抑制作用。
进一步地,所述诃子提取物的制备方法包括如下步骤:诃子中加入去离子水煎煮提取,浓缩后得到诃子水提取物。
优选地,所述诃子提取物的制备方法包括如下步骤:称取诃子粉末,加入去离子水煎煮提取,料液比为1:6~14,提取时间为1-3h。
更优选地,所述诃子提取物的制备方法包括如下步骤:称取诃子干燥粉末,加入去离子水煎煮提取2次,料液比分别为1:10、1:8;提取时间分别为2h、1.5h;合并两次滤液,减压浓缩后得到诃子水提取物。
在本发明的又一个方面中,提供了一种马拉色菌抑制剂,包含预防或治疗有效量的诃子提取物。
进一步地,所述马拉色菌抑制剂可用于制备治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的产品,所述产品包括药物和化妆品。
优选地,马拉色菌感染相关皮肤疾病包括花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎和脂溢性皮炎。在本发明的一些具体实施方式中,研究结果显示,诃子提取物对限制性马拉色菌最小抑菌浓度 (1.124mg/ml),并且无毒、无刺激,可用于制备抑制马拉色菌制剂及预防或治疗因马拉色菌过度增殖引起的相关疾病的皮肤外用产品。
在本发明的又一个方面中,提供了一种治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的药物,包含预防或治疗有效量的诃子提取物。
进一步地,所述药物的剂型为外用制剂。
优选地,所述外用制剂包括溶液、粉剂、洗剂、酊剂、乳霜剂、油剂或硬膏等。
进一步地,所述马拉色菌感染相关皮肤疾病包括花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎和脂溢性皮炎等疾病。
进一步地,所述诃子提取物为诃子水提取物。诃子水提取物对限制性马拉色菌和球形马拉色的最小抑菌浓度分别为1.124×103mg/ml,0.905×103mg/ml
进一步地,所述诃子提取物提取自诃子的干燥果实。
本发明通过大量研究发现,诃子提取物对限制性马拉色菌、球形马拉色菌均具有显著抑制作用,其中水提取得到的诃子提取物对限制性马拉色菌和球形马拉色菌抑制效果最为显著,最小抑菌浓度(MIC)分别可达到1.124mg/ml,0.905mg/ml。
本发明具有以下有益效果:本发明中的诃子提取物及其主要成分对马拉色菌具有显著抑制作用,其中诃子水提取物对限制性马拉色菌和球形马拉色的最小抑菌浓度分别为1.124mg/ml,0.905mg/ml,具有较强的抑制活性;同时,本发明所述的诃子提取物安全无刺激、无副作用,对马拉色菌引起的相关疾病具有显著的防治作用,且对皮肤组胺分泌引起的炎症具有抑制作用,具有抗炎止痒的效果,可应用于制备去屑止痒制剂及预防、治疗马拉色菌感染引起相关疾病的药物。
本发明主要是针对诃子提取物对马拉色菌抑制作用的及其对马拉色菌过度增殖引起的相关皮肤疾病中应用;通过研究马拉色菌对诃子水提物的敏感性,发现诃子水提取物对多种马拉色菌良好的抑制作用,作为提供一种潜在的新型天然绿色的马拉色菌抑制剂,具有重要的意义。
本发明所用术语“治疗”,包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况;抑制并发症的产生:改善或预防潜在代谢综合征;抑制疾病或症状的产生,如控制疾病或情况的发展;减轻疾病或症状;使疾病或症状减退;减轻由疾病或症状引起的并发症,或预防或治疗由疾病或症状引起的征兆。如本文所用,给药后,可以使某一疾病、症状或情况得到改善,尤指其严重度得到改善,延迟发病,减缓病情进展,或减少病情持续时间。无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药,可以归因于给药有关的情况。
在具体实施例中,本发明所述的诃子提取物可单独使用,还可与其他许多化学物质组合使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能,这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药中的一种或多种。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例3中诃子提取物化学成分的负离子模式下的总离子流程图;
图2为本发明实施例5中诃子提取物作用于马拉色菌感染的豚鼠模型的豚鼠皮肤切片图;其中,(A)正常组;(B)模型组;(C)吡啶硫酮锌组;(D)诃子提取物低剂量组;(E)诃子提取物中剂量组;(F)诃子提取物高剂量组;
图3为为本发明实施例6中诃子提取物对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的血管反应性影响示意图;其中,(A)0.9%NaCl溶液(B)1%Texpon ASV溶液(C)诃子提取物低剂量组(D) 诃子提取物中剂量组(E)诃子提取物高剂量组分别接触CAM 5min后各组CAM的血管反应影响示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式并配合附图予以说明。
除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
特别注明:以下应用中诃子乙醇提取物有诃子水提取物和诃子95%乙醇提取物,但不限于水和95%浓度乙醇所制备的诃子乙醇提取物。
实施例1:中药提取物对限制性马拉色菌活性筛选
①材料与仪器:
3株限制性马拉色菌(Malassezia restricta),均购自中国工业微生物菌种保藏中心,菌株编号:CICC 33081。
ATCC培养基:2693改良Dixon(mDixon),成分:麦芽浸膏36.0g,牛胆粉20.0g,蛋白胨6.0g,甘油2.0g,油酸2.0g,水1000ml,吐温-40 10ml调pH至6.0,固体培养基则加琼脂15g。
培养基购自海博生物技术有限公司,批号:20190401;琼脂购自美仑生物科技有限公司,批号:A1230A,CAS:9002-18-0;吐温40购自山东优索化工科技有限公司,CAS:S12702115。
电热套,厂家:海宁市华星仪器厂,型号:TC-15;旋蒸仪,厂家:上海爱朗仪器有限公司,型号:SB-1200,编号:61513412;冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司,型号:Lab-1A-80E;电热恒温培养箱,厂家:上海一恒科学仪器有限公司;超净工作台,厂家:苏州安泰空气技术有限公司,型号:SW-OJ-1F;电热手提式压力蒸汽灭菌器,型号:XFS-280,厂家:浙江新丰医疗器械有限公司;XSP-10C生物显微镜,厂家:上海永享光学仪器制造有限公司;上皿电子天平,型号:FA2104,上海精密科学仪器有限公司;超声波清洗仪,型号: KQ-500E,厂家:昆山市超声仪器有限公司。
香茅、蔷薇花、马齿苋、连翘、蒲公英、无患子、薰衣草、紫苏、栀子、牛至、姜黄、升麻、苍耳、百里香、肉桂、薄荷、牡丹皮、蛇床子、两面针、香茶菜、诃子、侧柏叶、花椒、苦参、甘草均购于广州同仁堂医药有限公司;吡啶硫酮锌,纯度96%,批号C10319727, CAS号13463-41-7,上海麦克林生化科技有限公司;酮康唑,纯度98%,批号C10097279, CAS号65277-41-1,上海麦克林生化科技有限公司。
②实验步骤
1、中药提取物的制备
中药水提取物的制备方法:称取每种中草药各22克,分别加入10倍量的纯化水,然后,加热煎煮2小时,收集滤液,滤渣再加入8倍量的纯化水,加热煎煮1.5小时,合并滤液,纱网过滤,然后加热浓缩,冷冻干燥成冻干粉,4℃冷藏备用。
中药醇提取物的制备:称取每种中草药各22克,分别加入10倍量的95%乙醇,进行回流提取,加热煎煮2小时,收集滤液,滤渣再加入8倍量的95%乙醇,进行回流提取,加热煎煮1.5小时,合并滤液,纱网过滤,然后加热浓缩,冷冻干燥成冻干粉,4℃冷藏备用。
2、中药提取物抗限制性马拉色菌最低抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration,MIC) 测定
培养基的配制:称取66g ATCC改良Dixon培养基,用量筒量取1000ml纯化水置于烧杯中混匀,用玻璃棒搅拌均匀,并用lmol/L的盐酸溶液调整pH值至6.0,分装于250ml锥形瓶中,用软胶塞塞口,然后用牛皮纸包扎,最后,进行121℃高压灭菌20min,冷却后置于 4℃冰箱备用。
药物的配制:称取各中药水提取及醇提物适量,用吐温40:水=1:3的混合溶液进行溶解,然后进行超声波溶解30min,制备500mg/ml的高浓度药物原液,实验时,再用液体培养基进行稀释。
菌液的制备:挑取已转种活化的限制性马拉色菌受试菌,置于组织研磨器中,再以无菌操作法加入0.9%无菌生理盐水,不断研磨均匀使菌丝断裂。用血细胞计数板计数,将菌液浓度调节为1.0×109~1.2×109CFU/ml;实验时,用液体培养基将菌液稀释至1.0×106~ 1.2×106CFU/ml。
实验操作过程:1)取12根试管,在1-10号试管中,分别加入1ml培养液,第11、12 号试管,加入2ml培养液;2)取药液1ml加入1号试管中,如香茅,然后,使1号试管药液与培养液混合均匀,取1ml至2号试管,混合均匀,取1ml至3号试管,依此至10号试管,最后10号试管混合均匀后,弃去1ml;3)分别取1ml培养液置于1-10号试管中,使体积均为2ml,可知,各试管药物浓度为1号试管125mg/ml,2号试管为62.50mg/ml,3号试管为 31.25mg/ml,4号试管为15.63mg/ml,5号试管为7.81mg/ml,6号试管为3.91mg/ml,7号试管为1.95mg/ml,8号试管为0.98mg/ml,9号试管为0.49mg/ml,10号试管为0.24mg/ml,11 号试管为加菌,不加药的生长对照,12号试管为空白对照;4)取50ul稀释过的菌液,分别加入1-11号试管中,混合均匀;5)将上述加样后的试管置于32℃培养箱,培养15-18天。
③实验结果
肉眼观察到阳性对照孔生长良好,有菌落生长为无抑制,无菌落生长为抑制,MIC值为无菌落生长的最低药物浓度。实验重复三次,最终结果为取三次实验的几何平均值。
表1中药水提取物及95%乙醇提物MIC(生药量计算)
中药水提取物及95%乙醇提取物抗限制性马拉色菌MIC值如表1,由表可知,在中药水提物中,按照生药量计算,MIC值越小对限制性马拉色菌抑制活性越高。由上表1中的中药提取物MIC值结果表明,诃子水提取物和95%乙醇提取物的抑制马拉色菌的MIC分别为7.206 ±2.30mg/ml,33.544±5.26mg/ml,相比于其他中药提取物,诃子提取物的有效抑菌浓度最小,具有最好的对限制性马拉色菌的抑制效果。
后续实验中,对诃子水提取物和95%乙醇提取物进行进一步的活性筛选。
实施例2:诃子水提取物和诃子95%乙醇提取物的提取制备与对不同真菌的活性筛选
材料与仪器:中药诃子购自北京同仁堂(产地,云南;批号,181120;厂家,广西梧州市桂康药业有限公司);2693改良Dixon(mDixon)培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司,批号:20190508);XTT试剂(广州瑞舒生物科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO)(广州瑞舒生物科技有限公司);氯化钠(Nacl)(广州化学试剂有限公司);RPMI Medium1640粉末,(美国GIBICO公司,批号:1256837);无菌PBS(0.01M)(美国HyClone, 批号:AXH440260);无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司);Multiskan FC酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司);恒温培养振荡器。
菌株:限制性马拉色菌(CICC 33081),由中国工业微生物菌种保藏中心提供;球形马拉色菌(临床株编号MC 14)、红色毛癣菌(CMCC(f)T 1b)、石膏样小孢子菌(CMCC(F) M2C)、须癣毛癣菌(CMCC(F)T4d)、犬小孢子菌(CMCC(F)M3d),购于中国医学科学院皮肤研究所(南京);质量控制(QC)株采用近平滑念珠菌(ATCC 220 19),购于中国医学科学院皮肤研究所(南京)。
1、诃子提取物的制备
称取诃子干燥粉末20g,采用回流提取法加入去离子水或95%乙醇提取2次,料液比分别为1:10、1:8;提取时间分别为2h、1.5h;合并两次滤液,过2000Da有机膜,保留小分子部分,对提取物进行浓缩纯化,减压浓缩后得到诃子水提取物和诃子95%乙醇提取物。
2、诃子提取物对不同真菌抑制活性筛选
①方法及培养基配制
诃子提取物抗马拉色菌活性测定方法,参照美国CLSI制定的M27-A3方案进行操作的,并使用试管法将测试体积扩大,以便观察马拉色菌的生长情况。对皮肤癣菌的活性测定,采用微量稀释法按美国CLSI制定的M38-A3方案进行,肉眼观察皮肤癣菌的生长情况。
石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌、红毛癣菌、犬小孢子菌微量稀释法适用培养基,RPMI-1640 培养基的配制:称取RPMI-1640粉末5.2g加蒸馏水450mL,再称取17.25g的MOPS粉末,搅拌使其溶解。同时用1mol/L NaOH溶液调培养基的pH为7.0±0.1,加蒸馏水使培养基终体积为500mL,用0.22μm针式滤器在超净台中过滤,无菌分装至锥形瓶内。以上培养基保存在4℃冰箱内备用。
对马拉色菌适用培养基,所用培养基同实施例1中②操作配制方法。
②实验步骤简述如下:
试管法测试诃子提取物对马拉色菌的抑制作用
用接种环轻刮Dixon培养基表面菌落,使用无菌研磨器将菌丝研碎,将马拉色菌悬浮于无菌生理盐水中,调整浊度至4号麦氏浊度,并用血细胞计数板计数菌数。使菌液浓度为 1×106CFU/mL至3×106CFU/mL。即用Dixon液体培养基将4号麦氏浊度菌液稀释1000倍,并以血细胞计数板计数为准,得接种菌液。使用Dixon液体培养基稀释的诃子提取物贮备液(2305mg/mL),取2ml稀释后药液于第一根试管,使用培养基进行横向2倍稀释至第10根,第11根加入1mL Dixon液体培养基,第12根加入2mL Dixon液体培养基。然后再于第1根至第11根加入接种菌液1mL。此时,第1-10根为梯度药物孔,中药水提取物浓度为230.5mg/mL 至0.450mg/mL,且各孔中抗菌药物第11根为生长对照孔,第12根为阴性对照孔。将上述 12根试管置于32℃恒温孵育后,肉眼观察,以无可见菌落生长于试管的对应药物浓度为MIC。
此外,在每次测定时应进行质量控制,QC株采用近平滑念珠菌(ATCC 22019),质控药物为酮康唑,在平行操作条件下,QC株的MIC应在0.06~0.25ug/mL范围内,如此则视为测定结果有效可信。
各菌株按以上操作平行重复测定三次,计算MIC几何平均数,结果见表3。
微量稀释法测定诃子提取物对皮肤癣菌的抑制作用
用接种环轻刮SDA培养基表面(犬小孢子菌是PDA培养基面上刮下)菌落使用无菌研磨器将菌丝研碎,将皮肤癣菌悬浮于无菌生理盐水中,调整麦氏浊度至0.5,并用血细胞计数板计数孢子数量及短菌丝数。使菌液浓度为1×104CFU/mL~3×104CFU/mL。即用RPMI-1640 液体培养基将0.5麦氏浊度菌液稀释1000倍,并以血球计数板计数为准,得接种菌液。用 RPMI-1640液体培养基稀释薰衣草精油的贮备液(200μL/mL)于96孔板上的第1至第10列用RPMI-1640液体培养基进行倍比稀释,第11列为生长对照孔,加入100μL RPMI-1640液体培养基;第12列为空白对照,加入200μL RPMI-1640液体培养基。然后再于第1-11列各孔中加入100μL接种菌液,此时,第1-10列的薰衣草精油浓度为100μL/mL至0.1953μL/mL,且各孔中抗菌药物贮备液溶剂浓度(v/v)低于1%,符合M27-A3规定。将96孔板置于35℃恒温孵育7天,以肉眼观察,视相当于与生长对照比较产生了80%生长抑制的终浓度为MIC。
此外,在每次测定时应进行质量控制,QC株采用近平滑念珠菌(ATCC 22019),质控药物为酮康唑,在平行操作条件下,QC株的48h后MIC为0.06~0.25μg/mL范围内,如此则视为测定结果有效可信。
各株菌按以上操作平行重复测定3次,计算MIC的算数平均数,结果见表2。
③实验结果见表2
表2诃子提取物体外抗马拉色菌的作用研究
实验结果表明,诃子提取物对限制性马拉色菌、球形马拉色菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌的MIC分别为1.124mg/ml,0.905mg/ml,3.678mg/ml,5.231mg/ml,2.984mg/ml,4.972mg/ml;诃子95%乙醇提取物对限制性马拉色菌、球形马拉色菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌的MIC分别为3.943mg/ml,2.091mg/ml,6.341mg/ml,8.328mg/ml,5.327mg/ml,8.328mg/ml;相对于其他类型的真菌,诃子提取物对于马拉色菌(包括限制性马拉色菌和球形马拉色菌)明显具有更好的抑制效果。
同时,本实施例中,相较于诃子95%乙醇提取物,诃子水提取物对马拉色菌具有更好的抑制作用;相较于其他真菌,诃子水提取物对马拉色菌的抑制作用MIC值最小,抑制马拉色菌效果最为明显;
因此,选择诃子水提取物作为进一步实验研究对象,以下试验诃子提取物均为诃子水提取物。
实施例3:诃子提取物的制备与成分分析
材料与仪器:中药诃子购自北京同仁堂(产地,云南;批号,181120;厂家,广西梧州市桂康药业有限公司),Waters UPLC-Q/TOF MS液相质谱联用仪(美国沃特世有限公司)。
1、诃子提取物的制备
称取诃子干燥粉末20g,采用回流提取法加入水提取2次,料液比分别为1:10、1:8;提取时间分别为2h、1h;合并两次滤液,过2000Da有机膜,保留小分子部分,对提取物进行浓缩纯化,减压浓缩后得到诃子提取物。
2、诃子提取物主要成分分析
色谱条件:色谱柱Cloud C18(4.6mm×150mm,5μm),流速:0.5μL·min-1;进样量:5μl;柱温:25℃;流动相为A:甲醇,B:0.1%乙酸水溶液;梯度洗脱程序流动相:洗脱梯度: 0-6min,8%-13%A,6-10min,13%-23%A,10-16min,23%-29%A,16-21min,29%-35%A,21-30min,35%-39%A,30-40min,39%-55%A,40-50min,55%-90%A。
质谱条件:电喷雾离子源(ESI);负离子检测,毛细管电压:3kV;锥孔电压:20V;离子源温度:100℃;雾化气温度:300℃;雾化气流速:500L/h;锥孔气流速:50L/h。
扫描模式:Full Scan/MSE;MS1和MS2;扫描范围:m/z 50~1500。
样品测定:取诃子提取物样品1.0g溶解于25.0mL 80%甲醇,过0.22μm滤膜;进行UPLC-Q/TOF MS分析。
表3诃子提取物的主要成分
诃子提取物经UPLC-Q/TOF MS分析,得到诃子提取物化学成分的负离子模式下的总离子流程图如图1所示,初步确定了诃子提取物中的7个主要成分结果如表3所示。莽草酸、诃子酸、石榴皮鞣质、新诃子鞣酸、新诃子酸、诃子次酸、没食子酸甲酯,其质量百分比的比例为7:4:5:3:11:4:2。
实施例4:诃子提取物对实验性皮肤瘙痒模型的药效学研究
为进一步研究诃子提取物对头皮屑所致皮肤瘙痒的治疗效果,采用磷酸组胺所致豚鼠皮肤瘙痒模型,记录观察诃子提取物对豚鼠致痒阈值的影响。
动物:普通级豚鼠,9周龄,体重260-280g,48只,雄性,豚鼠为广州市白云区龙归兴科动物养殖场提供,动物许可证:SCXK(粤)2017-0042,质量合格证编号:44817200000496。
实验步骤简述如下:
取普通级豚鼠48只,饲养一周适应环境,称量体重后,编号,按照随机数字表进行分组,分6组,每组8只,其中,模型组不给药,阳性药物组给予吡啶硫酮锌,空白基质组给予空白基质,诃子提取物分三组,药物浓度分别为14.412mg/ml、28.824mg/ml、57.648mg/ml,每只豚鼠每次均给药2.5ml,用脱毛膏将豚鼠右后足背部毛发脱去,形成一块1×1cm2无毛区,分别给药,连续三天,在末次给药前1h,将豚鼠右后足背擦伤,以渗血但不出血为宜,涂药 1h后,在擦伤部位进行滴加0.01%磷酸组胺溶液,每次均为50ul,若豚鼠出现回头舔舐右后足动作,则停止滴加磷酸组胺,记录磷酸组胺滴加量,若豚鼠没有出现回头舔舐动作,则继续滴浓度递增的磷酸组胺,浓度依次为0.02%、0.03%、0.04%、0.05%…等,直至豚鼠回头舔舐右后足背,记录磷酸组胺量,即致痒阈。
表4诃子提取物对磷酸组胺所致豚鼠瘙痒的治疗效果
注:“-”表示不用药,下同。与空白基质组比较,*P<0.1,**P<0.05,***P<0.01;与吡啶硫酮锌组比较,###P<0.01。
实验结果如表4所示,实验结果表明,诃子提取物高、中、低剂量组致痒阈值分别为292.50±79.714μg,293.13±97.30μg,233.75±83.14均高于吡啶硫酮锌组(56.25±26.02μg),与空白基质组比较,诃子提取物高、中、低剂量组的致痒阈值显著高于空白组(P<0.01),表明诃子提取物具有显著抑制磷酸组胺的作用,有较好的止痒效果,可进一步应用于止痒皮肤外用产品的开发。
实施例5:诃子提取物的体内治疗限制性马拉色菌所致豚鼠感染模型实验
为了进一步研究诃子提取物对限制性马拉色菌所致豚鼠皮肤感染模型的影响,采用限制性马拉色菌感染豚鼠,制备皮肤鳞屑模型,记录观察施用诃子提取物对豚鼠皮肤鳞屑模型的治疗效果。
动物:普通级豚鼠,9周龄,体重260-280g,48只,雄性,豚鼠为广州市白云区龙归兴科动物养殖场提供,动物许可证:SCXK(粤)2017-0042,质量合格证编号:44817200000502。
菌种:限制性马拉色菌编号CICC 33081。
实验步骤简述如下:
取普通级豚鼠48只,采用剃毛刀去除豚鼠背部粗毛,再用脱毛膏脱去细毛,形成一块 5×5cm2无毛区,24h后,用75%乙醇进行清洗,待乙醇挥发干;在无毛区进行涂抹适量橄榄油,待其稍干,再进行涂菌,菌液浓度为1×109CFU/ml,连续涂菌7d。涂菌7d后,对模型进行检查评分,取鳞屑进行逆培养;根据评分对豚鼠进行随机分组,共6组,每组8只,分别为模型组、阳性药物组、空白基质组、诃子提取物低浓度组、诃子提取物中浓度组和诃子提取物高浓度组,药物浓度分别为3.603mg/ml、7.206mg/ml、14.412mg/ml,连续用药9d,在用药后第3d,第7d,分别进行评分和取鳞屑进行逆培养,用药7d后,处死豚鼠,取皮,研磨,进行培养,观察药物的治疗效果。评分结果见表5,逆培养转阴率见表6。
实验结果:
表6诃子提取物对限制性马拉色菌所致豚鼠皮肤感染模型的真菌学转阴率的影响
实验结果表明,使用诃子提取物7天后,限制性马拉色菌所致豚鼠感染模型皮损评分与模型组比较,高剂量组(2.00±1.69)与中剂量(2.38±1.60)均有显著降低,表现出较好的修复治疗作用。同时用药7天后对限制性马拉色菌所致豚鼠皮肤感染模型的真菌学转阴率高剂量组和中剂量组分别达到62.5%和50%,表现出了较好的抑制马拉色菌感染的作用。
诃子提取物的体内治疗限制性马拉色菌所致豚鼠感染模型皮肤纵切片结果图(HE染色×40)如图2所示;其中,(A)正常组;(B)模型组;(C)吡啶硫酮锌组;(D)诃子提取物低剂量组;(E)诃子提取物中剂量组;(F)诃子提取物高剂量组;结果分析如下:
与正常组图2中A相比,模型组图2中B皮损区域角质层结构严重破坏,表皮层明显变厚,真皮与表皮结合处较弯曲,网脊线大幅度延长,说明豚鼠皮肤经过限制性马拉色菌感染后,表皮层发生了明显的病理变化,角质细胞角化异常,增殖速度加快,增殖方向紊乱,真皮表皮交界处更易曲折,表皮网状脊被拉长。
阳性药物吡啶硫酮锌组图2中C与模型组图2中B比较,发现阳性药物吡啶硫酮锌组图 2中C皮损区域角质层结构破坏程度较轻,表层厚度较薄,真皮与表皮结合处弯曲度大幅度降低,网脊线较短,较平直;与正常组图2中A比较,图2中C表层厚度比正常组图2中A 略厚,真皮与表皮结合处弯曲度略大,网脊线略长,略弯曲,说明吡啶硫酮锌可对限制性马拉色菌所致豚鼠皮肤感染模型有一定效治愈效果。
将诃子提取物低浓度组图2中D、诃子提取物中浓度组图2中E、诃子提取物高浓度组图2中F分别与模型组图2中B作比较,发现诃子提取物低、中、高浓度组图2中D-F皮损区域角质层结构破坏程度变轻,表层厚度较薄,真皮与表皮结合处弯曲度降低,网脊线较短,较平直,说明诃子提取物低、中、高浓度对限制性马拉色菌所致豚鼠皮肤感染模型均有较好的治疗和预防效果且随着诃子提取物浓度的增大,其对限制性马拉色菌所致豚鼠皮肤感染模型治疗效果越明显。可应用于制备皮肤外用马拉色菌抑制剂及预防、治疗皮肤因马拉色菌过度增殖引起相关疾病的药物。
实施例6诃子提取物的鸡胚尿囊膜实验
绒毛膜尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)试验是眼刺激性试验替代方法中广泛使用的模型之一。鸡胚绒毛膜尿囊膜是鸡胚的一种体外循环系统,具有丰富血管的完整组织,利用CAM与结膜结构相似的特性,通过观察CAM暴露于化学物质后血管的变化(充血、出血、凝血),检测化学物质对CAM的损伤,可以评价化学物可能的刺激性。
为进一步测定诃子提取物的刺激性,通过不同浓度的诃子提取物对鸡胚尿囊膜的刺激性实验,检验诃子提取物的刺激性,为诃子提取物在皮肤外用产品中的应用提供充足的依据。
实验步骤简述如下:
1、品系和来源
白莱杭鸡(White Leghorn chicken)受精鸡胚,应选用SPF鸡胚,供应商应具有农业部门认可的《兽药生产、检验用SPF鸡(蛋)定点生产企业》资格,鸡胚质量应符合国家标准的要求。
鸡胚应新鲜、干净、完好,重量50g~60g。孵化至9d龄时,应进行照蛋检查,未受精、无活性或者有缺失的鸡胚应弃去,严重畸形、破壳或者薄壳鸡胚也不能使用。
孵化条件:室温20℃~25℃,相对湿度45%~70%。孵化温度37.5℃±0.5℃,相对湿度 55%~70%,转盘频率3次/h~6次/h。9d龄的鸡胚孵化时不必旋转。
2、鸡胚尿囊膜(HET-CAM)试验
9d龄鸡胚进行照蛋检查,在蛋壳表面标记气室位置;用牙科锯齿弯镊刀剥去蛋壳部分,完整暴露白色蛋膜,用吸管滴加1~2mL的0.9%NaCl溶液使蛋膜湿润,小心用弯镊去除内膜,暴露出绒毛尿囊膜(CAM),避免血管膜受损,如有破损则不用于实验。
根据SNT 2329-2009商检标准,采用终点评价法检测诃子提取物的眼刺激性,选用实施例1制备的诃子提取物为试验组,诃子提取物分三组,药物浓度分别为14.412mg/ml、28.824mg/ml、57.648mg/ml,生理盐水(0.9%NaCl,NS)为阴性对照,1%脂肪醇醚硫酸钠盐混合物(Texapon ASV)溶液为阳性对照。取0.3mL受试样品直接作用于CAM,确保至少 50%的CAM表面被受试样品覆盖,作用5min后用生理盐水轻轻冲洗CAM,冲洗后30s后观察CAM的出血、血管溶解和凝血反应,并分别按轻、中、重度记1分、2分和3分,每个鸡胚的最高积分为9分。每个受试样品均用6个鸡胚进行试验,计算6个鸡胚的刺激反应评分(endpoint score,ES)总和,按表8所示的分级标准,对受试样品的眼刺激性进行分级评价。
表7终点评价法受试样品眼刺激性分级标准
上述实验中对对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的血管反应性影响示意图如图3所示,其中, (A)0.9%NaCl溶液组(B)1%Texpon ASV溶液(C)抗菌组合物组分别接触CAM 5min 后各组CAM的血管反应影响示意图。0.9%NaCl溶液在接触CAM后5分钟内均未见出血、 血管溶解或凝血反应,血液流通清晰可见,如图3中A所示。1%Texpon ASV溶液接触CAM 后出现出血,血管融解,反应积分在18分以上,如图3中B所示。诃子提取物各剂量组接 触CAM后未出现任何血管刺激反应,如图3中C-E刺激积分均为0分,眼刺激性分级结果 见表8所示。诃子提取物作用于鸡胚绒毛尿囊膜未见毒性效应,说明诃子提取物无眼刺激性, 可应用于药物中作为预防和治疗脱发的功能性成分使用。
表8 HET-CAM试验的眼刺激性评价结果
结果表明,诃子提取物浓度达到57.648mg/ml仍无刺激性,属于安全剂量范围。因此,综合以上实验结果,证明诃子提取物在浓度为7.206mg/ml下即具有良好的马拉色菌抑制效果,且浓度越高治疗效果越好,并且,在57.648mg/ml高浓度下无刺激,具有良好的安全性特征。
综上所述,本发明提供的诃子提取物及其主要成分对马拉色菌具有显著抑制作用,其中诃子水提取物对限制性马拉色菌和球形马拉色的最小抑菌浓度分别为1.124mg/ml, 0.905mg/ml,具有更强的抑制活性。同时,本发明所述的诃子提取物安全无刺激、无副作用,对马拉色菌引起的相关疾病具有显著的防治作用,可应用于制备去屑止痒制剂及预防、治疗马拉色菌感染引起相关疾病的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.诃子提取物在制备马拉色菌抑制剂中的应用。
2.诃子提取物在制备治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述马拉色菌感染相关皮肤疾病包括花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎和脂溢性皮炎中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述诃子提取物为诃子的水提取物或乙醇提取物。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述诃子提取物为诃子的水提取物。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述诃子提取物包含莽草酸、诃子酸、石榴皮鞣质、新诃子鞣酸、新诃子酸、诃子次酸和没食子酸甲酯。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述诃子提取物包含以质量百分数计的下列组分:莽草酸6%~10%、诃子酸3%~8%、石榴皮鞣质4%~9%、新诃子鞣酸2%~6%、新诃子酸8%~12%、诃子次酸2%~6%以及没食子酸甲酯1%~4%。
8.一种马拉色菌抑制剂,其特征在于,包含预防或治疗有效量的诃子提取物。
9.一种治疗和/或预防马拉色菌感染相关皮肤疾病的药物,其特征在于,包含预防或治疗有效量的诃子提取物。
10.根据权利要求9所述的药物,其特征在于,所述药物的剂型为外用制剂。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200915 |