CN108553527B - 一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法 - Google Patents

一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法，包括下列步骤：脱脂步骤：通过脱脂剂去除干燥粉碎后的青刺果仁中的油脂，并在所述脱脂剂蒸发后，得到青刺果仁材料；回流提取步骤：将青刺果仁材料，用体积浓度为40～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为40～95vol.％的甲醇水溶液进行回流提取，得到提取液，将所述提取液蒸干，得到粗提物；分离纯化步骤：通过大孔树脂柱对所述粗提物进行分离纯化，富集得到含有总黄酮的提取物。其技术效果是：可以使提取物中总黄酮的含量达到30wt.％以上，并在制备过程中显著缩短分离纯化步骤的时间。

Description

一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及提取技术领域的一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法。
背景技术
黄酮类化合物(Flavonoids Compounds)是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样。黄酮类表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用。近年来，黄酮类化合物的研究进入了一个新的层次，随着对其结构功效关系的深入研究，发现了黄酮类化合物的一些作用机制，为其在护肤品、医药、食品领域的应用提供了理论依据，加快了黄酮类化合物的开发利用。
芦丁(Rutin)又名芸香苷、紫槲皮苷，广泛存在于自然界中，几乎所有的芸香科、蔷薇科和石楠科植物均含有芦丁，是来源很广的黄酮类化合物，其具有抗菌消炎、抗辐射、调节毛细血管壁的渗透及脆性、防止血管破裂、止血和对紫外线具有极强的吸收以及很好的抗氧化等作用。目前国产芦丁经羟乙基化得到曲克芦丁，可抑制血小板聚集，有效防止血栓形成。
青刺果为蔷薇科扁核木属植物青刺尖的果实，又名青那果、鸡蛋果、阿那斯，产于云南、四川、西藏等省区交界地区，生于海拔1800～3200m 的山坡、山谷或路旁等处，而青刺果实去除果皮即得青刺果仁。目前青刺果黄酮提取物在药理方面有相关报道，主要集中在青刺果仁总黄酮提取物的降血糖、降血脂的作用，对动物内脏的保护作用以及免疫调节作用等。然而，关于青刺果仁总黄酮提取物的提取工艺仅见少量的研究报道，且富集得到的青刺果仁总黄酮提取物中总黄酮含量都较低，例如：
安徽农业科学,2010,38(28):15580～15582上发表了詹素琼等的《青刺果总黄酮定性分析及含量测定》，经过测定青刺果提取物中黄酮含量均值为7.25wt.％。申请号为201610270265.2，名称为一种青刺果提取物及其制备方法和应用的中国发明专利申请，最终得到的总黄酮含量为 0.04～2.97wt.％。
目前，对青刺果仁中总黄酮的提取均是用乙醇或甲醇直接进行提取，得到粗提物，再通过分离纯化得到青刺果仁提取物，未见有脱脂工艺用于制备高总黄酮含量的青刺果仁提取物的研究报道，得到的青刺果仁提取物中总黄酮含量较低，区间在0.04～8wt.％，且青刺果仁中含有非常高的油脂，一般占30wt.％，由此带来了如下技术问题：第一，纯化时油脂会降低大孔树脂的吸附效率，使柱层析时间延长，大孔树脂柱由于油脂的吸附而无法重复利用；第二，所得产品中存在较高含量的油脂，不利于溶解，使其应用受到限制。
粗提物中总黄酮含量的测定，以芦丁标准品为对照，参照农业机械学报,2011,12(42):177-181，《山核桃外果皮黄酮提取与纯化》进行。
传统的青刺果提取物的提取方法，取干燥的青刺果仁，粉碎，以料液重量比为1:8的比例加入70vol.％的乙醇水溶液，在75℃下回流提取2 次，合并两次回流提取的提取液并进行过滤和富集，进行减压浓缩，去除其中的乙醇得到浓缩液，再对浓缩液水浴蒸干，得粗提物。粗提物中总黄酮的含量为20.02wt.％，粗提物的得率20.38％。粗提物用浓度为50～95vol. ％乙醇水溶液或甲醇水溶液溶解，以D101大孔树脂柱将其吸附并对其进行分离和纯化，先用20vol.％乙醇水溶液为除杂溶剂去除吸附在大孔树脂柱上粗提物中杂质；再用40～80vol.％的乙醇水溶液为梯度洗脱溶剂对大孔树脂柱进行洗脱得到洗脱液，并先对洗脱液进行减压浓缩去除其中的乙醇，再水浴蒸干，得到青刺果仁总黄酮提取物，简称提取物，以提取物的得率和提取物中总黄酮含量为比较指标，各体积浓度乙醇水溶液中提取物的得率和总黄酮含量如表1所示：
表1各体积浓度乙醇水溶液中提取物的得率和总黄酮含量
乙醇浓度(vol.％) 20 40 60 80
总黄酮含量(％) 9.06 41.02 25.16 11.95
提取物得率 1.27 1.08 0.15 0.11
根据传统工艺方法，未经脱脂处理的青刺果仁进行提取得到的粗提物，油状非常明显，在过D101大孔树脂柱时造成严重的堵塞，分离纯化的时间超过36h，并且给大孔树脂回收利用带来不便。
如若不采取脱脂措施，直接进行提取，不仅提取物的得率低，且因为含油量高会导致分离纯化耗时费力，最终富集得到的提取物中黄酮有效部位的总黄酮含量低。对比其他研究工作者在青刺果仁提取方面的研究探索，均未见有得到总黄酮含量超过30wt.％的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法，既能显著提高提取物中总黄酮的含量，也能显著缩短分离纯化步骤的时间。
实现上述目的的一种技术方案是：一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法，包括下列步骤：
脱脂步骤：通过脱脂剂去除干燥粉碎后的青刺果仁中的油脂，并在所述脱脂剂蒸发后，得到青刺果仁材料；
回流提取步骤：将青刺果仁材料，用体积浓度为40～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为40～95vol.％的甲醇水溶液进行回流提取，得到提取液，将所述提取液蒸干，得到粗提物；
分离纯化步骤：通过大孔树脂柱对所述粗提物进行分离纯化，富集得到含有总黄酮的提取物。
进一步的，所述脱脂剂为正己烷、石油醚或环己烷。
进一步的，脱脂步骤中的料液重量比为1：3，脱脂次数为三次，每次脱脂时浸泡搅拌的时间为3h。
进一步的，所述脱脂剂是通过减压浓缩去除的。
进一步的，回流提取步骤进行的温度为50～80℃，溶剂是体积浓度为40～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为40～95vol.％的甲醇水溶液。
再进一步的，回流提取步骤中合并两次回流提取的提取液，先对所述提取液进行减压浓缩，去除其中的乙醇或甲醇，得到浓缩液，再通过水浴蒸干去除所述浓缩液中的水分得到提取物。
进一步的，所述的大孔树脂柱为D101大孔树脂柱。
进一步的，所述粗提物是通过溶解在体积浓度为50～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为50～95vol.％的甲醇水溶液中引入大孔树脂柱的。
再进一步的，分离纯化步骤中先用体积浓度为5～15vol.％乙醇水溶液或体积浓度为5～15vol.％的甲醇水溶液作为除杂质剂洗脱所述大孔树脂柱，至除杂质剂的颜色变为深黄；
再用体积浓度为50～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为50～ 95vol.％的甲醇水溶液洗脱所述大孔树脂，得到含有总黄酮的颜色为橙色的洗脱液，收集合并所述洗脱液，先通过减压浓缩去除所述洗脱液中的乙醇或甲醇，再通过水浴将洗脱液蒸干，得到青刺果仁总黄酮提取物。
更进一步的，用体积浓度为5～15vol.％乙醇水溶液或体积浓度为 5～15vol.％的甲醇水溶液作为除杂质剂洗脱所述大孔树脂柱前，先用去离子水洗脱所述大孔树脂柱。
采用了本发明的一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法的技术方案，包括下列步骤：脱脂步骤：通过脱脂剂去除干燥粉碎后的青刺果仁中的油脂，并在所述脱脂剂蒸发后，得到青刺果仁材料；回流提取步骤：将青刺果仁材料，用体积浓度为40～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为40～ 95vol.％的甲醇水溶液进行回流提取，得到提取液，将所述提取液蒸干，得到粗提物；分离纯化步骤：通过大孔树脂柱对所述粗提物进行分离纯化，富集得到含有总黄酮的提取物。其技术效果是：可以使提取物中总黄酮的含量达到30wt.％以上，并在制备过程中显著缩短分离纯化步骤的时间。
附图说明
图1为本发明的一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法的实施例4的液相色谱图。
图2为本发明的一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法的实施例5的液相色谱图。
具体实施方式
本发明的发明人为了能更好地对本发明的技术方案进行理解，下面通过具体地实施例，并结合附图进行详细地说明：
本发明的一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法，包括下列步骤：脱脂步骤、回流提取步骤和分离纯化步骤。
脱脂步骤：
本发明的一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法，在回流提取步骤前增加了脱脂步骤，旨在缩短分离纯化步骤的时间，提高提取物中总黄酮的含量并提升效率。脱脂步骤是以总得油率为最终衡量脱脂效果的标准，选取最佳的工艺条件。
按照1：3～1：8的料液重量比，将干燥并粉碎后的青刺果仁浸渍在脱脂剂中，在室温下进行1～3次的脱脂，每次脱脂过程中，均进行浸泡搅拌，每次浸泡搅拌时间为1～3h，使青刺果仁中油脂溶入脱脂剂，然后通过减压浓缩去除脱脂剂，得到青刺果仁材料。表2和表3中所有脱脂方案中所采用的脱脂剂均为正己烷。
表2采用正己烷对青刺果仁进行脱脂的脱脂方案工艺条件列表
A(料液重量比) B(脱脂次数) C(浸泡搅拌时间)
1 1:3 1 1h
2 1:5 2 2h
3 1:8 3 3h
表3采用正己烷对青刺果仁进行脱脂的脱脂方案的总得油率列表
Test A B C E 总得油率(％)
1 1 1 1 1 11.60
2 1 2 2 2 15.15
3 1 3 3 3 19.99
4 2 1 2 3 12.67
5 2 2 3 1 17.07
6 2 3 1 2 20.86
7 3 1 3 2 18.01
8 3 2 1 3 13.72
9 3 3 2 1 21.91
T1 15.580 14.093 15.393 16.860
T2 16.867 15.313 16.577 18.007
T3 17.880 20.920 18.357 15.460
R 2.300 6.827 2.964 2.547
表4采用正己烷对青刺果仁进行脱脂的脱脂方案的正交实验结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值
料液重量比 7.972 2 0.288 4.460
脱脂次数 79.526 2 2.876 4.460
浸泡搅拌时间 13.350 2 0.483 4.460
Error 110.61 8
上述正交实验中，脱脂剂为正己烷，料液重量比、脱脂次数和每次脱脂的浸泡搅拌时间，三个因素对脱脂效果虽无显著性差异，但相对来说脱脂次数影响最为明显，经过脱脂处理后的青刺果仁材料呈干粉状、无油腻感。
考虑到经济因素及安全和有机溶剂残留等问题，优选的脱脂步骤工艺为料液重量比1:3，脱脂次数3次，浸泡搅拌时间3h的脱脂工艺，当然脱脂步骤中采用环己烷或者石油醚也是可以的。
回流提取步骤：
该步骤对青刺果仁材料中的总黄酮进行回流提取，其进行的温度为 50～80℃，溶剂是体积浓度为40～95vol.％的乙醇水溶液或甲醇水溶液，选取的料液重量比：1:5～1:30，回流提取的次数为两次，合并两次提取的提取液并进行过滤和富集，再对提取液进行减压浓缩，去除其中的乙醇，得到浓缩液，再对浓缩液水浴蒸干，得到粗提物。
下面是根据料液重量比1:3，脱脂次数3次，浸泡搅拌时间3h的脱脂工艺的基础上，给出了回流提取步骤的三个实施例：
实施例1
取干燥的青刺果仁200g，粉碎，用600mL正己烷进行脱脂3次，每次脱脂过程中，均进行浸泡搅拌，每次浸泡搅拌时间为3h，得到青刺果仁材料。之后以料液重量比为1:8的比例将青刺果仁材料加入体积浓度为70 vol.％的乙醇水溶液，在75℃条件下回流提取2次,合并两次的提取液并进行过滤富集，然后通过减压浓缩去除提取液中的乙醇得到浓缩液，再对浓缩液水浴蒸干，得粗提物16.23g，以芦丁为标准品对照，该粗提物中总黄酮含量为20.99wt.％。
实施例2
取干燥的青刺果仁200g，粉碎，用600mL石油醚进行脱脂3次，每次脱脂过程中，均进行浸泡搅拌，每次浸泡搅拌时间为3h，得到青刺果仁材料。之后以料液重量比为1:8的比例将青刺果仁材料加入体积浓度70 vol.％的乙醇水溶液，在75℃条件下回流提取2次,合并两次的提取液并进行过滤富集，然后通过减压浓缩去除提取液中的乙醇得到浓缩液，再对浓缩液水浴蒸干，得粗提物15.87g，以芦丁为标准品对照，该粗提物中总黄酮含量为18.79wt.％。
实施例3
取干燥的青刺果仁200g，粉碎，用600mL环己烷进行脱脂3次，每次脱脂过程中，均进行浸泡搅拌，每次浸泡搅拌时间为3h，得到青刺果仁材料。之后以料液重量比为1:8的比例将青刺果仁材料加入70vol.％的乙醇水溶液，在75℃条件下回流提取2次,合并两次的提取液并进行过滤富集，然后通过减压浓缩去除提取液中的乙醇得到浓缩液，再对浓缩液水浴蒸干，得粗提物17.57g，以芦丁为标准品对照，该粗提物中总黄酮含量为 19.43wt.％。
分离纯化步骤：
粗提物用体积浓度为50～95vol.％乙醇水溶液或甲醇水溶液溶解后，上样至D101大孔树脂柱，使D101大孔树脂柱吸附其中的总黄酮。先用去离子水洗脱D101大孔树脂柱至去离子水的颜色变为浅黄，再用体积浓度为5～15vol.％乙醇水溶液或甲醇水溶液作为除杂质剂洗脱D101大孔树脂柱，至除杂质剂的颜色变为深黄，再用体积浓度为50％～95vol.％乙醇水溶液或甲醇水溶液作为洗脱溶剂，洗脱D101大孔树脂柱，得到含有总黄酮的颜色为橙色的洗脱液，收集洗脱液，先通过减压浓缩去除洗脱液中的乙醇或甲醇，再通过水浴将洗脱液蒸干，得到青刺果仁总黄酮提取物，简称提取物。
本步骤溶解粗提物优选浓度为60vol.％乙醇水溶液或甲醇水溶液。
选取实施例1所得的粗提物，以最佳体积浓度的乙醇水溶液作为洗脱溶剂。
粗提物用浓度为60vol.％乙醇水溶液或甲醇水溶液溶解后，上样至 D101大孔树脂柱，使D101大孔树脂柱吸附其中的总黄酮。先用10vol.％乙醇水溶液洗脱D101大孔树脂柱。
再用相同体积的，体积浓度为20vol.％、40vol.％、60vol.％和80vol.％的乙醇水溶液依次梯度洗脱D101大孔树脂柱。
对五次洗脱后得到的洗脱液，减压浓缩去除洗脱液中的乙醇，再通过水浴将洗脱液蒸干得到提取物。
不同体积浓度乙醇水溶液洗脱D101大孔树脂柱，并对洗脱后的洗脱液进行减压浓缩和水浴蒸干后得到的提取物中总黄酮含量及提取物的得率为比较指标，以芦丁为标准品对照，不同体积浓度乙醇水溶液洗脱D101 大孔树脂柱后得到的提取物的重量及提取物中总黄酮的含量如下所示：
表5不同体积浓度乙醇水溶液分离纯化得到的提取物的重量及提取物中总黄酮的含量
Figure BDA0001706899920000091
实验结果表明，10vol.％乙醇水溶液基本可以将绝大部分极性的杂质去除，对总黄酮的洗脱能力很弱，适合作为除杂溶剂。
体积浓度40vol.％的乙醇水溶液对总黄酮的洗脱效果较为明显；出于富集得到更多提取物的考虑，最终确定了以体积浓度60vol.％的乙醇水溶液作为最佳洗脱溶剂。对比未脱脂的实验过程，经充分脱脂后的青刺果仁材料，进行提取后的粗提物和提取物无油状感，分离纯化步骤的时间不超过12h，非常利于大批量生产应用。相比于先回流提取后脱脂的工艺，其提取物中总黄酮含量更高，更容易提纯。
下面继续提供两个总的实施例：
实施例4
实施例4是以实施例1为基础的，
取干燥的青刺果仁100g，粉碎，用300mL正己烷进行脱脂3次，每次脱脂时间为3小时，得到青刺果仁材料。
之后以料液重量比1:8的比例将青刺果仁材料加入体积浓度70vol.％的乙醇水溶液，在75℃下回流提取2次,合并两次提取液，对提取液进行过滤和富集，然后先对提取液进行减压浓缩，去除其中的乙醇，得到浓缩液，再对浓缩液进行水浴蒸干，得粗提物。
粗提物用体积浓度为50～95vol.％乙醇水溶液溶解后，上样至D101 大孔树脂柱，使D101大孔树脂柱吸附其中的总黄酮；用去离子水洗脱D101 大孔树脂柱至去离子水的颜色变为浅黄；用体积浓度10vol.％乙醇水溶液洗脱D101大孔树脂柱，去除粗提物中的杂质；再用体积浓度60vol.％乙醇水溶液洗脱D101大孔树脂柱，得到洗脱液，合并收集洗脱液，先通过减压浓缩去除洗脱液中的乙醇，再通过水浴将洗脱液蒸干，得到提取物。提取物中总黄酮的含量为56wt.％，提取物总重量2.05g，得率2.05％。
测试方法为：配置芦丁对照品溶液和提取物溶液，用安捷伦1260液相色谱仪进行总黄酮含量测定，色谱条件如下：色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；溶液过0.45 μm微孔滤膜后各取20μl；流动相：以乙腈为流动相A，娃哈哈纯净水为流动相B；洗脱方式：从0～20min，流动相A：10％～50％，流动相B：90 ％～50％；检测波长：365nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min；测得提取物中芦丁含量为0.12wt.％。液相色谱图如图1。
实施例5
实施例5与实施例4的区别在于：取干燥的青刺果仁200g，正己烷用量为600ml。提取物中总黄酮的含量为60wt.％，提取物总重量4.35g，得率2.18％，液相色谱图如图2。
本发明的一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法所得的提取物，包含有芦丁等，且总黄酮在提取物中的含量为30％～60wt.％，远高于已知文献中提取物中总黄酮含量；其中芦丁在提取物中的含量大于0.1wt.％。
本发明的一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法，因青刺果仁中含有非常高的油脂，一般占30wt.％，脱脂实属必要。未经脱脂直接提取得到的油状青刺果仁提取物含有大量脂溶性成分使干燥费时费力，且正己烷等液体脱脂剂很难将其穿透，将使后续分离纯化效率低且总黄酮含量一般；而青刺果仁粒度小，在提取步骤之前先对其进行脱脂，脱脂效果非常明显, 可得到干粉状的青刺果仁提取物，经提取大孔树脂柱分离纯化效率高且总黄酮含量有所提升。由此，其工艺简单，成本低，显著降低了大孔树脂柱分离纯化的时间，且总黄酮含量非常高，在护肤、食品及抗氧化药物等领域内具备非常巨大的发展潜力。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims (1)

1.一种青刺果仁总黄酮提取物的制备方法，包括下列步骤：
脱脂步骤：通过脱脂剂去除干燥粉碎后的青刺果仁中的油脂，并在所述脱脂剂蒸发后，得到青刺果仁材料；
回流提取步骤：将青刺果仁材料，用体积浓度为40～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为40～95vol.％的甲醇水溶液进行回流提取，得到提取液，将所述提取液蒸干，得到粗提物；
分离纯化步骤：通过大孔树脂柱对所述粗提物进行分离纯化，富集得到含有总黄酮的提取物；
脱脂步骤中，所述脱脂剂为正己烷、石油醚或环己烷；
脱脂步骤中的料液重量比为1：3，脱脂次数为三次，每次脱脂时浸泡搅拌的时间为3h；
所述脱脂剂是通过减压浓缩去除的；
回流提取步骤进行的温度为50～80℃，溶剂是体积浓度为40～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为40～95vol.％的甲醇水溶液，料液重量比为1：5～1：30，回流提取的次数为两次；
回流提取步骤中合并两次回流提取的提取液，先对所述提取液进行减压浓缩，去除其中的乙醇或甲醇，得到浓缩液，再通过水浴蒸干去除所述浓缩液中的水分 得到提取物；
分离纯化步骤中，所述的大孔树脂柱为D101大孔树脂柱；
所述粗提物是通过溶解在体积浓度为50～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为50～95vol.％的甲醇水溶液中引入大孔树脂柱的；
分离纯化步骤中，先用去离子水洗脱所述大孔树脂；然后用体积浓度为5～15vol.％乙醇水溶液或体积浓度为5～15vol.％的甲醇水溶液作为除杂质剂洗脱所述大孔树脂柱，至除杂质剂的颜色变为深黄；
再用体积浓度为50～95vol.％的乙醇水溶液或体积浓度为50～95vol.％的甲醇水溶液洗脱所述大孔树脂，得到含有总黄酮的颜色为橙色的洗脱液，收集合并所述洗脱液，先通过减压浓缩去除所述洗脱液中的乙醇或甲醇，再通过水浴将洗脱液蒸干，得到青刺果仁总黄酮提取物。
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