CN104974214B - 商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu‑17及其制备方法，包括以下步骤：(1)商陆皂苷元活性酯中间体的制备：商陆皂苷元溶于干燥的DMF/THF中，加入N,N‑二环己基碳酰亚胺和N‑羟基苯并三氮唑形成商陆皂苷元活性酯；(2)Hu‑17的合成：在步骤(1)获得的商陆皂苷元活性酯中加入硫酸氨基胍和二甲亚砜，加热搅拌，分离纯化，即得目标产物Hu‑17。为提高商陆皂苷元的活性，对商陆皂苷元进行结构改造获得商陆皂苷元C28衍生物Hu‑17。C28羧基结构是其主要的活性位点，通过化学合成方法，将商陆皂苷元衍生化，获得的化合物Hu‑17具有显著的抗卵巢癌活性。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，更具体地讲，涉及新的具有抗癌活性的商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17及其制备方法和应用。
背景技术
商陆皂苷元(phytolaccagenin，化学名：2β,3β,23-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-30-酸甲酯)是从中药商陆中分离得到的一种活性成分，是商陆皂苷甲(EsculentosideA，EsA)的苷元部分，而本发明中的商陆皂苷元通过酸水解商陆皂苷甲而得到，其结构如下：
研究显示，商陆皂苷甲在体外能显著抑制巨噬细胞释放IL-1、IL-6、TNF、PGE等促炎因子，并能选择性抑制COX-2的活性；动物实验表明，商陆皂苷甲对各种急慢性炎症的动物模型有显著的抗炎作用(Wang Hong-Bin，et a1.Mediators of inflammation 5(4)：292—294，1996；Wang Hong-Bin,et al,Mediators of Inflammation 5(6):196,1996；Dianwen Ju，et al.Pharmacology 1998；鞠佃文等，药学学报34(1):9-12，1999；肖振宇等，中国药理学会通讯，17(4):32,2000；肖振宇等，中国药理学会通讯，17(4):33,2000；郑钦岳等，第二军医大学学报，22(5)：425，2001；肖振宇等，中国药理学报，23(7)：638，2002；ZYXiao,et al.Int J Radiat Oncol,65(3)：882-889,2006；Wang YB,Zhang YC,Zhu ZY,etal.,Bioorg&Med Chem.(15):2528–2532,2007)。但由于商陆皂苷甲有较强的溶血作用，限制了其作 为注射药物的使用。而商陆皂苷元没有溶血作用，因而具有良好的开发前景。为了发现商陆皂苷元的新的活性，我们对商陆皂苷元进行了结构改造。有关具有抗癌活性的商陆皂苷元衍生物的制备，国内外未见有过报导。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17。
本发明的第二个目的在于提供商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17的制备方法。
为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17，其特征在于，所述Hu-17分子式：C63H96N4O11，化学结构式如下：
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)商陆皂苷元活性酯中间体的制备：商陆皂苷元溶于干燥的DMF/THF中，加入N,N-二环己基碳酰亚胺和N-羟基苯并三氮唑形成商陆皂苷元活性酯；
(2)Hu-17的合成：在步骤(1)获得的商陆皂苷元活性酯中加入硫酸氨基胍和二甲亚砜，加热搅拌，分离纯化，即得目标产物Hu-17。
作为一个优选方案，步骤(1)中DMF/THF的体积比为1:3。
作为一个优选方案，步骤(2)的反应条件为氩气或者氮气保护，60—90℃，4—8小时。
本发明的优点在于：为提高商陆皂苷元的活性，对商陆皂苷元进行结构改造获得商陆皂苷元C28衍生物Hu-17。C28羧基结构是其主要的活性位点，通过 化学合成方法，将商陆皂苷元衍生化，获得的化合物Hu-17具有显著的抗卵巢癌活性。
附图说明
图1化合物Hu-17抑制卵巢癌细胞：A)化合物Hu-17(1.25μM、2.5μM、3.75μM、5μM)处理A2780细胞24、48和72小时；B)化合物Hu-17(2.5μM、3.75μM、5μM)处理HO-8910细胞24、48和72小时；C)化合物Hu-17(2.5μM、3.75μM、5μM)处理HO-8910PM细胞24、48和72小时；D)化合物Hu-17(2.5μM、3.75μM、5μM)处理SK-OV-3细胞24、48和72小时。MTT比色法检测细胞相对活力，计算细胞生长抑制情况。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均值±标准差(mean±SD)展示。
图2化合物Hu-17能显著诱导卵巢癌细胞凋亡：A)(a)化合物Hu-17(2.5μM、3.75μM)处理A2780和SK-OV-3细胞42小时流式细胞仪检测的Annexin V阳性细胞(统计二四象限比例之和)的比例，(b)候选药物(3.75μM、5μM、6.25μM)处理HO-8910和HO-8910PM细胞48小时检测的Annexin V阳性细胞比例。B)选取的HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞在不同药物浓度处理后的凋亡散点图，横坐标代表FITC-Annexin V，纵坐标代表PI，红色散点(即第三象限)代表活细胞，蓝色散点(即第二象限)代表晚期凋亡的细胞，绿色散点(即第四象限)代表早期凋亡的细胞。C)5μM候选药物(Hu-17)处理HO-8910PM细胞48小时线粒体跨膜电位降低的细胞比例。D)线粒体跨膜电位变化的散点图，图中横坐标为Rh123，纵坐标为PI，第四象限表示罗丹明123阳性细胞，一三象限表示膜电位降低的细胞。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图3化合物Hu-17扰乱卵巢癌细胞周期：A)(a)A2780细胞经候选药物(2.5μM)处理48小时后各周期比例的柱状图。(b)HO-8910细胞经候选药物(3.75μM)处理48小时候后各周期比例的柱状图。(c)HO-8910PM细胞经候选药物(3.75μM)处理48小时候后各周期比例的柱状图。B)A2780、HO-8910、HO-8910PM细胞加药前后的周期分布图，图中蓝色部分代表处于S期的细胞， 其左右两侧红色部分分别代表处于G0/G1期和G2/M期的细胞。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示无统计学显著性差异。
图4化合物Hu-17在荷瘤小鼠上显著抑制卵巢癌细胞的生长：A)在裸鼠皮下移植A2780细胞2周后给药(腹腔注射给药，三天两次，5mg/kg/次)并动态监测肿瘤直径，通过公式V＝1/2×a×b2计算出肿瘤体积，并得出相对肿瘤体积(RTV＝Vt/V0，Vt表示实时测量的肿瘤体积，V0表示给药前肿瘤体积)，绘制肿瘤生长曲线，Candidate表示候选新药组，Control表示阴性对照组。B)给药结束3天后(Day31)，脱颈处死裸鼠，将两组瘤体剥离后称得的瘤重。C)给药期间动态监测裸鼠体重的变化绘制成的体重变化曲线。图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用t检验法，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，ns表示无统计学显著性差异。D)两组瘤体剥离后的照片。
图5体外实验证实化合物Hu-17显著增强顺铂对耐药的卵巢癌细胞的生长抑制和诱导凋亡效果：A)A2780、HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经10μM和20μM的顺铂处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。B)HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经20μM顺铂或2.5μMHu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。C)Western blot法检测HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞的蛋白P53的表达。D)流式技术检测HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经20μM顺铂或2.5μM Hu-17单独或联合处理48小时后的凋亡细胞的比例，凋亡细胞以Annexin V阳性细胞的比例显示(统计二四象限)。E)SK-OV-3细胞在20μM顺铂或2.5μM Hu-17处理48小时后的凋亡散点图。F)SK-OV-3细胞在2.5μM Hu-17或20μM顺铂处理12小时后，抽提蛋白检测凋亡指示分子PARP及caspase 3的变化。G)HO-8910细胞经200μM卡铂(Carboplatin)或5μM Hu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。H)SK-OV-3细胞经80μM卡铂或5μM Hu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。M表示候选新药，M+C(combination)表示候选新药与顺铂联合使用。M+carboplatin表示候选新药与卡铂联合使用。各组实验 均独立重复三次，图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图6裸鼠体内实验显示Hu-17与顺铂联合使用显著抑制耐药的卵巢癌细胞的生长：A)裸鼠皮下移植SK-OV-3细胞第13天开始用药，期间动态监测肿瘤大小，通过公示V＝1/2×a×b2和RTV＝Vt/V0分别计算肿瘤体积和相对肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(图a和图c)，图b和图d显示的是最后一次给药时的肿瘤的体积和相对肿瘤体积。B)用药结束后，将各组瘤体剥离得到的瘤体照片及各组瘤重。C)用药期间各组裸鼠体重的变化。D)和E)瘤体剥离后，免疫组织化学方法检测各组肿瘤组织中Ki-67(20X物镜)和CD34(10X物镜)的表达情况，图D柱状图展示Ki-67阳性细胞的倍数变化(各组取三张不同的组织切片分别计数)。图中数据以平均数±标准误(mean±SEM)展示，M表示单用候选新药组，Cis表示单用顺铂组，M+Cis表示两药合用组，组间比较采用双侧t检验法，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示无统计学差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.化合物Hu-17的制备
化合物Hu-17的化学结构式如下式：
分子式：C63H96N4O11，分子量：1084Da。
商陆皂苷元(phytolaccagenin)是从中药商陆中分离得到的一种活性成分， 是商陆皂苷甲(Esculentoside A，EsA)的苷元部分，而本发明中的商陆皂苷元通过酸水解商陆皂苷甲而得到，合成路线如下：
将商陆皂苷元(26.6mg,0.05mmol)溶于干燥的2ml DMF/THF(1:3,v/v)中，加入N,N-二环己基碳酰亚胺(DCC,20.7mg,0.1mmol)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt,13.5mg,0.1mmol),室温搅拌3小时。反应完成后，减压浓缩至干，残留物用二氯甲烷(20ml)溶解、过滤，滤液浓缩至干，加入23mg硫酸氨基胍和5ml二甲亚砜，充N2后密封，油浴(90～95℃)磁力搅拌反应8小时。反应液冷却后加2倍蒸馏水，过滤，沉淀用蒸馏水洗涤2次，50℃烘干，即得Hu-17粗品。粗品再经硅胶柱层层析纯化，洗脱剂：二氯甲烷：甲醇(9.2：0.8)，得Hu-17纯品3.5mg,白色粉末，得率：19.4％。mp 285～7℃；分子式：C63H96N4O11；分子量：1084；ESI-MS高分辨质谱：m/z 1107.6879[M+Na]+,1083.6892[M-H]-；红外光谱(IR)：vmaxcm-13427(OH),2948(CH3,CH2),1729(C＝O),1577,1462,1213,1150,1051(C-O-C)。
实施例2.Hu-17的合成
2.1 商陆皂苷元活性酯的制备
将商陆皂苷元533mg溶于10ml的DMF和THF(1:3,v/v)混合溶剂中,加入162mg羟基苯駢三唑(HOBt)和248mg二环己基碳酰亚胺(DCC)溶于其中。然后，室温磁力搅拌反应6小时。反应完成后，减压浓缩至干，残留物用20ml二氯甲烷溶解，过滤，滤液浓缩至干，即为商陆皂苷元活性酯粗品。粗品再经200～300目硅胶柱层层析，二氯甲烷：甲醇(30：1)为洗脱剂，得纯品商陆皂苷元活性酯373.1mg,得率：70％。
2.2 Hu-17的合成
将325mg商陆皂苷元活性酯和258mg硫酸氨基胍溶于25ml二甲亚砜(DMSO)中，充N2后密封。油浴(90～95℃)磁力搅拌反应8小时。反应液冷却后加2倍蒸馏水，过滤，沉淀用蒸馏水洗涤2次，50℃烘干，得Hu-17粗品。粗品再经硅胶柱层析纯化，洗脱剂：二氯甲烷：甲醇(9.2：0.8)，得Hu-17纯品66mg,白色粉末，得率：20.3％。
实施例3.化合物Hu-17单独或联合铂类药物在制备治疗卵巢癌药物中的应用
实验材料及方法：
1 实验材料
1.1 实验用细胞系和裸鼠
实验过程中所用的人卵巢癌细胞系SK-OV-3购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。人卵巢癌细胞系A2780、HO8910以及HO8910PM由中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所方靖研究员友情馈赠。实验用裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.2 实验主要试剂及材料
1.3主要实验仪器设备
2 实验方法
2.1 药物的配制
细胞用化合物Hu-17和顺铂的配制：称取一定质量的Hu-17，常温条件以DMSO(Sigma)溶剂溶解，配成20mM母液置于-20℃保存。顺铂以无菌PSB缓冲液配制，配成10mM母液于-20℃保存。
动物用化合物Hu-17和顺铂的配制：称取一定质量的Hu-17，常温以DMSO(Sigma)溶液溶解，配成100mg/ml母液，小体积分装至小EP管中于-20℃保存。用时以含有2％吐温80的生理盐水稀释，稀释成2mg/ml，混匀后置37℃放置一段时间，待药物完全溶解后再注射给药；称取一定质量的顺铂，无菌PBS缓冲液溶解配成1.25mg/ml母液，用时以适量的生理盐水稀释。
2.2 细胞培养
A2780、HO8910和HO8910PM卵巢癌细胞系培养于含有90％RPMI-1640培液和10％胎牛血清(FBS)的培养液中，SK-OV-3卵巢癌细胞系培养于含有90％McCOY’S5A培液和10％胎牛血清的培养液中。
所有细胞放置于含有5％二氧化碳的37℃培养箱中培养。根据细胞密度和 增殖速度情况，A2780细胞一般每2～3天传代一次，HO8910、HO8910PM以及SK-OV-3细胞每3～4天传代一次。
2.3 细胞活力的检测(MTT法)
卵巢癌细胞活力检测：48孔细胞培养板中接种3×104cells/孔的单细胞悬液500μl，培养24小时待细胞完全贴壁后替换含有不同药物浓度或不同种类药物的新鲜培液。在各加药时间点(0，24，48，72小时)结束后，每孔加入50μl5mg/ml的thiazolyl bluetetrazolium bromide(噻唑兰)溶液，37℃培养箱孵育3h后，吸除上清溶液，加入500μlDMSO溶液，脱色摇床上摇晃充分溶解紫色结晶，酶标仪上570nm吸收波长检测样品吸光值，每个药物处理组设三复孔，最终结果为三次独立实验所得。
2.4 细胞凋亡的磷脂酰丝氨酸外翻检测
卵巢癌细胞加药处理细胞凋亡的检测：联合使用FITC-Annexin V(激发波长488nm,最大发射波长525nm)和Propidium Iodide(激发波长488，最大发射波长617nm)双荧光染料可以检测凋亡的细胞并区分早期凋亡与晚期凋亡的细胞。提前一天于6孔板中接种2×105个细胞，药物处理一定时间点后(48小时或42小时)，胰酶消化并收集全部细胞(包括收集上清)，每管收集1×105以上的细胞，以2000rmp离心速度离心5分钟，离心结束后去除上清，加入500μl PBS缓冲液重悬一次，2000rmp离心5分钟，离心结束后弃上清，每管再加入500μl 1×AnnexinV binding buffer重复离心去上清步骤，最后每管加入200μl 1×AnnexinV binding buffer，5μl PI以及2.5μl FITC标记的AnnexinV抗体，混匀后室温避光标记15分钟，最后于流式细胞仪上检测。每次试验至少检测10000个细胞，各组实验均独立重复三次。
2.5 线粒体跨膜电位的检测
在细胞凋亡发生过程中，由于线粒体内膜通透性发生变化，线粒体跨膜电位会降低。利用亲脂性阴离子染料罗丹明123和检测细胞存活的PI染料可用来检测线粒体膜电位的变化以研究药物诱导的细胞凋亡。加药前一天于6孔板中接种2×105个细胞，加药处理48小时后，胰酶消化收集各组细胞，用吸出的上清终止消化过程，每管收集1×105以上的细胞，2000rpm离心5分钟，弃 上清，用500μl PBS缓冲液重悬细胞，再以2000rpm 5分钟离心，离心结束后弃上清，每管加入100μl PBS及100μl罗丹明123染料，37℃避光孵育30分钟，孵育结束后2000rpm离心5分钟并弃上清，用500μl PBS清洗一次并重复离心处理，最后每管加入300μl PBS，3μl 1mg/ml的PI，混匀并于流式细胞仪上检测，每次试验至少检测10000个细胞，各组实验均独立重复三次。
2.6 细胞周期的检测
对于卵巢癌细胞系，在加药前一天于6孔板中接种2×105个细胞，加药处理一定时间点后，胰酶消化收集细胞，每管收集2×105个细胞，2000rpm离心5分钟，离心结束后弃掉上清，用1ml PBS缓冲液重悬为单细胞悬液，再以2000rpm 5分钟，弃上清，重复以上步骤，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，最后加入500μl含0.5％皂素，0.1mg/ml Rnase A，50μg/ml PI的PBS溶液(皂素用于细胞打孔)，混匀后将流式管置于37℃培养箱中避光标记10～15分钟，标记结束后上流式仪检测。每次试验至少检测10000个细胞，各组实验均独立重复三次。对于慢性粒细胞白血病细胞，加药当天6孔板中铺板2×105个细胞，加药处理24或48小时后，收集细胞，其后处理方式同卵巢癌细胞一致。
2.7 蛋白质水平的检测
2.7.1 细胞总蛋白的裂解与提取
收集加药处理的不同时间点的细胞(5-10×106)于15ml离心管中，4℃2000rpm离心5分钟，去掉上清，加入1ml预冷的PBS重悬细胞，将单细胞悬液转移至1.5ml EP管中，2000rpm离心5分钟，去掉上清后，加入适量含有蛋白酶体抑制剂以及磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，涡旋混匀并于冰上孵育30分钟，期间间隔涡旋2次，12000rpm 4℃离心10分钟，吸取上清至新1.5ml EP管中。
2.7.2 蛋白浓度的定量
蛋白定量采用DC protein assay试剂盒，根据Lowry法原理测定蛋白浓度。具体步骤：96孔板依次加入2μl蛋白样品，25μl A’试剂(A’试剂由试剂盒中1mlA试剂和20μlS试剂混合配得)，200μl B试剂，室温静置15分钟后，酶标仪吸收波长设置为750nm检测。蛋白标准曲线由BSA蛋白标准品分别配成0.1、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/ml的不同浓度梯度的蛋白溶液测得，蛋白样品与标准品分别做三复孔以保证数据稳定可靠。
2.7.3 SDS-PAGE及蛋白免疫印迹
将适量的5×蛋白loading buffer加入到定量后的蛋白样品中，涡旋混匀后置于100℃沸水中煮沸10分钟，煮好的样品可直接进行SDS-PAGE电泳或置于-80℃中保存。首先配备不同丙烯酰胺浓度的SDS-PAGE胶，待胶完全凝固后(可4℃过夜保存)，加入适当体积的蛋白样品(30μg)，于BIO-RAD蛋白电泳仪上电泳，电压设置为80～120V，电泳时间设置为120分钟；电泳结束后继续进行转膜(NC膜)实验，设置电流200mA，时间为120分钟，转膜结束后，蛋白样品将由PAGE胶迁移至NC膜上；待转膜实验结束后，将NC膜放在滤纸上风干，用含有5％脱脂牛奶或5％BSA的的TBST溶液室温封闭1小时；封闭完成后，一抗4℃过夜孵育；1×TBST洗5次，每次5分钟；用辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗室温孵育1小时；二抗孵育结束后，1×TBST洗5次，每次5分钟；用ECL plus western blotting reagent试剂于暗室显色曝光X光片，将曝光后的X光片用高密扫描仪扫描成清晰数据图片。
2.8 裸鼠皮下卵巢癌异种转移模型的建立及给药方案
本模型全部采用6～8周龄雌性BALB/c品系来源的裸鼠。A2780或SK-OV-3细胞消化后，加入适当的培养液混合终止消化并制成单细胞悬液，再次离心，用无血清培养液重悬，离心反复洗涤2次，细胞密度控制在2×107～4×107cells/ml，用1ml无菌注射器吸取100μl单细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝或右侧脂肪垫处。
给药方案：A2780接种的裸鼠(7周龄雌性裸鼠)在接种15天后，随机成2组，(给)生理盐水组和化合物Hu-17给药组，每组3只老鼠，腹腔注射候选新药(化合物)Hu-17,3天给药2次，每次剂量为5mg/kg，给药时间为2周；生理盐水组以同样方式给以同等体积的生理盐水。SK-OV-3接种的裸鼠，待肿瘤长到约4～5mm后(第13天)，随机分为四组(生理盐水组，单给顺铂组，单给候选新药(化合物)组，两药合用组)，每组6只裸鼠，给药时间为4周，单给顺铂组通过腹腔注射方式给药，每2天给药一次，剂量为1.2mg/kg；单给 候选新药组通过尾静脉注射的方式给药，每2天给药一次，剂量为3.75mg/kg；联合用药组给药方式及剂量同上，同一天给药，2天给药一次；生理盐水组给予注射同等体积的生理盐水。给药期间每周用游标卡尺测量肿瘤直径2次，每周测量小鼠体重一次。给药结束后，颈椎脱臼法处死裸鼠，将肿瘤剥离，称重，并用预冷的4％多聚甲醛固定。
肿瘤体积(tumor volume,TV)计算公式：V＝1/2×a×b2，其中a表示肿瘤长度，b表示肿瘤宽度。由测量得出肿瘤体积再计算相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0，V0表示分组后开始给药当天测量所得的肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积。相对肿瘤增值率T/C(％)的计算：T/C％＝TRTV/CRTV×100％，其中TRTV表示治疗组的相对肿瘤体积，CRTV表示阴性对照组的相对肿瘤体积。肿瘤生长抑制率的计算：肿瘤生长抑制率＝(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。
2.9 组织包埋、切片及免疫组织化学实验
石蜡包埋和切片：用梯度酒精脱水，二甲苯透明后，将组织放于蜡箱中浸蜡包埋，石蜡切片仪进行切片作业，切片厚度为4～6μm。
切片脱蜡及水化：依次将切片放入二甲苯Ⅰ，20分钟-二甲苯Ⅱ，20分钟-无水乙醇Ⅰ，10分钟-无水乙醇Ⅱ，10分钟-95％酒精，5分钟-80％酒精，5分钟-70％酒精，5分钟-蒸馏水冲洗。
抗原修复：采用微波修复法，将组织切片置于含有EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中，并于微波炉内进行修复。中火8分钟，停火8分钟，中低火7分钟(此过程应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片)。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤三次，每次5分钟。
阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％过氧化氢溶液中，室温避光孵育25分钟，孵育结束后将玻片放置PBS中于脱色摇床上晃动洗涤三次，每次5分钟。
抗体孵育：切片稍甩干后以组化笔在组织周围画圈以防抗体流失，在圈内滴加含有一定稀释比例一抗的5％BSA溶液，湿盒内4℃孵育过夜；一抗孵育完成后，玻片置于PBS中洗涤3次，每次5分钟，稍甩干后在圈内滴加相应 的二抗溶液(辣根过氧化物酶标记)，室温孵育50分钟。
DAB显色：玻片置于PBS中洗涤3次，每次5分钟。稍甩干后圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水洗涤切片终止显色。
复染细胞核：Harris苏木素复染细胞核3分钟，自来水冲洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
脱水封片：将切片依次置于70％酒精，5分钟-80％酒精，5分钟-90％酒精，5分钟-95％酒精，5分钟-无水乙醇Ⅰ，5分钟-无水乙醇Ⅱ，5分钟-二甲苯Ⅰ，5分钟-二甲苯Ⅱ，5分钟，脱色透明，待切片稍晾干后，用中性树胶封片。
2.10 统计学分析
实验数据采用专业的GraphPad Prism5软件作图并做出相应统计学分析结果，两组间比较采用student t test(双侧t检验)检测组间有无统计学差异，多组之间比较采用单因素方差分析，图中ns表示无统计学差异，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。通过抑制细胞生长的能力、诱导细胞凋亡的能力、对细胞周期的影响以及体内用药抗卵巢癌的能力(药效体内试验)四个方面评价化合物Hu-17对卵巢癌细胞的毒性效应和杀伤作用。
我们选用四株卵巢癌细胞系(A2780、HO-8910、HO-8910PM、SK-OV-3)作为研究对象，已有文献报道，A2780是顺铂(cisplatin)敏感细胞株(HenkelsKM,Turchi JJ.Cancerresearch,1997,57(20):4488-4492.)，SKOV3是对顺铂固有耐药的细胞株(Johnson SW,Swiggard PA,Handel LM,et al.Cancer research,1994,54(22):5911-5916.)。
实验结果见图1，图1说明：化合物Hu-17抑制卵巢癌细胞活力表现为剂量-时间依赖型。
化合物Hu-17处理卵巢癌细胞A2780、HO-8910、HO-8910PM以及SK-OV-3细胞24、48、72小时后，MTT法检测细胞相对活力(以各时间点0μM浓度组(即DMSO组)为对照组，相对细胞活力＝各药物浓度组OD值/对照组OD值)，以相对细胞活力为指标绘制不同细胞在各药物浓度处理下的生长曲线(图1)。从图中数据可得知Hu-17对四株卵巢癌细胞生长抑制作用强弱依次为： A2780>HO-8910>HO-8910PM>SK-OV-3；在5μM剂量下，Hu-17均能显著抑制卵巢癌细胞生长和增殖。
图2说明：化合物Hu-17能显著诱导细胞凋亡。以FITC-Annexin V和P I双荧光染料标记不同药物浓度处理一定时间点的卵巢细胞A2780、HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3检测候选新药诱导卵巢癌细胞凋亡的能力，流式细胞仪检测各标记阳性细胞群比例，结果如图2。对于A2780和SK-OV-3细胞(图2A-a)，候选新药3.75μM处理42小时能显著诱导细胞发生凋亡，候选新药对顺铂耐药细胞株SK-OV-3细胞清除强于对顺铂敏感株A2780细胞的清除；对于HO-8910和HO-8910PM细胞(图2A-b)，候选新药3.75μM浓度处理48小时均能显著诱导细胞凋亡，随着药物浓度增加，凋亡细胞的比例也逐步增加。此外，我们检测了化合物Hu-17处理HO-8910PM 48小时后线粒体跨膜电位的变化，发现Hu-17处理后线粒体膜电位变化明显(图2C)，这些结果与细胞凋亡检测结果具有一致性。
图3说明：化合物Hu-17处能扰乱卵巢癌细胞周期。我们利用皂素打孔和PI标记DNA的周期检测方法检测卵巢癌细胞在候选药物处理后各细胞周期的变化(如图3)。对于A2780细胞，在2.5μM浓度的候选药物处理48小时后，细胞周期发生很大的变化。G0/G1期和S期细胞比例变化较大，表现为G0/G1期比例上升，S期细胞比例下降，变化均具有统计学显著性差异(P<0.001)，细胞周期的明显阻滞与A2780细胞对候选药物较高的敏感性相关。对于HO-8910和HO-8910PM细胞，候选药物对其周期阻滞效果相对不明显；HO-8910细胞G0/G1期比例未有明显变化，S期细胞比例有所下降，G2/M期细胞比例略微上升。HO-8910PM细胞G0/G1细胞比例略微下降，G2/M期细胞增加。
以上细胞周期数据说明，候选药物能显著改变卵巢癌的细胞周期，尤其对A2780细胞周期阻滞作用最明显，细胞周期阻滞方式及强弱与细胞类型有一定关系。候选药物引起卵巢癌细胞周期阻滞结果和诱导细胞凋亡结果与药物抑制细胞活力的结果相对应，显示了体外实验中候选药物对卵巢癌细胞的毒性效应。
图4说明：化合物Hu-17能抑制荷瘤小鼠中卵巢癌细胞的生长。我们利用裸鼠皮下移植瘤模型评价候选新药治疗卵巢癌的效果。A2780细胞皮下接种6～8周龄的雌性裸鼠，每只裸鼠接种2×106个细胞，接种15天(肿瘤大小肉眼可见)后随机分组(生理盐水组和候选新药组，每组各4只裸鼠)，给药方案为3天2次腹腔注射给药，候选新药剂量为5mg/kg/次。我们根据测量的肿瘤直径(长和宽)计算得到肿瘤的体积(V＝1/2×a×b2，其中a表示肿瘤长度，b表示肿瘤宽度)，计算得到相对肿瘤体积(RTV＝Vt/V0)，根据相对肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线(如图4A)。给药结束后处死小鼠，并称量肿瘤质量，发现给化合物Hu-17组肿瘤质量明显减少(P<0.05)，且该剂量下，化合物Hu-17对小鼠的体重影响较小，显示一定的低毒副作用(图4C)。
图5体外实验证实化合物Hu-17显著增强顺铂对耐药的卵巢癌细胞的生长抑制和诱导凋亡效果：A)A2780、HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经10μM和20μM的顺铂处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。B)HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经20μM顺铂或2.5μMHu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。C)Western blot法检测HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞的蛋白P53的表达。D)流式技术检测HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经20μM顺铂或2.5μM Hu-17单独或联合处理48小时后的凋亡细胞的比例，凋亡细胞以Annexin V阳性细胞的比例显示(统计二四象限)。E)SK-OV-3细胞在20μM顺铂或2.5μM Hu-17处理48小时后的凋亡散点图。F)SK-OV-3细胞在2.5μM Hu-17或20μM顺铂处理12小时后，抽提蛋白检测凋亡指示分子PARP及caspase 3的变化。G)HO-8910细胞经200μM卡铂(Carboplatin)或5μM Hu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。H)SK-OV-3细胞经80μM卡铂或5μM Hu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。M表示候选新药，M+C(combination)表示候选新药与顺铂联合使用。M+carboplatin表示候选新药与卡铂联合使用。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图6裸鼠体内实验显示Hu-17与顺铂联合使用显著抑制耐药的卵巢癌细 胞的生长：A)裸鼠皮下移植SK-OV-3细胞第13天开始用药，期间动态监测肿瘤大小，通过公示V＝1/2×a×b2和RTV＝Vt/V0分别计算肿瘤体积和相对肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(图a和图c)，图b和图d显示的是最后一次给药时的肿瘤的体积和相对肿瘤体积。B)用药结束后，将各组瘤体剥离得到的瘤体照片及各组瘤重。C)用药期间各组裸鼠体重的变化。D)和E)瘤体剥离后，免疫组织化学方法检测各组肿瘤组织中Ki-67(20X物镜)和CD34(10X物镜)的表达情况，图D柱状图展示Ki-67阳性细胞的倍数变化(各组取三张不同的组织切片分别计数)。图中数据以平均数±标准误(mean±SEM)展示，M表示单用候选新药组，Cis表示单用顺铂组，M+Cis表示两药合用组，组间比较采用双侧t检验法，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示无统计学差异。
总结卵巢癌部分实验结果：
通过MTT比色法我们发现，新化合物Hu-17能显著抑制卵巢癌A2780、HO8910、HO8910PM以及SK-OV-3细胞的活力，该化合物抑制细胞活力的特征表现为时间剂量依赖特征(图1)。
通过磷酯酰丝氨酸外翻实验以及线粒体跨膜电位检测实验我们发现，化合物Hu-17单独使用能显著诱导卵巢癌细胞发生凋亡(图2)。
通过细胞周期检测实验，我们发现化合物Hu-17能显著扰乱卵巢癌细胞周期，尤其对A2780细胞周期阻滞作用最为明显(图3)。
裸鼠体内实验表明，化合物Hu-17能显著抑制卵巢癌细胞A2780在裸鼠体内的生长，且在有效剂量下对裸鼠的体重影响较小，显示一定的低毒副作用(图4)。
化合物Hu-17与卵巢癌一线治疗药物顺铂或卡铂联合使用能诱导卵巢癌细胞发生凋亡，联合用药对P53缺失的且顺铂耐药的SK-OV-3细胞诱导凋亡作用更明显，实验结果显示Hu-17与顺铂或卡铂联合使用能增强卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性，特别是增强了对铂类药物耐药的卵巢癌细胞的清除作用(图5)。
化合物Hu-17与顺铂联合的体内实验表明，联合用药能显著抑制耐药的卵 巢癌细胞SK-OV-3的生长，Hu-17与顺铂联合除能抑制肿瘤细胞增殖(细胞核增殖抗原Ki67表达减少)外，还能抑制肿瘤组织内部微血管的生成(CD34表达量减少)；此外，我们还观察到联合用药方案对裸鼠的体重影响较弱，显示出较低的毒性(图6)。
对于耐药的卵巢癌患者，Hu-17单独使用或与顺铂(或卡铂)联合使用具有非常好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17，其特征在于，所述Hu-17分子式：
C63H96N4O11，化学结构式如下：
2.权利要求1所述商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)商陆皂苷元活性酯中间体的制备：商陆皂苷元溶于干燥的DMF/THF中，加入N,N-二环己基碳酰亚胺和N-羟基苯并三氮唑形成商陆皂苷元活性酯；
(2)Hu-17的合成：在步骤(1)获得的商陆皂苷元活性酯中加入硫酸氨基胍和二甲亚砜，加热搅拌，分离纯化，即得目标产物Hu-17，其中反应条件为氩气或者氮气保护，60—90℃，4—8小时。
3.根据权利要求2所述的商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17的制备方法，其特征在于，步骤(1)中DMF/THF的体积比为1:3。
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