CN102351701A - 一种从藏丹参中分离纯化迷迭香酸的制备方法 - Google Patents

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许定舟
李金华
汪涛
孙红梅
葛发欢
刘忠云
杨丽
钟鸣
张聪琪
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Abstract

本发明公开了一种从藏丹参中分离纯化迷迭香酸的制备方法。将藏丹参药材粉碎成细粉，加入乙醇，控制pH值，低温提取，离心或过滤得澄清液，在大孔树脂柱上动态吸附，先用去离子水洗脱，再以一定浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥即得产品。本发明以迷迭香酸含量较高的藏丹参为原料，筛选不同型号大孔吸附树脂，并优化吸附洗脱条件，实现对藏丹参中迷迭香酸的工业化制备。所得的迷迭香酸含量为32.11%，回收率可达93.22%。

Description

一种从藏丹参中分离纯化迷迭香酸的制备方法
 
技术领域
本发明涉及一种从藏丹参中分离纯化迷迭香酸的制备方法。
背景技术
藏丹参为唇形科的绒毛鼠尾草Salvia castanea Diels f. tomentosa Stib，其在《中国植物志》和《西藏植物志》中均有记载，为栗色鼠尾草的变型。在藏医里，藏丹参广泛用于心悸、心烦失眠、肝脾肿大、关节疼痛、产后淤血疼痛、黄疸性发烧、口腔溃疡、月经不调等病症的治疗。藏丹参集中分布住林芝地区的林芝、米林、工布江达和波密等四个相邻县，为林芝地区独特的林下藏药材。初步调查认为林芝地区绒毛鼠尾草资源量约为5000吨以上，在资源上具有较大的开发潜力。
迷迭香酸(Rosmarinic Acid)是一种多功能酚酸类化合物，作为抗氧化剂，具有极强的清除体内自由基的活性．其抗氧化性强于咖啡酸、绿原酸、叶酸等，能抑制内皮细胞调节的低密度脂蛋白的氧化，并具有显著的抗病毒活性。迷迭香酸的来源甚广，在丹参、紫苏草、鼠尾草、夏枯草、轮香山香、牛至、迷迭香、蜜蜂花和马郁兰中等均发现迷迭香酸，但含量较低。迷迭香酸结构式如下：
Figure 2011103305953100002DEST_PATH_IMAGE002
由其结构式可以看出迷迭香酸为一种多酚类化合物，结构不稳定，易被氧化。传统的迷迭香酸提取工艺是：药材粉碎后热水提取，乙酸乙酯萃取得浸膏后上硅胶柱分离，氯仿-甲醇洗脱。此工艺消耗时间长，容易造成溶剂残留。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便，能从藏丹参中分离纯化出高纯度迷迭香酸的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从藏丹参中分离纯化迷迭香酸的方法，包括以下步骤：
(1) 取藏丹参药材，粉碎，用乙醇水溶液提取；
(2) 提取液加酸调节pH值到1-5；                            
(3) 处理后的提取液在大孔树脂柱上进行吸附、洗脱：先以水为洗脱液，再以乙醇溶液洗脱；洗脱液经浓缩、干燥后即得产品。
在上述方法中，步骤(1)中所述乙醇水溶液的乙醇体积百分比浓度为20-90%。所述乙醇水溶液提取包括乙醇加热回流提取法、浸渍法、渗漉法、微波提取法、超声法或酶法的一种，优选加热回流法提取。乙醇溶液的体积百分比浓度优选为40-90%，最佳乙醇溶液体积百分比浓度为70%。
在上述方法中，步骤（2）中所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸或高氯酸中的一种或两种以上混合。pH值优选= 2.5~3.5。
在上述方法中，步骤(3)中所述吸附采用的吸附剂为弱碱性离子交换树脂D392、D380或D301R，所述大孔树脂为AB-8、SP825、D101或HPD750中的一种或多种组合。
在上述方法中，步骤(3)中所述大孔树脂吸附pH值在2-8之间，优选pH=3~3.5；吸附与洗脱温度在20-35℃，优选温度25℃。
在上述方法中，步骤(3)中所述水洗脱以0.5-4BV/hr的速度洗脱，洗脱体积为1-5BV。
在上述方法中，步骤(3)中所述乙醇溶液洗脱所用乙醇体积浓度为20%-80%，洗脱速度为0.5-1.5BV/hr，洗脱体积4-7BV。
在上述方法中，步骤(3)中的所述干燥采用真空干燥或喷雾干燥。
浓缩采用常压或者减压旋转蒸发浓缩法。
所得产品的迷迭香酸经高效液相色谱测定。其中色谱分析条件如下：Hypersil ODS2色谱柱(5μm，4.6㎜×250㎜)流动相以乙腈为流动相A, 以0.05%磷酸溶液为流动相B按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为286nm；柱温30℃；流速为1.0ml/min。
表1  迷迭香酸HPLC梯度洗脱条件
时间（min） 流动相A（%） 流动相B(%)
0~15 10→20 90→80
15~35 20→25 80→75
35~45 25→30 75→70
45~55 30→90 70→10
55~70 90 10
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对迷迭香酸药材来源的筛选，发现藏丹参含有更丰富的迷迭香酸，其含量高达1.51%，而内地丹参的迷迭香酸含量为0.53%。现阶段对藏丹参资源开发尚处初期，从藏丹参中分离纯化迷迭香酸的方法尚未见报道。
本发明的特点在于以藏丹参为原料，采用乙醇提取，大孔树脂一步吸附、洗脱的纯化方法，获得较高纯度的迷迭香酸，核心技术在于以迷迭香酸含量较高的藏丹参为原料，对比研究了不同型号大孔树脂的洗脱行为，并优化吸附和洗脱条件（包括吸附pH、吸附与洗脱温度、洗脱流速、洗脱液乙醇浓度等），从而简便的实现迷迭香酸的分离纯化与高纯制备的目的。
具体实施方式
下述乙醇的浓度为体积百分比浓度（V/V, %）。
实施例1
（1）提取：取藏丹参药2kg材粉碎至20-60目，用药材量12倍体积(V/W)60%乙醇溶液加热回流提取2小时，抽滤弃残渣，提取液旋蒸至无乙醇，得藏丹参提取液。
（2）酸化：取提取液200ml用4%盐酸（w/w,%）溶液调pH至3.5，抽滤去除絮状沉淀。
（3）吸附及洗脱：上述处理的提取液在25℃以下以1.4BV/hr流过填充大孔吸附树脂HPD750的色谱柱，进行动态吸附；上样结束后，用1BV蒸馏水以1.4BV/hr的流速进行动态洗脱，随后用6BV的60%乙醇洗脱，洗脱速度为1.5BV/hr，收集洗脱液。
（4）浓缩、干燥：洗脱液经旋转蒸发浓缩除去乙醇，再喷雾干燥即得干粉产品。
（5）检测分析：经高效液相色谱分析证明产品的迷迭香酸纯度为30.52%，回收率为85.31%。
实施例2
（1）提取：取藏丹参药2kg材粉碎至20-60目，用药材量12倍体积(V/W) 60%乙醇溶液加热回流提取1小时，抽滤弃残渣，提取液旋蒸至无乙醇，得藏丹参提取液。
（2）酸化：取提取液200ml用4%盐酸（w/w,%）溶液调pH至4，抽滤去除絮状沉淀。
（3）吸附及洗脱：上述处理的提取液在25℃以下以1.4BV/hr流过填充大孔吸附树脂HPD750的色谱柱，进行动态吸附；上样结束后，用1BV蒸馏水以1.4BV/hr的流速进行动态洗脱，随后用6BV的60%乙醇洗脱，洗脱速度为1.5BV/hr，收集洗脱液。
（4）浓缩、干燥：洗脱液经旋转蒸发浓缩除去乙醇，再喷雾干燥即得干粉产品。
（5）检测分析：经高效液相色谱分析, 产品的迷迭香酸含量为29.23%，回收率为78.12%。 
实施例3
（1）提取：取藏丹参药2kg材粉碎至20-60目，用药材量12倍体积(V/W)60%乙醇溶液加热回流提取2小时，抽滤弃残渣，提取液旋蒸至无乙醇，得藏丹参提取液。
（2）酸化：取提取液200ml用4%盐酸（w/w, %）溶液调pH至4，抽滤去除絮状沉淀。
（3）吸附及洗脱：上述处理的提取液在25℃以下以1.4BV/hr流过填充大孔吸附树脂HPD750的色谱柱，进行动态吸附；上样结束后，用1BV蒸馏水以1.4BV/hr的流速进行动态洗脱，随后用6BV的40%乙醇洗脱，洗脱速度为1.5BV/hr，收集洗脱液。
（4）浓缩、干燥：洗脱液经旋转蒸发浓缩除去乙醇，再喷雾干燥即得干粉产品。
（5）检测分析：经高效液相色谱分析证明产品的迷迭香酸纯度为28.49%，回收率为90.43%。
实施例3
（1）提取：取藏丹参药2kg材粉碎至20-60目，用药材量12倍体积(V/W)60%乙醇溶液加热回流提取2小时，抽滤弃残渣，提取液旋蒸至无乙醇，得藏丹参提取液。
（2）酸化：取提取液200ml用4%盐酸（w/w,%）溶液调pH至4，抽滤去除絮状沉淀。
（3）吸附及洗脱：上述处理的提取液在25℃以下以1.4BV/hr流过填充大孔吸附树脂HPD750的色谱柱，进行动态吸附；上样结束后，用1BV蒸馏水以1.4BV/hr的流速进行动态洗脱，随后用6BV的80%乙醇洗脱，洗脱速度为2BV/hr，收集洗脱液。
（4）浓缩、干燥：洗脱液经旋转蒸发浓缩除去乙醇，再喷雾干燥即得干粉产品。
（5）检测分析：经高效液相色谱分析证明产品的迷迭香酸纯度为28.49%，回收率为90.43%。
实施例4
（1）提取：取藏丹参药2kg材粉碎至20-60目，用药材量12倍体积(V/W)60%乙醇溶液加热回流提取2小时，抽滤弃残渣，提取液旋蒸至无乙醇，得藏丹参提取液。
（2）酸化：取提取液200ml用4%盐酸（w/w,%）溶液调pH至5，抽滤去除絮状沉淀。
（3）吸附及洗脱：上述处理的提取液在25℃以下以1.4BV/hr流过填充大孔吸附树脂HPD750的色谱柱，进行动态吸附；上样结束后，用1BV蒸馏水以1.4BV/hr的流速进行动态洗脱，随后用4BV的60%乙醇洗脱，洗脱速度为2BV/hr，收集洗脱液。
（4）浓缩、干燥：洗脱液经旋转蒸发浓缩除去乙醇，再喷雾干燥即得干粉产品。
（5）检测分析：经高效液相色谱分析证明产品的迷迭香酸纯度为28.49%，回收率为90.43%。
实施例5
（1）提取：取藏丹参药2kg材粉碎至20-60目，用药材量12倍体积(V/W) 60%乙醇溶液加热回流提取2小时，抽滤弃残渣，提取液旋蒸至无乙醇，得藏丹参提取液。
（2）酸化：取提取液200ml用4%盐酸（w/w,%）溶液调pH至3.5，抽滤去除絮状沉淀。
（3）吸附及洗脱：上述处理的提取液在25℃以下以1.4BV/hr流过填充大孔吸附树脂HPD750的色谱柱，进行动态吸附；上样结束后，用1BV蒸馏水以1.4BV/hr的流速进行动态洗脱，随后用6BV的60%乙醇洗脱，洗脱速度为1BV/hr，收集洗脱液。
（4）浓缩、干燥：洗脱液经旋转蒸发浓缩除去乙醇，再喷雾干燥即得干粉产品。
（5）检测分析：经高效液相色谱分析证明产品的迷迭香酸纯度为30.49%，回收率为91.79%。
实施例6
（1）提取：取藏丹参药2kg材粉碎至20-60目，用药材量12倍体积(V/W)60%乙醇溶液加热回流提取2小时，抽滤弃残渣，提取液旋蒸至无乙醇，得藏丹参提取液。
（2）酸化：取提取液200ml用4%盐酸（w/w,%）溶液调pH至3.5，抽滤去除絮状沉淀。
（3）吸附及洗脱：上述处理的提取液在25℃以下以1.4BV/hr流过填充大孔吸附树脂D101的色谱柱，进行动态吸附；上样结束后，用1BV蒸馏水以1.4BV/hr的流速进行动态洗脱，随后用6BV的60%乙醇洗脱，洗脱速度为1BV/hr，收集洗脱液。
（4）浓缩、干燥：洗脱液经旋转蒸发浓缩除去乙醇，再喷雾干燥即得干粉产品。
（5）检测分析：经高效液相色谱分析证明产品的迷迭香酸纯度为25.52%，回收率为75.31%。
实施例7
（1）提取：取藏丹参药2kg材粉碎至20-60目，用药材量12倍体积(V/W)60%乙醇溶液加热回流提取2小时，抽滤弃残渣，提取液旋蒸至无乙醇，得藏丹参提取液。
（2）酸化：取提取液200ml用4%盐酸溶液（质量浓度）调pH至3.5，抽滤去除絮状沉淀。
（3）吸附及洗脱：上述处理的提取液在25℃以下以1.4BV/hr流过填充大孔吸附树脂AB-8的色谱柱，进行动态吸附；上样结束后，用1BV蒸馏水以1.4BV/hr的流速进行动态洗脱，随后用6BV的60%乙醇洗脱，洗脱速度为1.5BV/hr，收集洗脱液。
（4）浓缩、干燥：洗脱液经旋转蒸发浓缩除去乙醇，再喷雾干燥即得干粉产品。
（5）检测分析：经高效液相色谱分析证明产品的迷迭香酸纯度为26.52%，回收率为75.21%。

Claims (8)

1.一种从藏丹参中分离纯化迷迭香酸的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1) 取藏丹参药材，粉碎，用乙醇水溶液提取；
(2) 提取液加酸调节pH值到1-5；   
(3) 处理后的提取液在大孔树脂柱上进行吸附、洗脱：先以水为洗脱液，再以乙醇溶液洗脱；洗脱液经浓缩、干燥后即得产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙醇水溶液的乙醇体积百分比浓度为20-90%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸或高氯酸中的一种或两种以上混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述吸附采用的吸附剂为弱碱性离子交换树脂D392、D380或D301R，所述大孔树脂为AB-8、SP825、D101或HPD750中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述大孔树脂吸附pH值在2-8之间，吸附与洗脱温度在20-35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述水洗脱以0.5-4BV/hr的速度洗脱，洗脱体积为1-5BV。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述乙醇溶液洗脱所用乙醇体积浓度为20%-80%，洗脱速度为0.5-1.5BV/hr，洗脱体积4-7BV。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的所述干燥采用真空干燥或喷雾干燥。
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