KR102605775B1 - 보체 성분 Ｃ5 ｉＲＮＡ 조성물 및 그 이용 방법 - Google Patents

보체 성분 Ｃ5 ｉＲＮＡ 조성물 및 그 이용 방법 Download PDF

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클라우스 채리스
무티아 마노하란
마틴 마이어
칼란토타틸 지. 라지브
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Abstract

본 발명은 보체 성분 C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA, 예를 들어, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA), 조성물, 및 C5의 발현을 억제하고, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, 발작성 야간혈색소뇨증을 갖는 피검자를 치료하기 위한 그러한 iRNA, 예를 들어, dsRNA, 조성물의 이용 방법에 관한 것이다.

Description

보체 성분 Ｃ5 ｉＲＮＡ 조성물 및 그 이용 방법{COMPLEMENT COMPONENT C5 IRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2013년 3월 14일에 출원된 미국 가출원 제61/782,531호, 2013년 6월 20일에 출원된 미국 가출원 제61/837,399호, 및 2013년 11월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/904,579호, 2013년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 제61/912,777호 및 2014년 2월 20일에 출원된 미국 가출원 제61/942367호의 이익을 주장한다. 전술한 가출원 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고, 그의 전체가 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 포함한다. 2014년 3월 10일에 생성된 상기 ASCII 카피는 121301-00520_SL.txt로 명명되며, 734,486 바이트 크기이다.
보체는 1890년대에 처음 발견되었으며, 그때, 그것은 정상 혈청에 존재하는 열-안정성 항체에 의한 박테리아의 사멸을 보조하거나 "보충"하는 것으로 관찰되었다(Walport, M.J. (2001) N Engl J Med. 344:1058). 보체 시스템은 혈액 중 가용성 단백질로 존재하거나, 막-회합 단백질로 존재하는 30개 초과의 단백질로 구성된다. 보체의 활성화는 보체 활성화 경로로 알려져 있는 순차적인 효소 반응의 캐스케이드를 야기하여, 주화성에서 아폽토시스(apoptosis)에 이르는 많은 생리적 반응을 유도하는 강력한 아나필라톡신(anaphylatoxin) C3a 및 C5a의 형성을 초래한다. 처음에는, 보체는 침입 병원체에 대하여 강하고 신속한 반응을 시작하는 선천성 면역에서 주요 역할을 수행하는 것으로 여겨졌다. 그러나 최근에는 보체가 병원체의 제거(Dunkelberger JR and Song WC. (2010) Cell Res. 20:34; Molina H, 등 (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93:3357), 병원체 재침입을 방지하는 면역 기억의 유지를 돕고, 수많은 인간 병태에 연루되는(Qu, H, et al. (2009) Mol Immunol. 47:185; Wagner, E. and Frank MM. (2010) Nat Rev Drug Discov. 9:43) T 및 B 세포를 수반하는 획득 면역에서 중요한 역할을 수행한다는 증거가 증가하고 있다.
보체 활성화는 이어서, 순차적으로 절단되고 활성화되는 불활성 자이모겐(zymogen)으로 대부분 존재하는 단백질을 수반하는 3가지 상이한 경로, 대체 경로, 고전 경로 및 렉틴 경로(도 1)를 통해 발생하는 것으로 알려져 있다. 보체 활성화의 모든 경로는 C5 분자의 절단을 야기하여, 아나필라톡신 C5a 및 이후에 최종 보체 복합체(C5b-9)를 형성하는 C5b를 생성한다. C5a는 다양한 면역 및 비-면역 세포에서 발현되는 고전의 G-단백질 결합 수용체 C5aR(CD88) 및 비-G 단백질 결합 수용체 C5L2(GPR77)와의 상호작용을 통해 뚜렷한 염증유발 활성을 발휘한다. C5b-9는 막 공격 복합체(MAC)의 형성을 통해 세포용해를 유발하며, 하위-용해(sub-lytic) MAC 및 가용성 C5b-9는 또한, 다수의 비-세포용해 면역 기능을 지닌다. C5 절단으로부터 생성되는 이들 2개의 보체 이펙터(effector), C5a 및 C5b-9는 발작성 야간혈색소뇨증, 류마티스 관절염, 허혈-재관류 손상 및 신경변성 질병을 포함하는 상이한 질병에서 병적이상의 전파 및/또는 개시의 원인이 되는 보체 시스템의 주요 성분이다.
현재까지, C5-C5a 축을 표적으로 하는 오직 하나의 치료제, 항-C5 항체, 에쿨리주맙(eculizumab)(Soliris®)만이 보체 성분 C5-관련 질병의 치료에 이용가능하다. 에쿨리주맙이 발작성 야간혈색소뇨증(PNH) 및 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)의 치료에 효율적인 것으로 보이고, 현재 추가의 보체 성분 C5-관련 질병용으로 임상 시험에서 평가되고 있지만, 에쿨리주맙 치료법은 연간 약 400,000 달러의 비용으로, 주마다의 고용량 주입에 이어서, 격주의 유지 주입을 필요로 한다. 따라서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자를 위한 대체 요법 및 병용 요법이 당업계에 필요하다.
요약
본 발명은 C5 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)-매개의 절단을 야기하는 iRNA 조성물을 제공한다. C5 유전자는 세포, 예를 들어, 피검자, 예컨대 인간 내의 세포에 존재할 수 있다. 또한, 본 발명은 C5 유전자의 발현을 억제하기 위한 C5 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)-매개의 절단을 야기하는 iRNA 조성물을 사용하는 C5 유전자의 발현을 억제하거나 감소시키는 것으로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, 발작성 야간혈색소뇨증(PNH) 및 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)을 갖는 피검자를 치료하기 위한 방법 및 병용 요법을 제공한다.
따라서, 일 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제를 제공하며, 여기서, dsRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제를 제공하며, 여기서, dsRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥은 A-118320, A-118321, A-118316, A-118317, A-118332, A-118333, A-118396, A-118397, A-118386, A-118387, A-118312, A-118313, A-118324, A-118325, A-119324, A-119325, A-119332, A-119333, A-119328, A-119329, A-119322, A-119323, A-119324, A-119325, A-119334, A-119335, A-119330, A-119331, A-119326, A-119327, A-125167, A-125173, A-125647, A-125157, A-125173 및 A-125127로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에서의 서열 중 어느 하나로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제를 제공하며, 여기서, dsRNA 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA(SEQ ID NO: 62)를 포함하며, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUU(SEQ ID NO: 113)를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 후술되는 바와 같은 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 이중-가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이며, 센스 가닥은 3'-말단에 부착된 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 변형 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드로 된 짧은 서열이다. 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 및 3'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 3'-말단에서 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 변형 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠금(locked) 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에 있어서, 변형 뉴클레오티드는 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드로 된 짧은 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상보성 영역은 길이가 적어도 17개 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 상보성 영역은 길이가 19 내지 21개 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, 상보성 영역은 길이가 19개 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드로 된 3' 오버행을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드로 된 3' 오버행을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 리간드를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는 dsRNA 작용제의 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체이다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는
Figure 112021145756847-pat00001
이다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 하기의 도식에 나타낸 바와 같이 리간드에 컨쥬게이트된다:
Figure 112021145756847-pat00002
상기 식에서, X는 O 또는 S이다.
일 실시형태에 있어서, X는 O이다.
일 실시형태에 있어서, 상보성 영역은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나의 안티센스 서열 중 하나로 구성된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 AD-58123, AD-58111, AD-58121, AD-58116, AD-58133, AD-58099, AD-58088, AD-58642, AD-58644, AD-58641, AD-58647, AD-58645, AD-58643, AD-58646, AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650, 및 AD-62651로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제를 제공하며, 여기서, dsRNA 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA(SEQ ID NO: 62)를 포함하며, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUUdTdT(SEQ ID NO: 2899)를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제를 제공하며, 여기서, dsRNA 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuAfauaL96(SEQ ID NO: 2876)을 포함하며, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT(SEQ ID NO: 2889)를 포함한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서 보체 성분 C5의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 여기서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00003
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np, np', nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, i는 0이거나; j는 0이거나; i는 1이거나; j는 1이거나; i 및 j 둘 모두는 0이거나; i 및 j 둘 모두는 1이다.
일 실시형태에 있어서, k는 0이거나; l은 0이거나; k는 1이거나; l은 1이거나; k 및 l 둘 모두는 0이거나; k 및 l 둘 모두는 1이다.
일 실시형태에 있어서, XXX는 X'X'X'에 상보적이며, YYY는 Y'Y'Y'에 상보적이고, ZZZ는 Z'Z'Z'에 상보적이다.
일 실시형태에 있어서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, Y'Y'Y' 모티프는 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 11, 12 및 13 위치에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, Y'는 2'-O-메틸이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 (III)은 화학식 (IIIa)로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00004
다른 실시형태에 있어서, 화학식 (III)은 화학식 (IIIb)로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00005
상기 식에서,
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 1 내지 5개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 (III)은 화학식 (IIIc)로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00006
상기 식에서,
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 1 내지 5개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 (III)은 화학식 (IIId)로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00007
상기 식에서,
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 1 내지 5개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, Na 및 Na'는 각각 독립적으로 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 15 내지 30개 뉴클레오티드 쌍이다.
일 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 17 내지 23개 뉴클레오티드 쌍이다. 다른 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 17 내지 25개 뉴클레오티드 쌍이다. 다른 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 23 내지 27개 뉴클레오티드 쌍이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19 내지 21개 뉴클레오티드 쌍이다. 다른 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 21 내지 23개 뉴클레오티드 쌍이다.
일 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 15 내지 30개 뉴클레오티드를 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 상의 변형은 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-히드록실 및 그들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 상의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통하여 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는
Figure 112021145756847-pat00008
이다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 하기의 도식에 나타낸 바와 같이 리간드에 컨쥬게이트된다:
Figure 112021145756847-pat00009
일 실시형태에 있어서, 상기 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합은 하나의 가닥의 3'-말단에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 가닥은 센스 가닥이다.
일 실시형태에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 가닥은 센스 가닥이다.
일 실시형태에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합은 하나의 가닥의 5'- 및 3'-말단 둘 모두에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥이다.
일 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서의 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
일 실시형태에 있어서, Y 뉴클레오티드는 2'-플루오로 변형을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, Y' 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, p'는 0 초과이다.
일 실시형태에 있어서, p'는 2이다.
일 실시형태에 있어서, q'는 0이고, p는 0이며, q는 0이고, p'개 오버행 뉴클레오티드는 표적 mRNA에 상보적이다.
일 실시형태에 있어서, q'는 0이고, p는 0이며, q는 0이고, p'개 오버행 뉴클레오티드는 표적 mRNA에 비-상보적이다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 총 21개 뉴클레오티드를 가지며, 안티센스 가닥은 총 23개 뉴클레오티드를 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 np'가 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결된다.
일 실시형태에 있어서, 모든 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결된다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 표 4, 표 18, 표 19 또는 표 23에 열거된 RNAi 작용제의 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 AD-58123, AD-58111, AD-58121, AD-58116, AD-58133, AD-58099, AD-58088, AD-58642, AD-58644, AD-58641, AD-58647, AD-58645, AD-58643, AD-58646, AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 및 AD-62651로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서 보체 성분 C5의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 보체 성분 C5를 인코딩(encoding)하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이고, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00010
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np, np', nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트된다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서 보체 성분 C5의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 보체 성분 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이고, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00011
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
np, nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
np'는 0 초과이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트된다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서 보체 성분 C5의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 보체 성분 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이고, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00012
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
np, nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
np'는 0 초과이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되고, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서 보체 성분 C5의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 보체 성분 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이고, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00013
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
np, nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
np'는 0 초과이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되고, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서 보체 성분 C5의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 보체 성분 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이고, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00014
상기 식에서,
np, nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
np'는 0 초과이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
YYY 및 Y'Y'Y'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내고, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이며;
센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되고, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하여, 이중 가닥 영역을 형성하고, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며, 센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함하고, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며, 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함하고, 센스 가닥은 3'-말단에서 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 19 내지 30개 뉴클레오티드를 갖는다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제를 함유하는 세포를 제공한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 dsRNA 작용제의 적어도 하나의 가닥을 인코딩하는 벡터를 제공하며, dsRNA 작용제는 보체 성분 C5를 인코딩하는 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 영역을 포함하고, dsRNA는 길이가 30개 이하의 염기쌍이고, dsRNA 작용제는 절단을 위해 mRNA를 표적으로 한다.
일 실시형태에 있어서, 상보성 영역은 길이가 적어도 15개 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 상보성 영역은 길이가 19 내지 21개 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 19 내지 30개 뉴클레오티드를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제를 포함하는, 보체 성분 C5 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 비완충 용액 중에 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 비완충 용액은 염수 또는 물이다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 완충 용액과 함께 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 완충 용액은 아세트산염, 시트르산염, 프롤라민, 탄산염 또는 인산염 또는 그들의 임의의 조합을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 완충 용액은 인산염 완충 염수(PBS)이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제 및 지질 제형을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 지질 제형은 LNP를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 지질 제형은 MC3을 포함한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 19, 표 18, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 안티센스 폴리뉴클레오티드 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 19, 표 18, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 센스 폴리뉴클레오티드 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 표 4, 표 6, 표 18, 표 19, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 변형된 안티센스 폴리뉴클레오티드 작용제를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 표 4, 표 6, 표 18, 표 19, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 센스 폴리뉴클레오티드 작용제를 제공한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 치료적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, 피검자를 치료하는 단계를 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자에서의 적어도 하나의 증상의 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 치료적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애를 갖는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 치료적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, 피검자를 치료하는 단계를 포함하며, 안티센스 가닥은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자에서의 적어도 하나의 증상의 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 예방적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애를 갖는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함하며, 안티센스 가닥은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 이중 가닥 RNAi 작용제를 피검자에게 투여하는 단계를 포함하며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하여, 이중 가닥 영역을 형성하고, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이며, 센스 가닥은 3'-말단에서 하나 이상의 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 투여는 피하 투여이다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 dT 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 dT 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 변형 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드로 된 짧은 서열이다. 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 및 3'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 3'-말단에서 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 예방적 유효량의 이중 가닥 RNAi 작용제를 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자에서의 적어도 하나의 증상의 예방 방법을 제공하고, 이중 가닥 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하여 이중 가닥 영역을 형성하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이며, 센스 가닥은 3'-말단에서 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, 투여는 피하 투여이다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 dT 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 dT 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 변형 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드로 된 짧은 서열이다. 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 및 3'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 3'-말단에서 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하는, 치료적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자를 치료하는 단계를 포함하며, 안티센스 가닥은 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00015
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np, np', nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트됨으로써, 피검자를 치료하고, 이로써 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자를 치료한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자에서의 적어도 하나의 증상의 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하는, 예방적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함하며, 안티센스 가닥은 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00016
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np, np', nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트됨으로써, C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애를 갖는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하고, 이로써 보체 성분 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방한다.
일 실시형태에 있어서, 피검자로의 dsRNA의 투여는 혈관내 용혈의 감소, 헤모글로빈 수준의 안정화 및/또는 C5 단백질 축적의 감소를 야기한다.
일 실시형태에 있어서, 장애는 보체 성분 C5-관련 질병이다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병은 발작성 야간혈색소뇨증(PNH), 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS), 천식, 류마티스 관절염(RA); 항인지질 항체 증후군; 루푸스 신장염; 허혈-재관류 손상; 전형적 또는 감염성 용혈성 요독 증후군(tHUS); 고밀도침착병(DDD); 시신경척수염(NMO); 다초점 운동 신경병증(MMN); 다발성 경화증(MS); 황반 변성(예를 들어, 연령-관련 황반 변성(AMD)); 용혈, 상승된 간 효소 및 혈소판 감소(HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판 감소 자반증(TTP); 자연 유산(spontaneous fetal loss); 파우시-면역 혈관염(Pauci-immune vasculitis); 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa); 재발성 유산(recurrent fetal loss); 전자간증, 외상성 뇌 손상, 중증근육무력증, 저온응집병, 피부근염 수포성 유천포창, 쉬가 독소 이. 콜라이-관련 용혈성 요독 증후군, C3 신장병증, 항-호중구 세포질 항체-관련 혈관염, 체액 및 혈관 이식 거부, 이식편 기능이상, 심근 경색증, 동종이계 이식, 패혈증, 관상동맥병, 피부근염, 그레이브스병, 죽상동맥경화증, 알츠하이머병, 전신 염증 반응 패혈증, 패혈쇼크, 척수 손상, 사구체신염, 하시모토 갑상선염, I형 당뇨병, 건선, 천포창, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), ITP, 굿파스처 증후군, 데고스병(Degos disease), 항인지질 증후군(APS), 파국적 APS(CAPS), 심혈관 장애, 심근염, 뇌혈관 장애, 말초 혈관 장애, 신장혈관 장애, 장간막/장 혈관 장애, 혈관염, 헤노호-쉔라인 자반병성 신장염, 전신 홍반성 루푸스-관련 혈관염, 류마티스 관절염과 관련된 혈관염, 면역 복합체 혈관염, 다카야스병, 확장성 심근병증, 당뇨병성 혈관병증, 카와사키 병(동맥염), 정맥 기체 색전(VGE) 및 스텐트 삽입 후의 재협착증, 회전죽상반제술(rotational atherectomy), 막 신장병증, 길랭-바레 증후군 및 경혈관 관상동맥 확장술(PTCA)로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병은 발작성 야간혈색소뇨증(PNH)이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병은 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)이다.
일 실시형태에 있어서, 피검자는 인간이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 피검자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단편 C5a 및 C5b로의 보체 성분 C5의 절단을 억제한다. 다른 실시형태에 있어서, 항-보체 성분 C5 항체는 에쿨리주맙이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 수막구균(meningococcal) 백신을 피검자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 900 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 900 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 900 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 1200 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 1200 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 900 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 1200 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 1200 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 2주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 900 mg 미만의 제3 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 900 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 2주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 600 mg 미만의 제3 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 600 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 1주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 300 mg 미만의 제2 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 1주 동안 주마다 약 300 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 300 mg 미만의 제2 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 피검자에서의 혈장분리교환술 또는 혈장 교환을 추가로 포함한다. 그러한 일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 600 mg 미만의 용량으로 또는 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
추가의 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 피검자에서의 혈장 주입을 추가로 포함한다. 그러한 일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량으로 피검자에게 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg 및 15 mg/kg으로 구성된 군으로부터 선택되는 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 정맥내 주입을 통해 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 피검자에게 피하 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg으로 구성된 군으로부터 선택되는 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 주 1회 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 주 2회 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 월 2회 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 피하 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제 및 에쿨리주맙은 피검자에게 피하 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제 및 에쿨리주맙은 피검자에게 동시 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제가 먼저, 피검자에서 보체 성분 C5의 수준을 감소시키기에 충분한 기간 동안 피검자에게 투여되고, 에쿨리주맙은 이후에 약 600 mg 미만의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 피검자에서의 보체 성분 C5의 수준은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 감소된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 100 내지 500 mg의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 피검자에서 헤모글로빈 및/또는 LDH 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA는 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는 dsRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체이다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서의 보체 성분 C5 발현의 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNA 작용제와 세포를 접촉시키는 단계 및 단계 (a)에서 생성된 세포를 C5 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서 C5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서의 보체 성분 C5 발현의 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNA 작용제와 세포를 접촉시키는 단계 및 단계 (a)에서 생성된 세포를 C5 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서 C5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하며, 안티센스 가닥은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서의 보체 성분 C5 발현의 억제 방법을 제공하고, 이는 상보성 영역을 포함하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNA 작용제와 세포를 접촉시키는 단계; 및 제1 단계에서 생성된 세포를 C5 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서 C5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이고, 센스 가닥은 3'-말단에서 하나 이상의 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 dT 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 dT 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 변형 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드로 된 짧은 서열이다. 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 및 3'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 3'-말단에서 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 세포에서의 보체 성분 C5 발현의 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하는 dsRNA 작용제와 세포를 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 생성된 세포를 C5 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지하여, 세포에서 C5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하며, 안티센스 가닥은 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00017
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np, np', nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 피검자 내에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 피검자는 인간이다.
일 실시형태에 있어서, 인간 피검자는 보체 성분 C5-관련 질병을 앓고 있다.
일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병은 발작성 야간혈색소뇨증(PNH), 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS), 천식, 류마티스 관절염(RA); 항인지질 항체 증후군; 루푸스 신장염; 허혈-재관류 손상; 전형적 또는 감염성 용혈성 요독 증후군(tHUS); 고밀도침착병(DDD); 시신경척수염(NMO); 다초점 운동 신경병증(MMN); 다발성 경화증(MS); 황반 변성(예를 들어, 연령-관련 황반 변성(AMD)); 용혈, 상승된 간 효소 및 혈소판 감소(HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판 감소 자반증(TTP); 자연 유산; 파우시-면역 혈관염; 수포성 표피박리증; 재발성 유산; 전자간증, 외상성 뇌 손상, 중증근육무력증, 저온응집병, 피부근염 수포성 유천포창, 쉬가 독소 이. 콜라이-관련 용혈성 요독 증후군, C3 신장병증, 항-호중구 세포질 항체-관련 혈관염, 체액 및 혈관 이식 거부, 이식편 기능이상, 심근 경색증, 동종이계 이식, 패혈증, 관상동맥병, 피부근염, 그레이브스병, 죽상동맥경화증, 알츠하이머병, 전신 염증 반응 패혈증, 패혈쇼크, 척수 손상, 사구체신염, 하시모토 갑상선염, I형 당뇨병, 건선, 천포창, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), ITP, 굿파스처 증후군, 데고스병, 항인지질 증후군(APS), 파국적 APS(CAPS), 심혈관 장애, 심근염, 뇌혈관 장애, 말초 혈관 장애, 신장혈관 장애, 장간막/장 혈관 장애, 혈관염, 헤노호-쉔라인 자반병성 신장염, 전신 홍반성 루푸스-관련 혈관염, 류마티스 관절염과 관련된 혈관염, 면역 복합체 혈관염, 다카야스병, 확장성 심근병증, 당뇨병성 혈관병증, 카와사키 병(동맥염), 정맥 기체 색전(VGE) 및 스텐트 삽입 후의 재협착증, 회전죽상반제술, 막 신장병증, 길랭-바레 증후군 및 경혈관 관상동맥 확장술(PTCA)로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병은 발작성 야간혈색소뇨증(PNH)이다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병은 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단편 C5a 및 C5b로의 보체 성분 C5의 절단을 억제한다.
일 실시형태에 있어서, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 에쿨리주맙이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 수막구균 백신과 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 4주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 900 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 900 mg 미만의 용량으로 에쿨리주맙과 접촉된다.
다른 실시형태에 있어서, 세포는 4주 동안 주마다 약 900 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 1200 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 1200 mg 미만의 용량으로 에쿨리주맙과 접촉된다.
다른 실시형태에 있어서, 세포는 4주 동안 주마다 약 900 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 1200 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 1200 mg 미만의 용량으로 에쿨리주맙과 접촉된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 세포는 2주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 900 mg 미만의 제3 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 900 mg 미만의 용량으로 에쿨리주맙과 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 2주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 600 mg 미만의 제3 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 600 mg 미만의 용량으로 에쿨리주맙과 접촉된다.
다른 실시형태에 있어서, 세포는 1주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 300 mg 미만의 제2 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 300 mg 미만의 용량으로 에쿨리주맙과 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 1주 동안 주마다 약 300 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 300 mg 미만의 제2 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 300 mg 미만의 용량으로 에쿨리주맙과 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 피검자 내에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 피검자에서의 혈장분리교환술 또는 혈장 교환을 추가로 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 600 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 피검자에서의 혈장 주입을 추가로 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량의 에쿨리주맙과 접촉된다.
다른 실시형태에 있어서, 세포는 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량의 에쿨리주맙과 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg 및 15 mg/kg으로 구성된 군으로부터 선택되는 용량의 에쿨리주맙과 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 피검자에게 정맥내 주입을 통해 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 피검자에게 피하 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량의 dsRNA 작용제와 접촉된다.
다른 실시형태에 있어서, 세포는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량의 dsRNA 작용제와 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 0.5 mg/kg 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg으로 구성된 군으로부터 선택되는 용량의 dsRNA 작용제와 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 dsRNA 작용제와 주 1회 접촉된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 주 2회 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 세포는 dsRNA 작용제와 월 2회 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 피하 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제 및 에쿨리주맙은 피검자에게 피하 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제 및 에쿨리주맙은 피검자에게 동시 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 dsRNA 작용제 및 에쿨리주맙과 동시에 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제가 먼저, 피검자에서 보체 성분 C5의 수준을 감소시키기에 충분한 기간 동안 피검자에게 투여되고, 에쿨리주맙은 이후에 약 600 mg 미만의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 피검자에서의 보체 성분 C5의 수준은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 감소된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 100 내지 500 mg의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 먼저, 세포에서 보체 성분 C5의 수준을 감소시키기에 충분한 기간 동안 dsRNA 작용제와 접촉되고, 세포는 이후에 약 600 mg 미만의 용량의 에쿨리주맙과 접촉된다.
일 실시형태에 있어서, 세포에서의 보체 성분 C5의 수준은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 감소된다.
일 실시형태에 있어서, 세포는 약 100 내지 500 mg의 용량의 에쿨리주맙과 접촉된다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 피검자에서의 C5의 발현의 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 치료적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, 피검자에서 C5의 발현을 억제하는 단계를 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 피검자에서의 C5의 발현의 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 치료적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, 피검자에서 C5의 발현을 억제하는 단계를 포함하며, 안티센스 가닥은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하여 이중 가닥 영역을 형성하는, 치료적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, 피검자에서 C5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 피검자에서의 보체 성분 C5 발현의 억제 방법을 제공하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이며, 센스 가닥은 3'-말단에서 하나 이상의 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, 투여는 피하 투여이다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 dT 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 3'-말단 dT 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 변형 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드로 된 짧은 서열이다. 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 및 3'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 3'-말단에서 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 피검자에서의 C5의 발현의 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하는, 치료적 유효량의 dsRNA 작용제를 피검자에게 투여하여, 피검자에서 C5의 발현을 억제하는 단계를 포함하며, 안티센스 가닥은 C5를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개 뉴클레오티드이며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00018
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 그들의 조합인 0 내지 10개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np, np', nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트됨으로써, 피검자에서 C5의 발현을 억제한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 피검자로의 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 에쿨리주맙이다.
일 실시형태에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단편 C5a 및 C5b로의 보체 성분 C5의 절단을 억제한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 수막구균 백신을 피검자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 900 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 900 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 900 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 1200 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 1200 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 900 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 1200 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 1200 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 2주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 900 mg 미만의 제3 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 900 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 2주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 600 mg 미만의 제3 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 600 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 1주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 300 mg 미만의 제2 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 피검자는 18세 미만이며, 에쿨리주맙은 1주 동안 주마다 약 300 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 300 mg 미만의 제2 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 피검자에서의 혈장분리교환술 또는 혈장 교환을 추가로 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 600 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 피검자에서의 혈장 주입을 추가로 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량으로 피검자에게 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량으로 피검자에게 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg으로 구성된 군으로부터 선택되는 용량으로 피검자에게 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 정맥내 주입을 통해 피검자에게 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 피검자에게 피하 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg으로 구성된 군으로부터 선택되는 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 주 1회 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 주 2회 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 월 2회 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 피검자에게 피하 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제 및 에쿨리주맙은 피검자에게 피하 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제 및 에쿨리주맙은 피검자에게 동시 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제가 먼저, 피검자에서 보체 성분 C5의 수준을 감소시키기에 충분한 기간 동안 피검자에게 투여되고, 에쿨리주맙은 이후에 약 600 mg 미만의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 피검자에서의 보체 성분 C5의 수준은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 감소된다.
일 실시형태에 있어서, 에쿨리주맙은 약 100 내지 500 mg의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA 작용제는 리간드에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는 dsRNA 작용제의 센스 가닥의 3'-말단에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체이다.
도 1은 3가지 보체 경로: 대체 경로, 고전 경로 및 렉틴 경로의 개략도이다.
표 2는 표기된 iRNA의 단일의 10 mg/kg 투여 후에 C57BL/6 마우스에 잔류하는 보체 성분 C5의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 3은 표기된 iRNA의 단일의 10 mg/kg 투여 후에 C57BL/6 마우스에 잔류하는 보체 성분 C5의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 4는 표기된 iRNA의 단일의 10 mg/kg 투여 후 48시간에 C57BL/6 마우스에 잔류하는 보체 성분 C5의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 5a는 AD-58642의 단일의 2.5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 25 mg/kg의 피하 투여 후에 생쥐에서, 제4일 및 제7일에 잔류하는 용혈의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 5b는 AD-58642의 단일의 2.5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 25 mg/kg의 피하 투여 후에 생쥐에서, 제7일에 잔류하는 보체 성분 C5의 양을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 6a 및 도 6b는 AD-58642의 단일의 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 25 mg/kg 투여 후 제5일에, C57BL/6 마우스에 잔류하는 보체 성분 C5의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 AD-58642의 단일의 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 25 mg/kg 투여 후 제5일에, C57BL/6 마우스에 잔류하는 용혈의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 8은 AD-58642의 단일의 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 25 mg/kg 투여 후 제5일에, C57BL/6 마우스에 잔류하는 보체 성분 C5의 양을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 9는 AD-58641의 단일의 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg 투여 후 제5일 및 제9일에, 마우스 혈청에 잔류하는 보체 성분 C5 단백질의 양을 보여주는 그래프이다. 분석법의 정량 하한(LLOQ)은 파선으로 나타나 있다.
도 10은 제0일, 제1일, 제2일 및 제3일의 AD-58641의 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg 또는 2.5 mg/kg 투여 후 8일에, 마우스 혈청에 잔류하는 보체 성분 C5 단백질의 양을 보여주는 그래프이다. 분석법의 정량 하한(LLOQ)은 파선으로 나타나 있다.
도 11a 및 도 11b는 생쥐에서의 화합물 AD-58641의 반복 투여의 효능 및 누적 효과를 도시한 것이다. 도 11a는 2.5 mg/kg/용량 또는 5.0 mg/kg/용량, q2w x3(3주 동안 주 2회)로의 반복 투여 후, 제0일, 제4일, 제7일, 제11일, 제14일, 제18일, 제25일 및 제32일에 생쥐의 혈청에 잔류하는 용혈 활성을 도시한 그래프이다. 도 11b는 동물의 혈청에 잔류하는 보체 성분 C5 단백질의 양을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 12는 8회의 투여 동안 3일마다 2.5 mg/kg 또는 5 mg/kg의 AD-58641의 2회차의 피하 투여 이전, 그 동안 및 그 이후의 다양한 시점에서 시노몰구스 마카크(cynomolgus macaque) 혈청에서의 보체 성분 C5 단백질의 양을 보여주는 그래프이다. C5 단백질 수준을 3개의 투여전 시료의 평균으로 정규화시켰다.
도 13은 8회의 투여 동안 3일마다 2.5 mg/kg 또는 5 mg/kg의 AD-58641의 2회차의 피하 투여 이전, 그 동안 및 그 이후의 다양한 시점에 시노몰구스 마카크 혈청에 잔류하는 용혈의 백분율을 보여주는 그래프이다. 용혈 백분율을 대조군 시료에서의 최대 용혈 및 백그라운드 용혈과 비교하여 계산하였다.
도 14는 표기된 iRNA의 단일의 1 mg/kg 투여 후 제5일에 C57BL/6 마우스의 혈청에 잔류하는 보체 성분 C5 단백질의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 15는 표기된 iRNA의 단일의 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg 또는 2.0 mg/kg 투여 후 제5일에 C57BL/6 마우스의 혈청에 잔류하는 보체 성분 C5 단백질의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 16은 표기된 iRNA의 단일의 1.0 mg/kg 투여 후 제6일, 제13일, 제20일, 제27일 및 제34일에 C57BL/6 마우스의 혈청에 잔류하는 보체 성분 C5 단백질의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 17은 제0일, 제4일 및 제7일에, 표기된 화합물의 5 mg/kg의 투여 후 다양한 시점에 생쥐 혈청에 잔류하는 용혈의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 18a는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 보체 성분 5(C5)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 1)을 보여주고; 도 18b는 마카카 물라타(Macaca mulatta) 보체 성분 5(C5)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 2)을 보여주며; 도 18c는 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 보체 성분 5(C5)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 3)을 보여주고; 도 18d는 라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus) 보체 성분 5(C5)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 4)을 보여주며; 도 18e는 SEQ ID NO: 1의 역 상보물(SEQ ID NO: 5)을 보여주고; 도 18f는 SEQ ID NO: 2의 역 상보물(SEQ ID NO: 6)을 보여주며; 도 18g는 SEQ ID NO: 3의 역 상보물(SEQ ID NO: 7)을 보여주고; 도 18h는 SEQ ID NO: 4의 역 상보물(SEQ ID NO: 8)을 보여준다.
상세한 설명
본 발명은 보체 성분 C5 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)-매개의 절단을 초래하는 iRNA 작용제를 제공한다.
본 발명의 iRNA는 길이가 약 30개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어, 길이가 15 내지 30개, 15 내지 29개, 15 내지 28개, 15 내지 27개, 15 내지 26개, 15 내지 25개, 15 내지 24개, 15 내지 23개, 15 내지 22개, 15 내지 21개, 15 내지 20개, 15 내지 9개, 15 내지 18개, 15 내지 17개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 18 내지 25개, 18 내지 24개, 18 내지 23개, 18 내지 22개, 18 내지 21개, 18 내지 20개, 19 내지 30개, 19 내지 29개, 19 내지 28개, 19 내지 27개, 19 내지 26개, 19 내지 25개, 19 내지 24개, 19 내지 23개, 19 내지 22개, 19 내지 21개, 19 내지 20개, 20 내지 30개, 20 내지 29개, 20 내지 28개, 20 내지 27개, 20 내지 26개, 20 내지 25개, 20 내지 24개, 20 내지 23개, 20 내지 22개, 20 내지 21개, 21 내지 30개, 21 내지 29개, 21 내지 28개, 21 내지 27개, 21 내지 26개, 21 내지 25개, 21 내지 24개, 21 내지 23개, 또는 21 내지 22개 뉴클레오티드인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하며, 이 영역은 C5 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다. 이들 iRNA의 이용은 포유류에서 C5 유전자의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다. 특히, 매우 적은 용량의 C5 iRNA는 RNA 간섭(RNAi)을 특이적으로 그리고 효율적으로 매개하여, C5 유전자의 발현의 상당한 억제를 초래할 수 있다. 본 발명자들은 C5를 표적으로 하는 iRNA가 시험관내 및 생체내에서 RNAi를 매개하여, C5 유전자의 발현의 상당한 억제를 초래할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 이들 iRNA를 포함하는 방법 및 조성물은 C5 단백질의 수준 및/또는 활성의 감소로 이득을 보게 되는 피검자, 예컨대, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, 발작성 야간혈색소뇨증(PNH)을 갖는 피검자를 치료하는데 유용하다.
또한, 본 발명은 보체 성분 C5 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)-매개의 절단을 초래하는 iRNA 조성물을 사용하여, C5 유전자의 발현의 억제 또는 감소로 이득을 보게 되는 장애, 예컨대, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, 발작성 야간혈색소뇨증(PNH) 및 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)을 갖는 피검자를 치료하기 위한 방법 및 병용 요법을 제공한다.
또한, 본 발명은 C5 유전자의 발현의 억제 또는 감소로 이득을 보게 되는 장애, 예컨대, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, 발작성 야간혈색소뇨증(PNH) 및 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)을 갖는 피검자에서 적어도 하나의 증상, 예를 들어, 용혈을 예방하기 위한 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 보체 성분 C5 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)-매개의 절단을 초래하는 iRNA 조성물을 제공한다. C5 유전자는 세포, 예를 들어, 피검자, 예를 들어, 인간 내의 세포에 존재할 수 있다.
본 발명의 병용 요법은 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자에게 본 발명의 RNAi 작용제 및 추가의 치료제, 예를 들어, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어, 에쿨리주맙을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 병용 요법은 본 발명의 iRNA 작용제를 사용하여 C5 mRNA를 표적으로 함으로써 피검자에서 C5 수준을 감소시키고(예를 들어, 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 99%), 이에 따라, 피검자를 치료하는데 필요한 에쿨리주맙의 치료적(또는 예방적) 유효량이 감소되게 하여, 치료 비용을 절감하고, 보다 용이하고, 보다 편리한 에쿨리주맙의 투여 방식, 예를 들어, 피하 투여를 가능하게 한다.
하기의 상세한 설명은 C5 유전자의 발현을 억제하기 위한 iRNA를 함유하는 조성물의 제조 및 이용 방법, 및 이러한 유전자의 발현의 억제 및/또는 감소로 이득을 보게 되는 질병 또는 장애를 갖는 피검자를 치료하기 위한 조성물, 용도 및 방법을 개시한다.
I. 정의
본 발명이 더 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어들을 우선 정의한다. 또한, 매개변수의 값 또는 값의 범위가 인용될 때마다, 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다는 것을 유의하여야 한다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나를 초과하는(예컨대, 적어도 하나)을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들자면, "하나의 구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나를 초과하는 구성요소, 예컨대, 복수개의 구성요소들을 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 여기에 한정되지 않는"이라는 어구를 의미하는 것으로 본원에서 사용되고, 상기 어구와 교환가능하게 사용된다.
"또는"이라는 용어는 문맥이 명백히 달리 표시하지 않으면, "및/또는"이라는 용어를 의미하는 것으로 본원에서 사용되고, 상기 용어와 교환가능하게 사용된다.
"C5"라는 용어와 상호교환가능하게 사용되는 본원에 사용된 "보체 성분 C5"는 CPAMD4, C3 및 PZP-유사 알파-2-마크로글로불린 도메인-함유 단백질, 아나필라톡신 C5a 유사체, 용혈성 보체(Hc) 및 보체 C5로 당업계에 알려져 있는, 널리 알려져 있는 유전자 및 폴리펩티드를 말한다. 인간 C5 mRNA 전사물의 서열은 예를 들어, 유전자 은행(GenBank) 승인 번호 GI:38016946(NM_001735.2; SEQ ID NO: 1)에서 찾을 수 있다. 레서스(rhesus) C5 mRNA의 서열은 예를 들어, 유전자 은행 승인 번호 GI:297270262(XM_001095750.2; SEQ ID NO: 2)에서 찾을 수 있다. 마우스 C5 mRNA의 서열은 예를 들어, 유전자 은행 승인 번호 GI:291575171(NM_010406.2; SEQ ID NO: 3)에서 찾을 수 있다. 생쥐 C5 mRNA의 서열은 예를 들어, 유전자 은행 승인 번호 GI:392346248(XM_345342.4; SEQ ID NO: 4)에서 찾을 수 있다. C5 mRNA 서열의 추가의 예는 공개 이용가능한 데이터베이스, 예를 들어, 유전자 은행를 사용하여 용이하게 이용가능하다.
또한, 본원에 사용된 "C5"라는 용어는 C5 유전자의 천연 발생 DNA 서열 변이, 예를 들어, C5 유전자 내의 단일 뉴클레오티드 다형성을 말한다. C5 유전자 내의 수많은 SNP가 확인되었으며, 예를 들어, NCBI dbSNP에서 찾을 수 있다(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/snp 참조). C5 유전자 내의 SNP의 비제한적인 예는 NCBI dbSNP 승인 번호 rs121909588 및 rs121909587에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 "표적 서열"은 일차 전사 산물의 RNA 가공의 산물인 mRNA를 포함하여, C5 유전자의 전사 동안에 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 일 실시형태에 있어서, 서열의 표적 부분은 적어도 C5 유전자의 전사 동안 형성되는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 부분에서의 또는 그 근처에서의 iRNA-유발성 절단을 위한 기질로서 작용하기에 충분히 길 것이다.
표적 서열은 길이가 약 9 내지 36개 뉴클레오티드, 예를 들어, 길이가 약 15 내지 30개 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 길이가 약 15 내지 30개 뉴클레오티드, 15 내지 29개, 15 내지 28개, 15 내지 27개, 15 내지 26개, 15 내지 25개, 15 내지 24개, 15 내지 23개, 15 내지 22개, 15 내지 21개, 15 내지 20개, 15 내지 19개, 15 내지 18개, 15 내지 17개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 18 내지 25개, 18 내지 24개, 18 내지 23개, 18 내지 22개, 18 내지 21개, 18 내지 20개, 19 내지 30개, 19 내지 29개, 19 내지 28개, 19 내지 27개, 19 내지 26개, 19 내지 25개, 19 내지 24개, 19 내지 23개, 19 내지 22개, 19 내지 21개, 19 내지 20개, 20 내지 30개, 20 내지 29개, 20 내지 28개, 20 내지 27개, 20 내지 26개, 20 내지 25개, 20 내지 24개, 20 내지 23개, 20 내지 22개, 20 내지 21개, 21 내지 30개, 21 내지 29개, 21 내지 28개, 21 내지 27개, 21 내지 26개, 21 내지 25개, 21 내지 24개, 21 내지 23개 또는 21 내지 22개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 인용 범위 및 길이의 중간인 범위 및 길이도 또한 본 발명의 부분으로 의도된다.
본원에 사용된 "서열을 포함하는 가닥"이라는 용어는 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 지칭되는 서열에 의해 기술되는 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
"G", "C", "A", "T" 및 "U" 각각은 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실 각각을 포함하는 뉴클레오티드를 일반적으로 나타낸다. 그러나, "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"라는 용어는 하기에 더욱 상술된 바와 같이 변형 뉴클레오티드, 또는 대리 대체 모이어티(surrogate replacement moiety)를 지칭할 수도 있다는 것을 알 것이다(예를 들어, 표 2 참조). 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 그러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오티드를 포함하여, 올리고뉴클레오티드의 염기 짝지음 성질을 실질적으로 변경시키지 않으면서 기타 모이어티에 의해 대체될 수 있다는 것을 충분히 인지한다. 예를 들면, 제한 없이, 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오티드는 본 발명에서 특성화된 dsRNA의 뉴클레오티드 서열 내에서, 예를 들면, 이노신을 포함하는 뉴클레오티드에 의해 대체될 수 있다. 다른 예에서, 올리고뉴클레오티드의 어디든 아데닌 및 시토신이 각각 구아닌 및 우라실로 대체되어, 표적 mRNA와 G-U 워블(Wobble) 염기 짝지음을 형성할 수 있다. 그러한 대체 모이어티를 포함하는 서열은 본 발명에서 특성화된 조성물 및 방법에 적당하다.
본원에 교환가능하게 사용된 "iRNA", "RNAi 작용제", "iRNA 작용제", "RNA 간섭제"라는 용어는 상기 용어가 본원에 정의된 바와 같은 RNA를 포함하고, RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC) 경로를 통하여 RNA 전사물의 표적화된 절단을 매개하는 작용제를 지칭한다. iRNA는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 공정을 통해 mRNA의 서열-특이적 분해를 지시한다. iRNA는 세포, 예컨대, 포유류 피검자와 같은 피검자 내의 세포 내에서 C5의 발현을 조절, 예컨대, 억제한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 표적 RNA 서열, 예컨대, C5 표적 mRNA 서열과 상호작용하여, 표적 RNA의 절단을 지시하는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이론에 구속되지 않으면서, 세포로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)(Sharp 등, (2001) Genes Dev. 15:485)로 알려진 III형 엔도뉴클레아제에 의하여 siRNA로 분해되는 것으로 여겨진다. 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 두 개 염기 3' 오버행들을 갖는 19 내지 23 염기쌍 단 간섭 RNA로 처리한다(Bernstein 등, (2001) Nature 409:363). 이후, siRNA는 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)로 포함되어, 여기서 하나 이상의 헬리카제는 siRNA 듀플렉스를 풀어내어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내할 수 있도록 한다(Nykanen 등, (2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA에 결합시에, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단시켜 침묵화를 유도한다(Elbashir 등, (2001) Genes Dev.15:188). 따라서, 일 양태에 있어서, 본 발명은 세포 내에 발생되고, 표적 유전자, 즉, C5 유전자의 침묵화를 일으키는 RISC 복합체의 형성을 촉진하는 단일 가닥 RNA(siRNA)에 관한 것이다. 따라서, "siRNA"라는 용어는 상술한 RNAi를 지칭하는 것으로 본원에서 사용되기도 한다.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 표적 mRNA를 억제하기 위해 세포 또는 유기체로 도입되는 단일 가닥 siRNA일 수 있다. 단일 가닥 RNAi 작용제는 RISC 엔도뉴클레아제 아르고노트(Argonaute) 2에 결합하며, 이는 이어서 표적 mRNA를 절단한다. 단일 가닥 siRNA는 일반적으로 15 내지 30개 뉴클레오티드이며, 화학적으로 변형된다. 단일 가닥 siRNA의 설계 및 시험은 미국 특허 번호 제8,101,348호 및 Lima 등, (2012) Cell 150: 883-894에 기술되어 있으며, 그 각각의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 기술된 안티센스 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것은 본원에 기술된 바와 같은, 또는 Lima 등, (2012) Cell 150;:883-894에 기술된 방법에 의해 화학적으로 변형된 바와 같은 단일 가닥 siRNA로서 사용될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법에 이용되는 "iRNA"는 이중-가닥 RNA이며, 본원에서 "이중 가닥 RNAi 작용제", "이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자", "dsRNA 작용제", 또는 "dsRNA"로 지칭된다. "dsRNA"라는 용어는 표적 RNA, 즉, C5 유전자에 대하여 "센스" 및 "안티센스" 배향성을 갖는 것으로 지칭된, 2 개의 반평행(anti-parallel) 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥들을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는, 리보핵산 분자들의 복합체를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 이중-가닥 RNA(dsRNA)는 본원에서 RNA 간섭 또는 RNAi로 지칭되는 전사 후 유전자-침묵화 메커니즘을 통해 표적 RNA, 예컨대, mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자의 각각의 가닥의 뉴클레오티드의 대부분은 리보뉴클레오티드이나, 본원에 상세히 기술된 바와 같이, 각각의 또는 둘 모두의 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 게다가, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "RNAi 작용제"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; RNAi 작용제는 다수의 뉴클레오티드에서 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 본원에 개시된 또는 당업계에 공지된 모든 유형의 변형을 포함할 수 있다. siRNA 형 분자에 사용되는 바와 같은 임의의 그러한 변형은 명세서 및 청구범위의 목적을 위한 "RNAi 작용제"에 포함된다.
듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통한 요망되는 표적 RNA의 특이적인 분해를 가능하게 하는 임의의 길이의 것일 수 있으며, 길이가 약 9 내지 36개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 약 15 내지 30개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 약 15 내지 30개, 15 내지 29개, 15 내지 28개, 15 내지 27개, 15 내지 26개, 15 내지 25개, 15 내지 24개, 15 내지 23개, 15 내지 22개, 15 내지 21개, 15 내지 20개, 15 내지 19개, 15 내지 18개, 15 내지 17개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 18 내지 25개, 18 내지 24개, 18 내지 23개, 18 내지 22개, 18 내지 21개, 18 내지 20개, 19 내지 30개, 19 내지 29개, 19 내지 28개, 19 내지 27개, 19 내지 26개, 19 내지 25개, 19 내지 24개, 19 내지 23개, 19 내지 22개, 19 내지 21개, 19 내지 20개, 20 내지 30개, 20 내지 29개, 20 내지 28개, 20 내지 27개, 20 내지 26개, 20 내지 25개, 20 내지 24개, 20 내지 23개, 20 내지 22개, 20 내지 21개, 21 내지 30개, 21 내지 29개, 21 내지 28개, 21 내지 27개, 21 내지 26개, 21 내지 25개, 21 내지 24개, 21 내지 23개 또는 21 내지 22개 염기쌍의 범위일 수 있다. 상기 인용된 범위 및 길이의 중간인 범위 및 길이도 본 발명의 부분으로 의도된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 두 개의 가닥들은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분들일 수 있거나, 개별 RNA 분자들일 수 있다. 두 개 가닥들이 하나의 더 큰 분자의 부분이며, 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 비-단속(non-interrupted) 사슬에 의하여 연결되는 경우에, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"로 지칭된다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, 헤어핀 루프는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 23개 또는 그 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 개별 RNA 분자에 의해 포함되는 경우, 그들 분자는 공유적으로 연결될 필요는 없지만, 공유적으로 연결될 수 있다. 두 개 가닥들이 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 비-단속 사슬이 아닌 수단에 의하여 공유적으로 연결되는 경우에, 연결 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥들은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 염기 쌍의 최대수는 dsRNA의 최단 가닥에 존재하는 뉴클레오티드의 수에서 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행들을 차감한 숫자이다. 듀플렉스 구조에 더하여, RNAi는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행들을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 표적 RNA 서열, 예를 들어, C5 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 24 내지 30개 뉴클레오티드의 dsRNA이다. 이론에 구속되지 않으면서, 세포 내로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서로 공지된 유형 III 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해된다(Sharp 등 (2001) Genes Dev. 15:485). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 2개 염기 3' 오버행을 갖는 19 내지 23개 염기 쌍의 단 간섭 RNA로 처리한다(Bernstein, 등, (2001) Nature 409:363). 이어서, siRNA는 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC) 내로 혼입되고, 여기서 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 풀어내어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내할 수 있게 한다(Nykanen, 등, (2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA에 결합 시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 침묵화를 유도한다(Elbashir, 등, (2001) Genes Dev. 15:188).
본원에 사용된 "뉴클레오티드 오버행"은 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출하는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, dsRNA의 하나의 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어서 연장되거나, 그 반대인 경우, 뉴클레오티드 오버행이 존재한다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있으며; 대안적으로, 오버행은 적어도 2개의 뉴클레오티드, 적어도 3개의 뉴클레오티드, 적어도 4개의 뉴클레오티드, 적어도 5개의 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 그들의 임의의 조합에 존재할 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥 중 어느 하나의 5'-말단, 3'-말단 또는 둘 모두의 말단에 존재할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 및/또는 5'-말단에서, 1 내지 10개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 및/또는 5'-말단에서, 1 내지 10개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 오버행 내의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 뉴클레오시드 티오포스페이트로 대체된다.
"평활성" 또는 "평활성 말단인"은 이중 가닥 RNAi 작용제의 말단에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 없다, 즉, 뉴클레오티드 오버행이 없다는 것을 의미한다. "평활성 말단인" RNAi 작용제는 그의 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥인, 즉, 분자의 어느 하나의 말단에 뉴클레오티드 오버행이 없는 dsRNA이다. 본 발명의 RNAi 작용제는 하나의 말단에 뉴클레오티드 오버행이 있거나(즉, 하나의 오버행 및 하나의 평활성 말단이 있는 작용제) 둘 모두의 말단에 뉴클레오티드 오버행이 있는 RNAi 작용제를 포함한다.
"안티센스 가닥" 또는 "안내(guide) 가닥"이라는 용어는 표적 서열, 예를 들어, C5 mRNA에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA의 가닥, 예를 들어, dsRNA를 지칭한다. 본원에 사용된 "상보성 영역"이라는 용어는 서열, 예를 들어, 표적 서열, 예를 들어, 본원에 정의된 C5 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 대하여 완전히 상보적이지 않은 경우에, 미스매치들은 분자의 내부 또는 말단 영역에 존재할 수 있다. 일반적으로, 미스매치들은 말단 영역, 예를 들어, iRNA의 5'- 및/또는 3'-말단의 5, 4, 3 또는 2개 뉴클레오티드에서 대개 허용된다.
본원에 사용된 "센스 가닥" 또는 "승객(passenger) 가닥"이라는 용어는 용어가 본원에 정의된 바와 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 "절단 영역"이라는 용어는 절단 부위에 바로 인접하여 위치한 영역을 지칭한다. 절단 부위는 절단이 발생하는 표적상의 부위이다. 일부 실시형태들에 있어서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단에, 그리고 그에 바로 인접한 3개의 염기를 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단에, 그리고 그에 바로 인접한 2개의 염기를 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 절단 부위는 구체적으로 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 10 및 11에 의해 결합된 부위에 존재하며, 절단 영역은 뉴클레오티드 11, 12 및 13을 포함한다.
본원에 사용되고 달리 지시되지 않으면, 제2 뉴클레오티드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오티드 서열을 기술하는데 이용될 때 "상보적"이라는 용어는 당업자가 이해하는 바와 같이, 특정 조건 하에서 혼성화하여 상기 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 듀플렉스 구조를 형성하는 상기 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 그러한 조건은 예를 들면, 가혹한 조건일 수 있는데, 가혹한 조건은 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12 내지 16시간 이후에 세척을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조). 유기체 내에서 직면할 수 있는 생리학적으로 적절한 조건과 같은 기타 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 최종적인 적용에 따른 2개 서열들의 상보성의 시험에 대해 가장 적절한 조건들의 세트를 결정할 수 있을 것이다.
iRNA, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이 dsRNA 내의 상보적 서열은 하나 또는 양쪽의 뉴클레오티드 서열들의 전체 길이에 걸쳐서 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기-짝지음을 포함한다. 그러한 서열은 본원에서 서로에 대하여 "완전 상보적(fully complementary)"이라고 지칭될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본원에서 제2 서열에 대하여 "실질적으로 상보적"으로 지칭되는 경우, 상기 두 서열들은 완전 상보적일 수 있거나, 이들의 최종적인 적용, 예컨대, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제에 대하여 가장 적절한 조건하에서 혼성화할 수 있는 능력을 유지하면서, 혼성화 시 최대 30개 염기쌍의 듀플렉스에 대하여 그들은 하나 이상이나, 일반적으로 5, 4, 3 또는 2개 이하의 미스매치된 염기쌍을 형성할 수 있다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시에 하나 이상의 단일 가닥 오버행들을 형성하도록 설계되는 경우, 그러한 오버행들은 상보성의 결정에 대하여 미스매치로 간주되지 않는다. 예를 들면, 길이가 21개 뉴클레오티드인 하나의 올리고뉴클레오티드 및 길이가 23개 뉴클레오티드인 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA는 길이가 더 긴 올리고뉴클레오티드가 길이가 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 대하여 완전 상보적인 21개 뉴클레오티드로 된 서열을 포함하는 경우, 본원에 기술된 목적을 위해 "완전 상보적"으로도 지칭될 수 있다.
또한, 본원에 사용된 "상보적" 서열은 혼성화할 수 있는 능력에 대하여 상기 요구사항이 충족되는 한, 비-왓슨-크릭 염기쌍 및/또는 비-천연 및 변형 뉴클레오티드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나 전적으로 이들로부터 형성될 수도 있다. 그러한 비-왓슨-크릭 염기쌍은 G:U 워블 또는 후그스타인 염기 짝지음을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 "상보적", "완전 상보적" 및 "실질적으로 상보적"이라는 용어들은 이들의 이용의 맥락에서 이해될 수 있는 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이, 또는 iRNA 작용제의 안티센스 가닥 및 표적 서열 사이의 염기 매칭에 대하여 이용될 수 있다.
본원에 사용된, 전령 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적"인 폴리뉴클레오티드는 관심 대상의 mRNA(예컨대, C5를 인코딩하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들면, 서열이 C5를 인코딩하는 mRNA의 비-단속 부분에 실질적으로 상보적이라면 폴리뉴클레오티드는 C5 mRNA의 적어도 일부분에 상보적이다.
일반적으로, 각각의 가닥의 뉴클레오티드의 대부분은 리보뉴클레오티드이지만, 본원에서 상세히 기술된 바와 같이, 각각의 가닥 또는 양 가닥들은 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예컨대, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 변형 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 또한, "iRNA"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러한 변형은 본원에 개시되거나 당업계에 알려진 모든 유형의 변형을 포함할 수 있다. iRNA 분자에서 이용되는 바와 같이, 그러한 임의의 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위한 "iRNA"에 포함된다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 작용제는 안티센스 억제 메커니즘을 통해 표적 mRNA를 억제하는 단일-가닥 안티센스 RNA 분자이다. 단일-가닥 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA 내의 서열에 상보적이다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA로의 염기 짝지음 및 번역 기구의 물리적인 폐쇄에 의해, 화학양론 방식으로 번역을 억제할 수 있다, Dias, N. 등, (2002) Mol. Cancer Ther. 1:347-355 참조. 단일-가닥 안티센스 RNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드일 수 있으며, 표적 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 단일-가닥 안티센스 RNA 분자는 본원에 기술된 안티센스 서열들 중 어느 하나로부터의 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드인 서열을 포함할 수 있다.
용어 "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 약학적 활성 분자, 예를 들어, 핵산 분자, 예를 들어, iRNA 또는 iRNA가 전사되는 플라스미드를 캡슐화하는 지질층을 포함하는 소낭이다. LNP는 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,858,225호, 6,815,432호, 8,158,601호 및 8,058,069호에 기술되어 있다.
본원에 사용된 "피검자"는 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이 및 침팬지와 같은 비-인간 영장류), 비-영장류(예컨대, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니 피그, 고양이, 개, 생쥐, 마우스, 말 및 고래)를 포함하는 포유류 또는 조류(예컨대, 오리 또는 거위)와 같은 동물이다. 일 실시형태에 있어서, 피검자는 인간, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는, 질병, 장애 또는 질환(condition)에 대해 치료되거나 평가되는 인간; C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는, 질병, 장애 또는 질환에 대한 위험이 있는 인간; C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는, 질병, 장애 또는 질환을 갖는 인간; 및/또는 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는, 질병, 장애 또는 질환에 대해 치료 중인 인간이다.
본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 검출되든지, 검출되지 않든지, 원치 않는 보체 경로 활성화와 관련된 하나 이상의 증상(예를 들어, 용혈 및/또는 만성 염증)의 완화 또는 개선; 원치 않는 보체 경로 활성화의 정도 약화; 만성 염증 및/또는 용혈의 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음); 원치 않는 보체 경로 활성화(예를 들어, 만성 염증 및/또는 용혈)의 개선 또는 완화를 포함하나 이들에 한정되지 않는 유익하거나 요망되는 결과를 지칭한다. 또한, "치료"는 치료의 부재 하에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수도 있다.
피검자에서의 보체 성분 C5의 수준 또는 질병 마커 또는 증상의 맥락에서 "보다 낮은"이라는 용어는 그러한 수준에서 통계적으로 상당한 감소를 지칭한다. 감소는 예를 들면, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상일 수 있으며, 바람직하게는, 그러한 장애가 없는 개인의 정상 범위 내인 것으로 허용되는 수준으로 내려가는 것이다.
본원에 사용된 "예방" 또는 "예방하는"은 C5 유전자의 발현의 감소로 이득을 보게 되는 질병, 장애 또는 질환을 참조하여 사용되는 경우, 피검자가 그러한 질병, 장애 또는 질환, 예컨대, 원치 않는 보체 활성화의 증상, 예를 들어, 만성 염증, 용혈 및/또는 혈전증의 증상이 발생할 가능성의 감소를 지칭한다. 혈전증이 발생할 가능성은 예를 들면, 혈전증에 대한 하나 이상의 위험 인자들을 갖는 개인에 혈전증이 생기지 않거나 동일한 위험 인자들을 가지며 본원에 기술된 바와 같이 치료를 받지 않은 개체군에 비하여 낮은 중증도로 혈전증이 생기는 경우 감소된다. 질병, 장애 또는 질환이 생기지 못하거나, 그러한 질병, 장애 또는 질환과 관련된 증상의 발생의 감소(예컨대, 그 질병 또는 장애에 대하여 임상적으로 허용되는 스케일에서 적어도 약 10%), 또는 지연된 증상의 표현(예컨대, 수일, 수주, 수개월 또는 수년)은 효과적인 예방으로 간주된다.
본원에 사용된 "보체 성분 C5-관련 질병"이라는 용어는 보체 활성화에 의해 야기되거나, 이와 관련된 질병 또는 장애이다. 그러한 질병, 예를 들어, 막 공격 복합체-매개의 용해, 아나필락시스 및/또는 용혈은 전형적으로 염증 및/또는 면역계 활성화와 관련된다. 보체 성분 C5-관련 질병의 비제한적인 예에는 발작성 야간혈색소뇨증(PNH), 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS), 천식, 류마티스 관절염(RA); 항인지질 항체 증후군; 루푸스 신장염; 허혈-재관류 손상; 전형적 또는 감염성 용혈성 요독 증후군(tHUS); 고밀도침착병(DDD); 시신경척수염(NMO); 다초점 운동 신경병증(MMN); 다발성 경화증(MS); 황반 변성(예를 들어, 연령-관련 황반 변성(AMD)); 용혈, 상승된 간 효소 및 혈소판 감소(HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판 감소 자반증(TTP); 자연 유산; 파우시-면역 혈관염; 수포성 표피박리증; 재발성 유산; 전자간증, 외상성 뇌 손상, 중증근육무력증, 저온응집병, 피부근염 수포성 유천포창, 쉬가 독소 이. 콜라이-관련 용혈성 요독 증후군, C3 신장병증, 항-호중구 세포질 항체-관련 혈관염(예를 들어, 다발혈관염을 동반한 육아종증(이전에 베게너육아종증으로 알려져 있음), 처르그 스트라우스 증후군 및 현미경적 다발성혈관염), 체액 및 혈관 이식 거부, 이식편 기능이상, 심근 경색증(예를 들어, 심근 경색증에서의 조직 손상 및 허혈), 동종이계 이식, 패혈증(예를 들어, 패혈증의 불량한 결과), 관상동맥병, 피부근염, 그레이브스병, 죽상동맥경화증, 알츠하이머병, 전신 염증 반응 패혈증, 패혈쇼크, 척수 손상, 사구체신염, 하시모토 갑상선염, I형 당뇨병, 건선, 천포창, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), ITP, 굿파스처 증후군, 데고스병, 항인지질 증후군(APS), 파국적 APS(CAPS), 심혈관 장애, 심근염, 뇌혈관 장애, 말초(예를 들어, 근골격) 혈관 장애, 신장혈관 장애, 장간막/장 혈관 장애, 혈관염, 헤노호-쉔라인 자반병성 신장염, 전신 홍반성 루푸스-관련 혈관염, 류마티스 관절염과 관련된 혈관염, 면역 복합체 혈관염, 다카야스병, 확장성 심근병증, 당뇨병성 혈관병증, 카와사키 병(동맥염), 정맥 기체 색전(VGE) 및 스텐트 삽입 후의 재협착증, 회전죽상반제술, 막 신장병증, 길랭-바레 증후군 및 경혈관 관상동맥 확장술(PTCA)이 포함된다(예를 들어, Holers (2008) Immunological Reviews 223:300-316; Holers and Thurman (2004) Molecular Immunology 41:147-152; 미국 특허 공개 번호 20070172483호 참조).
일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병은 발작성 야간혈색소뇨증(PNH)이다. PNH는 통상의 PNH 또는 다른 골수 부전 증후군 및/또는 골수형성이상 증후군(MDS), 예를 들어, 혈구감소증의 환경에서의 PNH일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병은 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)이다.
II. 본 발명의 iRNA
본 발명은 보체 성분 C5 유전자의 발현을 억제하는 iRNA를 제공한다. 일 실시형태에 있어서, iRNA 작용제는 세포, 예를 들어, 피검자, 예컨대, 포유류, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH를 갖는 인간 내의 세포에서의 C5 유전자의 발현 억제용 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNA는 C5 유전자의 발현에서 형성되는 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 상보성 영역은 길이가 약 30개 이하의 뉴클레오티드(예컨대, 길이가 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 또는 18개 이하의 뉴클레오티드)이다. C5 유전자를 발현하는 세포와 접촉시에, iRNA는 예를 들면, PCR 또는 분지쇄 DNA(bDNA) 기반의 방법 또는 단백질 기반의 방법, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅 또는 유세포측정 기법을 이용한 면역형광 분석에 의한 것과 같이 분석시, C5 유전자(예컨대, 인간, 영장류, 비-영장류 또는 조류 C5 유전자)의 발현을 적어도 약 10% 억제한다.
dsRNA는 상보적이며 dsRNA가 이용될 조건하에서 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 RNA 가닥들을 포함한다. dsRNA의 한 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열에 대하여 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 C5 유전자가 발현하는 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 가닥(센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 두 가닥들이 적절한 조건하에서 결합되는 경우 혼성화하고 듀플렉스 구조를 형성하도록 한다. 본원 어딘가에서 기술되고 당업계에 알려진 바와 같이, dsRNA의 상보성 서열은 개별 올리고뉴클레오티드 상에 있는 것과 대조적으로, 단일 핵산 분자의 자가-상보적 영역으로 포함될 수도 있다.
일반적으로, 듀플렉스 구조는 길이가 15 내지 30개 염기쌍, 예컨대, 길이가 15 내지 29개, 15 내지 28개, 15 내지 27개, 15 내지 26개, 15 내지 25개, 15 내지 24개, 15 내지 23개, 15 내지 22개, 15 내지 21개, 15 내지 20개, 15 내지 19개, 15 내지 18개, 15 내지 17개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 18 내지 25개, 18 내지 24개, 18 내지 23개, 18 내지 22개, 18 내지 21개, 18 내지 20개, 19 내지 30개, 19 내지 29개, 19 내지 28개, 19 내지 27개, 19 내지 26개, 19 내지 25개, 19 내지 24개, 19 내지 23개, 19 내지 22개, 19 내지 21개, 19 내지 20개, 20 내지 30개, 20 내지 29개, 20 내지 28개, 20 내지 27개, 20 내지 26개, 20 내지 25개, 20 내지 24개, 20 내지 23개, 20 내지 22개, 20 내지 21개, 21 내지 30개, 21 내지 29개, 21 내지 28개, 21 내지 27개, 21 내지 26개, 21 내지 25개, 21 내지 24개, 21 내지 23개, 또는 21 내지 22개 염기쌍이다. 또한, 상기 인용된 범위 및 길이의 중간인 범위 및 길이도 본 발명의 부분으로 의도된다.
유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 길이가 15 내지 30개 뉴클레오티드, 예를 들어, 길이가 15 내지 29개, 15 내지 28개, 15 내지 27개, 15 내지 26개, 15 내지 25개, 15 내지 24개, 15 내지 23개, 15 내지 22개, 15 내지 21개, 15 내지 20개, 15 내지 19개, 15 내지 18개, 15 내지 17개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 18 내지 25개, 18 내지 24개, 18 내지 23개, 18 내지 22개, 18 내지 21개, 18 내지 20개, 19 내지 30개, 19 내지 29개, 19 내지 28개, 19 내지 27개, 19 내지 26개, 19 내지 25개, 19 내지 24개, 19 내지 23개, 19 내지 22개, 19 내지 21개, 19 내지 20개, 20 내지 30개, 20 내지 29개, 20 내지 28개, 20 내지 27개, 20 내지 26개, 20 내지 25개, 20 내지 24개, 20 내지 23개, 20 내지 22개, 20 내지 21개, 21 내지 30개, 21 내지 29개, 21 내지 28개, 21 내지 27개, 21 내지 26개, 21 내지 25개, 21 내지 24개, 21 내지 23개 또는 21 내지 22개 뉴클레오티드이다. 또한, 상기 인용된 범위 및 길이의 중간인 범위 및 길이도 본 발명의 부분으로 의도된다.
일부 실시형태들에 있어서, dsRNA는 길이가 약 15 내지 약 20개 뉴클레오티드 또는 길이가 약 25 내지 약 30개 뉴클레오티드이다. 일반적으로, dsRNA는 다이서(Dicer) 효소에 대한 기질로서 작용하기에 충분히 길다. 예를 들어, 길이가 약 21 내지 23개 초과의 뉴클레오티드인 dsRNA가 다이서에 대한 기질로서 작용할 수 있다는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 당업자도 인식하는 바와 같이, 절단을 위해 표적화된 RNA의 영역은 가장 흔하게는 더 큰 RNA 분자, 흔하게는 mRNA 분자의 일부일 것이다. 적절한 경우에 있어서, mRNA 표적의 "일부"는 RNAi-유발성 절단(즉, RISC 경로를 통한 절단)에 대한 기질이 되도록 하는 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다.
또한, 당업자는 듀플렉스 영역, 예를 들어, 약 9 내지 36개 염기쌍, 예를 들어, 약 10 내지 36개, 11 내지 36개, 12 내지 36개, 13 내지 36개, 14 내지 36개, 15 내지 36개, 9 내지 35개, 10 내지 35개, 11 내지 35개, 12 내지 35개, 13 내지 35개, 14 내지 35개, 15 내지 35개, 9 내지 34개, 10 내지 34개, 11 내지 34개, 12 내지 34개, 13 내지 34개, 14 내지 34개, 15 내지 34개, 9 내지 33개, 10 내지 33개, 11 내지 33개, 12 내지 33개, 13 내지 33개, 14 내지 33개, 15 내지 33개, 9 내지 32개, 10 내지 32개, 11 내지 32개, 12 내지 32개, 13 내지 32개, 14 내지 32개, 15 내지 32개, 9 내지 31개, 10 내지 31개, 11 내지 31개, 12 내지 31개, 13 내지 32개, 14 내지 31개, 15 내지 31개, 15 내지 30개, 15 내지 29개, 15 내지 28개, 15 내지 27개, 15 내지 26개, 15 내지 25개, 15 내지 24개, 15 내지 23개, 15 내지 22개, 15 내지 21개, 15 내지 20개, 15 내지 19개, 15 내지 18개, 15 내지 17개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 18 내지 25개, 18 내지 24개, 18 내지 23개, 18 내지 22개, 18 내지 21개, 18 내지 20개, 19 내지 30개, 19 내지 29개, 19 내지 28개, 19 내지 27개, 19 내지 26개, 19 내지 25개, 19 내지 24개, 19 내지 23개, 19 내지 22개, 19 내지 21개, 19 내지 20개, 20 내지 30개, 20 내지 29개, 20 내지 28개, 20 내지 27개, 20 내지 26개, 20 내지 25개, 20 내지 24개, 20 내지 23개, 20 내지 22개, 20 내지 21개, 21 내지 30개, 21 내지 29개, 21 내지 28개, 21 내지 27개, 21 내지 26개, 21 내지 25개, 21 내지 24개, 21 내지 23개 또는 21 내지 22개 염기쌍의 듀플렉스 영역이 dsRNA의 주요 기능 부분임을 인식할 것이다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 절단에 대해 요망되는 RNA를 표적으로 하는 예컨대, 15 내지 30개 염기쌍의 기능적 듀플렉스로 처리되는 한, 30개 초과의 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자들의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 당업자는 일 실시형태에 있어서, miRNA가 dsRNA이라는 것을 인식할 것이다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA는 천연 발생 miRNA가 아니다. 다른 실시형태에 있어서, C5 발현을 표적으로 하는 데 유용한 iRNA 작용제는 더 큰 dsRNA의 절단에 의하여 표적 세포 내에서 생성되지 않는다.
본원에 기술된 dsRNA는 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행들, 예컨대, 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 뉴클레오티드 오버행을 갖는 dsRNA는 그들의 평활성 말단인 대응부에 대하여 예상치 못하게 뛰어난 억제 특성을 가질 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 그들의 임의의 조합에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양 말단들에 존재할 수 있다.
dsRNA는 하기에 더 서술된 바와 같이, 예를 들면, Biosearch, Applied Biosystems, Inc로부터 상업적으로 이용가능한 바와 같이, 예컨대, 자동화된 DNA 합성기를 이용함으로써 당업계에 알려진 표준 방법에 의하여 합성될 수 있다.
본 발명의 iRNA 화합물은 2-단계 과정을 이용하여 제조될 수 있다. 우선, 이중-가닥 RNA 분자의 개별 가닥들은 별개로 제조된다. 이후, 성분 가닥들은 어닐링된다. siRNA 화합물의 개별 가닥들은 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 양쪽 모두를 이용하여 제조될 수 있다. 유기 합성은 비천연 또는 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 가닥들이 용이하게 제조될 수 있다는 장점을 제공한다. 본 발명의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 양쪽 모두를 이용하여 제조될 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 dsRNA는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열들, 센스 서열 및 안티-센스 서열을 포함한다. 센스 가닥은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 제공된 서열들의 그룹으로부터 선택되며, 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나의 서열들의 그룹으로부터 선택된다. 이러한 양태에 있어서, 2개 서열들 중 하나는 2개 서열들 중 다른 하나에 상보적이며, 서열들 중 하나는 C5 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, 이러한 양태에 있어서, dsRNA는 2개 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이며, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에서의 센스 가닥으로 기술되고, 제2 올리고뉴클레오티드는 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에서의 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥으로 기술된다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열들은 개별 올리고뉴클레오티드 상에 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열들은 단일의 올리고뉴클레오티드상에 포함된다.
표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23에서 서열의 일부가 변형된 및/또는 컨쥬게이트된 서열로 기술되어 있지만, 본 발명의 iRNA의 RNA, 예를 들어, 본 발명의 dsRNA가 비변형된, 비-컨쥬게이트된 및/또는 거기에 기술된 것과 상이하게 변형된 및/또는 컨쥬게이트된 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23에 기재된 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
당업자는 약 20 내지 23개 염기쌍, 예컨대, 21개 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA는 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 인정되는 것을 충분히 알고 있다(Elbashir 등, EMBO 2001, 20:6877-6888). 그러나, 다른 이들은 더 짧거나 더 긴 RNA 듀플렉스 구조도 효과적일 수 있다는 것을 알아 냈다(Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim 등 (2005) Nat Biotech 23:222-226). 상술된 실시형태들에 있어서, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 제공된 올리고뉴클레오티드 서열들의 성질을 이용하여, 본원에 기술된 dsRNA는 최소 21개 뉴클레오티드의 길이인 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나의 서열들 중 하나에서 하나 또는 양 말단에서 소수의 뉴클레오티드만을 제한 서열을 갖는 더 짧은 듀플렉스들은 상술한 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있다고 합리적으로 예상할 수 있다. 따라서, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나의 서열 중 하나로부터 유래된 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 서열을 가지며, C5 유전자의 발현을 억제하는 능력에 있어서 전체 서열을 포함하는 dsRNA와는 억제가 약 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하만큼 상이한 dsRNA가 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다.
또한, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 제공된 RNA로, RISC-매개의 절단에 감수성인 C5 전사물 내의 부위(들)를 동정한다. 이와 같이, 본 발명은 또한 이들 부위들 중 하나의 부위 내를 표적으로 하는 iRNA를 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, iRNA는 iRNA가 그 특정 부위 내의 어디에서 전사물의 절단을 촉진한다면, RNA 전사물의 특정 부위 내를 표적으로 한다고 한다. 그러한 iRNA는 일반적으로, C5 유전자에서 선택된 서열에 연속적인 영역으로부터 취한 추가적인 뉴클레오티드 서열들에 결합된, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 제공된 서열 중 하나로부터의 적어도 약 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
표적 서열이 일반적으로 길이가 약 15 내지 30개 뉴클레오티드인 반면에, 임의의 주어진 표적 RNA의 절단을 유도하기 위하여, 이러한 범위에 있는 특정 서열들의 적합성에 있어서는 광범위한 변이가 있다. 본원에 제시된 다양한 소프트웨어 패키지 및 지침은 임의의 주어진 유전자 표적에 대한 최적의 표적 서열들의 동정에 대한 지침을 제공하지만, 주어진 크기(비한정 예로서, 21개 뉴클레오티드)의 "윈도우" 또는 "마스크"가 표적 서열들로 작용할 수 있는 크기 범위에서 서열들을 동정하기 위한 표적 RNA 서열상에 문자 그대로 또는 비유적으로(예컨대, 컴퓨터 내(in silico) 포함) 놓이게 되는 실험적인 접근법도 취할 수 있다. "윈도우" 서열을 최초 표적 서열 위치의 하나의 뉴클레오티드 상류 또는 하류로 점진적으로 이동시킴으로써, 다음의 잠재적인 표적 서열은 가능한 서열들의 완전한 세트가 선택된 임의의 주어진 표적 크기에 대하여 동정될 때까지 동정될 수 있다. (본원에 기술되거나 당업계에 알려진 분석법을 이용하여) 동정된 서열들의 체계적인 합성 및 시험과 결합되어 최적으로 수행하는 그러한 서열들을 동정하는 이러한 공정은 iRNA 작용제를 사용하여 표적화되는 경우, 표적 유전자 발현의 최적의 억제를 매개하는 그러한 RNA 서열들을 동정할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에서 동정된 서열들이 효과적인 표적 서열들을 나타내는 반면에, 억제 효율의 추가의 최적화는 주어진 서열들의 하나의 뉴클레오티드 상류 또는 하류로 점진적으로 "윈도우를 보행"하여 동일하거나 더 나은 억제 특징들을 갖는 서열들을 동정함으로써 달성될 수 있다는 것이 고려된다.
또한, 예컨대, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에서 동정된 임의의 서열에 대하여, 추가의 최적화가 뉴클레오티드를 체계적으로 더하거나 제거하여 더 길거나 더 짧은 서열들을 발생시키고 그 지점으로부터 표적 RNA의 상향 또는 하향으로 크기가 더 길거나 더 짧은 윈도우를 보행함으로써 생성된 그러한 서열들을 시험함으로써 달성될 수 있다는 것이 고려된다. 또한, 신규한 후보 표적을 생성하기 위한 이러한 접근법을 당업계에 알려지고/지거나 본원에 기술된 바와 같은 억제 분석법에서의 그러한 표적 서열들에 기초한 iRNA의 유효성에 대한 시험과 결합하면, 억제의 효율에 있어서 추가의 개선으로 이어질 수 있다. 또한, 그러한 최적화된 서열들은 예컨대, 본원에 기술되거나 당업계에 알려진 바와 같이 변형 뉴클레오티드의 도입, 오버행에 있어서 추가 또는 변경, 또는 당업계에 알려지고/지거나 본원에 기술된 바와 같은 다른 변형으로 발현 억제제로서 분자를 추가로 최적화시킴으로써(예컨대, 혈청 안정성 또는 순환 반감기의 증가, 열 안정성의 증가, 막횡단 전달의 향상, 특정 위치 또는 세포 유형으로의 표적화, 침묵화 경로 효소와의 상호작용의 증가, 엔도솜으로부터의 방출의 증가에 의해) 조정될 수 있다.
본원에 기술된 iRNA는 표적 서열에 대한 하나 이상의 미스매치들을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 iRNA는 3개 이하의 미스매치들을 포함한다. iRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치들을 포함한다면, 미스매치의 영역은 상보성 영역의 중심에 위치되지 않는 것이 바람직하다. iRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치들을 포함한다면, 미스매치는 상보성 영역의 5'- 또는 3'-말단으로부터 마지막 5개의 뉴클레오티드 이내로 한정되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 23개 뉴클레오티드 iRNA 작용제에 대하여, C5 유전자의 영역에 대하여 상보적인 가닥은 일반적으로 중심 13개 뉴클레오티드 내에 임의의 미스매치를 포함하지 않는다. 본원에 기술된 방법 또는 당업계에 알려진 방법은 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하는 iRNA가 C5 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인지의 여부를 결정하는데 이용될 수 있다. C5 유전자의 발현을 억제하는데 있어서 미스매치들을 갖는 iRNA의 효능을 고려하는 것은 특히, C5 유전자에서 상보성의 특정 영역이 개체군 내에서 다형성 서열 변이를 갖는 것으로 알려져 있으면, 중요하다.
III. 본 발명의 변형된 iRNA
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 iRNA의 RNA, 예컨대, dsRNA는 변형되지 않으며, 예를 들어, 당업계에 알려져 있고 본원에 기술된 화학적 변형 및/또는 컨쥬게이션을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 iRNA의 RNA, 예를 들어, dsRNA는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 기타 유익한 특징들을 향상시킨다. 본 발명의 특정 실시형태들에 있어서, 본 발명의 iRNA의 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 iRNA의 모든 뉴클레오티드가 변형된다. "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형되는" 본 발명의 iRNA는 대부분 변형되지만, 완전히 변형되지 않으며, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 비변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 특성화된 핵산들은 본원에 참조로서 포함되어 있는 "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA에 기술된 방법들과 같이 당업계에 널리 확립된 방법에 의하여 합성되고/되거나 변형될 수 있다. 변형은 예를 들면, 말단 변형, 예컨대, 5'-말단 변형(인산화, 컨쥬게이션, 역위 결합) 또는 3'-말단 변형(컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 역위 결합 등); 염기 변형, 예컨대, 안정화 염기, 불안정화 염기 또는 파트너들의 연장된 레퍼토리와 염기 쌍을 이루는 염기로 대체, 염기들의 제거(무염기 뉴클레오티드), 또는 컨쥬게이트된 염기; 당 변형(예컨대, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 및/또는 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는 골격 변형을 포함한다. 본원에 기술된 실시형태들에서 유용한 iRNA 화합물들의 구체적인 예는 변형된 골격들 또는 비천연 뉴클레오시드간 결합들을 포함하는 RNA를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 변형된 골격을 갖는 RNA는 다른 RNA들 중에서, 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 이 명세서의 목적을 위하여, 그리고 때때로 당업계에서 참고되는 바와 같이, 그들 뉴클레오시드간 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA도 올리고뉴클레오시드인 것으로 고려될 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, 변형된 iRNA는 그의 뉴클레오시드간 골격 내에 인 원자를 가질 것이다.
변형 RNA 골격은 예를 들면, 포스포로티오에이트, 카이랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 카이랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보통의 3'-5' 결합, 이들의 2'-5' 결합된 유사체 및 반전된 극성을 갖는 것들을 갖는 보라노포스페이트를 포함하며, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍은 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2' 연결된다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리 산 형태도 포함된다.
상기 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 3,687,808호; 4,469,863호; 4,476,301호; 5,023,243호; 5,177,195호; 5,188,897호; 5,264,423호; 5,276,019호; 5,278,302호; 5,286,717호; 5,321,131호; 5,399,676호; 5,405,939호; 5,453,496호; 5,455,233호; 5,466,677호; 5,476,925호; 5,519,126호; 5,536,821호; 5,541,316호; 5,550,111호; 5,563,253호; 5,571,799호; 5,587,361호; 5,625,050호; 6,028,188호; 6,124,445호; 6,160,109호; 6,169,170호; 6,172,209호; 6,239,265호; 6,277,603호; 6,326,199호; 6,346,614호; 6,444,423호; 6,531,590호; 6,534,639호; 6,608,035호; 6,683,167호; 6,858,715호; 6,867,294호; 6,878,805호; 7,015,315호; 7,041,816호; 7,273,933호; 7,321,029호; 미국 특허 번호 RE39464호를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형 RNA 골격은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 결합에 의하여 형성된 골격을 갖는다. 이들은 (부분적으로는 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 결합; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 구성 부분을 갖는 다른 것들을 갖는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 각각의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,034,506호; 5,166,315호; 5,185,444호; 5,214,134호; 5,216,141호; 5,235,033호; 5,64,562호; 5,264,564호; 5,405,938호; 5,434,257호; 5,466,677호; 5,470,967호; 5,489,677호; 5,541,307호; 5,561,225호; 5,596,086호; 5,602,240호; 5,608,046호; 5,610,289호; 5,618,704호; 5,623,070호; 5,663,312호; 5,633,360호; 5,677,437호; 5,677,439호를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
다른 실시형태들에 있어서, 적당한 RNA 모방체는 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 결합, 즉, 골격이 신규한 기로 대체되는 iRNA에서 사용되는 것이 고려된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 하나의 그러한 올리고머 화합물, 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 RNA 모방체는 펩티드 핵산(PNA)이라고 한다. PNA 화합물에 있어서, RNA의 당 골격은 아미드 포함 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 뉴클레오염기는 유지되며 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 본 발명의 iRNA에 사용하기에 적당한 추가적인 PNA 화합물은 예를 들면, Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497-1500에 기술되어 있다.
본 발명에서 특성화된 일부 실시형태들은 포스포로티오에이트 골격을 갖는 RNA들 및 헤테로원자 골격, 특히, 상기 참조된 미국 특허 번호 5,489,677호의 --CH2--NH--CH2--, [메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 알려진] --CH2--N(CH3)--O--CH2--, --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2-- [여기서, 고유 포스포디에스테르 골격은 --O--P--O--CH2--로 표시됨] 및 상기 참조된 미국 특허 번호 5,602,240호의 아미드 골격을 갖는 올리고뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 본원에서 특성화된 RNA는 상기-참조된 미국 특허 번호 5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는다.
변형 RNA는 하나 이상의 치환된 당 모이어티들을 포함할 수도 있다. 본원에서 특성화된 iRNA, 예컨대, dsRNA는 2'-위치에서 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함할 수 있으며, 여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적당한 변형은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2을 포함하고, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 실시형태들에 있어서, dsRNA는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기(cleaving group), 리포터 기, 인터칼레이터, iRNA의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기 또는 iRNA의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기. 일부 실시형태들에 있어서, 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려진 2'-O--CH2CH2OCH3)(Martin 등, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 다른 예시적인 변형은 본원에서 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 알려진 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(당업계에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려짐), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다.
기타 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. iRNA의 RNA상의 기타 위치들, 특히, 3' 말단 뉴클레오티드 상 또는 2'-5' 결합된 dsRNA에서 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 유사한 변형이 이루어질 수 있다. iRNA는 펜토퓨라노실 당을 대신하여 사이클로부틸 모이어티들과 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 그러한 변형 당 구조의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 그중 일부가 당해 출원과 공유되어 있는 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 상기 특허들의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
iRNA는 (당업계에서 단순히 "염기"로 자주 지칭되는) 뉴클레오염기 변형 또는 치환을 포함할 수도 있다. 본원에 사용된 "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형 뉴클레오염기는 데옥시-티민(dT), 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 기타 합성 및 천연 뉴클레오염기를 포함한다. 다른 뉴클레오염기는 미국 특허 번호 3,687,808호에 개시된 것들, Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008에 개시된 것들; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것들, Englisch 등, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에 개시된 것들 및 Sanghvi, Y S., Chapter 15, DsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993에 개시된 것들을 포함한다. 이들 뉴클레오염기들 중 특정한 것들은 본 발명에서 특성화된 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환으로 인해 핵산 듀플렉스 안정성이 0.6℃ 내지 1.2℃ 정도 증가하는 것으로 밝혀져 있으며(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 더욱 특히, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우의 예시적인 염기 치환이다.
상기 언급된 특정 변형 뉴클레오염기 및 기타 변형 뉴클레오염기의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 상기 표시된 미국 특허 번호 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; 및 7,495,088호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
iRNA의 RNA는 변형되어 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)를 포함할 수도 있다. 잠금 핵산은 변형된 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이며, 상기 리보오스 모이어티는 2' 및 4 탄소들을 연결하는 여분의 다리를 포함한다. 이러한 구조는 3'-엔도 구조 형태(conformation)에서 리보오스를 효과적으로 "잠근다". siRNA에 잠금 핵산을 첨가하면 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 오프-표적(off-target) 효과를 감소시키는 것으로 밝혀져 있다(Elmen, J. 등, (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. 등, (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. 등, (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
잠금 핵산 뉴클레오티드의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,268,490; 6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; 및 7,399,845호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
RNA 분자의 말단에 대한 잠재적인 안정화 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-히드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-0-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 역전된 염기 dT(idT) 등을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 개시내용은 PCT 공개 번호 WO 2011/005861호에서 찾을 수 있다.
A. 본 발명의 모티프를 포함하는 변형 iRNA
본 발명의 특정 양태에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는, 예를 들어, 2011년 11월 18일에 출원된 미국 가출원 제61/561,710호 또는 2012년 11월 16일에 출원된 PCT/US2012/065691호에 개시된 바와 같은 화학적 변형을 갖는 작용제를 포함한다.
본원 및 가출원 제61/561,710호 또는 PCR 출원 PCT/US2012/065691호에 나타낸 바와 같이, 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나 이상의 모티프를 RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에, 특히 절단 부위에 또는 그 근처에 도입함으로써 우수한 결과가 수득될 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 다르게는 완전히 변형될 수 있다. 이들 모티프의 도입은 존재하는 경우, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 방해한다. RNAi 작용제는 선택적으로, 예를 들어 센스 가닥 상에서, GalNAc 유도체 리간드와 컨쥬게이트될 수 있다. 생성되는 RNAi 작용제는 우수한 유전자 침묵화 활성을 제시한다.
더욱 구체적으로, 놀랍게도, 이중 가닥 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에서, 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 하나 이상 갖도록 완전히 변형되는 경우, RNAi 작용제의 유전자 침묵화 활성을 상당히 증대시킴을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 생체 내에서 표적 유전자(즉, 보체 성분 C5(C5) 유전자)의 발현을 억제할 수 있는 이중-가닥 RNAi 작용제를 제공한다. RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 작용제의 각각의 가닥은 길이가 12 내지 30개 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 예를 들어, 각각의 가닥은 길이가 14 내지 30개 뉴클레오티드, 길이가 17 내지 30개 뉴클레오티드, 길이가 25 내지 30개 뉴클레오티드, 길이가 27 내지 30개 뉴클레오티드, 길이가 17 내지 23개 뉴클레오티드, 길이가 17 내지 21개 뉴클레오티드, 길이가 17 내지 19개 뉴클레오티드, 길이가 19 내지 25개 뉴클레오티드, 길이가 19 내지 23개 뉴클레오티드, 길이가 19 내지 21개 뉴클레오티드, 길이가 21 내지 25개 뉴클레오티드, 또는 길이가 21 내지 23개 뉴클레오티드일 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 전형적으로 본원에서 "RNAi 작용제"로도 지칭되는 듀플렉스 이중 가닥 RNA("dsNRA")를 형성한다. RNAi 작용제의 듀플렉스 영역은 길이가 12 내지 30개 뉴클레오티드 쌍일 수 있다. 예를 들어, 듀플렉스 영역은 길이가 14 내지 30개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 17 내지 30개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 27 내지 30개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 17 내지 23개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 17 내지 21개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 17 내지 19개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 19 내지 25개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 19 내지 23개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 19 내지 21개 뉴클레오티드 쌍, 길이가 21 내지 25개 뉴클레오티드 쌍, 또는 길이가 21 내지 23개 뉴클레오티드 쌍일 수 있다. 다른 예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27개 뉴클레오티드로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 하나 또는 둘 모두의 가닥의 3' 말단, 5' 말단 또는 양 말단에 하나 이상의 오버행 영역 및/또는 캡핑기(capping group)를 포함할 수 있다. 오버행은 길이가 1 내지 6개 뉴클레오티드, 예를 들어 길이가 2 내지 6개 뉴클레오티드, 길이가 1 내지 5개 뉴클레오티드, 길이가 2 내지 5개 뉴클레오티드, 길이가 1 내지 4개 뉴클레오티드, 길이가 2 내지 4개 뉴클레오티드, 길이가 1 내지 3개 뉴클레오티드, 길이가 2 내지 3개 뉴클레오티드, 또는 길이가 1 내지 2개 뉴클레오티드일 수 있다. 오버행은 하나의 가닥이 다른 가닥보다 더 길어서 생기는 것이거나, 또는 동일한 길이의 가닥 2개가 서로 엇갈려서 생기는 것일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 오버행은 표적화된 유전자 서열과 상보적일 수 있거나 또는 다른 서열일 수 있다. 제1 가닥과 제2 가닥은 또한, 예를 들어, 추가의 염기에 의해 결합되어 헤어핀을 형성할 수 있거나, 또는 다른 비-염기 링커에 의해 결합될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제의 오버행 영역 내의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로, 2'-당 변형, 예를 들어, 2-F, 2'-O메틸, 티미딘(T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo), 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 변형 또는 비변형 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, TT는 어느 한 가닥 상의 어느 한 말단에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 오버행은 표적화된 유전자 서열과 상보적일 수 있거나 또는 다른 서열일 수 있다.
RNAi 작용제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥 모두에 있는 5' 또는 3' 오버행은 인산화될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 오버행 영역(들)은 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트를 가지는 2개의 뉴클레오티드를 포함하며, 2개의 뉴클레오티드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥의 3'-말단에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 이러한 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 이러한 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
RNAi 작용제는, RNAi의 전체적인 안정성에 영향을 미치지 않으면서 이의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단에 위치하거나, 또는 다르게는, 안티센스 가닥의 3'-말단 말단에 위치할 수 있다. RNAi는 또한, 안티센스 가닥의 5'-말단 (또는 센스 가닥의 3'-말단)에 위치하거나 또는 그 반대로 위치하는 평활성 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, RNAi의 안티센스 가닥은 3'-말단에 뉴클레오티드 오버행을 가지며, 5'-말단이 평활성이다. 이론에 구속되지 않으면서, 안티센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행에서의 비대칭적 평활성 말단은 길잡이 가닥이 RISC 공정으로 로딩되는 것을 돕는다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 길이가 19개 뉴클레오티드인 이중 말단 블런트머(bluntmer)이며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 7, 8, 9에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 길이가 20개 뉴클레오티드인 이중 말단 블런트머이며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 8, 9, 10에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 길이가 21개 뉴클레오티드인 이중 말단 블런트머이며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 21개 뉴클레오티드 센스 가닥 및 23개 뉴클레오티드 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함하며; 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함하고, RNAi 작용제의 하나의 말단은 평활성인 한편, 다른 말단은 2개 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 바람직하게는, 2개 뉴클레오티드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재한다. 2개 뉴클레오티드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재하는 경우, 3개의 말단 뉴클레오티드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 존재할 수 있으며, 3개의 뉴클레오티드 중 2개는 오버행 뉴클레오티드이고, 제3 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 바로 옆의 쌍을 이루는 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에서 3개의 말단 뉴클레오티드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 모티프의 일부인 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내의 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에 있어서, 각각의 잔기는 예를 들어, 교대 모티프에서, 독립적으로 2'-O-메틸 또는 3'-플루오로로 변형된다. 선택적으로, RNAi 작용제는 리간드(바람직하게는 GalNAc3)를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 길이가 25 내지 30개 뉴클레오티드 잔기들이며, 5' 말단 뉴클레오티드(위치 1)에서 시작하여, 제1 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8개의 리보뉴클레오티드를 포함하고; 안티센스 가닥은 길이가 36 내지 66개 뉴클레오티드 잔기들이며, 3' 말단 뉴클레오티드에서 시작하여, 센스 가닥의 위치 1 내지 23과 쌍을 이루는 위치에서 적어도 8개의 리보뉴클레오티드를 포함하여, 듀플렉스를 형성하며; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않으며, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않고, 이에 의해, 1 내지 6개 뉴클레오티드로 된 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 이루지 않는 10 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하여, 이에 의해, 10 내지 30개 뉴클레오티드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 센스 및 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬되는 경우, 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루어, 이에 의해, 센스 및 안티센스 가닥 간에 실질적으로 듀플렉스 영역을 형성하며; 안티센스 가닥은 이중 가닥 핵산이 포유류 세포로 도입되는 경우, 표적 유전자 발현을 감소시키도록, 적어도 19개 리보뉴클레오티드의 안티센스 가닥 길이를 따라 표적 RNA에 충분히 상보적이고; 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오티드에 3개의 2'-F 변형으로 된 적어도 하나의 모티프를 함유하며, 모티프 중 적어도 하나는 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 안티센스 가닥은 절단 부위에 또는 그 근처에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형들로 된 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, RNAi 작용제는 적어도 25개, 최대 29개 뉴클레오티드인 길이를 갖는 제1 가닥, 및 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속적인 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 갖는 최대 30개 뉴클레오티드인 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 제1 가닥의 3' 말단 및 제2 가닥의 5' 말단은 평활성 말단을 형성하며, 제2 가닥은 그의 3' 말단에서 제1 가닥보다 1 내지 4개 뉴클레오티드가 더 길고, 듀플렉스 영역은 길이가 적어도 25개 뉴클레오티드인 영역이며, 제2 가닥은 제2 가닥 길이의 적어도 19개 뉴클레오티드를 따라, RNAi 작용제가 포유류 세포 내로 도입되는 경우 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 충분히 표적 mRNA에 상보적이고, RNAi 작용제의 다이서 절단은 제2 가닥의 3' 말단을 포함하는 siRNA를 야기하여, 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, RNAi 작용제는 리간드를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함하며, 모티프 중 하나는 센스 가닥의 절단 부위에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함할 수 있으며, 모티프 중 하나는 안티센스 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 발생하기도 한다.
길이가 17 내지 23개 뉴클레오티드인 듀플렉스 영역을 가지는 RNAi 작용제에서, 안티센스 가닥의 절단 부위는 전형적으로 5'-말단으로부터 대략 위치 10, 11 및 12 주변에 존재한다. 따라서, 3개의 동일한 변형이 있는 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 위치 10, 11, 12; 위치 11, 12, 13; 위치 12, 13, 14; 또는 위치 13, 14, 15에 존재할 수 있으며, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드로부터 시작하거나, 또는 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오티드로부터 시작한다. 안티센스 가닥의 절단 부위는 또한, 5'-말단으로부터 RNAi의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변할 수도 있다.
RNAi 작용제의 센스 가닥은, 가닥의 절단 부위에서, 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함할 수 있으며; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에, 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 가질 수 있다. 센스 가닥과 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 또한, 센스 가닥 상의 3개의 뉴클레오티드가 있는 하나의 모티프와 안티센스 가닥 상의 3개의 뉴클레오티드가 있는 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오티드 중첩을 가지도록, 즉, 센스 가닥의 모티프의 3개의 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 안티센스 가닥의 모티프의 3개의 뉴클레오티드 중 적어도 하나와 염기쌍을 형성하도록, 정렬될 수 있다. 다르게는, 적어도 2개의 뉴클레오티드가 중첩될 수 있거나, 3개 모두의 뉴클레오티드가 중첩될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 하나 초과해서 포함할 수 있다. 제1 모티프는 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재할 수 있으며, 다른 모티프는 윙(wing) 변형일 수 있다. 본원에서, "윙 변형"이라는 용어는 동일한 가닥의 절단 부위의 또는 그 근처의 모티프로부터 분리된, 가닥의 다른 부위에 존재하는 모티프를 지칭한다. 윙 변형은 제1 모티프에 인접해 있거나, 또는 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 모티프가 서로 바로 인접해 있는 경우 모티프의 화학적 성질은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 경우 모티프의 화학적 성질은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 2개 이상의 윙 변형이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2개의 윙 변형이 존재하는 경우, 각각의 윙 변형은 절단 부위에 또는 그 근처에 존재하는 제1 모티프에 대해 하나의 말단에서 또는 선도 모티프의 어느 하나의 측에 존재할 수 있다.
센스 가닥처럼, RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 1개 초과하여 포함할 수 있으며, 모티프 중 적어도 하나는 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 이러한 안티센스 가닥은 또한, 센스 가닥에 존재할 수 있는 윙 변형과 유사한 정렬의 윙 변형을 하나 이상 포함할 수도 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 전형적으로, 가닥의 3'-말단, 5'-말단 또는 양 말단 모두에서 1개 또는 2개의 제1 말단 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 전형적으로, 가닥의 3'-말단, 5'-말단 또는 양 말단 모두에서 듀플렉스 영역 내에 1개 또는 2개의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 변형을 포함하는 경우, 윙 변형은 듀플렉스 영역의 동일한 말단에 존재할 수 있으며, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드의 중첩을 가진다.
RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2개의 윙 변형을 포함하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은, 하나의 가닥의 2개의 변형이 각각 듀플렉스 영역의 하나의 말단에 존재하고, 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드의 중첩을 갖거나; 하나의 가닥의 2개의 변형이 각각 듀플렉스 영역의 다른 말단에 존재하고, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드 중첩을 갖거나; 하나의 가닥의 2개의 변형이 선도 모티프의 각각의 측에 존재하고, 듀플렉스 영역에서 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드의 중첩을 갖도록 정렬될 수도 있다.
일 실시형태에 있어서, 모티프의 일부인 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내의 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오티드는, 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경; 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당의 2'-히드록실의 변경; 포스페이트 모이어티의 "데포스포" 링커로의 대체; 자연 발생 염기의 변형 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형을 하나 이상 포함할 수 있는 동일하거나 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
핵산이 하위단위의 중합체이기 때문에, 다수의 변형들은 핵산에서 반복되는 위치에서 발생하며, 이는 예를 들어, 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O의 변형이다. 일부 경우에, 변형은 핵산의 모든 대상 위치에서 발생할 것이지만, 많은 경우 그렇지 않을 것이다. 예를 들어, 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있으며, 가닥의 말단 영역, 예를 들어 말단 뉴클레오티드 상의 위치, 또는 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오티드에서 발생할 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 두 영역 모두에서 발생할 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나, 또는 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-연결 O 위치에서의 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 말단 또는 양 말단 모두에서만 발생할 수 있거나, 가닥의 말단 영역, 예를 들어, 말단 뉴클레오티드 상의 위치 또는 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오티드에서만 발생할 수 있거나, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5' 말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 증대시키거나, 오버행에 특정 염기들을 포함하거나, 또는 단일 가닥 오버행, 예를 들어 5' 또는 3' 오버행 또는 둘 다에 변형 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 대리물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, 3' 또는 5' 오버행 내의 염기들 중 모두 또는 일부는 변형되는데, 예를 들어, 본원에서 기술된 변형으로 변형될 수 있다. 변형으로는, 예를 들어, 당업계에 공지된 변형을 가지는 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예를 들어, 핵염기의 리보당 대신에 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 2'-O-메틸의 사용, 및 포스페이트 기에서의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형이 포함될 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요가 없다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-히드록실 또는 2'-플루오로로 변형된다. 가닥은 변형을 하나 초과해서 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 잔기는 각각 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다.
적어도 2개의 상이한 변형은 전형적으로, 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 존재한다. 그들 2개의 변형들은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 또는 그외의 변형일 수 있다.
일 실시형태에 있어서, Na 및/또는 Nb는 교대 패턴의 변형을 포함한다. 본원에서 사용되는, "교대 모티프"라는 용어는 하나 이상의 변형을 갖는 모티프를 지칭하며, 각각의 변형은 하나의 가닥의 교대 뉴클레오티드에서 발생한다. 교대 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 2개마다 하나, 또는 뉴클레오티드 3개마다 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C가 각각 뉴클레오티드에 대한 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교대 모티프는 "ABABABABABAB...", "ABBAABBAABB...", "AABAABAABAAB...", "AAABAAABAAAB...", "AAABBBAAABBB..." 또는 "ABCABCABCABC..." 등일 수 있다.
교대 모티프에 포함되는 변형의 유형은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D가 각각 뉴클레오티드 상에서 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교대 패턴, 즉 2개 뉴클레오티드마다의 변형은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 각각 교대 모티프 예컨대 "ABABAB...", "ACACAC...", "BDBDBD..." 또는 "CDCDCD..." 등에서의 몇몇 가능한 변형으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는, 안티센스 가닥에서의 교대 모티프에 대한 변형 패턴에 비하여 이동된, 센스 가닥에서의 교대 모티프에 대한 변형 패턴을 포함한다. 이 이동은, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 변형된 기가 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 상이하게 변형된 기에 상응하도록 이루어질 수 있으며, 그 반대이기도 하다. 예를 들어, 센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스에서 안티센스 가닥과 쌍을 이루는 경우, 센스 가닥의 교대 모티프는 가닥의 5'-3'으로부터 "ABABAB"로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 교대 모티프는 듀플렉스 영역의 가닥의 5'-3'으로부터 "BABABA"로부터 시작할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥의 교대 모티프는 가닥의 5'-3'으로부터 "AABBAABB"로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 교대 모티프는 듀플렉스 영역 내의 가닥의 5'-3'으로부터 "BBAABBAA"로 시작하여, 센스 가닥과 안티센스 가닥 간의 변형 패턴의 완전하거나 또는 부분적인 이동이 존재하도록 할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 처음의 안티센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형의 교대 모티프의 패턴에 대해 이동을 갖는 처음의 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형의 교대 모티프의 패턴을 포함하며, 즉, 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드는 안티센스 가닥 상의 2'-F 변형 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루며 또 그 반대이기도 하다. 센스 가닥의 위치 1은 2'-F 변형으로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 위치 1은 2'-O-메틸 변형으로 시작할 수 있다.
3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프 하나 이상을 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 도입하는 것은, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 존재하는 초기 변형 패턴을 방해한다. 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프 하나 이상을 센스 및/또는 안티센스 가닥에 도입함으로써 센스 및/또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 방해하는 것은 놀랍게도, 표적 유전자에 대한 유전자 침묵화 활성을 증대시킨다.
일 실시형태에 있어서, 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프가 임의의 가닥에 도입되는 경우, 모티프의 옆에 있는 뉴클레오티드의 변형은 모티프의 변형과 상이한 변형이다. 예를 들어, 모티프를 포함하는 서열의 부분은 "...NaYYYNb...,"로서, "Y"는 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프의 변형을 나타내며, "Na" 및 "Nb"는 Y의 변형과 상이한 모티프 "YYY"의 옆에 있는 뉴클레오티드의 변형을 나타내며, Na 및 Nb는 동일하거나 또는 상이한 변형일 수 있다. 다르게는, Na 및/또는 Nb는 윙 변형이 존재하는 경우 존재하거나 또는 부재할 수 있다.
RNAi 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합 변형은 가닥의 임의의 위치에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 둘 모두의 가닥의 임의의 뉴클레오티드에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드간 결합 변형은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드에서 발생할 수 있거나; 각각의 뉴클레오티드간 결합 변형은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 교대 패턴으로 발생할 수 있거나; 또는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교대 패턴에서 뉴클레오티드간 결합 변형 둘 다를 포함한다. 센스 가닥에서의 뉴클레오티드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 센스 가닥에서의 뉴클레오티드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥에서의 뉴클레오티드간 결합 변형의 교대 패턴에 대해 이동을 가질 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 6 내지 8개 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합과 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함하며, 센스 가닥은 5'-말단 또는 3'-말단 중 어느 하나에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오티드 간에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 가지는 2개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드간 결합 변형은 또한, 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 말단 뉴클레오티드와 오버행 뉴클레오티드를 연결하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4개 또는 모든 오버행 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 통해 연결될 수 있으며, 선택적으로, 오버행 뉴클레오티드의 옆에 존재하는 쌍을 이루는 뉴클레오티드와 오버행 뉴클레오티드를 연결하는 부가적인 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합이 존재할 수 있다. 예를 들어, 3개의 말단 뉴클레오티드 간에는 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 존재할 수 있으며, 3개의 뉴클레오티드 중 2개는 오버행 뉴클레오티드이며, 제3 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 옆의 쌍을 이루는 뉴클레오티드이다. 이들 3개의 말단 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 3'-말단, 센스 가닥의 3'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단 및/또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 존재할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 2개 뉴클레오티드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재하며, 3개의 말단 뉴클레오티드 사이에는 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 존재하고, 3개의 뉴클레오티드 중 2개는 오버행 뉴클레오티드이며, 제3 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 옆의 쌍을 이루는 뉴클레오티드이다. 선택적으로, RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에서 3개의 말단 뉴클레오티드 간에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 가질 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 듀플렉스 내에서 표적과의 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 특성을 토대로 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 짝지음의 회합 또는 해리의 자유 에너지를 토대로, 가장 간단한 방법은 개별 쌍 기준으로 쌍을 시험하는 것이지만, 다음의 인접한 또는 유사한 분석이 또한 사용될 수 있음). 해리의 촉진 면에서, A:U는 G:C보다 바람직하며; G:U는 G:C보다 바람직하고; I:C는 G:C보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-원형(canonical) 또는 원형 짝지음 이외의 짝지음(전술한 바와 같음)은 원형(A:T, A:U, G:C) 짝지음보다 바람직하며; 보편적인 염기를 포함하는 짝지음이 원형 짝지음보다 바람직하다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 듀플렉스의 5' 말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 독립적으로 A:U, G:U, I:C, 및 미스매칭된 쌍, 예를 들어, 비-원형 또는 원형 짝지음 이외의 짝지음 또는 보편적인 염기를 포함하는 짝지음의 군으로부터 선택되는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 처음의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 위치 1의 뉴클레오티드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 구성된 군으로부터 선택된다. 다르게는, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 1, 2 또는 3개의 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음의 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 3'-말단에서 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT)이다. 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 3'-말단에서 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT)이다. 일 실시형태에 있어서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 3'-말단에 데옥시-티민 뉴클레오티드, 예를 들어, 2개의 dT 뉴클레오티드로 된 짧은 서열이 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥 서열은 화학식 (I)로 표시될 수 있다:
Figure 112021145756847-pat00019

상기 식에서,
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na는 각각 독립적으로 0 내지 25개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb는 각각 독립적으로 0 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np 및 nq는 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내며;
Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;
XXX, YYY 및 ZZZ는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타낸다. 바람직하게는, YYY는 모든 2'-F 변형 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, Na 및/또는 Nb는 교대 패턴의 변형을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 예를 들어, RNAi 작용제가 17 내지 23개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재할 수 있으며(예를 들어, 위치 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 또는 11, 12, 13에서 발생할 수 있음), 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드에서 시작하거나; 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오티드에서 시작한다.
일 실시형태에 있어서, i는 1이고 j는 0이거나, 또는 i는 0이고 j는 1이거나, 또는 i 및 j는 둘다 1이다. 따라서, 센스 가닥은 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
Figure 112021145756847-pat00020

센스 가닥이 화학식 (Ib)로 표시되는 경우, Nb는 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 0 내지 2개 또는 0개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 화학식 (Ic)로 표시되는 경우, Nb는 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 0 내지 2개 또는 0개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 화학식 (Id)로 표시되는 경우, Nb는 각각 독립적으로 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 0 내지 2개 또는 0개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 바람직하게는, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. Na는 각각 독립적으로, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
X, Y 및 Z는 각각 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, i는 0이고, j는 0이며, 센스 가닥은 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
Figure 112021145756847-pat00021

센스 가닥이 화학식 (Ia)로 표시되는 경우, Na는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi의 안티센스 가닥 서열은 화학식 (II)로 표시될 수 있다:
Figure 112021145756847-pat00022

상기 식에서,
k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p' 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na'는 각각 독립적으로 0 내지 25개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb'는 각각 독립적으로 0 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np' 및 nq'는 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내며;
Nb' 및 Y'는 동일한 변형을 갖지 않고;
X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, Na' 및/또는 Nb'는 교대 패턴의 변형을 포함한다.
Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 예를 들어, RNAi 작용제가 17 내지 23개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; 또는 13, 14, 15에 존재할 수 있으며, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드에서 시작하거나; 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오티드에서 시작한다. 바람직하게는, Y'Y'Y' 모티프는 위치 11, 12, 13에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, Y'Y'Y' 모티프는 모두 2'-OMe 변형 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, k는 1이고 l은 0이거나, 또는 k는 0이고 l은 1이거나, 또는 k 및 l은 둘 모두 1이다.
따라서, 안티센스 가닥은 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
Figure 112021145756847-pat00023

안티센스 가닥이 화학식 (IIb)로 표시되는 경우, Nb'는 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 0 내지 2개 또는 0개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na'는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 화학식 (IIc)로 표시되는 경우, Nb'는 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 0 내지 2개 또는 0개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na'는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 화학식 (IId)로 표시되는 경우, Nb'는 각각 독립적으로 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 0 내지 2개 또는 0개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na'는 각각 독립적으로, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 바람직하게는 Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
다른 실시형태에 있어서, k는 0이고, l은 0이며, 안티센스 가닥은 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
Figure 112021145756847-pat00024
.
안티센스 가닥이 화학식 (IIa)로 표시되는 경우, Na'는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
X', Y' 및 Z'는 각각 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-히드록실, 또는 2'-플루오로로 변형될 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 독립적으로, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 특히, 각각의 X, Y, Z, X', Y' 및 Z'는 2'-O-메틸 변형 또는 2'-플루오로 변형을 나타낼 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21개 뉴클레오티드인 경우 가닥의 위치 9, 10 및 11에 존재하는 YYY 모티프를 포함할 수 있으며, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드에서 시작하거나, 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오티드에서 시작하고; Y는 2'-F 변형을 나타낸다. 센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대쪽 말단에 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 윙 변형으로서 포함할 수 있으며; XXX 및 ZZZ은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 가닥의 위치 11, 12 및 13에 존재하는 Y'Y'Y' 모티프를 포함할 수 있으며, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드에서 시작하거나, 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오티드에서 시작하며; Y'는 2'-O-메틸 변형을 나타낸다. 안티센스 가닥은 부가적으로, 듀플렉스 영역의 반대쪽 말단에 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 윙 변형으로서 포함하며; X'X'X' 및 Z'Z'Z'은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
상기 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id) 중 어느 하나로 표시되는 센스 가닥은 각각 화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId) 중 어느 하나로 표시되는 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있으며, 각각의 가닥은 14 내지 30개의 뉴클레오티드를 가지며, RNAi 듀플렉스는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112021145756847-pat00025

상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 0 내지 25개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 0 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
np', np, nq' 및 nq는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, i는 0이고, j는 0이거나; i는 1이고, j는 0이거나; i는 0이고, j는 1이거나; i 및 j 둘 모두는 0이거나; i 및 j 둘 모두는 1이다. 다른 실시형태에 있어서, k는 0이고, l은 0이거나; k는 1이고, l은 0이거나; k는 0이고, l은 1이거나; k 및 l 둘 모두는 0이거나; k 및 l 둘 모두는 1이다.
RNAi 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 하기의 화학식을 포함한다:
Figure 112021145756847-pat00026

Figure 112021145756847-pat00027

RNAi 작용제가 화학식 (IIIa)로 표시되는 경우, Na는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIIb)로 표시되는 경우, Nb는 각각 독립적으로 1 내지 10개, 1 내지 7개, 1 내지 5개 또는 1 내지 4개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIIc)로 표시되는 경우, Nb, Nb'는 각각 독립적으로 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 0 내지 2개 또는 0개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIId)로 표시되는 경우, Nb, Nb'는 각각 독립적으로 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 10개, 0 내지 7개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 0 내지 2개 또는 0개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na, Na'는 각각 독립적으로 2 내지 20개, 2 내지 15개 또는 2 내지 10개의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na, Na', Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 교대 패턴의 변형을 포함한다.
화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)에서 X, Y 및 Z의 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
RNAi 작용제가 화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)로 표시되는 경우, Y 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 Y' 뉴클레오티드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Y 뉴클레오티드 중 적어도 2개는 상응하는 Y' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하거나; Y 뉴클레오티드 중 3개 모두는 상응하는 Y' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIIb) 또는 (IIId)로 표시되는 경우, Z 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 Z' 뉴클레오티드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Z 뉴클레오티드 중 적어도 2개는 상응하는 Z' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하거나; Z 뉴클레오티드 중 3개 모두는 상응하는 Z' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIIc) 또는 (IIId)로 표시되는 경우, X 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 X' 뉴클레오티드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, X 뉴클레오티드 중 적어도 2개는 상응하는 X' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하거나; X 뉴클레오티드 중 3개 모두는 상응하는 X' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다.
일 실시형태에 있어서, Y 뉴클레오티드 상의 변형은 Y' 뉴클레오티드 상의 변형과 상이하고/거나, Z 뉴클레오티드 상의 변형은 Z' 뉴클레오티드 상의 변형과 상이하고/거나, X 뉴클레오티드 상의 변형은 X' 뉴클레오티드 상의 변형과 상이하다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제가 화학식 (IIId)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 다른 실시형태에 있어서, RNAi 작용제가 (IIId)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'는 0 초과이며, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결된다. 또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 작용제가 화학식 (IIId)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'는 0 초과이며, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다(하기 기술). 다른 실시형태에 있어서, RNAi 작용제가 화학식 (IIId)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'는 0 초과이며, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제가 화학식 (IIIa)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'는 0 초과이며, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)로 표시되는 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 다량체이며, 상기 듀플렉스들은 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단가능하거나 비-절단가능할 수 있다. 선택적으로, 상기 다량체는 리간드를 추가로 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적할 수 있거나; 또는 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 작용제는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)로 표시되는 3, 4, 5, 6개 이상의 듀플렉스를 함유하는 다량체이며, 상기 듀플렉스들은 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단가능하거나 비-절단가능할 수 있다. 선택적으로, 상기 다량체는 리간드를 추가로 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적할 수 있거나; 또는 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)로 표시되는 2개의 RNAi 작용제들은 5' 말단에서 서로 연결되며, 3' 말단 중 하나 또는 둘 모두는 리간드에 선택적으로 컨쥬게이트된다. 작용제 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적할 수 있거나; 또는 작용제 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적할 수 있다.
다양한 공개문헌은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다량체 RNAi 작용제를 기술한다. 그러한 공개문헌은 제WO2007/091269호, 미국 특허 제7858769호, 제WO2010/141511호, 제WO2007/117686호, 제WO2009/014887호 및 제WO2011/031520호를 포함하며, 그들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
하기에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, RNAi 작용제로의 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 컨쥬게이션을 포함하는 RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 하나 이상의 특성을 최적화할 수 있다. 많은 경우에, 탄수화물 모이어티는 RNAi 작용제의 변형된 서브유닛에 부착될 것이다. 예를 들어, dsRNA 작용제의 하나 이상의 리보뉴클레오티드 서브유닛의 리보스 당은 다른 모이어티, 예를 들어, 탄수화물 리간드가 부착되는 비-탄수화물(바람직하게는 사이클릭) 캐리어로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보스 당이 대체된 리보뉴클레오티드 서브유닛은 본원에서, 리보스 대체 변형 서브유닛(RRMS)으로 지칭된다. 사이클릭 캐리어는 카르보사이클릭 고리계일 수 있으며, 즉 모든 고리 원자들이 탄소 원자 또는 헤테로사이클릭 고리계일 수 있으며, 즉, 하나 이상의 고리 원자는 예를 들어, 질소, 산소, 황과 같은 헤테로원자일 수 있다. 사이클릭 캐리어는 모노사이클릭 고리계일 수 있거나, 또는 2개 이상의 고리, 예를 들어, 융합 고리를 포함할 수 있다. 사이클릭 캐리어는 완전히 포화된 고리계일 수 있거나, 또는 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있다.
리간드는 캐리어를 통해 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 캐리어로는, (i) 적어도 하나의 "골격 부착점", 바람직하게는 2개의 "골격 부착점", 및 (ii) 적어도 하나의 "테터링(tethering) 부착점"이 포함된다. 본원에 사용된, "골격 부착점"은 히드록실기와 같은 기능기, 또는 일반적으로 골격, 예를 들어, 리보핵산의 포스페이트, 또는 변형된 포스페이트, 예를 들어, 황 함유 골격으로의 캐리어의 혼입에 적절하며 이에 이용가능한 결합을 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, "테터링 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는 (골격 부착점을 제공하는 원자와 구별되는) 탄소 원자 또는 헤테로원자와 같은 사이클릭 캐리어의 구성원 고리 원자를 지칭한다. 모이어티는, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 및 다당류와 같은 탄수화물일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 개재 테터링에 의해 사이클릭 캐리어로 연결된다. 따라서, 사이클릭 캐리어는 종종 아미노기와 같은 기능기를 포함하거나, 또는 일반적으로 구성분 고리로의 리간드와 같은 다른 화학적 엔터티(entity)의 혼입 또는 테터링에 적절한 결합을 제공한다.
RNAi 작용제는 캐리어를 통해 리간드에 컨쥬게이트될 수 있으며, 캐리어는 사이클릭기 또는 비-사이클릭기일 수 있으며; 바람직하게는, 사이클릭기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸릴 및 데칼린으로부터 선택되며; 바람직하게는, 비-사이클릭기는 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격으로부터 선택된다.
구체적인 특정 실시형태들에 있어서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 RNAi 작용제는 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 18, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 23 중 어느 하나에 열거된 작용제의 그룹으로부터 선택되는 작용제이다. 이들 작용제는 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
IV. 리간드에 컨쥬게이트된 iRNA
본 발명의 iRNA의 RNA의 다른 변형은 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 섭취를 향상시키는 하나 이상의 리간드들, 모이어티들 또는 컨쥬게이트들을 RNA에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 그러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티(Letsinger 등, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산(Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예컨대, 베릴-S-트리틸티올(Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras 등, EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)와 같은 지질 모이어티들을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, 리간드는, 그것이 혼입되는 iRNA 작용제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경한다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 리간드는 선택된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 신체의 구획, 예를 들어, 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 영역에 대해, 그러한 리간드가 존재하지 않는 화학종과 비교하여, 향상된 친화성을 제공한다. 바람직한 리간드는 듀플렉스 핵산에서 듀플렉스 짝지음에 참여하지 않을 것이다.
리간드는 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 리포단백질(LDL), 또는 글로불린); 탄수화물(예컨대, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린, N-아세틸갈락토사민 또는 히알루론산); 또는 지질과 같은 자연 발생 물질을 포함할 수 있다. 리간드는 재조합 또는 합성 분자, 예를 들어, 합성 중합체, 예컨대, 합성 폴리아미노산일 수도 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예는: 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민(peptidomimetic polyamine), 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 헬리칼 펩티드를 포함한다.
리간드는 표적화기, 예컨대, 세포 또는 조직 표적 작용제, 예컨대, 렉틴, 글리코단백질, 지질 또는 단백질, 예컨대, 신장 세포와 같은 특정된 세포 유형과 결합하는 항체를 포함할 수도 있다. 표적화기는 갑상선 자극 호르몬, 멜라노트로핀, 렉틴, 글리코단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코스아민 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 글리코실화 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다.
리간드의 다른 예는 염료, 삽입성 작용제(예컨대, 아크리딘), 가교제(예컨대, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환 방향족 탄화수소(예컨대, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예컨대, EDTA), 친지방성 분자, 예컨대, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스틱산,O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜레닉산(cholenic acid), 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진)및 펩티드 컨쥬게이트(예컨대, 안테나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화 작용제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예컨대, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사선표지 마커, 효소, 합텐(예컨대, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예컨대, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예컨대, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 컨쥬게이트, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예컨대, 글리코단백질, 또는 펩티드, 예컨대, 공-리간드에 대한 특정 친화도를 갖는 분자, 또는 항체, 예컨대, 간세포와 같은 특정 세포 유형과 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수도 있다. 이들은 비-펩티드성 화학종, 예를 들어, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스 또는 다가 푸코오스를 포함할 수도 있다. 리간드는 예를 들면, 리포다당류, p38 MAP 키나아제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예컨대, 세포의 미소관, 미세섬유 및/또는 중간 필라멘트를 파열시킴으로써 세포의 세포골격을 파열시킴으로써 예컨대, iRNA 작용제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 약물과 같은 물질일 수 있다. 약물은 예를 들면, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리데(japlakinolide), 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리데(swinholide) A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.
일부 실시형태들에 있어서, 본원에 기술된 iRNA에 부착된 리간드는 약동학적 조절제(PK 조절제)로 작용한다. PK 조절제는 친지체, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 수많은 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 혈청 단백질과 결합하는 것으로 알려져 있어서, 짧은 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 골격 내에서 복수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 약 5개 염기들, 10개 염기들, 15개 염기들 또는 20개 염기들의 올리고뉴클레오티드는 리간드로서(예컨대, PK 조절 리간드로서) 본 발명에 따른다. 또한, 혈청 성분(예컨대, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머도 본원에 기술된 실시형태들에 있어서 PK 조절 리간드로서의 용도에 적합하다.
본 발명의 리간드-컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드는 (아래에 기술된) 결합 분자를 올리고뉴클레오티드로 부착하여 유래된 것과 같이 펜던트 반응 작용기를 지니는 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 합성될 수 있다. 이 반응성 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 이용가능한 리간드, 다양한 보호기 중 어느 하나를 지니는 합성된 리간드 또는 이에 부착된 결합 모이어티를 갖는 리간드와 직접적으로 반응될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트에 이용되는 올리고뉴클레오티드는 고체상 합성의 주지의 기술을 통해 용이하게 통상적으로 제조될 수 있다. 그러한 합성을 위한 장비는 예를 들면, Applied Biosystems(Foster City, Calif.)를 포함하는 몇몇 판매 회사에 의해 판매된다. 당업계에 알려진 그러한 합성을 위한 임의의 다른 수단은 추가적으로 또는 대안적으로 채용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 기타 올리고뉴클레오티드를 제조하는 유사한 기술을 이용하는 것도 알려져 있다.
본 발명의 리간드-컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드 및 리간드-분자 보유 서열-특이적 결합된 뉴클레오시드에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드는 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구체 또는 결합 모이어티를 이미 보유하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 컨쥬게이트 전구체, 리간드 분자를 이미 보유하는 리간드-뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드-컨쥬게이트 전구체 또는 비-뉴클레오시드 리간드-보유 빌딩 블록을 활용하는 적당한 DNA 합성기 상에 조립될 수 있다.
결합 모이어티를 이미 보유한 뉴클레오티드-컨쥬게이트 전구체를 이용하는 경우, 서열-특이적 결합된 뉴클레오시드의 합성이 통상적으로 완료된 후, 리간드 분자는 결합 모이어티와 반응하여 리간드-컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 일부 실시형태들에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 결합된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 합성에 상업적으로 이용가능하며 통상적으로 이용되는 표준 포스포르아미디트 및 비-표준 포스포르아미디트에 더하여 리간드-뉴클레오시드 컨쥬게이트로부터 유래된 포스포르아미디트를 이용하는 자동화된 합성기에 의하여 합성된다.
A. 리간드 컨쥬게이트
일 실시형태에 있어서, 리간드 또는 컨쥬게이트는 지질 또는 지질계 분자이다. 그러한 지질 또는 지질계 분자는 바람직하게는 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA)과 결합한다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예컨대, 신체의 비-신장 표적 조직으로 컨쥬게이트의 분포가 이루어지도록 한다. 예를 들면, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA와 결합할 수 있는 기타 분자들은 리간드로 이용될 수도 있다. 예를 들면, 나프록센 또는 아스피린을 이용할 수 있다. 지질 또는 지질계 리간드는 (a) 컨쥬게이트의 분해에 대한 내성을 증가시키고/거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로 표적 또는 수송을 증가시키고/거나 (c) 혈청 단백질, 예컨대, HSA로의 결합을 조정하는데 이용될 수 있다.
지질계 리간드는 컨쥬게이트의 표적 조직으로의 결합을 억제, 예컨대, 제어하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, HSA에 더 강하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 신장에 표적될 가능성이 적을 것이며, 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적을 것이다. HSA와 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 신장에 컨쥬게이트를 표적으로 하는 데 이용될 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 지질계 리간드는 HSA와 결합한다. 바람직하게는, 컨쥬게이트가 바람직하게는 비-신장 조직으로 분포되도록 충분한 친화도로 HSA와 결합한다. 그러나, 친화도는 HSA-리간드 결합이 반전될 수 없도록 강하지 않은 것이 바람직하다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 지질계 리간드는 컨쥬게이트가 바람직하게는 신장으로 분포되도록 HSA와 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않는다. 신장 세포에 표적으로 하는 기타 모이어티들은 지질계 리간드 대신에 또는 이에 더하여 이용될 수도 있다.
다른 양태에 있어서, 리간드는 모이어티, 예컨대, 표적 세포, 예컨대, 증식하는 세포에 의하여 흡수되는 비타민이다. 이들은 예컨대, 악성 또는 비-악성 형태, 예컨대, 암 세포의 원하지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 특히 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E 및 K를 포함한다. 기타 예시적인 비타민은 비타민 B, 예컨대, 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 표적 세포, 예를 들어, 간 세포에 의하여 취해지는 비타민 또는 영양분을 포함한다. HSA 및 저밀도 리포단백질(LDL)도 포함된다.
B. 세포 침투제
다른 양태에 있어서, 리간드는 세포-침투제, 바람직하게는 헬리칼 세포-침투제이다. 바람직하게는, 작용제는 양친매성이다. 예시적인 작용제는 태트(tat) 또는 안테노페디아와 같은 펩티드이다. 작용제가 펩티드이면, 펩티딜미메틱(peptidylmimetic), 인베르토머(invertomer), 비-펩티드 또는 슈도-펩티드 연결 및 D-아미노산의 이용을 포함하여 변형될 수 있다. 헬리칼 작용제는 바람직하게는 친유상 및 소유상을 갖는, 바람직하게는 알파-헬릭칼 작용제이다.
리간드는 펩티드 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic)일 수 있다. 펩티도미메틱(본원에서 올리고펩티도미메틱이라고도 함)은 천연 펩티드와 유사한 정의된 3-차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. iRNA 작용제로의 펩티드 및 펩티도미메틱의 부착은 예를 들어, 세포 인식 및 흡수를 증진시킴으로써 iRNA의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 또는 펩티도미메틱 모이어티는 길이가 약 5 내지 50개 아미노산들, 예컨대, 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산들일 수 있다.
펩티드 또는 펩티도미메틱은 예를 들면, 세포 침투 펩티드, 양이온 펩티드, 양친매성 펩티드 또는 소수성 펩티드(예컨대, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 구속성 펩티드 또는 교차결합성 펩티드일 수 있다. 다른 대안에 있어서, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO: 9)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 포함하는 RFGF 유사체(예컨대, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10))는 표적 모이어티일 수도 있다. 펩티드 모이어티는 세포막을 가로지르는 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 단백질을 포함하는 더 큰 극성 분자들을 운반할 수 있는 "전달" 펩티드일 수 있다. 예를 들면, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 11)) 및 드로소필라 안테나페디아 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 12)) 유래의 서열들은 전달 펩티드로서 기능할 수 있다는 것이 발견되었다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 파지-표시 라이브러리 또는 알갱이당-한 분자(one-bead-one) 화합물(OBOC) 조합 라이브러리로부터 동정된 펩티드와 같은 DNA의 임의적 서열에 의하여 인코딩될 수 있다(Lam 등., Nature, 354:82-84, 1991). 세포 표적화 목적을 위해 혼입된 단량체 단위를 통해 dsRNA 작용제에 테터링된 펩티드 또는 펩티도미메틱의 예는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩티드 또는 RGD 모방체이다. 펩티드 모이어티는 길이가 약 5개 아미노산들 내지 약 40개 아미노산들에 이를 수 있다. 펩티드 모이어티는 안정성을 증가시키거나 형태적 특성을 지시하는 것과 같은 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기에 기술된 구조적 변형들 중 임의의 것이 활용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 이용되는 RGD 펩티드는 선형 또는 환형일 수 있으며, 변형되어, 예컨대, 글리코실화 또는 메틸화되어 특정 조직(들)으로 표적화되는 것을 용이하게 할 수 있다. RGD-함유 펩티드 및 펩티도미메틱은 D-아미노산 및 합성 RGD 모방체를 포함할 수 있다. RGD에 더하여, 인테그린 리간드를 표적으로 하는 기타 모이어티들을 이용할 수 있다. 이 리간드의 바람직한 컨쥬게이트는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적화으로 다.
"세포 투과 펩티드"는 세포, 예컨대, 박테리아성 또는 진균 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유류 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩티드는 예를 들면, α-헬리칼 선형 펩티드(예컨대, LL-37 또는 세로핀 P1), 디설파이드 결합-함유 펩티드(예컨대, α-디펜신(defensin), β-디펜신 또는 박테네신), 또는 하나 또는 두 개의 우세한 아미노산만을 포함하는 펩티드(예컨대, PR-39 또는 인도리시딘)일 수 있다. 세포 투과 펩티드는 핵 위치 신호(NLS)를 포함할 수도 있다. 예를 들면, 세포 투과 펩티드는 HIV-1 gp41 및 SV40 대형 T 항원의 NLS의 융합 펩티드 도메인으로부터 유래된 MPG와 같은 이분 양친매성 펩티드(bipartite amphipathic peptide)일 수 있다(Simeoni 등, Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
C. 탄수화물 컨쥬게이트
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시형태들에 있어서, iRNA 올리고뉴클레오티드는 탄수화물을 추가로 포함한다. 탄수화물 컨쥬게이트된 iRNA는 본원에 기술된 바와 같이 생체내 치료용에 적합한 조성물뿐만 아니라 핵산의 생체 내 전달에 유리하다. 본원에 사용된 "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 (선형, 분지형 또는 환형일 수 있는) 적어도 6개의 탄소 원자들을 갖는 하나 이상의 단당류 단위들로 구성된 탄수화물 그 자체인 화합물; 또는 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 (선형, 분지형 또는 환형일 수 있는) 적어도 6개의 탄소 원자들을 각각 갖는 하나 이상의 단당류 단위들로 구성된 탄수화물 모이어티를 그 일부로서 갖는 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물로는 당(약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 단당류 단위를 포함하는 단당류, 이당류, 삼당류 및 올리고당류) 및, 전분, 글리코겐, 셀룰로오스 및 다당류 검과 같은 다당류가 포함된다. 구체적인 단당류로는 C5 및 그 이상(예컨대, C5, C6, C7 또는 C8) 당이 포함되며; 이당류 및 삼당류로는 2 또는 3개의 단당류 단위들을 갖는 당(예컨대, C5, C6, C7 또는 C8)이 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법에 이용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 단당류이다. 일 실시형태에 있어서, 단당류는 하기와 같은 N-아세틸갈락토사민이다:
[화학식 II]

다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법에 이용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
[화학식 II]
,
[화학식 III]
,
[화학식 IV]
,
[화학식 V]
,
[화학식 VI]
,
[화학식 VII]
,
[화학식 VIII]
,
[화학식 IX]
,
[화학식 X]
,
[화학식 XI]
,
[화학식 XII]
,
[화학식 XIII]
,
[화학식 XIV]
,
[화학식 XV]
,
[화학식 XVI]
,
[화학식 XVII]
,
[화학식 XVIII]
,
[화학식 XIX]
,
[화학식 XX]
,
[화학식 XXI]
,
[화학식 XXII]
.
본원에 기술된 실시형태들에 이용하기 위한 다른 대표적인 탄수화물 컨쥬게이트는 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다:
[화학식 XXIII]

X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 나머지 하나는 수소이다.
일부 실시형태들에 있어서, 탄수화물 컨쥬게이트는 PK 조절제 및/또는 세포 침투 펩티드와 같지만, 이들에 한정되는 않은, 상술한 바와 같은 하나 이상의 추가적인 리간드들을 추가로 포함한다.
D. 링커
일부 실시형태들에 있어서, 본원에 기술된 컨쥬게이트 또는 리간드는 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 다양한 링커로 iRNA 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
"링커" 또는 "연결기"라는 용어는 화합물의 두 부분들을 연결하는, 예컨대, 화합물의 두 부분들을 공유적으로 부착하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 통상적으로 직접 결합, 또는 원자, 예를 들어, 산소 또는 황, 단위, 예를 들어, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, 또는 원자의 사슬, 예컨대 비제한적으로 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알케닐, 치환되거나 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴을 포함하며, 하나 이상의 메틸렌들은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭에 의하여 중단되거나 종결될 수 있으며; R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 일 실시형태에 있어서, 링커는 약 1 내지 24개 원자들, 2 내지 24개, 3 내지 24개, 4 내지 24개, 5 내지 24개, 6 내지 24개, 6 내지 18개, 7 내지 18개, 8 내지 18개 원자들, 7 내지 17개, 8 내지 17개, 6 내지 16개, 7 내지 16개 또는 8 내지 16개 원자들이다.
절단가능한 연결기는 세포 밖에서는 충분히 안정한 것이지만, 표적 세포로 들어오면 절단되어 링커가 결합시키는 2개 부분들을 방출하는 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 절단가능한 연결기는 피검자의 혈액 내 또는 (예컨대, 혈액 또는 혈청 내에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 제2 기준 조건 하에서보다 표적 세포 내 또는 (예컨대, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 제1 기준 조건 하에서 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상 또는 적어도 약 100배 더 빠르게 절단된다.
절단가능한 연결기는 절단 작용제, 예컨대, pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로, 절단 작용제는 혈청 또는 혈액 내에서 보다 세포 내에서 더 우세하거나 더 높은 수준 또는 활성으로 발견된다. 그러한 분해 작용제의 예로는: 예컨대, 환원에 의하여 산화환원 절단가능한 연결기를 분해시킬 수 있는, 세포내에 존재하는 메르캅탄과 같은 산화 또는 환원 효소 또는 환원제를 비롯하여, 특정 기질에 대하여 선택되거나 기질 특이성이 없는 산화환원 작용제; 에스테라아제; 산성 환경을 발생시킬 수 있는 엔도솜 또는 작용제, 예컨대, 5 이하의 pH를 일으키는 엔도솜 또는 작용제; 일반적인 산으로 작용함으로써 산 절단가능한 연결기를 혼성화하거나 분해시킬 수 있는 효소, (기질 특이적일 수 있는) 펩티다아제 및 포스파타아제를 포함한다.
디설파이드 결합과 같은 절단가능한 연결기는 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면에, 평균 세포내 pH는 이보다 약간 더 낮은 약 7.1 내지 7.3에 이른다. 엔도솜은 5.5 내지 6.0의 범위에 이르는 더 산성인 pH를 가지며, 리소좀은 5.0 근처의 좀 더 산성인 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되는 절단가능한 연결기를 가짐으로써, 세포 내부의 리간드로부터 또는 세포의 원하는 구획으로 양이온성 지질을 방출하게 된다.
링커는 특정 효소에 의하여 절단될 수 있는 절단가능한 연결기를 포함할 수 있다. 링커내로 포함되는 절단가능한 연결기의 유형은 표적화되는 세포에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 간-표적화 리간드는 에스테르기를 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포는 에스테라아제가 풍부하며, 따라서, 링커는 에스테라아제가 풍부하지 않은 세포 유형 내에서보다 간 세포 내에서 더 효율적으로 절단될 것이다. 에스테라아제가 풍부한 기타 세포-유형은 폐, 신장 피질 및 고환의 세포를 포함한다.
펩티드 결합을 포함하는 링커는 간 세포 및 윤활막세포와 같이, 펩티다아제가 풍부한 세포 유형을 표적으로 하는 경우에 이용될 수 있다.
일반적으로, 절단가능한 연결기 후보의 적합성은 후보 연결기를 절단하는 분해 작용제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한, 절단가능한 연결기 후보에 대하여 혈액 내에서 또는 기타 비표적 조직과 접촉하는 경우에 절단에 저항하는 능력을 시험하는 것도 바람직할 것이다. 따라서, 표적 세포 내에서 절단을 나타내도록 선택되는 제1 조건과 기타 조직 또는 생물학적 유체, 예컨대, 혈액 또는 혈청 내에서 절단을 나타내도록 선택되는 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적 민감도를 결정할 수 있다. 평가는 무세포 시스템, 세포 내, 세포 배양 내, 기관 또는 조직 배양 내, 또는 전체 동물 내에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 실시하고 전체 동물에서 추가의 평가에 의하여 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 유용한 후보 화합물은 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건)에서 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건)과 비교하여 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 약 100배 더 빨리 절단된다.
i. 산화환원 절단가능한 연결기
일 실시형태에 있어서, 절단가능한 연결기는 산화 또는 환원시에 절단되는 산화환원 절단가능한 연결기이다. 환원적으로 절단가능한 연결기의 일 예는 디설파이드 연결기(-S-S-)이다. 절단가능한 연결기 후보가 적당한 "환원적으로 절단가능한 연결기"인지 여부 또는 예를 들면, 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적화 작용제와 함께 사용하기 위해 적당한지 여부를 결정하기 위하여, 본원에 기술된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들면, 후보는 세포, 예컨대, 표적 세포 내에서 관찰될 수 있는 절단 속도를 모방하는, 당업계에 알려진 시약을 이용한 기타 환원제, 또는 디티오트레이톨(DTT)과의 인큐베이션에 의하여 평가될 수 있다. 후보는 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수도 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 후보 화합물은 혈액 내에서 최대 약 10% 절단된다. 다른 실시형태들에 있어서, 유용한 후보 화합물은 혈액 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하)에서와 비교하여 세포 내 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 약 100배 더 빨리 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 매질을 모방하도록 선택된 조건 하에서 그리고 세포외 매질을 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 역동학 분석법을 이용하여 결정될 수 있다.
ii. 포스페이트계 절단가능한 연결기
다른 실시형태에 있어서, 절단가능한 링커는 포스페이트계 절단가능한 연결기를 포함한다. 포스페이트계 절단가능한 연결기는 포스페이트기를 분해시키거나 혼성화하는 작용제에 의하여 절단된다. 세포 내에서 포스페이트기를 절단하는 작용제의 일 예는 세포 내에서 포스파타아제와 같은 효소이다. 포스페이트계 연결기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, 및 -O-P(S)(Rk)-S이다. 바람직한 실시형태들은 -OP(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -OP(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 일 실시형태는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보들은 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
iii. 산 절단가능한 연결기
다른 실시형태에 있어서, 절단가능한 링커는 산 절단가능한 연결기를 포함한다. 산 절단가능한 연결기는 산 조건 하에서 절단되는 연결기이다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 산 절단가능한 연결기는 약 6.5 이하(예컨대, 약 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 이하)의 pH를 갖는 산성 환경에서나 또는 일반적인 산으로 작용할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의하여 절단된다. 세포 내에서, 엔도솜 및 리소좀과 같은 특이적인 낮은 pH 세포 기관은 산 절단가능한 연결기에 대하여 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단가능한 연결기의 예로는 히드라존, 에스테르 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 산 절단가능한 기는 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)을 가질 수 있다. 바람직한 일 실시형태는 에스테르(알콕시기)의 산소에 부착된 탄소가 아릴기, 치환된 알킬기 또는 디메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 삼차 알킬기인 경우이다. 이들 후보들은 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르계 연결기
다른 실시형태에 있어서, 절단가능한 링커는 에스테르계 절단가능한 연결기를 포함한다. 에스테르계 절단가능한 연결기는 세포 내에서 에스테라아제 및 아미다아제와 같은 효소에 의하여 절단된다. 에스테르계 절단가능한 연결기의 예로는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기의 에스테르를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 에스테르 절단가능한 기는 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-을 갖는다. 이들 후보들은 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
v. 펩티드계 절단기
또 다른 실시형태에 있어서, 절단가능한 링커는 펩티드계 절단가능한 연결기를 포함한다. 펩티드계 절단가능한 연결기는 세포 내에서 펩티다아제 및 프로테아제와 같은 효소에 의하여 절단된다. 펩티드계 절단가능한 연결기는 아미노산들 사이에서 형성되어 올리고펩티드(예컨대, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 생성하는 펩티드 결합이다. 펩티드계 절단가능한 기는 아미드기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌 사이에서 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 아미노산 사이에서 형성되어 펩티드 및 단백질을 생성하는 아미드 결합의 특별한 유형이다. 펩티드계 절단기는 일반적으로 아미노산들 사이에서 형성되어 펩티드 및 단백질을 생성하는 펩티드 결합(즉, 아미드 결합)에 한정되고 전체 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩티드계 절단가능한 연결기는 일반식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-를 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산들의 R 기들이다. 이들 후보들은 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 iRNA는 링커를 통해 탄수화물에 컨쥬게이트된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 링커와의 iRNA 탄수화물 컨쥬게이트의 비한정 예로는 다음이 포함되지만, 여기에 한정되지 않는다:
[화학식 XXIV]
,
[화학식 XXV]
,
[화학식 XXVI]
,
[화학식 XXVII]
,
[화학식 XXVIII]
,
[화학식 XXIX]
및
[화학식 XXX]

X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 나머지 하나는 수소이다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 실시형태들에 있어서, 리간드는 2가 또는 3가 분지 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc"(N-아세틸갈락토사민) 유도체이다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 dsRNA는 화학식 (XXXI) 내지 (XXXIV) 중 어느 하나에 나타낸 구조의 그룹으로부터 선택된 2가 또는 3가 분지형 링커에 컨쥬게이트된다:
[화학식 XXXI]
,
[화학식 XXXII]
,
[화학식 XXXIII]
, 또는
[화학식 XXIV]
;
상기 식에서,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각각 독립적으로 각각의 경우 0 내지 20을 나타내고, 반복 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 각각 독립적으로 각각의 경우 부재이거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 각각 독립적으로 각각의 경우 부재이거나, 알킬렌, 치환된 알킬렌이며, 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 또는 종결될 수 있으며;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 각각 독립적으로 각각의 경우 부재이거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure 112021145756847-pat00062
또는 헤테로사이클릴이며;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드; 즉, 각각 독립적으로 각각의 경우 단당류(예컨대 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류, 또는 다당류를 나타내고; Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 컨쥬게이팅 GalNAc 유도체, 예를 들어, 화학식 (XXXV)의 것은 특히, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제와 함께 사용하기에 특히 유용하다:
[화학식 XXXV]

상기 식에서,
L5A, L5B 및 L5C는 단당류, 예를 들어, GalNAc 유도체를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 컨쥬게이트시키는 적절한 2가 및 3가 분지형 링커 기의 예에는 상기에서 식 II, VII, XI, X 및 XIII으로 인용된 구조들이 포함되지만, 여기에 한정되지 않는다.
RNA 컨쥬게이트의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있는 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
주어진 화합물 내의 모든 위치들이 균일하게 변형되는 것은 필요하지 않으며, 사실상 상기 언급된 변형들 중 하나를 초과하는 것이 단일 화합물 내 또는 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오시드에 포함될 수 있다. 본 발명은 키메릭 화합물인 iRNA 화합물도 포함한다.
본 발명의 맥락에 있어서 "키메릭" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 각각이 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, dsRNA 화합물의 경우 뉴클레오티드로 구성된 둘 이상의 화학적으로 별개인 영역들을 포함하는 iRNA 화합물, 바람직하게는, dsRNA이다. 이들 iRNA는 통상적으로 적어도 하나의 영역을 포함하며, 여기서, RNA는 변형되어 iRNA 상에 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 섭취 및/또는 표적 핵산에 대해 증가된 결합 친화성을 부여한다. iRNA의 추가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성물을 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로 작용할 수 있다. 예를 들면, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. 그러므로, RNase H의 활성화로 인해 RNA 표적의 절단이 일어나서, 유전자 발현의 iRNA 억제의 효율을 현저히 향상시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 키메릭 dsRNA가 이용되는 경우 더 짧은 iRNA로 유사한 결과를 종종 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요하면, 당업계에 알려진 연관된 핵산 혼성화 기법에 의하여 통상적으로 검출될 수 있다.
특정한 경우에 있어서, iRNA의 RNA는 비-리간드 기에 의해 변형될 수 있다. iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해 수많은 비-리간드 분자들이 iRNA에 컨쥬게이트되었으며, 그러한 컨쥬게이션을 수행하기 위한 절차는 과학 문헌에서 이용가능하다. 그러한 비-리간드 모이어티들은 콜레스테롤(Kubo, T. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1): 54-61; Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예컨대, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras 등, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티(Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)와 같은 지질 모이어티들을 포함한다. 그러한 RNA 컨쥬게이트의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기에 열거되어 있다. 통상적인 컨쥬게이션 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치들에서 아미노링커를 보유하는 RNA의 합성을 포함한다. 이후 아미노기는 적절한 커플링 시약 또는 활성화 시약을 이용하여 컨쥬게이트되는 분자와 반응된다. 컨쥬게이션 반응은 고체 지지체에 여전히 결합된 RNA 또는 RNA의 절단 후에 용액 상(phase)에서 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 컨쥬게이트의 정제는 통상적으로 순수한 컨쥬게이트를 제공한다.
IV. 본 발명의 iRNA의 전달
본 발명의 iRNA의 세포, 예컨대, 인간 피검자와 같은 피검자(예컨대, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자와 같이 이를 필요로 하는 피검자) 내의 세포로의 전달은 수많은 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 전달은 세포를 본 발명의 iRNA와 시험관 내 또는 생체 내에서 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 생체 내 전달은 iRNA, 예컨대, dsRNA를 포함하는 조성물을 피검자에게 투여함으로써 직집적으로 수행될 수도 있다. 대안적으로, 생체 내 전달은 iRNA를 인코딩하고 그의 발현을 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 그러한 대안은 하기에서 더 토의된다.
일반적으로, (시험관 내 또는 생체 내에서) 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 본 발명의 iRNA와의 이용을 위해 적합하게 할 수 있다(예컨대, 본원에서 그 전체가 참조로 포함되어 있는, Akhtar S. and Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 및 WO94/02595 참조). 생체 내 전달을 위해, iRNA 분자를 전달하기 위해 고려하는 인자는 예를 들면, 전달된 분자의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 방지 및 표적 조직 내에서 전달된 분자의 축적을 포함한다. iRNA의 비-특이적인 효과는 예를 들면, 조직으로의 직접 주사 또는 이식에 의해 또는 제제를 국소적으로 투여함으로써 국소 투여에 의하여 최소화될 수 있다. 치료 부위로의 국소 투여는 작용제의 국소 농도를 최대화하고, 다르게는 작용제에 의하여 해를 입을 수 있거나 작용제를 분해할 수 있는 전신 조직으로의 작용제의 노출을 제한하며, iRNA 분자의 더 낮은 총 용량이 투여될 수 있도록 한다. 몇몇 연구에 따르면, iRNA가 국소적으로 투여되는 경우 유전자 생성물의 성공적인 녹다운(knockdown)을 보였다. 예를 들면, 시노몰구스 원숭이 내에 유리체내 주사(Tolentino, MJ. 등, (2004) Retina 24:132-138) 및 마우스 내의 망막하 주사(Reich, SJ. 등. (2003) Mol. Vis. 9:210-216)에 의한 VEGF dsRNA의 안구 내 전달은 양쪽 모두 연령-관련 황반 변성의 실험적 모델에서 신혈관신생을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 마우스들 내로 dsRNA의 직접적인 종양 내 주사는 종양 부피를 감소시키고(Pille, J. 등(2005) Mol. Ther.11:267-274), 종양 보유 마우스들의 생존을 연장시킬 수 있다(Kim, WJ. 등, (2006) Mol. Ther.14:343-350; Li, S. 등, (2007) Mol. Ther.15:515-523). RNA 간섭은 직접 주사에 의하여 CNS에(Dorn, G. 등, (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. 등, (2005) Gene Ther.12:59-66; Makimura, H. 등(2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., 등. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275; Akaneya,Y., 등 (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) 그리고 비강 내 투여에 의하여 허파에(Howard, KA. 등, (2006) Mol. Ther.14:476-484; Zhang, X. 등, (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. 등, (2005) Nat. Med.11:50-55) 국소 전달이 성공하는 것도 보였다. 질병의 치료를 위해 iRNA를 전신으로 투여하기 위하여, RNA가 변형되거나 약물 전달 시스템을 이용하여 대안적으로 전달될 수 있으며; 양쪽 방법은 생체 내 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의하여 dsRNA의 급속한 분해를 방지하는 작용을 한다. RNA 또는 약학적 담체의 변형으로 iRNA 조성물이 표적 조직으로 표적되도록 할 수도 있으며, 바람직하지 않은 비표적 효과를 회피할 수 있다. iRNA 분자는 콜레스테롤과 같은 친지방성기로의 화학적 컨쥬게이션에 의하여 변형되어 세포 흡수를 향상시키고 분해를 방지할 수 있다. 예를 들면, 친지방성 콜레스테롤 모이어티에 컨쥬게이트된 ApoB에 대하여 지시된 iRNA는 마우스들에게 전신으로 주사되어 간 및 공장 내에서 apoB mRNA의 녹다운을 일어나게 하였다(Soutschek, J. 등, (2004) Nature 432:173-178). iRNA의 압타머로의 컨쥬게이션은 전립선암의 마우스 모델 내에서 종양 성장을 억제하고 종양 퇴화를 조정하는 것이 밝혀졌다(McNamara, JO. 등, (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). 대안적인 일 실시형태에 있어서, iRNA는 나노입자, 덴드리머, 중합체, 리포솜 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 양으로 대전된 양이온성 전달 시스템은 iRNA 분자(음으로 대전됨)의 결합을 용이하게 하고, 음으로 대전된 세포막에서의 상호작용을 향상시켜 세포에 의하여 iRNA의 효율적인 흡수를 가능하게도 한다. 양이온 지질, 덴드리머 또는 중합체는 iRNA에 결합될 수 있거나 유도되어 iRNA를 둘러싸는 소낭 또는 미셀을 형성할 수 있다(예컨대, Kim SH. 등, (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116 참조). 소낭 또는 미셀의 형성은 iRNA가 전신으로 투여되는 경우 iRNA의 분해를 더 방지한다. 양이온성 iRNA 복합체를 제조하고 투여하는 방법은 충분히 당업자의 능력 내에 있다(예컨대, 그 전체가 본원에서 참조로 포함되어 있는 Sorensen, DR., 등 (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN. 등, (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS 등, (2007) J. Hypertens. 25:197-205 참조). iRNA의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비-한정 예는 DOTAP(Sorensen, DR., 등 (2003), 상기; Verma, UN. 등, (2003), 상기), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자"(Zimmermann, TS. 등, (2006) Nature 441:111-114), 카르디올리핀(Chien, PY. 등, (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A. 등, (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), 폴리에틸렌이민(Bonnet ME. 등, (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) 펩티드(Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), 및 폴리아미도아민(Tomalia, DA. 등, (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. 등, (1999) Pharm. Res.16:1799-1804)을 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, iRNA는 전신 투여를 위해 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. iRNA 및 사이클로덱스트린의 투여 방법 및 약학적 조성물은 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는, 미국 특허 번호 7,427,605호에서 찾을 수 있다.
A. 본 발명의 벡터 인코딩된 iRNA
C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA는 DNA 또는 RNA 벡터로 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다(예컨대, Couture, A, 등, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., 등, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/22113호, Conrad, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/22114호, 및 Conrad, 미국 특허 번호 6,054,299호 참조). 발현은 이용된 특이적인 컨스트럭트(construct) 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 일시적(수시간 내지 수주) 또는 지속적(수주 내지 수개월 이상)일 수 있다. 그러한 이식 유전자는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있는 선형 컨스트럭트, 원형 플라스미드, 또는 바이러스성 벡터로 도입될 수 있다. 이식 유전자는 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 구성될 수도 있다(Gassmann 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
iRNA의 개별 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 2개의 개별 가닥들이 발현되어 예를 들면, dsRNA를 발생시킬 경우, 2개의 개별 발현 벡터는 표적 세포로 (예컨대, 전달감염(transfection) 또는 감염에 의하여) 공-도입(co-introduced)될 수 있다. 대안적으로, dsRNA의 각각의 개별 가닥은 둘 모두가 동일한 발현 플라스미드 상에 위치되어 있는 프로모터들에 의하여 전사될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA는 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 합쳐진 역반복(inverted repeat) 폴리뉴클레오티드로 발현되어 dsRNA는 줄기 및 루프 구조를 갖는다.
iRNA 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스성 벡터이다. 진핵 세포와 양립하는 발현 벡터, 바람직하게는 척추동물 세포와 양립하는 발현 벡터는 본원에 기술된 바와 같이 iRNA의 발현을 위한 재조합 컨스트럭트를 생성하는데 이용될 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당업계에 주지되어 있으며 수많은 상업적 원천으로부터 이용 가능하다. 통상적으로, 원하는 핵산 세그먼트의 삽입을 위한 간편한 제한 부위를 포함하는 그러한 벡터가 제공된다. iRNA 발현 벡터의 전달은 정맥 내 또는 근육 내 투여에 의하거나, 환자로부터 빼낸 표적 세포에 투여하고 이후 환자에 재도입하거나 소기의 표적 세포로 도입하도록 하는 기타 수단에 의해서와 같이 전신적일 수 있다.
iRNA 발현 플라스미드는 양이온성 지질 담체(예컨대, 올리고펙타민) 또는 비-양이온성 지질계 담체(예컨대, Transit-TKOTM)와의 복합체로서 표적 세포에 전달감염될 수 있다. 일 주일 이상의 기간에 걸쳐 표적 RNA의 상이한 영역을 표적으로 하는 iRNA-매개 녹다운에 대한 복수의 지질 전달감염도 본 발명에 의하여 고려된다. 숙주 세포로 벡터를 성공적으로 도입하는 것은 다양한 알려진 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 일시 전달감염은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 마커와 같은 리포터로 표시될 수 있다. 생체 외에서 세포의 안정된 전달감염은 하이그로마이신 B 내성과 같이, 특정 환경 요인(예컨대, 항생제 및 약물)에 내성을 갖는 전달감염된 세포를 제공하는 마커를 이용하여 확보할 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물을 이용하여 활용될 수 있는 바이러스성 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스성 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노-연관 바이러스 벡터; (d) 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 유두종 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스 벡터; (i) 오르토폭스(orthopox)와 같은 수두 바이러스 벡터, 예컨대, 우두 바이러스 벡터 또는 조류두, 예컨대, 카나리아 수두 또는 계두; 및 (j) 헬퍼(helper)-종속 또는 무력화(gutless) 아데노바이러스를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 복제-결함 바이러스도 유리할 수 있다. 상이한 벡터가 세포 게놈으로 혼입되거나 혼입되지 않을 수 있다. 컨스트럭트는 원한다면, 전달감염용 바이러스성 서열들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 컨스트럭트는 에피솜의 복제가 가능한 벡터, 예컨대, EPV 및 EBV 벡터로 혼입될 수 있다. iRNA의 재조합 발현용 컨스트럭트는 일반적으로 표적 세포 내에서 iRNA의 발현을 확보하는데 조절 요소들, 예컨대, 프로모터, 인헨서 등을 필요로 할 것이다. 벡터 및 컨스트럭트에 대하여 고려되는 기타 양태는 하기에 더 기술된다.
iRNA의 전달에 유용한 벡터는 소기의 표적 세포 또는 조직 내에서 iRNA의 발현에 충분한 조절 요소들(프로모터, 인헨서 등)을 포함할 것이다. 조절 요소들을 선택하여 구성적 또는 조절된/유도성 발현을 제공할 수 있다.
iRNA의 발현은 예를 들면, 특정한 생리학적 조절제, 예컨대, 순환하는 포도당 수준 또는 호르몬에 민감한 유도성 조절 서열을 이용함으로써 정확히 조절될 수 있다(Docherty 등, 1994, FASEB J. 8:20-24). 세포 내 또는 포유류 내에서 dsRNA 발현의 조절에 적당한 그러한 유도성 발현 시스템은 예를 들면, 엑디손, 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라사이클린, 이합체화의 화학적 유도체 및 이소프로필-베타-D1-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업자는 iRNA 이식 유전자의 의도된 이용을 기초로 하여 적절한 조절/프로머터 서열을 선택할 수 있게 된다.
iRNA를 인코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 바이러스성 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스성 벡터를 이용할 수 있다(Miller 등, Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993) 참조). 그러한 레트로바이러스성 벡터는 바이러스성 게놈의 올바른 패키징 및 숙주 세포 DNA로의 통합에 필요한 구성요소들을 포함한다. iRNA를 인코딩하는 핵산 서열들은 환자에로의 핵산의 전달을 용이하게 하는 하나 이상의 벡터로 클로닝된다. 레트로바이러스성 벡터에 대한 더 상세한 사항은 예를 들면, 줄기 세포를 화학요법에 더 내성이 있게 하기 위하여 조혈 줄기 세포로 mdr1 유전자를 전달하는 레트로바이러스성 벡터의 사용을 기술하는 Boesen 등, Biotherapy 6:291-302 (1994)에서 찾을 수 있다. 유전자 요법에서 레트로바이러스성 벡터의 사용을 예시하는 기타 참조문헌은 다음과 같다: Clowes 등, J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem 등, Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); 및 Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). 사용이 고려되는 렌티바이러스성 벡터는 예를 들면, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,143,520호; 5,665,557호; 및 5,981,276호에 기술된 HIV계 벡터를 포함한다.
아데노바이러스는 본 발명의 iRNA의 전달에 사용이 고려되기도 한다. 아데노바이러스는 예컨대, 유전자를 호흡성 상피(respiratory epithelia)에 전달하기에 특히 매력적인 운반체이다. 아데노바이러스는 호흡성 상피를 자연적으로 감염시키는데, 여기서 아데노바이러스는 가벼운 질병을 유발한다. 아데노바이러스계 전달 시스템에 대한 기타 표적은 간, 중추 신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있는 장점을 갖는다. Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)은 아데노바이러스계 유전자 요법의 리뷰를 제시한다. Bout 등, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)은 레서스 원숭이의 호흡성 상피에 유전자를 전달하는 아데노바이러스 벡터의 사용을 보여주었다. 유전자 요법에서 아데노바이러스의 사용의 다른 경우는 Rosenfeld 등, Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld 등, Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli 등, J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT 출원 공개번호 WO94/12649; 및 Wang 등, Gene Therapy 2:775-783 (1995)에서 찾을 수 있다. 본 발명에 특징된 iRNA를 발현하기 위한 적당한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구성하는 방법 및 벡터를 표적 세포로 전달하는 방법은 Xia H 등 (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010에 기술되어 있다.
아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터는 본 발명의 iRNA을 전달하는데 이용될 수도 있다(Walsh 등, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); 미국 특허 번호 제5,436,146호). 일 실시형태에 있어서, iRNA는 예를 들면, U6 또는 H1 RNA 프로모터, 또는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 갖는 재조합 AAV 벡터로부터 유래한 2개의 분리된 상보적인 단일-가닥 RNA 분자로 발현될 수 있다. 본 발명에서 특징된 dsRNA를 발현하는데 적당한 AAV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구성하는 방법 및 벡터를 표적 세포로 전달하는 방법은 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되어 있는, Samulski R 등 (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J 등 (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R 등 (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 미국 특허 번호 5,252,479호; 미국 특허 번호 5,139,941호; 국제 특허 출원 번호 WO 94/13788호; 및 국제 특허 출원 번호 WO 93/24641호에 기술되어 있다.
본 발명의 iRNA 전달에 적당한 다른 바이러스성 벡터는 우두 바이러스와 같은 수두 바이러스, 예를 들면, 변형된 바이러스 앙카라(MVA) 또는 NYVAC와 같은 약독화된 우두, 계두 또는 카나리아 수두와 같은 조류두이다.
바이러스성 벡터의 친화성(tropism)은 벡터를 다른 바이러스로부터 유래한 외피 단백질(envelope protein) 또는 다른 표면 항원으로 슈도타이핑(pseudotyping)하거나 적절히, 상이한 바이러스성 캡시드 단백질(viral capsid protein)을 치환함으로써 변형될 수 있다. 예를 들면, 렌티바이러스성 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), 광견병, 에볼라, 모콜라 등으로부터 유래한 표면 단백질로 슈도타이프될 수 있다. AAV 벡터는 벡터를 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하도록 조작(engineering)함으로써 상이한 세포를 표적하도록 할 수 있으며; 예컨대, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되어 있는 Rabinowitz J E 등. (2002), J Virol 76:791-801을 참조한다.
벡터의 약학적 제제는 허용 가능한 희석제 내에서 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 전달 운반체가 심어져 있는 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예컨대, 레트로바이러스성 벡터로부터 손상되지 않고 생성될 수 있는 경우에, 약학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포들을 포함할 수 있다.
V. 본 발명의 약학적 조성물
본 발명은 본 발명의 iRNA를 포함하는 약학적 조성물 및 제형도 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 바와 같은 iRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 어구는 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 합당한 이득/위험율에 상응하는, 인간 피검자 및 동물 피검자의 조직과 접촉하는 용도에 적당한, 그러한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 지칭하는 것으로 본원에서 채용된다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"라는 어구는 피검자가 신체의 일 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 화합물을 전하거나 수송하는데 연루되는, 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제, 제조 보조물(예컨대, 윤활제, 활석 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아르산) 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약학적으로-허용 가능한 물질, 조성물 또는 운반체를 의미한다. 각각의 담체는 제형의 기타 성분과 양립할 수 있으며 치료받는 피검자에게 해가 되지 않는 의미에서 "허용 가능"하여야 한다. 약학적으로-허용 가능한 담체로 작용할 수 있는 물질들의 일부 예는 (1) 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당류; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분류; (3) 셀룰로오스, 및 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 에틸 셀룰로오스 및 아세트산 셀룰로오스와 같은 그 유도체들; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 마그네슘 스테아레이트, 라우릴 황산 나트륨 및 활석과 같은 윤활제; (8) 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; (9) 낙화생유, 목화씨유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올류; (12) 올레산 에틸 및 라우르산 에틸과 같은 에스테르류; (13) 아가; (14) 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원 제거수; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르류, 폴리카보네이트류 및/또는 폴리안하이드라이드류; (22) 폴리펩티드 및 아미노산과 같은 부피 조정제, (23) 혈청 성분, 예를 들어, 혈청 알부민 HDL 및 LDL; 및 (22) 약학적 제형에 채용된 기타 비-독성 양립성 물질을 포함한다.
iRNA를 포함하는 약학적 조성물은 C5 유전자의 발현 또는 활성과 연관된 질병 또는 장애, 예컨대, 보체 성분 C5-관련 질병을 치료하는데 유용하다. 그러한 약학적 조성물은 전달의 방식에 기초하여 제형화된다. 일례는 비경구 전달을 통한, 예컨대, 피하(SC) 또는 정맥 내(IV) 전달에 의한 전신 투여용으로 제형화되는 조성물이다. 다른 예는 예컨대, 연속 펌프 주입에 의한 것과 같이, 뇌로의 주입에 의한 뇌실질로의 직접 전달을 위해 제형화되는 조성물이다. 본 발명의 약학적 조성물은 C5 유전자의 발현을 억제하는데 충분한 투여량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 iRNA의 적당한 용량은 일당 수여자의 체중 kg당 약 0.001 내지 약 200.0 밀리그램의 범위에 있으며, 일반적으로 일당 체중 kg당 약 1 내지 50 mg의 범위에 있을 것이다. 예를 들면, dsRNA는 단일 용량당 약 0.01 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 또는 약 50 mg/kg으로 투여될 수 있다.
예를 들면, RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
다른 실시형태에 있어서, dsRNA는 약 0.1 내지 약 50 mg/kg, 약 0.25 내지 약 50 mg/kg, 약 0.5 내지 약 50 mg/kg, 약 0.75 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 50 mg/mg, 약 1.5 내지 약 50 mg/kb, 약 2 내지 약 50 mg/kg, 약 2.5 내지 약 50 mg/kg, 약 3 내지 약 50 mg/kg, 약 3.5 내지 약 50 mg/kg, 약 4 내지 약 50 mg/kg, 약 4.5 내지 약 50 mg/kg, 약 5 내지 약 50 mg/kg, 약 7.5 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 50 mg/kg, 약 15 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 30 내지 약 50 mg/kg, 약 35 내지 약 50 mg/kg, 약 40 내지 약 50 mg/kg, 약 45 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 내지 약 45 mg/kg, 약 0.25 내지 약 45 mg/kg, 약 0.5 내지 약 45 mg/kg, 약 0.75 내지 약 45 mg/kg, 약 1 내지 약 45 mg/mg, 약 1.5 내지 약 45 mg/kb, 약 2 내지 약 45 mg/kg, 약 2.5 내지 약 45 mg/kg, 약 3 내지 약 45 mg/kg, 약 3.5 내지 약 45 mg/kg, 약 4 내지 약 45 mg/kg, 약 4.5 내지 약 45 mg/kg, 약 5 내지 약 45 mg/kg, 약 7.5 내지 약 45 mg/kg, 약 10 내지 약 45 mg/kg, 약 15 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 30 내지 약 45 mg/kg, 약 35 내지 약 45 mg/kg, 약 40 내지 약 45 mg/kg, 약 0.1 내지 약 40 mg/kg, 약 0.25 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 내지 약 40 mg/kg, 약 0.75 내지 약 40 mg/kg, 약 1 내지 약 40 mg/mg, 약 1.5 내지 약 40 mg/kb, 약 2 내지 약 40 mg/kg, 약 2.5 내지 약 40 mg/kg, 약 3 내지 약 40 mg/kg, 약 3.5 내지 약 40 mg/kg, 약 4 내지 약 40 mg/kg, 약 4.5 내지 약 40 mg/kg, 약 5 내지 약 40 mg/kg, 약 7.5 내지 약 40 mg/kg, 약 10 내지 약 40 mg/kg, 약 15 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 30 내지 약 40 mg/kg, 약 35 내지 약 40 mg/kg, 약 0.1 내지 약 30 mg/kg, 약 0.25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.5 내지 약 30 mg/kg, 약 0.75 내지 약 30 mg/kg, 약 1 내지 약 30 mg/mg, 약 1.5 내지 약 30 mg/kb, 약 2 내지 약 30 mg/kg, 약 2.5 내지 약 30 mg/kg, 약 3 내지 약 30 mg/kg, 약 3.5 내지 약 30 mg/kg, 약 4 내지 약 30 mg/kg, 약 4.5 내지 약 30 mg/kg, 약 5 내지 약 30 mg/kg, 약 7.5 내지 약 30 mg/kg, 약 10 내지 약 30 mg/kg, 약 15 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg, 약 0.25 내지 약 20 mg/kg, 약 0.5 내지 약 20 mg/kg, 약 0.75 내지 약 20 mg/kg, 약 1 내지 약 20 mg/mg, 약 1.5 내지 약 20 mg/kb, 약 2 내지 약 20 mg/kg, 약 2.5 내지 약 20 mg/kg, 약 3 내지 약 20 mg/kg, 약 3.5 내지 약 20 mg/kg, 약 4 내지 약 20 mg/kg, 약 4.5 내지 약 20 mg/kg, 약 5 내지 약 20 mg/kg, 약 7.5 내지 약 20 mg/kg, 약 10 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 15 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
예를 들면, dsRNA는 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
다른 실시형태에 있어서, dsRNA는 약 0.5 내지 약 50 mg/kg, 약 0.75 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 50 mg/mg, 약 1.5 내지 약 50 mg/kb, 약 2 내지 약 50 mg/kg, 약 2.5 내지 약 50 mg/kg, 약 3 내지 약 50 mg/kg, 약 3.5 내지 약 50 mg/kg, 약 4 내지 약 50 mg/kg, 약 4.5 내지 약 50 mg/kg, 약 5 내지 약 50 mg/kg, 약 7.5 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 50 mg/kg, 약 15 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 30 내지 약 50 mg/kg, 약 35 내지 약 50 mg/kg, 약 40 내지 약 50 mg/kg, 약 45 내지 약 50 mg/kg, 약 0.5 내지 약 45 mg/kg, 약 0.75 내지 약 45 mg/kg, 약 1 내지 약 45 mg/mg, 약 1.5 내지 약 45 mg/kb, 약 2 내지 약 45 mg/kg, 약 2.5 내지 약 45 mg/kg, 약 3 내지 약 45 mg/kg, 약 3.5 내지 약 45 mg/kg, 약 4 내지 약 45 mg/kg, 약 4.5 내지 약 45 mg/kg, 약 5 내지 약 45 mg/kg, 약 7.5 내지 약 45 mg/kg, 약 10 내지 약 45 mg/kg, 약 15 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 30 내지 약 45 mg/kg, 약 35 내지 약 45 mg/kg, 약 40 내지 약 45 mg/kg, 약 0.5 내지 약 40 mg/kg, 약 0.75 내지 약 40 mg/kg, 약 1 내지 약 40 mg/mg, 약 1.5 내지 약 40 mg/kb, 약 2 내지 약 40 mg/kg, 약 2.5 내지 약 40 mg/kg, 약 3 내지 약 40 mg/kg, 약 3.5 내지 약 40 mg/kg, 약 4 내지 약 40 mg/kg, 약 4.5 내지 약 40 mg/kg, 약 5 내지 약 40 mg/kg, 약 7.5 내지 약 40 mg/kg, 약 10 내지 약 40 mg/kg, 약 15 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 30 내지 약 40 mg/kg, 약 35 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 내지 약 30 mg/kg, 약 0.75 내지 약 30 mg/kg, 약 1 내지 약 30 mg/mg, 약 1.5 내지 약 30 mg/kb, 약 2 내지 약 30 mg/kg, 약 2.5 내지 약 30 mg/kg, 약 3 내지 약 30 mg/kg, 약 3.5 내지 약 30 mg/kg, 약 4 내지 약 30 mg/kg, 약 4.5 내지 약 30 mg/kg, 약 5 내지 약 30 mg/kg, 약 7.5 내지 약 30 mg/kg, 약 10 내지 약 30 mg/kg, 약 15 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.5 내지 약 20 mg/kg, 약 0.75 내지 약 20 mg/kg, 약 1 내지 약 20 mg/mg, 약 1.5 내지 약 20 mg/kb, 약 2 내지 약 20 mg/kg, 약 2.5 내지 약 20 mg/kg, 약 3 내지 약 20 mg/kg, 약 3.5 내지 약 20 mg/kg, 약 4 내지 약 20 mg/kg, 약 4.5 내지 약 20 mg/kg, 약 5 내지 약 20 mg/kg, 약 7.5 내지 약 20 mg/kg, 약 10 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 15 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 투여된다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
예를 들면, 피검자에는 iRNA의 단일의 치료량, 예컨대 약 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 약 50 mg/kg이 피하 또는 정맥내 투여될 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
일부 실시형태들에 있어서, 피검자에는 예를 들어, 다중 용량의 iRNA의 치료량, 예를 들어, 용량 약 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 약 50 mg/kg이 예를 들어, 피하 또는 정맥내로 투여된다. 다중-용량 양생법은 예를 들어, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 그 이상에 있어서, 치료량의 iRNA의 매일의 투여를 포함할 수 있다.
다른 실시형태들에 있어서, 피검자에는 예를 들어, 반복 용량의 iRNA의 치료량, 예를 들어, 용량 약 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 약 50 mg/kg이 예를 들어, 피하 또는 정맥내로 투여된다. 반복-용량 양생법은 정기적으로, 예를 들어, 격일로, 3일마다, 4일마다, 주 2회, 주 1회, 격주로 또는 월 1회로의, 치료량의 iRNA의 투여를 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 소정의 기간 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21, 22, 23, 24 또는 약 25분 기간에 걸쳐, 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어, 정기적으로, 예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 또는 그 이상 동안 주마다, 2주마다(즉, 격주로) 반복될 수 있다. 초기 치료 양생법 후에, 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 예를 들어, 3개월 동안 주마다 또는 격주의 투여 후에, 투여는 6개월 또는 1년 또는 그 이상 동안 월 1회 반복될 수 있다.
약학적 조성물은 매일 1회 투여될 수 있거나 iRNA는 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 2, 3 또는 그 이상의 하부 용량으로 또는 심지어 연속 주입 또는 방출 제어 제형(controlled release formulation)을 통한 전달을 이용하여 투여될 수 있다. 그러한 경우, 각각의 하부-용량에 포함된 iRNA는 총 일간 투여량을 달성하기 위하여 이에 상응하게 더 적어야 한다. 투여량 단위는 예컨대, 며칠간의 기간에 걸쳐 iRNA의 지속 방출을 제공하는 종래 지속 방출 제형을 이용하여 며칠간에 걸쳐서 전달되기 위해 배합될 수도 있다. 지속 방출 제형은 당업계에 주지되어 있으며, 본 발명의 작용제와 함께 이용될 수 있는 바와 같이, 특정 부위에서 작용제의 전달을 위해 특히 유용하다. 이 실시형태에 있어서, 투여량 단위는 일간 용량의 상응하는 배수를 포함한다.
다른 실시형태들에 있어서, 단일 용량의 약학적 조성물은 장기적으로 지속하여, 이후 용량은 3, 4 또는 5일 간격 이하, 또는 1, 2, 3 또는 4주 간격 이하로 투여된다. 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 단일 용량의 본 발명의 약학적 조성물은 주 1회 투여된다. 본 발명의 다른 실시형태들에 있어서, 단일 용량의 본 발명의 약학적 조성물은 2개월마다 투여된다.
당업자는 질병 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 피검자의 일반 건강 및/또는 연령 및 기타 현재 질병을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 특정 인자는 피검자를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 타이밍(timing)에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 피검자를 치료적 유효량의 조성물로 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 개별 iRNA들에 대한 효과적인 투여량 및 생체 내 반감기의 측정은 본원의 어디에선가 기술된 바와 같이, 종래 방법론을 이용하거나 적절한 동물 모델을 이용한 생체 내 시험을 기초로 하여 이루어질 수 있다.
마우스 유전학의 진보로 인하여 C5의 발현 감소로 이득을 보게 되는 장애와 같이, 다양한 인간 질병의 연구에 대한 수많은 마우스 모델들을 생성하였다. 그러한 모델은 치료적 유효 용량의 결정뿐만 아니라 iRNA의 생체 내 시험을 위해 이용될 수 있다. 적당한 마우스 모델은 당업계에 알려져 있으며 예를 들면, 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델(Courtenay, J.S., 등 (1980) Nature 283, 666-668), 심근 허혈(Homeister JW and Lucchesi BR (1994) Annu Rev Pharmacol Toxicol 34:17-40), 오브알부민 유도 천식 마우스 모델(예를 들어, Tomkinson A., 등 (2001). J. Immunol. 166, 5792-5800), (NZB×NZW)F1, MRL/Faslpr(MRL/lpr) 및 BXSB 마우스 모델(Theofilopoulos, A. N. and Kono, D. H. 1999. Murine lupus models: gene-specific and genome-wide studies. In Lahita R. G., ed., Systemic Lupus Erythematosus, 3rd edn, p. 145. Academic Press, San Diego, CA), 마우스 aHUS 모델(Goicoechea de Jorge 등 (2011) The development of atypical hemolytic uremic syndrome depeds on complement C5, J Am Soc Nephrol 22:137-145)을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 요하는지 여부 및 치료될 부위에 따라 수많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 (예컨대, 경피 패치에 의한) 국소, 폐, 예컨대, 분무기에 의하는 것을 비롯하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기(insufflation)에 의하고; 기관삽관, 비강 내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복막 내 또는 근육 내 주사 또는 주입; 피하, 예컨대, 이식된 장치를 통한; 또는 두개 내, 예컨대, 뇌실질 내, 척수강 내 또는 뇌실 내 투여를 포함한다.
iRNA는 간(예컨대, 간의 간세포)과 같은 특정 조직을 표적으로 하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래 약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스(oily bases), 증점제 등은 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 유용할 수 있다. 적당한 국소 제형으로는 본 발명에서 특징된 iRNA가 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 같은 국소 전달 작용제와 혼합되어 있는 것들을 포함한다. 적당한 지질 및 리포솜으로는 중성(예컨대, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(예컨대, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예컨대, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)이 포함된다. 본 발명에서 특징된 iRNA는 리포솜 내에서 캡슐화될 수 있거나 거기에, 특히 양이온성 리포솜에 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, iRNA는 지질, 특히 양이온성 지질에 복합될 수 있다. 적당한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C1-20 알킬 에스테르(예컨대, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 국소 제형은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,747,014호에 상세히 기술되어 있다.
A. 막 분자 어셈블리를 포함하는 iRNA 제형
본 발명의 조성물 및 방법에 이용되는 iRNA는 막 분자 어셈블리, 예컨대, 리포솜 또는 미셀 내에서 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본원에서 사용된 "리포솜"이라는 용어는 적어도 하나의 이중층, 예컨대, 하나의 이중층 또는 복수개의 이중층내에서 배열된 양친매성 지질로 구성된 소낭을 지칭한다. 리포솜은 친지방성 물질로부터 형성된 막 및 수성 내부를 갖는 단일층상 또는 다중층상 소낭을 포함한다. 수성 부분은 iRNA 조성물을 포함한다. 친지방성 물질은 비록 일부 예들에서는 포함할 수 있어도, 통상적으로는 iRNA 조성물을 포함하지 않는 수성 외부로부터 수성 내부를 분리한다. 리포솜은 작용 부위로의 활성 성분의 수송 및 전달에 유용하다. 리포솜막은 생물학적 막과 구조적으로 유사하기 때문에, 리포솜이 조직에 적용되는 경우, 리포솜 이중층이 세포막의 이중층과 융합한다. 리포솜 및 세포의 융합이 진행됨에 따라, iRNA를 포함하는 내부 수성 내용물이 세포로 전달되며, 여기서, iRNA는 표적 RNA와 특이적으로 결합할 수 있고 RNAi를 매개할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 리포솜도 특이적으로 표적되어, 예컨대, iRNA를 특정 세포 유형으로 지시한다.
RNAi 작용제를 포함하는 리포솜은 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있다. 일례에서, 리포솜의 지질 구성성분은 미셀이 지질 구성성분으로 형성되도록 세제에 용해된다. 예를 들면, 지질 구성성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 컨쥬게이트일 수 있다. 세제는 높은 임계 미셀 농도를 가질 수 있으며, 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜산염, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜산염 및 라우로일 사르코신을 포함한다. 이후 RNAi 작용제 제제는 지질 구성성분을 포함하는 미셀에 첨가된다. 지질상의 양이온기는 RNA 작용제와 상호작용하고 RNAi 작용제 주위에서 응축하여 리포솜을 형성한다. 응축 이후에는, 세제는 예컨대, 투석에 의하여 제거되어 RNAi 작용제의 리포솜 제제를 산출한다.
필요하면, 응축을 보조하는 담체 화합물은 응축 반응 동안에 예컨대, 조절된 첨가에 의하여 첨가될 수 있다. 예를 들면, 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체(예컨대, 스페르민 또는 스페르미딘)일 수 있다. 또한, pH는 조절되어 응축을 유리하게도 할 수 있다.
전달 운반체의 구조적 구성성분으로서 폴리뉴클레오티드/양이온 지질 복합체를 포함하는 안정한 폴리뉴클레오티드 전달 운반체를 생성하는 방법은 예컨대, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있는 WO 96/37194호에 더 기술되어 있다. 리포솜 형성은 Felgner, P. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; 미국 특허 번호 제4,897,355호; 미국 특허 번호 제5,171,678호; Bangham, 등 M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, 등 Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, 등 Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, 등 Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, 등 Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; 및 Fukunaga, 등 Endocrinol. 115:757, 1984에 기술된 예시적인 방법의 하나 이상의 양태를 포함할 수도 있다. 전달 운반체로서 이용되는데 적당한 크기의 지질 응집체를 제조하는 흔히 이용되는 기법은 초음파처리 및 동결-해동 플러스 압출(freeze-thaw plus extrusion)을 포함한다(예컨대, Mayer 등, Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986 참조). 일관되게 작고(50 내지 200 nm) 및 상대적으로 균일한 응집체를 원하는 경우 미세유동화를 이용할 수 있다(Mayhew 등, Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). 그러한 방법은 RNAi 작용제 제제를 리포솜으로 패키징하도록 용이하게 개조된다.
리포솜은 2개의 광범위한 종류에 속한다. 양이온성 리포솜은 음으로 대전된 핵산 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 양으로 대전된 리포솜이다. 양으로 대전된 핵산/리포솜 복합체는 음으로 대전된 세포 표면과 결합하고 엔도솜에 내재된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인하여, 리포솜은 파열되어 그 내용물을 세포 세포질로 방출한다(Wang 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
pH-민감성 또는 음으로 대전된 리포솜은 핵산과 복합하기 보다는 핵산을 트래핑한다. 핵산 및 지질이 유사하게 대전되기 때문에, 복합체 형성보다는 반발력이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 일부 핵산이 그러한 리포솜의 수성 내부 내에서 트래핑된다. pH-민감성 리포솜은 배양되는 세포 단일층들로 티미딘 키나아제 유전자를 인코딩하는 핵산을 전달하는데 이용되어 왔다. 외인성 유전자의 발현은 표적 세포에서 검출되었다(Zhou 등, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
리포솜 조성물의 하나의 중요한 유형은 천연-유래 포스파티딜콜린이 아닌 인지질을 포함한다. 중성 리포솜 조성물은, 예를 들면, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포솜 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면에, 음이온성 융합성 리포솜은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 다른 유형의 리포솜 조성물은 예를 들면, 대두 PC 및 계란 PC와 같이 포스파티딜콜린(PC)으로부터 형성된다. 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
시험관 내 및 생체 내에서 세포로 리포솜을 도입하는 다른 방법의 예는 미국 특허 번호 5,283,185호; 미국 특허 번호 5,171,678호; WO 94/00569호; WO 93/24640호; WO 91/16024호; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; 및 Strauss, EMBO J.11:417, 1992를 포함한다.
비이온성 리포솜 시스템, 특히, 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템도 피부로의 약물의 전달에 있어서 그 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. Novasome™ I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome™ II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포솜 제형을 이용하여 마우스 피부의 진피로 사이클로스포린-A를 전달하였다. 결과에 따르면 그러한 비이온성 리포솜 시스템은 사이클로스포린-A의 피부의 상이한 층들로의 침착을 촉진시키는데 효과적이었다(Hu 등, S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
리포솜은 "입체적으로 안정화된" 리포솜도 포함하는데, 본원에 사용된 이 용어는 하나 이상의 특수화된 지질이 리포솜으로 혼입되는 경우, 그러한 특수화된 지질이 부족한 리포솜과 비교하여 순환 수명을 향상시키는 결과를 갖는 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포솜을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포솜의 예로는 리포솜의 소낭-형성 지질 부분(A)의 일부가 모노시알로강글리오시드 GM1 등과 같은 하나 이상의 글리코지질을 포함하거나 (B)가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화되는 것들이다. 어느 특정한 이론에 구속되려 하지 않으면서, 적어도 강글리오시드, 스핑고미엘린 또는 PEG-유도체화 지질을 포함하는 입체적으로 안정화된 리포솜에 대하여, 그러한 입체적으로 안정화된 리포솜의 향상된 순환 반감기는 세망내피계통(RES)의 세포로의 감소된 흡수로부터 유래한다고 당업계에서 간주된다(Allen 등, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu 등, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
하나 이상의 글리코지질을 포함하는 다양한 리포솜이 당업계에 알려져 있다. Papahadjopoulos 등(Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)은 모노시알로강글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트 및 포스파티딜리노시톨이 리포솜의 혈액 반감기를 향상시키는 능력을 보고하였다. 그러한 발견은 Gabizon 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)에 의하여 상세히 설명되었다. 양쪽 모두가 Allen 등에 속하는 미국 특허 번호 4,837,028호 및 국제 특허 출원 번호 WO 88/04924호는 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜(1) 및 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포솜(2)을 개시한다. 미국 특허 번호 5,543,152 호(Webb 등)는 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포솜은 국제 특허 출원 번호 WO 97/13499 호(Lim 등)에 개시되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 양이온성 리포솜이 이용된다. 양이온성 리포솜은 세포막으로 융합할 수 있는 이점을 갖는다. 비-양이온성 리포솜은 비록 원형질막과 효율적으로 융합할 수 없다고 하더라도 생체 내에서 대식세포들에 의하여 취해지고, RNAi 작용제를 대식세포들로 전달하기 위해 이용될 수 있다.
리포솜의 다른 이점은 다음을 포함한다; 천연 인지질로부터 얻은 리포솜은 생물학적 적합성 및 생물분해성이 있고; 리포솜은 광범위한 물 및 지질 용해성 약물이 혼입될 수 있고; 리포솜은 그 내부 격실에 있는 캡슐화된 RNAi 작용제를 물질 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다(Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). 리포솜 제형의 제제에 있어서 중요한 고려사항은 리포솜의 지질 표면 전하, 소낭 크기 및 수성 부피이다.
양으로 대전된 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)를 이용하여 핵산과 자발적으로 상호작용하는 작은 리포솜을 형성하여 조직 배양 세포의 세포막의 음으로 대전된 지질과 융합할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하여, RNAi 작용제의 전달이 이루어질 수 있다(예컨대, Felgner, P. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417, 1987 및 DOTMA의 설명 및 DNA와의 그 용도에 대한 미국 특허 번호 4,897,355호 참조).
DOTMA 유사체인 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판(DOTAP)을 인지질과 병용하여 DNA-복합 소낭을 형성할 수 있다. LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)은 고도의 음이온성 핵산을 음으로 대전된 폴리뉴클레오티드와 자발적으로 상호작용하는 양으로 대전된 DOTMA 리포솜을 포함하는 살아있는 조직 배양 세포로 전달하여 복합체를 형성하는데 효과적인 작용제이다. 충분히 양으로 대전된 리포솜을 이용하는 경우, 이로 인해 생성된 복합체 상의 순전하 또한 양이다. 이런 식으로 제조된 양으로 대전된 복합체는 음으로 대전된 세포 표면에 자발적으로 부착하고, 원형질막과 융합하며, 기능적 핵산을 예를 들면, 조직 배양 세포로 효율적으로 전달한다. 다른 상업적으로 허용 가능한 양이온성 지질, 1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판("DOTAP")(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)은 올레오일 모이어티들이 에테르 연결보다는 에스테르에 의하여 연결된다는 점에서 DOTMA와 상이하다.
다른 보고된 양이온성 지질 화합물은 예를 들면, 두가지 유형의 지질 중 하나에 컨쥬게이트되고 5-카르복시스페르밀글리신 디옥타올레오일아미드("DOGS")(Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카르복시스페르밀-아미드("DPPES")와 같은 화합물을 포함하는 카르복시스페르민을 포함하는 다양한 모이어티들에 컨쥬게이션된 것들을 포함한다(예컨대, 미국 특허 번호 5,171,678호 참조).
다른 양이온성 지질 컨쥬게이트는 DOPE와 조합되어 리포솜으로 제형화되는 콜레스테롤("DC-Chol")과 지질의 유도체화를 포함한다(Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun.179:280, 1991 참조). 폴리리신을 DOPE에 컨쥬게이트하여 제조되는 지질폴리리신(lipopolylysine)은 혈청의 존재하에 전달감염에 대하여 유효한 것으로 보고되었다(Zhou, X. 등, Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). 특정 세포주에 대하여, 컨쥬게이트된 양이온성 지질을 포함하는 그러한 리포솜은 DOTMA-함유 조성물보다 더 낮은 독성을 보이며 더 효율적인 전달감염을 제공하는 것으로 전해진다. 기타 상업적으로 이용 가능한 양이온성 지질 생성물은 DMRIE 및 DMRIE-HP(Vical, La Jolla, California) 및 리포펙타민(DOSPA)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 전달에 적합한 기타 양이온성 지질은 WO 98/39359호 및 WO 96/37194호에 기술되어 있다.
리포솜 제형은 국소 투여에 특히 적합하며, 리포솜은 기타 제형보다 더 몇몇 장점을 제시한다. 그러한 장점은 투여된 약물의 높은 전신 흡수에 관한 감소된 부작용, 소기의 표적에서 투여된 약물의 증가된 축적 및 피부로 RNAi 작용제를 투여할 수 있는 능력을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 리포솜은 RNAi 작용제를 상피 세포로 전달하는데 이용되며, 또한, RNAi 작용제의 피부 조직, 예컨대, 피부로의 투과를 향상시키기 위해서 이용된다. 예를 들면, 리포솜은 국소적으로 도포될 수 있다. 리포솜으로 제형화되는 약물의 피부로의 국소 전달은 문서화되었다(예컨대, Weiner 등, Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 및 du Plessis 등, Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. 등 Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. 등 Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987 참조).
비이온성 리포솜 시스템, 특히, 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템도 피부로의 약물의 전달에 있어서 그 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. Novasome I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포솜 제형을 이용하여 마우스 피부의 표피로 약물을 전달하였다. RNAi 작용제와의 그러한 제형은 피부 장애를 치료하는데 유용하다.
iRNA를 포함하는 리포솜은 고도로 변형가능하게 할 수 있다. 그러한 변형가능함은 리포솜이 리포솜의 평균 반경보다 더 작은 기공을 통과하도록 할 수 있다. 예를 들면, 트랜스퍼솜은 변형가능한 리포솜의 일 유형이다. 트랜스퍼솜은 표면단 활성화제, 통상적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. RNAi 작용제를 포함하는 트랜스퍼솜은 예를 들면, RNAi 작용제를 피부 내에서 케라틴 생성 세포로 전달하기 위하여 감염에 의하여 피하적으로 전달될 수 있다. 무손상 포유류의 피부를 가로지르기 위하여, 지질 소낭은 적당한 경피 구배의 영향 하에서 각각의 직경이 50 nm 미만인 일련의 미세 기공들을 통과하여야 한다. 또한, 지질 특성으로 인하여, 그러한 트랜스퍼솜은 자가-최적화하고(예컨대, 피부 내의 기공의 형상에 적응됨), 자가-복구할 수 있으며, 종종 단편화하지 않고 그 표적에 도달하며 자주 자가-로딩(loading)할 수 있다.
본 발명에 부합하는 기타 제형은 2008년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/018,616호; 2008년 1월 2일에 출원된 61/018,611호; 2008년 3월 26일에 출원된 61/039,748호; 2008년 4월 22일에 출원된 61/047,087호 및 2008년 5월 8일에 출원된 61/051,528호에 기술되어 있다. 2007년 10월 3일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2007/080331호도 본 발명에 부합하는 제형을 기술한다.
트랜스퍼솜은 또 다른 유형의 리포솜이며, 약물 전달 운반체에 대한 매력적인 후보인 고도로 변형가능한 지질 응집체이다. 트랜스퍼솜은 고도로 변형가능하여 소적보다 더 작은 기공을 용이하게 침투할 수 있는 지질 소적으로 기술될 수 있다. 트랜스퍼솜은 이들이 이용되는 환경에 적응될 수 있으며, 예컨대, 이들은 자가-최적화하고(피부 내의 기공의 형상에 적응됨), 자가-복구하며, 종종 단편화하지 않고 그 표적에 도달하며 자주 자가-로딩한다. 트랜스퍼솜을 제작하기 위하여, 표면단-활성화제, 통상적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가하는 것이 가능하다. 트랜스퍼솜은 피부에 혈청 알부민을 전달하는데 이용되어 왔다. 혈청 알부민의 트랜스퍼솜-매개 전달은 혈청 알부민을 포함하는 용액의 피하 주사만큼 유효하다고 밝혀져 있다.
계면활성제는 (마이크로에멀젼을 포함하는) 에멀젼 및 리포솜과 같은 제형에서 광범위한 응용이 있다. 천연 및 합성인 많은 상이한 유형의 계면활성제의 특성을 분류하고 등급화하는 가장 흔한 방법은 친수성/친지방성 균형(HLB)의 이용에 의한 것이다. ("머리"로도 알려진) 친수성기의 특성은 제형에서 이용되는 상이한 계면활성제를 범주로 나누는 가장 유용한 수단을 제공한다(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285에서).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면, 이는 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약학적 및 화장료 제품에서 광범위한 응용이 있으며 넓은 범위의 pH 값에 걸쳐 사용할 수 있다. 일반적으로, 그 HLB 값은 그 구조에 따라 2 내지 약 18에 이른다. 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르 및 에톡실화된 에스테르와 같은 비이온성 에스테르를 포함한다. 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화된 알코올 및 에톡실화/프로폭실화 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르도 이 분류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 클래스의 가장 인기있는 요소이다.
만약 계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산되는 경우 음전하를 보유한다면, 계면활성제는 비이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누와 같은 카브록실레이트, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 알킬 설페이트 및 에톡실화 알킬 설페이트와 같은 황산의 에스테르, 알킬 벤젠 설포네이트와 같은 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 클래스의 가장 중요한 요소는 알킬 설페이트 및 비누이다.
만약 계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산되는 경우 양전하를 보유한다면, 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4급 암모늄 염 및 에톡실화 아민을 포함한다. 4급 암모늄 염은 이 클래스의 가장 많이 이용되는 요소이다.
만약 계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 보유하는 능력을 갖는다면, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
계면활성제를 약물 제품, 제형 및 에멀젼에 이용하는 것을 검토하였다(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285에서).
본 발명의 방법에 이용되는 iRNA는 미셀 제형으로 제공될 수도 있다. "미셀"은 분자의 모든 소수성 부분들이 안으로 향하게 되어, 친수성 부분들이 주위의 수상과 접촉하도록, 양친매성 분자들이 구형 구조로 배열되어 있는 특정 유형의 분자 어셈블리로서 본원에 정의되어 있다. 환경이 소수성이면 반대 배열이 존재한다.
경피막을 통한 전달에 적당한 혼합된 미셀 제형은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 C8 내지 C22 알킬 설페이트 및 미셀 형성 화합물의 수용액을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예시적인 미셀 형성 화합물은 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올리에이트, 모노라우레이트, 보라지유, 달맞이꽃유, 멘톨, 트리히드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 그 약학적으로 허용 가능한 염, 글리세린, 폴리글리세린, 리신, 폴리리신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 그 유사체, 폴리도카놀 알킬 에테르 및 그 유사체, 케노데옥시콜산염, 데옥시콜산염, 및 그 혼합물을 포함한다. 미셀 형성 화합물은 알칼리 금속 알킬 설페이트와 동시에 또는 이의 첨가 이후에 첨가될 수 있다. 혼합된 미셀은 더 작은 크기의 미셀을 제공하기 위하여 실질적으로 임의의 성분과 혼합하지만 격렬한 혼합으로 형성될 것이다.
하나의 방법에 있어서, siRNA 조성물 및 적어도 알칼리 금속 알킬 설페이트를 포함하는 제1 미셀 조성물이 제조된다. 이후 제1 미셀 조성물은 적어도 3개의 미셀 형성 혼합물과 혼합되어 혼합된 미셀 조성물을 형성한다. 다른 방법에 있어서, 미셀 조성물은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 미셀 형성 화합물들 중 적어도 하나를 혼합한 이후, 나머지 미셀 형성 화합물들을 격렬히 혼합하면서 첨가함으로써 제조된다.
페놀 및/또는 m-크레솔은 혼합된 미셀 조성물에 첨가되어 제형을 안정화시키고 세균 성장에 대항하여 보호할 수 있다. 대안적으로, 페놀 및/또는 m-크레솔은 미셀 형성 성분들과 함께 첨가될 수 있다. 글리세린과 같은 등장제는 혼합된 미셀 조성물을 형성한 이후에 첨가될 수도 있다.
미셀 제형을 스프레이로 전달하기 위하여, 제형은 에어로졸 분배기로 들어갈 수 있고, 분배기는 추진제로 충진된다. 압력 하에 있는 추진제는 분배기 내에서 액체 형태이다. 성분들의 비율은 수상 및 추진제상이 하나가 되도록, 즉, 하나의 상이 존재하도록, 조정된다. 2가지 상들이 존재한다면, 예컨대, 계량 밸브를 통해 내용물의 일부를 분배하기 전에 분배기를 흔들 필요가 있다. 약학 제제의 분배된 용량은 미세한 스프레이의 계량 밸브로부터 추진된다.
추진제는 수소-함유 염화불화탄소, 수소-함유 불화탄소, 디메틸 에테르 및 디에틸 에테르를 포함할 수 있다. 특정 실시형태들에 있어서, HFA 134a(1,1,1,2 테트라플루오로에탄)를 이용할 수 있다.
필수 성분들의 특정 농도는 상대적으로 간단한 실험에 의하여 측정될 수 있다. 구강을 통한 흡수를 위해, 주사를 통한 투약량 또는 위장관을 통한 투여를 예컨대, 적어도 2배 또는 3배 증가시키는 것이 종종 바람직하다.
B. 지질 입자
iRNA, 예컨대, 본 발명의 dsRNA는 지질 제형, 예컨대, LNP 또는 기타 핵산-지질 입자 내에 완전히 캡슐화된다.
본원에 사용된 "LNP"라는 용어는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. LNP는 전형적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예컨대, PEG-지질 컨쥬게이트)을 포함한다. LNP는 이들이 정맥 내(i.v.) 주사 이후에 순환 수명이 연장된 것을 보이며, 원위(예컨대, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위들)에서 축적되기 때문에 전신적인 응용에 극히 유용하다. LNP는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/03683호에서 설명된 캡슐화된 축합제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본 발명의 입자는 통상적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 더 통상적으로는 약 60 nm 내지 약 130 nm, 더 통상적으로는 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 통상적으로는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로는 비독성이다. 또한, 핵산이 본 발명의 핵산-지질 입자 내에 존재하는 경우, 핵산은 수용액 내에서 뉴클레아제로 분해되는 것에 내성이 있다. 핵산-지질 입자 및 그 제조 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 5,976,567호; 5,981,501호; 6,534,484호; 6,586,410호; 6,815,432호; 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0324120호 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 96/40964호에 개시되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 지질 대 약물 비율(질량/질량 비율)(예컨대, 지질 대 dsRNA 비율)은 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위에 있을 것이다. 상기 인용된 범위에 중간인 범위도 본 발명의 일부로 고려된다.
양이온성 지질은 예를 들면, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(I-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), N-(I-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 그 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민(ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아자네디일)디도데칸-2-올(Tech G1), 또는 그 혼합물일 수 있다. 양이온 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 20 몰% 내지 약 50 몰% 또는 약 40 몰%로 포함될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 화합물 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란을 이용하여 지질-siRNA 나노입자를 제조할 수 있다. 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란의 합성은 본원에 참조로 포함된 2008년 10월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/107,998호에 기술되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 지질-siRNA 입자는 63.0 ± 20 nm의 입자 크기 및 0.027 siRNA/지질 비율을 갖는 40% 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란: 10% DSPC: 40% 콜레스테롤: 10% PEG-C-DOMG(몰 퍼센트)를 포함한다.
이온화가능/비-양이온성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-말), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 콜레스테롤, 또는 그 혼합물을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 콜레스테롤이 포함된다면, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 90 몰%, 약 10 몰% 또는 약 58 몰%일 수 있다.
입자의 응집을 억제하는 컨쥬게이트된 지질은 예를 들면, PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer) 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질일 수 있다. PEG-DAA 컨쥬게이트는 예를 들면, PEG-디라우릴옥시프로필(Ci2), PEG-디미리스틸옥시프로필(Ci4), PEG-디팔미틸옥시프로필(Ci6), 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필(C18)일 수 있다. 입자의 응집을 방지하는 컨쥬게이트 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 0 몰% 내지 약 20 몰% 또는 약 2 몰%일 수 있다.
일부 실시형태들에 있어서, 핵산-지질 입자는 콜레스테롤을 입자 내에 존재하는 총 지질의 예컨대, 약 10 몰% 내지 약 60 몰% 또는 약 48 몰%로 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 리피도이드(lipidoid) ND98·4HCl (분자량 1487)(본원에서 참조로 포함되어 있는 2008년 3월 26일에 출원된 미국 특허 출원 번호 12/056,230 호 참조), 콜레스테롤(Sigma-Aldrich) 및 PEG-세라미드 C16(Avanti Polar Lipids)을 이용하여 지질-dsRNA 나노입자(즉, LNP01 입자)를 제조할 수 있다. 각각이 에탄올 내에 용해된 스톡 용액은 하기와 같이 제조될 수 있다: ND98, 133 mg/ml; 콜레스테롤, 25 mg/ml, PEG-세라미드 C16, 100 mg/ml. ND98, 콜레스테롤 및 PEG-세라미드 C16 스톡 용액은 이후 예컨대, 42:48:10 몰 비율로 조합될 수 있다. 조합된 지질 용액은 최종 에탄올 농도가 약 35 내지 45%이고 최종 아세트산 나트륨 농도가 약 100 내지 300 mM가 되도록 수성 dsRNA(예컨대, 아세트산 나트륨 pH 5에서)와 혼합될 수 있다. 지질-dsRNA 나노입자는 통상적으로 혼합시에 자발적으로 형성된다. 소기의 입자 크기 분포에 따라, 이로 생성된 나노입자 혼합물은 예를 들면, Lipex Extruder(Northern Lipids, Inc)와 같은 열배럴 압출기(thermobarrel extruder)를 이용하여 폴리카보네이트막(예컨대, 100 nm 컷-오프(cut-off))을 통해 압출될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 압출 단계는 생략될 수 있다. 에탄올 제거 및 동시적인 완충액 교환은 예를 들면, 투석 또는 접선 유동 여과에 의하여 달성될 수 있다. 완충액은 예를 들면, 인산염 완충 염수(PBS)와 약 pH 7, 예컨대, 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3 또는 약 pH 7.4에서 교환될 수 있다.
[화학식 1]

LNP01 제형은 예컨대, 본원에 참조로 포함된 국제 출원 공개 번호 WO 2008/042973호에 기술되어 있다.
추가의 예시적인 지질-dsRNA 제형은 하기 표 1에 기술되어 있다.
표 1.


DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린
DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린
PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤(C14-PEG, 또는 PEG-C14) (평균 2000의 몰 wt의 PEG)
PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤(C18-PEG, 또는 PEG-C18) (평균 2000의 몰 wt의 PEG)
PEG-cDMA: PEG-카르바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민(평균 2000의 몰 wt의 PEG)
SNALP(1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA))를 포함하는 제형은 본원에 참조로 포함된 2009년 4월 15일에 출원된 국제 공개 번호 WO2009/127060 호에 기술되어 있다.
XTC를 포함하는 제형은 예컨대, 본원에 참조로 포함된, 2009년 1월 29일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/148,366 호; 2009년 3월 2일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/156,851 호; 2009년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 계열 번호; 2009년 7월 24일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/228,373 호; 2009년 9월 3일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/239,686 호 및 2010년 1월 29일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2010/022614 호에 기술되어 있다.
MC3을 포함하는 제형은 예컨대, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된, 2010 년 6월 10일에 출원된 미국 특허 공개 번호 2010/0324120 호에 기술되어 있다.
ALNY-100을 포함하는 제형은 예컨대, 본원에 참조로 포함된, 2009년 11월 10일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US09/63933 호에 기술되어 있다.
C12-200을 포함하는 제형은 본원에 참조로 포함된, 2009년 5월 5일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/175,770 호 및 2010년 5월 5일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US10/33777 호에 기술되어 있다.
이온화가능/양이온성 지질의 합성
본 발명의 핵산-지질 입자에 사용된 화합물들 중 어느 하나는, 예컨대, 양이온성 지질 등은 실시예에 더 상세히 기술된 방법을 포함하는 알려진 유기 합성 기법에 의하여 제조될 수 있다. 모든 치환기는 달리 지시되지 않으면 하기에 정의된 바와 같다.
"알킬"은 직쇄 또는 분지쇄, 비고리형 또는 고리형인 탄소 원자 1 내지 24 개를 포함하는 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 포화 직쇄 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하는 반면에, 포화된 분지쇄 알킬은 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸 등을 포함한다. 대표적인 포화 고리형 알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함하는 반면에, 불포화된 고리형 알킬은 사이클로펜테닐 및 사이클로헥세닐 등을 포함한다.
"알케닐"은 상기에 정의된 바와 같이, 인접 탄소 원자들 사이의 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는 알킬을 의미한다. 알케닐은 시스 및 트랜스 이성질체 양쪽 모두를 포함한다. 대표적인 직쇄 및 분지쇄 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등을 포함한다.
"알키닐"은 상기에 정의된 바와 같이, 인접 탄소들 사이의 적어도 하나의 3중 결합을 추가로 포함하는 임의의 알킬 또는 알케닐을 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지쇄 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1 부티닐 등을 포함한다.
"아실"은 임의의 알킬, 알케닐 또는 알키닐을 의미하며, 부착 지점에서의 탄소가 하기에 정의된 바와 같이 옥소기로 치환된다. 예를 들면, -C(=O)알킬, -C(=O)알케닐, 및 -C(=O)알키닐은 아실기이다.
"헤테로사이클"은 포화, 불포화 또는 방향족이며, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 개의 헤테로원자를 포함하는 5원 내지 7원 모노사이클릭, 또는 7원 내지 10원 바이사이클릭 헤테로사이클릭 고리를 의미하며, 상기 헤테로사이클들 중 어느 하나는 벤젠 고리로 융합되는 바이사이클릭 고리를 포함하여, 질소 및 황 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 사원화(quaternized)될 수 있다. 헤테로사이클은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통하여 부착될 수 있다. 헤테로사이클은 하기에 정의된 바와 같은 헤테로아릴을 포함한다. 헤테로사이클은 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 히단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로피리디닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐 등을 포함한다.
"선택적으로 치환된 알킬", "선택적으로 치환된 알케닐", "선택적으로 치환된 알키닐", "선택적으로 치환된 아실" 및 "선택적으로 치환된 헤테로사이클"이라는 용어는 치환되는 경우, 적어도 하나의 수소 원자가 치환기로 대체되는 것을 의미한다. 옥소 치환기(=O)의 경우, 2 개의 수소 원자들이 대체된다. 이런 점에 있어서, 치환기는 옥소, 할로겐, 헤테로사이클, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy을 포함하며, n은 0, 1 또는 2이고, Rx 및 Ry은 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로사이클이며, 상기 알킬 및 헤테로사이클 치환기들의 각각은 옥소, 할로겐, -OH, -CN, 알킬, -ORx, 헤테로사이클, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy 중 하나 이상으로 더 치환될 수 있다.
"할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 의미한다.
일부 실시형태들에 있어서, 본 발명의 방법은 보호기의 사용을 필요로 할 수 있다. 보호기 방법론은 당업자에게 주지되어 있다(예를 들면, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. 등, Wiley-Interscience, New York City, 1999 참조). 요컨대, 본 발명의 문맥 내에서 보호기는 기능기의 원하지 않은 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 기능기에 첨가되어 특정 반응 도중에 그 반응성을 감추고, 이후 제거되어 최초 기능기를 드러낼 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, "알코올 보호기"가 사용된다. "알코올 보호기"는 알코올 기능기의 원하지 않는 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 당업계에 주지된 기법을 이용하여 첨가되고 제거될 수 있다.
화학식 A의 합성
일부 실시형태들에 있어서, 본 발명의 핵산-지질 입자는 화학식 A의 양이온성 지질을 이용하여 공식화된다:
[화학식 A]
Figure 112021145756847-pat00067

여기서, R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각은 선택적으로 치환될 수 있으며, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이거나 R3 및 R4는 함께 취하여 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, 양이온성 지질은 XTC(2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란)이다. 일반적으로, 상기 화학식 A의 지질은 달리 지시되지 않으면 모든 치환기가 상기 정의된 바와 같은, 하기 반응식 1 또는 2에 의하여 제조될 수 있다.
[반응식 1]

R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각이 선택적으로 치환될 수 있으며, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이거나, R3 및 R4는 함께 취하여 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있는 지질 A는 반응식 1에 따라 제조될 수 있다. 케톤 1 및 브롬화물 2는 구입되거나 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 1 및 2의 반응으로 케탈 3을 산출한다. 케탈 3을 아민 4로 처리하면 화학식 A의 지질을 산출한다. 화학식 A의 지질은 화학식 5의 유기염을 갖는 해당 암모늄 염으로 변환될 수 있으며, X는 할로겐, 수산화물, 포스페이트, 설페이트 등으로부터 선택된 음이온 반대 이온이다.
[반응식 2]

대안적으로, 케톤 1 시작 물질은 반응식 2에 따라 제조될 수 있다. 그리냐르 시약 6 및 시안화물 7은 구입되거나 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 6 및 7의 반응은 케톤 1을 산출한다. 케톤 1의 화학식 A의 해당 지질로의 변환은 반응식 1에 기술된 바와 같다.
MC3의 합성
DLin-M-C3-DMA(즉, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트)의 제조는 다음과 같다. 디클로로메탄(5 mL)에 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(0.53 g), 4-N,N-디메틸아미노부티르산 염산염(0.51 g), 4-N,N-디메틸아미노피리딘(0.61 g) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(0.53 g)을 용해시킨 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반시켰다. 용액은 묽은 염산으로 세척하고 묽은 수성 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 유기 분획을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 여과하며 용매를 로타베이퍼(rotavap) 상에서 제거하였다. 잔사는 1 내지 5% 메탄올/디클로로메탄 용리 구배를 이용하여 실리카 겔 칼럼(20 g)으로 통과시켰다. 정제된 생성물을 포함하는 분획을 조합하고 용매를 제거하여 무색의 오일(0.54 g)을 산출하였다.
ALNY-100의 합성
케탈 519[ALNY-100]의 합성은 하기 반응식 3을 이용하여 수행되었다:
[반응식 3]
Figure 112021145756847-pat00070

515의 합성
2 구 RBF(1 L) 내의 200 ml 무수 THF에 LiAlH4 (3.74 g, 0.09852 mol)의 교반된 현탁액에 THF 70 mL에 514(10 g, 0.04926 mol)을 용해시킨 용액을 0℃의 질소 분위기 하에서 천천히 첨가하였다. 완전히 첨가한 이후에, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 이후 4 시간 동안 환류 가열하였다. 반응의 진행은 TLC로 모니터링하였다. (TLC에 의한) 반응의 완료 이후에, 혼합물은 0℃로 냉각하였으며, 포화 Na2SO4 용액을 조심스럽게 첨가하여 ◎칭하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하고 여별하였다. 잔사를 THF로 충분히 세척하였다. 여과액 및 세척액을 혼합하고, 400 mL 디옥산 및 26 mL의 진한 HCl로 희석하고, 실온에서 20 분 동안 교반하였다. 휘발 성분들을 진공 하에서 제거하여 백색 고체로서 515의 염산염을 생성하였다. 수율: 7.12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (broad, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
516의 합성
250 mL 2 구 RBF 내의 100 mL 무수 DCM에 화합물 515를 용해시킨 교반된 용액에 NEt3(37.2 mL, 0.2669 mol)을 첨가하고 질소 분위기 하에서 0℃로 냉각하였다. N-(벤질옥시-카르보닐옥시)-숙신이미드(20 g, 0.08007 mol)를 50 mL 무수 DCM에 천천히 첨가한 이후에, 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. (TLC에 의하여 2 내지 3 시간) 반응을 완료한 이후에, 혼합물을 1 N HCl 용액(1 x 100 mL) 및 포화 NaHCO3 용액(1 x 50 mL)으로 연속적으로 세척하였다. 이후, 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매를 증발시켜 미정제 물질을 생성하고, 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 끈적한 덩어리로서 516을 얻었다. 수율: 11g (89%). 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
517A 및 517B의 합성
사이클로펜텐 516(5g, 0.02164 mol)을 단일 구 500 mL RBF 내의 220 mL 아세톤 및 물(10:1)의 용액에 용해시키고, 여기에 N-메틸 모르폴린-N-옥사이드(7.6 g, 0.06492 mol)를 첨가하고, 실온에서 tert-부탄올에 용해시킨 OsO4(0.275 g, 0.00108 mol)의 7.6% 용액 4.2 mL를 첨가하였다. 반응(~ 3 시간)을 완료한 이후에, 혼합물을 고체 Na2SO3를 첨가하여 ◎칭하고, 이로 생성된 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM(300 mL)로 희석시키고 물(2 x 100 mL)로 세척하고, 이후 포화 NaHCO3(1 x 50 mL) 용액, 물(1 x 30 mL)로 세척하고, 마지막으로 염수(1 x 50 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공 중에 제거하였다. 미정제 물질의 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 정제로 부분 입체 이성질체의 혼합물을 생성하였고, 이를 예비 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하였다. 수율: - 6 g 미정제
517A - 피크-1 (백색 고체), 5.13 g (96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72-1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 +]-283.5 존재, HPLC-97.86%. 입체화학을 X-선으로 확인하였다.
518의 합성
화합물 505의 합성에 대해 기술된 절차와 유사한 절차를 이용하여, 무색 오일로서 화합물 518(1.2 g, 41%)을 얻었다. 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
화합물 519의 합성을 위한 일반 절차
헥산(15 mL)에 화합물 518(1 당량)을 용해시킨 용액을 LAH를 THF(1 M, 2 당량)에 용해시킨 냉각된 용액에 적하 방식으로 첨가하였다. 완전히 첨가한 이후에, 혼합물을 40℃에서 0.5 시간에 걸쳐서 가열하고, 이후 얼음조상에서 다시 냉각시켰다. 혼합물을 포화 수성 Na2SO4으로 조심스럽게 가수분해시키고 이후 셀라이트를 통해 여과시키고, 오일이 되게 하였다. 칼럼 크로마토그래피로 인하여 순수한 519(1.3 g, 68%)가 제공되고, 순수한 519는 무색 오일로 수득되었다. 13C NMR δ = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; 전기분무 MS (+ve): C44H80NO2 (M + H)+에 대한 분자량 계산값. 654.6, 실제값 654.6.
표준 또는 무압출(extrusion-free) 방법에 의해 제조된 제형은 유사한 방식으로 특징될 수 있다. 예를 들면, 제형은 통상적으로 육안 검사에 의해 특징된다. 이들은 응집체 또는 침전물이 없는 약간 흰색의 반투명 용액이어야 한다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 예를 들면, 맬번 제타사이저 나노 ZS(맬번, 미국)을 이용하여 광산란에 의하여 측정될 수 있다. 입자는 크기가 40 내지 100 nm인 것과 같이 약 20 내지 300 nm이어야 한다. 입자 크기 분포는 단봉형이어야 한다. 트랩된 분율뿐만 아니라 제형 내의 총 dsRNA 농도는 염색 배제 분석법을 이용하여 추정한다. 제형화된 dsRNA의 시료는 예컨대, 0.5% 트리톤-X100과 같은 계면활성제를 파열시키는 제형의 존재 또는 부재 하에 리보그린(Molecular Probes)과 같은 RNA-결합 염료와 함께 배양될 수 있다. 제형 내의 총 dsRNA는 표준 곡선에 대하여 계면활성제를 포함하는 시료로부터 나온 신호에 의하여 결정될 수 있다. 트랩된 분율은 (계면활성제의 부재 하의 신호에 의해 측정되는 바와 같이) 총 dsRNA 함량으로부터 "유리(free)" dsRNA 함량을 차감함으로써 결정된다. 트랩된 dsRNA 퍼센트는 통상적으로 85%를 초과한다. SNALP 제형에 대하여, 입자 크기는 적어도 30 nm, 적어도 40 nm, 적어도 50 nm, 적어도 60 nm, 적어도 70 nm, 적어도 80 nm, 적어도 90 nm, 적어도 100 nm, 적어도 110 nm, 및 적어도 120 nm이다. 적당한 범위는 통상적으로 약 적어도 50 nm 내지 약 적어도 110 nm, 약 적어도 60 nm 내지 약 적어도 100 nm, 또는 약 적어도 80 nm 내지 약 적어도 90 nm이다.
경구 투여용 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 마이크로미립자, 나노미립자, 물 또는 비수성 매질 내의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제를 포함한다. 증점제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 조제 또는 결합제는 바람직할 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, 경구 제형은 본 발명에서 특징된 dsRNA가 하나 이상의 침투 향상제 계면활성제 및 킬레이트제와 함께 투여되는 경구 제형이다. 적당한 계면활성제는 지방산 및/또는 이들의 에스테르 또는 염, 이들의 담즙산 및/또는 염을 포함한다. 적당한 담즙산/염은 케노데옥시콜산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산(UDCA), 콜산, 데히드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산, 글리콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 나트륨 타우로-24,25-디히드로-푸시데이트 및 나트륨 글리코디히드로푸시데이트를 포함한다. 적당한 지방산은 아라키돈산, 운데칸산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 예를 들면, 담즙산/염과 조합된 지방산/염과 같은 침투 향상제의 조합이 이용된다. 예시적인 일 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 다른 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명에서 특징된 dsRNA는 스프레이된 건조 입자를 포함하여 과립 형태로 경구적으로 전달되거나 복합화되어 마이크로 또는 나노입자를 형성할 수 있다. dsRNA 복합화제는 폴리아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화 젤라틴, 알부빈, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도체화된 폴리이민, 풀루란, 셀룰로오스 및 전분을 포함한다. 적당한 복합화제는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-라이신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예컨대, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락틱-코-글리콜산(PLGA), 알기네이트, 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. dsRNA용 경구 제형 및 그 제제는 그 각각이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 6,887,906 호, 미국 특허 공개 번호 20030027780 호 및 미국 특허 번호 6,747,014 호에 상세히 기술되어 있다.
비경구, (뇌로의) 실질세포 내, 척수강 내, 뇌실 내 또는 간 내 투여용 조성물 및 제형은 완충제, 희석제, 및 침투 향상제, 담체 화합물 및 기타 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 같은, 그러나 여기에 한정되지 않은 기타 적당한 첨가제도 포함할 수 있는 살균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 용액, 에멀젼 및 리포솜-함유 제형을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 이 조성물은 사전형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. 간 암종과 같은 간 장애를 치료하는 경우 간을 표적으로 하는 제형이 특히 바람직하다.
단위 제형으로 간편하게 제시될 수 있는, 본 발명의 약학적 제제는 제약 당업계에 주지된 종래 기법에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기법으로는 활성 성분을 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세 분할된 고체 담체 또는 양쪽 모두와 균일하고 밀접하게 회합시키고 이후 필요하다면, 생성물을 형상화함으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질 젤, 좌약 및 관장제와 같은, 그러나 여기에 한정되지 않은 수많은 가능한 제형 중 어느 하나로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질 내의 현탁액으로 제형화될 수도 있다. 수성 현탁액은 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수도 있다.
C. 추가 제형
i. 에멀젼
본 발명의 조성물은 에멀젼으로 제조 및 제형화될 수 있다. 에멀젼은 통상적으로 직경이 보통 0.1 μm를 초과하는 소적의 형태로 하나의 액체를 다른 액체에 분산시킨 이종 시스템이다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199에서; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245에서; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335에서; Higuchi 등, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301에서 참조). 에멀젼은 종종 서로 서로 밀접하게 혼합되고 분산된 2 개의 혼합되지 않는 액체상을 포함하는 2상계이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 종류일 수 있다. 수상이 크기가 큰 유상으로 미세하게 분할되고 미세한 소적으로 분산되는 경우, 이로 인한 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼이라고 불린다. 대안적으로, 유상이 크기가 큰 수상으로 미세하게 분할되고 미세한 소적으로 분산되는 경우, 이로 인한 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼이라고 불린다. 에멀젼은 분산된 상 및 수상, 유상의 용액으로 또는 분리상으로서 자체적으로 존재할 수 있는 활성 약물에 더하여 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약학적 부형제는 필요하다면 에멀젼에 존재할 수도 있다. 약학적 에멀젼은 예를 들면, 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수(w/o/w) 에멀젼의 경우에서와 같이 2 상을 초과하여 구성된 다중 에멀젼일 수도 있다. 그러한 복합체 제형은 종종 단순 2상 에멀젼이 제공하지 않는 특정 장점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 유성 소적이 작은 물 소적을 둘러싸는 복수의 에멀젼들은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 마찬가지로, 유성 연속상 내에 안정화된 물의 소구체립에 둘러싸인 유성 소적의 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 열역학적 안정성이 거의 없거나 열역학적 안정성이 전혀 없는 것에 의하여 특징된다. 종종, 에멀젼의 분산되거나 불연속적 상은 외부 또는 연속상으로 잘 분산되며, 유화제의 이용을 통하거나 제형의 점도를 통해 이 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 어느 하나는 에멀젼-스타일 연고 베이스 및 크림의 경우에서 처럼, 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 상으로 포함될 수 있는 유화제의 이용을 수반한다. 유화제는 합성 계면활성제, 자연발생적 유화제, 흡수 베이스 및 미세하게 분산된 고체의 4 개 카테고리로 넓게 분류될 수 있다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199에서 참조).
표면 활성제라고도 알려진 합성 계면활성제는 에멀젼의 제형에서 광범위한 적용가능성을 찾으며 문헌에서 검토되었다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285에서; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p.199에서 참조). 계면활성제는 통상적으로 양친매성이며 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성의 비율은 친수성/친지방성 균형(HLB)라고 칭하며 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 있어서 가치있는 도구이다. 계면활성제는 친수성기의 성질에 기초하여 상이한 클래스로 분류될 수 있다: 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285에서 참조).
에멀젼 제형에 이용되는 자연발생적 유화제는 라놀린, 밀랍, 인지질, 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 흡수 베이스는 친수성을 소지하여, 이들이 물을 흡수하여 w/o 에멀젼을 형성하지만, 무수 라놀린 및 친수성 광유(petrolatum)와 같은 이들의 반고체 연경도(consistencies)를 유지할 수 있다. 미세하게 분할된 고체는 특히 계면활성제와의 조합에서, 그리고 점성 제제에 있어서 양호한 유화제로서 이용되기도 한다. 이것은 중금속 수산화물과 같은 극성 무기 고체, 벤토나이트, 아타풀자이트, 헥토라이트, 고령토, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트와 같은 비-팽윤성 점토, 안료 및 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트와 같은 비극성 고체를 포함한다.
대단히 다양한 비-유화 물질들도 에멀젼 제형에 포함되며 에멀젼의 특성에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 항산화제를 포함한다(Block, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드 또는 수성콜로이드는 다당류(예를 들면, 아카시아, 아가, 알긴산, 카라기난, 구아검, 카라야검 및 트라가칸트), 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스 및 카르복시프로필셀룰로오스) 및 합성 중합체(예를 들면, 카르보머, 셀룰로오스 에테르 및 카르복시비닐 중합체)와 같은 자연발생적 검 및 합성 중합체를 포함한다. 이들은 물에서 분산하거나 팽창하여 분산된 상의 소적 주위에 강한 계면 필름을 형성하고 외부상의 점도를 증가시킴으로써 에멀젼을 안정화시키는 콜로이드성 용액을 형성한다.
에멀젼은 종종 미생물의 성장을 용이하게 지지할 수 있는 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 인지질과 같은 많은 성분을 포함하기 때문에, 그러한 제형은 종종 보존제를 포함한다. 에멀젼 제형에 포함되는 흔히 이용되는 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4급 암모늄 염, 염화 벤잘코늄, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산을 포함한다. 항산화제도 에멀젼 제형에 흔히 추가되어 제형의 열화를 방지한다. 이용된 항산화제는 토코페롤과 같은 유리 라디칼 스캐빈저, 알킬 갈레이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 또는 아스코르브산 및 메타중아황산 나트륨과 같은 환원제, 및 시트르산, 주석산 및 레시틴과 같은 항산화 상승제일 수 있다.
피부, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제형의 응용 및 그 제조법은 문헌에서 되었다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199에서 참조). 경구 전달용 에멀젼 제형은 흡수 및 생물이용도 관점에서 효능뿐만 아니라 제형의 용이성으로 인하여 매우 광범위하게 이용되었다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245에서; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199에서 참조). 광유 베이스 완하제, 유용성 비타민 및 고지방 영양 제제는 o/w 에멀젼으로 경구로 흔히 투여되는 물질들이다.
ii. 마이크로에멀젼
본 발명의 일 실시형태에 있어서, iRNA 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼으로 제형화된다. 마이크로에멀젼은 단일 광학적 등방성이며 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 기름 및 양친매성 물질의 시스템으로 정의될 수 있다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245에서 참조). 통상적으로 마이크로에멀젼은 우선 오일을 수성 계면활성제 용액에 분산시킨 후 일반적으로, 중간 사슬-길이 알코올인 제4 성분의 충분량을 첨가하여 투명 시스템을 형성하여 제조되는 시스템이다. 그러므로, 마이크로에멀젼은 표면-활성 분자의 계면 필름에 의하여 안정화된 2 개의 비혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성으로 맑은 분산액으로 기술되었다(Leung 및 Shah, Controlled Release of Drugs에서: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀젼은 오일, 물, 계면활성제, 공계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5 개의 성분의 조합을 통해 흔히 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 형인지의 여부는 이용된 오일 및 계면활성제의 성질에 의존하며, 계면활성제 분자의 극성 머리 및 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적인 패킹에 의존한다(Schott, Remington's Pharmaceutical Sciences에서, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
상 다이아그램을 활용하는 현상학적 접근법은 광범위하게 연구되었으며, 마이크로에멀젼을 제형화하는 방법의 폭넓은 지식을 당업자에게 부여하였다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245에서; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335에서 참조). 종래 에멀젼과 비교하여, 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 소적의 제형에 있어서 수-불용성 약물을 가용화하는 장점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 이용되는 계면활성제는 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올리에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올리에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올리에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올리에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올리에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올리에이트(DAO750)를 단독으로 또는 공계면활성제와 조합하여 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올과 같은 주로 단쇄 알코올인 공계면활성제는 계면활성제 분자들 사이에서 발생된 빈 공간으로 인하여 계면활성제 필름으로 침투하고 그에 따라 무질서한 필름을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 역할을 한다. 그러나, 마이크로에멀젼은 당업계에 알려진 공계면활성제 및 무알코올 자가-유화 마이크로에멀젼 시스템의 이용 없이 제조될 수 있다. 수상은 통상적으로는 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 유상은 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중간 사슬 (C8-C12) 모노, 디, 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성유 및 실리콘유와 같은 물질을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
마이크로에멀젼은 약물 용해화 및 약물의 향상된 흡수의 관점에서 특히 관심의 대상이 된다. (o/w 및 w/o)인 지질계 마이크로에멀젼은 펩티드를 포함하는, 약물의 경구 생물이용도를 향상시키는 것으로 제안되었다(예컨대, 미국 특허 번호 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099 호; Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205 참조). 마이크로에멀젼은 개선된 약물 용해화, 약물을 효소적 가수분해로부터 보호, 막 유동성 및 침투성에서 계면활성제-유도된 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 향상, 제조의 용이성, 고체 제형에 비해 경구 투여의 용이성, 개선된 임상적 역가 및 감소된 독성의 장점을 부여한다(예컨대, 미국 특허 번혼 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099 호; Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho 등, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143 참조). 종종, 마이크로에멀젼은 그 구성성분들이 주위 온도에서 함께 도입되는 경우 자발적으로 형성될 수 있다. 이는 불안정성 약물, 펩티드 또는 iRNA를 제형화하는 경우 특히 장점이 될 수 있다. 마이크로에멀젼은 화장품 및 약학적 응용에 있어서 활성 성분들의 경피적 전달에서 효과적이기도 하다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물 및 제형은 iRNA 및 핵산의 국소 세포 흡수를 개선시킬뿐 아니라, 위장관으로부터 iRNA 및 핵산의 증가된 전신 흡수를 촉진할 것이라고 기대된다.
본 발명의 마이크로에멀젼은 소르비탄 모노스테아레이트(Grill 3), 라브라졸(Labrasol), 및 침투 향상제와 같은 추가적인 구성성분 및 첨가제도 함유하여 제형의 특성을 개선시키고 본 발명의 iRNA 및 핵산의 흡수를 향상시킬 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀젼에 이용된 침투 향상제는 다섯 개의 광범위한 범주- 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 이들 클래스의 각각은 상기에서 토의되었다.
iii. 미세입자
본 발명의 RNAi 작용제는 입자, 예컨대, 미세입자로 포함될 수 있다. 미세입자는 스프레이-건조에 의하여 생성될 수 있지만, 동결 건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이 기법들의 조합을 포함하는 기타 방법에 의하여 생성될 수도 있다.
iv. 침투 향상제
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 다양한 침투 향상제를 채용하여 동물의 피부에 핵산, 특히 iRNA를 효율적으로 전달한다. 대부분의 약물들은 이온화 및 비이온화 형태 양쪽 모두로 용액 내에 존재한다. 그러나, 주로 지질 용해성 또는 친지방성 약물은 세포막을 용이하게 관통한다. 심지어 비친지방성 약물은 관통되는 막이 침투 향상제로 처리되면 세포막을 관통할 수 있다는 것을 알게 되었다. 세포막을 통과하여 비친지방성 약물의 확산을 돕는 것뿐만 아니라, 침투 향상제는 친지방성 약물의 침투성도 향상시킨다.
침투 향상제는 다섯 개의 광범위한 범주, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(예컨대, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92 참조). 상기 언급된 침투 향상제의 클래스들의 각각은 하기에 더 상세히 기술된다.
계면활성제(또는 "표면-활성제")는 수용액에 용해되는 경우, 용액의 표면 장력 또는 수용액 및 다른 액체 사이의 계면 장력을 감소시켜 점막을 통해 iRNA의 흡수가 향상되는 화학적 실체이다. 담즙산염 및 지방산에 더하여, 그러한 침투 향상제는 예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(예컨대, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92 참조); 및 FC-43과 같은 수소를 불소로 치환한 화합물의 에멀젼을 포함한다(Takahashi 등, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
침투 향상제로 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체는 예를 들면, 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데카노산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레오일-락-글리세롤), 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이의 C1-20 알킬 에스테르(예컨대, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이의 모노글리세리드 및 디글리세리드(즉, 올리에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀리에이트 등)을 포함한다(예컨대, Touitou, E., 등. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri 등, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654 참조).
담즙의 생리학적 역할은 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수의 촉진을 포함한다(예컨대, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman 등. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935 참조). 다양한 천연 담즙산염 및 이들의 합성 유도체는 침투 향상제로서 작용한다. 따라서, "담즙산염"이라는 용어는 담즙의 합성 유도체 중 어느 하나뿐만 아니라 담즙의 자연발생적 구성성분중 어느 하나를 포함한다. 적당한 담즙산염은 예를 들면, 콜산(또는 그 약학적으로 허용 가능한 나트륨염, 나트륨 콜레이트), 디히드로콜린산(나트륨 디히드로콜레이트), 데옥시콜린산(나트륨 데옥시콜레이트), 글루콜산(나트륨 글루콜레이트), 글리콜산(나트륨 글리콜레이트), 글리코데옥시콜린산(나트륨 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜린산(나트륨 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜산(나트륨 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜린산(나트륨 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산(UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디히드로-푸시데이트(STDHF), 나트륨 글리코디히드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE) (예컨대, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 판, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto 등, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita 등, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583 참조)를 포함한다.
본 발명과 연관하여 이용되는 킬레이트제는 금속 이온과 함께 복합체를 형성함으로써 용액으로부터 금속 이온을 제거하여 점막을 통해 iRNA의 흡수가 향상시키는 화합물로 정의될 수 있다. 본 발명에서 침투 향상제로의 이용에 대하여, 킬레이트제는 대부분의 특징이되는 DNA 뉴클레아제는 촉매작용에 대한 2가 금속 이온을 필요로 하며, 따라서 킬레이트제에 의하여 억제되므로 DNase 억제제로서도 작용하는 추가 장점을 갖는다(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). 적당한 킬레이트제는 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예컨대, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레스-9 및 베타-디케톤의 N-아미노 아실 유도체(엔아민)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다(예컨대, Katdare, A. 등, Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur 등, J. Control Rel., 1990, 14, 43-51 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 비킬레이트 비계면활성제 침투 향상 화합물은 킬레이트제로서 또는 계면활성제로서 현저하지 않은 활성을 보이지만, 그럼에도 불구하고 영양 점막(alimentary mucosa)를 통해 iRNA의 흡수를 향상시키는 화합물로 정의될 수 있다(예컨대, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33 참조). 그러한 클래스의 침투 향상제는 예를 들면, 불포화 사이클릭 요소, 1-알킬- 및 1-알케닐아자사이클로-알칸온 유도체(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); 및 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존과 같은 비스테로이드성 소염제(Yamashita 등, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)를 포함한다.
세포 수준에서 iRNA의 흡수를 향상시키는 작용제는 본 발명의 약학적 조성물 및 기타 조성물에 첨가될 수도 있다. 예를 들면, 리포펙틴(Junichi 등, 미국특허 번호 5,705,188 호)과 같은 양이온성 지질, 양이온성 글리세롤 유도체 및 폴리리신(Lollo 등, PCT 출원 WO 97/30731 호)과 같은 폴리양이온성 분자는 dsRNA의 세포 흡수를 향상시키는 것으로 알려져 있기도 하다. 상업적으로 이용 가능한 전달감염 시약의 예는 예를 들면, 다른 것들 중에서, Lipofectamine™(Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™(Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™(Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™(Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™(Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX(Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD(Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™(Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX(Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™(Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™(Invitrogen; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 전달감염 시약(Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), DOTAP 리포솜 전달감염 시약(Grenzacherstrasse, Switzerland), DOSPER 리포솜 전달감염 시약(Grenzacherstrasse, Switzerland), 또는 Fugene(Grenzacherstrasse, Switzerland), Transfectam® 시약(Promega; Madison, WI), TransFast™ 전달감염 시약(Promega; Madison, WI), Tfx™-20 시약(Promega; Madison, WI), Tfx™-50 시약(Promega; Madison, WI), DreamFect™(OZ Biosciences; Marseille, France), EcoTransfect(OZ Biosciences; Marseille, France), TransPassª D1 전달감염 시약(New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™(Invitrogen; San Diego, CA, USA), PerFectin 전달감염 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), NeuroPORTER 전달감염 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER 전달감염 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER 2 전달감염 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), Cytofectin 전달감염 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), BaculoPORTER 전달감염 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), TroganPORTER™ 전달감염 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), 또는 HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA)을 포함한다.
기타 작용제를 활용하여 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 2-피롤과 같은 피롤, 아존 및 리모넨 및 멘톤과 같은 테르펜을 포함하여, 투여된 핵산의 침투를 향상시킬 수 있다.
v. 담체
본 발명의 특정 조성물은 제형에 담체 화합물도 포함한다. 본원에 사용된 "담체 화합물" 또는 "담체"는 비활성(즉, 그 자체로 생물학적 활성을 가지지 않음)이지만, 예를 들면, 생물학적으로 활성인 핵산을 분해하거나 순환으로부터 이의 제거를 촉진함으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생물이용도를 감소시키는 생체 내 공정에 의하여 핵산으로 인지되는 핵산 또는 이의 유사체를 지칭할 수 있다. 통상적으로 담체 화합물이 과잉으로 있는, 핵산 및 담체 화합물의 공투여로 인해 아마도 공통의 수용체에 대한 담체 화합물 및 핵산 사이의 경쟁으로 인하여, 간, 신장 또는 기타 특별한 순환 조수(extracirculatory reservoirs) 내에서 회수된 핵산의 양의 실질적인 감소로 이어질 수 있다. 예를 들면, 간 조직 내에서 부분적으로 포스포로티오에이트 dsRNA의 회수는 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티드산 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디설폰산과 함께 공투여되는 경우, 감소될 수 있다(Miyao 등, DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura 등, DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
vi. 부형제
담체 화합물과 달리, "약학적 담체" 또는 "부형제"는 약학적으로 허용 가능한 용매, 현탁제 또는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 임의의 기타 약리적 비활성 운반체이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있으며, 선택되어 염두에 둔 계획된 투여 방식으로 핵산 및 주어진 약학적 조성물의 기타 구성성분들과 조합되는 경우 소기의 벌크, 연경도 등을 제공하게 된다. 통상적인 약학적 담체는 결합체(예컨대, 사전에 젤라틴화한 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충진제(예컨대, 락토오스 및 기타 당, 마이크로결정질 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 등); 윤활제(예컨대, 스테아르산 마그네슘, 활석, 실리카, 콜로이드성 이산화 실리콘, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소화 식물성유, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨 등); 붕해제(예컨대, 전분, 전분 글리콜산 나트륨 등); 및 습윤제(예컨대, 황산 나트륨 라우릴 등)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
핵산과 유해하게 반응하지 않는, 비경구가 아닌 투여에 적당한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제를 이용하여 본 발명의 조성물을 제형화할 수도 있다. 적당한 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
핵산의 국소 투여용 제형은 살균 및 비살균 수용액, 알코올과 같은 통상적인 용매의 비수성 용액 또는 액체 또는 고체 베이스에서의 핵산의 용액을 포함할 수 있다. 용액은 완충제, 희석제 및 기타 적당한 첨가제도 포함할 수 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구가 아닌 투여에 적당한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제가 이용될 수 있다.
적당한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
vii. 기타 구성요소
본 발명의 조성물은 약학적 조성물에서 종래 발견되는 기타 부가 구성요소를 당업계에 확립된 이용 수준에서 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 조성물은 예를 들면, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 소염제와 같은 추가의 융합성인 약학적으로 활성인 물질을 포함할 수 있거나, 염료, 풍미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제와 같이, 본 발명의 조성물의 다양한 제형을 물리적으로 제형화하는데 유용한 추가적인 물질을 포함할 수 있다. 그러나, 그러한 물질은 첨가되는 경우, 본 발명의 조성물의 구성성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다. 제형은 살균될 수 있으며, 원한다면, 제형의 핵산(들)과 유해하게 반응하지 않는, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충제, 착색제, 풍미 및/또는 방향 물질 등과 같은 보조제와 혼합될 수 있다.
수성 현탁액은 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에 있어서, 본 발명에서 특징된 약학적 조성물은 (a) 하나 이상의 iRNA 화합물 및 (b) 비-RNAi 메커니즘에 의하여 기능하고 용혈 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 작용제를 포함한다. 그러한 작용제의 예는 소염제, 항-지방증제, 항-바이러스제 및/또는 항-섬유증제를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 또한, 실리마린과 같이 간을 보호하는데 흔히 이용되는 기타 물질은 본원에 기술된 iRNA와 연계하여 이용될 수도 있다. 간 질병을 치료하는데 유용한 기타 작용제는 텔비부딘, 엔테카비르 및 텔라프레비어와 같은 프로테아제 억제제 및 예를 들면, Tung 등, 미국 출원 공개 번호 2005/0148548, 2004/0167116, 및 2003/0144217 호; 및 Hale 등, 미국 출원 공개 번호 2004/0127488 호에 기술된 기타 작용제를 포함한다.
그러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 예컨대, LD50(개체군의 50%까지 치사하는 용량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물에 있어서 표준 약학적 절차에 의하여 결정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 투여량의 범위를 인간용으로 제형화하는데 이용될 수 있다. 본 발명에서 특징된 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 채용된 제형 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명에서 특징된 방법에 이용된 임의의 화합물에 대하여, 치료학적 유효 용량은 세포 배양 분석법으로부터 최초로 추정될 수 있다. 용량은, 상기 화합물의 순환 혈장 농도 범위, 또는 적절한 경우 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 표적 서열의 폴리펩티드 생성물의 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록(예컨대, 감소된 농도의 폴리펩티드를 달성) 동물 모델 내에서 제형화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 혈장 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.
상기에서 토의된 바와 같이, 이의 투여뿐만 아니라, 본 발명에서 특징된 iRNA는 C5 발현에 의해 매개된 병적 과정의 치료에 효과적인 기타 알려진 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 좌우간, 투여하는 의사는 당업계에 알려지거나 본원에 기술된 효능의 표준 척도를 이용하여 관찰된 결과에 기초하여 iRNA 투여의 양 및 타이밍을 조정할 수 있다.
VI. C5 발현의 억제 방법
본 발명은 세포에서의 C5의 발현의 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 세포에서 C5의 발현을 억제하기 위한 유효량의 RNAi 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시켜, 세포에서 C5의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
세포를 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계는 시험관 내 또는 생체 내에서 행해질 수 있다. 세포를 생체 내에서 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계는 피검자, 예를 들어, 인간 피검자 내의 세포 또는 세포의 군을 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 시험관 내 및 생체 내 접촉 방법의 조합도 또한 가능하다. 접촉시키는 단계는 상술된 바와 같이 직접적 또는 간접적일 수 있다. 또한, 세포를 접촉시키는 단계는 본원에 기술되거나 당업계에 공지되어 있는 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 달성될 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 예를 들어, GalNAc3 리간드 또는 RNAi 작용제를 관심 대상 부위, 예를 들어, 피검자의 간으로 유도하는 임의의 다른 리간드이다.
본원에 사용되는, "억제하는"이라는 용어는 "감소시키는", "침묵화하는", "하향조절하는" 및 기타 유사 용어와 교환가능하게 이용되며, 임의의 수준의 억제를 포함한다.
"C5의 발현을 억제하는"이라는 어구는 임의의 C5 유전자(예컨대, 마우스 C5 유전자, 생쥐 C5 유전자, 원숭이 C5 유전자 또는 인간 C5 유전자)뿐만 아니라 C5 유전자의 변이체 또는 돌연변이체의 발현의 억제를 지칭하는 의도이다. 따라서, C5 유전자는 야생형 C5 유전자, 돌연변이 C5 유전자 또는 유전자 조작된 세포, 세포의 그룹 또는 유기체의 맥락에서 형질전환 C5 유전자일 수 있다.
"C5 유전자의 발현을 억제하는"은 C5 유전자의 임의의 수준의 억제, 예를 들어, C5 유전자의 발현의 적어도 부분적인 저해를 포함한다. C5 유전자의 발현은 C5 유전자 발현과 연관된 임의의 변수의 수준, 예컨대, C5 mRNA 수준, C5 단백질 수준, 또는 예를 들어, 총 용혈 보체의 척도로서의 CH50 활성, 보체의 대체 경로의 용혈 활성을 측정하기 위한 AH50 및/또는 혈관내 용혈 및/또는 헤모글로빈 수준의 척도로서 락테이트 탈수소효소(LDH) 수준에 기초하여, 또는 그의 변화에 기초하여 평가할 수 있다. C5a, C5b 및 가용성 C5b-9 복합체의 수준을 측정하여, C5 발현을 평가할 수 있다. 이러한 수준을 개별 세포 또는 예를 들어, 피검자로부터 유래된 시료를 포함하는 세포의 그룹에서 평가할 수 있다.
억제는 대조군 수준과 비교하여 C5 발현과 관련된 하나 이상의 변수들의 절대 또는 상대 수준의 감소에 의하여 측정될 수 있다. 대조군 수준은 당업계에 활용되는 임의의 형태의 대조군 수준, 예컨대, 투여전 기저 수준, 또는 (예컨대, 완충제 유일 대조군 또는 비활성 작용제 대조군과 같은) 대조군으로 처리 또는 미처리된 유사한 피검자, 세포 또는 시료로부터 결정된 수준일 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태들에서, C5 유전자의 발현은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 억제된다.
C5 유전자의 발현의 억제는 제1 세포 또는 세포의 군(그러한 세포는 예를 들어, 피검자로부터 유래된 시료에 존재할 수 있음)에 의해 발현되는 mRNA의 양의 감소에 의해 나타날 수 있으며, 여기서, C5 유전자가 전사되고, (예를 들어, 세포 또는 세포들을 본 발명의 RNAi 작용제와 접촉시키거나, 본 발명의 RNAi 작용제를 상기 세포가 존재하거나 존재하였던 피검자에게 투여함으로써) 제1 세포 또는 세포들의 군과 실질적으로 동일하지만, 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포들의 군(대조군 세포들)과 비교하여, C5 유전자의 발현이 억제되도록 처리된다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 억제는 처리된 세포에서 mRNA의 수준을 하기의 식을 사용하여 대조군 세포에서의 mRNA의 수준의 백분율로서 표현함으로써 측정된다:
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대안적으로, C5 유전자의 발현의 억제는 기능적으로 C5 유전자 발현, 예를 들어, C5 단백질 발현, 헵시딘(hepcidin) 유전자 또는 단백질 발현 또는 조직 또는 혈청 중의 철 수준의 감소의 면에서 측정될 수 있다. C5 유전자 침묵화는 구성적으로 또는 게놈 조작에 의해, 그리고 당업계에 공지되어 있는 임의의 분석에 의해 C5를 발현하는 임의의 세포에서 결정될 수 있다. 간은 주요 C5 발현 부위이다. 기타 유의미한 발현 부위는 신장 및 자궁을 포함한다.
C5 단백질의 발현의 억제는 세포 또는 세포의 군에 의해 발현되는 C5 단백질의 수준(예를 들어, 피검자로부터 유래된 시료에 의해 발현되는 C5 단백질의 수준)의 감소에 의해 나타날 수 있다. mRNA 억제의 측정에 대하여 상기 설명된 바와 같이, 처리된 세포 또는 세포의 군에서의 단백질 발현 수준의 억제는 대조군 세포 또는 세포의 군에서의 단백질의 수준의 백분율로서 유시하게 표현될 수 있다.
C5 유전자의 발현의 억제를 측정하기 위해 사용될 수 있는 대조군 세포 또는 세포의 군은 본 발명의 RNAi 작용제와 접촉된 적이 없는 세포 또는 세포의 군을 포함한다. 예를 들어, 대조군 세포 또는 세포의 군은 피검자를 RNAi 작용제로 처리하기 전에 개별 피검자(예를 들어, 인간 또는 동물 피검자)로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포의 군에 의해 발현되는 C5 mRNA의 수준은 mRNA 발현을 측정하기 위한 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 시료에서의 C5의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 부분, 예를 들어, C5 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. RNA는 예를 들어, 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출(RNAzol B; Biogenesis), RNeasy RNA 제조 키트(Qiagen) 또는 PAXgene(PreAnalytix, Switzerland)을 사용하는 것을 포함하는 RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 혼성화를 사용하는 전형적인 분석 형식은 핵 런-온 분석(nuclear run-on assay), RT-PCR, RNase 보호 분석(Melton 등, Nuc. Acids Res. 12:7035), 노던 블롯팅(Northern blotting), 동소 혼성화(in situ hybridization) 및 마이크로어레이 분석을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, C5의 발현 수준은 핵산 탐침을 사용하여 결정된다. 본원에 사용된, "탐침"이라는 용어는 특정 C5에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 탐침은 당업자에 의해 합성되거나, 적절한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 탐침은 특이적으로 표지되도록 설계될 수 있다. 탐침으로 사용될 수 있는 분자의 예에는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자가 포함되나, 이들에 한정되지 않는다.
분리된 mRNA는 서던(Southern) 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석 및 탐침 분석을 포함하나 이들에 한정되지 않는 혼성화 또는 증폭 분석에서 사용될 수 있다. mRNA 수준의 결정을 위한 하나의 방법은 분리된 mRNA를 C5 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자(탐침)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, mRNA는 예를 들어, 아가로스 겔 위에 분리된 mRNA를 전개시키고, mRNA를 겔로부터 막, 예를 들면 니트로셀룰로오스로 옮김으로써, 고체 표면상에서 고정되고, 탐침과 접촉한다. 대안적 실시형태에 있어서, 탐침(들)은 고체 표면에 고정되고, 예를 들어, 아피매트릭스(Affymetrix) 유전자 칩 어레이에서 mRNA가 탐침(들)과 접촉된다. 당업자는 C5 mRNA의 수준을 측정하는데 사용하기 위한 공지된 mRNA 검출방법들을 쉽게 적응시킬 수 있다.
시료 내의 C5의 발현 수준을 측정하기 위한 대안적 방법은 예를 들면, RT-PCR(Mullis의 미국 특허 제4,683,202호 (1987)에 개시된 실험예), 리가아제 연쇄반응(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자립 서열복제(Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 복제효소(Lizardi 등 (1988) Bio/Technology 6:1197), 회전환 복제(Lizardi 등, 미국 특허 제5,854,033호), 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법 후, 당업자에게 잘 알려진 기술들을 사용한 증폭된 분자의 검출에 의해, 시료 내 mRNA의 핵산 증폭 과정 및/또는 (cDNA를 제조하기 위한) 역전사효소를 포함한다. 그러한 분자들이 매우 적은 수로 존재한다면, 상기 검출 계획들이 핵산 분자들을 검출하는데 특히 유용하다. 본 발명의 특정 양태에서, C5의 발현수준은 정량적 형광원 RT-PCR(즉, TaqManTM 시스템)에 의해 측정된다.
C5 mRNA의 발현 수준은 막 블롯(예를 들면, 노던, 서던, 도트 등과 같은 혼성화 분석법에 사용됨) 또는 마이크로웰, 시료 튜브, 젤, 비드 또는 섬유(또는 결합 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 미국 특허 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 및 제5,445,934호를 참조하며, 이는 이후에 본원에 포함된다. C5 발현 수준의 측정은 용액내 핵산 탐침을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, mRNA 발현 수준은 분지형 DNA(bDNA) 분석법 또는 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 측정된다. 상기 방법들의 용도는 본원에 설명되고, 실시예에 예시되어 있다.
C5 단백질 발현 수준은 단백질 수준의 측정 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 방법들은 예를 들면, 전기영동법, 모세관 전기영동법, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박막 크로마토그래피(TLC), 고분산(hyperdiffusion) 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침강반응, 흡수 분광법, 비색분석법, 분광분석법, 유동세포 분석법, 면역확산법(단일 또는 이중), 면역전기영동법, 웨스턴 블롯팅, 방사면역분석법(RIA), 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 면역형광 분석법, 전기화학발광 분석법 등을 포함한다.
본원에 사용된 "시료"라는 용어는 피검자 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직뿐만 아니라 피검자로부터 분리된 유사한 유체, 세포 또는 조직의 집합을 지칭한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 림프, 소변, 뇌척수액, 타액, 안 유체 등을 포함한다. 조직 시료는 조직, 기관 또는 국소화된 영역으로부터 나온 시료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 시료는 특정 기관, 기관의 부분 또는 그러한 기관 내의 유체 또는 세포로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태들에 있어서, 시료는 간(예컨대, 전 간(whole liver) 또는 간의 특정 분절 또는 예컨대, 간세포와 같이 간 내의 특정 유형의 세포)으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, "피검자로부터 유래된 시료"는 피검자로부터 뽑은 혈액 또는 혈장을 지칭한다. 추가의 실시형태들에 있어서, "피검자로부터 유래된 시료"는 피검자로부터 유래된 간 조직을 지칭한다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태들에 있어서, RNAi 작용제는 RNAi 작용제가 피검자 내의 특정 부위에 전달되도록 피검자에게 투여된다. C5의 발현의 억제는 피검자 내의 특정 부위로부터의 유체 또는 조직으로부터 유래된 시료에서 C5 mRNA 또는 C5 단백질의 수준 또는 그의 수준의 변화의 측정을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 상기 부위는 간이다. 상기 부위는 또한 전술된 부위 중 임의의 것으로부터의 세포의 세부항목 또는 하위그룹일 수도 있다. 또한, 상기 부위는 특정 수용체 유형을 발현하는 세포를 포함할 수 있다.
본원에 사용된, "세포를 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계"라는 어구는 임의의 가능한 수단에 의하여 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포를 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계는 세포를 시험관 내에서 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계 또는 세포를 생체 내에서 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉시키는 단계는 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, RNAi 작용제는 방법을 수행하는 개인에 의하여 세포와 물리적으로 접촉하게 될 수 있거나, 대안적으로, RNAi 작용제를 이후에 세포와 접촉시키도록 하거나 접촉시키도록 유도하는 상황에 둘 수 있다.
세포를 시험관 내에서 접촉시키는 단계는 예를 들면, 세포를 RNAi 작용제와 함께 배양함으로써 수행될 수 있다. 세포를 생체 내에서 접촉시키는 단계는 예를 들면, RNAi 작용제를 세포가 위치하는 조직으로 또는 조직 근처에 주입하거나, RNAi 작용제가 이후에 접촉될 세포가 위치하는 조직에 도달하도록 RNAi 작용제를 다른 구역, 예컨대, 혈류 또는 피하 공간으로 주입함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, RNAi 작용제는 RNAi 작용제를 관심 대상인 부위, 예컨대, 간으로 향하게 하는 리간드, 예컨대, GalNAc3 리간드를 함유하고/함유하거나 결합될 수 있다. 시험관 내 및 생체 내 접촉 방법의 조합도 가능하다. 예를 들어, 세포는 RNAi 작용제와 시험관 내에서 접촉되고, 이후 피검자로 이식될 수도 있다.
일 실시형태에 있어서, 세포를 iRNA와 접촉시키는 단계는 세포로의 섭취 또는 흡수를 용이하게하거나 이루어지게 함으로써 "iRNA를 세포로 전달하는 것" 또는 "도입하는 것"을 포함한다. iRNA의 흡수 또는 섭취는 보조받지 않은 확산성 또는 활성 세포 과정를 통하거나 보조 작용제 또는 장치에 의하여 발생할 수 있다. iRNA를 세포를 도입하는 단계는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 이루어질 수 있다. 예를 들면, 생체 내 도입을 위해, iRNA는 조직 부위로 주입되거나 전신으로 투여될 수 있다. 생체 내 전달은 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함되는, 미국 특허 번호 제5,032,401호 및 제5,607,677호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2005/0281781호에 기술된 것들과 같이, 베타-글루칸 전달 시스템에 의하여 수행될 수도 있다. 세포로의 시험관 내 도입은 전기 천공법 및 리포펙션과 같이 당업계에 알려진 방법들을 포함한다. 다른 접근법들은 하기 본원에 기술되어 있고/있거나 당업계에 알려져 있다.
VII. 보체 성분 C5-관련 장애의 치료 또는 예방 방법
또한, 본 발명은 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 갖는 피검자에게 iRNA 작용제, iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물, 본 발명의 iRNA를 포함하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명의 일부 양태들에서, 상기 방법은 추가의 치료제, 예를 들어, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)을 피검자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 갖는 피검자의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 치료 방법(및 용도)은 C5 유전자를 표적하는, 치료적 유효량의 iRNA 작용제 또는 C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물을 피검자, 예를 들어, 인간에게 투여하여, C5 발현의 감소로 이익을 얻을 장애를 갖는 피검자를 치료하는 단계를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 C5 유전자를 표적하는, 치료적 유효량의 iRNA 작용제 또는 C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물, 및 추가의 치료제, 예를 들어, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)을 피검자, 예를 들어, 인간에게 투여하여, C5 발현의 감소로 이익을 얻을 장애를 갖는 피검자를 치료하는 단계를 포함하는, C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 갖는 피검자의 치료 방법을 제공한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 갖는 피검자에서의 적어도 하나의 증상의 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 예방적 유효량의 iRNA 작용제, 예를 들어, 본 발명의 dsRNA 또는 벡터를 피검자에게 투여하여, C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애를 갖는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 앓고 있는 피검자에서의 용혈의 예방 방법을 제공한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 갖는 피검자에서의 적어도 하나의 증상의 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 예방적 유효량의 iRNA 작용제, 예를 들어, 본 발명의 dsRNA 또는 벡터, 및 추가의 치료제, 예를 들어, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)을 피검자에게 투여하여, C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애를 갖는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 "치료적 유효량"은 보체 성분 C5 관련 질병을 갖는 피검자에게 투여되는 경우, (예컨대, 기존 질병 또는 질병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 개선시키거나, 유지시킴으로써) 질병의 치료를 가져오는데 충분한, RNAi 작용제, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)의 양을 포함하는 의도이다. "치료적 유효량"은 RNAi 작용제 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 작용제의 투여 방법, 질병 및 그 중증도 및 치료될 피검자의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 선행 또는 동반 치료의 유형, 및 있다고 하면 기타 개인적 특성에 따라 달라질 수 있다.
본원에 사용된 "예방적 유효량"은 보체 성분 C5-관련 질병을 가지나, 질병의 증상을 아직(또는 현재) 경험하지 않거나 나타내지 않은 피검자 및/또는 보체 성분 C5-관련 질병이 발생할 위험이 있는 피검자, 예를 들어, 이식편 및/또는 이식을 가진 피검자, 예를 들어, 감작된 또는 동종이계 수여자, 패혈증을 갖는 피검자 및/또는 심근 경색증을 갖는 피검자에게 투여되는 경우, 질병, 또는 질병의 하나 이상의 증상을 예방하거나 개선하는데 충분한 iRNA 작용제 또는 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)의 양을 포함하는 의도이다. 질병의 개선은 질병의 과정을 늦추거나 이후 발생하는 질병의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 RNAi 작용제 또는 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 작용제, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 방법, 질병의 위험 정도 및 치료할 환자의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 선행 또는 동반 치료의 유형, 및 있다고 하면 기타 개인적 특성에 따라 달라질 수 있다.
"치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"은 임의의 치료에 적용될 수 있는 합당한 이득/위험율에서 일부 원하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 RNAi 작용제 또는 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)의 양도 포함한다. 본 발명의 방법에 채용되는 RNAi 작용제는 그러한 치료에 적용될 수 있는 합당한 이득/위험율을 생성하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 피검자, 예를 들어, C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자를 치료하기 위한 치료적 유효량의 본 발명의 iRNA 작용제의 용도를 제공한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 피검자, 예를 들어, C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 얻을 피검자를 치료하기 위한, 치료적 유효량의 본 발명의 iRNA 작용제 및 추가의 치료제, 예를 들어, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 피검자, 예를 들어, C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자, 예를 들어, C5 발현의 감소로 이득을 보게 되는 장애를 갖는 피검자, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS의 치료용 약제의 제조에서의, C5 유전자를 표적으로 하는 본 발명의 iRNA 작용제, 예를 들어, dsRNA 또는 C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 추가의 치료제, 예를 들어, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)과 병용되는, 피검자, 예를 들어, C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS의 치료용 약제의 제조에서의, C5 유전자를 표적으로 하는 본 발명의 iRNA 작용제, 예를 들어, dsRNA 또는 C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 앓고 있는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하기 위한 본 발명의 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 앓고 있는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하기 위한, 본 발명의 iRNA 작용제, 예를 들어, dsRNA 및 추가의 치료제, 예를 들어, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)의 용도를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 앓고 있는 피검자에서 적어도 하나의 증상의 예방용 약제의 제조에서의, 본 발명의 iRNA 작용제의 용도를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 장애, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 앓고 있는 피검자에서 적어도 하나의 증상을 예방하기 위하여, 추가의 치료제, 예를 들어, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 에쿨리주맙)과 병용되는 약제의 제조에서의, 본 발명의 iRNA 작용제의 용도를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, C5를 표적으로 하는 iRNA 작용제는 예를 들어, 피검자의 세포, 조직, 혈액, 소변 또는 다른 조직 또는 체액 중 C5 수준이 적어도 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99% 또는 그 이상 감소되도록 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자에게 투여된 후에, 추가의 치료제(하기 기술된 바와 같음)가 피검자에게 투여된다.
추가의 치료제는 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 항-보체 성분 C5 항체는 에쿨리주맙(SOLIRIS®) 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체이다. 에쿨리주맙은 높은 친화성으로 보체 성분 C5에 특이적으로 결합하고, C5a 및 C5b로의 C5의 절단을 억제하여, 최종 보체 복합체 C5b-9의 생성을 억제하는 인간화 모노클로널 IgG2/4, 카파 경쇄 항체이다. 에쿨리주맙은 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,355,245호에 기술되어 있다.
본 발명의 iRNA 작용제 및 에쿨리주맙을 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 수막구균 백신을 피검자에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 치료제, 예를 들어, 에쿨리주맙 및/또는 수막구균 백신은 C5를 표적으로 하는 iRNA 작용제와 동시에 또는 상이한 시간에 피검자에게 투여될 수 있다.
더욱이, 추가의 치료제, 예를 들어, 에쿨리주맙은 C5를 표적으로 하는 iRNA 작용제와 동일한 제형에서, 또는 C5를 표적으로 하는 iRNA 작용제와 상이한 제형에서 피검자에게 투여될 수 있다.
에쿨리주맙 투여 양생법은 예를 들어, 에쿨리주맙(SOLIRIS®)에 대한 제품 삽입물(insert) 및 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2012/0225056호에 기술되어 있다. 보체 성분 C5-관련 질병, 예를 들어, PNH 또는 aHUS를 치료하기 위한 본 발명의 예시적인 방법에서, C5를 표적으로 하는 iRNA 작용제가 먼저, 피검자에서 C5 수준이 감소되도록(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99% 또는 그 이상) 피검자에게 투여된 후에(예를 들어, 피하), 에쿨리주맙은 SOLIRIS®에 대한 제품 삽입물에 기재된 것보다 더 낮은 용량으로 투여된다. 예를 들어, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 900 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 900 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여될 수 있다. 또한, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 900 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 1200 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 1200 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여될 수 있다. 피검자가 18세 미만이면, 에쿨리주맙은 4주 동안 주마다 약 900 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 1200 mg 미만의 제5 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 1200 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여되거나; 피검자가 18세 미만이면, 에쿨리주맙은 2주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 900 mg 미만의 제3 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 900 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여되거나; 피검자가 18세 미만이면, 에쿨리주맙은 2주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 600 mg 미만의 제3 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 600 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여되거나; 피검자가 18세 미만이면, 에쿨리주맙은 1주 동안 주마다 약 600 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 300 mg 미만의 제2 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여되거나; 피검자가 18세 미만이면, 에쿨리주맙은 1주 동안 주마다 약 300 mg 미만의 용량에 이어서, 약 1주 후에 약 300 mg 미만의 제2 용량에 이어서, 그 후 약 2주마다 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여될 수 있다. 피검자가 혈장분리교환술 또는 혈장 교환을 받고 있다면, 에쿨리주맙은 (에쿨리주맙의 가장 최근의 용량이 약 300 mg이었다면) 약 300 mg 미만의 용량으로 또는 (에쿨리주맙의 가장 최근의 용량이 약 600 mg 이상이었다면) 약 600 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여될 수 있다. 피검자가 혈장 주입을 받고 있다면, 에쿨리주맙은 (에쿨리주맙의 가장 최근의 용량이 약 300 mg 이상이었다면) 약 300 mg 미만의 용량으로 피검자에게 투여될 수 있다. 보다 낮은 용량의 에쿨리주맙은 에쿨리주막의 피하 또는 정맥내 투여를 가능하게 한다.
에쿨리주맙을 포함하는 본 발명의 병용 요법에서, 에쿨리주맙은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량으로 피검자에게 예를 들어, 피하로 투여될 수 있다. 예를 들어, 에쿨리주맙은 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14 mg/kg, 14.5 mg/kg 또는 15 mg/kg의 용량으로 피검자에게 예를 들어 피하 투여될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 표적 C5 유전자의 발현이 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76 또는 약 80시간 동안 감소되도록, 본원에 기술된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 표적 C5 유전자의 발현은 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상, 예를 들어, 약 1주, 2주, 3주 또는 약 4주 또는 그 이상 동안 감소된다.
본 발명의 방법 및 용도에 따른 dsRNA의 투여는 보체 성분 C5-관련 질병이 있는 환자에서 이러한 질병 또는 장애의 중증도, 증후, 증상 및/또는 마커의 감소를 초래할 수 있다. 이러한 맥락에서 "감소"는 그러한 수준의 통계적으로 유의미한 감소를 의미한다. 감소는 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 100%일 수 있다.
질병의 치료 또는 예방의 효능은 예를 들면, 질병 진행, 질병 회복, 증상 중증도, 통증 감소, 삶의 질, 치료 효과 지속에 필요한 약제의 용량, 질병 마커의 수준 또는 치료중이거나 예방을 위해 표적화된 주어진 질병에 적절한 임의의 다른 측정가능한 매개변수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 그러한 매개변수들 중 어느 하나 또는 매개변수들의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 충분히 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들면, 용혈 장애의 치료의 효능은 예를 들면, LDH 및 CH50 수준의 주기적 모니터링에 의하여 평가될 수 있다. 최초 값 판독과 나중 값 판독을 비교하여 의사에게 치료가 효과적인지의 여부에 대한 지시를 제공한다. 그러한 매개변수들 중 어느 하나 또는 매개변수들의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 충분히 당업자의 능력 내에 있다. C5를 표적으로 하는 iRNA 또는 그의 약학적 조성물의 투여와 관련하여, 보체 성분 C5-관련 질병에 "대하여 효과적인"은 임상적으로 적절한 방식으로 투여하게 되면 증상의 개선, 치유, 질병의 감소, 생명의 연장, 삶의 질의 개선 또는 보체 성분 C5-관련 질병 및 이와 관련된 원인 치료에 익숙한 의사에 의하여 일반적으로 긍정적이라고 인정되는 다른 효과와 같은, 환자의 적어도 통계적으로 유의한 분율에 대하여 유익한 효과가 생긴다는 것을 나타낸다.
치료 또는 예방 효과는 질병 상태의 하나 이상의 매개변수들에 있어서 통계적으로 유의한 개선이 있거나, 달리 예상되는 증상을 악화시키거나 진전시키지 않는 것에 의해 명백해진다. 일례로, 질병의 측정가능한 매개변수에 있어서 적어도 10%의 바람직한 변화 및 바람직하게는, 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상은 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 주어진 iRNA 약물 또는 그러한 약물의 제형에 대한 효능은 당업계에 알려진 바와 같이 주어진 질병에 대하여 실험적 동물 모델을 이용하여 판단될 수도 있다. 실험적 동물 모델을 이용하는 경우, 치료의 효능은 마커 또는 증상에 있어서 통계적으로 유의미한 감소가 관찰되는 경우 입증된다.
대안적으로, 효능은 임상적으로 받아들여지는 질병 중증도 등급 스케일, 일례로 류마티스 관절염 중증도 스케일(RASS)에 기초하여 진단의 당업자에 의하여 결정된 바와 같은 질병의 중증도의 감소에 의하여 측정될 수 있다. 예컨대, 적절한 스케일을 이용하여 측정된 질병의 중증도의 경감을 일어나게 하는 임의의 긍정적인 변화는 본원에 기술된 바와 같이 iRNA 또는 iRNA 제형을 이용하는 적절한 치료를 나타낸다.
피검자에는 치료적 유효량의 iRNA, 예를 들어, 약 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.75 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.85 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.95 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg dsRNA, 2.6 mg/kg dsRNA, 2.7 mg/kg dsRNA, 2.8 mg/kg dsRNA, 2.9 mg/kg dsRNA, 3.0 mg/kg dsRNA, 3.1 mg/kg dsRNA, 3.2 mg/kg dsRNA, 3.3 mg/kg dsRNA, 3.4 mg/kg dsRNA, 3.5 mg/kg dsRNA, 3.6 mg/kg dsRNA, 3.7 mg/kg dsRNA, 3.8 mg/kg dsRNA, 3.9 mg/kg dsRNA, 4.0 mg/kg dsRNA, 4.1 mg/kg dsRNA, 4.2 mg/kg dsRNA, 4.3 mg/kg dsRNA, 4.4 mg/kg dsRNA, 4.5 mg/kg dsRNA, 4.6 mg/kg dsRNA, 4.7 mg/kg dsRNA, 4.8 mg/kg dsRNA, 4.9 mg/kg dsRNA, 5.0 mg/kg dsRNA, 5.1 mg/kg dsRNA, 5.2 mg/kg dsRNA, 5.3 mg/kg dsRNA, 5.4 mg/kg dsRNA, 5.5 mg/kg dsRNA, 5.6 mg/kg dsRNA, 5.7 mg/kg dsRNA, 5.8 mg/kg dsRNA, 5.9 mg/kg dsRNA, 6.0 mg/kg dsRNA, 6.1 mg/kg dsRNA, 6.2 mg/kg dsRNA, 6.3 mg/kg dsRNA, 6.4 mg/kg dsRNA, 6.5 mg/kg dsRNA, 6.6 mg/kg dsRNA, 6.7 mg/kg dsRNA, 6.8 mg/kg dsRNA, 6.9 mg/kg dsRNA, 7.0 mg/kg dsRNA, 7.1 mg/kg dsRNA, 7.2 mg/kg dsRNA, 7.3 mg/kg dsRNA, 7.4 mg/kg dsRNA, 7.5 mg/kg dsRNA, 7.6 mg/kg dsRNA, 7.7 mg/kg dsRNA, 7.8 mg/kg dsRNA, 7.9 mg/kg dsRNA, 8.0 mg/kg dsRNA, 8.1 mg/kg dsRNA, 8.2 mg/kg dsRNA, 8.3 mg/kg dsRNA, 8.4 mg/kg dsRNA, 8.5 mg/kg dsRNA, 8.6 mg/kg dsRNA, 8.7 mg/kg dsRNA, 8.8 mg/kg dsRNA, 8.9 mg/kg dsRNA, 9.0 mg/kg dsRNA, 9.1 mg/kg dsRNA, 9.2 mg/kg dsRNA, 9.3 mg/kg dsRNA, 9.4 mg/kg dsRNA, 9.5 mg/kg dsRNA, 9.6 mg/kg dsRNA, 9.7 mg/kg dsRNA, 9.8 mg/kg dsRNA, 9.9 mg/kg dsRNA, 9.0 mg/kg dsRNA, 10 mg/kg dsRNA, 15 mg/kg dsRNA, 20 mg/kg dsRNA, 25 mg/kg dsRNA, 30 mg/kg dsRNA, 35 mg/kg dsRNA, 40 mg/kg dsRNA, 45 mg/kg dsRNA 또는 약 50 mg/kg dsRNA가 투여될 수 있다. 인용된 값의 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
특정 실시형태들에 있어서, 예를 들어, 본 발명의 조성물이 본원에 기술된 바와 같은 dsRNA 및 지질을 포함하는 경우에, 피검자에는 치료량의 iRNA, 예를 들어, 약 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.2 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 약 2.5 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 3.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 4.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 6.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 7.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 8 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 8.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 9 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 9.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이 투여될 수 있다. 인용된 값의 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
예를 들어, dsRNA는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 인용된 값의 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
다른 실시형태에 있어서, 예를 들어, 본 발명의 조성물이 본원에 기술된 바와 같은 dsRNA 및 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 경우, 피검자에는 치료량의 iRNA, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 50 mg/kg, 약 0.25 내지 약 50 mg/kg, 약 0.5 내지 약 50 mg/kg, 약 0.75 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 50 mg/mg, 약 1.5 내지 약 50 mg/kb, 약 2 내지 약 50 mg/kg, 약 2.5 내지 약 50 mg/kg, 약 3 내지 약 50 mg/kg, 약 3.5 내지 약 50 mg/kg, 약 4 내지 약 50 mg/kg, 약 4.5 내지 약 50 mg/kg, 약 5 내지 약 50 mg/kg, 약 7.5 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 50 mg/kg, 약 15 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 30 내지 약 50 mg/kg, 약 35 내지 약 50 mg/kg, 약 40 내지 약 50 mg/kg, 약 45 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 내지 약 45 mg/kg, 약 0.25 내지 약 45 mg/kg, 약 0.5 내지 약 45 mg/kg, 약 0.75 내지 약 45 mg/kg, 약 1 내지 약 45 mg/mg, 약 1.5 내지 약 45 mg/kb, 약 2 내지 약 45 mg/kg, 약 2.5 내지 약 45 mg/kg, 약 3 내지 약 45 mg/kg, 약 3.5 내지 약 45 mg/kg, 약 4 내지 약 45 mg/kg, 약 4.5 내지 약 45 mg/kg, 약 5 내지 약 45 mg/kg, 약 7.5 내지 약 45 mg/kg, 약 10 내지 약 45 mg/kg, 약 15 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 30 내지 약 45 mg/kg, 약 35 내지 약 45 mg/kg, 약 40 내지 약 45 mg/kg, 약 0.1 내지 약 40 mg/kg, 약 0.25 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 내지 약 40 mg/kg, 약 0.75 내지 약 40 mg/kg, 약 1 내지 약 40 mg/mg, 약 1.5 내지 약 40 mg/kb, 약 2 내지 약 40 mg/kg, 약 2.5 내지 약 40 mg/kg, 약 3 내지 약 40 mg/kg, 약 3.5 내지 약 40 mg/kg, 약 4 내지 약 40 mg/kg, 약 4.5 내지 약 40 mg/kg, 약 5 내지 약 40 mg/kg, 약 7.5 내지 약 40 mg/kg, 약 10 내지 약 40 mg/kg, 약 15 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 30 내지 약 40 mg/kg, 약 35 내지 약 40 mg/kg, 약 0.1 내지 약 30 mg/kg, 약 0.25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.5 내지 약 30 mg/kg, 약 0.75 내지 약 30 mg/kg, 약 1 내지 약 30 mg/mg, 약 1.5 내지 약 30 mg/kb, 약 2 내지 약 30 mg/kg, 약 2.5 내지 약 30 mg/kg, 약 3 내지 약 30 mg/kg, 약 3.5 내지 약 30 mg/kg, 약 4 내지 약 30 mg/kg, 약 4.5 내지 약 30 mg/kg, 약 5 내지 약 30 mg/kg, 약 7.5 내지 약 30 mg/kg, 약 10 내지 약 30 mg/kg, 약 15 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg, 약 0.25 내지 약 20 mg/kg, 약 0.5 내지 약 20 mg/kg, 약 0.75 내지 약 20 mg/kg, 약 1 내지 약 20 mg/mg, 약 1.5 내지 약 20 mg/kb, 약 2 내지 약 20 mg/kg, 약 2.5 내지 약 20 mg/kg, 약 3 내지 약 20 mg/kg, 약 3.5 내지 약 20 mg/kg, 약 4 내지 약 20 mg/kg, 약 4.5 내지 약 20 mg/kg, 약 5 내지 약 20 mg/kg, 약 7.5 내지 약 20 mg/kg, 약 10 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 15 내지 약 20 mg/kg의 용량이 투여될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물이 본원에 기술된 바와 같은 dsRNA 및 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 경우, 피검자에는 치료량의 약 10 내지 약 30 mg/kg의 dsRNA가 투여될 수 있다. 인용된 값의 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
예를 들어, 피검자는 치료량의 iRNA, 예를 들어, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 약 50 mg/kg이 투여될 수 있다. 인용된 값의 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
iRNA는 소정의 기간 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21, 22, 23, 24 또는 약 25분 기간에 걸쳐, 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어, 정기적으로, 예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 또는 그 이상 동안 주마다, 격주로(즉, 2주마다) 반복될 수 있다. 초기 치료 양생법 후에, 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 예를 들어, 3개월 동안 주마다 또는 격주로의 투여 후에, 투여는 6개월 또는 1년 또는 그 이상 동안 월 1회 반복될 수 있다.
iRNA의 투여는 예를 들어, 환자의 세포, 조직, 혈액, 소변 또는 다른 구획에서 C5 수준을 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99% 또는 그 이상 감소시킬 수 있다.
iRNA의 전체 용량을 투여하기 이전에, 환자는 5% 주입과 같이 더 적은 용량을 투여받을 수 있으며, 알러지 반응과 같은 불리한 효과에 대하여 모니터링될 수 있다. 다른 예에 있어서, 환자는 증가된 사이토카인(예컨대, TNF-알파 또는 INF-알파) 수준과 같이 원하지 않는 면역자극 효과에 대하여 모니터링될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 또는 그로부터 제조된 약학적 조성물은 C5 발현에 대한 억제 효과 때문에, 삶의 질을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 iRNA는 "네이키드(naked)" 형태 또는 "유리 iRNA"로서 투여될 수 있다. 네이키드 iRNA는 약학적 조성물의 부재 하에서 투여된다. 네이키드 iRNA는 적당한 완충 용액 내에 있을 수 있다. 완충 용액은 아세트산염, 시트르산염, 프롤라민, 탄산염 또는 인산염, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 완충 용액은 인산염 완충 염수(PBS)이다. iRNA를 포함하는 완충 용액의 pH 및 오스몰농도는 피검자에게 투여하기에 것이 적합하도록 조정될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 iRNA는 약학적 조성물, 예를 들어, dsRNA 리포좀 제형으로서 투여될 수 있다.
C5 유전자 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자는 본원에 기술된 바와 같은 보체 성분 C5-관련 질병 또는 장애를 갖는 것들이다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 발작성 야간혈색소뇨증(PNH)을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 천식을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 류마티스 관절염을 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 전신 홍반성 루푸스를 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 사구체신염을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 건선을 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 피부근염 수포성 유천포창을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 쉬가 독소 이. 콜라이-관련 용혈성 요독 증후군을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 중증근육무력증을 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 시신경척수염을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 고밀도침착병을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 C3 신장병증을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 연령-관련 황반 변성을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 저온응집병을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 항-호중구 세포질 항체-관련 혈관염을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 체액 및 혈관 이식 거부를 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 이식편 기능이상을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 심근 경색증을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 감작된 이식 수여자이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자는 패혈증을 갖는다.
C5 유전자 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 얻을 피검자의 치료는 치료적 및 예방적(예를 들어, 피검자는 감작된(또는 동종이계) 이식 수술을 겪을 것임) 처치를 포함한다.
본 발명은 추가로 다른 약제 및/또는 다른 치료 방법, 예를 들어, 알려져 있는 약제 및/또는 알려져 있는 치료 방법, 예를 들어, 이들 장애를 치료하기 위해 현재 채용되는 것들과 병용하여, C5 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자를 치료하기 위한, iRNA 작용제 또는 그의 약학적 조성물의 방법 및 용도(iRNA 작용제 또는 iRNA 작용제 및 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 방법 및 용도 포함)를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시형태들에 있어서, C5를 표적으로 하는 iRNA는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 보체 성분 C5-관련 질병을 치료하는데 유용한 작용제와 병용 투여된다.
예를 들어, C5 발현의 감소를 이득을 보게 되는 피검자, 예를 들어, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자의 치료에 적당한 추가의 치료제 및 치료 방법은 혈장교환술, 혈전용해 요법(예를 들어, 스트렙토키나아제), 항혈소판제, 엽산, 코르티코스테로이드; 면역억제제; 에스트로겐, 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진, 클로로퀴닌/하이드록시클로퀸, 펜실라민, 아우로티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사), 베타-2 아드레날린성 수용체 효능제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄), 잔틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린성 작용제, 전염증성 사이토카인, 예를 들면, TNF-α 또는 IL-1(예를 들어, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제)에 의해 신호전달을 간섭하는 작용제, IL-1β 전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소(TACE) 억제제, T-세포 신호전달 억제제, 예를 들면, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토푸린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 용해성 사이토카인 수용체 및 그의 유도체(예를 들어, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFRIgG(Enbrel™ 및 p55TNFRIgG(레네르셉트)), sIL-1RI, sIL-1RII 및 sIL-6R), 항염증성 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ), 셀레콕시브, 엽산, 하이드록시클로퀸 설페이트, 로페콕시브, 에타너셉트, 인플릭시모노클로널 항체, 나프록센, 발데콕시브, 설파살라진, 메틸프레드니솔론, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 금 나트륨 티오말레이트, 아스피린, 트리암시놀론 아세토나이드, 프로폭시펜 나프실레이트/apap, 폴레이트, 나부메톤, 디클로페낙, 피록시캄, 에토돌락, 디클로페낙 나트륨, 옥사프로진, 옥시코돈 hcl, 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 펜타닐, 아나킨라, 인간 재조합체, 트라마돌 hcl, 살살레이트, 술린닥, 시아노코발라민/fa/피리독신, 아세트아미노펜, 알렌드로네이트 나트륨, 프레드니솔론, 모르핀 설페이트, 리도카인 하이드로클로라이드, 인도메타신, 글루코사민 설프/콘드로이친, 아미트립틸린 hcl, 설파디아진, 옥시코돈 HCl/아세트아미노펜, 올로파타딘 hcl, 미소프로스톨, 나프록센 나트륨, 오메프라졸, 사이클로포스파미드, 리툭시모노클로널 항체, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, 항-IL-18, 항-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, 로플루밀라스트, IC-485, CDC-801, 메소프람, 사이클로스포린, 사이토카인 억제 항-염증 약물(들)(CSAID); CDP-571/BAY-10-3356(인간화 항-TNFα 항체; 셀테크(Celltech)/Bayer); cA2/인플릭시모노클로널 항체(키메라 항-TNFα 항체; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/에타너셉트(75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; 이뮤넥스(Immunex); 예를 들어, (1994) Arthr. Rheum. 37: S295; (1996) J. Invest. Med. 44: 235A 참조); 55 kdTNF-IgG(55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396(비-고갈 영장류화된 항-CD4 항체; IDEC/SmithKline; 예를 들어, (1995) Arthr. Rheum. 38: S185 참조); DAB 486-IL-2 및/또는 DAB 389-IL-2(IL-2 융합 단백질; Seragen; 예를 들어, (1993) Arthrit. Rheum. 36: 1223 참조); 항-Tac(인간화된 항-IL-2Rα; Protein Design Labs/Roche); IL-4(항염증 사이토카인; DNAX/Schering); IL-10(SCH 52000; 재조합 IL-10, 항-염증 사이토카인; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 및/또는 IL-4 효능제(예를 들어, 효능제 항체); IL-1RA(IL-1 수용체 길항제; Synergen/Amgen); 아나킨라(Kineret®/Amgen); TNF-bp/s-TNF(가용성 TNF 결합 단백질; 예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement)): S284; (1995) Amer. J. Physiol. - Heart and Circ. Physiol. 268: 37-42 참조); R973401(포스포디에스테라아제 IV형 억제제; 예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S282 참조); MK-966(COX-2 억제제; 예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S81 참조); 일로프로스트(Iloprost)(예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S82 참조); 메토트렉세이트; 탈리도미드(예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S282 참조) 및 탈리도미드-관련 약물(예를 들어, Celgen); 레플루노미드(항-염증 및 사이토카인 억제제; 예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S131; (1996) Inflamm. Res. 45: 103-107 참조); 트라넥삼산(플라스미노겐 활성화의 억제제; 예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S284 참조); T-614(사이토카인 억제제; 예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S282 참조); 프로스타글란딘 E1(예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S282 참조); 테니답(Tenidap)(비-스테로이드성 항-염증 약물; 예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S280 참조); 나프록센(Naproxen)(비-스테로이드성 항-염증 약물; 예를 들어, (1996) Neuro. Report 7: 1209-1213 참조); 멜록시캄(Meloxicam)(비스테로이드성 항-염증 약물); 이부프로펜(Ibuprofen)(비스테로이드성 항-염증 약물); 피록시캄(Piroxicam)(비-스테로이드성 항-염증 약물); 디클로페낙(비스테로이드성 항-염증 약물); 인도메타신(Indomethacin)(비스테로이드성 항-염증 약물); 설파살라진(Sulfasalazine)(예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S281 참조); 아자티오프린(Azathioprine)(예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S281 참조); ICE 억제제(효소 인터류킨-1β 전환 효소의 억제제); zap-70 및/또는 lck 억제제(티로신 키나제 zap-70 또는 lck의 억제제); VEGF 억제제 및/또는 VEGF-R 억제제(혈관 내피 세포 성장 인자 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체의 억제제; 혈관신생의 억제제); 코르티코스테로이드 항-염증 약물(예를 들어, SB203580); TNF-컨버타아제 억제제; 항-IL-12 항체; 항-IL-18 항체; 인터류킨-11(예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S296 참조); 인터류킨-13(예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S308 참조); 인터류킨-17 억제제(예를 들어, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S120 참조); 금; 페니실라민; 클로로퀸; 클로람부실; 하이드록시클로로퀸; 사이클로스포린; 사이클로포스파미드; 전체 림프구 자극; 항-흉선세포 글로불린; 항-CD4 항체; CD5-독소; 경구 투여된 펩티드 및 콜라겐; 로벤자리트 이나트륨; 사이토카인 조절제(CRA) HP228 및 HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고-데옥시뉴클레오티드(ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 가용성 보체 수용체 1(TP10; T Cell Sciences, Inc.); 프레드니손; 오르고테인(orgotein); 글리코사미노글리칸 폴리설페이트; 미노사이클린(minocycline); 항-IL2R 항체; 해양 및 식물 지질(어류 및 식물 종자 지방산; 예를 들어, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777 참조); 아우라노핀; 페닐부타존; 메클로페남산; 플루페남삼; 정맥내 면역 글로불린; 질레우톤; 아자리빈; 미코페놀산(RS-61443); 타크롤리무스(FK-506); 시롤리무스(라파마이신); 아미프릴로즈(테라펙틴); 클라드리빈(2-클로로데옥시아데노신); 메토트렉세이트; bcl-2 억제제(Bruncko, M. et al. (2007) J. Med. Chem. 50(4): 641-662 참조); 항바이러스 및 면역-조절제, KDR의 소분자 억제제, Tie-2의 소분자 억제제; 메토트렉세이트; 프레드니손; 셀레콕시브; 엽산; 히드록시클로로퀸 설페이트; 로페콕시브; 에타너셉트; 인플릭시모노클로널 항체; 레플루노미드; 나프록센; 발데콕시브; 설파살라진; 메틸프레드니솔론; 이부프로펜; 멜록시캄; 메틸프레드니솔론 아세테이트; 금 나트륨 티오말레이트; 아스피린; 아자티오프린; 트리암시놀론 아세토나이드; 프로폭시펜 나프실레이트/apap; 폴레이트; 나부메톤; 디클로페낙; 피록시칸; 에토돌락; 디클로페낙 나트륨; 옥사프로진; 옥시코돈 hcl; 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨; 펜타닐; 아나킨라; 인간 재조합체; 트라마돌 hcl; 살살레이트; 술린닥; 시아노코발라민/fa/피리독신; 아세트아미노펜; 알렌드로네이트 나트륨; 프레드니솔론; 모르핀 설페이트; 리도카인 하이드로클로라이드; 인도메타신; 글루코사민 설페이트/콘드로이틴; 사이클로스포린; 아미트립틸린 hcl; 설파디아진; 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜; 올로파타딘 hcl; 미소프로스톨; 나프록센 나트륨; 오메프라졸; 마이코페놀레이트 모페틸; 사이클로포스파미드; 리툭시모노클로널 항체; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; 항-IL 18; 항-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; 로플루밀라스트(Roflumilast); IC-485; CDC-801; 메소프람, 알부테롤, 살메테롤/플루티카손, 몬테루카스트 나트륨, 플루티카손 프로피오네이트, 부데소니드, 프레드니손, 살메테롤 크시나포에이트, 레발부테롤 hcl, 알부테롤 설페이트/이프라트로피움, 프레드니솔론 나트륨 포스페이트, 트리암시놀론 아세토니드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 이프라트로피움 브로마이드, 아지트로마이신, 피르부테롤 아세테이트, 프레드니솔론, 무수 테오필린, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 클라리트로마이신, 자피를루카스트, 포르모테롤 푸마레이트, 인플루엔자 바이러스 백신, 메틸프레드니솔론, 아목시실린 트리하이드레이트, 플루니솔리드, 알러지 주입, 크로몰린 나트륨, 펙소페나딘 하이드로클로라이드, 플루니솔리드/멘톨, 아목시실린/클라불라네이트, 레보플록사신, 흡입 보조 장치, 구아니페네신, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 목시플록사신 hcl, 독시사이클린 하이클레이트, 구아이페네신/d-메토르판, p-에페드린/cod/클로르페니르, 가티플록사신, 세티리진 하이드로클로라이드, 모메타손 푸로에이트, 살메테롤 크시나포에이트, 벤조나테이트, 세팔렉신, pe/하이드로코돈/클로르페니르, 세티리진 hcl/슈도에페드, 페닐에프린/cod/프로메타진, 코데인/프로메타진, 세프프로질, 덱사메타손, 구아이페네신/슈도에페드린, 클로르페니라민/하이드로코돈, 네도크로밀 나트륨, 테르부탈린 설페이트, 에피네프린, 메틸프레드니솔론, 메타프로테레놀 설페이트, 아스피린, 니트로글리세린, 메토프롤롤 타르트레이트, 에녹사파린 나트륨, 헤파린 나트륨, 클로피도그렐 비설페이트, 카르베딜롤, 아테놀롤, 모르핀 설페이트, 메토프롤롤 석시네이트, 와파린 나트륨, 리시노프릴, 이소소르비드 모노니트레이트, 디곡신, 푸로세미드, 심바스타틴, 라미프릴, 테넥테플라제, 에날라프릴 말레이트, 토르세미드, 레타바세, 로사르탄 칼륨, 퀴나프릴 hcl/mag carb, 부메타니드, 알테플라제, 에날라프릴라트, 아미오다론 하이드로클로라이드, 티로피반 hcl m-하이드레이트, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 캅토프릴, 이르베사르탄, 발사르탄, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드, 포시노프릴 나트륨, 리도카인 하이드로클로라이드, 에프티피바티드, 세파졸린 나트륨, 아트로핀 설페이트, 아미노카프로산, 스피로놀락톤, 인터페론, 소탈롤 하이드로클로라이드, 염화칼륨, 도쿠세이트 나트륨, 도부타민 hcl, 알프라졸람, 프라바스타틴 나트륨, 아토르바스타틴 칼슘, 미다졸람 하이드로클로라이드, 메페리딘 하이드로클로라이드, 이소소르비드 디니트레이트, 에피네프린, 도파민 하이드로클로라이드, 비발리루딘, 로수바스타틴, 에제티미베/심바스틴, 아바시미베 및 카리포리드를 포함한다.
iRNA 작용제(및/또는 항-보체 성분 C5 항체) 및 추가의 치료제 및/또는 치료는 동시에 및/또는 동일한 조합물에서 예를 들어, 비경구적으로 투여되거나, 추가의 치료제가 개별 조성물의 부분으로서 또는 개별 시간에 및/또는 당업계에 알려져 있거나 본원에 기술된 다른 방법에 의해, 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 세포에서 보체 성분 C5 발현을 감소시키고/거나 억제시키기 위한 본 발명의 iRNA 작용제 및/또는 본 발명의 iRNA 작용제를 함유하는 조성물의 이용 방법을 제공한다. 다른 양태들에 있어서, 본 발명은 세포에서 C5 발현을 감소시키고/거나 억제하는데 사용하기 위한 본 발명의 iRNA 및/또는 본 발명의 iRNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 양태들에 있어서, 세포에서 C5 발현을 감소하고/거나 억제하기 위한 약제의 제조를 위한, 본 발명의 iRNA 및/또는 본 발명의 iRNA를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
상기 방법 및 용도는 세포를 본 발명의 iRNA, 예를 들어, dsRNA와 접촉시키는 단계 및 C5 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 세포를 유지시켜, 세포에서 C5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
유전자 발현의 감소는 당업계에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, C5 발현의 감소는 당업자에게 통상적인 방법, 예를 들어, 노던 블롯팅, qRT-PCR을 사용하여 C5의 mRNA 발현 수준을 결정함으로써, 당업자에게 통상적인 방법, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅, 면역학적 기술, 유세포측정 방법, ELISA를 사용하여 C5의 단백질 수준을 결정함으로써, 및/또는 C5의 생물학적 활성을 결정함으로써, 예를 들어, CH50 또는 AH50 용혈 분석법에 의해, 및/또는 보체 시스템과 관련된 하나 이상의 분자, 예를 들어, C5 생성물, 예를 들어, C5a 및 C5b(또는 시험관내 환경에서, 예를 들어, 용혈)의 생물학적 활성을 결정함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도에서, 세포는 시험관내 또는 생체내에서 접촉될 수 있으며, 다시 말하면, 세포는 피검자 내에 존재할 수 있다. 세포가 피검자 내에 존재하는 본 발명의 실시형태들에 있어서, 상기 방법은 세포를 항-보체 성분 C5 항체, 예를 들어, 에쿨리주맙과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용한 치료에 적당한 세포는 C5 유전자를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 본 발명의 방법 및 용도에서 사용하기에 적당한 세포는 포유류 세포, 예컨대, 영장류 세포(예컨대, 인간 세포 또는 비인간 영장류 세포, 예컨대, 원숭이 세포 또는 침팬지 세포), 비영장류 세포(예컨대, 소 세포, 돼지 세포, 낙타 세포, 라마 세포, 말 세포, 염소 세포, 토끼 세포, 양 세포, 햄스터, 기니 피그 세포, 고양이 세포, 개 세포, 생쥐 세포, 마우스 세포, 사자 세포, 호랑이 세포, 곰 세포 또는 버팔로 세포), 조류 세포(예컨대, 오리 세포 또는 거위 세포) 또는 고래 세포일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 인간 세포, 예컨대, 인간 간 세포일 수 있다.
C5 발현은 세포에서 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100% 억제될 수 있다.
본 발명의 생체 내 방법 및 용도는 iRNA를 포함하는 조성물을 피검자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, iRNA는 치료받는 포유류의 C5 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치료받는 유기체가 인간과 같은 포유류인 경우, 조성물을 두개 내(예컨대, 뇌실 내, 뇌실질 내 및 척수강 내), 근육내, 경피, 기도(에어로졸), 비강, 직장 및 국소(협측 및 설하를 포함) 투여를 포함하여, 피하, 정맥내, 경구, 복막 내 또는 비경구 경로를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 수단에 의하여 투여될 수 있다. 특정 실시형태들에 있어서, 조성물은 피하 또는 정맥내 주입 또는 주사에 의하여 투여된다.
일부 실시형태들에 있어서, 투여는 데포 주사를 통한 것이다. 데포 주사는 오랜 시간에 걸쳐서 일관된 방식으로 iRNA를 방출할 수 있다. 따라서, 데포 주사는 요망되는 효과, 예컨대, 요망되는 C5의 억제 또는 치료적 또는 예방적 효과를 얻는데 필요한 용량 투여의 빈도를 감소시킬 수 있다. 데포 주사는 더 일관적인 혈청 농도를 제공할 수도 있다. 데포 주사는 피하 주사 또는 근육 내 주사를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 데포 주사는 피하 주사이다.
일부 실시형태들에 있어서, 투여는 펌프를 통한 것이다. 펌프는 외부 펌프 또는 외과적으로 이식된 펌프일 수 있다. 특정 실시형태들에 있어서, 펌프는 피하로 이식된 삼투 펌프이다. 다른 실시형태들에 있어서, 펌프는 주입 펌프이다. 주입 펌프는 정맥 내, 피하, 동맥 또는 경막외 주입용으로 이용될 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 주입 펌프는 피하 주입 펌프이다. 다른 실시형태들에 있어서, 펌프는 iRNA를 간에 전달하는 외과적으로 이식된 펌프이다.
투여의 양식은 국소 또는 전신 치료가 원하는지의 여부에 기초하여 그리고 치료되는 부분에 기초하여 선택될 수 있다. 투여의 경로 및 부위는 표적화를 향상시키기 위해 선택될 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 포유류, 예를 들어, 인간에서 C5 유전자의 발현을 억제하는 방법도 제공한다. 또한, 본 발명은 포유류에서 C5 유전자의 발현을 억제하는데 사용하기 위한 포유류의 세포에서 C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA, 예를 들어, dsRNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 포유류에서 C5 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제의 제조에서의, 포유류의 세포에서 C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 용도를 제공한다.
상기 방법 및 용도는 포유류의 세포에서 C5 유전자를 표적으로 하는 iRNA, 예를 들어, dsRNA를 포함하는 조성물을 포유류, 예를 들어, 인간에게 투여하는 단계 및 포유류를 C5 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 포유류에서 C5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 상기 방법은 항-보체 성분 C5 항체, 예를 들어, 에쿨리주맙을 피검자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
유전자 발현의 감소는 당업계에 알려진 임의의 방법 및 본원에 기술된 방법, 예컨대, 본원에 기술된 qRT-PCR에 의하여 평가될 수 있다. 단밸질 생성의 감소는 당업계에 알려진 임의의 방법 및 본원에 기술된 방법, 예컨대, ELISA에 의하여 평가될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 세공(puncture) 간 생검 시료는 C5 유전자 및/또는 단백질 발현에 있어서 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서 소용된다. 다른 실시형태에 있어서, 혈액 시료는 C5 유전자 및/또는 단백질 발현의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로 소용된다. 다른 실시형태들에 있어서, C5 유전자의 발현의 감소는 예를 들어, C5 경로의 유전자, 예를 들어, C5a, C5b 및 가용성 C5b-9의 발현 및/또는 활성을 결정함으로써 간접적으로 모니터링된다(예를 들어, 도 1 참조). 예를 들어, CD59의 활성을 모니터링하여, C5 유전자의 발현의 억제를 결정할 수 있다. 시료, 예를 들어, 혈액 또는 간 시료 중 CH50, AH50, 혈전 형성 및/또는 혈청 락테이트 탈수소효소(LDH)도 또한 측정될 수 있다. 적당한 분석법이 하기 실시예 섹션에 더 기술되어 있다.
달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 본 발명에 특징된 iRNA 및 방법의 실제 또는 시험에 이용될 수 있다고 하더라도, 적당한 방법 및 물질은 하기에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충이 있는 경우, 정의를 포함하여, 본 명세서가 우세할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시적인 것일 뿐이며 한정되는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1. iRNA 합성
시약의 공급처
시약의 공급처가 본원에 명시적으로 주어지지 않는 경우, 그러한 시약은 분자 생물학에서의 응용을 위한 품질/순도 표준으로 분자 생물학을 위한 시약의 임의의 공급처로부터 수득될 수 있다.
전사물
siRNA 설계를 수행하여, NCBI 유전자 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)에 주석을 단 인간, 레서스(마카카 물라타), 마우스 및 생쥐 C5 전사물을 표적으로 하는 siRNA를 동정하였다. 설계에는 NCBI RefSeq 집합으로부터 하기 전사물들을 이용하였다: 인간 - NM_001735.2; 레서스 - XM_001095750.2; 마우스 - NM_010406.2; 생쥐 - XM_345342.4. 오직 인간 및 레서스 전사물만; 오직 인간, 레서스 및 마우스 전사물만; 오직 인간, 레서스, 마우스 및 생쥐 전사물만; 및 오직 마우스 및 생쥐 전사물만 일치되는 듀플렉스를 함유하는 뱃치를 포함하나 이들에 한정되지 않는 몇몇 개별 뱃치에서 siRNA 듀플렉스를 설계하였다. 열거된 인간 전사물 및 각각의 뱃치 설계에서 고려되는 다른 종 전사물(상기)과 100% 동일성을 공유하는 모든 siRNA 듀플렉스를 설계하였다.
siRNA 설계, 특이성 및 효능 예측
모든 가능한 19mer의 예측되는 특이성을 각각의 서열로부터 예측하였다. 이어서, 7개 초과의 뉴클레오티드 반복체가 결여된 후보 19mer를 선택하였다. 이들 2971개의 후보 인간/레서스, 142개의 인간/레서스/마우스, 54개의 인간/레서스/마우스/생쥐 및 807개의 마우스/생쥐 siRNA를 파이선 스크립트(python script) 'BruteForce.py'에서 구현되는 포괄적인 "무작위 대입(brute-force)" 알고리즘을 이용한 적절한 전사체(transcriptome)(인간, 레서스, 개, 마우스 또는 생쥐 NCBI Refseq 세트 내의 NM_ 및 XM_ 기록의 세트로 정의됨)에 대한 광범위한 검색에 사용하였다. 다음으로, 스크립트는 전사물-올리고 정렬을 분석하여 siRNA와 임의의 잠재적인 '오프-표적' 전사물 간의 미스매치들의 위치 및 수에 기반한 점수를 발생시켰다. 오프-표적 점수는 가중되어 분자의 5' 말단으로부터 2-9 위치인 siRNA의 '시드(seed)' 영역에서 차이를 강조한다.
무작위-대입 검색으로부터 각각의 올리고-전사물 쌍은 개별 미스매치 점수들을 합함으로써 미스매치 점수가 주어지고; 위치 2-9 내의 미스매치들은 2.8로 계산되었고, 절단 부위 위치 10-11 내의 미스매치는 1.2로 계산되었으며, 영역 12-19 내의 미스매치들은 1.0으로 계산되었다. 추가적인 오프-표적 예측은 각각의 올리고의 3개의 상이한 시드-유래된 6량체로부터 유래된 7량체 및 8량체의 빈도를 비교함으로써 수행되었다. 5' 시작에 대한 2-7 위치로부터의 6량체를 이용하여 2개의 7량체 및 1개의 8량체를 생성하였다. '7량체 1'은 6량체에 3'-A를 첨가하여 생성하였고; 7량체 2는 6량체에 5'-A를 첨가하여 생성하였으며, 8량체는 6량체의 5'- 및 3'- 양 말단들에 A를 첨가함으로써 생성하였다. (코딩 영역 'CDS'의 말단이 분명히 정의되어 있는 NCBI의 Refseq 데이터베이스로부터 전사체의 하위서열로 정의된) 인간, 레서스, 마우스 또는 생쥐 3'-UTRome에서의 8량체 및 7량체의 빈도는 미리 산출하였다. 8량체 빈도는 8량체 빈도들의 범위로부터 중간 값을 이용하여 7량체 빈도로 정규화되었다. 이후, 'mirSeedScore'는 ((3 × 정규화된 8량체 계수) + (2 × 7량체 2 계수) + (1 × 7량체 1 계수))의 합을 계산함으로써 계산되었다.
siRNA 양 가닥을 계산된 점수에 따라 특이성의 범주에 할당하였다: 3을 초과하는 점수는 고도로 특이적인 것으로, 3과 동일한 점수는 특이적인 것 및 2.2에서 2.8 사이의 점수는 적당히 특이적인 것으로 한다. 듀플렉스는 안티센스 가닥의 특이성에 의해 분류하고, 안티센스 올리고가 제1 위치에서 GC가 결여되어 있고, 위치 13 및 14 둘 모두에서 G가 결여되어 있으며, 시드 영역 내에 3개 이상의 U 또는 A를 갖는 듀플렉스를 선택하였다.
GalNaC-컨쥬게이트된 듀플렉스에 있어서, 안티센스 19mer(상기 기술)를 표적-상보성 서열의 23개 뉴클레오티드로 연장시킴으로써 센스 21mer 및 안티센스 23mer 올리고를 설계하였다. 설계 뱃치에 포함된 모든 종 전사물을 상보성에 대하여 점검하였다. 적어도 2개의 종에서 100% 서열 상보성을 유지하는 23mer만을 사용하였다. 각각의 듀플렉스에 있어서, 센스 21mer를 안티센스 가닥의 처음 21개 뉴클레오티드의 역 상보물로 특정하였다.
siRNA 서열 선택
인간/레서스 유래의 총 23개 센스 및 23개 안티센스, 인간/레서스/마우스 유래의 6개 센스 및 6개 안티센스, 인간/레서스/마우스/마우스/생쥐 유래의 6개 센스 및 6개 안티센스 및 마우스/생쥐 유래의 13개 센스 및 13개 안티센스 siRNA 19mer 올리고를 합성하고, 듀플렉스로 형성하였다.
상기 19mer 세트를 GalNac 컨쥬게이트 설계를 위해 21/23mer 듀플렉스로 연장시키고, 그들의 신규한 종 일치에 따라 재분류하였다. 인간/레서스 유래의 27개 센스 및 27개 안티센스, 인간/레서스/마우스 유래의 1개 센스 및 1개 센스, 인간/레서스/생쥐 유래의 3개 센스 및 3개 안티센스, 인간/레서스/마우스/생쥐 유래의 4개 센스 및 4개 안티센스, 및 마우스/랫트 유래의 13개 센스 및 13개 안티센스 21mer(센스) 및 23mer(안티센스) 올리고를 합성하고 듀플렉스로 형성하였다.
C5 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록이 표 3 내지 표 6에 나타나 있다.
siRNA 합성
일반적인 소규모 및 중간 규모의 RNA 합성 절차
RNA 올리고뉴클레오티드를 표준 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 프로토콜에 따라 상업적으로 입수가능한 우리딘의 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-t-부틸디메틸실릴-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필)포스포르아미디트 단량체, 4-N-아세틸시티딘, 6-N-벤조일아데노신 및 2-N-이소부티릴구아노신 및 상응하는 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 포스포르아미디트를 사용하여 0.2 내지 500 μmol의 규모로 합성하였다. 아미디트 용액을 0.1-0.15 M 농도로 제조하고, 5-에틸티오-1H-테트라졸(아세토니트릴 중 0.25-0.6 M)을 활성화제로서 사용하였다. 포스포로티오에이트 골격 변형을 산화 단계 동안 루티딘:아세토니트릴(1:1)(v;v) 중 0.2 M 페닐아세틸 디설피드(PADS) 또는 피리딘 중 0.1 M 3-(디메틸아미노메틸렌) 아미노-3H-1,2,4-디티아졸-5-티온(DDTT)을 사용하여 합성 동안 도입하였다. 합성의 완료 후에, 서열을 고체 지지체로부터 절단하고, 메틸아민에 이어서 트리에틸아민.3HF를 사용하여 탈보호시켜, 존재하는 임의의 2'-O-t-부틸디메틸실릴 보호기를 제거하였다.
5 내지 500 μmol 범위의 합성 규모 및 완전 2'-변형 서열(2'-플루오로 및/또는 2'-O-메틸 또는 그들의 조합)을 위하여, 올리고뉴클레오티드를 35℃에서 16시간 동안 또는 55℃에서 5.5시간 동안 3:1(v/v) 에탄올 및 진한(28-32%) 암모니아 수용액을 사용하여 탈보호시켰다. 암모니아 탈보호 전에, 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체 상에서 20분 동안 아세토니트릴 중 0.5 M 피페리딘으로 처리하였다. 미정제 올리고뉴클레오티드를 LC-MS 및 음이온-교환 HPLC(IEX-HPLC)에 의해 분석하였다. 올리고뉴클레오티드의 정제를 20 mM 인산염, 10%-15% ACN, pH = 8.5(완충제 A) 및 20 mM 인산염, 10%-15% ACN, 1 M NaBr, pH = 8.5(완충제 B)를 사용하여 IEX HPLC에 의해 수행하였다. 분석 HPLC에 의해 순도에 대하여 분획을 분석하였다. 적절한 순도를 갖는 생성물-함유 분획을 풀링하고, 회전식 증발기에서 농축시킨 후 탈염시켰다. 시료를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 탈염시키고, 건조시까지 동결건조시켰다. 등몰량의 센스 및 안티센스 가닥을 1× PBS 완충제에서 어닐링시켜, 상응하는 siRNA 듀플렉스를 제조하였다.
소규모(0.2 내지 1 μmol)를 위하여, 합성을 96 웰 형식으로 MerMade 192 합성기에서 수행하였다. 완전 2'-변형 서열(2'-플루오로 및/또는 2'-O-메틸 또는 그들의 조합)의 경우에, 올리고뉴클레오티드를 실온에서 30 내지 60분 동안 메틸아민을 사용하여 탈보호시킨 다음, 60℃에서 30분 동안 인큐베이션시키거나, 또는 실온에서 30 내지 60분 동안 3:1(v/v) 에탄올 및 진한(28-32%) 암모니아 수용액을 사용하여 탈보호시킨 다음, 40℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 미정제 올리고뉴클레오티드를 아세토니트릴:아세톤 용액(9:1) 중에 침전시키고, 원심분리 및 상청액의 경사분리에 의해 분리하였다. 미정제 올리고뉴클레오티드 펠렛을 20 mM NaOAc 완충제 중에 재현탁화시키고, LC-MS 및 음이온 교환 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제 올리고뉴클레오티드 서열을 5 ㎖ HiTrap Sephadex G25 컬럼(GE Healthcare) 상의 96 딥 웰 플레이트(deep well plate)에서 탈염시켰다. 각각의 웰에서, 개별 서열에 상응하는 약 1.5 ㎖ 시료를 수집하였다. 이들 정제된 탈염 올리고뉴클레오티드를 LC-MS 및 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 듀플렉스를 Tecan 로봇 상에서 등몰량의 센스 및 안티센스 서열을 어닐링시킴으로써 제조하였다. 듀플렉스의 농도를 1× PBS 완충제 중에 10 μM로 조정하였다.
생체내 분석을 위한 GalNAc-컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드의 합성
그들의 3' 말단에서 GalNA 리간드와 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를, 테터(tether)를 통해 부착된 GalNAc 리간드 및 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)-보호 일차 하이드록시기를 갖는 Y-형상의 링커가 사전-로딩된 고체 지지체를 사용하여 0.2 내지 500 μmol의 규모로 합성하였다.
5 내지 500 μmol의 규모의 GalNAc 컨쥬게이트의 합성을 위하여, RNA에 대한 상기 합성 프로토콜을 다음과 같이 조정하여 따랐다: 폴리스티렌-기반의 합성 지지체를 위하여, 톨루엔 중 5% 디클로로아세트산을 합성 동안 DMT-절단을 위해 사용하였다. 지지체로부터의 절단 및 탈보호를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 포스포로티오에이트-풍부 서열(통상 5개 초과의 포스포로티오에이트)을 최종 5'-DMT 기를 제거하지 않고 합성하고("DMT-on"), 상기 기재된 바와 같은 절단 및 탈보호 후에, 수 중 50 mM 암모늄 아세테이트(완충제 A) 및 80% 아세토니트릴 중 50 mM 암모늄 아세테이트(완충제 B)를 사용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 분획을 분석적 HPLC 및/또는 LC-MS에 의해 순도에 대해 분석하였다. 적절한 순도를 갖는 생성물-함유 분획을 풀링하고, 회전식 증발기에서 농축시켰다. 완료될 때까지, 수 중 20% 내지 25% 아세트산을 사용하여 DMT-기를 제거하였다. 시료를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 탈염시키고, 건조시까지 동결건조시켰다. 등몰량의 센스 및 안티센스 가닥을 1× PBS 완충제에서 어닐링시켜, 상응하는 siRNA 듀플렉스를 제조하였다.
다중 포스포로티오에이트 결합을 갖는 서열을 포함하는 GalNAc 컨쥬게이트의 소규모 합성(0.2 내지 1 μmol)을 위하여, MerMade 플랫폼 상의 RNA 또는 완전 2'-F/2'-OME-함유 서열의 합성을 위해 상기 기재된 프로토콜을 적용하였다. 합성을 GalNAc-작용화 제어형 다공 글래스(pore glass) 지지체를 포함하는 사전-팩킹된 컬럼에서 수행하였다.
실시예 2. 시험관내 스크리닝
세포 배양 및 트랜스펙션(transfection)
Hep3B 세포(ATCC, Manassas, VA)를 10% FBS, 스트렙토마이신, 및 글루타민(ATCC)이 보충된 Eagle's 최소 필수 배지(ATCC)에서 5% CO2의 분위기하에 37℃에서 거의 컨플루언스(confluence)까지 성장시킨 후, 트립신처리에 의해 플레이트로부터 방출시켰다. 세포를 세척하고, 0.25×106개 세포/ml로 재현탁화시켰다. 트랜스펙션 동안 세포를 웰당 약 20,000개 세포로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다.
일차 마우스 간세포(PMH)를 트랜스펙션 전 1시간보다 짧은 시간에, C57BL/6 암컷 마우스(Charles River Labortories International, Inc. Willmington, MA)로부터 신선하게 분리하고, 일차 간세포 배지에서 성장시켰다. 세포를 InVitroGRO CP 생쥐(플레이팅) 배지(Celsis In Vitro Technologies, 카탈로그 번호 S01494) 중에 0.11×106개 세포/ml로 재현탁화시켰다. 트랜스펙션 동안, 세포를 웰마다 10,000개 세포로 BD BioCoat 96 웰 콜라겐 플레이트(BD, 356407)에 플레이팅하고, 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 인큐베이션시켰다.
동결보존된 일차 시노몰구스 간세포(Celsis In Vitro Technologies, M003055-P)를 사용 직전에, 37℃ 수조에서 해동시키고, InVitroGRO CP(플레이팅) 배지(Celsis In Vitro Technologies, catalog number Z99029)에서 0.26×106개 세포/ml로 재현탁화시켰다. 트랜스펙션 동안 세포를 웰마다 25,000개 세포로 BD BioCoat 96 웰 콜라겐 플레이트(BD, 356407)로 플레이팅하고, 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 인큐베이션시켰다.
Hep3B, PMH 및 일차 시노몰구스 간세포를 위하여, 96 웰 플레이트에서 개별 웰에, 웰당 14.8 μl의 Opti-MEM + 0.2 μl의 Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad CA. 카탈로그 번호 13778-150)를 5 μl의 각각의 siRNA 듀플렉스에 첨가함으로써 트랜스펙션을 수행하였다. 이후, 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 적절한 세포 개수를 함유하는 80 μl의 완전 성장 배지(항생제 비함유)를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. RNA 정제 전에 세포를 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
단일 용량 실험은 GalNAc 변형 서열에 대하여 10 nM 및 0.1 nM 최종 듀플렉스 농도에서, 또는 모든 다른 서열에 대하여 1 nM 및 0.01 nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행하였다. 용량 반응 실험은 일차 마우스 간세포에 대하여 3, 1, 0.3, 0.1, 0.037, 0.0123, 0.00412 및 0.00137 nM 최종 듀플렉스 농도에서 행하고, Hep3B 세포에 대하여 3, 1, 0.3, 0.1, 0.037, 0.0123, 0.00412, 0.00137, 0.00046, 0.00015, 0.00005 및 0.000017 nM 최종 듀플렉스 농도에서 행하였다.
자유 흡수 트랜스펙션(Free uptake transfection)
PBS 중 siRNA 듀플렉스 10 μl를 96 웰 플레이트에 첨가함으로써, 자유 흡수 실험을 수행하였다. 그 다음, 세포 유형에 적절한 세포 개수를 함유하는 90 μl의 완전 성장 배지를 siRNA에 첨가하였다. RNA 정제 전에, 세포를 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 단일 용량 실험을 500 nM 및 5 nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행하고, 용량 반응 실험을 1000, 333, 111, 37, 12.3, 4.12, 1.37, 0.46 nM 최종 듀플렉스 농도에서 행하였다.
DYNABEADS mRNA 분리 키트(Invitrogen, part #: 610-12)를 사용한 전체 RNA 분리
세포를 수집하고, 용해/결합 완충제 150 μl에서 용해시킨 다음, Eppendorf Thermomixer를 사용하여 850 rpm에서 5분 동안 혼합하였다(혼합 속도는 과정 내내 동일하였다). 10 μl의 자성 비드 및 80 μl의 용해/결합 완충제 혼합물을 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고, 1분 동안 혼합하였다. 자성 비드를 자성 스탠드(magnetic stand)를 사용하여 포획하고, 비드를 건드리지 않고 상청액을 제거하였다. 상청액을 제거한 후에, 용해된 세포를 남아있는 비드에 첨가하고 5분 동안 혼합하였다. 상청액을 제거한 후에, 자성 비드를 150 μl 세척 완충제 A로 2회 세척하고, 1분 동안 혼합하였다. 비드를 다시 포획하고, 상청액을 제거하였다. 그 다음, 비드를 150 μl 세척 완충제 B로 세척하고, 포획하고, 상청액을 제거하였다. 다음으로, 비드를 150 μl 용리 완충제로 세척하고, 포획하고, 상청액을 제거하였다. 마지막으로, 비드가 2분 동안 건조되게 하였다. 건조 후에, 50 μl의 용리 완충제를 첨가하고, 70℃에서 5분 동안 혼합하였다. 비드를 5분 동안 자석 위에서 포획하였다. 45 μl의 상청액을 제거하고, 다른 96 웰 플레이트에 첨가하였다.
ABI High capacity cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성
반응마다 2 μl 10× 완충제, 0.8 μl 25× dNTP, 2 μl 랜덤(Random) 프라이머, 1 μl 역전사효소, 1 μl RNase 억제제 및 3.2 μl의 H2O의 마스터 믹스를 제조하였다. 동일 부피의 마스터 믹스 및 RNA를 시험관내 스크린을 위해 12 μl 또는 생체내 스크린 시료를 위해 20 μl의 최종 부피를 위해 혼합하였다. cDNA를 하기의 단계를 통하여 Bio-Rad C-1000 또는 S-1000 써멀 사이클러(thermal cycler)(Hercules, CA)를 사용하여 생성하였다: 25℃에서 10분, 37℃에서 120분, 85℃에서 5초 및 4℃에서 유지.
리얼 타임(Real time) PCR
2 μl의 cDNA를, 384 웰 플레이트(Roche 카탈로그 번호 04887301001)에 웰당, 2 μl의 H2O, 0.5 μl GAPDH TaqMan 탐침(Hep3B 세포에 대해서는 Life Technologies 카탈로그 번호 4326317E, 일차 마우스 간세포에 대해서는 카탈로그 번호 352339E 또는 시노몰구스 일차 간세포에 대해서는 맞춤 탐침), 0.5 μl C5 TaqMan 탐침(Hep3B 세포에 대해서는 Life Technologies c 카탈로그 번호 Hs00156197_m1 또는 일차 마우스 간세포에 대해서는 mm00439275_m1 또는 시노몰구스 일차 간세포에 대해서는 맞춤 탐침) 및 5 μl Lightcycler 480 탐침 마스터 믹스(Roche 카탈로그 번호 04887301001)를 함유하는 마스터 믹스에 첨가하였다. ΔΔCt(RQ) 분석법을 사용하여 리얼 타임 PCR을 Roche LC480 리얼 타임 PCR 시스템(Roche)에서 수행하였다. 시험관내 스크리닝을 위하여, 달리 기재하지 않는 한 각각의 듀플렉스를 2개의 생물학적 반복검증으로 시험하였고, 각각의 리얼 타임 PCR을 이벌의 기술적 반복검증으로 수행하였다. 생체내 스크리닝을 위하여, 각각의 듀플렉스를 1개 이상의 실험(그룹당 3마리 마우스)에서 시험하고, 각각의 리얼 타임 PCR을 이벌의 기술적 반복검증으로 행하였다.
C5 mRNA 수준의 상대적인 배수 변화를 계산하기 위해, ΔΔCt 방법을 사용하여 실시간 데이터를 분석하였고, 10 nM AD-1955를 사용하여 트랜스펙션된 세포, 또는 모의 트랜스펙션된 세포를 사용하여 수행된 분석법으로 정규화시켰다. XLFit를 사용하는 4 파라미터 적합 모델을 사용하여 IC50을 계산하였고, 동일한 용량 범위에 걸쳐 AD-1955를 사용하여 트랜스펙션된 세포, 또는 그 자체의 가장 낮은 용량으로 정규화시켰다.
AD-1955의 센스 및 안티센스 서열은 다음과 같다:
센스: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 13);
안티센스: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 14).
siRNA 합성
표 7은 표기된 GalNAC 컨쥬게이트된 변형 iRNA로 트랜스펙션된 Hep3B 세포에서의 단일 용량 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 미처리 세포에 비한 잔류 mRNA의 백분율로 표현되어 있다.
표 8은 표기된 GalNAC 컨쥬게이트된 변형 iRNA로 트랜스펙션된 일차 마우스 간세포에서의 단일 용량 트랜스펙션 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 미처리 세포에 비한 잔류 mRNA의 백분율로 표현되어 있다.
표 9는 표기된 GalNAc 컨쥬게이트된 변형 iRNA를 사용한 일차 시노몰구스 간세포에서의 단일 용량 자유 흡수 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 미처리 세포에 비한 잔류 mRNA의 백분율로 표현되어 있다.
표 10은 표기된 GalNAc 컨쥬게이트된 변형 iRNA를 사용한 일차 마우스 간세포에서의 단일 용량 자유 흡수 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 미처리 세포에 비한 잔류 mRNA의 백분율로 표현되어 있다.
표 11은 표기된 GalNAc 컨쥬게이트된 변형 iRNA를 사용한 일차 시노몰구스 간세포에서의 자유 흡수 스크린의 용량 반응을 보여준다. 표기된 IC50 값은 미처리 세포에 비한 IC50 값을 나타낸다.
표 12는 표기된 GalNAc 컨쥬게이트된 변형 iRNA를 사용한 일차 마우스 간세포에서의 자유 흡수 스크린의 용량 반응을 보여준다. 표기된 IC50 값은 미처리 세포에 비한 IC50 값을 나타낸다.
표 13은 표기된 변형 및 비변형 iRNA로 트랜스펙션된 Hep3B 세포에서의 단일 용량 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 미처리 세포에 비한 잔류 mRNA의 백분율로 표현되어 있다. 0.01 nM 용량은 단일의 생물학적 트랜스펙션이었고, 1 nM 용량은 이벌의 생물학적 트랜스펙션이었다.
표 14는 표기된 변형 및 비변형 iRNA로 트랜스펙션된 일차 마우스 간세포에서의 단일 용량 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 미처리 세포에 비한 잔류 mRNA의 백분율로 표현되어 있다.
표 15는 표기된 변형 및 비변형 iRNA로 트랜스펙션된 Hep3B 세포에서의 용량 반응을 보여준다. 표기된 IC50 값은 미처리 세포에 비한 IC50 값을 나타낸다.
표 16은 표기된 변형 및 비변형 iRNA로 트랜스펙션된 일차 마우스 간 세포에서의 용량 반응을 보여준다. 표기된 IC50 값은 미처리 세포에 비한 IC50 값을 나타낸다.
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실시예 3. 생체내 스크리닝
7개의 GalNAC 컨쥬게이트된 iRNA의 서브셋을 추가의 생체내 평가를 위해 선택하였다.
C57BL/6 마우스(그룹마다 N=3)에 10 mg/kg의 GalNAc 컨쥬게이트된 듀플렉스 또는 동부피의 1× Dulbecco's 인산염-완충 염수(DPBS)(Life Technologies, Cat# 14040133)를 피하 주사하였다. 48시간 후에, 마우스를 안락사시키고, 간을 절개하고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 간을 2000 Geno/Grinder(SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ)에서 분쇄하였다. RNA 분리를 위하여 시료당 대략 10 mg의 간 분말을 사용하였다. 시료를 먼저 TissueLyserII(Qiagen Inc, Valencia, CA)에서 균질화시킨 다음, RNA를 진공/회전 기술을 사용하여, 제조처의 프로토콜에 따라 RNeasy 96 Universal Tissue Kit(Qiagen Inc, Cat#74881)를 사용하여 추출하였다. NanoDrop 8000(Thermo Scientific, Wilmington, DE)으로 RNA 농도를 측정하고, 100 ng/μl로 조정하였다. cDNA 및 RT-PCR을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
단일 용량 스크린의 결과는 도 2에 도시되어 있다. 표 17은 표기된 GalNAC 컨쥬게이트된 변형 iRNA를 사용한 생체내 단일 용량 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 DPBS 처리 마우스에 비한 잔류 mRNA의 백분율로 표현되어 있다. "실험" 열은 평균이 계산되는 실험의 개수를 나열한 것이다. 분석한 모든 실험에 걸쳐, 그룹 내의 모든 마우스로부터 표준 편차를 계산한다.
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가장 효율적인 GalNAC 컨쥬게이트된 iRNA 중 2개를 추가의 포스포로티오에이트 결합을 포함하도록 더욱 변형시키고(표 18), 이들 듀플렉스의 효능을 상기 기술된 바와 같이 생체내에서 결정하였다. 단일 용량 스크린의 결과는 도 3에 도시되어 있으며, 추가의 포스포로티오에이트 결합이 있는 iRNA 작용제가 포스포로티오에이트 결합이 없거나, 보다 소수의 포스포로티오에이트 결합이 있는 iRNA 작용제보다 더욱 효율적임을 나타낸다.
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상기 기술된 iRNA 작용제의 침묵화 능력에 대한 추가의 포스포로티오에이트 결합의 영향을 고려해 볼 때, 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 추가의 GalNAc 컨쥬게이트된 iRNA 듀플렉스의 효능(표 19)을 상기 기술된 바와 같이 생체내에서 결정하였다. 이러한 단일 용량 스크린의 결과는 도 4에 도시되어 있다.
단일의 2.5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 25 mg/kg 용량을 생쥐에 투여하고, 제7일에 존재하는 C5 단백질의 양(도 5b) 및 제4일 및 제7일에 존재하는 C5 단백질의 활성(도 5a)을 측정함으로써 생체내에서 AD-58642의 침묵화의 기간을 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 25 mg/kg 용량에서 제4일까지 C5 단백질의 활성의 50% 감소와, 제7일에는 C5 단백질의 활성의 70% 초과의 감소가 있었다.
전체 혈청의 웨스턴 블롯 분석에 의해 C5 단백질의 양을 측정하였다. C5 단백질의 활성을 용혈 검정에 의해 측정하였다. 약술하면, 인간 C5 고갈 인간 혈청의 고정 희석액을 마우스 혈청과 혼합하고, 항체-코팅된 양 적혈구와 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 헤모글로빈 흡광도를 측정하고, 참조 곡선(마우스 혈청의 단계 희석을 사용하여 만든)에 비한 용혈%를 계산하였다.
또한, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 25 mg/kg의 AD-58642의 단일의 피하 주사 후에, 생체내에서 AD-58642의 효능을 마우스에서 분석하였다. 제5일에, C5 mRNA를 qPCR을 사용하여 간 시료에서 분석하고, C5 활성을 용혈에 대하여 분석하고, C5 단백질의 양을 전체 혈청의 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다.
도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 10 mg/kg 용량에 비하여, 25 mg/kg의 용량에서, C5 mRNA를 억제하는 AD-58642의 효능의 오직 미소한 개선(즉, 약 5%)이 있지만, 25 mg/kg 용량을 사용하여 침묵화는 평균 85%이다. 또한, 약 2.5 mg/kg의 IC50을 사용하여 용량 반응 효과가 있다.
도 7a 및 도 7b 및 도 8은 AD-58642가 C5 단백질의 양(도 8) 및 C5 단백질 활성(도 7a 및 도 7b)을 감소시키는데 유효한 것을 나타낸다.
또한, 단일의 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg 용량의 AD-58641을 C57Bl/6(n=3) 마우스에 피하 투여하고, ELISA에 의해 제5일 및 제9일에 이들 동물에 존재하는 C5 단백질의 양을 측정함으로써, 생체내에서 AD-58641의 침묵화 기간을 측정하였다. 약술하면, 혈청을 제0일, 사전-채혈, 제5일 및 제9일에 수집하고, C5 단백질의 수준을 ELISA에 의해 정량화하였다. C5 단백질 수준을 제0일 사전-채혈 수준으로 정규화시켰다. 도 9에 도시된 바와 같이, 결과는 용량 의존적인 강력하고 지속적인 C5 혈청 단백질의 낙-다운이 있음을 나타낸다(단일 용량 ED50은 0.6 mg/kg이었음).
또한, 다중-용량 투여 프로토콜을 사용하여, C57Bl/6 마우스에서 화합물 AD-58641을 효능에 대하여 시험하였다. 제0일, 제1일, 제2일 및 제3일에 마우스에 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg 또는 2.5 mg/kg 용량의 AD-58641 화합물을 피하 투여하였다. 혈청을 도 10에 나타낸 바와 같이 제0일 및 제8일에 수집하고, ELISA에 의해 C5 단백질 수준에 대하여 분석하였다. C5 수준을 제0일 사전-채혈 수준으로 정규화시켰다. 도 10은 AD-58641의 다중 투여가 시험된 모든 용량에서 C5 단백질의 침묵화를 달성하며, 2.5 mg/kg의 용량에서 C5 단백질의 침묵화가 90% 초과임을 보여준다.
화합물 AD-58641을 효능에 대하여 추가로 시험하고, 반복 투여 프로토콜을 사용하여 생쥐에서 화합물의 누적 효과를 평가하였다. 야생형 Sprague Dawley 생쥐에, 2.5 mg/kg/용량 또는 5.0 mg/kg/용량을 3주 동안 주 2회(q2w x3) 피하 주사하였다. 혈청을 제0일, 제4일, 제7일, 제11일, 제14일, 제18일, 제25일, 제28일 및 제32일에 수집하였다. 혈청 용혈 활성을 생쥐 혈청의 1:150 희석액을 GVB++ 완충제에서 1시간 동안 감작된 양 적혈구와 인큐베이션시키는 용혈 분석법을 사용하여 정량화하고, 415 nm에서 흡광도를 측정함으로써 헤모글로빈 방출을 정량화하였다(도 11a 참조). 또한, 시료에 존재하는 C5 단백질의 양을 ELISA에 의해 측정하였다(도 11b). 결과는 약 90% 용혈 활성 억제를 달성하는, 용량 의존적인 강력하고 지속적인 용혈 활성의 감소를 나타낸다.
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실시예 4: 추가의 siRNA의 설계, 합성 및 시험관내 스크리닝
siRNA 설계
센스 및 안티센스 가닥 둘 모두에 대하여 19개 뉴클레오티드 길이의 C5 듀플렉스를 유전자 은행 승인 번호 NM_001735.2에 기재된 인간 C5 mRNA 서열을 사용하여 설계하였다. 실질적으로 전체 5480개 뉴클레오티드 전사물에 걸쳐 있는 7개 초과의 뉴클레오티드 반복체를 함유하지 않는 569개의 듀플렉스를 초기에 확인하였다. 그 다음, 모든 569개 듀플렉스를 각각의 듀플렉스 위치에서 뉴클레오티드 쌍, 및 스크리닝을 위해 사용될 용량 및 세포주를 평가하는 선형 모델에 따라 예측된 효능에 대하여 점수를 매겼다. 또한, 듀플렉스를 맞춤형 무작위 대입 알고리즘을 사용하여 인간 RefSeq 집합에서 모든 전사물에 대하여 매치시키고, C5 이외의 전사물에 대하여 가장 낮은 미스매치 개수(가닥 당)에 대하여 점수를 매겼다. 그 다음, 합성하고 스크리닝할 듀플렉스를 하기의 계획에 따라 569개로부터 선택하였다: 전사물의 5'-말단에서 시작하여,
1) 예측된 효능이 가장 높고,
2) SERPINC1 이외의 모든 전사물에 대하여 둘 모두의 가닥에서 적어도 하나의 미스매치를 가지며,
3) 다른 듀플렉스 세트의 부분으로서 이미 합성되고 스크리닝된 적이 없는 듀플렉스를 매 10 ± 2개 뉴클레오티드의 "윈도우(window)" 내에서 선택하였다.
모든 기준을 만족시키는 듀플렉스가 주어진 윈도우 내에서 확인될 수 없다면, 윈도우를 건너뛰었다.
569개 C5 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록은 표 20에 나타나 있다.
표 20에 열거된 센스 및 안티센스 서열을 포함하는 듀플렉스의 시험관내 효능을 하기의 방법으로 결정한다.
세포 배양 및 트랜스펙션
HepG2 세포(ATCC, Manassas, VA)를 10% FBS, 스트렙토마이신, 및 글루타민(ATCC)이 보충된 Eagle's 최소 필수 배지(ATCC)에서 5% CO2의 분위기 하에 37℃에서 거의 컨플루언스까지 성장시킨 후, 트립신처리에 의해 플레이트로부터 방출시켰다. 96-웰 플레이트에서 개별 웰에, 웰당 14.8 μl의 Opti-MEM + 0.2 μl의 Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를 5 μl의 각각의 164개 siRNA 듀플렉스에 첨가함으로써 트랜스펙션을 수행하였다. 이후, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 약 2.5×104개의 HepG2 세포를 함유하는 80 μl의 완전 성장 배지(항생제 비함유)를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. RNA 정제 전에 세포를 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 실험은 20 nM에서 수행하였고, 나이브(naive) 세포 및 AD-1955로 트랜스펙션된 세포, 루시퍼라제를 표적으로 하는 siRNA를 음성 대조군으로 포함시켰다.
DYNABEADS mRNA 분리 키트(Invitrogen, part #: 610-12)를 사용한 전체 RNA 분리
세포를 수집하고 150μl의 용해/결합 완충제에서 용해시킨 후, 플랫폼 진탕기(platform shaker) 상에서 700 rpm에서 5분 동안 혼합하였다(혼합 속도는 상기 과정 전체에서 동일하였다). 10 μl의 자성 비드 및 80 μl의 용해/결합 완충제 혼합물을 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고, 1분 동안 혼합하였다. 자성 스탠드를 사용하여 자성 비드를 포획하고, 비드를 건드리지 않으면서 상청액을 제거하였다. 상청액을 제거한 후, 용해된 세포를 남아있는 비드에 첨가하고 5분 동안 혼합하였다. 상청액을 제거한 후에, 자성 비드를, 150 μl의 세척 완충제 A를 사용하여 2회 세척하고, 1분 동안 혼합하였다. 비드를 다시 포획하고, 상청액을 제거하였다. 이후, 150 μl의 세척 완충제 B를 사용하여 비드를 세척하고, 포획하고, 상청액을 제거하였다. 다음에, 150 μl 용리 완충제를 사용하여 비드를 세척하고, 포획하고, 상청액을 제거하였다. 비드가 2분 동안 건조되도록 하였다. 건조 후, 50μl의 용리 완충제를 첨가하고, 70 ℃에서 5분 동안 혼합하였다. 비드를 5분 동안 자석상에서 포획하였다. 분리된 RNA를 함유하는 40 μl의 상청액을 회수하여, 또 다른 96 웰 플레이트에 첨가하였다.
ABI High capacity cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성
반응마다 2 μl 10× 완충제, 0.8 μl 25× dNTP, 2 μl 랜덤 프라이머, 1 μl 역전사효소, 1 μl RNase 억제제 및 3.2 μl의 H2O의 마스터 믹스를 10 μl의 전체 RNA에 첨가하였다. cDNA를 하기의 단계를 통하여 Bio-Rad C-1000 또는 S-1000 써멀 사이클러(Hercules, CA)를 사용하여 생성하였다: 25℃에서 10분, 37℃에서 120분, 85℃에서 5초 및 4℃에서 유지.
리얼 타임 PCR
2 μl의 cDNA를, 384 웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)에 웰당 0.5 μl 인간 GAPDH TaqMan 탐침(Applied Biosystems Cat #4326317E), 0.5 μl 인간 SERPINC1 TaqMan 탐침(Applied Biosystems cat # Hs00892758_m1) 및 5μl Lightcycler 480 탐침 마스터 믹스(Roche Cat #04887301001)를 함유하는 마스터 믹스에 첨가하였다. 리얼 타임 PCR을 LC480 Real Time PCR 장치(Roche)에서 행하였다.
상대 배수 변화를 계산하기 위하여, 실시간 데이터를 ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하고, 20 nM AD-1955로 트랜스펙션된 세포로 수행된 분석법으로 정규화시켰다.
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실시예 5: 생체내 C5 침묵화
3마리의 암컷 시노몰구스 마카크의 그룹을 어깨 및 등 중앙 부분에서 2.5 mg/kg 또는 5 mg/kg 용량의 C5-siRNA AD-58641 또는 운반체 대조군으로 피하로 처리하였다. 2회차의 투여를 각각의 회차에서 3일마다 주어지는 8회의 투여를 사용하여 시행하였다. 혈청 C5를 수집하고, 표기된 시점에 C5 검출에 특이적인 ELISA 분석법(Abcam)을 사용하여 평가하였다(도 13). C5 수준을 3가지 투여전 시료의 평균으로 정규화시켰다. 완전 혈청 화학, 혈액학 및 응고 패널에 의해 투여 전 및 제23일(제1 회차의 치료 동안 마지막 용량을 투여하고 24시간 후)에 수집된 시료를 분석하였다.
치료전 혈청 C5 단백질 수준에 비한 혈청 C5 단백질 수준의 분석에 의해, 5 mg/kg AD-58641 투여 양생법이 혈청 C5 단백질 수준을 98%까지 감소시키는 것으로 나타났다(도 12). 평균 혈청 C5 수준은 최저점에서 97%까지 감소되었으며, 이는 순환하는 C5의 대부분이 간 기원임을 나타낸다. AD-58641의 피하 투여를 사용하여 혈청 C5 단백질 수준의 강력하고, 용량-의존적이며, 지속적인 낙-다운이 있었다. 제1 회차의 투여 후 24시간에 혈액학, 혈청 화학 또는 응집 매개변수의 변화가 확인되지 않았다.
또한, 혈청 용혈 활성을 감작된 양 적혈구 분석법을 사용하여 분석하여, 고전 경로 활성을 측정하였다. 대조군 시료에서의 최대 용혈 및 백그라운드 용혈과 비교하여 용혈 백분율을 계산하였다. 3마리 동물에 대한 평균 용혈 값 +/- SEM을 계산하고, 분석하였다(도 13). 용혈은 5 mg/kg 투여 양생법에서 최대 94% 감소되었으며, 최저점에서 92%의 평균 억제가 있었다. 용혈의 감소는 마지막 투여 후 2주 넘게 유지되었다.
실시예 6: 추가의 siRNA의 시험관내 스크리닝
표 20에 나타낸 C5 센스 및 안티센스 가닥 서열을 데옥시-티민 뉴클레오티드(dT)들로 된 짧은 서열을 사용하여 3'-말단에서 변형시켰다(표 21). 표 21에 열거된 센스 및 안티센스 서열을 포함하는 듀플렉스의 시험관내 효능을 하기의 방법을 사용하여 결정하였다.
세포 배양 및 트랜스펙션
Hep3B 세포(ATCC, Manassas, VA)를 10% FBS가 보충된 EMEM(ATCC)에서 5% CO2의 분위기에서, 37℃에서 거의 컨플루언스까지 성장시킨 후, 트립신처리에 의해 플레이트로부터 방출시켰다. 384-웰 플레이트에, 웰당 5 μl의 Opti-MEM + 0.1 μl의 Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를 5 μl의 siRNA 듀플렉스에 첨가함으로써 트랜스펙션을 수행하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 약 5×103개 Hep3B 세포를 함유하는 40 μl의 완전 성장 배지를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포를 RNA 정제 전 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 실험을 10 nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행하였다.
DYNABEADS mRNA 분리 키트(Invitrogen, part #: 610-12)를 사용한 전체 RNA 분리
Biotek EL 405 워셔(washer)의 반자동화 과정을 사용하여 RNA 분리를 수행하였다. 약술하면, 세포를 2 μl의 Dynabeads를 함유하는 75 μl의 용해/결합 완충제에서 용해시킨 후, 전자기 진탕기(Union Scientific)의 설정 7에서 10분 동안 혼합하였다. 자성 스탠드를 사용하여 자성 비드를 포획하고, 상청액을 제거하였다. 상청액을 제거한 후, 자성 비드를, 90 μl의 세척 완충제 A를 사용하여 세척한 다음, 90 μl의 세척 완충제 B를 사용하여 세척하였다. 그 다음, 비드를 100 μl의 용리 완충제로 2회 세척한 다음, 이를 흡인시키고, cDNA를 384 웰 플레이트 내의 비드 결합 RNA에 대해 직접 생성하였다.
ABI High capacity cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성
반응마다 2 μl 10× 완충제, 0.8 μl 25× dNTP, 2 μl 랜덤 프라이머, 1 μl 역전사효소, 1 μl RNase 억제제 및 3.2 μl의 H2O의 마스터 믹스를 RNA 분리를 위해 사용되는 384 웰 플레이트 내의 비드 결합 RNA에 직접 첨가하였다. 플레이트를 전자기 진탕기에서 10분 동안 진탕시킨 다음, 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 두었다. 이러한 인큐베이션 후에, 플레이트를 진탕시키면서 80℃ 인큐베이터에 7분 동안 두어, 효소를 불활성화시키고, 비드로부터 RNA/cDNA를 용리시켰다.
리얼 타임 PCR
2 μl의 cDNA를, 384 웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)에 웰당 0.5 μl GAPDH TaqMan 탐침(Applied Biosystems Cat #4326317E), 0.5 μl C5 TaqMan 탐침(Applied Biosystems cat # Hs00156197_M1) 및 5μl Lightcycler 480 탐침 마스터 믹스(Roche Cat #04887301001)를 함유하는 마스터 믹스에 첨가하였다. 리얼 타임 PCR을 Roche LC480 Real Time PCR 시스템(Roche)에서 행하였다. 각각의 듀플렉스를 적어도 2개의 독립적인 트랜스펙션에서 시험하고, 각각의 트랜스펙션을 이벌로 분석하였다.
상대 배수 변화를 계산하기 위하여, 실시간 데이터를 ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하고, 10 nM AD-1955로 트랜스펙션된 또는 모의 트랜스펙션된 세포로 수행된 분석법으로 정규화시켰다.
표 22는 표기된 dT 변형 iRNA로 트랜스펙션된 Hep3B 세포에서의 단일 용량 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 미처리 세포에 비한 잔류 mRNA의 백분율로 표현되어 있다.
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실시예 7: 추가의 siRNA의 생체내 스크리닝
AD-58643의 서열에 기초하여, 추가의 4개의 센스 서열 및 3개의 안티센스 서열을 합성하고, 이를 사용하여, 12개의 21/25mer 화합물을 제조하였다(표 23). 일반적으로, 이들 화합물의 안티센스 가닥을 dTdT를 사용하여 연장시켰으며, 듀플렉스는 보다 적은 플루오로-변형 뉴클레오티드를 가졌다.
C57BL/6 마우스(그룹마다 N=3)에는 1 mg/kg의 이들 GalNAc 컨쥬게이트된 듀플렉스를 피하 주사하고, 혈청을 제0일 사전-채혈 및 제5일에 수집하고, C5 단백질의 수준을 ELISA에 의해 정량화시켰다. C5 단백질 수준을 제0일 사전-채혈 수준으로 정규화시켰다.
도 14는 표기된 iRNA를 사용한 생체내 단일 용량 스크린의 결과를 보여준다. 데이터는 사전-채혈 수준에 비한 잔류 C5 단백질의 백분율로 표현되어 있다. 모 화합물에 비하여 향상된 효능을 갖는 iRNA에는 AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 및 AD-62651이 포함되었다. 또한, 이들 iRNA는 유사한 효능을 나타내었다(약 23 내지 59 pM의 IC50).
또한, 이들 iRNA의 효능을 단일-용량 투여 프로모콜을 사용하여 C57Bl/6 마우스에서 시험하였다. 마우스에 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg 또는 2.5 mg/kg 용량의 AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 및 AD-62651을 피하 투여하였다. 혈청을 제0일 및 제5일에 수집하고, ELISA에 의해 C5 단백질 수준에 대하여 분석하였다. C5 수준을 제0일 사전-채혈 수준으로 정규화시켰다.
도 15는 시험된 모든 iRNA에서 용량 반응이 존재하며, 이들 iRNA의 모두의 단일의 투여로 AD-58641과 유사하거나 그보다 더 나은 C5 단백질의 침묵화가 달성하였음을 보여준다.
단일의 1.0 mg/kg 용량을 C57Bl/6 마우스에 투여하고, 제6일, 제13일, 제20일, 제27일 및 제34일에 존재하는 C5 단백질의 양을 ELISA에 의해 결정함으로써, 생체내에서의 AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 및 AD-62651의 침묵화 기간을 결정하였다. C5 수준을 제0일 사전-채혈 수준으로 정규화시켰다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 시험된 iRNA의 각각은 최적의 침묵화를 향한 AD-62643 경향과 동일한 회복 속도를 가졌으나, 분석법의 오차 이내였다.
AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650 및 AD-62651을 효능에 대하여 추가 시험하고, 반복 투여 프로토콜을 사용하여 생쥐에서 iRNA의 누적 효과를 평가하였다. 야생형 Sprague Dawley 생쥐에, 제0일, 제4일 및 제7일에 5.0 mg/kg/용량의 각각의 iRNA를 피하 주사하였다. 혈청을 제0일, 제4일, 제7일, 제11일, 제14일, 제18일, 제25일, 제28일 및 제32일에 수집하였다. 혈청 용혈 활성을 상기 기술된 바와 같이 정량화하였다.
도 17에 도시된 결과는 시험된 모든 iRNA가 용혈 활성의 강력하고 지속적인 감소를 가지며, AD-58641 처리로 관찰되는 것과 유사한 용혈의 회복을 갖는 것을 나타낸다.
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SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> COMPLEMENT COMPONENT C5 IRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 121301-00520 <150> US 61/782,531 <151> 2013-03-14 <150> US 61/837,399 <151> 2013-06-20 <150> US 61/904,579 <151> 2013-11-15 <150> US 61/912,777 <151> 2013-12-06 <150> US 61/942,367 <151> 2014-02-20 <160> 2899 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5480 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tatatccgtg gtttcctgct acctccaacc atgggccttt tgggaatact ttgtttttta 60 atcttcctgg ggaaaacctg gggacaggag caaacatatg tcatttcagc accaaaaata 120 ttccgtgttg gagcatctga aaatattgtg attcaagttt atggatacac tgaagcattt 180 gatgcaacaa tctctattaa aagttatcct gataaaaaat ttagttactc ctcaggccat 240 gttcatttat cctcagagaa taaattccaa aactctgcaa tcttaacaat acaaccaaaa 300 caattgcctg gaggacaaaa cccagtttct tatgtgtatt tggaagttgt atcaaagcat 360 ttttcaaaat caaaaagaat gccaataacc tatgacaatg gatttctctt cattcataca 420 gacaaacctg tttatactcc agaccagtca gtaaaagtta gagtttattc gttgaatgac 480 gacttgaagc cagccaaaag 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(2876)..(2895) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 2 catgatttcc tgctacctcc aaccatgggc cttttgggaa tactttgttt tttaatcttc 60 ctgggaaaaa cttggggaca ggagcaaaca tatgtcattt cagcaccaaa aatattccgt 120 gttggagcat ctgaaaacat tgtgattcaa gtttatggat acactgaagc atttgatgca 180 acaatctcta ttaaaagtta tcctgataaa aaatttagtt actcctcagg ccatgttcat 240 ttatcctcag agaataaatt ccaaaactcg gcagtcttaa caatacaacc aaaacaatta 300 cctggaggac aaaaccaagt ttcttatgtg tatttggaag ttgtatcaaa gcatttttca 360 aaatcaaaaa aaattccaat aacctatgac aatggatttc tcttcattca tacagacaaa 420 cctgtttata ctccagacca atcagtaaag gttagagttt attcgttgaa tgatgacttg 480 aagccagcca aaagagaaac tgtcttaact ttcatagatc ctgaaggatc agaaattgac 540 atggtagaag aaattgatca tattggaatt atctcttttc ctgacttcaa gattccgtct 600 aatcctagat atggtatgtg gatgatccag gctaaatata aagaggactt ttcaacaact 660 ggaactgcat tttttgaagt taaagaatat gtcttgccac atttttctgt ctcagtagaa 720 ccagaaagta atttcattgg ttataagaac tttaagaatt ttgaaattac tataaaagca 780 agatattttt ataataaagt agtcactgag 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ttataaaaat atcttgcttt cacagtgatt tcaaagttct taaagttttt atagccaatg 4680 aaggttcttt ctagttctat tgaaacagag aatcgtggca agacatattc tttaatttca 4740 aagtatgcag ttccagttgt tgtaaaatcc ttcttatagt tagctttaat tgtccaaaca 4800 ccatacttgg gattagatgg aatcttgaag tcaggaaaag agataattcc ggtgtaatca 4860 ttttcttcta caatgtcaac ttctgatcct tcggggtcta tgaaagttaa gacagtctcc 4920 cgtttggctg gcttcaagtc gtcacccaga gaatagactc tgatctttac tgactggtcc 4980 ggcgtgtaaa caggtttgtc tgtatggatg aagagaattc cattgttata ggtaattggt 5040 attttctttg attttgaaaa gtgttttgac acaacttcca gatacacgtg agagactggg 5100 ctttcttctc taggaacttg attgggctgt agtgtcaaca gtgccgcgtt ttggaatttg 5160 ttttccgggg acaaattaac atagcctgaa gagaaggtga cttttttgtc aggatagctt 5220 tttagagaaa gagttgcatc aaatgcttca gtgtagccat ggacttgaat taccacattt 5280 tcagacgagc cgacccggag gattttgggt gctgaaatga cgtaggtttg ttcctgtccc 5340 caagttttgt ccaggaaaat taaaagacaa agtattcccc aaagacccat ggctggtagc 5400 ggcataaacc catgggcatg gcctccctgt aaccactttc cttttaaa 5448 <210> 8 <211> 4497 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 8 tacagttgag tgcaaagtca agcttttatg gcattttctg tccttggtat tttttttttc 60 aagcaagacc atgttttcct aaggggctac aatttcagtg agtctcttct tccggcccca 120 acaaacaccc ctggctgcta acgttacaga cttgttccag cttattggtg ctgatgtcca 180 atagccttgg gggacctgcc ttcggctctc cacaaggcta ttttgtttca caaagtaact 240 cttcaactta cgctttacta taaagaaaat gtatccgatt ctaggctaag tttccaagcg 300 atcctggctc ctaggagcca ccaacaggag tacccgggaa ggccacgcag cagaacttcc 360 tcaggcattt tcacagccat ttagaaagat gtcttcagcg aactcgtcca aattagctac 420 aaacgcttgg caggatggac acgttgtgtc tgtgggccaa tattcaatcc aggtggagga 480 atctagaggg tatatatact tgaaactgaa attgtgtttg atctgcagag cctctttgcc 540 catgattaaa tattgctttc ctttcaccag gttggcgttg gtacagctta tctttttaat 600 gaaggtgatc tcagagtcct tctcagcagc ggcttcccct gttttgtaaa tatccagaag 660 cgtcgcagtg tacttgacaa aaatgttttc ttccgtggcc gacgtgatcc tgaccttata 720 agcatatgca atctctggtt tacatgctgt ttctttcctg gtgtctgcag agatggccag 780 gtccagttct gcctgcagtt gcccacaatc agcttcaacg catttgcatg ccgctccttc 840 acagactctc tgaaggttgg tgtcagaagt gctgtaaatc atggtacact gcttatctgg 900 tctgtgatac tcgtacaccg tgaacgtagc aggattcaga aacccaactt ggaaaagttc 960 aaatatccgg aaccgaacac aaaggaaatc tctggaggga atcgaattca attgcagaat 1020 aacatgactg tctttgatct ggtaatcagt taggagttga tctactcctt ccacaagagc 1080 tcgtaaatct tcttggtttg ctccgattcc ggtcggcagc agtatatcca ttactgcatg 1140 ggaggaccca gatgctgact cctccttgct gggcttgtag ctggcacagg ctattatgcg 1200 cttgtgtccc gagtcactgt agctgaggta gctggaggct tcaacttctt gggtatcaat 1260 tttcaagtaa aagctgcaaa attcctcagc gacactagtt ttgtgaacca cagtttttac 1320 atatactgta gccaagccac tgctatagcc tgtggtgacg atgaggtcat cattgagggg 1380 tacctccact ggcctcccga ggaagttctt ctctgtcact ttatactggt agaaatcccc 1440 tttgtgtttg taggagacat tgatatccat atccaaatga agttgtttaa ccaggagtga 1500 atactctgtc aggccctcga tggcgttaat ggtatcctgg gtggaataaa agccgcctcc 1560 atacctctgc tcctcagata gccacttgat gatcgggttg acataactcg tctccttcag 1620 gttcaggctg gtgagcaaag cataggccgt ggtttctacc atacctgctg tgccgctgtt 1680 gggtgctgag ctgtctggac gttggagagt gtctctccag aaacggtaaa tgggcgggtc 1740 tcctttaacc aaagcttccc tcttcagggc tgacacaata gaacgaaact tcgggtgggt 1800 tctgtctccc agggagagag cataggccac aatggccagg gtgaaggtgc tcttggaagg 1860 cagggtcctt tcaagtagga aggagtcagc tttagccagc gctgtgtaga ttttctccgt 1920 ggggcatatg ccaatagcct ttctaattcc aatcacagaa aaggctgtaa gatataaagt 1980 gttctcttgg gcttcagcag gcaaagtacc ctgtaatttt attggtagat attgggaatt 2040 ttccttgaaa gatccgtttt ccagctgaca cttctcaatc agccataaca aggagttaca 2100 gatcgagtat tggtcttgtt tcacatactt gttcacctgt ccaagcactc tcagagcaaa 2160 agctgtcagc caggcactag agcttgctcc cttccacatg ctgtaggaat agtcagcgtt 2220 tctgtaggac atgacgctca ccagcccttc ttttattttt ttctgcaggc tctgttttct 2280 agctaacgta tcagggtgga aaatattcca atggtttcct gcttccaggt agtggaaaac 2340 gtagaacacc gggactatgc tcatgagttc tgcctcggcg ctgcccttgg ggaggtgggt 2400 taggatgtcg atgccttctt tactcagaac cgtggacaag aattccccta taagcagtcc 2460 ttttacactc aaaatccttt tgacgttggt tttggggacc aaatctaatg gtatcctgta 2520 tgggaattcc tttcgtctgt taacaatacc ataaactccc ctggggtcca gagtcacacc 2580 agcatagctt tcccttttga tcccttctgg cactacccgt aatgtcttca ctaagatttc 2640 tttcccaaat gaagtctcta gtgagaagtt tatggagtga aggccaattt ccagaggaag 2700 caggctgaag gtcaccaagt gactggagga gccctctatt ctctggcgca cacatctgga 2760 ggacctagag gtctgagggc tagcagccga gcttcctgga gtgcagattc cctccacggc 2820 agacatttta acacagaaca ttgtcccaga ggtcctataa ttgtaaacgg ttcccttcaa 2880 ttggatctgc tcccctcgta caacagaata tggtatgttc atctccagga agacatcttt 2940 gaacaccttt gccttgagtg tgtcagcaac acatatacca ttgtctgaga tgccgatgcc 3000 ttgaatttcc caggtcgtca gtgagtcagg cagtgcaacc tgcagctggt ttcttttggg 3060 aacacgatga acttcccata gccagctctc tggaaagtag cttcggattt ctgccttcat 3120 cactggtaac agggccttta tttggatcct tcccaacagc atgcctttgt ggtggctttc 3180 ttttcggatc ttatccgcaa tagtacaaca ctcgttgaag gccctgatgc agtgtgggcc 3240 tatggtcacc cgggcaactc gctgctcaca ggtttcgtat ttgttttctc gggctccatc 3300 ataacagcat ttcttgggca cacggtgttt gtatttagca gcttgttctt ccactttctg 3360 atgcaggagc tgcaggtctc tctttggcct gagaatttcc ttacaagagt catcgtggta 3420 ttgggagtca tctgcgtttg cattggtgag gaaggtgagc ccagctagat ggaatacatc 3480 tacattgtca cggccaccac ctgccccaca gcccaggtca ctcttgtcat caaaagcttg 3540 gaacactctt tgcatggccc ttttggcttt tccccggact ccatacacag cgctgtccac 3600 cgcagatagt gccacccatg agtctgcttc agtcaccatg tcaagggaca cagtttggcc 3660 tggagaatac acgtctttat ctggagacag atggacctgg agctggttgc cacacttctc 3720 ctcaatgttt atccagactg cgtcagccac caattctgct gtctgctccc ccgtgactat 3780 gtaatagacc aggagccgcg ctgaaggaac catgtcctgt gtcactggga tgtttatatt 3840 ttgataagat gaatagagaa gtttctcctt tgtgccatac tgtacaattt tgcctttgga 3900 taaaatcaag taattatagt gagttatttt gtcaatatat ggactcttgg gggtgacgat 3960 aatattcaga tattctccca caagcatggg cttgtagttt tcagtccagc caatgtaaat 4020 gtaactctgg ctgagggatg agtatgtaac tgcttcatat tctttgctgg cttgattttc 4080 ttcgggaagt tccggggcat cagttttgac ctcaaacttc agtgatgtca cttctgatgg 4140 gaggttcacc acaaatgaag ccactccatc agcagagtgt gtgatgctcc tctttggttc 4200 caagtcagat gtctcttgat tcacattgac tgtttgtgcc atcagagtta ctgggacccc 4260 tcctaccaac tgctcgagtg aatccttaac ctgtaccttg atggaaaatg gaatcccagg 4320 cttcaggaaa agaggggtag cgaccaaatt cagtgtatag ggagagagga cgtatttgat 4380 gccaggaatt tctgcctctt ccgaaaaccc acctacaagg gcagcaagca ctgagttaat 4440 gtttccggaa agatgatggc gggctgtagg acatctgtcg gtctctgtgc tatccat 4497 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 11 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 12 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 13 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 14 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 aauaacucac uauaauuacu u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 ugacaaaaua acucacuaua a 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 cuuccucugg aaauuggccu u 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 gacaaaauaa cucacuauaa u 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 uccucuggaa auuggccuuc a 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 aagcaagaua uuuuuauaau a 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 aaaauguuuu ugucaaguac a 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 auuuaaacaa caaguaccuu u 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 auucagaaag ucugugaagg a 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 acacugaagc auuugaugca a 21 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 gcaguucugu guuaaaaugu c 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 aggauuuuga guguaaaagg a 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 aaugaugaac cuuguaaaga a 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 aucauuggaa cauuuuucau u 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 agccagaaau ucggaguuau u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 ucccugggag auaaaacuca c 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 gaaaaugaug aaccuuguaa a 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 auugcucaag 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uugaaauuac u 21 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 uauucugcaa cugaauucga u 21 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 gcccuuggaa agaguauuuc a 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 ccugauaaaa aauuuaguua c 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 cccuuggaaa gaguauuuca a 21 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 49 ugcagaucaa acacaauuuc a 21 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 50 cagaucaaac acaauuucag u 21 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 51 guuccggaua uuugaacuuu u 21 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 auuuaaacaa caaguaccuu u 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 auuuaaacaa caaguaccuu u 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 ugacaaaaua acucacuaua a 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 ugacaaaaua acucacuaua a 21 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 gacaaaauaa cucacuauaa u 21 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 gacaaaauaa cucacuauaa u 21 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 58 guuccggaua uuugaacuuu u 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 59 guuccggaua uuugaacuuu u 21 <210> 60 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 60 ugcagaucaa acacaauuuc a 21 <210> 61 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 61 ugcagaucaa acacaauuuc a 21 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 aagcaagaua uuuuuauaau a 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 aagcaagaua uuuuuauaau a 21 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 64 cagaucaaac acaauuucag u 21 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 65 cagaucaaac acaauuucag u 21 <210> 66 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 aaguaauuau agugaguuau uuu 23 <210> 67 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 uuauagugag uuauuuuguc aau 23 <210> 68 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 aaggccaauu uccagaggaa gca 23 <210> 69 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 auuauaguga guuauuuugu caa 23 <210> 70 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 ugaaggccaa uuuccagagg aag 23 <210> 71 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 71 uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23 <210> 72 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 72 uguacuugac aaaaacauuu ucu 23 <210> 73 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 73 aaagguacuu guuguuuaaa ucu 23 <210> 74 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 74 uccuucacag acuuucugaa uuu 23 <210> 75 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 75 uugcaucaaa ugcuucagug uau 23 <210> 76 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 76 gacauuuuaa cacagaacug cau 23 <210> 77 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 77 uccuuuuaca cucaaaaucc uuu 23 <210> 78 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 78 uucuuuacaa gguucaucau uuu 23 <210> 79 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 79 aaugaaaaau guuccaauga uuu 23 <210> 80 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 80 aauaacuccg aauuucuggc uug 23 <210> 81 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 81 gugaguuuua ucucccaggg aaa 23 <210> 82 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 82 uuuacaaggu ucaucauuuu cuu 23 <210> 83 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 83 aucaaaugug acuugagcaa uuc 23 <210> 84 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 84 uuuauaagca uaugcaaucu cug 23 <210> 85 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 85 uaaauuuuuu aucaggauaa cuu 23 <210> 86 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 86 aauaaaagcu gcaaacuucc uca 23 <210> 87 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 87 uccaauauga ucaauuucuu cua 23 <210> 88 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 88 aacuaaauuu uuuaucagga uaa 23 <210> 89 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 89 uuuacuaaga uuucuuuucc aaa 23 <210> 90 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 aauguuuaua cuuugauaag aug 23 <210> 91 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 accaaauuca guuuguaggg aga 23 <210> 92 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 aaugacauau guuugcuccu guc 23 <210> 93 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 ugaacuacag uuguuacaug uac 23 <210> 94 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 94 aaauguucca augauuuccu guu 23 <210> 95 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 95 aguaauuuca aaauucuuaa agu 23 <210> 96 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 aucgaauuca guugcagaau aac 23 <210> 97 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 97 ugaaauacuc uuuccaaggg cuu 23 <210> 98 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 98 guaacuaaau uuuuuaucag gau 23 <210> 99 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 99 uugaaauacu cuuuccaagg gcu 23 <210> 100 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 100 ugaaauugug uuugaucugc aga 23 <210> 101 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 101 acugaaauug uguuugaucu gca 23 <210> 102 <211> 23 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 102 aaaaguucaa auauccggaa ccg 23 <210> 103 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 103 aaagguacuu guuguuuaaa ucu 23 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23 <210> 194 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 aaugacauau guuugcuccu guc 23 <210> 195 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 ugaacuacag uuguuacaug uac 23 <210> 196 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 aaauguucca augauuuccu guu 23 <210> 197 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 aguaauuuca aaauucuuaa agu 23 <210> 198 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 aucgaauuca guugcagaau aac 23 <210> 199 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 ugaaauacuc uuuccaaggg cuu 23 <210> 200 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 guaacuaaau uuuuuaucag gau 23 <210> 201 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 uugaaauacu cuuuccaagg gcu 23 <210> 202 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 ugaaauugug uuugaucugc aga 23 <210> 203 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 acugaaauug uguuugaucu gca 23 <210> 204 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 aaaaguucaa auauccggaa ccg 23 <210> 205 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 aaagguacuu guuguuuaaa ucu 23 <210> 206 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 aaagguacuu guuguuuaaa ucu 23 <210> 207 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 uuauagugag uuauuuuguc aau 23 <210> 208 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 uuauagugag uuauuuuguc aau 23 <210> 209 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 auuauaguga guuauuuugu caa 23 <210> 210 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 auuauaguga guuauuuugu caa 23 <210> 211 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 aaaaguucaa auauccggaa ccg 23 <210> 212 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 aaaaguucaa auauccggaa ccg 23 <210> 213 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 ugaaauugug uuugaucugc aga 23 <210> 214 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 ugaaauugug uuugaucugc aga 23 <210> 215 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23 <210> 216 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23 <210> 217 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 acugaaauug uguuugaucu gca 23 <210> 218 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 acugaaauug uguuugaucu gca 23 <210> 219 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 219 cacuauaauu acuugauuu 19 <210> 220 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 220 uaacucacua uaauuacuu 19 <210> 221 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 221 acaaaauaac ucacuauaa 19 <210> 222 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 222 uccucuggaa auuggccuu 19 <210> 223 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 223 caaaauaacu cacuauaau 19 <210> 224 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 224 cucuggaaau uggccuuca 19 <210> 225 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 225 gcaagauauu uuuauaaua 19 <210> 226 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 226 aauguuuuug ucaaguaca 19 <210> 227 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 227 uuaaacaaca aguaccuuu 19 <210> 228 <211> 19 <212> RNA <213> Homo 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uuuaucagg 19 <210> 326 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 326 uuuacuaaga uuucuuuuc 19 <210> 327 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 327 aauguuuaua cuuugauaa 19 <210> 328 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 328 accaaauuca guuuguagg 19 <210> 329 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 329 aaugacauau guuugcucc 19 <210> 330 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 330 ugaacuacag uuguuacau 19 <210> 331 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 331 aaauguucca augauuucc 19 <210> 332 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 332 aguaauuuca aaauucuua 19 <210> 333 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 333 aucgaauuca guugcagaa 19 <210> 334 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 334 ugaaauacuc uuuccaagg 19 <210> 335 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 335 guaacuaaau uuuuuauca 19 <210> 336 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 336 uugaaauacu cuuuccaag 19 <210> 337 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 337 aaaucaagua auuauagug 19 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 389 caaaauaacu cacuauaaut t 21 <210> 390 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 390 cucuggaaau uggccuucat t 21 <210> 391 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 391 gcaagauauu uuuauaauat t 21 <210> 392 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 392 aauguuuuug ucaaguacat t 21 <210> 393 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 393 uuaaacaaca aguaccuuut t 21 <210> 394 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 394 ucagaaaguc ugugaaggat t 21 <210> 395 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 395 acugaagcau uugaugcaat t 21 <210> 396 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 396 aguucugugu uaaaauguct t 21 <210> 397 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 446 acaaaauaac ucacuauaat t 21 <210> 447 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 447 uccucuggaa auuggccuut t 21 <210> 448 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 448 caaaauaacu cacuauaaut t 21 <210> 449 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 449 cucuggaaau uggccuucat t 21 <210> 450 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 466 acugaagcau uugaugcaat t 21 <210> 467 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 467 aguucugugu uaaaauguct t 21 <210> 468 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 468 aaaucaagua auuauagugt t 21 <210> 469 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 469 aaguaauuau agugaguuat t 21 <210> 470 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 507 auuauaguga guuauuuugt t 21 <210> 508 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 508 ugaaggccaa uuuccagagt t 21 <210> 509 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 509 uauuauaaaa auaucuugct t 21 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 510 uguacuugac aaaaacauut t 21 <210> 511 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 515 aaaucaagua auuauagugt t 21 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 516 aaguaauuau agugaguuat t 21 <210> 517 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 517 uuauagugag uuauuuugut t 21 <210> 518 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 518 aaggccaauu uccagaggat t 21 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 519 auuauaguga guuauuuugt t 21 <210> 520 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 520 ugaaggccaa uuuccagagt t 21 <210> 521 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 521 uauuauaaaa auaucuugct t 21 <210> 522 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 522 uguacuugac aaaaacauut t 21 <210> 523 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 523 aaagguacuu guuguuuaat t 21 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 524 uccuucacag acuuucugat t 21 <210> 525 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 525 uugcaucaaa ugcuucagut t 21 <210> 526 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 526 gacauuuuaa cacagaacut t 21 <210> 527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 527 aaaucaagua auuauagugt t 21 <210> 528 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 528 aaguaauuau agugaguuat t 21 <210> 529 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 529 uuauagugag uuauuuugut t 21 <210> 530 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 530 aaggccaauu uccagaggat t 21 <210> 531 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 531 auuauaguga guuauuuugt t 21 <210> 532 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 532 ugaaggccaa uuuccagagt t 21 <210> 533 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 533 uauuauaaaa auaucuugct t 21 <210> 534 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 534 uguacuugac aaaaacauut t 21 <210> 535 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 543 auuauaguga guuauuuugt t 21 <210> 544 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 544 ugaaggccaa uuuccagagt t 21 <210> 545 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 545 uauuauaaaa auaucuugct t 21 <210> 546 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 546 uguacuugac aaaaacauut t 21 <210> 547 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 547 aaagguacuu guuguuuaat t 21 <210> 548 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 548 uccuucacag acuuucugat t 21 <210> 549 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 549 uugcaucaaa ugcuucagut t 21 <210> 550 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 550 gacauuuuaa cacagaacut t 21 <210> 551 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 551 gacaaaauaa cucacuauaa u 21 <210> 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acugaaauug uguuugaucu gca 23 <210> 600 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 600 acugaaauug uguuugaucu gca 23 <210> 601 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 601 uauccguggu uuccugcua 19 <210> 602 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 602 gguuuccugc uaccuccaa 19 <210> 603 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 603 ccuccaacca ugggccuuu 19 <210> 604 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 604 gggccuuuug ggaauacuu 19 <210> 605 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 605 ggaauacuuu guuuuuuaa 19 <210> 606 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 606 cuuuguuuuu uaaucuucc 19 <210> 607 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 607 cuuccugggg aaaaccugg 19 <210> 608 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 608 ggaaaaccug gggacagga 19 <210> 609 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 609 gggacaggag caaacauau 19 <210> 610 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 610 caaacauaug ucauuucag 19 <210> 611 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 611 cauuucagca ccaaaaaua 19 <210> 612 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 612 gcaccaaaaa uauuccgug 19 <210> 613 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 613 ccguguugga gcaucugaa 19 <210> 614 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 614 ggagcaucug aaaauauug 19 <210> 615 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 615 gaaaauauug ugauucaag 19 <210> 616 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 616 gauucaaguu uauggauac 19 <210> 617 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 617 ggauacacug aagcauuug 19 <210> 618 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 618 gaagcauuug augcaacaa 19 <210> 619 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 619 ugcaacaauc ucuauuaaa 19 <210> 620 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 620 aaucucuauu aaaaguuau 19 <210> 621 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 621 aaguuauccu gauaaaaaa 19 <210> 622 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 622 cugauaaaaa auuuaguua 19 <210> 623 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 623 uuaguuacuc cucaggcca 19 <210> 624 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 624 ccucaggcca uguucauuu 19 <210> 625 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 625 uucauuuauc cucagagaa 19 <210> 626 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 626 cucagagaau aaauuccaa 19 <210> 627 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 627 aauaaauucc aaaacucug 19 <210> 628 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 628 cucugcaauc uuaacaaua 19 <210> 629 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 629 cuuaacaaua caaccaaaa 19 <210> 630 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 630 caaccaaaac aauugccug 19 <210> 631 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 631 caauugccug gaggacaaa 19 <210> 632 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 632 ggacaaaacc caguuucuu 19 <210> 633 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 633 ccaguuucuu auguguauu 19 <210> 634 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 634 auguguauuu ggaaguugu 19 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acuggucugg aguauaaac 19 <210> 1214 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1214 aacuuuuacu gacuggucu 19 <210> 1215 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1215 auaaacucua acuuuuacu 19 <210> 1216 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1216 cauucaacga auaaacucu 19 <210> 1217 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1217 uucaagucgu cauucaacg 19 <210> 1218 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1218 ucuuuuggcu ggcuucaag 19 <210> 1219 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1219 caguuucucu uuuggcugg 19 <210> 1220 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1220 augaaaguua agacaguuu 19 <210> 1221 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1221 uucaggaucu augaaaguu 19 <210> 1222 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1222 ugauccuuca ggaucuaug 19 <210> 1223 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1223 ugucaacuuc ugauccuuc 19 <210> 1224 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1224 aauuucuucu accauguca 19 <210> 1225 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1842 ggauuuucug aagaggcagt t 21 <210> 1843 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1843 gaagaggcag aaauaccugt t 21 <210> 1844 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1844 agaaauaccu ggcaucaaat t 21 <210> 1845 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1845 gcaucaaaua uguccucuct t 21 <210> 1846 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1994 gcuacacaug aagacccugt t 21 <210> 1995 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1995 caugaagacc cuguuaccat t 21 <210> 1996 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1996 uaccaguaag caagccagat t 21 <210> 1997 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1997 agcaagccag aaauucggat t 21 <210> 1998 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1998 agaaauucgg aguuauuuut t 21 <210> 1999 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1999 aguuauuuuc cagaaagcut t 21 <210> 2000 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2000 cagaaagcug guugugggat t 21 <210> 2001 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2001 gugggaaguu caucuuguut t 21 <210> 2002 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2002 ucaucuuguu cccagaagat t 21 <210> 2003 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2003 ccagaagaaa acaguugcat t 21 <210> 2004 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2004 caguugcagu uugcccuact t 21 <210> 2005 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2005 caguuugccc uaccugauut t 21 <210> 2006 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2006 ccugauucuc uaaccaccut t 21 <210> 2007 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2007 accaccuggg aaauucaagt t 21 <210> 2008 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2008 gaaauucaag gcguuggcat t 21 <210> 2009 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2009 cguuggcauu ucaaacacut t 21 <210> 2010 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2078 ccauuaauug aaaagcagat t 21 <210> 2079 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2079 aaagcagaaa cugaagaaat t 21 <210> 2080 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2080 aacugaagaa aaaauuaaat t 21 <210> 2081 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2081 aaaaaauuaa aagaagggat t 21 <210> 2082 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2082 agggauguug agcauuaugt t 21 <210> 2083 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2083 gagcauuaug uccuacagat t 21 <210> 2084 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2084 uguccuacag aaaugcugat t 21 <210> 2085 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2085 aaugcugacu acucuuacat t 21 <210> 2086 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2086 uacucuuaca guguguggat t 21 <210> 2087 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2087 agugugugga aggguggaat t 21 <210> 2088 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2088 ggguggaagu gcuagcacut t 21 <210> 2089 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2089 gcuagcacuu gguuaacagt t 21 <210> 2090 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2122 acauuggcca uuucugcgut t 21 <210> 2123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2123 cugcguaugc ucuuucccut t 21 <210> 2124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2124 cuuucccugg gagauaaaat t 21 <210> 2125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2125 gagauaaaac ucacccacat t 21 <210> 2126 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2158 ggacaucgau guuucuuact t 21 <210> 2159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2159 cgauguuucu uacaagcaut t 21 <210> 2160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2160 caagcauaaa ggugccuuat t 21 <210> 2161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2161 gugccuuaca uaauuauaat t 21 <210> 2162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2162 acauaauuau aaaaugacat t 21 <210> 2163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2163 aaaaugacag acaagaauut t 21 <210> 2164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2164 caagaauuuc cuugggaggt t 21 <210> 2165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2165 ccuugggagg ccaguagagt t 21 <210> 2166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2166 aguagaggug cuucucaaut t 21 <210> 2167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2167 cuucucaaug augaccucat t 21 <210> 2168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2168 ugaccucauu gucaguacat t 21 <210> 2169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2169 gucaguacag gauuuggcat t 21 <210> 2170 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2238 aggcaacccu ucuggauaut t 21 <210> 2239 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2239 ccuucuggau aucuacaaat t 21 <210> 2240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2240 uaucuacaaa acuggggaat t 21 <210> 2241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2241 cuggggaagc uguugcugat t 21 <210> 2242 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2318 uucagaugcu ccaacacggt t 21 <210> 2319 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2319 caauauuuuc agaugcucct t 21 <210> 2320 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2320 cuugaaucac aauauuuuct t 21 <210> 2321 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2321 guauccauaa acuugaauct t 21 <210> 2322 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2322 caaaugcuuc aguguaucct t 21 <210> 2323 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2323 uuguugcauc aaaugcuuct t 21 <210> 2324 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2324 uuuaauagag auuguugcat t 21 <210> 2325 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2325 auaacuuuua auagagauut t 21 <210> 2326 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2326 uuuuuuauca ggauaacuut t 21 <210> 2327 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2327 uaacuaaauu uuuuaucagt t 21 <210> 2328 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2328 uggccugagg aguaacuaat t 21 <210> 2329 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2329 aaaugaacau ggccugaggt t 21 <210> 2330 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2478 ucaaguaauu auagugagut t 21 <210> 2479 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2479 aucaaguaau uauagugagt t 21 <210> 2480 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2480 aaucaaguaa uuauagugat t 21 <210> 2481 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2481 aaaaucaagu aauuauagut t 21 <210> 2482 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2482 uaaaaucaag uaauuauagt t 21 <210> 2483 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2483 auaaaaucaa guaauuauat t 21 <210> 2484 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2484 gauaaaauca aguaauuaut t 21 <210> 2485 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2485 ggauaaaauc aaguaauuat t 21 <210> 2486 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2486 uggauaaaau caaguaauut t 21 <210> 2487 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2487 uuggauaaaa ucaaguaaut t 21 <210> 2488 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2488 uaauuuugcc cuuggauaat t 21 <210> 2489 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2489 ccaaagugga uaauuuugct t 21 <210> 2490 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2562 ugguaacagg gucuucaugt t 21 <210> 2563 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2563 ucuggcuugc uuacugguat t 21 <210> 2564 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2564 uccgaauuuc uggcuugcut t 21 <210> 2565 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2565 aaaauaacuc cgaauuucut t 21 <210> 2566 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2566 agcuuucugg aaaauaacut t 21 <210> 2567 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2567 ucccacaacc agcuuucugt t 21 <210> 2568 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2568 aacaagauga acuucccact t 21 <210> 2569 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2569 ucuucuggga acaagaugat t 21 <210> 2570 <211> 21 <212> DNA <213> 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Claims (112)

  1. 보체 성분 C5의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제로서,
    상기 dsRNA 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    상기 안티센스 가닥은 5'-UUAUAGUGAGUUAUUUUGUCAAU-3'(SEQ ID NO:105)의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 센스 가닥은 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체인 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되는,
    이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하는, dsRNA 작용제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함하는, dsRNA 작용제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함하는, dsRNA 작용제.
  5. 제2항에 있어서, 상기 변형 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠금(locked) 뉴클레오티드, 무염기(abasic) 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는, dsRNA 작용제.
  6. 제1항에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오티드인, dsRNA 작용제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드로 된 3' 오버행을 포함하거나, 상기 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드로 된 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 작용제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리간드는 상기 dsRNA 작용제의 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 리간드는
    인, dsRNA 작용제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제는 하기의 도식에 나타낸 바와 같이 상기 리간드에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제:

    상기 식에서,
    X는 O 또는 S이다.
  11. 제10항에 있어서, X는 O인, dsRNA 작용제.
  12. 제1항에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 15 내지 30개 뉴클레오티드인, dsRNA 작용제.
  13. 제1항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역은 길이가 15 내지 30개 뉴클레오티드 쌍, 17 내지 23개 뉴클레오티드 쌍, 17 내지 25개 뉴클레오티드 쌍, 23 내지 27개 뉴클레오티드 쌍, 19 내지 21개 뉴클레오티드 쌍, 또는 21 내지 23개 뉴클레오티드 쌍인, dsRNA 작용제.
  14. 제1항에 있어서, 상기 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간(internucleotide) 결합을 추가로 포함하는, dsRNA 작용제.
  15. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 5'-UUAUAGUGAGUUAUUUUGUCAAU-3'(SEQ ID NO:105) 또는 5'-AUUAUAGUGAGUUAUUUUGUCAA-3'(SEQ ID NO:107)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, dsRNA 작용제.
  16. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 5'-UGACAAAAUAACUCACUAUAA-3'(SEQ ID NO:54)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 안티센스 가닥은 5'-UUAUAGUGAGUUAUUUUGUCAAU-3'(SEQ ID NO:105)의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 센스 가닥은 5'-GACAAAAUAACUCACUAUAAU-3'(SEQ ID NO:56)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 안티센스 가닥은 5'-AUUAUAGUGAGUUAUUUUGUCAA-3'(SEQ ID NO:107)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, dsRNA 작용제.
  17. 제1항의 dsRNA 작용제를 함유하는, 세포.
  18. 세포에서의 보체 성분 C5 발현을 억제하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 세포를 제1항의 dsRNA 작용제와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 생성된 세포를 보체 성분 C5 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 상기 세포에서 보체 성분 C5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 치료적 유효량의 제1항의 dsRNA 작용제를 포함하는, 보체 성분 C5-관련 질병을 갖는 피검자를 치료하기 위한 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 피검자는 인간인, 약학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 항-보체 성분 C5 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 투여하기 위한, 약학적 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제의 치료적 유효량이 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 또는 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg인, 약학적 조성물.
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