CN114404460B - 杨叶肖槿内生真菌发酵提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

杨叶肖槿内生真菌发酵提取物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX‑002发酵提取物以及其作为活性成分在制备清除DPPH自由基的药物或保健品中的应用。本发明提供的杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX‑002发酵提取物具有明显的抗氧化活性，且可有效消除DPPH自由基，在制备新型抗氧化药物/保健品方面具有广泛的应用前景。

Description

杨叶肖槿内生真菌发酵提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种杨叶肖槿内生真菌发酵提取物及其制备方法与应用。
背景技术
随着我国的经济发展和人民生活水平的提高，人们的饮食结构、生活方式都发生了很大的改变，但各类疾病也随之而来。研究表明大量疾病的发展都与氧化应激有关，如癌症、心脏病、老年痴呆等。当细胞产生的自由基和抗氧化剂不平衡导致机体内过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)积聚就可能发生氧化应激。
目前抗氧化药物主要分为直接抗氧化药物和间接抗氧化药物两种。直接抗氧化药物能够以适当的浓度到达病变部位,并与机体产生的ROS迅速反应,起到直接抗氧化作用；间接抗氧化药物则是通过激活细胞内抗氧化信号通路,诱导抗氧化蛋白的表达达到清除ROS的目的。然而现有的抗氧化药物只能抑制ROS 的产生或清除ROS。
另一方面，杨叶肖槿是一种广泛分布于亚欧非、大洋洲的红树植物，其是一种常见的民间药用植物，具有广泛的药学用途。如杨叶肖槿的树皮可用来治疗痢疾、皮肤疾病；叶子可消炎消肿，果实分泌液可制备皮癣。目前关于杨叶肖槿的研究也多局限于研究其各部位的成分以及药用机理，并未有对其内生真菌的相关研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种具有药用价值的杨叶肖槿内生真菌发酵提取物及其制备方法与应用。
具体的，本发明提供了杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物作为活性成分在制备清除DPPH自由基的药物或保健品中的应用。发明人通过研究发现，杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物具有明显的抗氧化作用，且可清除DPPH自由基，即其在制备新型抗氧化药物/保健品方面具有广泛的应用前景。该菌种已于2022年1月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市，保藏号为GDMCC NO:62179。
具体的，该Penicillium sp.YX-002发酵提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002接种至培养基中，发酵得到发酵产物；
具体的，步骤(1)包括：
(1.1)将杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002活化；
具体的，将杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002置于温度为20～30℃、湿度为60～90％(RH)的培养箱中活化。
(1.2)将活化后的杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002接种至海水马铃薯培养基，培养得到孢子液；
具体的，海水马铃薯培养基的组成为：马铃薯汁100～800mL/L，葡萄糖 10～50g/L，蛋白胨0.5～10g/L，海盐5～50g/L。接种前在0.5×105～3×105Pa下灭菌 10～40min。优选的，在本发明的一个实施例中，海水马铃薯培养基的组成为：马铃薯汁500mL/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，海盐20g/L。
其中，马铃薯汁的制备方法为：马铃薯去皮，洗净切块，加入去离子水，加热煮沸10～30min，过滤即得，每100g马铃薯煮100mL土豆汁。
具体的，接种量为10～20g菌落平板/400mL培养基。接种后在摇床培养3～4 天，得到孢子液。
(1.3)将所述孢子液接种至大米培养基，在20～35℃发酵10～50天，即得到发酵产物。
具体的，大米培养基的组成为：大米20～100g/60mL海水，1～3wt％海盐。接种前在0.5×105～3×105Pa下灭菌10～40min。优选的，在本发明的一个实施例中，大米培养基的组成为：大米50g，海水60mL，海水中海盐的浓度为26g/L。
具体的，孢子液的接种量为1～8vol％，优选的为4vol％。
具体的，发酵温度为20～35℃，发酵时间为10～50天；优选的，发酵温度为 25～30℃，发酵时间为30天。
(2)将所述发酵产物经提取溶剂提取、萃取溶剂萃取、分离溶剂分离后得到发酵提取物；
具体的，步骤(2)包括：
(2.1)将发酵产物采用提取溶剂提取1～3次，合并提取液后干燥，得到粗提物；
具体的，提取溶剂选用甲醇和/或二氯甲烷，但不限于此。优选的，提取溶剂选用甲醇和二氯甲烷；进一步优选的，提取溶剂选用甲醇和二氯甲烷，两者的体积比为1:1。
(2.2)将粗提物采用萃取溶剂萃取，干燥得到中间产物；
具体的，萃取溶剂选用乙酸乙酯，但不限于此。萃取后蒸干，即得到中间产物。
(2.3)将所述中间产物采用分离溶剂进行柱层析分离，即得到发酵提取物；
具体的，分离溶剂可选用乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、甲醇、氯仿中的一种或多种，但不限于此。优选的，所述分离溶剂依次为正己烷、体积比为1:9 的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为3:7的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为1:1的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为7:3的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为1:1的氯仿甲醇混合溶剂、乙酸乙酯。需要说明的是，本发明中的分离操作是通过柱层析进行的，所述的分离溶剂是指洗脱液。
具体的，先将中间产物采用正相硅胶色谱进行柱层析，依次正己烷、体积比为1:9的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为3:7的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为1:1的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为7:3的正己烷乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，收集体积比为7:3的正己烷乙酸乙酯混合溶剂的洗脱液进行凝胶柱层析，采用体积比为1:1的氯仿甲醇混合溶剂进行洗脱，收集洗脱液；再采用正相硅胶色谱进行柱层析，采用乙酸乙酯进行洗脱，收集洗脱液，即得。
相应的，本发明还提供了一种杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物，其由上述的制备方法制备而得。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明提供的杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物具有明显的抗氧化活性，且可有效消除DPPH自由基，在制备新型抗氧化药物/保健品方面具有广泛的应用前景。此外，本发明的制备方法制备过程操作简单、适合大规模生产。
附图说明
图1是本发明实施例1中杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物的薄层色谱(TLC)图；
图2是本发明实施例1中杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物的HPLC图；
图3是本发明实施例2中杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物对DPPH的清除率图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
实施例1Penicillium sp.YX-002发酵提取物的制备
(1)将菌株YX-002(已于2022年1月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:62179)冻存管置于温度28℃、湿度80％的霉菌培养箱活化过夜；将菌种接种到预先灭菌的海水马铃薯液体培养基(马铃薯汁 500mL，葡萄糖20g，蛋白胨5g，海盐20g，加入纯水至1L，于1×105Pa灭菌 30min)中摇床培养4d，得到种子液。
(2)将种子液接种于大米培养基(大米50g/瓶，海水60mL/瓶，1×105Pa 灭菌30min)的锥形瓶中(1L)，共接种50瓶，于室温下培养30天，待菌丝体完全充满于培养基中发酵结束。
(3)发酵所得菌饼用甲醇：二氯甲烷＝1:1(体积比)进行浸泡，重复提取三次，合并蒸干后用乙酸乙酯进行萃取，萃取液经浓缩蒸干后得到中间产物。
(4)中间产物利用正相硅胶色谱进行柱层析；具体的，将中间产物与空白硅胶(200-300目)按重量比＝1:2充分拌样后获得样品硅胶，采用干法装柱首先加入200-300目空白硅胶，而后在上层平铺样品硅胶(样品硅胶：空白硅胶体积比为1:7)，柱子上端铺一层棉花防止平面被溶剂冲垮。依次采用以正己烷、正己烷-乙酸乙酯体积比1:9、3:7、1:1、7:3进行洗脱，收集正己烷/乙酸乙酯体积比7:3组分C2，再经凝胶柱层析，采用氯仿:甲醇体积比1:1进行洗脱。而后再进行正相硅胶色谱柱层析进行分离，采用乙酸乙酯洗脱后得到成品。
将所得成品采用TLC、HPLC进行分析。其中，TLC采用正己烷:乙酸乙酯＝10:1为展开剂；HPLC为Agilent 1200D，色谱柱尺寸为4.6mm×100mm，色谱柱填料为PhenomenexKinetex C18
Figure BDA0003474467520000051
检测器为DAD，检测波长254.4nm。流动相为甲醇-水，其洗脱程序为：0-3min 60％甲醇等度洗脱，3-18min 60％-100％甲醇梯度洗脱，18-23min 100％甲醇等度洗脱，23-25min 100％-60％甲醇梯度洗脱，25-30min 60％甲醇等度洗脱，流速为0.6mL/min。具体结果如图1、图2所示。/>
实施例2杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物在抗氧化方面的应用
1.实验方法：
选择在96孔板中测定样品的抗氧化能力，首先将实施例1中发酵提取物的样品浓度调整为0.03mg/mL、0.06mg/mL、0.12mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、 1.00mg/mL，然后进行实验。其中，实验分组为：实验组(每孔加入10μL样品溶液，自然晾干后加入50μL DMSO溶液和50μL 0.16mM DPPH)、实验对照组 (加入样品晾干后加入50μL DMSO溶液和50μL甲醇溶液)、空白组(不加样品，其他同实验组)、空白对照组(不加样品其他同实验对照组)，每组做3 个平行。最后将96孔板置于暗处30min后，通过酶标仪测定517nm处的吸光度。阳性对照组为维生素C，采集数据后以下式计算清除率。
Figure BDA0003474467520000061
其中，A空白为空白组的吸光度，A空白对照为空白对照组的吸光度，A实验为实验组的吸光度，A实验对照为实验对照组的吸光度。
2、实验结果
具体实验结果见下表。
Figure BDA0003474467520000062
由上表可以看出：本发明的杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物在0.03mg/mL、0.06mg/mL、0.12mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、 1.00mg/mL时均有抗氧化活性，且基本与剂量浓度正相关，其EC50＝0.27mg/mL。此外，当用量为1mg/mL时，本发明的杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002 发酵提取物的清除率与维生素C(清除率＝96.5％)相近。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物作为活性成分在制备清除DPPH自由基的药物或保健品中的应用，其中，杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002于2022年1月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：62179；
所述杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物的制备方法为：
(1)将杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002活化，活化后接种至海水马铃薯培养基，培养得到种子液；
(2)将种子液接种至大米培养基，在20～35℃发酵10～50天，得到发酵产物；
(3)将所述发酵产物采用提取溶剂提取1～3次，合并提取液后干燥，再采用萃取溶剂萃取，干燥得到中间产物；
(4)将所述中间产物采用分离溶剂进行柱层析分离，即得到发酵提取物；
其中，所述提取溶剂选用甲醇和二氯甲烷，其体积比为1:1；
所述分离溶剂依次为正己烷、体积比为1:9的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为3:7的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为1:1的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为7:3的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为1:1的氯仿甲醇混合溶剂、乙酸乙酯。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述海水马铃薯培养基的组成为：马铃薯汁100～800mL/L，葡萄糖10～50g/L，蛋白胨0.5～10g/L，海盐5～50g/L；
所述大米培养基的组成为：大米20～100g/60mL，1～3wt％海盐。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述海水马铃薯培养基的组成为：马铃薯汁500mL/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，海盐20g/L；
所述大米培养基的组成为：大米50g/60mL，1.42wt％海盐。
4.一种杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002活化，活化后接种至海水马铃薯培养基，培养得到种子液；其中，杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002于2022年1月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：62179；
(2)将种子液接种至大米培养基，在20～35℃发酵10～50天，得到发酵产物；
(3)将所述发酵产物采用提取溶剂提取1～3次，合并提取液后干燥，再采用萃取溶剂萃取，干燥得到中间产物；
(4)将所述中间产物采用分离溶剂进行柱层析分离，即得到发酵提取物；
其中，所述提取溶剂选用甲醇和二氯甲烷，其体积比为1:1；
所述分离溶剂依次为正己烷、体积比为1:9的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为3:7的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为1:1的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为7:3的正己烷乙酸乙酯混合溶剂、体积比为1:1的氯仿甲醇混合溶剂、乙酸乙酯。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述海水马铃薯培养基的组成为：马铃薯汁100～800mL/L，葡萄糖10～50g/L，蛋白胨0.5～10g/L，海盐5～50g/L；
所述大米培养基的组成为：大米20～100g/60mL，1～3wt％海盐。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述海水马铃薯培养基的组成为：马铃薯汁500mL/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，海盐20g/L；
所述大米培养基的组成为：大米50g/60mL，1.42wt％海盐。
7.一种杨叶肖槿内生真菌Penicillium sp.YX-002发酵提取物，其特征在于，其由如权利要求4～6任一项所述的制备方法制备而得。
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