CN114989180B - 杨叶肖槿内生真菌来源的化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了式（Ⅰ）化合物及其药学上可接受的盐；本发明还公开了该化合物的制备方法，以及以该化合物为活性成分的药物组合物，以及该化合物的用途。本发明提供的化合物能显著抑制AChE；在制备治疗阿尔兹海默症的药物中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种杨叶肖槿内生真菌来源的化合物及其制备方法与应用。
背景技术
阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease，AD），是一种慢性神经退行性疾病，多发于65岁以上的老年人。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害和执行功能障碍等为特征。目前AD已成为全球范围内亟需解决的社会问题和医学问题。目前关于AD的特征性病理变化研究发现，患者大脑表面会出现β-淀粉样蛋白（amyloid-protein, Aβ）的异常沉积，形成老年斑；以及患者脑内Tau蛋白过度磷酸化，在神经细胞内形成神经元纤维缠结，并伴有神经胶质细胞的增生。关于AD的发病机制主要有“β-淀粉样蛋白（Aβ）假说”，“Tau蛋白假说”，“氧化应激学说”，“金属离子代谢紊乱学说”，“神经炎症假说”，“胆碱能损伤学说”等。其中胆碱能损伤学说是最早提出的关于AD的发病机制学说，也是目前大部分AD药物研发的理论基础。该假说认为胆碱能活性丧失与AD患者的病症严重程度有关。对AD患者进行尸检发现，其基底前脑区域神经元丢失，乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶活力下降，从而导致胆碱摄取合成能力降低，学习记忆功能的减退和认知功能障碍。因此，研制出可以改善体内胆碱系统功能的药物一直是治疗AD疾病的重要方向之一。
乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）属于丝氨酸水解酶类，主要存在于神经系统中，其活性中心主要由酶解部位、阴离子和与疏水性区域三部分组成。AChE是生物神经传导中的一种关键性酶，能够催化胆碱能突触间隙的神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）水解成胆碱和乙酸，终止信号刺激，阻断神经信号在体内的正常传递。而现有研究表明ACh是参与学习和记忆的最重要的神经递质，故提高脑内ACh水平可有效改善AD患者的认知和学习记忆能力。乙酰胆碱脂酶抑制剂（Acetylcholinesteraseinhibitor，AChEI）是一种能对AChE进行可逆性抑制的物质，它可使ACh在突触处积累，含量增加，保证神经信号在体内的正常传递，从而改善学习和记忆等功能，是目前临床上最为广泛使用的AD治疗药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种杨叶肖槿内生真菌来源的化合物及其制备方法与应用，以便为阿尔兹海默症的治疗提供更多的药物选择。
具体的，本发明提供了下述通式（Ⅰ）所式的化合物：
（Ⅰ）
此外，按照本发明所述技术领域中的一些通常方法，本发明的上式（Ⅰ）可与制备成药学上可接受的盐。
具体的，将本发明中的化合物中加入常规的辅料，按照常规工艺，可以制成药学上可接受的各种剂型，如片剂、胶囊剂、口服液、注射剂、软膏剂、颗粒剂、混悬剂或缓释剂等，但不限于此。其中，辅料可包括药学领域常见的粘合剂、润滑剂、崩解剂、稀释剂、助溶剂、稳定剂、悬浮剂等，但不限于此。
具体的，发明人在对式（Ⅰ）的化合物的研究证明，该化合物对AChE具有良好抑制作用，其IC50值为27.6μmol/L；基于此，本发明提供了下述式（Ⅰ）的化合物的几种用途：
具体的，在本发明的一个实施例中，本发明提供了式（Ⅰ）化合物及其在药学上可接受的盐作为活性组分在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
在本发明的另一个实施例中，本发明提供了式（Ⅰ）化合物及其在药学上可接受的盐抑制脑内神经递质乙酰胆碱的药物中的应用。
相应的，本发明还提供了式（Ⅰ）化合物的制备方法，具体的包括：将杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp.YX-002接种至培养基中，通过发酵、提取、分离后得到；
其中，所述杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp.YX-002于2022年1月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市，保藏编号为GDMCC No.62179。
具体的，在本发明的一个实施例中，式（Ⅰ）化合物的制备方法为：
（1）将杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp.YX-002接种至培养基中培养发酵，得到发酵产物；
具体的，步骤（1）包括：
（1.1）将杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp. YX-002活化；
具体的，将杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp. YX-002置于温度为20~30℃、湿度为60~90 %（RH）的培养箱中活化。
（1.2）将活化后的杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp.YX-002接种至海水马铃薯培养基，培养得到孢子液；
具体的，海水马铃薯培养基的组成为：马铃薯汁100~800mL/L，葡萄糖10~50g/L，蛋白胨0.5~10g/L，海盐5~50g/L。接种前在0.5×105~3×105Pa下灭菌10~40min。优选的，在本发明的一个实施例中，海水马铃薯培养基的组成为：马铃薯汁500mL/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，海盐20g/L。
其中，马铃薯汁的制备方法为：马铃薯去皮，洗净切块，加入去离子水，加热煮沸10~30min，过滤即得，每100g土豆煮100mL土豆汁。
具体的，接种量为10~20g菌落平板/400mL培养基。接种后在摇床培养3~4天，得到孢子液。
（1.3）将所述孢子液接种至大米培养基，在20~35℃发酵10~50天，即得到发酵产物。
具体的，大米培养基的组成为：大米20~100g/60mL海水，海水中海盐的含量为25~35g/L。接种前在0.5×105~3×105Pa下灭菌10~40min。优选的，在本发明的一个实施例中，大米培养基的组成为：大米50g/60mL海水，海水中海盐的浓度为30g/L。
具体的，孢子液的接种量为1~8vol%，优选的为4vol%。发酵温度为20~35℃，发酵时间为10~50天；优选的，发酵温度为25~30℃，发酵时间为30天。
（2）将所述发酵产物经提取溶剂提取、萃取溶剂萃取、分离溶剂与半制备HPLC分离，并收集保留时间为25.6min的洗脱液，即得到产物。
具体的，步骤（2）包括：
（2.1）将发酵产物采用提取溶剂提取1~3次，合并提取液后干燥，得到粗提物；
具体的，提取溶剂选用甲醇和/或二氯甲烷，但不限于此。优选的，提取溶剂选用甲醇和二氯甲烷，进一步优选的，提取溶剂选用甲醇和二氯甲烷，两者的体积比为1:1。
（2.2）将粗提物采用萃取溶剂萃取，干燥得到中间产物；
具体的，萃取溶剂选用乙酸乙酯，但不限于此。萃取后蒸干，即得到中间产物。
（2.3）将所述中间产物采用分离溶剂进行柱层析，而后通过半制备HPLC分离，即得到式（Ⅰ）化合物；
具体的，所述分离溶剂选用正己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲醇中的一种或多种，但不限于此。优选的，分别正己烷-乙酸乙酯（体积比为1:1，2:3，3:7，1:4）梯度淋洗，所述正己烷-乙酸乙酯（体积比为2:3）洗脱部分，再经正相硅胶柱，用正己烷-乙酸乙酯（体积比为1:1，2:3，3:7，1:4，1:9，0:1）梯度洗脱，收集得到正己烷-乙酸乙酯（体积比为2:3）组分后经凝胶柱层析，采用氯仿:甲醇（体积比1:1）进行洗脱后，最后通过半制备HPLC分离，并收集保留时间为25.6min的洗脱液，即得到产物。具体的，半制备HPLC以体积比为1:1的甲醇和水为流动相，流速为2mL/min，检测波长为254nm，但不限于此。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明提供的化合物能显著抑制AChE，其IC50值为27.6μmol/L，在制备治疗阿尔兹海默症的药物中具有广泛的应用前景。此外，发明的化合物来源于杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp. YX-002，其提取分离的方法简单，成本低廉。
附图说明
图1是本发明实施例1中化合物的核磁共振氢谱；
图2是本发明实施例1中化合物的核磁共振碳谱；
图3是本发明实施例1中化合物的实验CD与计算ECD曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
实施例1 (R)-3-异丙基-4-甲基呋喃[3,4-b]喹啉-1,9(3H,4H)-二酮的制备
本实施例中的杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp.YX-002于2022年1月4日保存在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCCNO：62179。
具体的制备方法为：
（1）将杨叶肖槿内生真菌Penicilliumsp.YX-002冻存管置于温度28℃、湿度80%的霉菌培养箱活化过夜；将菌种接种到预先灭菌的海水马铃薯液体培养基（马铃薯汁500mL，葡萄糖20g，蛋白胨5g，海盐20g，加入纯水至1L，于1×105Pa灭菌30min）中摇床培养4d，得到种子液。
（2）将种子液接种于大米培养基（大米50g/瓶，海水60mL/瓶，1×105Pa灭菌30min）的锥形瓶中（1L），共接种50瓶，于室温下培养30天，待菌丝体完全充满于培养基中发酵结束。
（3）发酵所得菌饼用甲醇:二氯甲烷（体积比=1:1）进行浸泡，重复提取三次，合并蒸干后用乙酸乙酯进行萃取，萃取液经浓缩蒸干后得到中间产物。
（4）中间产物利用正相硅胶色谱进行柱层析；具体的，将中间产物与空白硅胶（200~300目）按重量比=1:2充分拌样后获得样品硅胶，采用干法装柱首先加入200~300目空白硅胶，而后在上层平铺样品硅胶（样品硅胶:空白硅胶体积比为1:7），柱子上端铺一层棉花防止平面被溶剂冲垮。而后分别用正己烷-乙酸乙酯（体积比为1:1，2:3，3:7，1:4）梯度淋洗，所述正己烷-乙酸乙酯（体积比为2:3）洗脱部分，再经正相硅胶柱，用正己烷-乙酸乙酯（体积比为1:1，2:3，3:7，1:4，1:9，0:1）梯度洗脱，收集得到正己烷-乙酸乙酯（体积比为2:3）组分后经凝胶柱层析，采用氯仿:甲醇（体积比1:1）进行洗脱后，最后通过半制备HPLC分析，流动相为甲醇-水（体积比为1:1），流速为2mL/min，相应获得产物(t R =25.6min，2.5mg)。
对实施例1中的化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：白色固体，熔点：251~253℃；ESI-MS:258[M+H]+；HR-ESI-MS:258.1342[M+H]+(理论值：258.1336)（具体参表1）。结合化合物的1H和13C NMR可知分子式为C15H15NO3，不饱和度Ω为9。并通过比较实验的CD与计算ECD谱图（图1）确定其绝对构型如式（Ⅰ）所示，其IUPAC标准名称为(R)-3-异丙基-4-甲基呋喃[3,4-b]喹啉-1,9(3H,4H)-二酮【(R)-3-isopropyl-4-methylfuro[3,4-b]quinoline-1,9(3H,4H)-dione】。
表1 化合物的13C和1H NMR (125 MHz, 500MHz)数据
实施例2 AChE抑制实验
对实施例1中的喹啉酮类化合物进行AChE抑制实验：
通过优化的Ellman’s比色法测定式（Ⅰ）化合物对AChE的体外抑制活性。称取实施例1所得的化合物用甲醇溶解为100μg/mL，采用倍半梯度稀释法对样品进行稀释后，向96孔板中每孔加100μL，等待样品中有机溶剂挥干。再依次往96孔板中每孔加入1μL的DMSO，49μLPBS、10μL 0.2U/mL AChE和20μL DTNB，将96孔板置于37℃培养箱保温10min。然后往每个孔加入20μL ATCI，继续于37℃培养箱孵育。20min后，通过酶标仪测定λ 405 nm处的光密度值D 405 nm，而后利用下述公式计算化合物对AChE的抑制率。
抑制率=[（D control−D blank）−（D sample−D sample blank）]/（D control−D blank）
其中D sample blank为加入样品和BSA，但不加入AChE的光密度，D sample为加入样品和AChE的光密度，D control为加入AChE但不加入样品的光密度，D blank为加入BSA但不加入样品和AChE的光密度。
最后将抑制率和浓度对数(lnC)导入Origin 9.1软件。通过三次多项式回归方程拟合得到浓度对数曲线，计算得到IC50，IC50值是化合物对AChE抑制为50 %所对应的浓度。结果测得该化合物对AChE具有良好抑制作用，其IC50值为27.6 μmol/L。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.式（Ⅰ）化合物或其药学上可接受的盐；
。
2.一种药用组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐作为活性组分在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
4.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐作为活性组分在制备抑制脑内神经递质乙酰胆碱的药物中的应用。
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