CN113876862B

CN113876862B - 一种抗马拉色菌中药组合物及其应用

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Publication number: CN113876862B
Application number: CN202111134769.9A
Authority: CN
Inventors: 张军; 曹梦飞; 钟廉; 杨馥桢; 陈观凤; 黄丰科; 陈泽伟; 肖妮
Original assignee: Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2041-09-27
Also published as: CN113876862A

Abstract

本发明公开了一种抗马拉色菌中药组合物及其应用。该抗马拉色菌中药组合物按质量份数计，包含如下组分：玫瑰花36～80份，月季花36～80份，凌霄花36～80份，苦参20份，苍术15份，蒲公英30份，当归8份，赤芍12份，侧柏叶30份，地骨皮30份，桑白皮15份，绿茶6份。本发明通过体外实验发现，通过该中药组合物制备的中药制剂能够显著抑制马拉色菌，如糠秕马拉色菌和限制马拉色菌等，因此可将其用于预防和治疗马拉色菌感染，具有副作用少、耐药性小、成本低廉以及安全稳定可靠的特点，具有良好的临床应用前景。

Description

一种抗马拉色菌中药组合物及其应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，特别涉及一种抗马拉色菌中药组合物及其应用。

背景技术

头皮屑是头皮角质细胞过度增生而引起的大量脱屑现象，是一种慢性、易复发、较常见的头皮问题，在医学上称为“脂溢性皮炎”。临床表现为头皮或头发上过多的细小灰白色干燥或稍油腻的糠秕样屑片，可伴瘙痒，人群发病率高。头皮屑的产生主要是由限制性马拉色菌、球形马拉色菌引起的，而限制性马拉色菌为主要的优势种属，它们能破坏头皮微环境，导致头部表皮细胞代谢紊乱，产生大量头皮屑。头皮屑一般开始于青春期，在20岁左右达到发病率和严重程度的高峰。

西医临床对该病的治疗常采用的产品主要分为三大类。第一类属于角质层剥脱剂，主要从角质层表皮细胞入手，将受损的角质层表皮细胞剥脱下来，减少头屑产生，如硫磺、水杨酸、煤焦油，其中硫磺和水杨酸主要是杀菌作用，但是实际去屑效果不太理想，同时刺激性与副作用比较大。第二类为抗生素类，将与头屑有关的真菌和细菌进行抑制或杀死从而达到治疗效果，如酮康唑和吡罗克酮乙醇胺盐(OCT)。酮康唑有极高的有效率，但可产生耐药性。第三类为头皮细胞生长抑制剂，通过抑制细胞的复制，使细胞恢复正常再生循环周期长度，从而改善头屑问题，常见的药物为二硫化硒，其临床应用广泛，但使用后头发容易变得干涩，还有可能导致头发褪色。

头皮脂溢性皮炎属于中医“头皮屑”范涛，也叫“面游风”、“白屑风”、“眉风癣”、“纽扣风”。中医治疗头皮屑至今已有数千年的历史。中医学认为，头皮屑由外感风热，内伤七情，五志过极，郁而化热，耗伤阴血，血虚风燥，肌肤失养而成，或脾胃虚弱，湿热内生所致。如唐·王焘《外台秘要》中记载“肺热则熏蒸而多白屑，复以风热鼓作，故痒而喜搔”；元·张从正《儒门事亲》也中记载：“至如年少发早白落或白屑者，此血热而太过也。世俗止知发者血之余也，血衰故耳，岂知血热而极发反不茂。肝者木也，火多水少，木反不荣，火至于顶，炎上之甚也”；明·陈实功《外科正宗·白屑风》中曾言“白屑风多生于头、面、耳、项、发中，初起微痒，久则渐生白屑，叠叠飞起，脱而又生。此皆起于热体当风，风热所化”；清·吴谦《医宗金鉴·外科心法要诀》中记载“此证生于上面，初发面目浮肿，痒若虫行，肌肤干燥时起白屑，次后极痒，抓破，热湿盛者津黄水；风燥盛者津血，痛楚难堪。由平素血燥，过食辛辣厚味，以致阳明胃经湿热受风而成”；清·祁坤《外科大成·面部》也记载“面游风，初发微痒，次如蚁行，而且浮肿更兼痛楚，由阳明荃热所至”；清·邹岳《外科真诊》日：“白屑风初生发内……燥痒日久，飞起白屑，脱去又生，由肌热当风，风邪侵入毛孔，郁久燥血，肌肤失养，化成燥症也”。

现代人日常压力较大，情绪不畅，易肝气郁结，或饮食失宜、油腻偏重，致脾胃失运，湿热由内而发，阻遏气血运行，瘀阻毛窍；或阴虚致生内热，热邪破血妄行，血外溢而成瘀，上窍得实邪之郁阻；或因外感风热，郁久化燥，耗伤阴血，血虚则不能濡养肌肤，以致头皮屑产生。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗马拉色菌中药组合物.

本发明的另一目的在于提供所述抗马拉色菌中药组合物在制备抗马拉色菌的中药制剂中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抗马拉色菌中药组合物，按质量份数计，包含如下组分：玫瑰花36～80份，月季花36～80份，凌霄花36～80份，苦参20份，苍术15份，蒲公英30份，当归8份，赤芍12份，侧柏叶30份，地骨皮30份，桑白皮15份，绿茶6份。

所述的抗马拉色菌中药组合物，按质量份数计，更优选包含如下组分：玫瑰花36份，月季花36份，凌霄花36份，苦参20份，苍术15份，蒲公英30份，当归8份，赤芍12份，侧柏叶30份，地骨皮30份，桑白皮15份，绿茶6份。

所述的马拉色菌为限制马拉色菌、糠秕马拉色菌和合轴马拉色菌中的至少一种；优选为限制马拉色菌和糠秕马拉色菌中的至少一种。

所述的限制马拉色菌优选为限制马拉色菌(Malassezia restricta)CICC 31847。

所述的糠秕马拉色菌优选为糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)GDMCC 2.181。

所述的抗马拉色菌中药组合物在制备抗马拉色菌的中药制剂中的应用。

所述的中药制剂中的生药含量(药液浓度)为0.05～0.6g/ml；优选为0.2～0.6g/ml；进一步优选为0.2～0.4g/ml；更进一步优选为0.4g/ml。

一种抗马拉色菌中药制剂，通过如下方法制备得到：

将上述抗马拉色菌中药组合物中的玫瑰花、月季花、凌霄花、苦参、苍术、蒲公英、当归、赤芍、侧柏叶、地骨皮、桑白皮和绿茶混合后碎成粗粉，然后用乙醇溶液渗漉提取，渗漉液减压回收乙醇，并调整生药含量为0.05～0.6g/ml，得到三花洗液，即所述抗马拉色菌中药制剂。

所述的乙醇溶液的浓度为质量百分比50％。

所述的乙醇溶液的用量为按每克(g)所述抗马拉色菌中药组合物配比5～10ml乙醇溶液计算；优选为按每克(g)所述抗马拉色菌中药组合物配比5ml乙醇溶液计算。

所述的生药的含量(生药量)优选为0.2～0.6g/ml；进一步优选为0.2～0.4g/ml；更进一步优选为0.4g/ml，所述的生药含量可通过浓缩或加水调节的方式实现。

所述的抗马拉色菌中药组合物和/或抗马拉色菌中药制剂在制备日化产品中的应用。

所述的产品为具有改善红斑、鳞屑、瘙痒以及油腻(脂溢)程度的产品。

本发明在对头皮屑病因病机深刻认识基础上，以中药性味归经及功能的认识，结合药材对马拉色菌的抑菌效能考察，形成了三花洗液组方。该三花洗液由玫瑰花、月季花、凌霄花、苦参、苍术、蒲公英、当归、赤芍、侧柏叶、地骨皮、桑白皮、绿茶组成，功能疏肝活血、清热燥湿、凉血止痒，适用于治疗血热生风、湿热内蕴所造成的头皮屑、脱发。

方中玫瑰花行气解郁、和血散瘀，月季花活血消肿解毒，凌霄花行气祛瘀、凉血祛风，三花能疏肝活血凉血祛风，共为君药；当归补血活血，赤芍清热凉血，侧柏叶凉血止血、生发乌发，地骨皮清热退蒸凉血，桑白皮活血祛瘀，共同增强其活血凉血之功，共为臣药；苦参增杀虫止痒之效，苍术增燥湿之能，蒲公英清热解毒，共为佐药；绿茶能清热解毒又能引药下行、清利头目，为使药。

本发明利用现代药理研究表明玫瑰花、月季花、凌霄花、蒲公英、苍术能抑制真菌生长，玫瑰花、当归、赤芍能促进局部血液循环，侧柏叶、地骨皮、桑白皮、绿茶能减少头脂分泌。中医认为肝气郁结、脾胃失运、阴虚生热、风热血虚是头皮屑得以发生的常见原因，上述三花洗液的组方符合中医药理论。

在组方中，重用对马拉色菌的抑菌能力强的玫瑰花、月季花(亦符合中医活血解郁凉血之功能)及凉血祛风功能的凌霄花，并对君药在复方中的占比进行了优化，超常规的运用大剂量的三花入外洗方，形成了既符合中医药理论、又有抑菌药效支持的三花洗液组方。续对三花洗液的浓度，进行了优化，动物试验及临床验证取得了优越的疗效。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)目前，对于玫瑰花、月季花、凌霄花、苦参、苍术、蒲公英、当归、赤芍、侧柏叶、地骨皮、桑白皮、绿茶组方的抗糠秕马拉色菌和限制马拉色菌的中药外用制剂尚无文献及专利报道，本发明在中医药理论和临床实践支持下，通过对比玫瑰花、月季花、凌霄花、苦参、苍术、蒲公英、当归等多种中药体外抗糠秕马拉色菌和限制马拉色菌的效果，筛选出最优中药组合物，经过反复实验所得到的上述组方的三花洗液抗糠秕马拉色菌和限制马拉色菌的效果优于现有上市的纯中药复方制剂，适合于长期及预防性应用等特点，具有良好的临床应用前景。

(2)本发明通过体外抗糠秕马拉色菌和限制马拉色菌的实验，优化处方中君药(玫瑰花、月季花、凌霄花)的占比，确定最优的君药比例，得出三花洗液处方的最佳比例和浓度，其对糠秕马拉色菌和限制马拉色菌的疗效显著。

(3)本发明所述的三花洗液，组方中药源广，副作用少，耐药性小，成本低廉，安全稳定可靠，抑菌效果显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1部分中药饮片对限制马拉色菌及糠秕马拉色菌的药敏实验

1.材料与仪器

1.1菌株

本实验中的限制马拉色菌标准株为限制马拉色菌(Malassezia restricta)CICC31847，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；糠秕马拉色菌标准株为糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)GDMCC 2.181，购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.2药物

表1药材信息

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1.3试剂

麦芽浸膏(广东环铠生物科技有限公司)、酵母浸膏(广东环铠生物科技有限公司)、吐温40(麦克林)、单硬脂酸酸甘油酯(麦克林)、葡萄糖(天津市致远化学试剂有限公司)、蛋白胨(广东环铠生物科技有限公司)、橄榄油(麦克林)、琼脂(天津市致远化学试剂有限公司)、氯霉素(colaber)、放线菌酮(Actidione)。

1.4主要仪器

电热恒温箱、超净台、立式高压蒸汽灭菌锅、显微镜、血细胞计数板、10ml无菌EP管。

2.方法

2.1中药储备液的制备

分别将中药饮片碎成粗粉，称取10g，用相当于饮片10倍量的(质量体积比，g/ml)50％(w/w)的乙醇溶液回流提取2次，每次1h，滤过，减压回收乙醇，浓缩至生药量为1g/ml，作为中药储备液。

2.2琼脂扩散法

2.2.1固体培养基的配制

2％橄榄油琼脂平板培养基：取2％(w/w)麦芽浸膏、0.01％(w/w)酵母浸膏、0.25％(w/w)单硬脂酸甘油脂、4％(w/w)葡萄糖、1％(w/w)蛋白胨、2％(w/w)琼脂、50mg/L氯霉素、300mg/L放线菌酮、2％(v/v)橄榄油，全部装入锥形瓶中，搅拌溶解，使各成分充分混合，用电磁炉加热使其充分溶化，冷却后即成2％橄榄油琼脂平板培养基。用121℃高压灭菌15分钟。在超净工作台上，加热融化已备无菌的固体培养基，再趁热将培养基倒入无菌平皿，这里应注意不要将平皿外壁与锥形瓶口相接触造成污染，在每个平皿中倒入约12mL融化的固体培养基，每个培养皿依次倒好后，立即盖上培养皿盖子，在超净工作台上静置约10分钟，让固体培养基冷却凝固，最后叠放好培养皿，备用。

2.2.2菌液的制备

分别将受试菌(限制马拉色菌、糠秕马拉色菌)连续传代培养2次，第2次35℃传代培养2天后，用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落，制成菌悬液，并调整其至麦氏4号比浊管浓度。经血细胞计数板计数其菌含量为(1～2)x10⁷ CFU/ml。

2.2.3抑菌活性的测定

在无菌操作台上，将制备好的马拉色菌菌悬液稍微摇匀；2％橄榄油琼脂培养基平板全部水平放在无菌操作台上，右手持灭菌吸管在酒精灯旁保持无菌原则吸取菌悬液，左手拇指和中指揭开培养皿盖，每个培养皿中滴入0.2ml菌悬液，用涂布棒将菌悬液涂布均匀，使菌悬液均匀密布于整个培养皿，加盖待其干燥2分钟后；右手持无菌镊子，每个平板上用无菌镊子放入灭菌牛津杯，牛津杯中分别加入上述2.1中制备的中药储备液100μl，然后放进35℃恒温培养箱中培养48h，设置3次重复，到达培养时间后用游标卡尺测量抑菌圈的直径d。

2.3试管倍比稀释法

2.3.1马拉色菌液体培养基的配制

马拉色菌液体培养基：取麦芽浸膏2g，酵母浸膏0.2g，葡萄糖2g，蛋白胨2g，橄榄油2mL，加入蒸馏水100mL，加热溶解。分装后，121℃高压灭菌15min。

2.3.2药液的制备

分别将中药储备液用马拉色菌液体培养基稀释10倍，使其生药浓度均为100mg/mL。

2.3.3菌液的制备

将限制马拉色菌、糠秕马拉色菌连续传代培养2次，第2次35℃传代培养2天后，用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落，制成菌悬液，并调整其至麦氏4号比浊管浓度。经血细胞计数板限制马拉色菌的菌液浓度为(1～2)×10⁷cfu/ml，并用马拉色菌液体培养基稀释10倍，使得菌液浓度为(1～2)×10⁶cfu/ml。

2.3.4药液加样及结果判读

①取10支试管，第1～10支试管分别加入马拉色菌液体培养基2ml。

②于第1根试管中加入受试药液2ml，混合均匀。

③从第1根试管吸取混合液2ml至第2根试管中，混合均匀；再从第2根试管中移取混合液2ml至下一支试管，依此倍比稀释抗菌药物(即受试药液)，至第9管时弃去2ml，此时各试管药物浓度依次为原药液的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512倍。

④再往第1～8支和第10支试管中分别加入100μl供试菌悬液。

⑤另取10支试管(编号1-10)，同法制备，至“第9管时弃去2ml”，不加菌悬液，作阴性对照，第10支为阳性对照。

⑥将20支试管于35℃条件下恒温培养箱中培养48h，通过肉眼比浊观察对应的阴性对照管，无菌生长者为供试品对该受试菌的MIC。3次测量，取平均值。

3.结果

3.1牛津杯法

不同药液(1.0g/ml)对限制马拉色菌及糠秕马拉色菌标准菌株的抑菌圈结果见表2。

表2不同药液对两种马拉色菌菌株的抑菌圈直径(包括牛津杯直径8mm)(mm)

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注：抑菌圈直径大于等于8mm且小于13mm的设为低度敏感，用“+”表示；抑菌圈直径大于等于13mm且小于19mm的设为中度敏感，用“++”表示；小于8mm用“-”表示。

由以上结果可知，具有疏肝活血、凉血祛风功能的玫瑰花、月季花、凌霄花对限制、糠秕马拉色菌有较强的抑菌效果。

3.2试管倍比稀释法

上述中药储备液对限制马拉色菌的MIC平均值如表3所示。

表3不同药材对限制马拉色菌的MIC测定结果

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由以上结果可知玫瑰花、月季花对限制马拉色菌的抑制效果较佳。

4.小结

根据头皮屑、脂溢性皮炎的中医病机，拟定“疏肝活血、清热燥湿、凉血止痒”为治则，参照饮片功能主治与临床经验，结合上述中药饮片对马拉色菌抑菌药效，遣方用药，形成三花洗液组方，方中玫瑰花、月季花、凌霄花为君药，具有活血凉血的中医功效，同时显示了对马拉色菌较强的抑菌效果，后续通过抑菌药效考察君药占比对洗液抑菌效果的影响，确定君药适宜的用量。

三花洗液组方药味：玫瑰花、月季花、凌霄花、苦参、苍术、蒲公英、当归、赤芍、侧柏叶、地骨皮、桑白皮、绿茶。

实施例2不同君药占比及浓度的三花药液对马拉色菌的抑菌药效

1.材料与仪器

1.1菌株

1.2药物

同实施例1(表1)。

1.3试剂

1.4主要仪器

2.方法

2.1中药储备液的制备

2.1.1不同君药占比的三花药液(0.4g/ml)的制备

60％君药占比的三花药液的制备：将玫瑰花80g、月季花80g、凌霄花80g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量(质量体积比，g/ml，下同)的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇，浓缩至1015ml，即得。

40％君药占比的三花药液的制备：将玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇，浓缩至685ml，即得。

20％君药占比的三花药液的制备：将玫瑰花14g、月季花14g、凌霄花14g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇，浓缩至520ml，即得。

10％君药占比的三花药液的制备：将玫瑰花6g、月季花6g、凌霄花6g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇，浓缩至460ml，即得。

2.1.2 40％君药占比的不同浓度的三花药液的制备

40％君药占比的三花药液(生药含量0.6g/ml)的制备：将玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量(质量体积比，g/ml，下同)的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇，浓缩至457ml，即得。

40％君药占比的三花药液(生药含量0.4g/ml)的制备：将玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇至无醇味，加水调整体积至685ml，即得。

40％君药占比的三花药液(生药含量0.2g/ml)的制备：将玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉,渗漉液减压回收乙醇至无醇味，加水调整体积至1370ml，即得。

40％君药占比的三花药液(0.1g/ml)的制备：将玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇至无醇味，加水调整体积至2740ml，即得。

40％君药占比的三花药液(0.05g/ml)的制备：将玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，用相当于饮片5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇至无醇味，加水调整体积至5482ml，即得。

2.2琼脂扩散法

2.2.1固体培养基的配制

取2％(w/w)麦芽浸膏、0.01％(w/w)酵母浸膏、0.25％(w/w)单硬脂酸甘油脂、4％(w/w)葡萄糖、1％(w/w)蛋白胨、2％(w/w)琼脂、50mg/L氯霉素、300mg/L放线菌酮、2％(v/v)橄榄油，全部装入锥形瓶中，搅拌溶解，使各成分充分混合，用电磁炉加热使其充分溶化，冷却后即成2％橄榄油琼脂平板培养基。用121℃高压灭菌15分钟。在超净工作台上，加热融化已备无菌的固体培养基，再趁热将培养基倒入无菌平皿，这里应注意不要将平皿外壁与锥形瓶口相接触造成污染，在每个平皿中倒入约12ml融化的固体培养基，每个培养皿依次倒好后，立即盖上培养皿盖子，在超净工作台上静置约10分钟，让固体培养基冷却凝固，最后叠放好培养皿，备用。

2.2.2菌液的制备

将受试菌(限制马拉色菌、糠秕马拉色菌)连续传代培养2次，第2次35℃传代培养2天后，用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落，制成菌悬液，并调整其至麦氏4号比浊管浓度。经血细胞计数板计数其菌含量为(1～2)x10⁷ cfu/ml。

2.2.3抑菌活性的测定

2.3试管倍比稀释法

2.3.1马拉色菌液体培养基配制

2.3.2药液的制备

三花洗液中药储备液：分别将中药储备液用马拉色菌液体培养基稀释10倍，使其生药浓度均为100mg/ml。

酮康唑贮备液：酮康唑粉由西安杨森制药有限公司生产，含量99.9％，溶于2.5％(v/v)二甲基亚砜(MDSO)溶液。

2.3.3菌液的制备

分别将受试菌(限制马拉色菌、糠秕马拉色菌)连续传代培养2次，第2次35℃传代培养2天后，用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落，制成菌悬液，并调整其至麦氏4号比浊管浓度。经血细胞计数板计马拉色菌的菌液浓度为(1～2)×10⁷cfu/ml，并用马拉色菌液体培养基稀释10倍，使得菌液浓度为(1～2)×10⁶cfu/ml。

2.3.4药液加样及结果判读

②于第1根试管中加入受试药液2ml，混合均匀。

③从第1根试管吸取混合液2ml至第2根试管中，混合均匀；再从第2根试管中移取混合液2ml至下一支试管，依此倍比稀释受试药液，至第9管时弃去2ml，此时各试管药物浓度依次为原药液的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512倍。

④再往第1～8支和第10支试管中分别加入100μl供试菌悬液。

⑦以酮康唑为阳性对照。

3.结果

3.1君药占比对抑菌能力的影响

表4不同君药占比的药液(0.4g/ml)对限制马拉色菌菌株的抑菌圈直径(包括牛津杯直径8mm)(mm)

表5不同君药占比的药液(0.4g/ml)对糠秕马拉色菌菌株的抑菌圈直径(包括牛津杯直径8mm)(mm)

由表4和表5的结果可知，增加君药占比，可有效抑制限制马拉色菌、糠秕马拉色菌标准株抑菌圈的直径。当君药占比达到40％以上后，抑菌效力增加不显著，考虑成本，选用40％君药占比的药液效果理想。

3.2试管倍比稀释法测定不同君药占比的三花药液的MIC

不同君药占比的三花药液的MIC测定结果如表6和表7所示。

表6不同君药占比的药液(0.4g/ml)对限制马拉色菌菌株的MIC测定结果

表7不同君药占比的药液(0.4g/ml)对糠秕马拉色菌菌株的MIC测定结果

药材(君药占比)	MIC平均值(mg/ml)
		酮康唑	0.00625
60％	12.5
		50％	12.5
40％	12.5
		30％	100
20％	100
		10％	100

由表6和表7的结果可知，增加君药占比，可提高对限制马拉色菌、糠秕马拉色菌的抗菌效果，当君药占比达到40％以上后，抑菌增加不显著，考虑成本，选用40％君药占比的药液效果理想。

确定处方如下：玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g。

本洗液为外用制剂，其抑菌效果与制剂浓度相关，后续考察洗液浓度对抑菌效果的影响，确定适宜的制剂浓度。

3.3 40％君药含量的不同浓度药液的抑菌能力(牛津杯法)

40％君药含量的不同浓度的三花药液对限制马拉色菌、糠秕马拉色菌的抑菌效果见表8和表9。

表8不同浓度药液(君药占比40％)对限制马拉色菌菌株的抑菌圈直径(包括牛津杯直径8mm)(mm)

表9不同浓度药液(君药占比40％)对糠秕马拉色菌菌株的抑菌圈直径(包括牛津杯直径8mm)(mm)

由表8和表9的结果可知，确定君药占比40％后，配制其处方不同浓度的药液，发现伴随药液浓度的提高，可提高对限制马拉色菌、糠秕马拉色菌的抗菌效果，当药液达到0.4g生药/ml以上后，抑菌药效增加不显著，药液的最佳抑菌浓度确定为0.4g生药/ml。

确定处方及制剂浓度之后，我们考察了三花洗液0.2g生药/ml、0.4g生药/ml对马拉色菌感染所致皮炎模型动物的药效。

实施例3三花洗液对豚鼠皮肤马拉色菌感染模型的抑菌作用研究

1.实验材料及方法

1.1实验动物和菌株：

白色SPF级豚鼠40只，320g～350g，雄性，由广州中医药大学动物室词养，室温25±2℃条件下饲养。

糠秕马拉色菌标准株为糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)GDMCC 2.181，购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.2主要试剂及设备

1.2.1主要试剂

三花洗液中药储备液：0.2g生药/ml、0.4g生药/ml(制备方法同实施例2中的2.1.2)，高压灭菌锅灭菌，4℃存放备用。

1.2.2主要设备

生物安全柜(BAG-16710IIB2-X北京东联哈儿仪器制造有限公司)；恒温振荡器箱(SHA-C澳华仪器有限公司)；全自动多功能酶标仪(BIO-RAD，MOLECULARDEVUCES)；全自动洗板机(washer430，bioMerieuxbv)；低温离心机(KDC-1042，沙鹰科学仪器上海有限公司)；倒置显微镜(IX83，OlympusCorporation)；其他设备包括：高压蒸气锅、电热恒温干燥箱、培养箱4℃以及-20℃、-80℃恒温冰箱等。

2.动物造模

2.1造模方法

(1)菌悬液的制备：将马拉色菌标准株在固体培养基(配制方法同实施例1中的2.2.1)上连续传代培养2次，以保证其活力。第2次32℃培养5天后，挑其菌落于0.9％生理盐水中，无菌吸管反复吹打，制成菌悬液，在血细胞记数板上记数，调整其终浓度为1×10⁹/CFU/ml。

(2)豚鼠背部以宠物推毛器剔除长毛后，用日本脱毛蜡脱毛，形成一片5×5cm²左右的无毛区。

(3)脱毛24h后以粗砂纸在豚鼠背上均匀打磨，再以移液器将糠批马拉色菌100μl+玉米油100μl溶液逆毛发生长方向均匀涂于背部无毛区。豚鼠背部每日1次，连续7日。

2.2动物模型评价指标：

(1)感染区皮损情况：观察红斑、鳞屑每项以0～3分计，计算各组每只豚鼠皮损总分(红斑+鳞屑)的平均值。

表10评分标准

(2)涂抹马拉色菌区皮肤真菌直接镜检阳性结果

分别于停止涂菌后的第7、14、21天取豚鼠涂抹马拉色菌区皮肤上处皮屑后用10％(w/v)氢氧化钾溶解角质后直接用显微镜检查，计算阳性率。

(3)统计学处理：应用SPSS20.0进行数据统计分析。

3.分组及给药

常规饲养一周后，随机分组，每组10只。

A组：空白对照组，豚鼠10只常规饲养，无药物干预。

B组：豚鼠模型阳性对照组，造模成功后，次日继续常规饲养，无药物干预。

C组：0.4g生药/ml三花洗液组，造模成功后，次日在每只豚鼠背部已去毛标记处外用三花洗液，每次取药1mL，每日涂药2次，疗程2周。

D组：0.2g生药/ml三花洗液组，造模成功后，次日在每只豚鼠背部已去毛处标记处以三花洗液外涂干预治疗，每次取药1mL，每日涂药2次，疗程2周。

E组：2％酮康唑组，造模成功后，次日在每只豚鼠背部已去毛处标记处以2％(w/v)酮康唑洗剂外涂干预治疗，每次取药1mL，每日涂药2次，疗程2周。

4.实验疗效评价

4.1豚鼠皮肤感染区皮损评分

统计治疗第0天，7天，14天，21天皮损的积分情况。

4.2治疗后豚鼠皮肤感染区皮肤真菌转阴率

给药结束后，将实验各组豚鼠背部感染区皮肤用75％酒精棉球消毒，每只豚鼠剪下直径约1.5×1.5cm²圆形皮损1块，剪碎，置于装有2mL 0.9％生理盐水的玻璃匀浆器中，加入0.5％(v/v)吐温80，充分匀浆，使成混悬液，取300mL混悬液均匀涂布于马拉色菌固体培养基(配制方法同实施例1中的2.2.1)的圆形平皿上，轻轻晃动培养皿，使其均匀分布于培养皿表面后32℃条件下静置培养3天，观察并记录其菌落数。如培养皿中的菌落数＞1，则视其为阳性。三次重复。真菌学转阴率＝每组培养阴性数/每组感染动物总数×100％。

5.统计方法

实验结果采用SPSS20.0统计软件。

6.实验结果

6.1实验各组皮损积分比较

由表11可见，实验分别对用药第0、7、14、21天豚鼠模型靶皮损进行评分，以重复测量方差分析评价不同时间点皮损评分的差异性。统计结果显示：随着治疗时间的延续，三花洗液组、酮康唑洗剂组、模型组皮损评分均呈现出下降的趋势。与模型组比较，0.4g生药/ml三花洗液组皮损改善最为明显(p＜0.01)。

表11各组豚鼠皮损评分差异表

	治疗第0天	治疗第7天	治疗第14天	治疗第21天
					0.4g生药/ml三花洗液组	5.52±1.211	3.44±0.965*	1.96±1.105**	0.72±0.962**
0.2g生药/ml三花洗液组	5.60±1.105	3.50±1.325*	2.28±0.932*	1.01±0.726**
					酮康唑组	5.68±0.953	3.58±1.524*	2.46±0.847*	1.33±0.475**
模型组	5.44±1.124	5.44±1.124	4.98±0.899	4.82±1.416

注：“*”表示与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

6.2真菌治愈率

由表12可见，各组真菌学治愈率采用x²检验，统计结果显示0.4g生药/ml三花洗液、0.2g生药/ml三花洗液与酮康唑洗剂组转阴率均为70％，模型组真菌学治愈率为0，三者与模型组之间具有显著统计学差异，三者之间无统计学差异。

表12各组真菌学治愈率

7.实验结果

上述实验表明中药复方三花洗液具有良好的真菌抑制效果。在对豚鼠马拉色菌感染模型靶皮损积分检测中，中药三花洗液组与酮康唑组均能有效减少皮损积分，但三花洗液组具有更好的改善皮损效果，皮损积分下降趋势及均值都较酮康唑组具有优势。二者真菌学治愈率评价提示：三花洗液与酮康唑都能有效抑制真菌，二者治愈水平没有统计学差异(P＞0.05)。基于三花洗液对马拉色菌感染所致皮炎模型动物的药效，我们进一步考察其对脂溢性皮炎的临床疗效。

实施例4抗马拉色菌药液治疗脂溢性皮炎的临床疗效

1.一般资料

本研究共纳入2020年3月至2021年3月门诊就诊且符合方案的患者120例。

2.研究药物

治疗组外用药物为三花药液：一组用40％君药含量0.4g生药/ml浓度的三花药液(标记为40％三花药液)，另一组用40％君药含量0.2g生药/ml浓度的三花药液(标记为20％三花药液)；阳性对照组外用药物采用联苯苄唑溶液(重庆青阳药业有限公司，国药准字H10950136)；安慰剂组(自制)。

40％三花药液的制备：药材原料均由广州致信药业股份有限公司提供。将玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，称取适量，用相当于饮片5倍量(质量体积比，g/ml)的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇至无醇味，加水调整体积至685ml，即得。

20％三花药液的制备：药材原料均由广州中医药大学第一附属医院草药房提供。将玫瑰花36g、月季花36g、凌霄花36g、苦参20g、苍术15g、蒲公英30g、当归8g、赤芍12g、侧柏叶30g、地骨皮30g、桑白皮15g、绿茶6g的饮片碎成粗粉，称取适量，用相当于饮片5倍量(质量体积比，g/ml)的50％(w/w)的乙醇溶液渗漉，渗漉液减压回收乙醇至无醇味，加水调整体积至1370ml，即得。

安慰剂的制备：本次项目采用的是模拟安慰剂，主要成分为焦麦芽、食用色素。由于麦芽、食用色素均无外用治疗脂溢性皮炎的相关报道，因此不影响疗效，而安慰剂在外形质感上与三花药液相似。同时为了避免色差，加入适量的褐色食用色素进行调节，通过色谱进行比色，达到视觉上的模拟效果。

3.治疗方法

为了促进药物的吸收排除去屑止痒功能的洗发露对于疗效的干扰，要求患者一周洗3次头，使用免费发放统一的洗发基质(即上述三种外用洗液)。使用方法和疗程：用棉球蘸取将40％三花药液(或20％三花药液或联苯苄唑或安慰剂)，涂于患处，每日早晚各涂药1次，共4周。治疗期间，患者均需保证生活作息规律，清淡饮食，避免摄入辛辣、油腻、甜食等。观察时间分别为：用药0天、用药14±3天，用药28±3天，对痊愈者停药后28±3天进行随访。对访视节点中患者的靶皮损进行拍照，为了避免因清洗头皮导致的疗效差异，要求患者复诊前2晚洗头。

4.观察疗程及时间

(1)观察疗程为4周。

(2)观察时间

观察时间分别为：用药0天、用药14±3天，用药28±3天，对痊愈者停药后28±3天进行随访。为了避免因清洗头皮导致的疗效差异，要求患者复诊前2晚洗头。

5.疗效判定

5.1主要疗效指标评分及方法如下：

表13评分标准

5.2皮损症状指标疗效判断

评定皮损的单项症状用积分记录(参照《中华人民共和国中医药行业标准中医皮肤科病证诊断疗效标准》)，并且记录其改善及消退时间。针对皮损主要指标的疗效判定标准如表14所示。

表14针对皮损主要指标的疗效判定标准

5.3综合疗效评价

红斑、鳞屑、脂溢及瘙痒等治疗前后的总积分变化来判断疗效，分4级判定。采用尼莫地平法：[(治疗前积分－治疗后积分)/治疗前积分]×100％。参照标准为《中华人民共和国中医药行业标准中医皮肤科病证诊断疗效标准》中面游风的疗效判定标准(表15)。

表15临床总疗效的评价

痊愈	症状积分减少90％及以上；
		显效	症状积分减少60％～89％；
有效	症状积分减少30％～59％；
		无效	症状积分减少在30％以下。

6.治疗结果

各组治疗前后症状评分及疗效比较各组治疗4周后疗效及治疗前后症状评分比较分别见表16和表17。

表16各组治疗4周后疗效比较(例)

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表17各组治疗前后症状评分比较

7.随访情况

治疗结束1个月后对所有患者进行随访，各组的复发率见表18。

表18四组复发率的比较

8.小结

40％三花药液组30例在治疗4周后痊愈9例，显效15例，有效5例，无效4例，显愈率80.0％；20％三花药液组30例在治疗4周后痊愈7例，显效11例，有效6例，无效6例，显愈率60.0％；酮康唑组30例在治疗4周后痊愈7例，显效9例，有效6例，无效7例，显愈率53.3％。40％三花药液组、20％三花药液组与酮康唑组之间差异有统计学意义，三花药液治疗头部脂溢性皮炎方面疗效优于酮康唑。

在改善靶皮损红斑程度方面，40％三花药液组、20％三花药液组与酮康唑组在治疗后较治疗前靶皮损红斑程度积分均有明显改善，且差异有统计学意义；治疗4周后，40％三花药液组、20％三花药液组与酮康唑组在改善皮损红斑程度方面具有一定疗效，后两组作用相当，40％三花药液组疗效优于酮康唑组。

在改善靶皮损鳞屑方面，40％三花药液组、20％三花药液组与酮康唑组在治疗后较治疗前靶皮损鳞屑程度积分均有明显改善，且差异有统计学意义；治疗4周后，40％三花药液组、20％三花药液组与酮康唑组在改善皮损鳞屑程度方面具有一定疗效，40％三花药液组疗效明显优于酮康唑组。

在改善靶皮损脂溢方面，40％三花药液组、20％三花药液组与酮康唑组在治疗后较治疗前靶皮损脂溢程度积分均有明显改善，且差异有统计学意义；治疗4周后，40％三花药液组、20％三花药液组与酮康唑组在改善皮损鳞屑程度方面具有一定疗效，40％三花药液组疗效明显优于酮康唑组。

在改善靶皮损瘙痒方面，40％三花药液组、20％三花药液组与酮康唑组治疗后较治疗前靶皮损瘙痒程度积分均有明显改善，且有统计学差异；治疗4周后，两组不同浓度的三花药液与酮康唑组瘙痒积分相比有统计学差异，说明三组在改善靶皮损瘙痒方面均有一定作用，且两组不同浓度的三花药液疗效优于酮康唑。

治疗结束一个月后，我们对所有患者进行了随访，其中使用40％三花药液组随访到30例患者，复发0例，复发率为0％；20％三花药液组随访到30例患者，复发4例，复发率为13.3％；酮康唑组随访到共30例患者，复发17例，复发率为56.7％；安慰剂组随访到的患者共30例，复发30例，复发率为100％，四组复发患者均无明显诱因。结果表明，使用三花药液的复发率相对较低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗马拉色菌的外用中药组合物，其特征在于：按质量份数计，由如下组分组成：玫瑰花36～80份，月季花36～80份，凌霄花36～80份，苦参20份，苍术15份，蒲公英30份，当归8份，赤芍12份，侧柏叶30份，地骨皮30份，桑白皮15份，绿茶6份。

2.根据权利要求1所述的抗马拉色菌的外用中药组合物，其特征在于：按质量份数计，由如下组分组成：玫瑰花36份，月季花36份，凌霄花36份，苦参20份，苍术15份，蒲公英30份，当归8份，赤芍12份，侧柏叶30份，地骨皮30份，桑白皮15份，绿茶6份。

3.权利要求1或2所述的抗马拉色菌的外用中药组合物在制备抗马拉色菌的中药制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的马拉色菌为限制马拉色菌、糠秕马拉色菌和合轴马拉色菌中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的中药制剂中的生药含量为0.05～0.6g/ml。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的中药制剂中的生药含量为0.2～0.6g/ml。

7.一种抗马拉色菌的外用中药制剂，其特征在于，通过如下方法制备得到：

将权利要求1或2所述的抗马拉色菌中药组合物中的玫瑰花、月季花、凌霄花、苦参、苍术、蒲公英、当归、赤芍、侧柏叶、地骨皮、桑白皮和绿茶混合后碎成粗粉，然后用乙醇溶液渗漉提取，渗漉液减压回收乙醇，并调整生药含量为0.05～0.6g/ml，得到三花洗液，即所述抗马拉色菌中药制剂。

8.根据权利要求7所述的抗马拉色菌的外用中药制剂，其特征在于：

所述的马拉色菌为限制马拉色菌、糠秕马拉色菌和合轴马拉色菌中的至少一种；

所述的生药的含量为0.2～0.6g/ml。

9.根据权利要求7所述的抗马拉色菌的外用中药制剂，其特征在于：

所述的乙醇溶液的浓度为质量百分比50%；

所述的乙醇溶液的用量为按每克所述抗马拉色菌中药组合物配比5～10ml乙醇溶液计算。

10.权利要求1～2任一项所述的抗马拉色菌的外用中药组合物和/或权利要求7～9任一项所述的抗马拉色菌的外用中药制剂在制备日化产品中的应用。