CN112852635B - 一株产他克莫司生长快速菌株及应用 - Google Patents
一株产他克莫司生长快速菌株及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株通过UV‑ARTP诱变方法筛选到的生长周期明显缩短的筑波链霉菌及其应用。所述菌株为筑波链霉菌ZJBN2001(Streptomyces tsukubensisZJBN2001),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期2020年12月10日,保藏编号CCTCC NO:M 2020883,保藏地址为中国武汉,武汉大学,邮编430072。本发明的有益效果主要体现在:(1)本发明通过UV‑ARTP诱变的方法得到了一株生长周期明显缩短的菌株;(2)采用本发明方法诱变育种获得的筑波链霉菌ZJBN2001,相对原始菌株S1,他克莫司产量提高了100%,能够作为基因工程菌的原始菌株。(3)通过本发明方法可以得到发酵周期显著缩短的菌株,对于工业生产有着巨大的意义。
Description
(一)技术领域
本发明涉及诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法,以及一株通过UV-ARTP 复合诱变筛选得到的产他克莫司的生长快速筑波链霉菌及其应用。
(二)背景技术
当前,随着人们生活水平的逐步提高,一些不健康的生活习惯慢慢催生着身体器官的病变。全世界每年因肝病、肾病需要器官移植的患者不断增加。而在器官移植的过程中可能会出现急性排斥反应和全身感染,合理地运用免疫抑制剂治疗能很大程度地减少移植失败的几率。现在主要在临床上使用的有环孢素A和他克莫司等免疫抑制剂,其中他克莫司对比环孢素A其效果更好且副反应更少。
1984年,日本藤泽制药株式会社(现为安斯泰来制药集团)研究所从分离自日本筑波山土壤的筑波链霉菌发酵液中首次提取到一种大环内酯类抗生素。该菌株名为Streptomyces tsukubaensis No.9993,目前被称为S.tsukubaensis NRRL 18488,是大多数用于他克莫司工业生产的菌株的亲本菌株。这种新发现的抗生素成为首个具有大环内酯结构的免疫抑制剂,其最初被命名为FR900506或FK506,随后被命名为藤霉素 (Fujimycin)和如今广泛使用的名称他克莫司(Tacrolimus)。经过大量的临床试验,他克莫司于1994年由藤泽制药公司在日本上市,同年在美国和德国也开始商业化生产。如今,他克莫司被广泛用作肾,肝和心脏移植的免疫抑制剂,还可用于治疗炎症性皮肤病。此外,由于其神经保护和神经再生活性,它还具有其他临床治疗潜力。
他克莫司是一种23元大环内酯类抗生素,同时是一类高效的免疫抑制剂,兼具抗真菌活性和T细胞增殖抑制能力。他克莫司的免疫抑制活性主要是因其对T细胞增殖的抑制作用,他克莫司进入细胞后首先与细胞溶质受体(如FKBP12)相互作用,其复合物(FKBP12-FK506)能够抑制钙调神经磷酸酶的钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性,从而导致钙调神经磷酸酶不再能使转录因子去磷酸化。而去磷酸化的转录因子是控制T细胞增殖所必需的。
当前全世界范围内由于肝病、肾病等原因需要移植器官的患者数量逐年增加。中国每年需要器官移植的患者人数大概约有30万人。广阔的市场前景使研究他克莫司提产具有巨大的医学意义和经济价值。他克莫司的化学结构复杂,目前多采用微生物发酵法生产,因此筛选优秀的他克莫司生产菌株是一项至关重要的工作。而传统育种是提高菌株次级代谢产物产量的切实有效的方法,其中诱变育种因成本低廉、操作简便被广泛运用于生产菌株的构建。
(三)发明内容
本发明是一株通过UV-ARTP诱变方法筛选到的生长周期明显缩短的筑波链霉菌诱变株及应用。
本发明采用的技术方法是:
一种诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法,所述方法包括:
(1)将待测筑波链霉菌接种至GYM平板26~30℃培养5~7天,取颜色为红色或白色的孢子洗脱至生理盐水中,将洗下的孢子悬液过滤、离心后去除上清液,加入生理盐水重悬后,离心、重新洗脱一次,用生理盐水重悬作为孢子悬液;
(2)步骤(1)孢子悬液稀释至浓度为107~108个/mL,取稀释后的孢子悬液置于紫外灯管下20~30cm处照射1~2min后,接种于GYM培养基中,26~30℃避光培养 24~32h,收集诱变后菌体,使用ARTP诱变仪处理,之后将整个金属载片投入到装有生理盐水的EP管中,充分振荡,从EP管中取液体涂布于GYM固体培养基上, 26~30℃避光培养直至获得突变株;所述ARTP诱变仪处理方式如下:取菌体悬液与等体积10~15%甘油混合于金属载片上并展开均匀,在10~20℃、10~20L/min工作气流量条件下使用ARTP诱变仪处理50~60s,;
(3)步骤(2)所得突变株涂布于GYM固体培养基上,26~30℃培养4~7天至能观测到单菌落,将单菌落用无菌牙签棒戳刺,并且在新的GYM固体培养基,按照顺序重新划单菌落,所得菌株发酵后经液相检测他克莫司产量,选取其中产量最高的菌株,获得所述高产他克莫司筑波链霉菌。
步骤(3)所获得的高产他克莫司筑波链霉菌,可重新作为初始菌株重复步骤(1)~(3)进行下一轮筛选。
本发明还涉及一株筛选获得的生长快速筑波链霉菌菌株——筑波链霉菌ZJBN2001(Streptomyces tsukubensis ZJBN2001),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期2020年12月10日,保藏编号CCTCC NO:M 2020883,保藏地址为中国武汉,武汉大学,邮编430072。
本发明通过UV-ARTP复合诱变得到了一株生长周期缩短且他克莫司产量提升的菌株(该菌株在发酵培养72h菌体的生物量达到最高,在120h其他克莫司的产量达到峰值。而现有一般筑波链霉菌在发酵培养第96~120h才能达到最高生物量,在168h 左右其他克莫司的产量最高),对于生产具有重要意义。
本发明还涉及所述筑波链霉菌ZJBN2001在微生物发酵制备他克莫司中的应用。
具体的,所述应用为:将所述筑波链霉菌ZJBN2001接种至发酵培养基,25~28℃、200~250rpm发酵培养24h以上,获得含他克莫司的发酵液,将发酵液经分离纯化,得到所述他克莫司。
具体的,所述发酵培养基终浓度组成为:葡萄糖5~15g/L,淀粉50~70g/L,糊精20~50g/L,酵母粉15~20g/L,(NH4)2SO4 1~2g/L,CaCO3 5~10g/L,溶剂为水(蒸馏水或自来水),pH 7.0。
优选的发酵培养基组成如下:葡萄糖10g/L,淀粉60g/L,糊精40g/L,酵母粉 20g/L,(NH4)2SO4 1g/L,CaCO3 9g/L,溶剂为蒸馏水,pH 7.0。
所述筑波链霉菌ZJBN2001先接种至种子培养基,培养获得种子液再接种至发酵培养基进行发酵培养,所述种子培养基组成如下:葡萄糖10~20g/L,蛋白胨10~20g/L,酵母粉5~15g/L,CaCO3 1~2g/L,NaCl 5~10g/L,溶剂为水,pH 7.0。
具体的,所述种子培养过程可如下:将产他克莫司的筑波链霉菌接种至GYM平板,28℃培养7天,取颜色为白色或红色的孢子,使用棉花棒将表面孢子洗脱至生理盐水中,将洗下的孢子悬液用带棉花的注射器过滤,12000rpm离心5min后弃上清液,沉淀加入生理盐水重悬后,12000rpm离心5min重新洗脱一次,用生理盐水重悬作为孢子悬液;将孢子悬液接种至种子培养基中,28℃,220rpm培养48h,获得种子液;所述GYM平板终浓度组成为:葡萄糖4g/L,酵母粉4g/L,麦芽提取物 10g/L,碳酸钙2g/L,琼脂20g/L,溶剂为水,pH 7.2;所述种子液培养基终浓度组成为:葡萄糖10g/L,蛋白胨15g/L,酵母粉10g/L,CaCO3 1g/L,NaCl5g/L,溶剂为水,pH 7.0
本发明的有益效果主要体现在:(1)本发明通过UV-ARTP诱变的方法得到了一株生长周期明显缩短的菌株;(2)采用本发明方法诱变育种获得的筑波链霉菌 ZJBN2001(即CCTCC NO:M2020883),相对原始菌株S1,他克莫司产量提高了 100%,能够作为基因工程菌的原始菌株。(3)通过本发明方法可以得到发酵周期显著缩短的菌株,对于工业生产有着巨大的意义。
(四)附图说明
图1为他克莫司结构式。
图2为实施例2摇瓶发酵过程pH变化趋势图;
图3为实施例2摇瓶发酵过程PMV值变化趋势图;
图4为实施例2摇瓶发酵过程他克莫司产量变化趋势图;
图5为实施例3他克莫司标准曲线;
图6为实施例4紫外诱变致死率曲线;
图7为实施例5ARTP诱变致死率曲线;
图8为实施例6初始菌株与诱变菌株摇瓶发酵过程中PMV变化趋势图;
图9为实施例6初始菌株与诱变菌株摇瓶发酵过程中他克莫司产量变化趋势图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为常规生化试剂。
实施例1:对菌株的复合诱变
(1)将筑波链霉菌(Streptomyces tsukubensis)S1(浙江工业大学生物工程实验室保藏)接种至GYM固体平板28℃培养7天,取颜色白色或红色的孢子,使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL生理盐水中,将洗下的孢子悬液用带棉花的注射器过滤,过滤后的孢子12000rpm离心5min后去上清液,加入10mL生理盐水重悬后, 12000rpm离心5min重新洗脱一次,用5mL生理盐水重悬作为孢子悬液。
(2)UV-ARTP诱变方法:取10mL稀释后的孢子悬液(稀释到孢子浓度为107个/mL)置于紫外灯管(15W,254nm)下20cm处照射90s后,接种于GYM培养基中,28℃避光培养36h,收集诱变后菌体,使用ARTP仪处理,处理方式:每1mL 菌体悬液取5μL与等体积10%甘油混合于金属载片上展开均匀,在10℃、10L/min 通气量条件下使用ARTP诱变仪处理60s。处理结束后将整个金属载片投入到装有 990μL生理盐水的1.5mL EP管中,充分振荡。每个上述EP管中取100μL液体涂布于GMY固体培养基上,28℃避光培养直至获得突变株。每次实验均采用3组平行。对于每轮诱变所获得的高产菌株,重新作为初始菌株按相同步骤进行下一轮筛选。突变次数、突变率和致死率如表1所示。
表1:紫外-ARTP复合诱变过程
对于每轮诱变获得的高产菌株,重新作为初始菌株按照上述方法进行复合诱变。在诱变过程中,不仅获得了高产他克莫司的诱变株,同时也获得了一株生长与发酵周期明显缩短的诱变菌株,命名为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubensis)ZJBN2001,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期2020年12月10日,保藏编号CCTCC NO: M 2020883,保藏地址为中国武汉,武汉大学,邮编430072。
本发明不仅限于上述诱变方式。
其中GYM固体培养基的配制:葡萄糖4g/L,酵母粉4g/L,麦芽提取物10g/L,碳酸钙2g/L,琼脂18g/L,溶剂为蒸馏水,pH7.2,115℃灭菌30min。
GYM液体培养基的配制:葡萄糖4g/L,酵母粉4g/L,麦芽提取物10g/L,溶剂为蒸馏水,pH7.2,115℃灭菌30min。
实施例2:摇瓶发酵产他克莫司
(1)种子液的制备:将实施例1制备的生长周期缩短的筑波链霉菌ZJBN2001 (即CCTCC NO:M 2020883)划线至GYM平板,28℃培养3天,挑取单菌落,接种至种子培养基中,28℃,220rpm培养36h,获得种子液。
种子培养基按以下方法配制:葡萄糖10g/L,蛋白胨15g/L,酵母粉10g/L,CaCO31g/L,NaCl 5g/L,溶剂为蒸馏水,pH 7.0。
(2)发酵培养
500mL规格摇瓶装样80mL发酵培养基,发酵时按体积浓度10%接种种子液, 28℃,220rpm发酵培养144h。发酵过程中,其发酵液中pH变化如图2,菌体PMV 值变化如图3,他克莫司产量变化如图4,由图可见,该菌株菌体量在70h左右达到最大值,他克莫司产量在第120h达到峰值。
PMV(%)=(发酵液总体积-上清液总体积)/发酵液总体积×100%,可反映菌体的生物量。
发酵培养基组成:葡萄糖10g/L,淀粉60g/L,糊精40g/L,酵母粉20g/L, (NH4)2SO41g/L,CaCO3 9g/L,溶剂为蒸馏水,pH 7.0,115℃灭菌30min。
实施例3:他克莫司的HPLC检测方法
取实施例2方法制备的发酵液,按发酵液:甲醇为1:1的体积比混合,离心管平放至摇床中,28℃水浴210rpm离心振荡5h。振荡后的离心管中取2mL于50℃水浴150min,每隔30min振荡一次。5000rpm离心10min,取上清用0.22μm有机滤膜过膜后通过高效液相色谱(HPLC)检测。
检测方法:色谱柱为C18柱(250×4.6mm,5μm),柱温60℃,流速0.9mL/min,进样量10μL,色谱保留时间22.5min,检测波长为210nm。他克莫司的出峰时间为 19.4min。
其中流动相配制方法:
乙腈:用0.45μm孔径的有机膜进行抽滤,再经过超声脱气20~30分钟即可。
0.1%磷酸水溶液:取超纯水480mL,再加入磷酸480μL,然后用0.45μm的微孔水膜进行抽滤,再经过超声脱气20~30分钟即可。
甲醇:用0.45μm孔径的有机膜进行抽滤,再经过超声脱气20~30分钟即可。
最终流动相的配比为乙腈:0.1%磷酸水溶液:甲醇=65:30:5。
他克莫司产量计算方法:从aladdin公司购买他克莫司的标准品,用无水甲醇配制不同浓度(25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)的他克莫司标准溶液,分别将上述标准液用HPLC检测出峰面积,根据峰面积和他克莫司标准溶液的浓度计算出标准曲线为Y=6.679X+119.9,R2=0.9995(其中Y为峰面积,X为他克莫司的浓度)。将未知浓度的他克莫司样品通过HPLC检测可以得到一个峰面积,带入上述标准曲线公式得出浓度,标准曲线结果如图5所示。
实施例4:紫外最佳诱变时间的确定
紫外诱变时间的不同会影响正突变率的高低,故需确定一个最优的诱变时间。
将实施例1中紫外照射时间分别改为30s、60s、90s、120s,其他紫外诱变条件与实施例2相同。将诱变后的菌液取100μL涂布到GYM固体平板上,于28℃培养4天,统计平板上的单菌落个数,分别计算不同诱变时间的致死率,如图6所示。一般80%致死率左右的诱变条件下正突变率最高,故选择紫外诱变时间为90s。
实施例5:ARTP最佳诱变时间的确定
ARTP诱变时间的不同会影响正突变率的高低,故需确定一个最优的诱变时间。
将实施例1中ARTP仪处理时间分别改为15s、30s、45s、60s、75s、90s、105 s、120s,其他ARTP诱变条件与实施例2相同。将诱变后的菌液取100μL涂布到 GYM固体平板上,于28℃培养4天,统计平板上的单菌落个数,分别计算不同诱变时间的致死率,如图7所示。一般80%致死率左右的诱变条件下正突变率最高,故选择ARTP诱变时间为60s。
实施例6:发酵周期短的诱变菌株
将通过实施例1所述的UV-ARTP复合诱变方法得到的生长速度快、发酵周期短的筑波链霉菌ZJBN2001(即CCTCC NO:M 2020883),按照实施例2的所述方法进行摇瓶发酵实验。同样条件下,以筑波链霉菌(Streptomyces tsukubensis)野生型菌株S1作为对照。
如图8和图9所示,筑波链霉菌ZJBN2001在72h菌体的生物量达到最高,在120h 其他克莫司的产量达到峰值。筑波链霉菌S1在第120h达到最高生物量,在160h左右其他克莫司的产量最高。
Claims (5)
1.一株产他克莫司菌株——筑波链霉菌(Streptomyces tsukubensis)ZJBN2001,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期2020年12月10日,保藏编号CCTCC NO:M 2020883,保藏地址为中国武汉,武汉大学,邮编430072。
2.权利要求1所述筑波链霉菌ZJBN2001在微生物发酵制备他克莫司中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述应用为:将所述筑波链霉菌ZJBN2001接种至发酵培养基,25~28℃、200~250rpm发酵培养24h以上,获得含他克莫司的发酵液,将发酵液经分离纯化,得到所述他克莫司。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为:葡萄糖5~15g/L,淀粉50~70 g/L,糊精20~50 g/L,酵母粉15~20 g/L,(NH4)2SO4 1~2 g/L,CaCO3 5~10g/L,溶剂为水,pH 7.0。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述筑波链霉菌ZJBN2001先接种至种子培养基,培养获得种子液再接种至发酵培养基进行发酵培养,所述种子培养基组成如下:葡萄糖10~20 g/L,蛋白胨10~20 g/L,酵母粉5~15 g/L,CaCO3 1~2 g/L,NaCl 5~10 g/L,溶剂为水,pH 7.0。
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