CN113860999A - 一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然产物制备技术领域，公开了一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法。该方法利用油橄榄叶制备羟基酪醇，依次采用生物酶酶解，萃取脱脂，树脂柱纯化和中低压色谱柱洗脱制备，以及对生物酶的选择，使得制得的羟基酪醇的纯度大于87％，高达93％。本发明制备的羟基酪醇对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌具有显著的抑制活性。本发明提供的方法，其操作简单，低压色谱柱的工作柱压低，对中低压色谱柱的要求较低，有利于大规模推广，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于天然产物制备技术领域，具体涉及一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法。
背景技术
油橄榄(Olea europaea L.)属木犀科(Oleaceae)、木犀榄属(Olea)常绿乔木，是世界著名的木本油料树种。橄榄油能大大降低心血管和肺癌的发病率，其营养价值和经济价值已被大家认可。生物学家进一步发现橄榄叶含有的抗氧化活性成分较之橄榄油更为突出，主要有橄榄苦苷、羟基酪醇、黄酮类、木酚素类、咖啡酰苯乙醇苷类等多酚类化合物。尤其是羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT；化学名为3，4－二羟基苯乙醇)，清除自由基的能力强，表现出独特的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流等。而且还能抑制人类早幼细胞白血病细胞HL60、腺癌细胞HT29及HT29克隆体19A、女性乳腺癌MCF-7细胞等扩散，透过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡，具有很好的抗癌活性。
天然羟基酪醇在油橄榄叶中含量很低，仅有0.01-0.8％，大多数以酯化物(橄榄苦苷)的形式存在于油橄榄的各个部位。橄榄苦苷(Oleuropein，OL)结构为裂环烯醚类多酚化合物，极易受空气、阳光、酸、碱、氧化剂、过渡金属离子、长时间高温等因素的影响，发生氧化、缩合、螯合等反应遭受破坏，尤其是在酸、碱和酶的作用下易降解为羟基酪醇和榄香酸，如下所示。油橄榄果及油橄榄叶中橄榄苦苷含量高，尤其在油橄榄叶中达到10-17％。因此利用橄榄苦苷降解制备天然羟基酪醇是国内外研究热点。
根据已有的报道，从橄榄果、叶，以及在制备橄榄油或食用橄榄果过程中产生的残渣和废水中分离羟基酪醇的过程中，由于原料成分复杂，且分离手段主要以溶剂萃取、硅胶柱反复分离为主，过程繁琐而且效率低。中低压柱色谱具有上样量大、高效、快速等优点，是新型的分离纯化技术，广泛应用于天然产物、食品和生物医药等领域。少部分研究也有采用中低压柱色谱的方法，但是其柱压较高，对中低压色谱柱的要求高，不利于大规模推广；且制备的羟基酪醇的纯度低，抗氧化能力弱。
因此，亟需提供一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法，能够制备出较高纯度的羟基酪醇，且对中低压色谱柱的要求较低，有利于大规模推广。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法，能够制备出纯度高达93％、抑菌性强的羟基酪醇，且制备中对中低压色谱柱的要求较低，有利于大规模推广。
本发明第一方面提供了一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法。
具体的，一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法，包括以下步骤：
(1)向油橄榄叶提取物中加入缓冲溶液，然后加入生物酶，酶解，过滤，得滤液；
(2)将步骤(1)制备的滤液进行萃取得萃取相，然后将所述萃取相浓缩，得膏状物；
(3)将步骤(2)制备的膏状物采用树脂柱纯化，得到羟基酪醇解附物；
(4)将步骤(3)制备的羟基酪醇解附物采用中低压色谱柱进行洗脱，得到羟基酪醇；
在步骤(1)中，所述生物酶选自纤维素酶、半纤维素酶或β-葡萄糖苷酶中的至少一种。
优选的，在步骤(1)中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
优选的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为4-7。
优选的，所述油橄榄叶提取物采用乙醇和/或水提取油橄榄叶得到。所述油橄榄叶提取物也可以直接购买，所述油橄榄叶提取物中橄榄苦苷含量在38％以上。
优选的，在步骤(1)中，所述油橄榄叶提取物的质量与所述缓冲溶液的体积比为1：(10-120)g/mL；进一步优选的，所述油橄榄叶提取物的质量与所述缓冲溶液的体积比为1：(10-100)g/mL；更优选的，所述油橄榄叶提取物的质量与所述缓冲溶液的体积比为1：(20-80) g/mL。
优选的，在步骤(1)中，所述油橄榄叶提取物与所述生物酶的质量比为1：(0.01-0.5)；优选的，所述油橄榄叶提取物与所述生物酶的质量比为1：(0.01-0.3)；更优选的，所述油橄榄叶提取物与所述生物酶的质量比为1：(0.02-0.1)。
优选的，在步骤(1)中，所述酶解的温度为30-100℃，所述酶解的时间为0.5-10h；更优选的，在步骤(1)中，所述酶解的温度为30-60℃，所述酶解的时间为2-10h。
优选的，在步骤(2)中，所述萃取的过程采用石油醚、正己烷或乙酸乙酯中的至少两种作为萃取剂。
优选的，所述滤液的质量与所述萃取剂的体积的比为1:(10-40)g/mL；优选的，所述滤液的质量与所述萃取剂的体积的比为1:(15-35)g/mL。
优选的，在步骤(2)中，所述萃取的过程为向所述滤液中加入所述石油醚或正己烷萃取 1-8次，得萃取相A和水相，将所述水相采用乙酸乙酯萃取1-8次，得萃取相B和水相，将所述B相进行浓缩。
优选的，在步骤(2)所述膏状物中，所述羟基酪醇的含量5％-20％。
优选的，在步骤(3)中，所述树脂柱中填充填料，所述填料选自AB-8、XAD-1、XAD-4、XAD-7、X-5、S-8、D-101、NKA-Ⅱ或H-103材料中的一种。
优选的，在步骤(3)中，所述膏状物与所述填料的质量比为1：(10-30)；进一步优选的，在步骤(3)中，所述膏状物与所述填料的质量比为1：(10-20)。
优选的，在步骤(3)中，所述纯化的过程为将所述膏状物加入所述树脂柱中，先采用水冲洗所述树脂柱直至流出澄清液，再采用洗脱剂进行洗脱，薄层色谱收集洗脱液，得到羟基酪醇解附物。
优选的，所述树脂柱的柱长为10-100cm，所述树脂柱的直径2-10cm。
优选的，所述洗脱剂选自乙酸乙酯、乙醇、甲醇、氯仿、乙腈或水中的至少一种。
优选的，在步骤(3)所述羟基酪醇解附物中，所述羟基酪醇的含量40％-60％。
优选的，在步骤(4)中，所述低压色谱柱中填充填料，所述填料选自100-400目硅胶、氧化铝、ODS C18柱、C8柱或Sephedex LH-20的中的一种。
优选的，所述羟基酪醇解附物与所述填料的质量比为1:10-30。
优选的，在步骤(4)中，所述洗脱过程采用洗脱剂，所述洗脱剂选自石油醚、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲醇或水中的至少一种。
优选的，在步骤(4)中，所述低压色谱柱的柱长为20-150cm，所述低压色谱柱的直径为5-20cm。
优选的，在步骤(4)中，所述洗脱的条件为：所述低压色谱柱的柱压为0.5-2.8MPa，检测波长为230-280nm，流速为5-100mL/min；进一步优选的，在步骤(4)中，所述洗脱的条件为：所述低压色谱柱的柱压为0.5-2.8MPa，检测波长为230-280nm，流速为5-30mL/min。在洗脱中，色谱柱的柱压小，对色谱柱的要求低，且有利于延长色谱柱的使用寿命。
优选的，在步骤(4)中，所述洗脱的过程为将所述羟基酪醇解附物加入到所述中低压柱中，采用洗脱剂进行洗脱，采用薄层色谱收集富含羟基酪醇的洗脱液，制得所述羟基酪醇。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明利用油橄榄叶制备羟基酪醇，依次采用生物酶酶解，萃取脱脂，树脂柱纯化和中低压色谱柱洗脱制备，以及对生物酶的选择，使得制得的羟基酪醇的纯度大于87％，高达93％。本发明制备的羟基酪醇对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌具有显著的抑制活性。
(2)本发明提供的方法，其操作简单，低压色谱柱的工作柱压低，对中低压色谱柱的要求较低，有利于大规模推广，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中油橄榄叶提取物酶解后的乙酸乙酯萃取物的HPLC图谱；
图2为实施例1中树脂柱纯化的羟基酪醇解附物的HPLC图谱；
图3为实施例1中低压色谱柱制备羟基酪醇的HPLC图谱；
图4为实施例1制备的羟基酪醇对金黄色葡萄球菌的抑制作用图；
图5为实施例1制备的羟基酪醇对大肠杆菌的抑制作用图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例和对比例中所用的油橄榄叶提取物购买于西安普莱特生物工程有限公司。其余原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法，包括以下步骤：
(1)将油橄榄叶提取物进行半纤维素酶酶解，取1g油橄榄叶提取物，加入pH 7的磷酸盐缓冲溶液50mL，再加入半纤维素酶20mg，置于50℃的恒温水浴摇床中。酶解6h后，过滤，滤液待用。
(2)滤液经正己烷按质量体积比1:20g/mL进行萃取2次，然后剩余水部分与乙酸乙酯按质量体积比1:15g/mL萃取3次，萃取相浓缩干燥，浓缩物为膏状物，经HPLC分析，羟基酪醇含量9.57％。图1为实施例1中油橄榄叶提取物酶解后的乙酸乙酯萃取物的HPLC图谱。
(3)将膏状物与H-103大孔树脂按质量比为1:15吸附，装柱，柱长20cm，柱直径4cm，先用蒸馏水冲洗树脂柱直至流出澄清液，再采用30％乙醇-水溶液进行洗脱，薄层色谱跟踪收集富含羟基酪醇的洗脱液，真空浓缩并干燥，浓缩物为羟基酪醇解附物，经HPLC分析，羟基酪醇含量54％；图2为实施例1中树脂柱纯化的羟基酪醇解附物的HPLC图谱。
(4)将羟基酪醇解附物与100目硅胶按质量比为1:10吸附，装入中低压色谱柱中，柱长60cm，柱直径5cm，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行洗脱，柱压为2MPa，检测波长为230nm，流速为3mL/min，薄层色谱跟踪收集富含羟基酪醇的洗脱液，真空浓缩并干燥，浓缩物为黄色的羟基酪醇，经HPLC分析，羟基酪醇的纯度为93％。图3为实施例1中低压色谱柱制备羟基酪醇的HPLC图谱。
实施例2
一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法，包括以下步骤：
(1)将油橄榄叶提取物进行纤维素酶酶解，取1g油橄榄叶提取物，加入pH 7的磷酸盐缓冲溶液50mL，再加入纤维素酶20mg，置于50℃的恒温水浴摇床中。酶解6h后，过滤，滤液待用；
(2)滤液经正己烷按质量体积比1:20g/mL进行萃取2次，然后剩余水部分与乙酸乙酯按质量体积比1:15g/mL萃取3次，萃取相浓缩干燥，浓缩物为膏状物，经HPLC分析，羟基酪醇含量9.03％；
(3)将膏状物与H-103大孔树脂按质量比为1:15吸附，装柱，柱长20cm，柱直径4cm，先用蒸馏水冲洗树脂柱直至流出澄清液，再采用30％乙醇-水溶液进行洗脱，薄层色谱跟踪收集富含羟基酪醇的洗脱液，真空浓缩并干燥，浓缩物为羟基酪醇解附物，经HPLC分析，羟基酪醇含量51％；
(4)将羟基酪醇解附物与100目硅胶按质量比为1:10吸附，装入中低压色谱柱中，柱长60cm，柱直径5cm，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行洗脱，柱压为2MPa，检测波长为230nm，流速为3mL/min，薄层色谱跟踪收集富含羟基酪醇的洗脱液，真空浓缩并干燥，浓缩物为黄色的羟基酪醇，经HPLC分析，羟基酪醇纯度为90％。
实施例3
一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法，包括以下步骤：
(1)将油橄榄叶提取物进行β-葡萄糖苷酶酶酶解，取1g油橄榄叶提取物，加入pH 7的磷酸盐缓冲溶液50mL，再加入β-葡萄糖苷酶20mg，置于50℃的恒温水浴摇床中。酶解6 h后，过滤，滤液待用；
(2)滤液经正己烷按质量体积比1:20g/mL进行萃取2次，然后剩余水部分与乙酸乙酯按质量体积比1:15g/mL萃取3次，萃取相浓缩干燥，浓缩物为膏状物，经HPLC分析，羟基酪醇含量8.15％；
(3)将膏状物与H-103大孔树脂按质量比为1:15吸附，装柱，柱长20cm，柱直径4cm，先用蒸馏水冲洗树脂柱直至流出澄清液，再采用30％乙醇-水溶液进行洗脱，薄层色谱跟踪收集富含羟基酪醇的洗脱液，真空浓缩并干燥，浓缩物为羟基酪醇解附物，经HPLC分析，羟基酪醇含量49％；
(4)将羟基酪醇解附物与100目硅胶按质量比为1:10吸附，装入中低压色谱柱中，柱长60cm，柱直径5cm，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行洗脱，柱压为2MPa，检测波长为230nm，流速为3mL/min，薄层色谱跟踪收集富含羟基酪醇的洗脱液，真空浓缩并干燥，浓缩物为黄色的羟基酪醇，经HPLC分析，羟基酪醇的纯度为88％。
实施例4
一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法，包括以下步骤：
(1)将油橄榄叶提取物进行半纤维素酶酶解，取1g油橄榄叶提取物，加入pH 7的磷酸盐缓冲溶液30mL，再加入半纤维素酶50mg，置于60℃的恒温水浴摇床中。酶解5h后，过滤，滤液待用；
(2)滤液经石油醚按质量体积比1:35g/mL进行萃取3次，然后剩余水部分与乙酸乙酯按质量体积比1:20g/mL萃取5次，萃取相浓缩干燥，浓缩物为膏状物；
(3)将膏状物与AB-8大孔树脂按质量比为1:15吸附，装柱，柱长50cm，柱直径3cm，先用蒸馏水冲洗树脂柱直至流出澄清液，再采用50％甲醇-水溶液进行洗脱，薄层色谱跟踪收集富含羟基酪醇的洗脱液，真空浓缩并干燥，浓缩物为羟基酪醇解附物；
(4)将羟基酪醇解附物与200目氧化铝按质量比为1:20吸附，装入中低压色谱柱中，柱长70cm，柱直径10cm，采用氯仿和甲醇的混合溶液进行洗脱，柱压为1MPa，检测波长为230nm，流速为10mL/min，薄层色谱跟踪收集富含羟基酪醇的洗脱液，真空浓缩并干燥，浓缩物为黄色的羟基酪醇，经HPLC分析，羟基酪醇的纯度为87％。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于采用木瓜蛋白酶替换半纤维素酶进行酶解，其余方法同实施例1，经HPLC分析，最终制得的羟基酪醇的纯度为76％。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于采用中温淀粉酶替换半纤维素酶进行酶解，其余方法同实施例1，经HPLC分析，最终制得的羟基酪醇的纯度为73％。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于采用中性蛋白酶替换半纤维素酶进行酶解，其余方法同实施例1，经HPLC分析，最终制得的羟基酪醇的纯度为78％。
产品效果测试
(1)分析各种生物酶对油橄榄叶提取物酶解效率的影响。
分别取实施例1-3和对比例1-3中的步骤(1)制备的滤液进行分析，测试油橄榄叶提取物中橄榄苦苷的降解率。测试结果见表1。
表1生物酶对油橄榄叶提取物酶解效率的影响
由表1可知，纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶对橄榄苦苷的降解率均大于55％，甚至高达81％，明显高于木瓜蛋白酶、中温淀粉酶和中性蛋白酶。
(2)羟基酪醇抑菌活性评价
用无菌移液枪移取100μL菌悬液(菌液浓度为105cfu/mL)并涂布于平板培养基，待菌悬液充分渗透于培养皿后，再用无菌镊子将灭菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，且均匀放入3 个牛津杯。将实施例1-4和对比例1-3制备羟基酪醇配制为10mg/mL的溶液，然后移取200 μL样品溶液至牛津杯中，尽量防止样品溶液溢出。每个样品浓度做两个平行测试，同时含有蒸馏水阴性对照和硫酸庆大霉素阳性对照。所有培养皿于37℃培养箱内培养，17h后观察各个样品的抑菌效果，采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈大小。其中图4为实施例1制备的羟基酪醇对金黄色葡萄球菌的抑制作用图；图5为实施例1制备的羟基酪醇对大肠杆菌的抑制作用图。抑菌圈的大小测试结果见表2。
表2
| 金黄色葡萄球菌 | 表皮葡萄球菌 | 大肠杆菌 | 产气肠杆菌 | 肺炎克雷伯氏菌 | |
| 实施例1 | 23 | 23.5 | 16 | 18 | 20 |
| 实施例2 | 21 | 22 | 14 | 17 | 18 |
| 实施例3 | 18 | 20 | 13 | 16 | 17 |
| 实施例4 | 17 | 20 | 13 | 14 | 15 |
| 对比例1 | 12 | 14 | 11 | 11 | 12.5 |
| 对比例2 | 12 | 13 | 10 | 9.5 | 12 |
| 对比例3 | 14 | 16 | 11 | 11 | 13.5 |
由表2可知，实施例和对比例制备的羟基酪醇，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌均具有抑菌作用，但是实施例制备的羟基酪醇的抑菌效果更优。
Claims (10)
1.一种利用油橄榄叶制备羟基酪醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向油橄榄叶提取物中加入缓冲溶液，然后加入生物酶，酶解，过滤，得滤液；
(2)将步骤(1)制备的滤液进行萃取得萃取相，然后将所述萃取相浓缩，得膏状物；
(3)将步骤(2)制备的膏状物采用树脂柱纯化，得到羟基酪醇解附物；
(4)将步骤(3)制备的羟基酪醇解附物采用中低压色谱柱进行洗脱，得到羟基酪醇；
在步骤(1)中，所述生物酶选自纤维素酶、半纤维素酶或β-葡萄糖苷酶中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述油橄榄叶提取物的质量与所述缓冲溶液的体积比为1：(10-120)g/mL；所述油橄榄叶提取物与所述生物酶的质量比为1：(0.01-0.5)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述油橄榄叶提取物的质量与所述缓冲溶液的体积比为1：(10-100)g/mL；所述油橄榄叶提取物与所述生物酶的质量比为1：(0.01-0.3)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述酶解的温度为30-100℃，所述酶解的时间为0.5-10h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述萃取的过程采用石油醚、正己烷或乙酸乙酯中的至少两种作为萃取剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述树脂柱中填充填料，所述膏状物与所述填料的质量比为1：(10-30)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述纯化的过程为将所述膏状物加入所述树脂柱中，先采用水冲洗所述树脂柱直至流出澄清液，再采用洗脱剂进行洗脱，薄层色谱收集洗脱液，得到羟基酪醇解附物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗脱剂选自乙酸乙酯、乙醇、甲醇、氯仿、乙腈或水中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述洗脱过程采用洗脱剂，所述洗脱剂选自石油醚、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲醇或水中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述洗脱的条件为：所述低压色谱柱的柱压为0.5-2.8MPa，检测波长为230-280nm，流速为5-100mL/min。
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