CN107643396A

CN107643396A - 一种免疫组化抗原修复方法

Info

Publication number: CN107643396A
Application number: CN201710833476.7A
Authority: CN
Inventors: 王航; 王大平
Original assignee: Rugao Fu Fu Engineering Technology Research Institute Co Ltd
Current assignee: Rugao Fu Fu Engineering Technology Research Institute Co Ltd
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2018-01-30

Abstract

本发明涉及一种免疫组化抗原修复方法，本技术方案通过蛋白酶K和脂肪酶与传统修复方法配合使用，寻找更佳的抗原修复方式，达到更好的免疫组化染色结果。蛋白酶K与柠檬酸高温高压修复配合使用，增强了大部分胞膜和胞核抗原的染色结果，特别是CD3、CD20、ER、ki‑67、p53和PR。脂肪酶虽然对部分抗原的作用不明显，甚至会产生负面的影响，例如CD3、CD20、CD56、CK516、PgP和PR，但是对部分抗原的染色效果依然有增强，特别是ER和p53。可见，对于胞膜和胞核定位的抗原，蛋白酶K能增强染色结果，特别是ER和ki‑67，增强效果达到50％以上。

Description

一种免疫组化抗原修复方法

技术领域

本发明属于免疫组织化学技术领域，特别是指一种免疫组化抗原修复方法。

背景技术

在免疫组化过程中，福尔马林固定的副作用是一个不可控因素，会对组织产生负面影响，使得抗原决定簇与甲醛交联，导致第一抗体无法与抗原结合，最终导致假阴性结果，而抗原修复能逆转福尔马林固定产生的有害影响。

许多学者报告中都显示抗原修复在病理诊断中的应用取得了良好的效果，它提高了抗原修复的再现性以及免疫组化标准化措施的可能性，寻找更佳的抗原修复方式，达到更好的免疫组化染色结果，促进免疫组化标准化、免疫组化质量控制及半定量的发展是本领域的重要课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫组化抗原修复方法，以实现更化的免疫组化染色结果，促进免疫组化标准化。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种免疫组化抗原修复方法，包括以下步骤：

1)脱蜡和水化，将组织切片分别在二甲苯、无水乙醇、乙醇溶液及蒸馏水中浸泡；

2)将经过脱蜡和水化后的组织节片用PBS冲洗，滴加配制好的蛋白酶K溶液或者脂肪酶溶液，室温孵育10分钟；

3)抗原修复，根据不同的抗原选择相应的修复方法；

4)甩去PBS，用PAP笔在组织切片周围画圈，油圈距离组织切片边缘2-3mm；

5)封闭内源性过氧化物酶，在组织切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10分钟，然后用PBS冲洗；

6)甩去PBS，每张组织切片加1滴或50μl的第一抗体，室温下孵育60分钟或4℃过夜，用PBS冲洗；

7)甩去PBS液，每张组织切片加1滴或50μl即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育10-15分钟，用PBS冲洗；

8)甩去PBS液，每张组织切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，

9)自来水冲洗，苏木素复染20秒，PBS浸泡20秒返蓝；如果DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。

在步骤1)中，二甲苯浸泡为在两个置有二甲苯的容器内，分别浸泡10分钟。

在步骤1)中，无水乙醇浸泡为在两个置有无水乙醇的容器内，分别浸泡5分钟。

在步骤1)中，在乙醇溶液中浸泡为，分别在95％乙醇中浸泡5分钟，在85％乙醇中浸泡5分钟，在70％乙醇中浸泡5分。

在步骤2)、步骤5)及步骤7)中的PBS冲洗均为冲洗三次。

在步骤9)中的梯度酒精脱水干燥是指使用酒精的溶液逐渐增高至无水乙醇。

在步骤1)前还包括将组织切片在60℃恒温箱烘烤20分钟。

本发明的有益效果是：

本技术方案通过蛋白酶K和脂肪酶与传统修复方法配合使用，寻找更佳的抗原修复方式，达到更好的免疫组化染色结果。

蛋白酶K与柠檬酸高温高压修复配合使用，增强了大部分胞膜和胞核抗原的染色结果，特别是CD3、CD20、ER、ki-67、p53和PR。

脂肪酶虽然对部分抗原的作用不明显，甚至会产生负面的影响，例如CD3、CD20、CD56、CK516、PgP和PR，但是对部分抗原的染色效果依然有增强，特别是ER和p53。可见，对于胞膜和胞核定位的抗原，蛋白酶K能增强染色结果，特别是ER和ki-67，增强效果达到50％以上。

附图说明

图1为CD3免疫组化结果图；

图2为CD20免疫组化结果图；

图3为CD56免疫组化结果图；

图4为CK516免疫组化结果图；

图5为ER免疫组化结果图；

图6为ki-67免疫组化结果图；

图7为P53免疫组化结果图；

图8为PgP免疫组化结果图；

图9为RP免疫组化结果图；

图10为TopoⅡ免疫组化结果图。

附图标记说明

A：柠檬酸高温高压修复(100倍视野)；B：柠檬酸高温高压修复(400倍视野)；C：蛋白酶K+柠檬酸高温高压修复(100倍视野)；D：蛋白酶K+柠檬酸高温高压修复(400倍视野)；E：脂肪酶+柠檬酸高温高压修复(100倍视野)；F：脂肪酶+柠檬酸高温高压修复(400倍视野)；G：蛋白酶K+EDTA高温修复(100倍视野)；H：蛋白酶K+EDTA高温修复(400倍视野)；I：脂肪酶+EDTA高温修复(100倍视野)；J：脂肪酶+EDTA高温修复(400倍视野)。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

本申请各实施例的主要试剂和试剂盒：

蛋白酶K溶液(天根生化科技有限公司)；脂肪酶(实验室保存或自制)；CD3、CD20、CD56、CK516、ER、ki-67、P53、PgP、PR、TopoⅡ一抗(福州迈新生物技术开发有限公司)。

主要溶液的配制：

蛋白酶K修复液：蛋白酶溶液(20mg/ml)，无菌PBS溶液定容终浓度为20mg/L。

脂肪酶修复液：0.02g脂肪酶，无菌双蒸水定容至1L。

EDTA抗原修复液：30.27g Tris，1.461g EDTA(乙二胺四乙酸)，蒸馏水定容至5000ml，调节pH值至9.0。

组织切片由福州买新生物技术开发有限公司提供。

一种免疫组化抗原修复方法，包括以下步骤：

1)脱蜡和水化

脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱烘烤20分钟。

置于二甲苯I中浸泡10分钟，在二甲苯II中再浸泡10分钟；

无水乙醇I中浸泡5分钟，在无水乙醇II中再浸泡5分钟；

95％乙醇中浸泡5分钟；

85％乙醇中浸泡5分钟；

70％乙醇中浸泡5分钟；

蒸馏水中浸泡5分钟。

2)切片用PBS冲洗3次，每次3分钟，滴加配制好的蛋白酶K溶液或者脂肪酶溶液，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟。

3)抗原修复，根据不同抗原选择相应修复方法。此处的抗原修复为现有技术，在此不进行详细的说明。

4)甩去PBS，用PAP笔在组织片周围画圈，油圈距离组织片边缘2-3mm。

5)封闭内源性过氧化物酶：在切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3×3分钟。

6)甩去PBS，每张切片加1滴或50μl的第一抗体，室温下孵育60分钟或4℃过夜。PBS冲洗3×5分钟。

7)甩去PBS液，每张切片加1滴或50μl即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育10-15分钟。PBS冲洗3×3分钟。

8)甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-5分钟(DAB)。

9)自来水冲洗，苏木素复染20秒，PBS浸泡20秒返蓝。如果DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。梯度酒精脱水干燥是指使用酒精的溶液逐渐增高至无水乙醇，梯度的范围根据需要进行设定。

还可以包括显微镜下观察并拍照。

如图1至图10所示，本申请中共列举了CD3、CD20、CD56、CK516、ER、ki-67、P53、PgP、PR、TopoⅡ共10种抗原，抗原所在位置包括了细胞核、细胞质以及细胞膜。以正常染色作对照，比较新抗原修复方式对结果的影响。

从三种不同细胞定位的蛋白入手，其中，细胞表面因子CD3、CD20和CD56定位于胞膜；细胞角蛋白516定位于胞浆；雌激素受体(ER)、细胞核增殖抗原ki-67、肿瘤抑制蛋白p53、孕激素受体PR、拓扑异构酶TopoⅡ定位于胞核；P-糖蛋白(PgP)定位于胞膜和胞浆。

在这十种抗原中，CD3、CD20、CD56定位于胞膜；ER、PR、p53、ki-67和TopoⅡ定位于胞核；CD516定位于胞浆；PgP同时定位于胞膜和胞浆。这十种抗原的最佳修复方式都是采用柠檬酸高温高压修复，从分析结果可以看出，CD3、CD20、ER、ki-67、p53、PR和TopoⅡ在经过蛋白酶K或者脂肪酶处理后染色强度均大于正常修复，其中CD3、CD20、ER、ki-67、p53和PR经过蛋白酶K处理后效果更为明显。ER、ki-67、p53和TopoⅡ在脂肪酶处理后染色结果强于正常修复组。而且我们可以发现，胞核蛋白ER、ki-67和PR在经过蛋白酶K处理后染色效果大大增强。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求极其等同限定。

Claims

1.一种免疫组化抗原修复方法，其特征在于，包括以下步骤：

3)抗原修复，根据不同的抗原选择相应的修复方法；

2.根据权利要求1所述的免疫组化抗原修复方法，其特征在于，在步骤1)中，二甲苯浸泡为在两个置有二甲苯的容器内，分别浸泡10分钟。

3.根据权利要求1所述的免疫组化抗原修复方法，其特征在于，在步骤1)中，无水乙醇浸泡为在两个置有无水乙醇的容器内，分别浸泡5分钟。

4.根据权利要求1所述的免疫组化抗原修复方法，其特征在于，在步骤1)中，在乙醇溶液中浸泡为，分别在95％乙醇中浸泡5分钟，在85％乙醇中浸泡5分钟，在70％乙醇中浸泡5分。

5.根据权利要求1所述的免疫组化抗原修复方法，其特征在于，在步骤2)、步骤5)及步骤7)中的PBS冲洗均为冲洗三次。

6.根据权利要求1所述的免疫组化抗原修复方法，其特征在于，在步骤9)中的梯度酒精脱水干燥是指使用酒精的溶液逐渐增高至无水乙醇。

7.根据权利要求1所述的免疫组化抗原修复方法，其特征在于，在步骤1)前还包括将组织切片在60℃恒温箱烘烤20分钟。