CN105324485A - 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法 - Google Patents

补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105324485A
CN105324485A CN201480027279.0A CN201480027279A CN105324485A CN 105324485 A CN105324485 A CN 105324485A CN 201480027279 A CN201480027279 A CN 201480027279A CN 105324485 A CN105324485 A CN 105324485A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide
reagent
double
stranded rna
modification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480027279.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105324485B (zh
Inventor
K·菲茨杰拉德
J·巴特勒
B·贝腾考特
A·博罗多夫斯基
S·库奇曼奇
K·查里斯
M·玛诺哈兰
M·迈尔
K·G·雷杰夫
D·福斯特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority to CN202111348463.3A priority Critical patent/CN114015692A/zh
Publication of CN105324485A publication Critical patent/CN105324485A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105324485B publication Critical patent/CN105324485B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

本发明涉及iRNA例如双链核糖核酸(dsRNA)、靶向补体组分C5基因的组合物以及使用此种iRNA(例如dsRNA)、组合物来抑制C5的表达并且治疗患有一种补体组分C5相关联的疾病(例如，阵发性睡眠性血红蛋白尿症)的受试者的方法。

Description

补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法
相关申请
本申请要求于2013年3月14日提交的美国临时专利申请号：61/782,531、于2013年6月20日提交的美国临时专利申请号：61/837,399和于2013年11月15日提交的美国临时专利申请号：61/904,579、于2013年12月6日提交的美国临时专利申请号：61/912,777以及2014年2月20日提交的美国临时专利申请号：61/942367的权益。将前述临时专利申请每一者的全部内容特此通过引用结合在此。
序列表
本申请包含已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此通过引用以其全文结合的序列表。创建于2014年3月10日的所述ASCII副本被命名为121301-00520_SL.txt并且大小为734,486个字节。
发明背景
在19世纪90年代，当发现补体通过存在于正常血清中的热稳定性抗体帮助或“补充”杀死细菌时，首次发现了补体(沃尔波特(Walport),M.J.(2001)新英格兰医学杂志(NEnglJMed.)344:1058)。补体系统由多于30种蛋白质组成，这些蛋白质或者作为可溶性蛋白存在于血液中或者作为膜相关蛋白存在。补体的激活引起依序的酶促反应级联(称为补体激活途径)，从而导致有效的过敏毒素C3a和C5a的形成，这些过敏毒素诱发从化学吸引到细胞凋亡范围内的多种生理学反应。最初，补体被认为在先天免疫方面起主要作用，其中对抗入侵病原体发动有力和快速的反应。然而，最近越发明显的是，补体还在适应性免疫方面起重要作用，该适应性免疫涉及帮助消除病原体(邓克尔伯格(Dunkelberger)JR和宋(Song)WC.(2010)细胞研究(CellRes.)20:34；莫利纳(Molina)H等人(1996)美国国家科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA.)93:3357)、帮助维持防止病原性再入侵的免疫记忆T细胞和B细胞，并且补体涉及许多人体病理学病况(曲(Qu)H等人(2009)分子免疫学(MolImmunol.)47:185；瓦格纳(Wagner)E.和法兰克(Frank)MM.(2010)自然评论：药物发现(NatRevDrugDiscov.)9:43)。
已知补体激活通过三种不同途径发生：旁路途径、经典途径和凝集素途径(图1)，涉及主要作为非活性酶原存在的蛋白质，然后这些非活性酶原依序地裂解并且激活。补体激活的所有途径均引起C5分子的裂解，从而产生过敏毒素C5a和随后形成末端补体复合体(C5b-9)的C5b。C5a通过与经典G蛋白偶联受体C5aR(CD88)以及与表达在不同免疫细胞和非免疫细胞上的非G蛋白偶联受体C5L2(GPR77)相互作用来发挥主要的促炎性活性。C5b-9通过形成膜攻击复合体(MAC)来引起细胞溶解，并且亚溶解型MAC和可溶性C5b-9还具有众多的非细胞溶解免疫功能。从C5裂解产生的这两种补体效应子C5a和C5b-9是在不同疾病中负责传播和/或启动病理学的补体系统的关键组分，这些疾病包括阵发性睡眠性血红蛋白尿症、类风湿性关节炎、缺血-再灌注损伤以及神经变性疾病。
迄今为止，仅有一种靶向C5-C5a轴线的治疗剂可供用于治疗补体组分C5相关联的疾病，抗C5抗体依库珠单抗(eculizumab)虽然已经显示依库珠单抗有效用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)，并且针对另外的补体组分C5相关联的疾病当前正进行临床试验评估，但是依库珠单抗疗法要求年花费约$400,000的每周高剂量的输注，接着是每两周的维持输注。因此，在本领域中存在对患有补体组分C5相关联的疾病的受试者进行替代疗法和联合疗法的需要。
发明概述
本发明提供了iRNA组合物，这些iRNA组合物影响C5基因的RNA转录物的RNA诱导沉默复合体(RISC)介导的裂解。该C5基因可以是在一种细胞内，例如在一个受试者如人内的一种细胞。本发明还提供了用于治疗患有将受益于抑制或减少C5基因的表达的病症的受试者的方法和联合疗法，该病症例如补体组分C5相关联的疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)，这些方法和联合疗法使用影响C5基因的RNA转录物的RNA诱导沉默复合体(RISC)介导的裂解的iRNA组合物来抑制C5基因的表达。
因此，一方面，本发明提供了一种用于抑制补体组分C5的表达的双链核糖核酸(dsRNA)试剂，其中该dsRNA包含一个有义链和一个反义链，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
另一方面，本发明提供了一种用于抑制补体组分C5的表达的双链核糖核酸(dsRNA)试剂，其中该dsRNA包含一个有义链和一个反义链，该反义链包含一个互补区，该互补区包含与表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中列出的任一个反义序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
在一个实施例中，这些有义链和反义链包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：A-118320、A-118321、A-118316、A-118317、A-118332、A-118333、A-118396、A-118397、A-118386、A-118387、A-118312、A-118313、A-118324、A-118325、A-119324、A-119325、A-119332、A-119333、A-119328、A-119329、A-119322、A-119323、A-119324、A-119325、A-119334、A-119335、A-119330、A-119331、A-119326、A-119327、A-125167、A-125173、A-125647、A-125157、A-125173和A-125127。在另一个实施例中，这些有义链和反义链包含选自下组的序列，该组由表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中的任何序列组成。在一个实施例中，该dsRNA试剂包含至少一个修饰的核苷酸。
一方面，本发明提供了一种用于抑制补体组分C5的表达的双链核糖核酸(dsRNA)试剂，其中该dsRNA试剂包含一个有义链和一个反义链，其中该有义链包含核苷酸序列AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA(SEQIDNO:62)，并且其中该反义链包含核苷酸序列UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUU(SEQIDNO:113)。在一个实施例中，该dsRNA试剂包含至少一个修饰的核苷酸，如下所述。
一方面，本发明提供了一种用于抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一个有义链和一个反义链，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该有义链的基本上所有的核苷酸和该反义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸，并且其中该有义链被缀合到附接在3'-末端处的一个配体上。
在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均包含一种修饰。
在一个实施例中，该有义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3’-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸。在另一个实施例中，该反义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3’-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸。在另一个实施例中，这些修饰的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸的短序列。在另一个实施例中，该有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在又另一个实施例中，该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。
在一个实施例中，这些修饰的核苷酸中的至少一个是选自下组，该组由以下各项组成：3’-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁定核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含核苷酸的非天然碱基、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸。
在另一个实施例中，这些修饰的核苷酸包含3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸的短序列。
在一个实施例中，该互补区的长度是至少17个核苷酸。在另一个实施例中，该互补区的长度是在19个与21个核苷酸之间。
在一个实施例中，该互补区的长度是19个核苷酸。
在一个实施例中，每个链的长度是不多于30个核苷酸。
在一个实施例中，至少一个链包含具有至少1个核苷酸的3'突出端。在另一个实施例中，至少一个链包含具有至少2个核苷酸的3'突出端。
在一个实施例中，该dsRNA试剂进一步包含一个配体。
在一个实施例中，该配体被缀合到该dsRNA试剂的该有义链的3'端上。
在一个实施例中，该配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。在一个实施例中，该配体是
在一个实施例中，该dsRNA试剂被缀合到以下示意图中所示的配体上，
并且其中X是O或S。
在一个实施例中，该X是O。
在一个实施例中，该互补区由表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个的反义序列中的一个组成。
在一个实施例中，该dsRNA试剂是选自下组，该组由以下各项组成：AD-58123、AD-58111、AD-58121、AD-58116、AD-58133、AD-58099、AD-58088、AD-58642、AD-58644、AD-58641、AD-58647、AD-58645、AD-58643、AD-58646、AD-62510、AD-62643、AD-62645、AD-62646、AD-62650和AD-62651。
另一方面，本发明提供了一种用于抑制补体组分C5的表达的双链核糖核酸(dsRNA)试剂，其中该dsRNA试剂包含一个有义链和一个反义链，其中该有义链包含核苷酸序列AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA(SEQIDNO:62)，并且其中该反义链包含核苷酸序列UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUUdTdT(SEQIDNO:2899)。
另一方面，本发明提供了一种用于抑制补体组分C5的表达的双链核糖核酸(dsRNA)试剂，其中该dsRNA试剂包含一个有义链和一个反义链，其中该有义链包含核苷酸序列asasGfcAfaGfaUfAfUfuUfuuAfuAfauaL96(SEQIDNO:2876)，并且其中该反义链包含核苷酸序列usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuGfcuususudTdT(SEQIDNO:2889)。
一方面，本发明提供了一种能够在细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中该反义链包含与编码C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
各np、np'、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、np'、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
在一个实施例中，i是0；j是0；i是1；j是1；i和j这两者均是0；或i和j这两者均是1。
在一个实施例中，k是0；l是0；k是1；l是1；k和l这两者均是0；或k和l这两者均是1。
在一个实施例中，XXX与X'X'X'互补，YYY与Y'Y'Y'互补，并且ZZZ与Z'Z'Z'互补。
在一个实施例中，该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。
在一个实施例中，该Y'Y'Y'基序出现在从5'-端起该反义链的11、12和13位置处。
在一个实施例中，该Y'是2'-O-甲基。
在一个实施例中，式(III)由式(IIIa)表示：
有义：5'np-Na-YYY-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5'(IIIa)。
在另一个实施例中，式(III)由式(IIIb)表示：
有义：5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq'5'(IIIb)
其中各Nb和Nb'独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在又另一个实施例中，式(III)由式(IIIc)表示：
有义：5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5'(IIIc)
其中各Nb和Nb'独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在另一个实施例中，式(III)由式(IIId)表示：
有义：5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq'5'(IIId)
其中各Nb和Nb'独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，并且各Na和Na'独立地表示包含2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施例中，该双链区的长度是15-30个核苷酸对。
在一个实施例中，该双链区的长度是17-23个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区的长度是17-25个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区的长度是23-27个核苷酸对。在又另一个实施例中，该双链区的长度是19-21个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区的长度是21-23个核苷酸对。
在一个实施例中，每个链具有15-30个核苷酸。
在一个实施例中，在这些核苷酸上的这些修饰是选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟代、2'-脱氧、2'-羟基以及其组合。
在一个实施例中，在这些核苷酸上的这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰。
在一个实施例中，该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
在一个实施例中，该配体是
在一个实施例中，该配体被附接到该有义链的3'端上。
在一个实施例中，该RNAi剂被缀合到以下示意图中所示的配体上
在一个实施例中，该试剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。
在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一个链的3'-末端处。
在一个实施例中，该链是该反义链。在另一个实施例中，该链是该有义链。
在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一个链的5'-末端处。
在一个实施例中，该链是该反义链。在另一个实施例中，该链是该有义链。
在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一个链的5'-末端和3'-末端这两者处。
在一个实施例中，该链是该反义链。
在一个实施例中，在该双链体的该反义链的5’-端的1位置处的碱基对是AU碱基对。
在一个实施例中，这些Y核苷酸包含一种2'-氟代修饰。
在一个实施例中，这些Y'核苷酸包含一种2'-O-甲基修饰。
在一个实施例中，p'>0。
在一个实施例中，p'＝2。
在一个实施例中，q’＝0，p＝0，q＝0，并且p’突出端核苷酸与靶mRNA互补。
在一个实施例中，q’＝0，p＝0，q＝0，并且p’突出端核苷酸与靶mRNA不互补。
在一个实施例中，该有义链具有总共21个核苷酸，并且该反义链具有总共23个核苷酸。
在一个实施例中，至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上。
在一个实施例中，所有np'均通过硫代磷酸酯键联被连接到相邻核苷酸上。
在一个实施例中，该RNAi试剂是选自在表4、表18、表19或表23中列出的RNAi试剂的组。在另一个实施例中，该RNAi试剂是选自下组，该组由以下各项组成：AD-58123、AD-58111、AD-58121、AD-58116、AD-58133、AD-58099、AD-58088、AD-58642、AD-58644、AD-58641、AD-58647、AD-58645、AD-58643、AD-58646、AD-62510、AD-62643、AD-62645、AD-62646、AD-62650和AD-62651。
一方面，本发明提供了一种能够在细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
各np、np'、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、np'、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
另一方面，本发明提供了一种能够在细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
各np、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
p、q和q'各自独立地是0-6；
np'>0并且至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
另一方面，本发明提供了一种能够在细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
各np、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
p、q和q'各自独立地是0-6；
np'>0并且至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
在又另一个方面中，本发明提供了一种能够在细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k–Nb'-Y'Y'Y'-Νb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
各np、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
p、q和q'各自独立地是0-6；
np'>0并且至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；
其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
另一方面，本发明提供了一种能够在细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-YYY-Na-nq3’
反义：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5’(IIIa)
其中：
各np、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
p、q和q'各自独立地是0-6；
np'>0并且至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
YYY和Y'Y'Y'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
一方面，本发明提供了一种用于抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一个有义链和一个反义链，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该有义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中该反义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该反义链包含在5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且其中该有义链被缀合到通过一个支链二价或三价接头附接在3’-末端处的一种或多种GalNAc衍生物上。
在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。在另一个实施例中，每个链具有19-30个核苷酸。
一方面，本发明提供了一种含有本发明的dsRNA试剂的细胞。
一方面，本发明提供了一种编码dsRNA试剂的至少一个链的载体，其中该dsRNA试剂包含与编码补体组分C5的mRNA的至少一部分互补的一个区，其中该dsRNA的长度是30个碱基对或更少，并且其中该dsRNA试剂靶向该mRNA用于裂解。
在一个实施例中，该互补区的长度是至少15个核苷酸。在另一个实施例中，该互补区的长度是19至21个核苷酸。在另一个实施例中，每个链具有19-30个核苷酸。
一方面，本发明提供了一种包含本发明的载体的细胞。
一方面，本发明提供了一种用于抑制补体组分C5基因的表达的药物组合物，该药物组合物包含本发明的dsRNA试剂。
在一个实施例中，以一种无缓冲的溶液给予该RNAi试剂。
在一个实施例中，该无缓冲的溶液是盐水或水。
在一个实施例中，与一种缓冲溶液一起给予该RNAi试剂。
在一个实施例中，该缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。
在另一个实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。
另一方面，本发明提供了一种包含本发明的双链RNAi试剂和脂质配制品的药物组合物。
在一个实施例中，该脂质配制品包含LNP。在另一个实施例中，该脂质配制品包含MC3。
一方面，本发明提供了一种包含选自下组的反义多核苷酸试剂的组合物，该组由表3、表4、表5、表6、表19、表18、表20、表21和表23中的任一个中列出的序列组成。
另一方面，本发明提供了一种包含选自下组的有义多核苷酸试剂的组合物，该组由表3、表4、表5、表6、表19、表18、表20、表21和表23中的任一个中列出的序列组成。
在又另一个方面中，本发明提供了一种选自下组的修饰的反义多核苷酸试剂，该组由表4、表6、表18、表19、表21和表23中的任一个中列出的反义序列组成。
在一个另外的方面中，本发明提供了一种选自下组的修饰的有义多核苷酸试剂，该组由表4、表6、表18、表19、表21和表23中的任一个中列出的有义序列组成。
一方面，本发明提供了治疗患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂，从而治疗该患者，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
另一方面，本发明提供了在患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者中预防至少一种症状的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂，从而在患有将受益于C5表达减少的病症的该受试者中预防至少一种症状，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
另一方面，本发明提供了治疗患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂，从而治疗该受试者，该反义链包含一个互补区，该互补区包含与表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21、表23中的任一个中列出的任一个反义序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
在又另一个方面中，本发明提供了在患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者中预防至少一种症状的方法。这些方法包括向该受试者给予预防有效量的包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂，从而在患有将受益于C5表达减少的病症的该受试者中预防至少一种症状，该反义链包含一个互补区，该互补区包含与表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中列出的任一个反义序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
一方面，本发明提供了治疗患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者的方法，这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一个有义链和一个反义链，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该反义链的基本上所有的核苷酸和该有义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸，并且其中该有义链被缀合到3'-末端处的一个或多个配体上。
在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该给予是皮下给予。
在一个实施例中，该有义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3'-末端dT核苷酸。在另一个实施例中，该反义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3’-末端dT核苷酸。在另一个实施例中，这些修饰的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸的短序列。在另一个实施例中，该有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在又另一个实施例中，该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。
另一方面，本发明提供了在患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者中预防至少一种症状的方法，这些方法包括向该受试者给予预防有效量的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一个有义链和一个反义链，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该反义链的基本上所有的核苷酸和该有义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸，并且其中该有义链被缀合到3'-末端处的一个配体上。
在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该给予是皮下给予。
在一个实施例中，该有义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3'-末端dT核苷酸。在另一个实施例中，该反义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3’-末端dT核苷酸。在另一个实施例中，这些修饰的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸的短序列。在另一个实施例中，该有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在又另一个实施例中，该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。
一方面，本发明提供了治疗患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的包含与一个反义链互补的一个有义链的dsRNA试剂，从而治疗该受试者，从而治疗患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者，其中该反义链包含与编码C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k–Nb'-Y'Y'Y'-Νb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
各np、np'、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、np'、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
另一方面，本发明提供了在患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者中预防至少一种症状的方法。这些方法包括向该受试者给予预防有效量的包含与一个反义链互补的一个有义链的dsRNA试剂，从而在患有将受益于C5表达减少的病症的该受试者中预防至少一种症状，从而在患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者中预防至少一种症状，其中该反义链包含与编码C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k–Nb'-Y'Y'Y'-Νb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
各np、np'、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、np'、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
在一个实施例中，向该受试者给予该dsRNA引起血管内溶血减少、血红蛋白水平稳定和/或C5蛋白累积减少。
在一个实施例中，该病症是一种补体组分C5相关联的疾病。在一个实施例中，该补体组分C5相关联的疾病是选自下组，该组由以下各项组成：阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、哮喘、类风湿性关节炎(RA)；抗磷脂抗体综合征；狼疮肾炎；缺血-再灌注损伤；典型的或感染性溶血性尿毒症综合征(tHUS)；致密沉积物病(DDD)；视神经脊髓炎(NMO)；多灶性运动神经病(MMN)；多发性硬化(MS)；黄斑变性(例如，年龄相关的黄斑变性(AMD))；溶血、肝脏酶升高以及血小板低(HELLP)综合征；血栓性血小板减少性紫癜(TTP)；自发性流产；寡免疫血管炎；大疱性表皮松解症；习惯性流产；先兆子痫、创伤性脑损伤、重症肌无力、冷凝集素病、皮肌炎大疱性类天疱疮、志贺毒素(Shigatoxin)大肠杆菌(E.coli)相关的溶血性尿毒症综合征、C3肾病、抗嗜中性粒细胞细胞质抗体相关联的血管炎、体液和血管移植排斥、移植物功能异常、心肌梗塞、异源移植、脓毒症、冠状动脉病、皮肌炎、格雷夫斯病、动脉粥样硬化、阿耳茨海默氏病、全身性炎症反应脓毒症、脓毒性休克、脊髓损伤、肾小球性肾炎、桥本氏甲状腺炎、I型糖尿病、牛皮癣、天疱疮、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、ITP、肺出血肾炎综合征、德戈斯病、抗磷脂综合征(APS)、灾难性APS(CAPS)、心血管病症、心肌炎、脑血管疾病、外周血管疾病、肾血管疾病、肠系膜/肠血管疾病、血管炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎、全身性红斑狼疮相关联的血管炎、与类风湿性关节炎相关联的血管炎、免疫复合物血管炎、高安氏病、扩张性心肌病、糖尿病性血管病、川畸氏病(动脉炎)、静脉气体栓子(VGE)以及支架放置、旋转式动脉粥样斑块去除术、膜性肾病、格-巴二氏综合征和经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄。在另一个实施例中，该补体组分C5相关联的疾病是阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。在又另一个实施例中，该补体组分C5相关联的疾病是非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)。
在一个实施例中，该受试者是人。
在另一个实施例中，本发明的这些方法进一步包括向该受试者给予一种抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段抑制补体组分C5裂解成片段C5a和C5b。在另一个实施例中，该抗补体组分C5抗体是依库珠单抗。
在另一个实施例中，本发明的这些方法进一步包括向该受试者给予一种脑膜炎球菌疫苗。
在一个实施例中，以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约900mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约900mg的剂量给予。
在另一个实施例中，以小于约900mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约1200mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约1200mg的剂量给予。
在一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且
以小于约900mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约1200mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约1200mg的剂量给予。
在另一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续2周，接着在约一周以后以小于约900mg的第三剂量给予，接着此后约每两周以小于约900mg的剂量给予。
在另一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续2周，接着在约一周以后以小于约600mg的第三剂量给予，接着此后约每两周以小于约600mg的剂量给予。
在又另一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续1周，接着在约一周以后以小于约300mg的第二剂量给予，接着此后约每两周以小于约300mg的剂量给予。
在一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约300mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续1周，接着在约一周以后以小于约300mg的第二剂量给予，接着此后约每两周以小于约300mg的剂量给予。
在另一个实施例中，本发明的这些方法进一步包括在该受试者中进行血浆去除术或血浆交换。在一个这样的实施例中，以小于约600mg的剂量或以小于约300mg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。
在一个另外的实施例中，本发明的这些方法进一步包括在该受试者中进行血浆输注。在一个这样的实施例中，以小于约300mg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。
在一个实施例中，以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约15mg/kg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。在另一个实施例中，以约5mg/kg至约15mg/kg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。
在一个实施例中，以选自下组的剂量向该受试者给予依库珠单抗，该组由以下各项组成：0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg和15mg/kg。
在一个实施例中，通过一种静脉内输注向该受试者给予依库珠单抗。
在另一个实施例中，向该受试者皮下给予依库珠单抗。
在一个实施例中，以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予该dsRNA试剂。
在另一个实施例中，以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予dsRNA试剂。
在一个实施例中，以选自下组的剂量给予该dsRNA试剂，该组由以下各项组成：0.5mg/kg1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和30mg/kg。
在一个实施例中，每周一次向该受试者给予该dsRNA试剂。在另一个实施例中，每周两次向该受试者给予该dsRNA试剂。在另一个实施例中，每个月两次向该受试者给予该dsRNA试剂。
在一个实施例中，向该受试者皮下给予该dsRNA试剂。
在一个实施例中，向该受试者皮下给予该dsRNA试剂和该依库珠单抗。在另一个实施例中，向该受试者同时给予该dsRNA试剂和该依库珠单抗。
在一个实施例中，首先向该受试者给予该dsRNA试剂持续足以降低该受试者中的补体组分C5水平的一段时间，并且随后以小于约600mg的剂量给予依库珠单抗。
在一个实施例中，该受试者中的补体组分C5水平降低至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。
在一个实施例中，以约100-500mg的剂量给予依库珠单抗。
在一个实施例中，本发明的这些方法进一步包括测量该受试者中的血红蛋白和/或LDH水平。
在一个实施例中，该dsRNA被缀合到一个配体上。
在一个实施例中，该配体被缀合到该dsRNA的该有义链的3'-端上。
在一个实施例中，该配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
一方面，本发明提供了在细胞中抑制补体组分C5表达的方法。这些方法包括使该细胞与包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂接触，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸；并且使在步骤(a)中产生的该细胞维持足以获得C5基因的mRNA转录物降解的时间，从而在该细胞中抑制该C5基因的表达。
另一方面，本发明提供了在细胞中抑制补体组分C5表达的方法。这些方法包括使该细胞与包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂接触，该反义链包含一个互补区，该互补区包含与表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中列出的任一个反义序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸；并且使在步骤(a)中产生的该细胞维持足以获得C5基因的mRNA转录物降解的时间，从而在该细胞中抑制该C5基因的表达。
另一方面，本发明提供了在细胞中抑制补体组分C5表达的方法，该方法包括使该细胞与包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂接触，该反义链包含一个互补区，该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该反义链的基本上所有的核苷酸和该有义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸，并且其中该有义链被缀合到3'-末端处的一个或多个配体上；并且使在第一步中产生的该细胞维持足以获得C5基因的mRNA转录物降解的时间，从而在该细胞中抑制该C5基因的表达。
在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该有义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3'-末端dT核苷酸。在另一个实施例中，该反义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3’-末端dT核苷酸。在另一个实施例中，这些修饰的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸的短序列。在另一个实施例中，该有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在又另一个实施例中，该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。
在又另一个方面中，本发明提供了在细胞中抑制补体组分C5表达的方法。这些方法包括使该细胞与dsRNA试剂接触，该dsRNA试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中该反义链包含与编码C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k–Nb'-Y'Y'Y'-Νb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；各np、np'、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、np'、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上；并且使在步骤(a)中产生的该细胞维持足以获得C5基因的mRNA转录物降解的时间，从而在该细胞中抑制该C5基因的表达。
在一个实施例中，该细胞是在一个受试者内。
在一个实施例中，该受试者是人。
在一个实施例中，该人受试者遭受一种补体组分C5相关联的疾病。
在一个实施例中，该补体组分C5相关联的疾病是选自下组，该组由以下各项组成：阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、哮喘、类风湿性关节炎(RA)；抗磷脂抗体综合征；狼疮肾炎；缺血-再灌注损伤；典型的或感染性溶血性尿毒症综合征(tHUS)；致密沉积物病(DDD)；视神经脊髓炎(NMO)；多灶性运动神经病(MMN)；多发性硬化(MS)；黄斑变性(例如，年龄相关的黄斑变性(AMD))；溶血、肝脏酶升高以及血小板低(HELLP)综合征；血栓性血小板减少性紫癜(TTP)；自发性流产；寡免疫血管炎；大疱性表皮松解症；习惯性流产；先兆子痫、创伤性脑损伤、重症肌无力、冷凝集素病、皮肌炎大疱性类天疱疮、志贺毒素(Shigatoxin)大肠杆菌(E.coli)相关的溶血性尿毒症综合征、C3肾病、抗嗜中性粒细胞细胞质抗体相关联的血管炎、体液和血管移植排斥、移植物功能异常、心肌梗塞、异源移植、脓毒症、冠状动脉病、皮肌炎、格雷夫斯病、动脉粥样硬化、阿耳茨海默氏病、全身性炎症反应脓毒症、脓毒性休克、脊髓损伤、肾小球性肾炎、桥本氏甲状腺炎、I型糖尿病、牛皮癣、天疱疮、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、ITP、肺出血肾炎综合征、德戈斯病、抗磷脂综合征(APS)、灾难性APS(CAPS)、心血管病症、心肌炎、脑血管疾病、外周血管疾病、肾血管疾病、肠系膜/肠血管疾病、血管炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎、全身性红斑狼疮相关联的血管炎、与类风湿性关节炎相关联的血管炎、免疫复合物血管炎、高安氏病、扩张性心肌病、糖尿病性血管病、川畸氏病(动脉炎)、静脉气体栓子(VGE)以及支架放置、旋转式动脉粥样斑块去除术、膜性肾病、格-巴二氏综合征和经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄。在另一个实施例中，该补体组分C5相关联的疾病是阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。在另一个实施例中，该补体组分C5相关联的疾病是非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)。
在一个实施例中，这些方法进一步包括使该细胞与一种抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段接触。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段抑制补体组分C5裂解成片段C5a和C5b。
在一个实施例中，该抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段是依库珠单抗。
在一个实施例中，这些方法进一步包括使该细胞与一种脑膜炎球菌疫苗接触。
在一个实施例中，以小于约600mg的剂量每周使该细胞与依库珠单抗接触，持续4周，接着在约一周以后以小于约900mg的第五剂量接触，接着此后约每两周以小于约900mg的剂量接触。
在另一个实施例中，以小于约900mg的剂量每周使该细胞与依库珠单抗接触，持续4周，接着在约一周以后以小于约1200mg的第五剂量接触，接着此后约每两周以小于约1200mg的剂量接触。
在另一个实施例中，以小于约900mg的剂量每周使该细胞与依库珠单抗接触，持续4周，接着在约一周以后以小于约1200mg的第五剂量接触，接着此后约每两周以小于约1200mg的剂量接触。
在又另一个实施例中，以小于约600mg的剂量每周使该细胞与依库珠单抗接触，持续2周，接着在约一周以后以小于约900mg的第三剂量接触，接着此后约每两周以小于约900mg的剂量接触。
在一个实施例中，以小于约600mg的剂量每周使该细胞与依库珠单抗接触，持续2周，接着在约一周以后以小于约600mg的第三剂量接触，接着此后约每两周以小于约600mg的剂量接触。
在另一个实施例中，以小于约600mg的剂量每周使该细胞与依库珠单抗接触，持续1周，接着在约一周以后以小于约300mg的第二剂量接触，接着此后约每两周以小于约300mg的剂量接触。
在一个实施例中，以小于约300mg的剂量每周使该细胞与依库珠单抗接触，持续1周，接着在约一周以后以小于约300mg的第二剂量接触，接着此后约每两周以小于约300mg的剂量接触。
在一个实施例中，该细胞在受试者体内。
在一个实施例中，本发明的这些方法进一步包括在该受试者中进行血浆去除术或血浆交换。在一个实施例中，以小于约600mg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。在另一个实施例中，以小于约300mg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。
在一个实施例中，本发明的这些方法进一步包括在该受试者中进行血浆输注。在一个实施例中，以小于约300mg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。
在一个实施例中，以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约15mg/kg的剂量使该细胞与依库珠单抗接触。
在另一个实施例中，以约5mg/kg至约15mg/kg的剂量使该细胞与依库珠单抗接触。
在一个实施例中，以选自下组的剂量使该细胞与依库珠单抗接触，该组由以下各项组成：0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg和15mg/kg。
在一个实施例中，通过一种静脉内输注向该受试者给予依库珠单抗。在另一个实施例中，向该受试者皮下给予依库珠单抗。
在一个实施例中，以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量使该细胞与该dsRNA试剂接触。
在另一个实施例中，以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量使该细胞与该dsRNA试剂接触。
在一个实施例中，以选自下组的剂量使该细胞与该dsRNA试剂接触，该组由以下各项组成：0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和30mg/kg。
在一个实施例中，每周一次使该细胞与该dsRNA试剂接触。在另一个实施例中，每周两次向该受试者给予该dsRNA试剂。在另一个实施例中，每个月两次使该细胞与该dsRNA试剂接触。
在一个实施例中，向该受试者皮下给予该dsRNA试剂。
在一个实施例中，向该受试者皮下给予该dsRNA试剂和该依库珠单抗。在另一个实施例中，向该受试者同时给予该dsRNA试剂和该依库珠单抗。
在一个实施例中，使该细胞同时与该dsRNA试剂和该依库珠单抗接触。
在一个实施例中，首先向该受试者给予该dsRNA试剂持续足以降低该受试者中的补体组分C5水平的一段时间，并且随后以小于约600mg的剂量给予依库珠单抗。
在一个实施例中，该受试者中的补体组分C5水平降低至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。
在一个实施例中，以约100-500mg的剂量给予依库珠单抗。
在一个实施例中，首先使该细胞与该dsRNA试剂接触持续足以降低该细胞中的补体组分C5水平的一段时间，并且随后以小于约600mg的剂量使该细胞与依库珠单抗接触。
在一个实施例中，该细胞中的补体组分C5水平降低至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。
在一个实施例中，以约100-500mg的剂量使该细胞与依库珠单抗接触。
一方面，本发明提供了在受试者中抑制C5表达的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂，从而在该受试者中抑制C5的表达，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
另一方面，本发明提供了在受试者中抑制C5表达的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的包含一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂，从而在该受试者中抑制C5的表达，该反义链包含一个互补区，该互补区包含与表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中列出的任一个反义序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
另一方面，本发明提供了在受试者中抑制补体组分C5表达的方法，这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的包含形成一个双链区的一个有义链和一个反义链的dsRNA试剂，从而在该受试者中抑制C5基因的表达，其中该有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该反义链的基本上所有的核苷酸和该有义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸，并且其中该有义链被缀合到3'-末端处的一个或多个配体上。
在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该给予是皮下给予。
在一个实施例中，该有义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3'-末端dT核苷酸。在另一个实施例中，该反义链的基本上所有的核苷酸是选自下组的修饰的核苷酸，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰、2'-氟代修饰和3’-末端dT核苷酸。在另一个实施例中，这些修饰的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸的短序列。在另一个实施例中，该有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在又另一个实施例中，该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。
另一方面，本发明提供了在受试者中抑制C5表达的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的包含与一个反义链互补的一个有义链的dsRNA试剂，从而在该受试者中抑制C5的表达，其中该反义链包含与编码C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k–Nb'-Y'Y'Y'-Νb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
各np、np'、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、np'、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
在一个实施例中，这些方法进一步包括向该受试者给予一种抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，该抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段是依库珠单抗。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段抑制补体组分C5裂解成片段C5a和C5b。
在一个实施例中，本发明的这些方法进一步包括向该受试者给予一种脑膜炎球菌疫苗。
在一个实施例中，以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约900mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约900mg的剂量给予。
在另一个实施例中，以小于约900mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约1200mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约1200mg的剂量给予。
在一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约900mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约1200mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约1200mg的剂量给予。
在另一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续2周，接着在约一周以后以小于约900mg的第三剂量给予，接着此后约每两周以小于约900mg的剂量给予。
在一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续2周，接着在约一周以后以小于约600mg的第三剂量给予，接着此后约每两周以小于约600mg的剂量给予。
在另一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续1周，接着在约一周以后以小于约300mg的第二剂量给予，接着此后约每两周以小于约300mg的剂量给予。
在又另一个实施例中，该受试者的年龄是小于18岁，并且以小于约300mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续1周，接着在约一周以后以小于约300mg的第二剂量给予，接着此后约每两周以小于约300mg的剂量给予。
在一个实施例中，这些方法进一步包括在该受试者中进行血浆去除术或血浆交换。在一个实施例中，以小于约600mg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。在另一个实施例中，以小于约300mg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。
在一个实施例中，这些方法进一步包括在该受试者中进行血浆输注。在一个实施例中，以小于约300mg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。
在一个实施例中，以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约15mg/kg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。在另一个实施例中，以约5mg/kg至约15mg/kg的剂量向该受试者给予依库珠单抗。
在另一个实施例中，以选自下组的剂量向该受试者给予依库珠单抗，该组由以下各项组成：0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg和30mg/kg。
在一个实施例中，通过一种静脉内输注向该受试者给予依库珠单抗。在另一个实施例中，向该受试者皮下给予依库珠单抗。
在一个实施例中，以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约15mg/kg的剂量给予该dsRNA试剂。
在一个实施例中，以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予该dsRNA试剂。在另一个实施例中，以选自下组的剂量给予该dsRNA试剂，该组由以下各项组成：0.5mg/kg1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和30mg/kg。
在一个实施例中，每周一次向该受试者给予该dsRNA试剂。在另一个实施例中，每周两次向该受试者给予该dsRNA试剂。在另一个实施例中，每个月两次向该受试者给予该dsRNA试剂。
在一个实施例中，向该受试者皮下给予该dsRNA试剂。
在一个实施例中，向该受试者皮下给予该dsRNA试剂和该依库珠单抗。在另一个实施例中，向该受试者同时给予该dsRNA试剂和该依库珠单抗。
在一个实施例中，首先向该受试者给予该dsRNA试剂持续足以降低该受试者中的补体组分C5水平的一段时间，并且随后以小于约600mg的剂量给予依库珠单抗。
在一个实施例中，该受试者中的补体组分C5水平降低至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。
在一个实施例中，以约100-500mg的剂量给予依库珠单抗。
在一个实施例中，该dsRNA试剂被缀合到一个配体上。
在一个实施例中，该配体被缀合到该dsRNA试剂的该有义链的3'-端上。
在一个实施例中，该配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
附图简要说明
图1是三种补体途径：旁路途径、经典途径和凝集素途径的示意图。
图2是示出在单次10mg/kg剂量的指定iRNA之后余留在C57BL/6小鼠中的补体组分C5的百分比的图。
图3是示出在单次10mg/kg剂量的指定iRNA之后余留在C57BL/6小鼠中的补体组分C5的百分比的图。
图4是示出在单次10mg/kg剂量的指定iRNA之后48小时余留在C57BL/6小鼠中的补体组分C5的百分比的图。
图5A是示出在单次2.5mg/kg、10mg/kg或25mg/kg皮下剂量的AD-58642之后在第4天和第7天余留在大鼠中的溶血百分比的图。
图5B是示出在单次2.5mg/kg、10mg/kg或25mg/kg皮下剂量的AD-58642之后在第7天余留在大鼠中的补体组分C5的量的蛋白质印迹。
图6A和图6B是示出在单次1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或25mg/kg剂量的AD-58642之后5天余留在C57BL/6小鼠中的补体组分C5的百分比的图。
图7A和图7B是示出在单次1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或25mg/kg剂量的AD-58642之后在第5天余留在C57BL/6小鼠中的溶血百分比的图。
图8是示出在单次1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或25mg/kg剂量的AD-58642之后在第5天余留在C57BL/6小鼠中的补体组分C5的量的蛋白质印迹。
图9是示出在单次0.625mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg剂量的AD-58641之后在第5天和第9天余留在小鼠血清中的补体组分C5蛋白的量的图。测定的定量下限(LLOQ)以虚线示出。
图10是示出在第0天、第1天、第2天和第3天在0.625mg/kg、1.25mg/kg或2.5mg/kg剂量的AD-58641之后，在第8天余留在小鼠血清中的补体组分C5蛋白的量的图。测定的定量下限(LLOQ)以虚线示出。
图11A和图11B描绘了在大鼠中重复给予化合物AD-58641的功效和累积效应。图11A是描绘了在以2.5mg/kg/剂量或5.0mg/kg/剂量，q2wx3(每周两次持续3周)重复给予之后，在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天、第18天、第25天和第32天余留在大鼠血清中的溶血活性的图。图11B是示出余留在动物血清中的补体组分C5蛋白的量的蛋白质印迹。
图12是示出在两轮每三天以2.5mg/kg或5mg/kg的AD-58641皮下给药持续8次剂量之前、之中和之后，在不同时间点下食蟹猴血清中的补体组分C5蛋白的量的图。C5蛋白水平被归一化成三个剂量前的样品的平均值。
图13是示出在两轮每三天以2.5mg/kg或5mg/kg的AD-58641皮下给药持续8次剂量之前、之中和之后，在不同时间点下余留在食蟹猴血清中的溶血百分比的图。相对于最大溶血和对照样品中的背景溶血计算溶血百分比。
图14是示出在单次1mg/kg剂量的指定iRNA之后在第5天余留在C57BL/6小鼠血清中的补体组分C5蛋白的百分比的图。
图15是示出在单次0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg或2.0mg/kg剂量的指定iRNA之后在第5天余留在C57BL/6小鼠血清中的补体组分C5蛋白的百分比的图。
图16是示出在单次1mg/kg剂量的指定iRNA之后，在第6天、第13天、第20天、第27天和第34天余留在C57BL/6小鼠血清中的补体组分C5蛋白的百分比的图。
图17是示出在第0天、第4天和第7天给予5mg/kg剂量的指定化合物之后，在不同时间点下余留在大鼠血清中的溶血百分比的图。
图18A示出智人补体组分5(C5)的核苷酸序列(SEQIDNO:1)；图18B示出猕猴补体组分5(C5)的核苷酸序列(SEQIDNO:2)；图18C示出小家鼠补体组分5(C5)的核苷酸序列(SEQIDNO:3)；图18D示出褐鼠补体组分5(C5)的核苷酸序列(SEQIDNO:4)；图18E示出SEQIDNO:1的反向补体(SEQIDNO:5)；图18F示出SEQIDNO:2的反向补体(SEQIDNO:6)；图18G示出SEQIDNO:3的反向补体(SEQIDNO:7)；并且图18H示出SEQIDNO:4的反向补体(SEQIDNO:8)。
本发明的详细说明
本发明提供了iRNA试剂，这些iRNA试剂影响补体组分C5基因的RNA转录物的RNA诱导沉默复合体(RISC)介导的裂解。
本发明的这些iRNA包括一个RNA链(反义链)，该RNA链具有长度是约30个核苷酸或更少的一个区，例如长度是15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸，该区基本上与C5基因的mRNA转录物的至少部分互补。使用这些iRNA能实现在哺乳动物中靶向降解C5基因的mRNA。具体地说，非常低剂量的C5iRNA可以特异性地和有效地介导RNA干扰(RNAi)，从而引起对C5基因的表达的显著抑制。本发明已经证实了靶向C5的iRNA可以在体外和在体内介导RNAi，从而引起对C5基因的表达的显著抑制。因此，包括这些iRNA的方法和组合物有用于治疗将通过C5蛋白的水平和/或活性降低而受益的受试者，如患有补体组分C5相关联的疾病如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的受试者。
本发明还提供了用于治疗患有将受益于抑制或减少C5基因的表达的病症的受试者的方法和联合疗法，该病症例如补体组分C5相关联的疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)，这些方法和联合疗法使用了影响补体组分C5基因的RNA转录物的RNA诱导沉默复合体(RISC)介导的裂解的iRNA组合物。
本发明还提供了用于在患有将受益于抑制或减少C5基因的表达的病症的受试者中预防至少一种症状例如溶血的方法，该病症例如补体组分C5相关联的疾病如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)。本发明进一步提供了iRNA组合物，这些iRNA组合物影响补体组分C5基因的RNA转录物的RNA诱导沉默复合体(RISC)介导的裂解。该C5基因可以是在一种细胞内，例如在一个受试者如人内的一种细胞。
本发明的这些联合疗法包括向患有一种补体组分C5相关联的疾病的患者给予本发明的一种RNAi试剂和一种另外的治疗剂，如抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段，例如依库珠单抗。本发明的这些联合疗法通过使C5mRNA与本发明的一种iRNA试剂靶向来使该受试者中的C5水平降低(例如，约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约99％)，并且因此，允许治疗该受试者所要求的治疗(或预防)有效量的依库珠单抗减少，从而降低治疗成本并且容许更简单和更方便的给予依库珠单抗的方法，如皮下给予。
以下详细说明披露了如何制备和使用抑制C5基因表达的含有iRNA的组合物，以及用于治疗患有将受益于抑制和/或减少这个基因的表达的疾病和病症的受试者的组合物、用途和方法。
I.定义
为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。此外，应该注意的是，每当列举一个参数的一个值或取值范围时,目的是表明这些列举的值的中间值和范围也意在成为本发明的部分。
在此使用冠词“一个(a)”和“一种(an)”是指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件，例如多个元件。
在此使用术语“包括(including)”意指短语“包括但不限于”，并且与该短语可互换使用。
在此使用术语“或(or)”意指术语“和/或”，并且与该术语可互换使用，除非上下文清楚地另外指明。
如在此所使用，与术语“C5”可互换使用的“补体组分C5”是指熟知的基因和多肽，该基因和多肽在本领域中又称为CPAMD4、C3和PZP样含α-2-巨球蛋白结构域的蛋白质、过敏毒素C5a类似物、溶血补体(Hc)以及补体C5。人C5mRNA转录物的序列可以例如在基因库登录号GI:38016946(NM_001735,2；SEQIDNO:1)中找到。恒河猴C5mRNA的序列可以例如在基因库登录号GI:297270262(XM_001095750.2；SEQIDNO:2)中找到。小鼠C5mRNA的序列可以例如在基因库登录号GI:291575171(NM_010406.2；SEQIDNO:3)中找到。大鼠C5mRNA的序列可以例如在基因库登录号GI:392346248(XM_345342.4；SEQIDNO:4)中找到。使用公共可获得的数据库例如基因库容易地获得C5mRNA序列的另外实例。
如在此所使用的术语“C5”还指C5基因的天然存在的DNA序列变异，如C5基因中的单核苷酸多态性。已经鉴定了C5基因内的众多SNP，并且可以例如在NCBIdbSNP中找到(参见，例如ncbi.nlm.nih.gov/snp)。C5基因内的SNP的非限制性实例可以在NCBIdbSNP登录号rs121909588和rs121909587中找到。
如在此所使用，“靶序列”是指在C5基因转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的一个连续部分，包括作为原代转录产物的RNA加工的产物的mRNA。在一个实施例中，序列的靶部分将是至少足够长的，以用作在C5基因转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的所述部分处或附近用于iRNA引导的裂解的底物。
该靶序列的长度可以是从约9-36个核苷酸，例如长度是约15-30个核苷酸。例如，该靶序列的长度可以是从约15-30个核苷酸，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。以上列举的范围和长度的范围与长度中间值也被想到成为本发明的部分。
如在此所使用，术语“包含序列的链”是指包含一个核苷酸链的寡核苷酸，该核苷酸链通过使用标准核苷酸命名法提到的顺序来描述。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自通常代表对应地含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，将理解的是，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指如下进一步详细描述的修饰的核苷酸、或替代物置换部分(参见，例如表2)。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包含一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如非限制性地，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明中体现的dsRNA的核苷酸序列中由含有例如肌苷的核苷酸置换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以对应地置换为鸟嘌呤和尿嘧啶，以便形成与靶mRNA碱基配对的G-U摇摆。含有这类置换部分的序列适用于在本发明中体现的组合物和方法。
如在此可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi试剂”、“iRNA试剂”、“RNA干扰试剂”是指含有作为在此定义的所述术语的RNA的试剂，并且该试剂通过一种RNA诱导沉默复合体(RISC)途径介导RNA转录物的靶向裂解。iRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的方法引导mRNA的序列特异性降解。该iRNA在细胞(例如，受试者如哺乳动物受试者内的细胞)中调节(例如，抑制)C5的表达。
在一个实施例中，本发明的RNAi试剂包括与靶RNA序列例如C5靶mRNA序列相互作用的一个单链RNA，以便引导靶RNA的裂解。不希望受理论约束，认为通过称为Dicer的III型核酸内切酶来将引入到细胞中的长双链RNA分解成siRNA(夏普(Sharp)等人(2001)基因与发育(GenesDev.)15:485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)使dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3'突出端的19-23个碱基对短干扰RNA(伯恩斯坦(Bernstein)等人(2001)自然(Nature)409:363)。然后将siRNA结合到一种RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一种或多种螺旋酶使siRNA双链体展开，从而能够实现互补反义链导引靶标识别(尼卡能(Nykanen)等人(2001)细胞(Cell)107:309)。当结合至适当的靶mRNA时，RISC内的一种或多种核酸内切酶裂解该靶标以便诱导沉默(巴希尔(Elbashir)等人(2001)基因与发育15:188)。因此，一方面，本发明涉及一种在细胞内产生的单链RNA(siRNA)并且该单链RNA促进RISC复合体形成以实现靶基因即C5基因的沉默。因此，在此使用术语“siRNA”还指如上所述的RNAi。
在另一个实施例中，该RNAi试剂可以是引入到细胞或生物体中以便抑制靶mRNA的单链siRNA。单链RNAi试剂结合至RISC核酸内切酶(Argonaute2)，然后该RISC核酸内切酶裂解靶mRNA。这些单链siRNA通常是15-30个核苷酸并且是化学修饰的。单链siRNA的设计和测试被描述于美国专利号8,101,348和利马(Lima)等人(2012)细胞150:883-894中，这些参考文献中的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。在此描述的任何反义核苷酸序列可以被用作如在此所描述或如通过描述于利马等人(2012)细胞150；:883-894中的方法化学修饰的单链siRNA。
在另一个实施例中，用于本发明的这些组合物、用途和方法中的“iRNA”是双链RNA，并且在此称为“双链RNAi试剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA试剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合体，该复合体具有包含两个反平行和基本上互补的核酸链的双链体结构，称为相对于靶RNA即C5基因具有“有义”和“反义”取向。在本发明的一些实施例中，双链RNA(dsRNA)通过在此称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机理来引发靶RNA例如mRNA的降解。
通常，dsRNA分子的每个链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如在此所详细描述，每个链或这两个链还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。另外，如在本说明书中所使用，“RNAi试剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi试剂可以在多个核苷酸上包括许多修饰。此类修饰可以包括在此披露的或在本领域中已知的所有类型的修饰。如在siRNA类型分子中所使用的任何此类修饰出于本说明书和权利要求的目的，涵盖在“RNAi试剂”中。
双链体区可以具有容许通过RISC途径特异性降解希望的靶RNA的任何长度，并且长度可以在从约9个至36个碱基对的范围内，例如长度是约15-30个碱基对，例如长度是约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对，如长度是约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。以上列举的范围和长度的范围与长度中间值也被想到成为本发明的部分。
形成双链体结构的两个链可以是一个更大的RNA分子的不同部分，或它们可以是单独的RNA分子。当这两个链是一个更大的分子的部分时，并且因此通过一个链的3’-端与形成双链体结构的对应的另一个链的5’-端之间的不间断核苷酸链来连接，连接的RNA链称为“发夹环”。发夹环可以包含至少一个未配对的核苷酸。在一些实施例中，该发夹环可以包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸。
当dsRNA的两个基本上互补的链包含单独的RNA分子时，这些分子不是必须的，但是可以共价连接。当这两个链通过除了一个链的3’-端与形成双链体结构的对应的另一个链的5’-端之间的不间断核苷酸链以外的方式共价连接时，连接的结构称为“接头”。这些RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去存在于该双链体中的任何突出端。除了双链体结构以外，RNAi可以包含一个或多个核苷酸突出端。
在一个实施例中，本发明的RNAi试剂是与靶RNA序列例如C5靶mRNA序列相互作用的具有24-30个核苷酸的dsRNA，以便引导靶RNA的裂解。不希望受理论约束，通过称为Dicer的III型核酸内切酶来将引入到细胞中的长双链RNA分解成siRNA(夏普等人(2001)基因与发育15:485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)使dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3'突出端的19-23个碱基对短干扰RNA(伯恩斯坦等人(2001)自然409:363)。然后将siRNA结合到一种RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一种或多种螺旋酶使siRNA双链体展开，从而能够实现互补反义链导引靶标识别(尼卡能等人(2001)细胞107:309)。当结合至适当的靶mRNA时，RISC内的一种或多种核酸内切酶裂解该靶标以便诱导沉默(巴希尔等人(2001)基因与发育15:188)。
如在此所使用，术语“核苷酸突出端”是指从iRNA例如dsRNA的双链体结构伸出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一个链的3’-端延伸超过另一个链的5’-端时，或反之亦然，存在核苷酸突出端。dsRNA可以包含具有至少一个核苷酸的突出端；替代地该突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个突出端可以处于有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的或者反义链或者有义链的5'-端、3'-端或这两端上。
在一个实施例中，dsRNA的反义链在3’-端和/或5’-端处具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出端。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3’-端和/或5’-端处具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出端。在另一个实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯置换。
“钝头”或“平端”意指在双链RNAi试剂的所述端处不存在未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“平端”RNAi试剂是在其整个长度上是双链的dsRNA，即，在分子的任一端处没有核苷酸突出端。本发明的RNAi试剂包括在一端处具有核苷酸突出端(即具有一个突出端和一个平端的试剂)或在两端处均具有核苷酸突出端的RNAi试剂。
术语“反义链”或“引导链”是指包括与靶序列例如C5mRNA基本上互补的一个区的iRNA例如dsRNA的链。如在此所使用，术语“互补区”是指在反义链上的基本上与例如靶序列的序列(例如，如在此所定义的C5核苷酸序列)基本上互补的区。当该互补区不完全与该靶序列互补时，错配可以处于分子的内部区域或末端区域中。通常，最耐受的错配是在末端区域中，例如在iRNA的5'-末端和/或3'-末端的5、4、3或2个核苷酸内。
如在此所使用的术语“有义链”或“过客链”是指包括与如在此定义的所述术语的反义链的一个区基本上互补的一个区的iRNA的链。
如在此所使用，术语“裂解区”是指位于紧邻裂解位点处的一个区。裂解位点是在其上发生裂解的靶标上的位点。在一些实施例中，该裂解区在裂解位点的任一端处并且紧邻裂解位点包含三个碱基。在一些实施例中，该裂解区在裂解位点的任一端处并且紧邻裂解位点包含两个碱基。在一些实施例中，裂解位点特异性地出现在反义链的核苷酸10和核苷酸11结合的位点处，并且该裂解区包含核苷酸11、核苷酸12和核苷酸13。
如在此所使用，并且除非另外指明，当用来描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，术语“互补”是指包含该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，如技术人员将理解。此类条件可以例如是严格条件，其中严格条件可以包括：400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA，50℃或70℃持续12-16个小时，接着洗涤(参见，例如“分子克隆：实验室指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989)冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))。其他条件如生物体内部可以遇到的生理相关的条件可以应用。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用，确定最适宜于测试两个序列的互补性的条件集合。
iRNA内例如在此所描述的dsRNA内的互补序列包括包含第一核苷酸序列的该寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整个长度上的碱基配对。此类序列在此可以称为相对于彼此而“完全互补”。然而，当第一序列在此称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或在对于高达30个碱基对的双链体杂交时，它们可以形成一个或多个但通常不多于5、4、3或2个错配的碱基对，同时保持在与其最终应用(例如通过RISC途径抑制基因表达)最相关的条件下杂交的能力。然而，当两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端时，此类突出端不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如，包含长度是21个核苷酸的一个寡核苷酸和长度是23个核苷酸的另一个寡核苷酸的dsRNA出于在此描述的目的又可以称为“完全互补”，其中较长的寡核苷酸包含与较端的寡核苷酸完全互补的具有21个核苷酸的序列。
如在此所使用“互补”序列还可以包括非沃森-克里克碱基配对和/或从非天然核苷酸和修饰的核苷酸中形成的碱基对，或完全从其中形成，以至于实现以上针对其杂交能力的要求。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
在此可以相对于dsRNA的有义链与反义链之间或iRNA试剂的反义链与靶序列之间的碱基配对使用术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”，如从其使用的上下文中将理解。
如在此所使用，与信使RNA(mRNA)的至少部分“基本上互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如，编码C5的mRNA)的一个连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码C5的mRNA的一个非中断部分基本上互补，多核苷酸与C5mRNA的至少一个部分互补。
通常，每个链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如在此详细描述，每个链或这两个链还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。另外，“iRNA”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸。此类修饰可以包括在此披露的或在本领域中已知的所有类型的修饰。如在iRNA分子中所使用的任何此类修饰出于本说明书和权利要求的目的，涵盖在“iRNA”中。
在本发明的一个方面中，用于本发明的这些方法和组合物中的试剂是通过反义抑制机理抑制靶mRNA的单链反义RNA分子。该单链反义RNA分子与靶mRNA内的一个序列互补。单链反义寡核苷酸可以通过与mRNA碱基配对并且物理阻塞翻译机以化学计量的方式抑制翻译，参见，迪亚斯(Dias)N.等人，(2002)分子癌症治疗(MolCancerTher)1:347-355。该单链反义RNA分子的长度可以是约15至约30个核苷酸并且具有与靶序列互补的序列。例如，该单链反义RNA分子可以包含来自在此描述的任一个反义序列的至少约15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的序列。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包含一个脂质层的囊泡，该脂质层包囊一种药物活性分子，如核酸分子，例如iRNA或从其中转录iRNA的质粒。LNP被描述于例如美国专利号6,858,225、6,815,432、8,158,601和8,058,069中，这些美国专利的全部内容特此通过引用结合在此。
如在此所使用，“受试者”是一种动物，如一种哺乳动物，包括灵长类动物(如人、非人灵长类动物，例如猴和黑猩猩)、非灵长类动物(如奶牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马以及鲸)或禽类(例如，鸭或鹅)。在一个实施例中，该受试者是人，如治疗或评价将受益于C5表达减少的疾病、病症或病状的人类；处于将受益于C5表达减少的疾病、病症或病状风险的人；患有将受益于C5表达减少的疾病、病症或病状的人；和/或治疗如在此所描述的将受益于C5表达减少的疾病、病症或病状的人类。
如在此所使用，属于“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指一种有益的或希望的结果，包括但不限于缓解或改善与不想要的补体途径激活相关联的一种或多种症状(例如，溶血和/或慢性炎症)；降低不想要的补体途径激活的程度；稳定(即，不恶化)慢性炎症和/或溶血的状况；改善或减轻不想要的补体途径激活(例如，慢性炎症和/或溶血)，无论可检测到或不可检测到。“治疗”还可以意指与不存在治疗情况下的预期存活相比，延长存活。
在受试者中的补体组分C5或疾病标志物或症状的水平的背景下的术语“降低”是指此种水平的统计学上显著的降低。该降低可以例如是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，并且优选地低至对于不具有此种病症的个体而言正常的范围内所接受的水平。
如在此所使用，当关于将受益于C5基因表达减少的疾病、病症或其病状使用时，“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指降低受试者将发展与这样一种疾病、病症或病状相关联的症状的可能性，例如，不想要的补体激活的症状，如慢性炎症、溶血和/或血栓形成。例如，当具有血栓形成的一种或多种风险因素的个体相对于具有相同风险因素并且没有接受如在此所描述的治疗的群体，没有发展血栓形成或发展具有较小严重性的血栓形成时，发展血栓形成的可能性降低。没有发展疾病、病症或病状；或减少发展与这样一种疾病、病症或病状相关联的症状(例如，减少对于所述疾病或病症临床上接受的标度的至少约10％)；或表现出延迟的症状(例如，延迟数天、数周、数月或数年)被认为是有效的预防。
如在此所使用，术语“补体组分C5相关联的疾病”是由补体激活引起或与补体激活相关联的疾病或病症。此类疾病典型地与炎症和/或免疫系统激活，例如膜攻击复合体介导的溶解、过敏反应和/或溶血相关联。补体组分C5相关联的疾病的非限制性实例包括阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、哮喘、类风湿性关节炎(RA)；抗磷脂抗体综合征；狼疮肾炎；缺血-再灌注损伤；典型的或感染性溶血性尿毒症综合征(tHUS)；致密沉积物病(DDD)；视神经脊髓炎(NMO)；多灶性运动神经病(MMN)；多发性硬化(MS)；黄斑变性(例如，年龄相关的黄斑变性(AMD))；溶血、肝脏酶升高以及血小板低(HELLP)综合征；血栓性血小板减少性紫癜(TTP)；自发性流产；寡免疫血管炎；大疱性表皮松解症；习惯性流产；先兆子痫、创伤性脑损伤、重症肌无力、冷凝集素病、皮肌炎大疱性类天疱疮、志贺毒素(Shigatoxin)大肠杆菌相关的溶血性尿毒症综合征、C3肾病、抗嗜中性粒细胞细胞质抗体相关联的血管炎(例如，肉芽肿性血管炎(先前称为韦格纳肉芽肿病)、丘-施综合征以及显微镜下多血管炎)、体液和血管移植排斥、移植物功能异常、心肌梗塞(例如，心肌梗塞中的组织损伤和局部缺血)、异源移植、脓毒症(例如，脓毒症中的不良结果)、冠状动脉病、皮肌炎、格雷夫斯病、动脉粥样硬化、阿耳茨海默氏病、全身性炎症反应脓毒症、脓毒性休克、脊髓损伤、肾小球性肾炎、桥本氏甲状腺炎、I型糖尿病、牛皮癣、天疱疮、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、ITP、肺出血肾炎综合征、德戈斯病、抗磷脂综合征(APS)、灾难性APS(CAPS)、心血管病症、心肌炎、脑血管疾病、外周(例如，肌骨骼)血管疾病、肾血管疾病、肠系膜/肠血管疾病、血管炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎、全身性红斑狼疮相关联的血管炎、与类风湿性关节炎相关联的血管炎、免疫复合物血管炎、高安氏病、扩张性心肌病、糖尿病性血管病、川畸氏病(动脉炎)、静脉气体栓子(VGE)以及支架放置、旋转式动脉粥样斑块去除术、膜性肾病、格-巴二氏综合征和经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄(参见，例如霍尔斯(Holers)(2008)免疫学评论(immunologicalReviews)223:300-316；霍尔斯和瑟曼(Thurman)(2004)分子免疫学(MolecularImmunology)41:147-152；美国专利公开号20070172483)。
在一个实施例中，补体组分C5相关联的疾病是阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。该PNH可以是经典的PNH或在另一种骨髓衰竭综合征和/或骨髓增生异常综合征(MDS)例如细胞减少环境中的PNH。在另一个实施例中，补体组分C5相关联的疾病是非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)。
II.本发明的iRNA
本发明提供了抑制补体组分C5基因表达的iRNA。在一个实施例中，iRNA试剂包括用于在一种细胞中抑制C5基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，该细胞如一个受试者例如哺乳动物(如患有补体组分C5相关联的疾病如PNH的人)内的细胞。该dsRNA包括一个反义链，该反义链具有与在C5基因的表达中形成的mRNA的至少一个部分互补的一个互补区。该互补区的长度是约30个核苷酸或更少(例如，长度是约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18个核苷酸或更少)。当与表达C5基因的细胞接触时，iRNA使C5基因(例如，人、灵长类动物、非灵长类动物或禽类C5基因)的表达抑制至少约10％，如通过例如PCR或基于支链DNA(bDNA)的方法，或通过基于蛋白质的方法，如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹法或流式细胞术技术所测定。
dsRNA包括互补并在其中将使用dsRNA的条件下杂交以形成双链体结构的两个RNA链。dsRNA的一个链(反义链)包括一个互补区，该互补区与一个靶序列基本上互补并且通常完全互补。该靶序列可以来源于在C5基因的表达过程中形成的mRNA的序列。另一个链(有义链)包括与反义链互补的一个区，这样使得在适合的条件下组合时，这两个链杂交并形成双链体结构。如在此的其他地方所描述并且如本领域中所知，与处于单独的寡核苷酸上相反，dsRNA的互补序列还可以被包含作为单一核酸分子的自我互补区。
通常，该双链体结构的长度是在15个与30个碱基对之间，例如长度是在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对之间。以上列举的范围和长度的范围与长度中间值也被想到成为本发明的部分。
类似地，与该靶序列互补的该区的长度是在15个与30个核苷酸之间，例如长度是在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸之间。以上列举的范围和长度的范围与长度中间值也被想到成为本发明的部分。
在一些实施例中，该dsRNA的长度是在约15与约20个核苷酸之间，或长度是在约25与约30个核苷酸之间。通常，该dsRNA是足够长以用作Dicer酶的底物。例如本领域中所熟知的，长度长于约21-23个核苷酸的dsRNA可以用作Dicer的底物。如技术人员也将认识，被靶向用于裂解的RNA的区将最经常是较大RNA分子(经常是mRNA分子)的部分。在必要时，mRNA靶标的一“部分”是足够长以允许其作为RNAi引导的裂解(即，通过RISC途径裂解)的底物的mRNA靶标的连续序列。
本领域技术人员还将认识到的是，双链体区是dsRNA的一个主要功能部分，例如具有约9至36个碱基对，例如约10-36、11-36、12-36、13-36、14-36、15-36、9-35、10-35、11-35、12-35、13-35、14-35、15-35、9-34、10-34、11-34、12-34、13-34、14-34、15-34、9-33、10-33、11-33、12-33、13-33、14-33、15-33、9-32、10-32、11-32、12-32、13-32、14-32、15-32、9-31、10-31、11-31、12-31、13-32、14-31、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对的双链体区。因此，在一个实施例中，达到加工成靶向希望的RNA用于裂解的具有例如15-30个碱基对的功能双链体的程度，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子的复合体是dsRNA。因此，技术人员将认识到在一个实施例中miRNA是dsRNA。在另一个实施例中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施例中，有用于靶向C5表达的iRNA试剂不是通过裂解更大的dsRNA而在靶细胞中产生的。
如在此所描述的dsRNA可以进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端，例如1、2、3或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA相对于其平端的对应物可以具有出乎意料地优越的抑制特性。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个突出端可以处于有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的或者反义链或者有义链的5'-端、3'-端或这两端上。
可以通过如下所进一步讨论的本领域中已知的标准方法，例如通过使用DNA自动合成仪(如从例如生物研究美国应用生物系统公司(Biosearch,AppliedBiosystems,Inc.)商业上可获得的)来合成dsRNA。
本发明的iRNA化合物可以使用二步程序来制备。首先，分别制备该双链RNA分子的各链。然后，将这些组分链退火。siRNA化合物的各链可以使用溶液相或固相有机合成或这两者来制备。有机合成提供了以下优点，可以容易地制备包含非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸链。本发明的单链寡核苷酸可以通过使用溶液相或固相有机合成或二者来制备。
一个方面，本发明的dsRNA包括至少两个核苷酸序列，一个有义序列和一个反义序列。该有义链是选自在表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中提供的序列的组，并且该有义链的相对应的反义链是选自表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个的序列的组。在这方面，这两个序列中的一个与这两个序列中的另一个互补，其中这些序列中的一个与在C5基因的表达中产生的mRNA的一个序列基本上互补。因此，在这方面，dsRNA将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述为表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中的有义链，并且第二寡核苷酸被描述为表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中的有义链的相对应的反义链。在一个实施例中，该dsRNA的基本上互补的序列被包含在单独的寡核苷酸上。在另一个实施例中，该dsRNA的基本上互补的序列被包含在单一寡核苷酸上。
将理解的是，虽然表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的一些序列被描述为修饰的和/或缀合的序列，但本发明的iRNA例如本发明的dsRNA的RNA可以包含未修饰的、未缀合的和/或与其中所描述不同修饰和/或缀合的在表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中列举的任一个序列。
技术人员将很好地意识到，具有在约20与23个碱基对之间(例如，21个碱基对)的双链体结构的dsRNA作为特别有效于诱导RNA干扰而受到欢迎(巴希尔等人，欧洲分子生物学学会(EMBO)2001，20:6877-6888)。然而，其他人发现更短或更长的RNA双链体结构也可以是有效的(朱棣文(Chu)和拉纳(Rana)(2007)RNA14:1714-1719；金姆(Kim)等人(2005)自然生物技术(NatBiotech)23:222-226)。在以上描述的这些实施例中，凭借在表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中提供的寡核苷酸序列的性质，在此描述的dsRNA可以包括具有长度是最小21个核苷酸的至少一个链。可以合理预期到的是，与以上描述的dsRNA相比，具有表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个的序列中的一个减去一端或两端上的仅有几个核苷酸的较短双链体可以是类似有效的。因此，具有来源于表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个的序列中的一个的至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的序列，并且与包含全部序列的dsRNA在其抑制C5基因的表达能力上相差不多于约5％、10％、15％、20％、25％或30％抑制的dsRNA被想到在本发明的范围内。
另外，在表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中提供的RNA在C5转录物中鉴定出易受RISC介导的裂解的一个或多个位点。因此，本发明进一步体现了在这些位点中的一个内靶向的iRNA。如在此所使用，如果iRNA在具体位点内的任何地方促进转录物的裂解，则称该iRNA在RNA转录物的具体位点内靶向。这样一种iRNA将通常包括来自在表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中提供的序列中的一个的至少约15个连续核苷酸，这些核苷酸联接到取自与C5基因中的选择的序列相邻的区的另外核苷酸序列上。
虽然靶序列的长度通常是约15-30个核苷酸，但在用于引导任何给定靶RNA的裂解的这个范围内的具体序列适用性上存在广泛的变化。在此列出的不同软件包和准则为鉴定任何给定基因靶标的最佳靶序列提供了指导，但还可以采取经验方法，其中具有给定尺寸(作为一个非限制性实例，21个核苷酸)的“窗口”或“掩膜”被真实或象征性地(包括，例如计算机模拟)放置于靶RNA序列上，以便鉴定在尺寸范围内的可以用作靶序列的序列。通过渐进地将该序列“窗口”向初始靶标序列位置的上游或下游移动一个核苷酸，可以鉴别出下一个潜在的靶标序列，直到针对所选择的任何给定靶标尺寸鉴别出全套可能的序列。这个方法结合系统合成和测试鉴定的序列(使用如在此所描述或如本领域中所知的测定)以鉴定表现最佳的那些序列一起，可以鉴定出当与iRNA试剂靶向时介导靶基因表达的最佳抑制的那些RNA序列。因此，虽然例如在表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中鉴定出的序列表示有效的靶序列，但应想到的是可以通过向给定序列的上游或下游渐进地“使窗口行走”一个核苷酸以鉴定具有同等或更好抑制特征的序列来实现抑制效率的进一步优化。
此外，对于例如在表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中鉴定出的任何序列应想到的是，可以通过系统添加或去除核苷酸以产生更长或更短的序列并且测试通过使具有更长或更短尺寸的窗口从所述点向靶RNA上方或下方行走所产生的那些序列来实现进一步优化。再次地，使这种方法与产生新候选物靶标结合，同时基于如本领域中所知和/或如在此所描述的抑制测定中的那些靶序列测试iRNA的有效性，可以引起抑制效率的进一步改善。再者，可以例如通过引入如在此所描述或如本领域中所知的修饰核苷酸、添加或改变突出端或如本领域中所知和/或在此讨论的其他修饰，调节此类优化的序列以便进一步优化分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加核内体释放)作为表达抑制剂。
如在此所描述的iRNA可以含有与靶序列的一个或多个错配。在一个实施例中，如在此所描述的iRNA含有不多于3个错配。如果iRNA的反义链含有与靶序列的错配，则优选错配区域不应当位于互补区的中心内。如果iRNA的反义链含有与靶序列的错配，则优选错配被局限在离互补区的5’-端或3’-端的最后5个核苷酸内。例如，对于23个核苷酸的iRNA试剂，与C5基因的一个区互补的链通常在中心13个核苷酸内不含有任何错配。在此描述的这些方法或本领域中已知的方法可以用来确定含有与靶序列的错配的iRNA是否有效于抑制C5基因的表达。考虑具有错配的iRNA在抑制C5基因的表达上的功效是重要的，尤其如果已知C5基因中的具体互补区在群体内具有多态序列变化。
III.本发明的修饰的iRNA
在一个实施例中，本发明的iRNA例如dsRNA的RNA是未修饰的，并且不包含例如本领域中已知和在此描述的化学修饰和/或缀合。在另一个实施例中，本发明的iRNA例如dsRNA的RNA被化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。在本发明的某些实施例中，本发明的iRNA的基本上所有的核苷酸是修饰的。在本发明的其他实施例中，本发明的iRNA的所有核苷酸均是修饰的。其中“基本上所有的核苷酸是修饰的”本发明的iRNA是大部分但不是全部修饰的，并且可以包括不多于5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
在本发明中体现的核酸可以通过本领域中公知的方法来合成和/或修饰，这些方法如描述于“核酸化学实验室指南(Currentprotocolsinnucleicacidchemistry)”比优凯奇(Beaucage)S.L.等人(编著)，约翰威立国际出版公司(JohnWiley&Sons,Inc.)，美国纽约州纽约(NewYork,NY,USA)中的那些，所述参考文献特此通过引用结合在此。修饰包括，例如端修饰，例如5’-端修饰(磷酸化、缀合、反向键联)或3’-端修饰(缀合物、DNA核苷酸、反向键合等)；碱基修饰，例如被稳定的碱基或与配伍物的扩展抗体库碱基配对的碱基置换、碱基去除(脱碱基核苷酸)或缀合的碱基；糖修饰(例如，在2’-位置或4’-位置处)或糖置换；和/或骨架修饰，包括磷酸二酯键联的修饰和置换。有用于在此所描述的这些实施例的iRNA化合物的具体实例包括，但不限于含有修饰的骨架或无天然核苷间键联的RNA。具有修饰的骨架的RNA包括在骨架中不具有磷原子的那些，连同其他。出于本说明书的目的并且如有时本领域中提及，在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰RNA也可以被认为是寡核苷。在一些实施例中，修饰的iRNA将在其核苷间骨架中具有磷原子。
修饰的RNA骨架包括，例如硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；甲基膦酸酯和其他烷基膦酸酯，包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯；亚膦酸酯；氨基磷酸酯，包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯；硫代烷基膦酸酯；硫代烷基磷酸三酯；以及具有通常3’-5’键联的硼烷磷酸酯、这些物质的2’-5’连接的类似物以及具有反相极性的那些，其中相邻的核苷单元对被3’-5’连接至5’-3’上或2’-5’连接至5’-2’上。还包括不同盐、混合盐以及游离酸形式。
教导以上含磷键联的制备的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美国专利RE39464，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
在其中不包括磷原子的修饰RNA骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键联、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键联、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键联形成的骨架。这些骨架包括具有以下各项的那些：吗啉代键联(部分地从核苷的糖部分中形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃的骨架；磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他骨架。
教导以上寡核苷的制备的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
在其他实施例中，适合的RNA模拟物被想到用于iRNA中，其中核苷单元的糖和核苷间键联(即骨架)均被新颖基团置换。维持碱基单元用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的低聚化合物(已经显示具有优异杂交特性的RNA模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含有酰胺的骨架置换，具体是氨基乙基甘氨酸骨架。这些核碱基得以保持并且直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331和5,719,262，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。适合用于本发明的iRNA中的另外PNA化合物被描述于例如尼尔森(Nielsen)等人，科学(Science)，1991，254，1497-1500中。
在本发明中体现的一些实施例包括具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有杂原子骨架的寡核苷，并且具体地以上提及的美国专利号5,489,677的--CH2--NH--CH2-、--CH2--(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2-、-CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)-CH2--CH2-[其中天然磷酸二酯骨架被表示为--O--P--O--CH2--]以及以上提及的美国专利号5,602,240的酰胺骨架。在一些实施例中，在此体现的RNA具有以上提及的美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构。
修饰的RNA还可以含有一个或多个取代的糖部分。在此体现的iRNA例如dsRNA可以在2’-位置处包括下列基团中的一个：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性适合的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是从1至约10。在其他实施例中，dsRNA在2’位置处包括下列基团中的一个：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基因基团、嵌入剂、用于改进iRNA的药物代谢动力学特性的基团或用于改进iRNA的药效特性的基团以及具有类似特性的其他取代基。在一些实施例中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，又称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(马丁(Martin)等人，瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)，1995，78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，又称为2’-DMAOE，如下在此实例中所描述；和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中又称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH2--O--CH2-N(CH2)2。
其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟代(2’-F)。还可以在iRNA的RNA上的其他位置处做出类似的修饰，具体地在3’末端核苷酸上的糖的3’位置或在2’-5’连接的dsRNA中以及5’末端核苷酸的5’位置。iRNA还可以具有糖模拟物，如代替戊呋喃糖的环丁基部分。
教导此类修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；以及5,700,920，所述美国专利中的某些与本申请共同拥有。特此通过引用将前述的每个的全部内容结合在此。
iRNA还可以包括核碱基(在本领域中经常简称为“碱基”)修饰或取代。如在此所使用，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成核碱基和天然核碱基，如脱氧-胸腺嘧啶(dT)；5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代(具体地5-溴代)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包括披露于美国专利号3,687,808中的那些；披露于生物化学中的修饰核苷(ModifiedNucleosidesinBiochemistry)，生物技术与医药(BiotechnologyandMedicine)，海瑞德威景(Herdewijn)P.编著威立-VCH，2008中的那些；披露于聚合物科学与工程的简明百科全书(TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering)，第858-859页，克奥赤威兹(Kroschwitz)J.L编著约翰威立国际出版公司(JohnWiley&Sons)，1990中的那些；由英格力士(Englisch)等人，应用化学(AngewandteChemie)，国际版，1991，30，613披露的那些；以及由桑格威(Sanghvi)YS.，第15章，dsRNA研究与应用(dsRNAResearchandApplications)，第289-302页，克鲁克(Crooke)S.T.和黎布鲁(Lebleu)B.编著，CRC出版社，1993披露的那些。这些核碱基中的某些特别有用于提高在本发明中体现的低聚化合物的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6℃-1.2℃(桑格威Y.S.、克鲁克S.T.和黎布鲁B.编著，dsRNA研究与应用，CRC出版社，波卡拉顿(BocaRaton)，1993，第276-278页)并且是示例性碱基取代，甚至更具体地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导以上所述的修饰核碱基中的某些以及其他修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括，但不限于以上所述的美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；以及7,495,088，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
iRNA的RNA还可以被修饰成包括一个或多个锁定核酸(LNA)。锁定核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中该核糖部分包含连接2’碳和4’碳的额外的桥。这个结构有效地以3’-内切结构构型“锁定”该核糖。已经显示将锁定核酸添加到siRNA上可增加siRNA在血清中的稳定性，并且减少脱靶效应(埃尔门(Elrnen)J.等人，(2005)核酸研究(NucleicAcidsResearch)33(1):439-447；穆克(Mook)OR.等人，(2007)分子癌症治疗6(3):833-843；格如威勒(Grunweller)A.等人，(2003)核酸研究31(12):3185-3193)。
教导锁定核酸核苷酸的制备的代表性美国专利包括，但不限于下列美国专利：美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；以及7,399,845，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
对于RNA分子的末端潜在稳定的修饰可以包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2’-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3”-磷酸酯、反相碱基(idT)以及其他修饰。这种修饰的披露可以在PCT公开号WO2011/005861中找到。
A.包含本发明的基序的修饰iRNA
在本发明的某些方面中，本发明的双链RNAi试剂包括具有化学修饰的试剂，如在例如2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710中或在2012年11月16日提交的PCT/US2012/065691中所披露，所述参考文献中的每一个的全部内容通过引用结合在此。
如在此和在临时申请号61/561,710或PCT申请号PCT/US2012/065691中所示，可以通过将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入到RNAi试剂的有义链和/或反义链中(具体地在裂解位点处或附近)来获得优越的结果。在一些实施例中，该RNAi剂的该有义链和反义链可以另外的方式被完全修饰。这些基序的引入中断了该有义链和/或反义链的修饰模式(如果存在的话)。该RNAi剂可以任选地与例如在该有义链上的GalNAc衍生物配体缀合。所得到的RNAi剂呈现优越的基因沉默活性。
更确切地说，出人意料地发现，当该双链RNAi试剂的该有义链和反义链被完全修饰成在RNAi试剂的至少一个链的裂解位点处或附近具有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序时，该RNAi试剂的基因沉默活性被卓越地增强。
因此，本发明提供了能够在体内抑制靶基因(即，补体组分C5(C5)基因)的表达的双链RNAi试剂。该RNAi试剂包含一个有义链和一个反义链。该RNAi试剂的每个链的长度可以在12-30个核苷酸范围内。例如，每个链的长度可以在14-30个核苷酸之间、17-30个核苷酸之间、25-30个核苷酸之间、27-30个核苷酸之间、17-23个核苷酸之间、17-21个核苷酸之间、17-19个核苷酸之间、19-25个核苷酸之间、19-23个核苷酸之间、19-21个核苷酸之间、21-25个核苷酸之间或21-23个核苷酸之间。
该有义链和该反义链典型地形成一种双链体双链RNA(“dsRNA”)，在此又称为“RNAi试剂”。RNAi试剂的双链体区的长度可以是12-30个核苷酸对。例如，该双链体区的长度可以在14-30个核苷酸对之间、17-30个核苷酸对之间、27-30个核苷酸对之间、17-23个核苷酸对之间、17-21个核苷酸对之间、17-19个核苷酸对之间、19-25个核苷酸对之间、19-23个核苷酸对之间、19-21个核苷酸对之间、21-25个核苷酸对之间或21-23个核苷酸对之间。在另一个实例中，该双链体区的长度是选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26以及27个核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi试剂可以在一个或两个链的3’-端、5’-端或两端处含有一个或多个突出端区和/或封端基团。该突出端的长度可以是1-6个核苷酸，例如2-6个核苷酸、1-5个核苷酸、2-5个核苷酸、1-4个核苷酸、2-4个核苷酸、1-3个核苷酸、2-3个核苷酸或1-2个核苷酸。这些突出端可以是一个链比另一个链更长的结果，或具有相同长度的两个链交错的结果。该突出端可以与靶mRNA形成错配，或它可以与被靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。第一链和第二链还可以例如通过另外的碱基连接以形成一个发夹或通过其他非碱基接头连接。
在一个实施例中，该RNAi试剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是一种修饰的或未修饰的核苷酸，包括但不限于2’-糖修饰的，如2-F、2’-O甲基、胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)以及其任何组合。例如，TT可以是任一链上的任一端的一个突出端序列。该突出端可以与靶mRNA形成错配，或它可以与被靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。
在该RNAi试剂的有义链、反义链或这两个链处的5’-突出端或3’-突出端可以被磷酸化。在一些实施例中，一个或多个突出端区含有两个在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的核苷酸，其中这两个核苷酸可以是相同或不同的。在一个实施例中，该突出端存在于有义链、反义链或这两个链的3’端处。在一个实施例中，这个3’-突出端存在于反义链中。在一个实施例中，这个3’-突出端存在于有义链中。
该RNAi试剂可以仅含有单个突出端，该突出端可以加强该RNAi的干扰活性而不影响其总稳定性。例如，单链突出端可以位于有义链的3’-末端处，或替代地位于反义链的3’-末端处。该RNAi还可以具有位于该反义链的5’-端(或该有义链的3’-端)处的平端，或反之亦然。一般来说，该RNAi的反义链在3'-端处具有核苷酸突出端，并且5'-端是平的。虽然不希望受理论约束，但该反义链的5’-端处的不对称平端和该反义链的3’-端突出端有利于引导链加载到RISC过程中。
在一个实施例中，该RNAi试剂是具有19个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置7、位置8、位置9处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序。该反义链在从5’端起的位置11、位置12、位置13处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在另一个实施例中，该RNAi试剂是具有20个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置8、位置9、位置10处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序。该反义链在从5’端起的位置13、位置12、位置13处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在又另一个实施例中，该RNAi试剂是具有21个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置9、位置10、位置11处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序。该反义链在从5’端起的位置11、位置12、位置13处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含一种21个核苷酸的有义链和一种23个核苷酸的反义链，其中该有义链在从5'端起的位置9、位置10、位置11处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序；该反义链在从5'端起的位置11位置12、位置13处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序，其中该RNAi试剂的一端是平的，而另一端包含一种2个核苷酸的突出端。优选地，该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’-端处。当该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’-端处时，在末端的三个核苷酸之间可以存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中这三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个核苷酸是紧挨着该突出端核苷酸的配对的核苷酸。在一个实施例中，该RNAi试剂在该有义链的5’-端和在该反义链的5’-端处均另外地具有在末端三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括作为基序的一部分的核苷酸)是修饰的核苷酸。在一个实施例中，每个残基独立地被例如交替基序中的2’-O-甲基或3’-氟代修饰。任选地，该RNAi试剂进一步包含一个配体(优选地GalNAc3)。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含一个有义链和一个反义链，其中该有义链的长度是25-30个核苷酸残基，其中从5’末端核苷酸(位置1)开始，第一链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；该反义链的长度是36-66个核苷酸残基，并且从3’末端核苷酸开始，在与有义链的位置1-23配对的位置上包含至少8个核糖核苷酸以形成一种双链体；其中反义链的至少3’末端核苷酸与有义链未配对，并且高达6个连续的3’末端核苷酸与有义链未配对，从而形成具有1-6个核苷酸的3’单链突出端；其中反义链的5’末端包含从10-30个连续的与有义链未配对的核苷酸，从而形成10-30个核苷酸的单链5’突出端；其中当出于最大互补性对准有义链和反义链时，至少该有义链5’末端核苷酸和3’末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链与反义链之间形成基本上双链体的区；并且沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸，反义链与靶RNA充分互补，以便当双链核酸被引入到哺乳动物细胞中时减少靶基因表达；并且其中该有义链含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序，其中这些基序中的至少一个出现在裂解位点处或附近。该反义链在裂解位点处或附近含有在三个连续核苷酸上具有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含有义链和反义链，其中该RNAi试剂包含一个第一链和一个第二链，该第一链具有至少25个和至多29个核苷酸的长度，该第二链具有至多30个核苷酸与从5’端起在位置11、位置12、位置13处在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序；其中该第一链的3’端和该第二链的5’端形成一个平端并且该第二链在其3’端处比该第一链长1-4个核苷酸，其中双链体区的长度是至少25个核苷酸，并且沿着该第二链长度的至少19个核苷酸，该第二链与靶mRNA充分互补，以便当该RNAi试剂被引入到哺乳动物细胞中时减少靶基因表达，并且其中RNAi试剂的dicer裂解优选产生包含该第二链的3’端的siRNA，从而在该哺乳动物中减少靶基因的表达。任选地，该RNAi试剂进一步包含一个配体。
在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链含有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序，其中这些基序中的一个出现在该有义链中的裂解位点处。
在一个实施例中，该RNAi试剂的反义链也可以含有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序，其中这些基序中的一个出现在该反义链中的裂解位点处或附近。
对于具有长度是17-23个核苷酸的双链体区的RNAi试剂，反义链的裂解位点典型地在从5’-端起的10、11和12位置周围。因此，具有三个相同修饰的这些基序可以出现在反义链的9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15位置，计数从反义链的5’-端起从第一个核苷酸开始，或计数从反义链的5’-端起从双链体区内的第一个配对的核苷酸开始。该反义链中的裂解位点还可以根据该RNAi的从5’端起的双链体区的长度而变化。
该RNAi试剂的有义链可以在该链的裂解位点处含有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序；并且反义链可以在该链的裂解位点处或附近具有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序。当该有义链和该反义链形成一种dsRNA双链体时，该有义链和该反义链可以被如此对准，以使得在该有义链上具有三个核苷酸的一个基序和在该反义链上具有三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即该有义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一者与该反义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一者形成碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个核苷酸均可以重叠。
在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链可以含有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的多于一个基序。第一基序可以出现在该链的裂解位点处或附近并且其他基序可以是翼修饰。术语“翼修饰”在此是指出现在链的与同一链裂解位点处或附近的基序分开的另一个部分处的一个基序。该翼修饰或者与该第一基序相邻，或者被至少一个或多个核苷酸分隔。当这些基序彼此紧邻着时，则这些基序的化学性质彼此相异，并且当这些基序被一个或多个核苷酸分隔时，则化学性质可以是相同或不同的。可以存在两个或更多个翼修饰。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以存在于相对于在裂解位点处或附近的该第一基序的一端处或该前导基序的任一侧上。
如同有义链，该RNAi剂的反义链可以含有多于一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，这些基序中的至少一者出现在该链的裂解位点处或附近。这个反义链也可以在一个比对中含有一个或多个与可以在有义链上存在的翼修饰类似的翼修饰。
在一个实施例中，该RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰典型地在该链的3’端、5’端或两端处不包括前一个或两个末端核苷酸。
在另一个实施例中，该RNAi试剂的有义链或反义链上的该翼修饰典型地不包括该链的3’-端、5’-端或这两端处的双链体区内的前一个或两个配对核苷酸。
当该RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，这些翼修饰可以落在双链体区的同一端上，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当该RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，该有义链和该反义链可以被如此对准，以使得各来自一个链的两个修饰落在双链体区的一端上，从而具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各来自一个链的两个修饰落在双链体区的另一端上，从而具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；一个链的两个修饰落在前导基序的每一侧上，从而在双链体区中具有一个、两个、三个核苷酸的重叠。
在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括作为基序的一部分的核苷酸)可以被修饰。每个核苷酸可以被相同或不同的修饰来修饰，该修饰可以包括对非键联的磷酸酯氧中的一个或两个和/或键联的磷酸酯氧中的一个或多个进行一种或多种改变；对核糖的成分例如核糖上的2’羟基进行改变；用“脱磷”接头全部置换磷酸酯部分；修饰或置换天然存在的碱基；以及置换或修饰核糖-磷酸酯骨架。
由于核酸是亚单位的聚合物，所以许多修饰出现在核酸内重复的一个位置处，例如一个碱基或一个磷酸酯部分或一个磷酸酯部分的一个非键联O的一种修饰。在一些情况下，该修饰将出现在该核酸中的所有标的位置处，但在许多情形下它不会这样。通过举例，修饰可以仅出现在3’或5’末端位置处，可以仅出现在末端区中，例如在末端核苷酸上的一个位置处或在一个链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可以出现在双链区、单链区或两者中。修饰可以仅出现在RNA的双链区中或可以仅出现在RNA的单链区中。例如，一个非键联O位置处的一个硫代磷酸酯修饰可以仅出现在一个或两个末端处，可以仅出现在末端区中，例如在末端核苷酸上的一个位置处或在一个链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中，或可以出现在特别是末端处的双链区和单链区中。一个或多个5’端可以被磷酸化。
为了增强稳定性，可能的是例如在突出端中包括具体碱基或在单链突出端中(例如在一个5'或3'突出端或两者中)包括修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可以希望在突出端中包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，一个3'或5'突出端中的全部或一些碱基可以被例如在此描述的修饰而修饰。修饰可以包括，例如使用本领域中已知的修饰在核糖的2’位置处使用修饰，例如使用脱氧核糖核苷酸、代替核碱基的核糖修饰的2’-脱氧-2’-氟代(2’-F)或2’-O-甲基以及硫酸酯基团中的修饰，例如硫代硫酸酯修饰。突出端不必与靶序列同源。
在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-羟基或2’-氟代修饰。这些链可以含有多于一个修饰。在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被2’-O-甲基或2’-氟代修饰。
至少两个不同修饰典型地存在于有义链和反义链上。那两个修饰可以是2’-O-甲基或2’-氟代修饰或其他修饰。
在一个实施例中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。如在此所使用的术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰，每个修饰出现在一个链的交替核苷酸上的基序。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每隔两个核苷酸一个、或一种类似模式。例如，如果A、B和C各自表示对核苷酸的一种修饰类型，则交替基序可以是“ABABABABABAB...”、“AABBAABBAABB...”、“AABAABAABAAB...”、“AAABAAABAAAB...”、“AAABBBAAABBB...”或“ABCABCABCABC...”等。
包含在交替基序中的修饰类型可以是相同或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示核苷酸上的一种修饰类型，则交替模式(即每隔一个核苷酸上的修饰)可以是相同的，但有义链或反义链中的每一个可以是选自交替基序如“ABABAB...”、“ACACAC...”、“BDBDBD...”或“CDCDCD...”等内的若干修饰可能。
在一个实施例中，本发明的RNAi试剂包含的有义链上的交替基序的修饰模式是相对于反义链上的交替基序的修饰模式移位的。该移位可以是如此以使得有义链的核苷酸的修饰基团相应于反义链的核苷酸的不同修饰基团，并且反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从该链的5’-3’起由“ABABAB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从该链的5’-3’起由“BABABA”开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以从该链的5'-3'起由“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从该链的5'-3'起由“BBAABBAA”开始，以使得在该有义链与该反义链之间存在修饰模式的完全或部分移位。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含起初在有义链上具有2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序模式，该模式相对于起初在反义链上具有2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序模式具有移位，即有义链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与反义链上的2’-F修饰的核苷酸碱基配对，并且反之亦然。该有义链的1位置可以由2’-F修饰开始，并且该反义链的1位置可以由2’-O-甲基修饰开始。
将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入到有义链和/或反义链中断了存在于该有义链和/或反义链中的初始修饰模式。通过将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入到有义链和/或反义链而使该有义链和/或反义链的修饰模式的这一中断出人意料地增强了对靶基因的基因沉默活性。
在一个实施例中，当将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到这些链中的任一个时，紧挨着该基序的核苷酸的修饰是与该基序的修饰不同的修饰。例如，含有基序的序列的部分是“...NaYYYNb...”，其中“Y”表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序的修饰，并且“Na”和“Nb”表示不同于Y的修饰的对紧挨着基序“YYY”的核苷酸的修饰，并且其中Na和Nb可以是相同或不同的修饰。可替代地，当存在翼修饰时，Na和/或Nb可以存在或不存在。
该RNAi剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰可以出现在有义链或反义链或这两个链的任何核苷酸上，在该链的任何位置中。例如，核苷酸间键联修饰可以出现在有义链和/或反义链上的每一个核苷酸上；每个核苷酸间键联修饰可以一种交替模式出现在有义链和/或反义链上；或有义链或反义链可以一种交替模式含有这两种核苷酸间键联修饰。该有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可以与该反义链相同或不同，并且该有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可以相对于该反义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式具有移位。在一个实施例中，双链RNAi试剂包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该反义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且该有义链在或者5’-末端或者3’-末端处包含至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一个实施例中，该RNAi在突出端区中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰。例如，该突出端区可以含有两个在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的核苷酸。还可以进行核苷酸间键联修饰以使突出端核苷酸与双链体区内的末端配对的核苷酸连接。例如，至少2个、3个、4个或所有的突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联来连接，并且任选地，可以存在将突出端核苷酸与紧挨着该突出端核苷酸的一个配对的核苷酸连接的另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。例如，在末端三个核苷酸之间可以存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中这三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个是紧挨着该突出端核苷酸的配对的核苷酸。这些末端三个核苷酸可以在该反义链的3’-端处、该有义链的3’-端处、该反义链的5’-端处和/或该反义链的5’端处。
在一个实施例中，该2个核苷酸的突出端是在该反义链的3’-端处，并且在末端的三个核苷酸之间存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中这三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个核苷酸是紧挨着该突出端核苷酸的配对的核苷酸。任选地，该RNAi试剂可以在该有义链的5’-端和在该反义链的5’-端处均另外地具有在末端三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一个实施例中，该RNAi试剂在双链体内包含与靶标的一个或多个错配、或其组合。该错配可以出现在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔融的倾向来分等级(例如对于一个具体配对的缔合或解离自由能，最简单的方法是基于个别对检查这些对，但也可以使用紧接着的相邻物或类似分析)。就促进解离而言，A:U优选于G:C；G:U优选于G:C；并且I:C优选于G:C(I＝肌苷)。错配例如非规范的配对或除了规范以外的配对(如在此其他地方所描述)优选于规范的(A:T、A:U、G:C)配对；并且包括通用碱基的配对优选于规范的配对。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含从反义链的5’-端起在双链体区内的前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个，这些碱基对独立地选自下组，该组具有以下各项：A:U、G:U、I:C和错配的对，例如非规范的配对或除了规范以外的配对，或包括通用碱基的配对，以便促进在双链体的5’-端处解离反义链。
在一个实施例中，从反义链中的5’-端起在双链体区内的1位置处的核苷酸是选自下组，该组由以下各项组成：A、dA、dU、U和dT。可替代地，从该反义链的5’端起在该双链体区内的前1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从该反义链的5’-端起在该双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。
在另一个实施例中，在该有义链的3’-端处的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)。在另一个实施例中，在该反义链的3’-端处的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)。在一个实施例中，在有义链和/或反义链的3’-端上存在脱氧-胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如两个dT核苷酸。
在一个实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3’(I)
其中：
i和j各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
各Na独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
各np和nq独立地表示突出核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同修饰；并且
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。优选地YYY全是2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施例中，Na和/或Nb包含具有交替模式的修饰。
在一个实施例中，该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。例如，当该RNAi试剂具有长度是17-23个核苷酸的一个双链体区时，该YYY基序可以出现在有义链的裂解位点处或附近(例如：可以出现在位置6、位置7、位置8、位置7、位置8、位置9、位置8、位置9、位置10、位置9、位置10、位置11、位置10、位置11、位置12或位置11、位置12、位置13处)，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始；或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始。
在一个实施例中，i是1并且j是0，或i是0并且j是1，或i和j这两者均是1。该有义链因此可以由以下式表示：
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’(Ib)；
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’(Ic)；或
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-Na-nq3’(Id)。
当该有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链表示为式(Ic)时，Nb表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链表示为式(Id)时，各Nb独立地表示包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。各Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z各自可以是彼此相同或不同的。
在其他实施例中，i是0并且j是0，并且该有义链可以由下式表示：
5’np-Na-YYY-Na-nq3’(Ia)。
当该有义链由式(Ia)表示时，各Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施例中，该RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5’nq-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-Na’-np’3’(II)
其中：
k和l各自独立地是0或1；
p’和q’各自独立地是0-6；
各Na’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
各np’和nq’独立地表示突出核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同的修饰；
并且
X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，Na’和/或Nb’包含具有交替模式的修饰。
该Y’Y’Y’基序出现在该反义链的裂解位点处或附近。例如，当该RNAi试剂具有长度是17-23个核苷酸的一个双链体区时，该Y’Y’Y’基序可以出现在反义链的位置9、位置10、位置11；位置10、位置11、位置12；位置11、位置12、位置13；位置12、位置13、位置14；或位置13、位置14、位置15处，其中计数从5’-端起从第一个核苷酸开始；或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始。优选地，该Y’Y’Y’基序出现在位置11、位置12、位置13处。
在一个实施例中，Y’Y’Y’基序全是2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施例中，k是1且l是0，或k是0且l是1，或k和l这两者均是1。
该反义链因此可以由以下式表示：
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’3’(IIb)；
5’nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’3’(IIc)；或
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’3’(IId)。
当该反义链由式(IIb)表示时，Nb’表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链表示为式(IIc)时，Nb’表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链表示为式(IId)时，各Nb’独立地表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施例中，k是0并且l是0，并且该反义链可以由下式表示：
5’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3’(Ia)。
当该反义链表示为式(IIa)时，各Na’独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’和Z’各自可以是彼此相同或不同的。
该有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地被LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基或2’-氟代修饰。例如，该有义链和反义链的每个核苷酸独立地由2’-O-甲基或2’-氟代修饰。具体地说，各X、Y、Z、X’、Y’和Z’可以表示2’-O-甲基修饰或2’-氟代修饰。
在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链可以含有YYY基序，当双链体区是21个核苷酸时，该YYY基序出现在该链的9、10和11位置处，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始；并且Y表示2’-F修饰。该有义链可以另外地含有XXX基序或ZZZ基序作为该双链体区的相反端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一个实施例中，该反义链可以含有出现在该链的位置11、12和13处的Y’Y’Y’基序，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始；并且Y’表示2’-O-甲基修饰。该反义链可以另外地含有X’X’X’基序或Z’Z’Z’基序作为该双链体区的相反端处的翼修饰；并且X’X’X’和Z’Z’Z’各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由以上式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链与对应地由式(IIa)、(IIb)、(IIe)和(IId)中的任一个表示的反义链形成一种双链体。
因此，用于本发明的这些方法中的RNAi试剂可以包含一个有义链和一个反义链，每个链具有14至30个核苷酸，该RNAi双链体由式(III)表示：
有义：5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3’
反义：3’np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’5’
(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
各np’、np、nq’和nq独立地表示突出端核苷酸，该np’、np、nq’和nq中的每一个可以或可以不存在；并且
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，i是0并且j是0；或i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j这两者均是0；或i和j这两者均是1。在另一个实施例中，k是0并且l是0；或k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l这两者均是0；或k和l这两者均是1。
形成RNAi双链体的该有义链和反义链的示例性组合包括下式：
5’np-Na-YYY-Na-nq3’
3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’nq’5’
(IIIa)
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’
3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’nq’5’
(IIIb)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’
3’np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-nq’5’
(IIIc)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’
3’np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na-nq’5’
(IIId)
当该RNAi试剂由式(IIIa)表示时，各Na独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi试剂由式(IIIb)表示时，各Nb独立地表示包含1-10个、1-7个、1-5个或1-4个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi试剂表示为式(IIIc)时，各Nb、Nb’独立地表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi试剂表示为式(IIId)时，各Nb、Nb’独立地表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。各Na、Na’独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’中的每一个独立地包含具有交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的X、Y和Z各自可以是彼此相同或不同的。
当该RNAi试剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示时，这些Y核苷酸中的至少一个可以与这些Y’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些Y核苷酸中的至少两个与相对应的Y’核苷酸形成碱基对；或所有三个Y核苷酸与相对应的Y’核苷酸都形成碱基对。
当该RNAi试剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，这些Z核苷酸中的至少一个可以与这些Z’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些Z核苷酸中的至少两个与相对应的Z’核苷酸形成碱基对；或所有三个Z核苷酸与相对应的Z’核苷酸都形成碱基对。
当该RNAi试剂表示为式(IIIc)或(IIId)时，这些X核苷酸中的至少一个可以与这些X’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些X核苷酸中的至少两个与相对应的X’核苷酸形成碱基对；或所有三个X核苷酸与相对应的X’核苷酸都形成碱基对。
在一个实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z’核苷酸上的修饰，和/或X核苷酸上的修饰不同于X’核苷酸上的修饰。
在一个实施例中，当该RNAi试剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟代修饰。在另一个实施例中，当该RNAi试剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟代修饰，并且np’>0并且至少一个np’通过硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上。在又另一个实施例中，当该RNAi试剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟代修饰，np’>0并且至少一个np’通过硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上，并且有义链被缀合到通过二价或三价支链接头(如下描述)附接的一种或多种GalNAc衍生物上。在另一个实施例中，当该RNAi试剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟代修饰，np’>0并且至少一个np’通过硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联，并且有义链被缀合到通过二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物上。
在一个实施例中，当该RNAi试剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟代修饰，np’>0并且至少一个np’通过硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联，并且有义链被缀合到通过二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物上。
在一个实施例中，该RNAi试剂是一种多聚体，该多聚体含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体，其中这些双链体通过一种接头来连接。该接头可以是可裂解的或不可裂解的。任选地，该多聚体进一步包含一个配体。这些双链体各自可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体各自可以在两个不同靶位点处靶向相同基因。
在一个实施例中，该RNAi试剂是一种多聚体，该多聚体含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的三个、四个、五个、六个或更多个双链体。该接头可以是可裂解的或不可裂解的。任选地，该多聚体进一步包含一个配体。这些双链体各自可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体各自可以在两个不同靶位点处靶向相同基因。
在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的两种RNAi试剂在5’端和这些3’端中的一个或两个处彼此连接，并且任选地缀合到一个配体上。这些试剂各自可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些试剂各自可以在两个不同靶位点处靶向相同基因。
不同公开物描述了可以在本发明的这些方法中使用的多聚体RNAi试剂。此类公开物包括WO2007/091269、美国专利号7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887以及WO2011/031520，所述公开物的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
如下更详细地描述，含有一个或多个碳水化合物部分与RNAi试剂的缀合的RNAi试剂可以优化该RNAi试剂的一种或多种特性。在许多情况下，该碳水化合物部分将被附接到该RNAi试剂的一个修饰的亚单元上。例如，一种dsRNA试剂的一个或多个核糖核苷酸亚单元的核糖可以被另一个部分(例如，一个碳水化合物配体所附接的一个非碳水化合物(优选环状)载体)置换。其中亚单元的核糖被如此置换的核糖核苷酸亚单元在此被称为核糖置换修饰亚单元(RRMS)。一种环状载体可以是一个碳环系统，即所有环原子均是碳原子，或一个杂环系统，即一个或多个环原子可以是一个杂原子，例如氮、氧、硫。该环状载体可以是一个单环系统，或可以含有两个或更多个环，例如稠合环。该环状载体可以是一个完全饱和的环系统，或它可以含有一个或多个双键。
该配体可以通过一个载体附接到多核苷酸上。这些载体包括(i)至少一个“骨架附接点”、优选两个“骨架附接点”，和(ii)至少一个“系拴附接点”。如在此使用的“骨架附接点”是指一个官能团(例如一个羟基基团)，或通常，可供用于并且适用于将该载体结合到一种核糖核酸的骨架(例如含硫骨架)中的一个键(例如磷酸酯或修饰的磷酸酯)。在一些实施例中，“系栓附接点”(TAP)是指该环状载体的、连接一个选择的部分的一个组成环原子，例如一个碳原子或一个杂原子(相异于提供骨架附接点的原子)。该部分可以是例如一种碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖以及多糖。任选地，该选择的部分通过一个介入系拴物连接到该环状载体上。因此，该环状载体将经常包括一个官能团(例如氨基基团)，或通常提供适用于将另一个化学实体(例如一个配体)结合或系拴到组成型环上的一个键。
这些RNAi试剂可以通过一种载体缀合到一个配体上，其中该载体可以是环状基团或非环状基团；优选地，该环状基团是选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基以及十氢化萘；优选地，该非环状基团是选自丝氨醇骨架或二乙醇胺骨架。
在某些具体的实施例中，用于本发明的这些方法中的RNAi试剂是选自下组的一种试剂，该组具有在表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中列出的试剂。这些试剂可以进一步包含一个配体。
IV.缀合到配体上的iRNA
本发明的iRNA的RNA的另一种修饰涉及使RNA化学连接到一种或多种增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取的配体、部分或共轭物上。此类部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分(莱兹斯英格(Letsinger)等人，美国科学院院报(Proc.NatlAcid.Sci.USA)，1989，86:6553-6556)、胆酸(曼汉兰(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Biorg.Med.Chem.Let.)，1994，4:1053-1060)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(曼汉兰等人，纽约科学院年报(Ann.NY.Acad.Sci.)，1992，660:306-309；曼汉兰等人，生物有机化学与医药化学通讯，1993，3:2765-2770)、硫代胆固醇(奥伯豪泽尔(Oberhauser)等人，核酸研究(NuclAcidsRes.)，1992，20:533-538)、脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(赛松-贝莫若斯(Saison-Behmoaras)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ)，1991,10:1111-1118；卡巴诺夫(Kabanov)等人，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)，1990，259:327-330；斯威那查克(Svinarchuk)等人，生化与分子生物学(Biochimie)，1993，75:49-54)、磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-磷酸酯(曼汉兰等人，四面体快报(TetrahedronLett.)，1995，36:3651-3654；谢伊(Shea)等人，核酸研究，1990，18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(曼汉兰等人，核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14:969-973)、或金刚烷乙酸(曼汉兰等人，四面体快报，1995,36:3651-3654)、棕榈基部分(米什拉(Mishra)等人，生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)，1995，1264:229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(克鲁克(Crooke)等人，美国药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1996，277:923-937)。
在一个实施例中，配体改变向其中并入该配体的iRNA试剂的分布、靶向或寿命。在优选实施例中，与例如不存在这样一个配体的物种相比，这种配体为选择的靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室、组织、器官或身体的区域))提供增强的亲和力。优选的配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊糖、环糊精、N-乙酰半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体还可以是重组或合成的分子，如合成聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括作为一种聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪的聚氨基酸。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树枝状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉类化合物(TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、大环扩展卟啉(Sapphyrin))、多环芳香族烃类(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子，例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、甲醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)以及肽缀合物(例如，触角基因肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、运输/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑团簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对辅助配体具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如结合到指定细胞类型如肝细胞上的抗体。配体还可以包括激素和激素受体。配体还可以包括非肽物种，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、多价甘露糖或多价岩藻糖。该配体可以例如是脂多糖、p38MAP激酶的激活物或NF-κB的激活物。
该配体可以是可以例如通过破坏细胞的细胞骨架(例如通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加iRNA试剂摄入到细胞中的物质，例如药物。该药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑(nocodazole)、促微丝聚合剂(japlakinolide)、拉春库林A(latrunculinA)、鬼笔环肽、海洋苔藓素A(swinholideA)、茚满诺星(indanocine)或myoservin。
在一些实施例中，附接到如在此所描述的iRNA上的一个配体用作药物代谢动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲油物质、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括，但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素等。包含许多硫代磷酸酯键联的寡核苷酸也已知与血清蛋白结合，因此骨架中包含多个硫代磷酸酯键联的短寡核苷酸，例如具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，也服从于本发明作为配体(例如作为PK调节配体)。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适配体也适合用作在此所述的这些实施例中的PK调节配体。
本发明的配体-缀合的寡核苷酸可以通过使用这样一种寡核苷酸来合成，该寡核苷酸具有下垂的反应功能性，例如来源于该寡核苷酸上的连接分子的附接(如下所述)。该反应性寡核苷酸可以直接与可商购的配体，合成的、具有多种保护基中的任一种的配体，或具有连接部分附接于其上的配体发生反应。
在本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以方便且常规地通过固相合成的熟知技术来制备。用于这种合成的仪器由若干个供应商销售，包括例如美国应用生物系统公司(加利福利亚州，福斯特市(FosterCity,Calif))。可另外地或替代地使用本领域中已知的用于这种合成的任何其他装置。使用类似的技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物)也是已知的。
在本发明的配体-缀合的寡核苷酸以及具有序列特异性连接的核苷的配体-分子中，该寡核苷酸以及寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体，或已经具有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体，已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体，或带有结构基元的非核苷配体，在适合的DNA合成仪上进行组装。
当使用已经具有连接部分的核苷酸-共轭物前体时，典型地完成该序列特异性连接的核苷的合成，并且然后该配体分子与该连接部分反应以形成配体共轭的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的这些寡核苷酸或连接的核苷通过自动化的合成仪，使用除了可商购的并且常规用于寡核苷酸合成中的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺以外的来源于配体-核苷缀合物的亚磷酰胺来合成。
A.脂质缀合物
在一个实施例中，该配体或缀合物是一种脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许缀合物分布至一个靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，该靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加缀合物对降解的抗性，(b)增加靶向或运输到靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。
基于脂质的配体可以用来抑制(例如控制)缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使缀合物靶向肾。
在一个优选实施例中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，它以足够的亲和力结合HSA，以使得该缀合物将优选地分布至非肾组织。然而，优选的是这种亲和力并不是这样强，以使得HSA-配体结合不能逆转。
在另一个优选实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合HSA，这样使得缀合物将优选地分布至肾。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，还可以使用靶向肾细胞的其他部分。
另一方面，该配体是由靶细胞(例如正在增殖的细胞)摄取的部分，例如维生素。这些特别有用于治疗特征在于不想要的细胞增殖(例如具有恶性或非恶性类型，例如癌细胞)的病症。示例性维生素包括维生素A、维生素E和维生素K。其他示例性维生素包括维生素B，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或由靶细胞如肝脏细胞摄取的其他维生素或营养物。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
B.细胞渗透剂
另一方面，该配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋细胞渗透剂。优选地，该试剂是两亲的。一种示例性试剂是肽如tat或触角足蛋白。如果该试剂是肽，则它可以被修饰，包括肽酰基模拟物、反转异构体、非肽键联或假肽键联和D-氨基酸的使用。该螺旋剂优选地是一种α-螺旋剂，该α-螺旋剂优选具有一个亲脂性相和一个疏脂性相。
该配体可以是一种肽或肽模拟物。肽模拟物(在此又称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA剂的接合可以影响iRNA的药物代谢动力学分布，如通过增强细胞鉴别与吸收。该肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代中，该肽部分可以包含疏水性膜转位序列(MTS)。一个示例性的含疏水性MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQIDNO:9)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQIDNO:10))也可以是靶向部分。该肽部分可以是一个“递送”肽，该递送肽可以携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸和跨细胞膜的蛋白。例如，已经发现来自HIVTat蛋白的序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQIDNO:11))和果蝇触角足蛋白的序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQIDNO:12))能够作为递送肽发挥作用。肽或肽模拟物可以通过DNA的随机序列来编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(拉姆(Lam)等人，自然，354:82-84,1991)。通过为了细胞靶向的目的结合的单体单元栓系至dsRNA试剂的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以在从约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内。这些肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或引导构象特性。可以利用以下描述的任何结构修饰。
用于本发明的这些组合物和方法中的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化以促进靶向一个或多个特定组织。含RGD的肽和肽模拟物可以包括D-氨基酸以及合成的RGD模拟物。除了RGD以外，可以使用靶向整合素配体的其他部分。这个配体的优选缀合物靶向PECAM-1或VEGF。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以例如是α-螺旋线性肽(例如，LL-37或天蚕素(Ceropin)P1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽)、或仅含有一种或两种主要的氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可以包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二重的两亲性肽，如MPG，该肽来源于HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(斯米尼(Simeoni)等人，核酸研究，31:2717-2724，2003)。
C.碳水化合物缀合物
在本发明的这些组合物和方法的一些实施例中，iRNA寡核苷酸进一步包含一种碳水化合物。该碳水化合物缀合的iRNA有利于体内递送如在此所描述的核酸以及适用于体内治疗使用的组合物。如在此所使用，“碳水化合物”是指作为本身由具有至少6个碳原子(这些碳原子可以是线性、支链或环状的)与键合到每个碳原子上的氧、氮或硫原子的一个或多个单糖单元组成的碳水化合物的化合物；或具有由一个或多个单糖单元组成的碳水化合物部分的一部分的化合物，每个单糖具有至少六个碳原子(这些碳原子可以是线性、支链或环状的)与键合到每个碳原子上的氧、氮或硫原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖以及含有从约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖)，以及多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C5和以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元的糖(例如，C5、C6、C7或C8)。
在一个实施例中，用于在本发明的这些组合物和方法中的碳水化合物缀合物是一种单糖。在一个实施例中，该单糖是一种N-乙酰半乳糖胺，如
化学式II。
在另一个实施例中，用于在本发明的这些组合物和方法中的碳水化合物缀合物是选自下组，该组由以下各项组成：
化学式II、
化学式III、
化学式IV、
化学式V、
化学式VI、
化学式VII、
化学式VIII、
化学式IX、
化学式X、
化学式XI、
化学式XII、
化学式XIII、
化学式XIV、
化学式XV、
化学式XVI、
化学式XVII、
化学式XVIII、
化学式XIX、
化学式XX、
化学式XXI、
化学式XXII。
用于所描述的这些实施例中的另一个代表性的碳水化合物缀合物包括，但不限于
(化学式XXIII)，
当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在一些实施例中，该碳水化合物缀合物进一步包含如上所描述的一个或多个另外的配体，如但不限于PK调节剂和/或细胞渗透肽。
D.接头
在一些实施例中，在此描述的该缀合物或配体可以借助不同接头附接到iRNA寡核苷酸上，这些接头可以是可裂解的或不可裂解的。
术语“接头”或“连接基团”意指连接化合物的两个部分，例如共价附接化合物的两个部分的有机部分。接头典型地包括直接键或原子如氧或硫、单元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，如但不限于取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，该一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环中断或封端；其中R8是氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在一个实施例中，该接头是在约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子、7-17、8-17、6-16、7-16或8-16个原子之间。
可裂解的连接基团在细胞外是足够稳定的一种基团，但该基团在进入靶细胞时被裂解以释放该接头结合在一起的两个部分。在一个优选实施例中，该可裂解的连接基团在靶细胞中或在一种第一参考条件(该第一参考条件可以例如被选择成模拟或代表细胞内条件)下的裂解比在受试者的血液中或在一种第二参考条件下(该第二参考条件可以例如被选择成模拟或代表在该血液或血清中发现的条件)快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少约100倍。
可裂解的连接基团对裂解剂敏感，例如pH、氧化还原电势或存在降解性分子。通常，裂解剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性被发现。此类降解剂的实例包括：被选择用于具体底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中，可以通过还原降解氧化还原可裂解的连接基团的氧化性或还原性酶或还原剂如硫醇；酯酶；可以产生酸性环境的核内体或试剂，例如产生5或更低的pH的那些；可以通过用作广义酸、肽酶(该肽酶可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可裂解的连接基团的酶。
一种可裂解的键基团，如二硫键可以对pH敏感。人血清的pH是7.4，而平均的细胞内pH稍低，在约7.1-7.3范围内。核内体具有在5.5-6.0范围内的更酸性的pH，并且溶酶体具有在5.0左右的甚至更酸性的pH。一些接头将具有在优选的pH下裂解的可裂解的连接基团，从而使阳离子脂质从细胞内的配体中释放，或进入希望的细胞区室中。
接头可以包括可被一种具体的酶裂解的可裂解的连接基团。结合到接头中的可裂解的连接基团的类型可以取决于有待靶向的细胞。例如靶向肝脏的配体可以通过包括酯基团的接头而被连接到阳离子脂质上。肝脏细胞富含酯酶，并且因此该接头将在肝脏细胞中比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地裂解。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质以及睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用含有肽键的接头。
通常，一种候选的可裂解的连接基团的适合性可以通过测试降解剂(或条件)裂解该候选的连接基团的能力来进行评估。还希望的是也测试该候选的可裂解的连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗裂解的能力。因此，可以确定在一种第一条件与一种第二条件之间进行裂解的相对敏感性，其中该第一条件被选择成指示在靶细胞中的裂解并且该第二条件被选择成指示在其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的裂解。这些评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整个动物中的进一步评估来进行确证。在优选实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择成模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解比在血液或血清(或在被选择成模拟细胞外条件的体外条件下)中的裂解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。
i.氧化还原可裂解的连接基团
在一个实施例中，可裂解的连接基团是在还原或氧化时被裂解的一种氧化还原可裂解的连接基团。可还原裂解的连接基团的一个实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定一种候选的可裂解连接基团是否是适合的“可还原裂解的连接基团”，或例如是否适合于与一种特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如可以通过用二硫苏糖醇(DTT)或本领域中已知的其他使用还原剂的试剂进行孵育来对一种候选物进行评估，这模拟了会在细胞(例如靶细胞)中观察到的裂解速率。还可以在被选择成模拟血液或血清条件的条件下对这些候选物进行评估。在一个实施例中，候选化合物在血液中被裂解至多约10％。在其他实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择成模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择成模拟细胞外条件的体外条件下)中的降解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。可以在被选择成模拟细胞内介质的条件下，使用标准的酶动力学测定来确定候选化合物的裂解速率，并且将其与被选择成模拟细胞外介质的条件下的速率相比较。
ii.基于磷酸酯的可裂解的连接基团
在另一个实施例中，可裂解接头包括一种基于磷酸酯的可裂解的连接基团。基于磷酸酯的可裂解的连接基团通过降解或水解磷酸酯基团的试剂来裂解。在细胞中裂解磷酸酯基团的试剂的一个实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选实施例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一个优选实施例是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
iii.酸可裂解的连接基团
在另一个实施例中，可裂解的接头包括一种酸可裂解的连接基团。酸可裂解的连接基团是在酸性条件下裂解的连接基团。在优选实施例中，酸可裂解的连接基团在具有约6.5或更低(例如约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的pH的酸性环境中裂解，或被多种试剂(如可以用作广义酸的酶)裂解。在细胞中，具体的低pH细胞器(如核内体或溶酶体)可以为酸可裂解的连接基团提供一种裂解环境。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可裂解的基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。一个优选实施例是当附接到酯(烷氧基基团)的氧的碳是芳基基团、取代的烷基基团或叔烷基基团(如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
iv.基于酯的连接基团
在另一个实施例中，可裂解的接头包括一种基于酯的可裂解的连接基团。基于酯的可裂解的连接基团通过酶如细胞中的酯酶与酰胺酶来裂解。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基以及亚炔基基团的酯。酯可裂解的连接基团具有通式-C(O)O或-OC(O)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
v.基于肽的裂解基团
在又另一个实施例中，可裂解的接头包括一种基于肽的可裂解的连接基团。基于肽的可裂解的连接基团通过酶如细胞中的肽酶和蛋白酶来裂解。基于肽的可裂解的连接基团是在氨基酸之间形成以得到寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可裂解的基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以得到肽和蛋白质的特定类型的酰胺键。基于肽的裂解基团通常限于在氨基酸之间形成从而得到肽和蛋白质的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可裂解的连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
在一个实施例中，本发明的iRNA通过一种接头被缀合到碳水化合物上。本发明的这些组合物和方法的具有接头的iRNA碳水化合物缀合物的非限制性实例包括但不限于，
(化学式XXIV)、
(化学式XXV)、
(化学式XXVI)、
(化学式XXVII)、
(化学式XXVIII)、
(化学式XXIX)以及
(化学式XXX)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在本发明的这些组合物和方法的某些实施例中，配体是通过二价或三价支链接头附接的一种或多种“GalNAc”(N-乙酰半乳糖胺)衍生物。
在一个实施例中，本发明的dsRNA被缀合到选自下组的一种二价或三价支链接头上，该组具有以任何式(XXXI)-(XXXIV)示出的结构：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B以及q5C对于每次出现独立地表示0-20并且其中该重复单元可以是相同或不同的；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C对于每次出现各自独立地是：不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C对于每次出现独立地是：不存在、亚烷基、取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下各项中的一个或多个中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C对于每次出现各自独立地是：不存在、
NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即对于每次出现各自独立地表示单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物特别有用于与RNAi试剂一起使用以用于抑制靶基因的表达，如具有式(XXXV)的那些：
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，如GalNAc衍生物。
适合的缀合GalNAc衍生物的二价和三价支链接头基团的实例包括，但不限于以上如式II、式VII、式XI、式X和式XIII所列举的结构。
教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，所述美国专利的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
对于给定化合物中的所有位置不必一致地被修饰，并且事实上，前面提到的修饰中的多于一种可以结合在单个化合物中或甚至iRNA内的单个核苷处。本发明还包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中的“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，优选地dsRNA，这些iRNA化合物含有两个或更多个化学相异的区，每个区由至少一个单体单元组成，即，在dsRNA化合物的情况下是核苷酸。
这些iRNA典型地含有至少一个区域，其中该RNA被修饰以便赋予iRNA增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取和/或增加的靶核酸结合亲和力。iRNA的一个另外的区可以用作能够裂解RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。通过举例，RNA酶H是裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶标的裂解，从而大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，可以在使用嵌合dsRNA时，经常用较短的iRNA获得可比较的结果。可以常规地通过凝胶电泳并且如果必要的话联合本领域中已知的核酸杂交技术来检测该RNA靶标的裂解。
在某些实例中，iRNA的RNA可以通过非配体基团来进行修饰。许多非配体分子已经被缀合到iRNA上以增强该iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类缀合的程序在科学文献中是可获得的。此类非配体部分包括脂质部分，如胆固醇(库伯(Kubo)T.等人，生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，2007，365(1):54-61；莱兹斯英格等人，美国科学院院报，1989，86:6553)、胆酸(曼汉兰等人，生物有机化学与医药化学通讯，1994，4:1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(曼汉兰等人，纽约科学院年报，1992，660:306；曼汉兰等人，生物有机化学与医药化学通讯，1993，3:2765)、硫代胆固醇(奥伯豪泽尔等人，核酸研究，1992，20:533)、脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(赛松-贝莫若斯等人，欧洲分子生物学学会杂志，1991,10:111；卡巴诺夫等人，欧洲生化学会联合会快报，1990，259:327；斯威那查克等人，生化与分子生物学，1993，75:49)、磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(曼汉兰等人，四面体快报，1995，36:3651；谢伊等人，核酸研究，1990，18:3777)、聚胺或聚乙二醇链(曼汉兰等人，核苷与核苷酸，1995，14:969)、或金刚烷乙酸(曼汉兰等人，四面体快报，1995,36:3651)、棕榈基部分(米什拉等人，生物化学与生物物理学报，1995，1264:229)、或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(克鲁克等人，美国药理学与实验治疗学杂志，1996，277:923)。教导此类RNA缀合物的制备的代表性美国专利已经在上文列出。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置处合成具有氨基接头的RNA。然后使用适当的偶联剂或活化剂使该氨基基团与被缀合的分子进行反应。可以用仍与固相载体结合或在裂解RNA之后处于溶液相中的RNA来进行缀合反应。通过HPLC纯化RNA缀合物典型地提供纯的缀合物。
IV.本发明的iRNA的递送
可以通过许多不同方式实现本发明的iRNA向一种细胞的递送，该细胞例如受试者内的细胞，如人受试者(例如，有需要的受试者，如患有补体组分C5相关联的疾病的受试者)。例如，可以通过在体外或体内使细胞与本发明的iRNA接触来进行递送。还可以通过向受试者给予包含iRNA(例如dsRNA)的组合物来直接进行体内递送。可替代地，可以通过给予编码并且引导iRNA表达的一种或多种载体来间接进行体内递送。这些替代方案在以下进一步论述。
通常，递送核酸分子(体外或体内)的任何方法均可以被适配用于与本发明的iRNA一起使用(参见，例如阿赫塔尔(Akhtar)S.和朱利安(Julian)RL.(1992)细胞生物学趋势(TrendsCell.Biol.)2(5):139-144和WO94/02595，所述参考文献通过引用以其全文结合在此)。对于体内递送，为了递送iRNA分子所考虑的因素包括例如，所递送的分子的生物稳定性、非特异性效应的预防以及所递送的分子在靶组织中的累积。可以通过局部给予，例如通过直接注射或植入到组织中或局部给予制剂来使iRNA的非特异性效应最小化。向治疗部位局部给予使试剂的局部浓度最大化，限制该试剂向全身组织的暴露，该全身组织否则可以受该试剂损害或可以降解该试剂，并且容许给予较低总剂量的iRNA分子。若干研究已经显示在局部给予iRNA时成功敲低基因产物。例如，通过在食蟹猴中玻璃体内注射(托伦蒂诺(Tolentino)ML等人(2004)视网膜(Retina)24:132-138)和在小鼠中视网膜下注射(赖希(Reich)SJ.等人(2003)分子视觉(Mol.Vis.)9:210-216)进行的VEGFdsRNA眼内递送均显示出在年龄相关的黄斑变性的实验模型中预防新血管形成。另外，在小鼠中直接瘤内注射dsRNA使肿瘤体积减小(佩雷(Pille)J.等人(2005)分子疗法(Mol.Ther.)11:267-274)，并且可以延长荷瘤小鼠的存活期(金姆WJ.等人(2006)分子疗法14:343-350；李(Li)S.等人(2007)分子疗法15:515-523)。RNA干扰也已经显示通过直接注射来向CNS局部递送(多恩(Dorn)G.等人(2004)核酸(NucleicAcids)32:e49；谈(Tan)PH.等人(2005)基因疗法(GeneTher.)12:59-66；马卡马如(Makimura)H.等人(2002)BMC神经科学(BMCNeurosci.)3:18；希什金娜(Shishkina)G.等人(2004)神经科学(Neuroscience)129:521-528；塔克尔(Thakker)ER.等人(2004)美国科学院院报101:17270-17275；阿卡尼亚(Akaneya)Y.等人(2005)神经生理学杂志(J.Neurophysiol)93:594-602)，并且通过鼻内给予向肺局部递送(霍华德(Howard)KA.等人(2006)分子疗法14:476-484；张(Zhang)X.等人(2004)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279:10677-10684；比特克(Bitko)V.等人(2005)自然医学(Nat.Med.)11:50-55)。对于全身给予iRNA以用于治疗疾病，该RNA可以被修饰或替代地使用一个药物递送系统来递送；这两种方法用来防止在体内由核酸内切酶和核酸外切酶引起的dsRNA的快速降解。对RNA或药物载体的修饰还可以容许iRNA组合物靶向靶组织，并且避免不希望的脱靶效应。iRNA分子可以通过化学缀合到亲脂基团如胆固醇上而被修饰，以便增强细胞摄取并且防止降解。例如将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对ApoB的iRNA全身注射到小鼠中并且导致肝脏和空肠两者中apoBmRNA的敲减(苏兹赫克(Soutschek)J.等人(2004)自然432:173-178)。已经显示iRNA与适配体的缀合在前列腺癌的小鼠模型中抑制肿瘤生长并且介导肿瘤消退(麦克纳马拉(McNamara)JO.等人(2006)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)24:1005-1015)。在替代实施例中，可以使用药物递送系统如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜增强相互作用以容许iRNA由细胞高效摄取。阳离子脂质、树状物或聚合物可以或者结合到iRNA上，或者诱导形成包住iRNA的囊泡或胶束(参见例如，金姆SH等人(2008)控释杂志(JournalofControlledRelease)129(2):107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身给予时iRNA的降解。用于制备并且给予阳离子-iRNA复合物的方法是处于本领域技术人员能力范围内的(参见例如，索伦森(Sorensen)DR.等人(2003)分子生物学杂志(J.Mol.Biol)327:761-766；维尔马(Verma)UN.等人(2003)临床癌症研究(Clin.CancerRes.)9:1291-1300；阿诺德(Arnold)AS等人(2007)高血压杂志(J.Hypertens.)25:197-205，所述参考文献通过引用以其全文结合在此)。有用于全身递送iRNA的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(索伦森DR.等人(2003)，同上；维尔马UN.等人(2003)，同上)、Oligofectamine“固体核酸脂质颗粒”(齐默曼(Zimmermann)TS.等人(2006)自然441:111-114)、心磷脂(钱(Chien)PY.等人(2005)癌症基因疗法(CancerGeneTher.)12:321-328；帕尔(Pal)A.等人(2005)国际肿瘤学杂志(IntJ.Oncol.)26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(邦尼特(Bonnet)ME.等人(2008)药学研究(Pharm.Res.)8月16日的印刷前电子版本；艾格纳(Aigner)A.(2006)生物医学与生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(刘(Liu)S.(2006)分子制药(Mol.Pharm.)3:472-487)以及聚酰胺型胺类(托马利亚(Tomalia)DA.等人(2007)生物化学会汇刊(Biochem.Soc.Trans.)35:61-67；奥沙瓦(Yoo)H.等人(1999)药学研究16:1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身给予的复合物。用于给予iRNA和环糊精的药物组合物的方法可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用以其全文结合在此。
A.载体编码的本发明的iRNA
靶向C5基因的iRNA可以由插入到DNA或RNA载体中的转录单元表达(参见，例如库蒂尔(Couture)A.等人TIG.(1996)，12:5-10；斯基伦(Skillern)A.等人，国际PCT公开号WO00/22113；康拉德(Conrad)，国际PCT公开号WO00/22114以及康拉德，美国专利号6,054,299)。取决于使用的具体构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持久的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。该转基因还可以被构建成容许其被遗传作为一种染色体外的质粒(加斯曼(Gassmann)等人美国科学院院报(1995)92:1292)。
iRNA的单个链或多个链可以从表达载体上的启动子转录。当两个单独的链有待被表达以产生例如dsRNA时，可以将两个单独的表达载体共引入(例如通过转染或感染)到靶细胞中。可替代地，dsRNA的每个单独链可以通过均位于相同表达质粒上的启动子来转录。在一个实施例中，dsRNA被表达为通过一种接头多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，这样使得该dsRNA具有茎环结构。
iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体、优选地与脊椎动物细胞相容的那些，可以用来产生用于表达如在此所描述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域中熟知的并且从许多商业来源可获得。典型地，提供含有用于插入希望的核酸区段的合宜限制性位点的这类载体。iRNA表达载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌肉内给予，通过向从患者外植接着重新引入到患者中的靶细胞给予，或通过允许引入到希望的靶细胞中的任何其他手段。
iRNA表达质粒可以被转染到靶细胞中作为具有阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如，Transit-TKOTM)的复合物。本发明还想到了在一周或更长时间范围内用于iRNA介导的靶向靶RNA的不同区的敲低的多次脂质转染。成功地将载体引入到宿主细胞中可以使用多种已知的方法来监测。例如瞬时转染可以使用一种报告基因来进行信号化，例如荧光标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。可以使用标志物来确保细胞离体的稳定转染，这些标志物提供对特定环境因素(例如，抗生素和药物)具有抗性如潮霉素B抗性的转染的细胞。
可以与在此描述的这些方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括，但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼氏鼠白血病病毒等；(c)腺伴随病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头状瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体如正痘病毒，例如牛痘病毒载体或禽痘病毒，例如金丝雀痘或鸡痘；以及(j)辅助依赖性或空壳的腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体将并入或将不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包含病毒序列以用于转染。可替代地，构建体可以并入能够发生附加体型复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。用于重组表达iRNA的构建体通常将需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。以下进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。
有用于递送iRNA的载体将包括足以在希望的靶细胞或组织中表达iRNA的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件以提供组成型或调节/诱导型表达。
iRNA的表达可以例如通过使用对某些生理学调节剂例如循环的葡萄糖水平或激素敏感的一种诱导型调节序列来精确调节(多彻蒂(Docherty)等人，1994，FASEB杂志(FASEBJ.)8:20-24)。适合于在细胞中或哺乳动物中控制dsRNA表达的此类诱导型表达系统包括例如由以下各项进行的调节：蜕皮激素、雌激素、黄体酮、四环素、二聚作用的化学诱导物以及异丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途选择适当的调节/启动子序列。
可以使用含有编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见米列尔(Miller)等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)217:581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有对于病毒基因组正确包装并整合入宿主细胞DNA必需的组分。将编码iRNA的核酸序列克隆到促进该核酸递送入患者的一种或多种载体中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以例如在博森(Boesen)等人，生物疗法(Biotherapy)6:291-302(1994)中找到，该参考文献描述了一种逆转录病毒载体将mdrl基因递送至造血干细胞以便制备对化学疗法更有抗性的干细胞的用途。说明逆转录病毒载体在基因疗法中的用途的其他参考文献是：克洛斯(Clowes)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)93:644-651(1994)；凯尔门(Kiem)等人，血液(Blood)83:1467-1473(1994)；萨蒙斯(Salmons)和根兹伯格(Gunzberg)，人类基因疗法(HumanGeneTherapy)4:129-141(1993)；以及格罗斯曼(Grossman)和威尔森(Wilson)，遗传学与发育新观点(Curr.Opin.inGeneticsandDevel)3:110-114(1993)。想到使用的慢病毒载体包括例如描述于美国专利号6,143,520；5,665,557和5,981,276中的基于HIV的载体，所述美国专利通过引用结合在此。
还想到腺病毒用于本发明的iRNA的递送中。腺病毒是特别有吸引力的媒介物，例如用于递送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感不分裂细胞的优点。科扎斯凯(Kozarsky)和威尔森,遗传学与发育学新观点3:499-503(1993)提出基于腺病毒的基因疗法的综述。布特(Bout)等人，人类基因疗法5:3-10(1994)展示了腺病毒载体将基因转移至恒河猴呼吸道上皮的用途。腺病毒在基因疗法中的用途的其他实例可以在罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，科学(Science)252:431-434(1991)；罗森菲尔德等人，细胞68:143-155(1992)；马斯安格利(Mastrangeli)等人，临床研究杂志91:225-234(1993)；PCT公开WO94/12649以及王(Wang)等人，基因疗法2:775-783(1995)中找到。用于表达在本发明中体现的iRNA的适合的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将载体递送到靶细胞中的方法被描述于夏(Xia)H等人(2002)，自然生物技术20:1006-1010中。
腺伴随病毒(AAV)载体还可以用来递送本发明的iRNA(瓦尔希(Walsh)等人，实验生物学与实验医学会会报(Proc.Soc,Exp.Biol.Med.)204:289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，iRNA可以从具有例如U6或H1RNA启动子或细胞巨化病毒(CMV)启动子的重组AAV载体作为两个单独的互补性单链RNA分子表达。用于表达在本发明中体现的dsRNA的适合的AAV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将载体递送到靶细胞中的方法被描述于萨穆尔斯基(Samulski)R等人(1987)，病毒学杂志(J.Virol.)61:3096-3101；费希尔(Fisher)KJ等人(1996)，病毒学杂志，70:520-532；萨穆尔斯基R等人(1989)，病毒学杂志63:3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO94/13788以及国际专利申请号WO93/24641中，这些参考文献的全部披露内容通过引用结合在此。
适合用于递送本发明的iRNA的另一种病毒载体是痘病毒如牛痘病毒，例如减毒牛痘，像改良的安卡拉病毒(MVA)或NYVAC；禽痘病毒，如鸡痘或金丝雀痘。
病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原来对这些载体假型化而进行修饰，或者适当时通过取代不同的病毒衣壳蛋白而进行修饰。例如，慢病毒载体可以是具有来自疱疹性口腔炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒(Ebola)、莫克拉(Mokola)病毒等的表面蛋白的假型。AAV载体可以被制成通过工程化载体以表达不同衣壳蛋白血清型来靶向不同细胞；参见，例如拉比诺维茨(Rabinowitz)JE等人(2002)，病毒学杂志76:791-801，该参考文献的全部披露内容通过引用结合在此。
载体的药物制剂可以包括在一种可接受的稀释剂中的该载体，或可以包括一种缓释基质，在该缓释基质中该基因递送媒介物被嵌入。可替代地，当完整的基因递送载体可以从重组细胞中完整产生时，例如逆转录病毒载体，药物制剂可以包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。
V.本发明的药物组合物
本发明还包括药物组合物和配制品，它们包括本发明的iRNA。在一个实施例中，在此提供了含有如在此所描述的iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物。
在此采用的短语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在正确医学判断范围内，适合于接触人受试者和动物受试者的组织而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。
如在此所使用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料(涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一个器官或部分)。在与该配制品的其他成分相容并且对所治疗的受试者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酐类；(22)增量剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；以及(24)在药物配制品中采用的其他无毒性相容的物质。
含有iRNA的药物组合物有用于治疗与C5基因的表达或活性相关联的疾病或病症，例如补体组分C5相关联的疾病。此类药物组合物基于递送方式来配制。一个实例是被配制用于通过肠胃外递送，例如皮下(SC)或静脉内(IV)递送来全身给予的组合物。另一个实例是被配制用于例如通过输注到脑，如通过连续泵输注来直接递送到脑实质中的组合物。本发明的这些药物组合物可以足以抑制C5基因的表达的剂量给予。通常，本发明的iRNA的适合剂量将处于每天约0.001至约200.0毫克/受体的千克体重范围内，通常处于每天约1mg至50mg/千克体重范围内。例如，可以在每单次剂量约0.01mg/kg、约0.05mgkg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mgkg、约40mg/kg或约50mg/kg下给予该dsRNA。
例如，可以约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg或约10mg/kg的剂量给予该dsRNA。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在另一个实施例中，以约0.1mg/kg至约50mg/kg、约0.25mg/kg至约50mg/kg、约0.5mg/kg至约50mg/kg、约0.75mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1.5mg/kg至约50mg/kg、约2mg/kg至约50mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg、约3mg/kg至约50mg/kg、约3.5mg/kg至约50mg/kg、约4mg/kg至约50mg/kg、约4.5mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约7.5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约30mg/kg至约50mg/kg、约35mg/kg至约50mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约45mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约45mg/kg、约0.25mg/kg至约45mg/kg、约0.5mg/kg至约45mg/kg、约0.75mg/kg至约45mg/kg、约1mg/kg至约45mg/kg、约1.5mg/kg至约45mg/kg、约2mg/kg至约45mg/kg、约2.5mg/kg至约45mg/kg、约3mg/kg至约45mg/kg、约3.5mg/kg至约45mg/kg、约4mg/kg至约45mg/kg、约4.5mg/kg至约45mg/kg、约5mg/kg至约45mg/kg、约7.5mg/kg至约45mg/kg、约10mg/kg至约45mg/kg、约15mg/kg至约45mg/kg、约20mg/kg至约45mg/kg、约20mg/kg至约45mg/kg、约25mg/kg至约45mg/kg、约25mg/kg至约45mg/kg、约30mg/kg至约45mg/kg、约35mg/kg至约45mg/kg、约40mg/kg至约45mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.25mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约40mg/kg、约0.75mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约40mg/mg、约1.5mg/kg至约40mg/kg、约2mg/kg至约40mg/kg、约2.5mg/kg至约40mg/kg、约3mg/kg至约40mg/kg、约3.5mg/kg至约40mg/kg、约4mg/kg至约40mg/kg、约4.5mg/kg至约40mg/kg、约5mg/kg至约40mg/kg、约7.5mg/kg至约40mg/kg、约10mg/kg至约40mg/kg、约15mg/kg至约40mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约25mg/kg至约40mg/kg、约25mg/kg至约40mg/kg、约30mg/kg至约40mg/kg、约35mg/kg至约40mg/kg、约0.1mg/kg至约30mg/kg、约0.25mg/kg至约30mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.75mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约30mg/mg、约1.5mg/kg至约30mg/kb、约2mg/kg至约30mg/kg、约2.5mg/kg至约30mg/kg、约3mg/kg至约30mg/kg、约3.5mg/kg至约30mg/kg、约4mg/kg至约30mg/kg、约4.5mg/kg至约30mg/kg、约5mg/kg至约30mg/kg、约7.5mg/kg至约30mg/kg、约10mg/kg至约30mg/kg、约15mg/kg至约30mg/kg、约20mg/kg至约30mg/kg、约20mg/kg至约30mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、约0.1mg/kg至约20mg/kg、约0.25mg/kg至约20mg/kg、约0.5mg/kg至约20mg/kg、约0.75mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约20mg/mg、约1.5mg/kg至约20mg/kb、约2mg/kg至约20mg/kg、约2.5mg/kg至约20mg/kg、约3mg/kg至约20mg/kg、约3.5mg/kg至约20mg/kg、约4mg/kg至约20mg/kg、约4.5mg/kg至约20mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约7.5mg/kg至约20mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg或约15mg/kg至约20mg/kg的剂量给予该dsRNA。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，可以约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg或约10mg/kg的剂量给予该dsRNA。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在另一个实施例中，以约0.5mg/kg至约50mg/kg、约0.75mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1.5mg/kg至约50mg/kg、约2mg/kg至约50mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg、约3mg/kg至约50mg/kg、约3.5mg/kg至约50mg/kg、约4mg/kg至约50mg/kg、约4.5mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约7.5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约30mg/kg至约50mg/kg、约35mg/kg至约50mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约45mg/kg至约50mg/kg、约0.5mg/kg至约45mg/kg、约0.75mg/kg至约45mg/kg、约1mg/kg至约45mg/kg、约1.5mg/kg至约45mg/kg、约2mg/kg至约45mg/kg、约2.5mg/kg至约45mg/kg、约3mg/kg至约45mg/kg、约3.5mg/kg至约45mg/kg、约4mg/kg至约45mg/kg、约4.5mg/kg至约45mg/kg、约5mg/kg至约45mg/kg、约7.5mg/kg至约45mg/kg、约10mg/kg至约45mg/kg、约15mg/kg至约45mg/kg、约20mg/kg至约45mg/kg、约20mg/kg至约45mg/kg、约25mg/kg至约45mg/kg、约25mg/kg至约45mg/kg、约30mg/kg至约45mg/kg、约35mg/kg至约45mg/kg、约40mg/kg至约45mg/kg、约0.5mg/kg至约40mg/kg、约0.75mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约40mg/mg、约1.5mg/kg至约40mg/kg、约2mg/kg至约40mg/kg、约2.5mg/kg至约40mg/kg、约3mg/kg至约40mg/kg、约3.5mg/kg至约40mg/kg、约4mg/kg至约40mg/kg、约4.5mg/kg至约40mg/kg、约5mg/kg至约40mg/kg、约7.5mg/kg至约40mg/kg、约10mg/kg至约40mg/kg、约15mg/kg至约40mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约25mg/kg至约40mg/kg、约25mg/kg至约40mg/kg、约30mg/kg至约40mg/kg、约35mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.75mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约30mg/mg、约1.5mg/kg至约30mg/kb、约2mg/kg至约30mg/kg、约2.5mg/kg至约30mg/kg、约3mg/kg至约30mg/kg、约3.5mg/kg至约30mg/kg、约4mg/kg至约30mg/kg、约4.5mg/kg至约30mg/kg、约5mg/kg至约30mg/kg、约7.5mg/kg至约30mg/kg、约10mg/kg至约30mg/kg、约15mg/kg至约30mg/kg、约20mg/kg至约30mg/kg、约20mg/kg至约30mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、约0.5mg/kg至约20mg/kg、约0.75mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约20mg/mg、约1.5mg/kg至约20mg/kb、约2mg/kg至约20mg/kg、约2.5mg/kg至约20mg/kg、约3mg/kg至约20mg/kg、约3.5mg/kg至约20mg/kg、约4mg/kg至约20mg/kg、约4.5mg/kg至约20mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约7.5mg/kg至约20mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg或约15mg/kg至约20mg/kg的剂量给予该dsRNA。在一个实施例中，以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予该dsRNA。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，可以例如皮下或静脉内给予受试者单次治疗量的iRNA，如约0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、0.6mg/kg、0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、0.7mg/kg、0.725mg/kg、0.75mg/kg、0.775mg/kg、0.8mg/kg、0.825mg/kg、0.85mg/kg、0.875mg/kg、0.9mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg、21mg/kg、21.5mg/kg、22mg/kg、22.5mg/kg、23mg/kg、23.5mg/kg、24mg/kg、24.5mg/kg、25mg/kg、25.5mg/kg、26mg/kg、26.5mg/kg、27mg/kg、27.5mg/kg、28mg/kg、28.5mg/kg、29mg/kg、29.5mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg或约50mg/kg。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在一些实施例中，例如皮下或静脉内给予受试者多次剂量的治疗量的iRNA，如约0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、0.6mg/kg、0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、0.7mg/kg、0.725mg/kg、0.75mg/kg、0.775mg/kg、0.8mg/kg、0.825mg/kg、0.85mg/kg、0.875mg/kg、0.9mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg、21mg/kg、21.5mg/kg、22mg/kg、22.5mg/kg、23mg/kg、23.5mg/kg、24mg/kg、24.5mg/kg、25mg/kg、25.5mg/kg、26mg/kg、26.5mg/kg、27mg/kg、27.5mg/kg、28mg/kg、28.5mg/kg、29mg/kg、29.5mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg或约50mg/kg。多次剂量方案可以包括每日给予治疗量的iRNA，如持续两天、三天、四天、五天、六天、七天或更长。
在其他实施例中，例如皮下或静脉内给予受试者重复剂量的治疗量的iRNA，如约0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、0.6mg/kg、0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、0.7mg/kg、0.725mg/kg、0.75mg/kg、0.775mg/kg、0.8mg/kg、0.825mg/kg、0.85mg/kg、0.875mg/kg、0.9mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg、21mg/kg、21.5mg/kg、22mg/kg、22.5mg/kg、23mg/kg、23.5mg/kg、24mg/kg、24.5mg/kg、25mg/kg、25.5mg/kg、26mg/kg、26.5mg/kg、27mg/kg、27.5mg/kg、28mg/kg、28.5mg/kg、29mg/kg、29.5mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg或约50mg/kg。重复剂量方法可以包括在规则的基础上给予治疗量的iRNA，如每隔一天、每隔两天、每隔三天、每周两次、每周一次、每隔一周或每月一次。
药物组合物可以通过静脉内输注经过一段时间来给予，如经过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21、22、23、24或约25分钟的周期。可以例如在规则的基础上重复该给予，如每周、每两周(即每两周)持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长。在初始治疗方案后，可以基于更低频率给予治疗。例如在每周或双周给予持续三个月后，给予可以按每个月重复一次，持续六个月或一年或更长。
可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该iRNA在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释配制品使用连续输注或递送而给予。在所述情况下，包含在每次亚剂量中的iRNA必须是相对应更小的，以便实现总每日剂量。也可以将剂量单位复配用于在几天内递送，例如使用在几天时间范围内提供持续的iRNA释放的常规持续释放配制品。持续释放配制品是本领域中熟知的并且对于在特定位点递送试剂是特别有用的，由此可以与本发明的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相对应的多个每日剂量。
在其他实施例中，单次剂量的药物组合物可以是持续长久的，这样使得在不多于3、4或5天间隔下或在不多于1、2、3或4周间隔下给予随后的剂量。在本发明的一些实施例中，每周给予一次单次剂量的本发明的这些药物组合物。在本发明的其他实施例中，每两月给予单次剂量的本发明的这些药物组合物。
本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所要求的剂量和时间安排，这些因素包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。如在此的其他地方所描述，使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试，可以评估本发明涵盖的各个iRNA的有效剂量和体内半衰期。
小鼠遗传学进展产生了用于研究不同人类疾病的许多小鼠模型，这些人类疾病如将受益于C5表达减少的病症。此类模型可以用于iRNA的体内测试，以及用于确定治疗有效的剂量。适合的小鼠模型是本领域中已知的，并且包括例如胶原诱导性关节炎小鼠模型(库特尼(Courtenay)J.S.等人(1980)自然283，666-668)、心肌缺血(霍米斯特(Homeister)JW和卢凯西(Lucchesi)BR(1994)药理学与毒理学年评(AnnuRevPharmacolToxicol)34:17-40)、卵白蛋白诱导性哮喘小鼠模型(例如，汤姆金森(Tomkinson)A.等人(2001).免疫学杂志(J.Immunol.)166，5792-5800)、(NZB×NZW)F1、MRL/Faslpr(MRL/lpr)和BXSB小鼠模型(赛奥菲诺斯(Theofilopoulos)A.N.和科诺(Kono)D.H.1999.鼠狼疮模型；基因特异性研究和基因组范围研究(Murinelupusmodels；gene-specificandgenome-widestudies).于拉黑塔(Lahita)R.G.编著，全身性红斑狼疮(SystemicLupusErythematosus)，第3版，第145页.学术出版社(AcademicPress)，加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego,CA))、小鼠aHUS模型(乔治高赛彻(GoicoecheadeJorge)等人，(2011)非典型性溶血性尿毒症综合征的发展取决于补体C5(ThedevelopmentofatypicalhemolyticuremicsyndromedepedsoncomplementC5)，美国肾脏病学会杂志(JAmSocNephrol)22:137-145)。
取决于希望局部或全身性治疗并且取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(例如，通过透皮贴剂)；肺的，例如通过吸入或吹入粉剂或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的和透皮的；口服的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内、动脉、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；表皮下，例如通过一个植入性装置；或颅内，例如通过实质内、鞘内或脑室内的给予。
iRNA可以按这样的方式递送以靶向特定组织，如肝脏(例如肝脏的肝细胞)。
用于局部给予的药物组合物和配制品可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉剂。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等可以是必要的或希望的。包衣的安全套、手套等也可以是有用的。适合的局部配制品包括其中在本发明中体现的iRNA与局部用递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。适合的脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰基磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、阴性(例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油DMPG)和阳离子性(例如，二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。在本发明中体现的iRNA可以被包囊在脂质体内或可以与其形成复合物，具体地与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，iRNA可以与脂质、具体地与阳离子脂质复合。适合的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、棕榈酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐)。局部配制品被详细地描述于美国专利号6,747,014中，所述美国专利通过引用方式结合在此。
A.包含膜性分子组件的iRNA配制品
用于本发明的这些组合物和方法中的iRNA可以被配制用于在膜性分子组件例如脂质体或胶束中递送。如在此所使用，术语“脂质体”是指主要由安排在至少一个双层(例如，一个双层或多个双层)中的双嗜性脂质组成的囊泡。脂质体包括单层囊泡和多层囊泡，这些囊泡具有从亲脂性材料和水性内部形成的膜。水性部分含有该iRNA组合物。该亲脂性材料使该水性内部与典型地不包括该iRNA组合物的水性外部(尽管在一些实例中，它可能包括)分离。脂质体有用于将活性成分转移并且递送至作用位点上。因为脂质体膜在结构上类似于生物膜，所以当脂质体被应用至组织上时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体和细胞的合并进行，包括iRNA的内部水性内含物被递送到细胞中，其中该iRNA可以特异性结合到靶RNA上并且可以介导RNAi。在一些情况下，这些脂质体还被特异地靶向成例如将该iRNA引导到特定细胞类型上。
含有RNAi试剂的脂质体可以通过各种方法来制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分被溶解在洗涤剂中以使得用脂质组分形成胶束。例如该脂质组分可以是一种两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。该洗涤剂可以具有高的临界胶束浓度并且可以是非离子的。示例性洗涤剂包括螯合物、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐以及月桂酰基肌氨酸。然后将RNAi试剂制剂添加到包括该脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与RNAi试剂相互作用并且缩合在RNAi试剂周围以形成脂质体。缩合之后，例如通过渗析去除该洗涤剂以得到RNAi试剂的脂质体制剂。
如果必要，可以在缩合反应过程中添加协助缩合的载体化合物，例如通过控制添加。例如，该载体化合物可以是除了核酸以外的一种聚合物(例如，精胺或亚精胺)。pH还可以调节成有利于缩合。
用于产生稳定的多核苷酸递送囊泡的方法被进一步描述于例如WO96/37194中，这些方法结合了多核苷酸/阳离子脂质复合物作为该递送囊泡的结构组分，所述专利的全部内容通过引用结合在此。脂质体形成还可以包括描述于以下参考文献中的示例性方法的一个或多个方面：菲格那(Feigner)P.L.等人，美国科学院院报8:7413-7417，1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；班厄姆(Bangham)等人，分子生物学(M.MotBiol.)23:238，1965；奥尔逊(Olson)等人，生物化学与生物物理学报557:9，1979；思卓卡(Szoka)等人，美国科学院院报75:4194，1978；梅休(Mayhew)等人生物化学与生物物理学报775:169，1984；金姆等人，生物化学与生物物理学报728:339，1983；以及福永佳娜(Fukunaga)等人，内分泌(Endocrinol.)115:757，1984。用于制备用作递送囊泡的具有适当尺寸的脂质聚集体的常用技术包括超声和冻融加挤出(参见，例如迈耶(Mayer)等人，生物化学与生物物理学报58:161，1986)。当希望一致小(50nm至200nm)和相对均匀的聚集体时，可以使用微流化法(梅休等人，生物化学与生物物理学报775:169，1984)。这些方法容易地适用于将RNAi试剂制剂封装到脂质体中。
脂质体分成两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，这些脂质体与带负电荷的核酸分子相互作用以形成一种稳定的复合物。带正电荷的核酸/脂质体复合物结合到带负电荷的核酸/脂质体复合物上，并且在核内体中内化。由于核内体内的酸性pH，脂质体破裂，从而将它们的内含物释放到细胞质中(王等人，生物化学与生物物理研究通讯，1987，147,980-985)。
pH-敏感或带负电荷的脂质体包埋核酸而不与它复合。由于该核酸与该脂质是带类似的电荷，所以形成排斥而不是复合。然而，某种核酸包埋于这些脂质体的水性内部之内。pH-敏感脂质体已经用来将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因的表达(周(Zhou)等人，控释杂志，1992，19，269-274)。
脂质体组合物的一个主要类型包括除了天然来源的磷脂酰胆碱以外的磷脂。例如中性脂质体组合物可以从二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)中形成。阴离子脂质体组合物通常从二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油中形成，而阴离子促融脂质体主要从二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中形成。另一个类型的脂质体组合物从磷脂酰胆碱(PC)，例如像大豆PC和蛋PC中形成。另一个类型从磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物中形成。
在体外和在体内将脂质体引入到细胞中的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO94/00569；WO93/24640；WO91/16024；菲格那，生物化学杂志269:2550，1994；诺贝尔(Nabel)，美国科学院院报90:11307，1993；诺贝尔，人类基因疗法3:649，1992；格申(Gershon)，生物化学32:7143，1993；以及施特劳斯(Strauss)欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)11:417，1992。
还已经检验非离子型脂质体系统以确定它们在递送药物至皮肤中的用途，具体地包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。包含NovasomeTMI(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NovasomeTMII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子型脂质体配制品被用来将环孢菌素-A递送到小鼠皮肤的真皮中。结果表明此类非离子型脂质体系统有效于促进环孢霉素A沉积进入皮肤的不同层中(胡(Hu)等人，标准药物科学(S.T.P.Pharma.Sci.)，1994，4(6)466)。
脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，如在此所使用的指包含一种或多种专门化的脂质的脂质体的术语，相对于缺乏此类专门化的脂质的脂质体，这些脂质当结合到脂质体中时引起循环寿命提高。空间稳定的脂质体的实例是其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分中的一部分(A)包含一种或多种糖脂，如单唾液酰神经节苷脂GMl或(B)被衍生具有一种或多种亲水聚合物，如聚乙二醇(PEG)部分的那些脂质体。虽然不希望受任何具体理论约束，但在本领域中认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG-衍生化的脂质的空间稳定的脂质体，这些空间稳定的脂质体的循环半衰期提高来源于进入网状内皮系统(RES)的细胞中的摄取减少(艾伦(Allen)等人，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLetters)，1987，223，42；吴等人，癌症研究(CancerResearch)，1993，53，3765)。
包含一种或多种糖脂的不同脂质体是本领域中已知的。帕帕哈德乔布力洛斯(Papahadjopoiilos)等人美国纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.，1987，507，64)报道了单唾液酰神经节苷脂GMl、半乳糖脑苷脂硫酸酯和磷脂酰肌醇提高脂质体的血液半衰期的能力。这些发现由格比松(Gabizon)等人(美国科学院院报，1988，85，6949)进行详细阐述。艾伦等人的美国专利号4,837,028和WO88/04924披露了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GMl或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。美国专利号5,543,152(韦伯(Webb)等人)披露了包含鞘磷脂的脂质体。包含1,2-sn-二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱的脂质体被披露于WO97/13499(利姆(Lim)等人)中。
在一个实施例中，使用了阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够融合到细胞膜上的优点。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与质膜融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取，并且可以用来将RNAi试剂递送到巨噬细胞中。
脂质体的另外的优点包括：从天然磷脂中获得的脂质体是生物相容的和可生物降解的；脂质体可以结合广范围的水和脂质可溶性药物；脂质体可以保护在它们的区室中包囊的RNAi试剂不受代谢和降解(罗索夫(Rosoff)，于“药物剂型(PharmaceuticalDosageForms)”，利伯曼(Lieberman)、列赫尔(Rieger)和班克(Banker)(编著)，1988，第1卷，第245页)。在制备脂质体配制品方面的重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及这些脂质体的水性体积。
带正电荷的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用来形成自发地与核酸相互作用以形成脂质-核酸复合物的小脂质体，这些复合物能够与组织培养物细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，从而递送RNAi试剂(参见，例如菲格那P.L.等人，美国科学院院报8:7413-7417，1987和美国专利号4,897,355对于DOTMA及其与DNA一起使用的描述)。
DOTMA类似物1,2-二(油酰基氧基)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用以形成复合DNA的囊泡。LipofectinTM(贝特斯达研究实验室(BethesdaResearchLaboratories)，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,Md.))是用于将高度阴离子核酸递送到活的组织培养物细胞中的有效试剂，这些活的组织培养物细胞包含自发地与带负电荷的多核苷酸相互作用以形成复合物的带正电荷的DOTMA脂质体。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物的净电荷也为正。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地附接到带负电荷的细胞表面上，与质膜融合，并且有效地将功能性核酸递送到例如组织培养物细胞中。另一种可商购的阳离子脂质1,2-二(油酰基氧基)-3,3-(三甲基铵)丙烷(“DOTAP”)(德国宝灵曼公司(BoehringerMannheim)，印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,Indiana))与DOTMA的不同之处在于油酰基部分通过酯而不是醚键来连接。
其他报道的阳离子脂质化合物包括已经被缀合到各种部分上的那些，包括例如已经被缀合到两种类型脂质中的一种上的羧基精胺，并且包括化合物如5-羧基精胺甘氨酸二辛油酰基酰胺(spermylglycinedioctaoleoylamide)(“DOGS”)(TransfectamTM，普洛麦格公司(Promega)威斯康辛州，麦迪逊(Madison,Wisconsin))和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺酰胺(“DPPES”)(参见，例如美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质缀合物包括脂质与胆固醇的衍生(“DC-Chol”)，该衍生被配制到与DOPE组合的脂质体中(参见，高X.和黄(Huang)L.，生物化学与生物物理研究通讯179:280，1991)。已经报道了通过将聚赖氨酸缀合到DOPE上而制备的脂质聚赖氨酸有效于在血清存在下转染(周X.等人，生物化学与生物物理学报1065:8,1991)。对于某些细胞系，这些含有缀合阳离子脂质的脂质体据说显示出较低的毒性，并且比含DOTMA组合物提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(威卡尔(Vical)、加州拉霍亚(LaJolla,California))和脂质体(Lipofectamine)(DOSPA)(美国生命技术公司，马里兰州盖瑟斯堡)。适合用于寡核苷酸的递送的其他阳离子脂质被描述于WO98/39359和WO96/37194中。
脂质体配制品特别适用于局部给予，脂质体比其他配制品呈现若干优势。这些优势包括：减少的与所给予药物的高全身性吸收相关的副作用、在希望的靶标处所给予药物的增加的积累、以及将RNAi剂给予进入皮肤的能力。在一些实施中，脂质体用于将RNAi试剂递送至表皮细胞并且还用来增强RNAi试剂渗透进入真皮组织例如进入皮肤中。例如，可以局部应用这些脂质体。已经记载了将配制呈脂质体的药物局部递送至皮肤(参见，例如魏纳(Weiner)等人，药物靶向杂志(JournalofDrugTargeting)，1992，第2卷，405-410和迪普莱西(duPlessis)等人，抗病毒研究(AntiviralResearch)，18，1992，259-265；曼尼诺(Mannino)R.J.和付吾尔德-付格瑞特(Fould-Fogerite)S.，生物技术(Biotecimiques)6:682-690，1988；伊塔尼(Itani)T.等人，基因(Gene)56:267-276.1987；尼古劳(Nicolau)C.等人，酶学方法(Meth.Enz.)149:157-176，1987；施特劳宾格(Straubinger).M.和帕帕哈德乔布力洛斯D.酶学方法101:512-527，1983；王C.Y.和黄L.，美国科学院院报84:7851-7855，1987)。
还已经检验非离子型脂质体系统以确定它们在递送药物至皮肤中的用途，具体地包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。包含NovasomeI(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NovasomeII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子型脂质体配制品被用来将药物递送到小鼠皮肤的真皮中。具有RNAi试剂的此类配制品有用于治疗皮肤病学失调。
包括iRNA的脂质体可以被制成高度可变形的。此种变形能力可以能够使得脂质体通过小于脂质体平均半径的孔渗透。例如传递体是一种可变形的脂质体的类型。传递体可以通过将表面边缘活化剂(通常为表面活性剂)添加到一种标准的脂质体组合物中制成。包括RNAi剂的传递体可以例如通过皮下地感染被递送以将RNAi剂递送到皮肤中的角质形成细胞中。为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适合的透皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每一孔具有小于50nm的直径。另外，由于脂质特性，这些传递体可以自动优化(适于例如皮肤中的孔隙的形状)、自动修复，并且可以经常到达其靶标而不破碎，并且通常自动负载。
适于本发明的其他配制品被描述于2008年1月2日提交的美国临时申请序号61/018,616；2008年1月2日提交的美国临时申请序号61/018,611；2008年3月26日提交的美国临时申请序号61/039,748；2008年4月22日提交的美国临时申请序号61/047,087以及2008年5月8日提交的美国临时申请序号61/051,528中。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US2007/080331还描述了适于本发明的配制品。
传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集体，它们是用于药物递送媒介物的引人注目的候选物。传递体可以被描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体可适于其中使用它们的环境，例如它们是自动优化(适于皮肤中的孔隙的形状)、自动修复，经常到达其靶标而不破碎，并且通常自动负载。为了制备传递体，可能的是将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加至一种标准的脂质体组合物。传递体已经被用于将血清白蛋白递送至皮肤。已经显示血清白蛋白的传递体介导的递送与皮下注射含有血清白蛋白的溶液一样有效。
表面活性剂在配制品如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中有广泛应用。对许多不同类型的表面活性剂(天然的和合成的两者)的特性进行分类并评级的最普通的方法是通过使用亲水/亲油平衡值(HLB)。亲水基团(又称为“头部”)的性质为对用于配制品中的不同表面活性剂进行归类提供了最有用的手段(列赫尔，于“药物剂型”，马塞尔德克公司(MarcelDekker,Inc.)，纽约州纽约(NewYork,N.Y.)，1988，第285页)。
如果该表面活性剂分子没有离子化，它被分类为一种非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂在药物产品和化妆品产品中有广泛应用，并且可在广范围的pH值上使用，通常取决于它们的结构，它们的HLB值在从2至约18的范围内。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化的酯。非离子型烷醇酰胺和醚如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化的醇以及乙氧基化的/丙氧基化的嵌段聚合物也被包括在这个类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧酸盐如皂类、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯如烷基硫酸酯和乙氧基化的烷基硫酸酯、磺酸酯如烷基苯磺酸酯、酰基谷胱甘肽、酰基牛磺酸酯以及磺基琥珀酸酯以及磷酸酯。该阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯和皂类。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化的胺。这些季铵盐是这一类别的最常用的成员。
如果该表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。
已经综述了表面活性剂在药物产品、配制品和在乳剂中的用途(列赫尔，于“药物剂型”，马塞尔德克公司，纽约州纽约，1988，第285页)。
用于在本发明的方法中使用的iRNA也可提供为胶束配制品。“胶束”在此定义为一种特定类型的分子组件，其中两亲性分子以球形结构排列这样使得这些分子的所有疏水性部分均向内定向，从而使亲水性部分与周围水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。
适合用于通过透皮的膜递送的混合胶束配制品可以通过混合该siRNA组合物的水溶液、碱金属C8-C22烷基硫酸盐以及胶束形成化合物来制备。示例性胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、油酸单甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆甾烷基甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚醚醇烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸酯、脱氧胆酸酯以及其混合物。胶束形成化合物可以在添加碱金属烷基硫酸盐的同时或之后添加。混合胶束会随着基本上任何种类的这些成分的混合(但剧烈的混合)形成，以提供更小尺寸的胶束。
在一个方法中，制备一种第一胶束组合物，其包含该siRNA组合物以及至少该碱金属烷基硫酸盐。然后将该第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合，以形成混合胶束组合物。在另一种方法中，该胶束组合物是通过将该siRNA组合物、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成的化合物混合，然后添加剩余的胶束形成化合物(剧烈混合下)来制备。
可将苯酚和/或间甲酚添加到该混合胶束组合物中以稳定该配制品并防止细菌生长。可替代地，可随着胶束形成成分一起添加苯酚和/或间甲酚。也可以在该混合胶束组合物形成之后加入等渗剂，如甘油。
对于作为喷雾的胶束配制品的递送，该配制品可被装入气溶剂分配器中并将该分配器用推进剂填充。在该分配器中推进剂(其在压力下)处于液体形式。对各成分的比例进行调整，以便使该水相和推进剂相成为一体，即存在一个相。如果存在两个相，必需在例如通过计量阀分配内含物的一部分之前振荡该分配器。药物试剂的分配量是从计量阀中以细雾推进。
推进剂可以包括含氢的氯氟烃、含氢的碳氟化合物、二甲基醚和二乙基醚。在某些实施例中，可以使用HFA134a(1,1,1,2四氟乙烷)。
这些必需成分的特定浓度可以通过相对简单的实验来确定。对于通过口腔吸收，经常希望的是使用于通过注射或通过胃肠道给予的剂量增加例如至少两倍或三倍。
B.脂质颗粒
本发明的iRNA(例如dsRNA)可以被完全包囊在一种脂质配制品中，例如一种LNP或其他核酸-脂质颗粒。
如在此所使用，术语“LNP”是指一种稳定的核酸-脂质颗粒。LNP典型地含有阳离子脂质、非阳离子脂质以及防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。LNP尤其有用于全身性应用，因为它们在静脉内(静脉内(i.v.))注射之后表现出延长的循环寿命，并且在远端部位(例如，物理上与给予部分分开的部位)累积。LNP包括“pSPLP”，该pSPLP包括如在PCT公开号WO00/03683中列举的一种包囊的缩合剂-核酸复合物。本发明的这些颗粒典型地具有约50nm至约150nm，更典型地约60nm至约130nm，更典型地约70nm至约110nm、最典型地约70nm至约90nm的平均直径，并且基本上是无毒性的。另外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，这些核酸在水溶液中对核酸酶的降解是有抗性的。核酸-脂质颗粒及其制备方法被披露于例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美国公开号2010/0324120和PCT公开号WO96/40964中。
在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如，脂质与dsRNA比率)将在从约1:1至约50:1、从约1:1至约25:1、从约3:1至约15:1、从约4:1至约10:1、从约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1的范围内。以上列举的范围的范围中间值也被想到成为本发明的部分。
该阳离子脂质可以是例如N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(DODMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油烯基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(二甲基氨基)乙酸基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油烯基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-二亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1-二亚油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(N-甲基哌嗪代)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油烯基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-四十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(二(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-l-基)乙基氮杂环丁基)二十二烷-2-醇(TechG1)或其混合物。该阳离子脂质可以构成存在于颗粒中的总脂质的从约20mol％至约50mol％或约40mol％。
在另一个实施例中，化合物2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环可以用来制备脂质-siRNA纳米颗粒。2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，该专利通过引用结合在此。
在一个实施例中，该脂质-siRNA颗粒包括40％2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环；10％DSPC；40％胆固醇；10％PEG-C-DOMG(摩尔百分比)，其中粒径是63.0±20nm并且siRNA/脂质比率是0.027。
可电离的/非阳离子脂质可以是一种阴离子脂质或一种中性脂质，包括但不限于二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。如果包括胆固醇，该非离子脂质可以是存在于颗粒中的总脂质的从约5mol％至约90mol％、约10mol％或约58mol％。
抑制颗粒聚集的缀合脂质可以是例如一种聚乙二醇(PEG)-脂质，其包括但不限于PEG-二酰甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)，或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆寇基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧基丙基(C]8)。防止颗粒聚集的缀合脂质可以是存在于颗粒中的总脂质的从0mol％至约20mol％或约2mol％。
在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，该胆固醇例如占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％或约48mol％。
在一个实施例中，利匹哆异德(lipidoid)ND98-4HC1(MW1487)(参见2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，该专利通过引用结合在此)、胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))以及PEG-神经酰胺C16(AvantiPolarLipids公司)可以用来制备脂质-dsRNA纳米颗粒(即LNP01颗粒)。可以如下制备各物质在乙醇中的储备溶液：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml；PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。然后可以例如42:48:10摩尔比组合ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16储备溶液。合并的脂质溶液可以与(例如pH5乙酸钠中的)水性dsRNA混合，这样使得最终乙醇浓度是约35％-45％并且最终乙酸钠浓度是约100-300mM。一旦混合，脂质-dsRNA纳米颗粒典型地自发形成。取决于希望的粒径分布，可以使用例如一种热屏障挤出器，像Lipex挤出器(加拿大NorthernLipids公司)，通过聚碳酸酯膜(例如，100nm截留量)挤出所得到的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切线流过滤实现乙醇去除和同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如在约pH7，例如约pH6.9、约pH7.0、约pH7.1、约pH7.2、约pH7.3或约pH7.4下的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)交换。
化学式1
LNP01配制品被例如描述于国际申请公开WO2008/042973中，该专利特此通过引用结合。
另外的示例性脂质-dsRNA配制品被描述于表1中。
表1
DSPC：二硬脂酰基磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰基磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-二肉豆蔻酰基甘油(C14-PEG或PEG-C14)(PEG具有2000的平均摩尔质量)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(PEG具有2000的平均摩尔质量)PEG-cDMA：PEG-氨基甲酰基-1,2-二肉豆蔻基氧基丙胺(PEG具有2000的平均摩尔质量)包含SNALP(1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的配制品被描述于2009年4月15日提交的国际公开号WO2009/127060中，该专利特此通过引用结合。
包含XTC的配制品被例如描述于2009年1月29日提交的美国临时序号61/148,366；2009年3月2日提交的美国临时序号61/156,851；2009年6月10提交的美国临时序号；2009年7月24日提交的美国临时序号61/228,373；2009年9月3日提交的美国临时序号61/239,686以及2010年1月29日提交的国际申请号PCT/US2010/022614中，所述专利特此通过引用结合。
包含MC3的配制品被例如描述于2010年6月10日提交的美国公开号2010/0324120中，该专利的全部内容特此通过引用结合。
包含ALNY-100的配制品被例如描述于2009年11月10提交的国际专利申请号PCT/US09/63933中，该专利特此通过引用结合。
包含C12-200的配制品被描述于2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770和2010年5月5日提交的国际申请号PCT/US10/33777中，所述专利特此通过引用结合。
可电离/阳离子脂质的合成
可以通过已知的有机合成技术(包括在实例中更详细描述的方法)来制备在本发明的核酸-脂质颗粒中使用的任何化合物，例如阳离子脂质等。除非另外指明，否则全部取代基如下文定义。
“烷基”意指含有从1至24个碳原子的直链或支链、非环状或环状的饱和脂肪族烃。代表性饱和的直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和的支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和的环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和的环状烷基包括环戊烯基和环己烯基等。
“烯基”意指在相邻碳原子之间含有至少一个双键的如上所定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”意指在相邻碳之间另外含有至少一个三键的如上所定义的任何烷基或烯基。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酰基”意指其中在附接点处的碳被一个氧代基团取代的任何烷基、烯基或炔基，如下所定义。例如，-C(＝O)烷基、-C(-O)烯基和-C(-O)炔基是酰基基团。
“杂环”意指饱和的、不饱和的或芳香族的并且含有从1或2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5元至7元单环或7元至10元双环、杂环，并且其中该氮和硫杂原子可以任选地被氧化，并且该氮杂原子可以被任选地季铵化，包括其中任何以上杂环被稠合到一个苯环上的双环。杂环可以经任何杂原子或碳原子附接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酰胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
术语“任选取代的烷基”、“任选取代的烯基”、“任选取代的炔基”、“任选取代的酰基”和“任选取代的杂环”意指当取代时，至少一个氢原子被取代基替代。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个氢原子被替代。在这点上，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，Rx和Ry是相同或不同的并且独立地氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基中的每一个可以被以下取代基中的一个或多个进一步取代：氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy。
“卤素”意指氟、氯、溴和碘。
在一些实施例中，本发明的方法可能需要使用保护基。保护基方法是本领域技术人员熟知的(参加，例如有机合成中的保护基(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)，格林(Green)T.W.等人，威利数字出版平台(Wiley-Interscience)，纽约市，1999)。简言之，本发明上下文中的保护基是降低或消除不希望的官能团反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团以掩蔽其在某些反应过程中的反应性并且随后将其移除以暴露原始官能团。在一些实施例中，使用了“醇保护基”。“醇保护基”是降低或消除不希望的官能团反应性的任何基团。保护基团可以使用本领域中公知的技术添加和去除。
式A的合成
在一些实施例中，使用式A的阳离子脂质配制本发明的核酸-脂质颗粒：
其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以一起形成任选取代的杂环。在一些实施例中，该阳离子脂质是XTC(2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)。通常，可以通过以下反应方案1或2产生以上式A的脂质，其中除非另外指明，否则全部取代基如上文定义。
方案1
根据方案1制备脂质A，其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以一起形成任选取代的杂环。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备酮1和溴化物2。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生具有化学式A的脂质。具有化学式A的脂质可以使用具有化学式5的有机盐转化成相对应的铵盐，其中X是选自卤素、羟基、磷酸酯、硫酸酯等的阴离子反离子。
方案2
可替代地，可以根据方案2制备该酮1起始材料。可以根据本领域技术人员已知的方法购买或制备格氏试剂6和氰化物7。6和7的反应产生酮1。酮1向相对应的具有化学式A的脂质的转化如方案1中所描述。
MC3的合成
如下制备DLin-M-C3-DMA(即，(6Z,9Z,28Z,31Z)-四十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6Z,9Z,28Z,31Z)-四十七-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)、4-N,N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。将该溶液用稀盐酸洗涤，随后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机部分在无水硫酸镁上干燥，过滤并且在旋转蒸发器上移除溶剂。使用1％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度，使残余物穿过硅胶柱(20g)。合并含有纯化产物的级分并且移除溶剂，产生无色油(0.54g)。ALNY-100的合成
使用以下方案3进行缩酮519[ALNY-100]的合成：
515的合成
在0℃下，在氮气气氛下，向双颈RBF(1L)中LiAlH4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水THF中的搅拌悬浮液中缓慢添加514(10g，0.04926mol)在70mL的THF中的溶液。在完全添加之后，将反应混合物加温至室温并且然后加热至回流，持续4h。通过TLC监测反应的进展。在反应完成(通过TLC)之后，将混合物冷却至0℃，并且使用小心添加饱和的Na2SO4溶液来猝灭。将反应混合物在室温搅拌4小时并滤出。将残余物用THF充分洗涤。混合滤液和洗涤物，并且用400mL二噁烷和26mL浓HCl稀释并在室温下搅拌20分钟。在真空下剥离挥发物以提供呈白色固体的515的盐酸盐。产率：7.12g1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ＝9.34(宽峰,2H),5.68(s,2H),3.74(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.50-2.45(m,5H)。
516的合成
向250mL双颈RBF中化合物515在100mL无水DCM中的搅拌溶液中添加NEt3(37.2mL，0.2669mol)并在氮气气氛下冷却至0℃。在缓慢添加50mL干燥DCM中的N-(苄氧基-羰基氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)之后，允许反应混合物加温至室温。在反应完成(通过TLC监测的2-3h)之后，用1NHCl溶液(1×100mL)和饱和NaHCO3溶液(1×50mL)连续洗涤混合物。然后在无水Na2SO4上干燥有机层并且蒸发溶剂以得到粗制材料，该粗制材料通过硅胶柱色谱法纯化得到呈粘性块状的516。产率：11g(89％)。1H-NMR(CDC13,400MHz)：δ＝7.36-7.27(m,5H),5.69(s,2H),5.12(s,2H),4.96(宽峰,1H)2.74(s,3H),2.60(m,211),2.30-2.25(m,2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94％)。
517A和517B的合成
将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于220mL丙酮和水(10:1)在单颈500mLRBF中的溶液中，并且在室温下向其中添加N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，接着是4.2mL的OsO4(0.275g，0.00108mol)在叔丁醇中的7.6％溶液。在反应完成(大约3h)之后，使用添加固体Na2SO3猝灭混合物，并且在室温下将所得到的混合物搅拌1.5h。用DCM(300mL)稀释反应混合物并且用水(2×100mL)洗涤，接着是饱和NaHCO3(1×50mL)溶液、水(1×30mL)并且最后用盐水(1×50mL)洗涤。在无水Na2SO4上干燥有机相，并且在真空中去除溶剂。粗制材料的硅胶柱色谱法纯化提供了非对映异构体的混合物，这些非对映异构体由制备级HPLC分离。产率：约6g粗制物
517A-峰-1(白色固体)，5.13g(96％)。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ＝7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H)。LC-MS-[M+H]-266.3，[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86％。通过X射线证实立体化学。
518的合成
使用与被描述用于合成化合物505的方法类似的方法，获得呈无色油状物的化合物518(1.2g，41％)。1H-NMR(CDC13,400MHz):δ＝7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5,37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(宽m,36H),0.87(m,6H)。HPLC-98.65％。
用于合成化合物519的一般程序
将化合物518(1当量)在己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加至LAH在THF(1M，2当量)中的冰冷溶液中。在完成添加之后，将混合物在40℃下加热0.5h，然后在冰浴上再次冷却。将混合物用饱和Na2SO4水溶液小心地水解，然后经硅藻土(celite)过滤并且缩减成油状物。柱色谱法提供呈无色油状物获得的纯519(1.3g，68％)。13CNMRδ＝130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1；电喷射MS(+ve)：C44H80NO2(M+H)+的分子量计算值654.6，实测值654.6。
通过标准或非挤出方法制备的配制品可以按类似的方式来表征。例如配制品典型地通过视觉检查来进行表征。它们应该是发白的半透明溶液，无聚集物或沉淀。脂质纳米颗粒的粒径和粒径分布可以使用例如马尔文(Malvern)ZetasizerNanoZS(马尔文公司(Malvern)，USA)通过光散射来进行测量。颗粒应该是约20-300nm，例如尺寸是40-100nm。该粒径分布应该是单峰的。使用染料排除测定来评估配制品中的总dsRNA浓度以及包埋的级分。可以在存在或不存在破坏配制品的表面活性剂(例如，0.5％曲通(Triton)-X100)的情况下，用RNA结合染料孵育配制的dsRNA的样品，该RNA结合染料如Ribogreen(分子探针公司(MolecularProbes))。配制品中的总dsRNA可以相对于标准曲线，通过来自含有表面活性剂的样品的信号来确定。包埋的级分通过从总dsRNA含量中扣除“游离”dsRNA含量(如通过不存在表面活性剂的情况下的信号所测量)来确定。包埋的dsRNA的百分比典型地>85％。对于SNALP配制品，该粒径是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm并且至少120nm。适合的范围典型地是约至少50nm至约至少110nm、约至少60nm至约至少100nm、或约至少80nm至约至少90nm。
用于口服给予的组合物和配制品包括粉剂或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒剂、在水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是希望的。在一些实施例中，口服配制品是以下那些：其中在本发明中体现的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂以及螯合剂结合地给予。适合的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。适合的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、谷氨胆酸(glucholicacid)、甘氨胆酸(glycholicacid)、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-褐霉酸钠以及甘氨二氢褐霉酸钠。适合的脂肪酸类包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸盐、三癸酸盐、油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱或甘油单酯、二甘油酯或其药学上可接受的盐(例如，钠盐)。在一些实施例中，渗透增强剂的组合(例如脂肪酸/盐)是与胆汁酸/盐组合使用。一个示例性的组合是月桂酸、羊蜡酸以及UDCA的钠盐。另外的渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醚。在本发明中体现的dsRNA可以口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的颗粒剂的形式递送，或复合成微颗粒或纳米颗粒。DsRNA复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧杂环丁烷、聚烷基氰基丙烯酸酯；阳离子化的明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亚胺、菊糖、纤维素和淀粉。适合的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如，对氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、海藻酸酯以及聚乙二醇(PEG)。用于dsRNA的口服配制品及其制备被详细描述于美国专利6,887,906、美国公开号20030027780和美国专利号6,747,014中，所述专利中的每一个通过引用结合在此。
用于肠胃外、实质内(进入脑中)、鞘内、心室内或肝内给予的组合物和配制品可以包括无菌水溶液，这些无菌水溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他适合的添加剂，如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体配制品。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症(例如肝癌)时靶向肝脏的配制品。
本发明的药物配制品(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括使活性成分与一种或多种药物载体或一种或多种赋形剂结合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或这两者均匀地和密切地结合来制备这些配制品，并且然后如果必要，使产品成形。本发明的这些组合物可以被配置成任何许多可能的剂型，如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂以及灌肠剂。本发明的这些组合物还可以被配制为在水性、非水性或混合性介质中的混悬液。水性混悬液可以进一步含有增加混悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该混悬液还可以含有稳定剂。
C.另外的配制品
i.乳液
可以将本发明的这些组合物制备和配制为乳液。乳液典型地是一种液体分散在另一种中的以直径通常超过0.1μm的液滴形式的多相系统(参见例如，安西尔(Ansel)的药物剂型和药物递送系统(PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems)，艾伦LV.、波波维奇(Popovich)NG.和安西尔HC，2004，LWW数据库(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约州纽约(NewYork,NY)；艾迪升(Idson)，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页；罗索夫，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；布洛克(Block)于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第2卷，第335页；樋口(Higuchi)等人于雷明顿的医药科学(Remington'sPharmaceuticalSciences)，马克出版公司(MackPublishingCo.)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.)，1985，第301页)。乳液经常是包含彼此密切混合且分散的两个不混溶的液相的双相体系。通常，乳液可以为油包水(w/o)或水包油(o/w)两种。当水相精细分散并且呈微小的液滴分散到大量油相中时，所得到的组合物被称为油包水(w/o)乳液。可替代地，当油相精细分散并且呈微小的液滴分散到大量水相中时，所得到的组合物被称为水包油(o/w)乳液。乳液可以含有除了分散相和活性药物以外的其他组分，该活性药物可以作为在水相、油相中的溶液或其自身作为独立相而存在。如果需要，也可以存在药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳液还可以是包含多于两个相的多重乳液，例如像在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。此类复合配制品通常提供某些简单的二元乳液所不具有的优势。其中o/w乳液的单独油滴封装小水滴的多重乳液构成w/o/w乳液。同样地，在油连续相中稳定化的水滴中封装油滴的系统提供o/w/o乳液。
乳剂具有较小或没有热力学稳定性的特征。通常，乳剂的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或配制品的粘性保持这种形式。在乳液状软膏基质或膏剂的情况下，乳液的任一相可以为半固体或固体。其他稳定乳液的方式需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并到乳液的任一相中。乳化剂可以被广泛地分成四类：合成表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质以及精细分散的固体(参见例如，安西尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.和安西尔HC，2004，LWW数据库(第8版)，纽约州纽约；艾迪升，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。
合成表面活性剂(又称为表面活性剂)在乳液配制中有广泛应用并且已经在文献中进行了综述(参见例如，安西尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.和安西尔HC，2004，LWW数据库(第8版)，纽约州纽约；列赫尔，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第285页；艾迪升，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，马塞尔德克公司，纽约州纽约，1988，第1卷，第199页)。表面活性剂典型地是两亲的，并且包含亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水和疏水性的比率被称为亲水/亲油平衡值(HLB)，并且它是配制品制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。可以基于亲水基团的性质将乳化剂广泛地分成不同类别：非离子型、阴离子型、阳离子型和两性的(参见例如，安西尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.和安西尔HC，2004，LWW数据库(第8版)，纽约州纽约；列赫尔，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第285页)。
乳液配制品中使用的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸收基质具有亲水特性，以使得它们可以吸收水以形成乳液但还保留其半固体一致性，如无水羊毛脂和亲水石油蜡。精细分散的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性制剂中使用。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、非溶胀粘土如膨润土、凹凸棒土、锂蒙脱石，高岭土、蒙脱土、胶状硅酸铝和胶状镁硅酸铝、颜料和非极性固体如碳或甘油基三硬脂酸酯。
在乳液配制品中还包括多种非乳化材料，并且它们对乳液的特性有帮助。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(布洛克，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第335页；艾迪升，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。
亲水胶体或水胶体包括天然存在的胶和合成聚合物，如多糖(例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、角叉菜胶、瓜尔胶、梧桐胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)以及合成聚合物(例如，卡波姆(carbomer)、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或溶胀形成胶状溶液，这些胶状溶液通过在分散相液滴的周围形成强的界面膜并通过增强外相的粘度来稳定乳液。
由于乳液通常含有许多可以容易地支持微生物生长的成分如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些配制品通常掺入防腐剂。在乳液配制品中包括的通常使用的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸的酯类和硼酸。通常也将抗氧化剂加入到乳液配制品中，以防止配制品变质。所使用的抗氧化剂可以是自由基清除剂如生育酚、五倍子酸烷基酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯；或还原剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠；以及抗氧化剂协同剂如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
通过皮肤学、口服和肠胃外途径应用乳液配制品及其制造方法已经在文献中进行了综述(参见例如，安西尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.和安西尔HC，2004，LWW数据库(第8版)，纽约州纽约；艾迪升，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。用于口服递送的乳液配制品由于配制简单以及从吸收和生物可利用率方面上的功效已经被非常广泛地使用(参见例如，安西尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.和安西尔HC，2004，LWW数据库(第8版)，纽约州纽约；罗索夫，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；艾迪升，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。基于矿物油的缓泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂属于经常作为o/w乳液口服给予的物质。
ii.微乳液
在本发明的一个实施例中，将iRNA和核酸的组合物配制为微乳液。微乳液可以被定义为水、油和两亲物的系统，该系统是单一的光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如，安西尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.和安西尔HC，2004，LWW数据库(第8版)，纽约州纽约；罗索夫，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页)。典型地，微乳液是通过如下方法制备的系统：首先将油分散到表面活性剂水溶液中，然后加入足量的通常为中等链长度的醇的第四组分来形成透明系统。因此，微乳液还被描述为具有两种不可混溶的液体的热力学稳定的、各向同性的澄清分散体，这两种不可混溶的液体通过表面活性剂分子的界面膜来稳定(莱昂(Leung)和沙哈(Shah)，于：药物的控释：聚合物和聚集体系统(ControlledReleaseofDrugs:PolymersandAggregateSystems)，罗索夫M.编著，1989，VCH出版社，纽约，第185-215页)。微乳液通常通过将三至五种组分组合来制备，这些组分包括油、水、表面活性剂、辅助表面活性剂和电解质。该微乳液是否具有油包水(w/o)或水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性，并且取决于表面活性剂分子的极性头部和烃尾部的结构和几何堆积(肖特(Schott)，于雷明顿的医药科学，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，1985，第271页)。
使用相图的现象学方法已经被广泛研究，并且已经对本领域技术人员而言得到如何配制微乳液的广泛认识(参见例如，安西尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.和安西尔HC，2004，LWW数据库(第8版)，纽约州纽约；罗索夫，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；布洛克，于药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第335页)。与常规乳液相比，微乳液提供以下优点：使水不可溶的药物溶于具有自发形成的热力学稳定的液滴的配制品中。
用于微乳液制备中的表面活性剂包括，但不限于单独地或与辅助表面活性剂组合的离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油烯醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油脱水山梨糖醇二油酸酯(sequioleate)(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)。该辅助表面活性剂通常是短链醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通过渗透到表面活性剂膜中并由此在表面活性剂分子间产生空余空间来产生无序膜从而提高界面流动性。然而，微乳液可以不使用辅助表面活性剂来制备，并且无醇的自乳化微乳液系统是本领域中已知的。水相可以典型地是，但不限于水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可以包括，但不限于材料如Captex300；Captex355；CapmulMCM；脂肪酸酯；中链(C8-C12)单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯；聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化的甘油酯、饱和聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解和增强的药物吸收方面看，微乳液是特别令人感兴趣的。已经提出基于脂质的微乳液(o/w和w/o两者)提高药物包括肽的口服生物可利用率(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；肯斯坦替奈德斯(Constantinides)等人，医药研究(PharmaceuticalResearch)，1994，11，1385-1390；里切尔(Ritschel)，实验与临床药理学方法与成果(Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.)，1993，13，205)。微乳液提供以下优点：改进的药物溶解、防止药物酶促水解、由于表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性的改变而带来的可能的药物吸收增强、制备简单、通过固体剂型口服给予简单、改进的临床有效性以及降低的毒性(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；肯斯坦替奈德斯等人，医药研究，1994，11，1385；霍(Ho)等人，药物科学杂志(J.Pharm,Sci.)，1996，85，138-143)。通常，当微乳液的组分在环境温度下混合在一起时，它们可以自发形成微乳液。当配制热不稳定的药物、肽或iRNA时，这可以是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，微乳剂在活性组分的透皮递送中也是有效的。期望的是，本发明的微乳液组合物和配制品将有利于增加从胃肠道中全身性吸收iRNA和核酸，以及改进iRNA和核酸的局部细胞摄取。
本发明的微乳液还可以含有另外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol、以及改善配制品特性并增强本发明的iRNA和核酸吸收的渗透增强剂。用于本发明的微乳液中的渗透增强剂可以被分为属于五个广泛分类中的一个—表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂以及非螯合的非表面活性剂(李(Lee)等人，治疗性药物载体系统的关键评论(CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems)，1991，第92页)。这些类别中的每一个已经在以上进行了讨论。
iii.微颗粒
本发明的RNAi试剂可以被结合到颗粒中，例如微颗粒。微颗粒可以通过喷雾干燥来产生，但也可以通过其他方法包括冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合来产生。
iv.渗透增强剂
在一个实施例中，本发明采用了不同渗透增强剂来实现向动物皮肤高效递送核酸，具体地iRNA。大多数药物以离子化形式和非离子化形式两者存在于溶液中。然而，通常仅有脂质可溶的或亲脂的药物易于穿过细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理有待穿过的膜，甚至连非亲脂药物也可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜以外，渗透增强剂还增强亲脂药物的渗透性。
渗透增强剂可以被分成属于五个广泛分类中的一个，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(参见例如，马尔姆斯滕(Malmsten)M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactantsandpolymersindrugdelivery)，健康传播杂志(InformaHealthCare)，纽约州纽约，2002；李等人，治疗性药物载体系统的关键评论，1991，第92页)。以下更详细地描述了以上提及的渗透增强剂的类别中的每一个。
表面活性剂(或“表面活性剂”)是当溶解于水溶液中时，减小该溶液的表面张力或该水溶液与另一种液体之间的界面张力的化学实体，结果就是通过粘膜对iRNA的吸收增强。除了胆汁盐和脂肪酸以外，这些渗透增强剂包括，例如月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡醚(参见例如，马尔姆斯滕M.，药物递送中的表面活性剂和聚合物，健康传播杂志，纽约州纽约，2002；李等人，治疗性药物载体系统的关键评论，1991，第92页)；以及全氟化合物乳液，如FC-43(塔卡哈施(Takahashi)等人，药学与药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol)，1988，40，252)。
用作渗透增强剂的不同脂肪酸和它们的衍生物包括，例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯(1-单油酰基-外消旋-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如，甲基、异丙基和叔丁基)以及其单甘油酯和二甘油酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见例如，特优易特优(Touitou)E.等人，药物递送增强(EnhancementinDrugDelivery)，CRC出版社，丹佛市(Danvers)MA，2006；李等人，治疗性药物载体系统的关键评论，1991，第92页；村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统的关键评论，1990，7，1-33；艾尔哈里里(ElHariri)等人，药学与药理学杂志，1992，44，651-654)。
胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂溶性维生素分散并且吸收(参见例如，马尔姆斯滕M.，药物递送中的表面活性剂和聚合物，健康传播杂志，纽约州纽约，2002；布鲁顿(Brunton)等人，于：古德曼(Goodman)和奥利曼(Oilman)的治疗剂的药理学基础中的第38章，第9版，哈德曼(Hardman)等人编著，麦格劳希尔集团(McGraw-Hill)，纽约，1996，第934-935页)。不同天然的胆汁盐和它们的合成衍生物用作渗透增强剂。因此术语“胆汁盐”包括胆汁的任何天然存在的组分以及任何它们的合成衍生物。适合的胆汁盐包括，例如胆酸(或它的药学上可接受的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、谷氨胆酸(谷氨胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢-褐霉酸盐(STDHF)、甘氨二氢褐霉酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见例如，马尔姆斯滕M.，药物递送中的表面活性剂和聚合物，健康传播杂志，纽约州纽约，2002；李等人，治疗性药物载体系统的关键评论，1991，第92页；斯温亚德(Swinyard)，于：雷明顿的医药科学中的第39章，第18版，詹纳罗(Gennaro)编著，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，1990，第782-783页；村西，治疗性药物载体系统的关键评论，1990，7，1-33；山本(Yamamoto)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharm.Exp.Ther.)，1992，263，25；山下(Yamashita)等人，药物科学杂志(J.Pharm.Sci)，1990，79，579-583)。
与本发明有关使用的的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的iRNA的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为增渗剂的应用，因为多数特征化的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此可以被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当DNase抑制剂的附加优势(加热特(Jarrett)，层析学杂志(J.Chromatogr.)，1993,618,315-339)。适合的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和同香兰酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、聚乙二醇单十二醚(laureth)-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如，卡特德若(Katdare)A.等人，用于医药、生物技术和药物递送的赋形剂发展(Excipientdevelopmentforpharmaceutical,biotechnology,anddrugdelivery)，CRC出版社，丹佛市MA，2006；李等人，治疗性药物载体系统的关键评论，1991，第92页；村西，治疗性药物载体系统的关键评论，1990，7，1-33；布尔(Buur)等人，控释杂志(J.ControlRel.)，1990，14，43-51)。
如在此所使用，非螯合的非表面活性剂渗透增强化合物可以被定义为作为螯合剂或作为表面活性剂展示不明显活性但是反而增强iRNA经消化道粘膜吸收的化合物(参见例如，村西，治疗性药物载体系统的关键评论，1990，7，1-33)。这种类别的渗透增强剂包括，例如不饱和的环脲、1-烷基氮杂环-烷酮衍生物和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(李等人，治疗性药物载体系统的关键评论，1991，第92页)；以及非类固醇抗炎剂如双氯芬酸钠、吲哚美辛(indomethacin)和苯基丁氮酮(山下等人，药学与药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)，1987，39，621-626)。
还可以添加在细胞水平增强摄取iRNA的试剂至本发明的药物组合物和其他组合物。例如，还已知阳离子脂质如lipofectin(醇一(Junichi)等人，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物以及聚阳离子分子，如聚赖氨酸(洛洛(Lollo)等人，PCT申请WO97/30731)增强dsRNA的细胞摄取。可商购的转染试剂的实例包括，例如LipofectamineTM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德(Carlsbad)，CA)、Lipofectamine2000TM(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、293fectinTM(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、CeilfectmTM(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、DMRIE-CTM(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、FreeStyleTMMAX(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、LipofectamineTM2000CD(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、LipofectamineTM(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、RNAiMAX(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、OligofectamineTM(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、OptifectTM(英杰公司；卡尔斯巴德，CA)、X-tremeGENEQ2转染试剂(罗氏公司(Roche)；瑞士格兰扎克尔街(Grenzacherstrasse,Switzerland))、DOTAP脂质体转染试剂(瑞士格兰扎克尔街)、DOSPER脂质体转染试剂(瑞士格兰扎克尔街)、或Fugene(瑞士格兰扎克尔街)、试剂(普洛麦格公司；威斯康辛州，麦迪逊(Madison,WI))、TransFastTM转染试剂(普洛麦格公司；威斯康辛州，麦迪逊)、TfxTM-20试剂(普洛麦格公司；威斯康辛州，麦迪逊)、TfxTM-50试剂(普洛麦格公司；威斯康辛州，麦迪逊)、DreamFectTM(OZ生物科技公司(OZBiosciences)；法国马赛(Marseille,France))、EcoTransfect(OZ生物科技公司；法国马赛)、TransPassaD1转染试剂(NEB公司(NewEnglandBiolabs)；伊普斯威奇(Ipswich)，MA，USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(英杰公司；圣地亚哥(SanDiego)，CA，USA)、PerFectin转染试剂(美国Genlantis公司；圣地亚哥，CA，USA)、NeuroPORTER转染试剂(美国Genlantis公司；圣地亚哥，CA，USA)、GenePORTER转染试剂(美国Genlantis公司；圣地亚哥，CA，USA)、GenePORTER2转染试剂(美国Genlantis公司；圣地亚哥，CA，USA)、Cytofectin转染试剂(美国Genlantis公司；圣地亚哥，CA，USA)、BaculoPORTER转染试剂(美国Genlantis公司；圣地亚哥，CA，USA)、TroganPORTERTM转染试剂(美国Genlantis公司；圣地亚哥，CA，USA)、RiboFect(Bioline公司；陶顿(Taunton)，MA，USA)、PlasFect(Bioline公司；陶顿，MA，USA)、UniFECTOR(B-Bridge国际公司；美国加利福尼亚州山景城(MountainView,CA,USA))、SureFECTOR(B-Bridge国际公司；美国加利福尼亚州山景城)或HiFectTM(B-Bridge国际公司；美国加利福尼亚州山景城)以及其他转染试剂。
可以使用其他试剂来增强所给予的核酸的渗透，这些其他试剂包括二醇类如乙二醇和丙二醇、吡咯类如2-吡咯、氮酮类以及萜类如柠檬烯和薄荷酮。
v.载体
本发明的某些组合物还将载体化合物结合在配制品中。如在此所使用，“载体化合物”或“载体”可以指惰性的(即，本身不具有生物活性)但通过体内过程被识别为核酸的一种核酸或其类似物，这些体内过程例如通过降解生物活性的核酸或促进它从循环中去除来降低具有生物活性的核酸的生物可利用率。核酸和载体化合物的共给予(典型地后一种物质过量)可以引起肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度减少，假定归因于该载体化合物与该核酸之间对共同受体的竞争。例如，当部分地硫代磷酸酯dsRNA与聚肌氨酸、葡聚糖硫酸盐、聚丙烯酸(polycytidicacid)或4-乙酰氨基-4'异硫氰基-茋-2,2'-二磺酸共给予时，可以减少肝组织中的部分硫代磷酸酯dsRNA的回收(米瑶(Miyao)等人，DsRNA研究发展(DsRNARes.Dev.)，1995，5，115-121；高仓(Takakura)等人，DsRNA与核酸药物开发(DsRNA&Nucl.AcidDrugDev.)，1996，6，177-183)。
vi.赋形剂
与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或用于将一种或多种核酸递送至动物的任何其他药理学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体并且在考虑计划的给予方式的情况下来选择，以便当与核酸和给定药物组合物的其他组分组合时提供希望的整体、一致性等。典型的药物载体包括，但不限于粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖类、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶状二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；润湿剂(例如，月桂基硫酸钠等)。
适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适合的药学上可接受的载体包括，但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包括缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学上可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本发明的这些组合物可以另外地含有其他本领域熟知用量的在药物组合物中常用的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包括另外的、可相容的药学上有活性的物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包括对本发明的组合物的各种剂型的物理配制有用的其他物质，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。
然而，当加入此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的成份的生物活性。可以将这些配制品进行灭菌并且如果希望的话与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐混合，用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。
水性混悬液可以含有增加混悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该混悬液还可以含有稳定剂。
在一些实施例中，在本发明中体现的药物组合物包括(a)一种或多种iRNA化合物和(b)一种或多种通过非RNAi机制起作用并且有用于治疗溶血病症的试剂。此类试剂的实例包括，但不限于抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒剂和/或抗纤维变性剂。另外，其他常用于保护肝脏的物质，如水飞蓟素，也可以与在此描述的iRNA结合使用。有用于治疗肝脏疾病的其他试剂包括替比夫定(telbivudine)、恩替卡韦(entecavir)和蛋白酶抑制剂如特拉匹韦(telaprevir)以及被例如披露于董(Tung)等人，美国申请公开号2005/0148548、2004/0167116和2003/0144217和哈勒(Hale)等人，美国申请公开号2004/0127488中的其他物质。
此类化合物的毒性与治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率LD50/ED50。优选那些表现出高的治疗指数的化合物。
从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制人类中使用的剂量范围时使用。在此在本发明中体现的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的ED50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及使用的给予途径而在该范围内变化。对于用于在本发明中体现的这些方法中的任何化合物，该治疗有效剂量起初可以从细胞培养物测定来评估。在动物模型中剂量可以被配制成达到化合物(或当适当时，靶序列的多肽产物)的循环血浆浓度范围(例如，达到多肽的减小的浓度)，该浓度范围包括如在细胞培养物中所确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)。这类信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法。
除了以上所讨论的它们的给予之外，在本发明中体现的iRNA可以与有效于治疗由C5表达介导的病理过程的其他已知试剂组合来给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或在此描述的标准功效量值所观察到的结果，给予医师可以调整给予iRNA的量和时间。
VI.用于抑制C5表达的方法
本发明提供了在细胞中抑制C5表达的方法。这些方法包括使细胞与有效于在该细胞中抑制该C5表达的量的RNAi试剂(例如，双链RNAi试剂)接触，从而在该细胞中抑制该C5的表达。
使细胞与双链RNAi试剂的接触可以在体外或在体内完成。在体内使细胞与该RNAi试剂接触包括在一个受试者(例如，人受试者)内使细胞或细胞的组与该RNAi试剂接触。体外和体内接触方法的组合也是可能的。如上所论述，接触可以是直接或间接的。此外，使细胞接触可以通过靶向配体(包括在此描述或本领域中已知的任何配体)来实现。在优选实施例中，该靶向配体是一个碳水化合物部分，例如GalNAc3配体，或将RNAi引导至感兴趣的部位例如受试者的肝脏的任何其他配体。
如在此所使用的术语“抑制”与“降低”、“沉默”、“下调”和其他类似的术语可互换地使用，并且包括任何水平的抑制。
短语“抑制C5的表达”意图是指抑制任何C5基因(例如像小鼠C5基因、大鼠C5基因、猴C5基因或人C5基因)以及C5基因的变异体或突变体的表达。因此，该C5基因可以是遗传操纵的细胞、细胞的组或生物体上下文中的野生型C5基因、突变型C5基因或转基因C5基因。
“抑制C5基因的表达”包括任何水平的抑制C5基因，例如至少部分压制C5基因的表达。可以基于与C5基因表达相关联的任何变量的水平或水平变化来评价C5基因的表达，例如C5mRNA水平、C5蛋白水平或例如作为总溶血补体的量度的CH50活性、测量补体旁路途径的溶血活性的AH50、和/或作为血管内溶血的量度的乳酸脱氢酶(LDH)水平、和/或血红蛋白水平。还可以测量C5a、C5b和可溶性C5b-9复合物的水平来评价C5表达。这个水平可以在单独细胞中或在一组细胞中(包括例如来源于一个受试者的一种样品)进行评价。
可以通过与对照水平比较，与C5表达相关联的一种或多种变量的绝对或相对水平降低来评价抑制。该对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从类似的未经处理或经对照(例如仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。
在本发明的这些方法的一些实施例中，C5基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
C5基因的表达抑制可以通过由第一细胞或细胞的组(此类细胞可以例如存在于来自一个受试者的一种样品中)表达的mRNA的量减少来表现，在该第一细胞或细胞的组中C5基因被转录并且该第一细胞或细胞的组已经被处理(例如，通过使该细胞或多个细胞与本发明的RNAi试剂接触，或通过向其中存在这些细胞的受试者给予本发明的RNAi试剂)，这样使得与基本上与该第一细胞或细胞的组相同但没有如此被处理的第二细胞或细胞的组(一个或多个对照细胞)相比，C5基因的表达被抑制。在优选实施例中，通过使用下式将被处理的细胞中的mRNA的水平表示为对照细胞中的mRNA的水平的百分比来评估该抑制：
可替代地，可以通过功能上与C5基因表达相关的参数的减小来评估C5基因的表达抑制，例如C5蛋白表达、铁调素基因或蛋白质表达、或组织或血清中的铁水平。或者在组成上或者通过基因组工程化，并且通过本领域中已知的任何测定，可以在表达C5的任何细胞中确定C5基因沉默。肝脏是C5表达的主要部位。其他重要的表达部位包括肾脏和子宫。
C5蛋白的表达抑制可以通过由一种细胞或细胞的组表达的C5蛋白的水平(例如，在来源于一个受试者的一种样品中表达的蛋白质水平)降低来表现。如上对于mRNA压制的评价所解释，在经处理的细胞或细胞的组中抑制蛋白质表达水平可以类似地表达为对照细胞或细胞的组中的蛋白质水平的百分比。
可以用来评价C5基因的表达抑制的对照细胞或细胞的组包括尚未与本发明的RNAi试剂接触的细胞或细胞的组。例如，在用RNAi试剂处理受试者之前，该对照细胞或细胞的组可以来源于单独受试者(例如，人或动物受试者)。
可以使用本领域中已知的用于评价mRNA表达的任何方法来确定由细胞或细胞的组表达的C5mRNA的水平。在一个实施例中，通过检测C5基因的转录的多核苷酸或其部分(例如，mRNA)来确定C5在样品中的表达水平。可以使用RNA提取技术，包括例如使用酸性苯酚/胍异硫氰酸酯提取(RNAzolB；Biogenesis公司)、RNeasyRNA制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))或PAXgene(PreAnalytix公司，瑞士)，从细胞中提取RNA。使用核糖核酸杂交的典型的测定形式包括核连缀测定、RT-PCR、RNA酶保护测定(梅尔顿(Melton)等人，核酸研究12:7035)、RNA印迹法、原位杂交以及微阵列分析。
在一个实施例中，使用核酸探针确定C5表达的水平。如在此所使用的术语“探针”是指能够选择性地结合特异性C5的任何分子。探针可以由本领域的技术人员合成或来源于适当生物制剂。探针可以具体地经设计成被标记的。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定中，这些杂交或扩增测定包括，但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。用于确定mRNA水平的一种方法涉及使分离的mRNA与可以杂交C5mRNA的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，将该mRNA固定在一个固体表面上，并且例如通过使该分离的mRNA在一个琼脂糖凝胶上跑胶并且将该mRNA从该凝胶转移到一个膜(如硝化纤维素)而与一种探针接触。在一个替代性实施例中，将该探针或这些探针固定在一个固体表面上，并且使该mRNA例如在一个Affymetrix基因芯片阵列中与该探针或这些探针接触。熟练的技术人员可以容易地采取已知的用于确定C5mRNA水平的mRNA检测方法。
用于确定样品中的C5表达的水平的一种替代方法涉及在该样品中的例如mRNA的核酸扩增过程和/或逆转录酶(制备cDNA)，例如通过RT-PCR(在穆利斯(Mullis)，1987，美国专利号4,683,202中列出的实验性实施例)、连接酶链反应(巴拉尼(Barany)(1991)美国科学院院报88:189-193)、自主序列复制(顾埃替勒(Guatelli)等人(1990)美国科学院院报87:1874-1878)、转录扩增系统(科国(Kwoh)等人(1989)美国科学院院报86:1173-1177)、Q-β复制酶(里扎迪(Lizardi)等人(1988)生物/技术(Bio/Technology)6:1197)、滚环复制(里扎迪等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，接着是使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。这些检测方案尤其有用于检测核酸分子，如果此类分子以非常少的数量存在。在本发明的具体方面中，通过定量荧光团RT-PCR(即，TaqManTM系统)来确定C5表达的水平。
可以使用膜印迹(如用于杂交分析如RNA印迹、DNA印迹、斑点印迹等)或微孔、取样管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合核酸的任何固体载体)来监测C5mRNA的表达水平。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，所述美国专利通过引用结合在此。C5表达水平的确定还可以包括使用溶液中的核酸探针。
在优选实施例中，使用支链DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达水平。这些方法的使用描述并且例证于在此呈现的实例中。
可以使用本领域中已知的用于测量蛋白质水平的任何方法来确定C5蛋白质表达的水平。此类方法包括，例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法、流体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱法、比色测定、分光光度法测定、流式细胞术、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳法、蛋白质印迹法、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。
如在此所使用的术语“样品”是指从受试者中分离的一批类似的流体、细胞或组织以及存在于受试者内的流体、细胞或组织。生物流体的实例包括血液、血清以及浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、脑脊液、唾液、眼内液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如样品可以源自特定器官、器官部分、或这些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可以来源于肝脏(例如，全部的肝脏或肝脏的某些区段或肝脏中的某些类型的细胞，例如像肝细胞)。在优选实施例中，“来源于受试者的样品”是指从该受试者中取出的血液或血浆。在另外的实施例中，“来源于受试者的样品”是指来源于该受试者的肝脏组织。
在本发明的方法的一些实施例中，向一个受试者给予该RNAi试剂，这样使得该RNAi剂被递送到该受试者内的一个具体部位上。可以使用来源于来自该受试者内的特定部位的流体或组织的样品中的C5mRNA或C5蛋白质水平的测量值或变化来评价C5的表达抑制。在优选实施例中，该部位是肝脏。该部位还可以是来自前述部位的任一个的细胞的亚组或亚群。该部位还可以包括表达特定类型的受体的细胞。
如在此所使用的短语“使细胞与RNAi试剂(如dsRNA)接触”包括通过任何可能的方式使细胞接触。使细胞与RNAi试剂接触包括在体外使细胞与iRNA接触或在体内使细胞与iRNA接触。该接触可以直接或间接地完成。因此，例如该RNAi试剂可以通过执行该方法的个体与细胞物理接触，或可替代地，该RNAi试剂可以进入容许或引起它随后接触到该细胞的一种情况。
在体外使细胞接触可以例如通过用该RNAi试剂孵育该细胞来完成。在体内使细胞接触可以例如通过将该RNAi试剂注射到细胞位于其中的组织中或附近，或通过将该RNAi试剂注射到另一个区域(例如血流或皮下空间)中，这样使得该试剂将随后到达有待接触的细胞位于其中的组织来完成。例如，该RNAi试剂可以含有和/或被偶联到将该RNAi试剂引导至感兴趣的部位(例如，肝脏)的一个配体上，例如GalNAc3。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如也可以在体外用RNAi剂接触细胞，并随后移植入受试者。
在一个实施例中，使细胞与iRNA接触包括通过促进或实现摄取或吸收到该细胞中的“引入”或“递送”该iRNA到该细胞中。吸收或摄取iRNA可以通过无协助扩散过程或主动细胞过程或借助助剂或装置发生。将iRNA引入到细胞中可以是在体外和/或在体内。例如对于体内引入，可以将iRNA注射到组织位点中或全身给予。体内递送还可以通过β-葡聚糖递送系统来完成，如被描述于美国专利号5,032,401和5,607,677以及美国公开号2005/0281781中的那些，所述专利的全部内容特此通过引用结合在此。体外引入到细胞中包括本领域中已知的方法，如电穿孔和脂质转染。其他方法在下文描述和/或是本领域中已知的。
VII.用于治疗或预防补体组分C5相关联的病症的方法
本发明还提供了治疗性和预防性的方法，这些方法包括向患有补体组分C5相关联的疾病(例如，PNH或aHUS)的受试者给予iRNA试剂、包含iRNA试剂的药物组合物或包含本发明的iRNA的载体。在本发明的一些方面中，这些方法进一步包括向该受试者给予另外的治疗剂，如抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)。
一方面，本发明提供了治疗患有将受益于C5表达减少的病症(例如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者的方法。本发明的这些治疗方法(和用途)包括向该受试者例如人给予治疗有效量的靶向C5基因的iRNA试剂或包含靶向C5基因的iRNA试剂的药物组合物，从而治疗患有将受益于C5表达减少的病症的该受试者。
另一方面，本发明提供治疗患有将受益于C5表达减少的病症(例如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者的方法，这些方法包括向该受试者例如人给予治疗有效量的靶向C5基因的iRNA试剂或包含靶向C5基因的iRNA试剂的药物组合物以及另外的治疗剂，如抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)，从而治疗患有将受益于C5表达减少的病症的该受试者。
一方面，本发明提供了在患有将受益于C5表达减少的病症(例如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者中预防至少一种症状的方法。这些方法包括向该受试者给予预防有效量的本发明的该iRNA试剂(例如dsRNA)或载体，从而在患有将受益于C5表达减少的病症的该受试者中预防至少一种症状。例如，本发明提供了在遭受将受益于C5表达减少的病症(例如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者中预防溶血的方法。
另一方面，本发明提供了在患有将受益于C5表达减少的病症(例如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者中预防至少一种症状的方法。这些方法包括向该受试者给予预防有效量的本发明的该iRNA试剂(例如dsRNA)或载体以及另外的治疗剂，如抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)，从而在患有将受益于C5表达减少的病症的该受试者中预防至少一种症状。
如在此所使用的“治疗有效量”意图包括当向患有补体组分C5相关联的疾病的受试者给予时，足以实现对该疾病的治疗(例如，通过减弱、改善或维持现有的疾病或疾病的一种或多种症状)的RNAi试剂或抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)的量。该“治疗有效量”可以取决于该RNAi试剂或抗体或其抗原结合片段、如何给予该试剂、该疾病和它的严重性和病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前的或伴随的治疗(如果有的话)以及有待治疗的该受试者的其他个体特征而变化。
如在此所使用的“预防有效量”意图包括当向患有补体组分C5相关联的疾病但尚未(或当前)经历或表现出该疾病的症状的受试者和/或处于发展补体组分C5相关联的疾病风险的受试者，例如具有移植物和/或移植体的受试者，例如敏化的或同种异体的受者，患有脓毒症的受试者和/或患有心肌梗死的受试者给予时，足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状的iRNA试剂或抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)的量。改善疾病包括减缓疾病的进程或减少后发疾病的严重度。该“预防有效量”可以取决于该iRNA试剂或抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段、如何给予该试剂或抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段、疾病的危险程度和病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前的或伴随的治疗的类型(如果有的话)以及有待治疗的患者的其他个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括在可适用于任何治疗的合理效益/风险比下产生一些希望的局部或全身作用的RNAi试剂或抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)的量，在本发明的这些方法中采用的iRNA试剂可以足够的产生可适用于此种治疗的合理效益/风险比的量给予。
另一方面，本发明提供了治疗有效量的本发明的iRNA试剂用于治疗受试者，例如将受益于C5表达的减少和/或抑制的受试者的用途。
另一方面，本发明提供了治疗有效量的本发明的iRNA试剂和另外的治疗剂如抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)用于治疗受试者，例如将受益于C5表达的减少和/或抑制的受试者的用途。
在又另一个方面中，本发明提供了靶向C5基因的本发明的iRNA试剂(例如，dsRNA)或包含靶向C5基因的iRNA试剂的药物组合物在制造用于治疗受试者(例如，将受益于C5表达的减少和/或抑制的受试者，如患有将受益于C5表达减少的病症(例如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者)的药剂的用途。
另一方面，本发明提供了靶向C5基因的本发明的iRNA试剂(例如，dsRNA)或包含靶向C5基因的iRNA试剂的药物组合物在制造与另外的治疗剂如抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)组合使用用于治疗受试者(例如，将受益于C5表达的减少和/或抑制的受试者，例如患有补体组分C5相关联的疾病(例如PNH或aHUS)的受试者)的药剂的用途。
另一方面，本发明提供了本发明的iRNA(例如，dsRNA)用于在遭受将受益于C5表达减少和/或抑制的病症(如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者中预防至少一种症状的用途。
在又另一个方面中，本发明提供了本发明的iRNA(例如，dsRNA)和另外的治疗剂如抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)用于在遭受将受益于C5表达减少和/或抑制的病症(如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者中预防至少一种症状的用途。
在另外的方面中，本发明提供了本发明的iRNA试剂在制造用于在遭受将受益于C5表达减少和/或抑制的病症(如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者中预防至少一种症状的药剂的用途。
在另外的方面中，本发明提供了本发明的iRNA试剂在制造与另外的治疗剂如抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段(例如，依库珠单抗)组合使用，用于在遭受将受益于C5表达减少和/或抑制的病症(如，补体组分C5相关联的疾病，例如PNH或aHUS)的受试者中预防至少一种症状的药剂的用途。
在一个实施例中，向患有补体组分C5相关联的疾病的受试者给予靶向C5的iRNA试剂，这样使得例如该受试者的细胞、组织、血液、尿液或其他组织或流体中的C5水平降低至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或更多，并且随后，向该受试者给予另外的治疗剂(如下描述)。
该另外的治疗剂可以是一种抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段或衍生物。在一个实施例中，该抗补体组分C5抗体是依库珠单抗或其抗原结合片段或衍生物。依库珠单抗是一种人源化的单克隆IgG2/4、κ轻链抗体，该抗体具有高亲和力地特异性结合补体组分C5并且抑制C5裂解成C5a和C5b，从而抑制产生末端补体复合物C5b-9。依库珠单抗被描述于美国专利号6,355,245中，该美国专利的全部内容通过引用结合在此。
包括向受试者给予本发明的iRNA试剂和依库珠单抗的本发明的这些方法可以进一步包括向该受试者给予脑膜炎球菌疫苗。
可以在与靶向C5的该iRNA试剂相同的时间下或在不同的时间下，向该受试者给予该另外的治疗剂，例如依库珠单抗和/或脑膜炎球菌疫苗。
此外，可以在与靶向C5的该iRNA试剂相同的配制品中或与靶向C5的该iRNA试剂不同的配制品中，向该受试者给予该另外的治疗剂，例如依库珠单抗。
依库珠单抗剂量方案被描述于例如依库珠单抗的产品插页中和美国专利申请号2012/0225056中，所述参考文件中的每一个的全部内容通过引用结合在此。在用于治疗补体组分C5相关联的疾病(例如PNH或aHUS)的本发明的示例性方法中，向该受试者首先(例如，皮下)给予靶向C5的iRNA试剂，这样使得该受试者中的C5水平降低(例如，至少约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或更多)，并且随后，在比的产品插页中描述的剂量更低的剂量下给予依库珠单抗。例如，可以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约900mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约900mg的剂量给予。
还可以小于约900mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约1200mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约1200mg的剂量给予。如果该受试者的年龄是小于18岁，可以小于约900mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续4周，接着在约一周以后以小于约1200mg的第五剂量给予，接着此后约每两周以小于约1200mg的剂量给予；或如果该受试者的年龄是小于18岁，可以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续2周，接着在约一周以后以小于约900mg的第三剂量给予，接着此后约每两周以小于约900mg的剂量给予；或如果该受试者的年龄是小于18岁，可以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续2周，接着在约一周以后以小于约600mg的第三剂量给予，接着此后约每两周以小于约600mg的剂量给予；或如果该受试者的年龄是小于18岁，可以小于约600mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续1周，接着在约一周以后以小于约300mg的第二剂量给予，接着此后约每两周以小于约300mg的剂量给予；或如果该受试者的年龄是小于18岁，可以小于约300mg的剂量每周向该受试者给予依库珠单抗，持续1周，接着在约一周以后以小于约300mg的第二剂量给予，接着此后约每两周以小于约300mg的剂量给予。如果该受试者正接受血浆去除术或血浆交换，可以小于约300mg(例如，如果依库珠单抗的最近剂量是约300mg)或小于约600mg(例如，如果依库珠单抗的最近剂量是约600mg或更多)的剂量向该受试者给予依库珠单抗。如果该受试者正接受血浆输注，可以小于约300mg(例如，如果依库珠单抗的最近剂量是约300mg或更多)的剂量向该受试者给予依库珠单抗。较低剂量的依库珠单抗允许或者皮下或者静脉内给予依库珠单抗。
在包含依库珠单抗的本发明的联合疗法中，可以约0.01mg/kg至约10mg/kg、或约5mg/kg至约10mg/kg、或约0.5mg/kg至约15mg/kg的剂量，向该受试者例如皮下给予依库珠单抗。例如，可以0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mgkg、9mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg或15mg/kg的剂量，向该受试者例如皮下给予依库珠单抗。
本发明的这些方法和用途包括给予在此描述的一种组合物，这样使得靶C5基因的表达减小如约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76或约80小时。在一个实施例中，使靶C5基因的表达减少延长的持续时间，例如至少约2、3、4、5、6、7天或更多，例如约1周、2周、3周或约4周或更长。
给予根据本发明的这些方法和用途的该dsRNA可以在患有补体组分C5相关联的疾病的患者中，引起此类疾病或病症的严重性、体征、症状和/或标志物减少。在此背景下的“减少”意指此种水平统计学上显著的降低。该减少可以是例如至少大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。
可以例如通过测量疾病进展、疾病缓和、症状严重性、疼痛减少、生活品质、维持治疗作用所要求的药剂的剂量、疾病标志物或适用于被治疗或目标用于预防的给定疾病的任何其他可测量参数的水平来评价疾病治疗或预防的功效。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测治疗或预防的功效，这在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可以例如通过周期性监测LDH和CH50水平来评价溶血病症的治疗功效。稍后数据与初始数据的比较为医师提供了该治疗是否有效的指示。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测治疗或预防的功效，这在本领域技术人员的能力范围之内。与给予靶向C5的iRNA或其药物组合物相关，对补体组分C5相关联的疾病“有效”指示以临床上适当的方式给予会对患者产生至少统计学上显著的部分的有益作用，如改善症状、治愈、减少疾病、延长生命、提高生活品质或由熟悉治疗补体组分C5相关联的疾病和相关病因的医师公认为阳性的其他作用。
当疾病状态的一个或多个参数存在统计学上显著的改进时，或通过没有恶化或发展其中它们以另外的方式提前发生的症状，治疗或预防作用是明显的。作为一个实例，在疾病的可测量参数方面的至少10％，并且优选是至少20％、30％、40％、50％或更多的有利改变，可以指示有效治疗。还可以使用如本领域中所知的给定疾病的实验动物模型，判定给定iRNA药物或所述药物的配制品的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状的统计学上显著的减少时，治疗的功效是明显的。
可替代地，可以基于临床上接受的疾病严重性分级量表(仅举一例，类风湿性关节炎严重性量表(RASS))，通过诊断领域技术人员所确定的疾病严重性减小来测量该功效。产生例如使用合适的量表而测量的疾病严重性的减轻的任何积极的改变代表使用如在此描述的iRNA或iRNA配制品的足够的治疗。
可以给予受试者治疗量的iRNA，如约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kgdsRNA、2.6mg/kgdsRNA、2.7mg/kgdsRNA、2.8mg/kgdsRNA、2.9mg/kgdsRNA、3.0mg/kgdsRNA、3.1mg/kgdsRNA、3.2mg/kgdsRNA、3.3mg/kgdsRNA、3.4mg/kgdsRNA、3.5mg/kgdsRNA、3.6mg/kgdsRNA、3.7mgkgdsRNA、3.8mg/kgdsRNA、3.9mg/kgdsRNA、4.0mg/kgdsRNA、4.1mg/kgdsRNA、4.2mg/kgdsRNA、4.3mg/kgdsRNA、4.4mg/kgdsRNA、4.5mg/kgdsRNA、4.6mg/kgdsRNA、4.7mg/kgdsRNA、4.8mg/kgdsRNA、4.9mg/kgdsRNA、5.0mg/kgdsRNA、5.1mg/kgdsRNA、5.2mgkgdsRNA、5.3mg/kgdsRNA、5.4mg/kgdsRNA、5.5mg/kgdsRNA、5.6mg/kgdsRNA、5.7mg/kgdsRNA、5.8mg/kgdsRNA、5.9mg/kgdsRNA、6.0mg/kgdsRNA、6.1mg/kgdsRNA、6.2mg/kgdsRNA、6.3mg/kgdsRNA、6.4mg/kgdsRNA、6.5mg/kgdsRNA、6.6mg/kgdsRNA、6.7mg/kgdsRNA、6.8mg/kgdsRNA、6.9mg/kgdsRNA、7.0mg/kgdsRNA、7.1mg/kgdsRNA、7.2mg/kgdsRNA、7.3mg/kgdsRNA、7.4mg/kgdsRNA、7.5mg/kgdsRNA、7.6mg/kgdsRNA、7.7mg/kgdsRNA、7.8mg/kgdsRNA、7.9mg/kgdsRNA、8.0mg/kgdsRNA、8.1mg/kgdsRNA、8.2mg/kgdsRNA、8.3mg/kgdsRNA、8.4mg/kgdsRNA、8.5mg/kgdsRNA、8.6mg/kgdsRNA、8.7mg/kgdsRNA、8.8mg/kgdsRNA、8.9mg/kgdsRNA、9.0mg/kgdsRNA、9.1mg/kgdsRNA、9.2mg/kgdsRNA、9.3mg/kgdsRNA、9.4mg/kgdsRNA、9.5mg/kgdsRNA、9.6mg/kgdsRNA、9.7mg/kgdsRNA、9.8mg/kgdsRNA、9.9mg/kgdsRNA、9.0mg/kgdsRNA、10mg/kgdsRNA、15mg/kgdsRNA、20mg/kgdsRNA、25mg/kgdsRNA、30mg/kgdsRNA、35mg/kgdsRNA、40mg/kgdsRNA、45mg/kgdsRNA或约50mg/kgdsRNA。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在某些实施例中，例如，当本发明的组合物包含如在此所描述的dsRNA和脂质时，可以给予受试者治疗量的iRNA，如约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.05mg/kg至约5mg/kg、约0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.2mg/kg至约5mg/kg、约0.2mg/kg至约10mg/kg、约0.3mgkg至约5mg/kg、约0.3mg/kg至约10mg/kg、约0.4mg/kg至约5mg/kg、约0.4mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约0.5mgkg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1.5mg/kg至约5mg/kg、约1.5mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约2.5mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约3mg/kg至约10mg/kg、约3.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约4.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约10mg/kg、约4.5mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约5.5mg/kg至约10mg/kg、约6mg/kg至约10mg/kg、约6.5mg/kg至约10mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约7.5mg/kg至约10mg/kg、约8mg/kg至约10mg/kg、约8.5mg/kg至约10mg/kg、约9mg/kg至约10mg/kg或约9.5mg/kg至约10mg/kg。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，可以约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg或约10mg/kg的剂量给予该dsRNA。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在其他实施例中，例如，当本发明的组合物包含如在此所描述的dsRNA和N-乙酰半乳糖胺时，可以给予受试者治疗量的iRNA，如约0.1mg/kg至约50mg/kg、约0.25mg/kg至约50mg/kg、约0.5mg/kg至约50mg/kg、约0.75mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约50mg/mg、约1.5mg/kg至约50mg/kg、约2mg/kg至约50mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg、约3mg/kg至约50mg/kg、约3.5mg/kg至约50mg/kg、约4mg/kg至约50mg/kg、约4.5mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约7.5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约30mg/kg至约50mg/kg、约35mg/kg至约50mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约45mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约45mg/kg、约0.25mg/kg至约45mg/kg、约0.5mg/kg至约45mg/kg、约0.75mg/kg至约45mg/kg、约1mg/kg至约45mg/mg、约1.5mg/kg至约45mg/kg、约2mg/kg至约45mg/kg、约2.5mg/kg至约45mg/kg、约3mg/kg至约45mg/kg、约3.5mg/kg至约45mg/kg、约4mg/kg至约45mg/kg、约4.5mg/kg至约45mg/kg、约5mg/kg至约45mg/kg、约7.5mg/kg至约45mg/kg、约10mg/kg至约45mg/kg、约15mg/kg至约45mg/kg、约20mg/kg至约45mg/kg、约20mg/kg至约45mg/kg、约25mg/kg至约45mg/kg、约25mg/kg至约45mg/kg、约30mg/kg至约45mg/kg、约35mg/kg至约45mg/kg、约40mg/kg至约45mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.25mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约40mg/kg、约0.75mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约40mg/mg、约1.5mg/kg至约40mg/kg、约2mg/kg至约40mg/kg、约2.5mg/kg至约40mg/kg、约3mg/kg至约40mg/kg、约3.5mg/kg至约40mg/kg、约4mg/kg至约40mg/kg、约4.5mg/kg至约40mg/kg、约5mg/kg至约40mg/kg、约7.5mg/kg至约40mg/kg、约10mg/kg至约40mg/kg、约15mg/kg至约40mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约25mg/kg至约40mg/kg、约25mg/kg至约40mg/kg、约30mg/kg至约40mg/kg、约35mg/kg至约40mg/kg、约0.1mg/kg至约30mg/kg、约0.25mg/kg至约30mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.75mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约30mg/mg、约1.5mg/kg至约30mg/kg、约2mg/kg至约30mg/kg、约2.5mg/kg至约30mg/kg、约3mg/kg至约30mg/kg、约3.5mg/kg至约30mg/kg、约4mg/kg至约30mg/kg、约4.5mg/kg至约30mg/kg、约5mg/kg至约30mg/kg、约7.5mg/kg至约30mg/kg、约10mg/kg至约30mg/kg、约15mg/kg至约30mg/kg、约20mg/kg至约30mg/kg、约20mg/kg至约30mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、约0.1mg/kg至约20mg/kg、约0.25mg/kg至约20mg/kg、约0.5mg/kg至约20mg/kg、约0.75mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约20mg/mg、约1.5mg/kg至约20mg/kg、约2mg/kg至约20mg/kg、约2.5mg/kg至约20mg/kg、约3mg/kg至约20mg/kg、约3.5mg/kg至约20mg/kg、约4mg/kg至约20mg/kg、约4.5mg/kg至约20mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约7.5mg/kg至约20mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg或约15mg/kg至约20mg/kg的剂量。在一个实施例中，当本发明的组合物包含如在此所描述的dsRNA和N-乙酰半乳糖胺时，可以给予受试者治疗量的约10mg/kg至约30mg/kg的dsRNA。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，可以给予受试者治疗量的iRNA，如约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg、21mg/kg、21.5mg/kg、22mg/kg、22.5mg/kg、23mg/kg、23.5mg/kg、24mg/kg、24.5mg/kg、25mg/kg、25.5mg/kg、26mg/kg、26.5mg/kg、27mg/kg、27.5mg/kg、28mg/kg、28.5mg/kg、29mg/kg、29.5mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg或约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
可以通过经过一段时间静脉内输注来给予该iRNA，如经过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或约25分钟的周期。可以例如在规则的基础上重复该给予，如每周、每两周(即每两周)持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长。在初始治疗方案后，可以基于更低频率给予治疗。例如在每周或双周给予持续三个月后，给予可以按每个月重复一次，持续六个月或一年或更长。
给予该iRNA可以使例如患者的细胞、组织、血液、尿液或其他区室中的C5水平降低至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或更多。
在给予全部剂量的iRNA之前，可以给予患者更少的剂量，如5％输注，并且监测不良作用，如过敏反应。在另一个实例中，可以针对不想要的免疫刺激作用对该患者进行监测，如细胞因子(例如，TNF-α或INF-α)水平增加。
归因于对C5表达的抑制作用，根据本发明的组合物或从其中制备的药物组合物可以提高生活品质。
本发明的iRNA可以“裸”形式或作为“游离iRNA”给予。在不存在药物组合物的情况下给予裸iRNA。该裸iRNA可以处在适合的缓冲溶液中。该缓冲溶液可以包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。在一个实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以将含有该iRNA的缓冲溶液的pH和摩尔渗透压浓度进行调节，这样使得它适合用于向受试者给予。
可替代地，可以将本发明的iRNA作为药物组合物进行给予，如dsRNA脂质体配制品。
将受益于C5基因表达减少和/或抑制的受试者是患有如在此所描述的补体组分C5相关联的疾病或病症的那些受试者。在一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有哮喘。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有类风湿性关节炎。在又另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有全身性红斑狼疮。在一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有肾小球肾炎。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有牛皮癣。在又另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有皮肌炎大疱性类天疱疮。在一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有非典型溶血性尿毒症综合征。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有志贺氏毒素大肠杆菌相关的溶血性尿毒症综合征。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有重症肌无力。在又另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有视神经脊髓炎。在一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有致密沉积物病。在一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有C3神经病。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有年龄相关的黄斑变性。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有冷凝集素病。在一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有抗嗜中性粒细胞细胞质抗体相关联的血管炎。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有体液和血管移植排斥。在一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有移植物功能异常。在一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有心肌梗塞。在另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者是移植物的敏化受体。在又另一个实施例中，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者患有脓毒症。
对将受益于C5基因表达减少和/或抑制的受试者进行的治疗包括治疗性和预防性(例如，该受试者有待经历敏化的(或同种异体的)移植手术)治疗。
本发明进一步提供了iRNA试剂或其药物组合物与其他药物剂和/或其他治疗方法(例如，与已知的药物剂和/或已知的治疗方法，例如像当前用于治疗这些病症所采用的那些)组合用于治疗将受益于C5表达减少和/或抑制的受试者(例如，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者)的用途(包括iRNA试剂或包含iRNA试剂的药物组合物和抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段的方法和用途)。例如，在某些实施例中，与例如有用于治疗如在此其他地方所描述的补体组分C5相关联的疾病的一种试剂组合来给予靶向C5的iRNA。
例如，适合用于治疗将受益于C5表达减少的受试者(例如，患有补体组分C5相关联的疾病的受试者)的另外治疗剂和治疗方法包括血浆去除术、溶血栓疗法(例如，链激酶)、抗血小板剂、叶酸、皮质类固醇；免疫抑制剂；雌激素、甲氨蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶、美沙拉秦(mesalazine)、奥沙拉秦(olsalazine)、氯喹啉/羟基氯喹、青霉胺、金硫苹果酸盐(肌肉内和口服)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)、β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林(terbutaline)、沙美特罗(salmeteral))、黄嘌呤类(茶碱、氨茶碱)、色甘酸酯、奈多罗米(nedocromil)、酮替芬(ketotifen)、异丙托品(ipratropium)和氧托品(oxitropium)、环孢菌素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、麦考酚酸莫酯(mycophenolatemofetil)、来氟米特(leflunomide)、NSAID、例如布洛芬(ibuprofen)、皮质类固醇如泼尼松龙(prednisolone)、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎性细胞因子如TNF-α或IL-1信号传导的试剂(例如，IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂、TNFα转化酶(TACE)抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂，如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如，可溶性p55或p75TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM和p55TNFRIgG(来那西普(Lenercept)))、sIL-1RI、sIL-1RII和sIL-6R)、抗炎性细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来考昔(celecoxib)、叶酸、羟基氯喹硫酸盐、罗非考昔(rofecoxib)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单克隆单体(infliximonoclonalantibody)、萘普生(naproxen)、伐地考昔(valdecoxib)、柳氮磺吡啶、甲泼尼龙(methylprednisolone)、美洛昔康(meloxicam)、乙酸甲泼尼龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、萘磺酸丙氧芬/apap、叶酸盐、萘丁美酮(nabumetone)、双氯芬酸(diclofenac)、吡罗昔康(piroxicam)、依托度酸(etodolac)、双氯芬酸钠、奥沙普秦(oxaprozin)、盐酸羟考酮(oxycodonehcl)、重酒石酸二氢可待因酮/apap、双氯芬酸钠/米索前列醇(misoprostol)、芬太尼(fentanyl)、阿那白滞素(anakinra)、人重组盐酸曲马多(tramadolhcl)、双水杨酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、氰钴铵素(cyanocobalamin)/fa/吡哆醇(pyridoxine)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、阿仑膦酸钠(alendronatesodium)、泼尼松龙(prednisolone)、硫酸吗啡、盐酸利多卡因(lidocainehydrochloride)、吲哚美辛(indomethacin)、葡糖胺硫酸盐/软骨素(chondroitin)、盐酸阿米替林(amitriptylinehcl)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、盐酸羟考酮/对乙酰氨基酚、盐酸奥洛他定(olopatadinehcl)、米索前列醇(misoprostol)、甲氧萘丙酸钠(naproxensodium)、奥美拉唑(omeprazole)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、利妥昔单克隆抗体(rituximonoclonalantibody)、IL-1TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、美索普兰(Mesopram)、环孢霉素、一种或多种细胞因子抑制性抗炎性药物(CSAID)；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；美国Celltech公司/拜耳公司(Bayer))；cA2/英夫利昔单克隆单体(嵌合抗TNFα抗体；Centocor公司)；75kdTNFR-IgG/依那西普(75kDTNF受体-IgG融合蛋白；免疫公司(Inimunex)；参见例如(1994)关节炎和风湿病(Arthr.Rheum.)37:S295；(1996)研究医学杂志(J.Invest.Med.)44:235A)；55kdTNF-IgG(55kDTNF受体-IgG融合蛋白；豪夫迈-罗氏有限公司(Hoffmann-LaRoche))；IDEC-CE9.1/SB210396(非缺失的灵长类动物源化的抗CD4抗体；IDEC/史密丝克莱恩公司(SmithKline)；参见例如(1995)关节炎和风湿病38:S185)；DAB486-IL-2和/或DAB389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen公司；参见例如(1993)关节炎和风湿病36:1223)；抗Tac(人源化的抗IL-2Rα；蛋白质设计实验室/罗氏公司)；IL-4(抗炎性细胞因子；DNAX/先灵公司(Schering))；IL-10(SCH52000；重组IL-10，抗炎性细胞因子；DNAX/先灵公司)；IL-4；IL-10和/或IL-4激动剂(例如，激动剂抗体)；IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；非牛脂胺/安进公司(Amgen))；阿那白滞素(/安进公司)；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF结合蛋白；参见例如(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)):S284；(1995)美国生理学杂志-心脏与循环生理学(Amer.J.Physiol.-HeartandCirc.Physiol.)268:37-42)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂；参见例如(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S282)；MK-966(COX-2抑制剂；参见例如(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S81)；伊洛前列素(Iloprost)(参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S82)；甲氨蝶呤；萨立多胺(thalidomide)(参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S282)和萨立多胺相关的药物(例如，Celgen)；来氟米特(抗炎性和细胞因子抑制剂；参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S131；(1996)炎症研究(Inflamm.Res.)45:103-107)；凝血酸(tranexamicacid)(血浆酶原激活的抑制剂；参见例如(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S284)；T-614(细胞因子抑制剂；参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S282)；前列腺素E1(参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S282)；替尼达普(Tenidap)(非类固醇抗炎性药物；参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)；S280)；萘普生(非类固醇抗炎性药物；参见例如，(1996)神经学报道(Neuro.Report)7:1209-1213)；美洛昔康(非类固醇抗炎性药物)；布洛芬(非类固醇抗炎性药物)；吡罗昔康(非类固醇抗炎性药物)；双氯芬酸(非类固醇抗炎性药物)；吲哚美辛(非类固醇抗炎性药物)；柳氮磺吡啶(参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S281)；硫唑嘌呤(参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S281)；ICE抑制剂(酶白细胞介素-1β转化酶的抑制剂)；zap-70和/或1ck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或1ck的抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体的抑制剂；血管生成的抑制剂)；皮质类固醇抗炎性药物(例如，SB203580)；TNF-转化酶抑制剂；抗IL-12抗体；抗IL-18抗体；白细胞介素-11(参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S296)；白细胞介素-13(参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S308)；白细胞介素-17抑制剂(参见例如，(1996)关节炎和风湿病39(9(增刊)：S120)；金；青霉胺；氯喹；苯丁酸氮芥；羟基氯喹；环孢霉素；环磷酰胺；全淋巴照射；抗胸腺细胞球蛋白；抗CD4抗体；CD5-毒素；口服给予的肽和胶原；氯苯扎利二钠(lobenzaritdisodium)；细胞因子调节剂(CRA)HP228和HP466(Houghten医药公司)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS2302；伊希斯医药公司(IsisPharmaceuticals,Inc.))；可溶性补体受体1(TP10；T细胞科技公司(TCellSciences,Inc.))；泼尼松；奥古蛋白(orgotein)；粘多糖聚硫酸酯；米诺环素(minocycline)；抗IL2R抗体；海洋和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如，德卢卡(DeLuca)等人(1995)北美风湿病临床(Rheum.Dis.Clin.NorthAm)，21:759-777)；金诺芬(auranofin)；苯基丁氮酮(phenylbutazone)；甲氯芬那酸(meclofenamicacid)；氟芬那酸(flufenamicacid)；静脉内免疫球蛋白；齐留通(zileuton)；阿扎立平(azaribine)；霉酚酸(mycophenolicacid)(RS-61443)；他克莫司(tacrolimus)(FK-506)；西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose)(盐酸氨普立糖(therafectin))；克拉屈滨(cladribine)(2-氯脱氧腺苷酸)；甲氨蝶呤；bcl-2抑制剂(参见布朗克口(Bruncko)M.等人(2007)医药化学杂志(J.Med,Chem.)50(4):641-662)；抗病毒剂和免疫调节剂、KDR的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制剂；甲氨蝶呤；泼尼松；塞来考昔；叶酸；羟基氯喹硫酸盐；罗非考昔；依那西普；英夫利昔单克隆单体；来氟米特；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲泼尼龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲泼尼龙；硫代苹果酸金钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安奈德；萘磺酸丙氧芬/apap；叶酸盐；萘丁美酮；双氯芬酸；吡罗昔康；依托度酸；双氯芬酸钠；奥沙普秦；盐酸羟考酮；重酒石酸二氢可待因酮/apap；双氯芬酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素、人重组盐酸曲马多；双水杨酯；舒林酸；氰钴铵素/fa/吡哆醇；对乙酰氨基酚；阿仑膦酸钠；泼尼松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；葡糖胺硫酸盐/软骨素；环孢霉素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟考酮/对乙酰氨基酚；盐酸奥洛他定；米索前列醇；甲氧萘丙酸钠；奥美拉唑；麦考酚酸莫酯；环磷酰胺；利妥昔单克隆抗体；IL-1TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18BP；IL-12/23；抗IL18；抗IL15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；罗氟司特；IC-485；CDC-801；美索普兰、沙丁胺醇、沙美特罗/氟替卡松(fluticasone)、孟鲁司特钠(montelukastsodium)、丙酸氟替卡松、布地奈德(budesonide)、泼尼松、沙美特罗昔萘酸酯、盐酸左沙丁胺醇、硫酸舒喘灵/异丙托品、泼尼松龙磷酸钠、曲安奈德、二丙酸氯地米松、异丙托溴铵、阿奇毒素(azithromycin)、乙酸吡布特罗(pirbuterolacetate)、泼尼松龙、无水茶碱、甲基泼尼松龙琥珀酸酯钠、克拉霉素(clarithromycin)、扎鲁司特(zafirlukast)、富马酸福莫特罗(formoterolfumarate)、流感病毒疫苗、甲泼尼龙、三水阿莫西林、氟尼缩松(flunisolide)、过敏注射剂、色甘酸钠(cromolynsodium)、盐酸非索那定(fexofenadinehydrochloride)、氟尼缩松/薄荷醇、阿莫西林/克拉维酸钾、左氧氟沙星(levofloxacin)、吸入器辅助装置、愈创甘油醚、塞米松磷酸钠、盐酸莫西沙星(moxitloxacinhcl)、盐酸多西环素(doxycyclinehyclate)、愈创甘油醚/d-吗喃甲醚、p-麻黄碱/cod/氯苯那敏(chlorphenir)、加替沙(gatifloxacin)、盐酸西替立嗪(cetirizinehydrochloride)、莫米松糠酸酯(mometasonefuroate)、沙美特罗昔萘酸酯、苯佐那酯(benzonatate)、先锋霉素Ⅳ(cephalexin)、pe/氢可酮/氯苯那敏、盐酸西替立嗪/伪麻黄碱(pseudoephed)、苯肾上腺素/cod/异丙嗪(promethazine)、甲基吗啡(codeine)/异丙嗪、头孢罗齐(cefprozil)、地塞米松(dexamethasone)、愈创甘油醚/伪麻黄碱、氯苯那敏/氢可酮、奈多罗米钠(nedocromilsodium)、硫酸特普他林(terbutalinesulfate)、肾上腺素、甲泼尼龙、硫酸间羟异丙肾上腺素、阿司匹林、硝化甘油、酒石酸美多洛尔(metoproioltartrate)、依诺肝素钠(enoxaparinsodium)、肝素钠、氯吡格雷硫酸氢盐(clopidogrelbisulfate)、卡维地洛(carvedilol)、阿替洛尔(atenolol)、硫酸吗啡、琥珀酸美多洛尔、华法令钠(warfarinsodium)、赖诺普利(lisinopril)、单硝酸异山梨酯、地高辛(digoxin)、利尿磺胺(furosemide)、辛伐他汀(simvastatin)、雷米普利(ramipril)、替奈普酶(tenecteplase)、马来酸依那普利、托塞米(torsemide)、瑞替普酶(retavase)、氯沙坦钾(losartanpotassium)、盐酸喹那普利(quinaprilhcl)/碳酸镁(magcarb)、布美他尼(bumetanide)、阿替普酶、依那普利拉(enalaprilat)、盐酸胺碘酮(amiodaronehydrochloride)、盐酸替罗非班(tirofibanhcl)m-水合物、盐酸地尔硫卓(diltiazemhydrochloride)、卡托普利(captopril)、依贝沙坦(irbesartan)、缬沙坦(valsartan)、盐酸普萘洛尔(propranololhydrochloride)、福辛普利钠(fosinoprilsodium)、盐酸利多卡因、依替巴肽(eptifibatide)、头孢钠素(cefazolinsodium)、硫酸阿托品(atropinesulfate)、氨基己酸、安体舒通(spironolactone)、干扰素、盐酸索他洛尔、氯化钾、多库酯钠(docusatesodium)、盐酸多巴酚丁胺(dobutaminehcl)、阿普唑仑(alprazolam)、普伐他汀钠(pravastatinsodium)、阿托伐他汀钙(atorvastatincalcium)、盐酸咪达唑(midazolamhydrochloride)、盐酸麦佩里定(meperidinehydrochloride)、硝酸异山梨酯、肾上腺素、盐酸多巴胺(dopaminehydrochloride)、比伐卢定(bivalirudin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、依泽替米贝(ezetimibe)/辛伐他汀、阿伐麦布(avasimibe)和卡立泊来德(cariporide)。
该iRNA试剂(和/或抗补体组分C5抗体)和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或在相同的组合中给予，例如肠胃外给予，或该另外的治疗剂可以作为分开的组合物的一部分或在分开的时间下和/或通过本领域中已知或在此描述的另一种方法来给予。
本发明还提供了使用本发明的iRNA试剂和/或含有本发明的iRNA试剂的组合物来在细胞中减少和/或抑制补体组分C5表达的方法。在其他方面中，本发明提供了用于在细胞中减少和/或抑制C5表达的本发明的iRNA和/或包含本发明的iRNA的组合物。在又其他方面中，提供了本发明的iRNA和/或包含本发明的iRNA的组合物用于制造用于在细胞中减少和/或抑制C5表达的药剂的用途。
这些方法和用途包括使该细胞与本发明的iRNA(例如，dsRNA)接触并且使该细胞维持足以获得C5基因的mRNA转录物降解的时间，从而在该细胞中抑制该C5基因的表达。
基因表达的减少可以通过本领域中已知的任何方法来评价。例如，可以通过使用本领域技术人员常用的方法，例如RNA印迹法、qRT-PCR确定C5的mRNA表达水平，通过使用本领域技术人员常用的方法，如蛋白质印迹法、免疫技术、流式细胞术方法、ELISA确定C5的蛋白质水平，和/或通过如CH50或AH50溶血测定确定C5的生物活性，和/或通过确定与补体系统相关联的一种或多种分子，例如C5产物，像C5a和C5b的生物活性(或在体内背景下，例如溶血)来确定C5表达的减少。
在本发明的这些方法和用途中，该细胞可以在体外或体内被接触，即，该细胞可以在一个受试者内。在其中该细胞是在一个受试者内的本发明的实施例中，这些方法可以包括进一步使该细胞与一种抗补体组分C5抗体(例如依库珠单抗)接触。
使用本发明的这些方法适合用于治疗的细胞可以是表达C5基因的任何细胞。适合用于本发明的这些方法和用途中的细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞(如人细胞或非人灵长类动物细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类动物细胞(如奶牛细胞、猪细胞、骆驼细胞、美洲驼细胞、马细胞、山羊细胞、兔细胞、绵羊细胞、仓鼠、豚鼠细胞、猫细胞、狗细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狮子细胞、老虎细胞、熊细胞或水牛细胞)、禽类细胞(例如，鸭细胞或鹅细胞)、或鲸细胞。在一个实施例中，该细胞是人细胞，例如人肝脏细胞。
在该细胞中可以使C5表达抑制至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％。
本发明的体内方法和用途可以包括向受试者给予含有iRNA的组合物，其中该iRNA包括与有待治疗的哺乳动物的C5基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。当有待治疗的生物体是哺乳动物如人时，该组合物可以通过本领域中已知的任何手段来给予，包括但不限于皮下、静脉内、口服、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，脑室内、实质内和鞘内)、肌肉内、透皮、气道(气雾剂)、鼻、直肠和局部(包括颊和舌下)给予。在某些实施例中，这些组合物通过皮下或静脉内输注或注射来给予。
在一些实施例中，该给予是通过积存注射。积存注射可以在一个延长的时期以连贯的方式释放该iRNA。因此，积存注射可以减少获得希望的作用所需要的给药频率，该希望的作用例如对C5的希望的抑制或治疗性或预防性作用。积存注射还可以提供更连贯的血清浓度。积存注射可以包括皮下注射或肌肉内注射。在优选实施例中，该积存注射是一种皮下注射。
在一些实施例中，该给予是通过一个泵。该泵可以是一个外部泵或手术植入的泵。在某些实施例中，该泵是一种皮下植入的渗透泵。在其他实施例中，该泵是一种输注泵。输注泵可以用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施例中，该输注泵是一个皮下输注泵。在其他实施例中，该泵是将该iRNA递送至肝脏的一个手术植入的泵。
给予模式可以基于是否希望局部治疗或全身性治疗并且基于有待治疗的区域来进行选择。给予的途径和部位可以被选择成增强靶向。
一方面，本发明还提供了用于在哺乳动物例如人中抑制C5基因表达的方法。本发明还提供了包含靶向哺乳动物细胞中的C5基因的iRNA(例如，dsRNA)的组合物，以用于在该哺乳动物中抑制该C5基因的表达。另一方面，本发明还提供了靶向哺乳动物细胞中的C5基因的iRNA(例如，dsRNA)在制造用于在该哺乳动物中抑制该C5基因的表达的药剂中的用途。
这些方法和用途包括向该哺乳动物(例如人)给予包含靶向该哺乳动物细胞中的C5基因的iRNA(例如，dsRNA)的组合物，并且使该哺乳动物维持足以获得该C5基因的mRNA转录物降解的时间，从而在该哺乳动物中抑制该C5基因的表达。在一些实施例中，这些方法进一步包括向该受试者给予一种抗补体组分C5抗体，例如依库珠单抗。
基因表达的减少可以通过本领域中任何已知的方法或通过在此描述的方法(例如qRT-PCR)来评价。蛋白质产生的减少可以通过本领域中任何已知的方法并且通过在此描述的方法(例如ELISA或蛋白质印迹法)来评价。在一个实施例中，穿刺肝脏活检样品用作用于监测C5基因和/或蛋白质表达减少的组织材料。在另一个实施例中，血液样品用作用于监测C5基因和/或蛋白质表达减少的组织材料。在其他实施例中，C5基因的表达抑制间接地通过例如确定C5途径中的基因的表达和/或活性来监测，该C5途径包括例如C5a、C5b和可溶性C5b-9(参见例如，图1)。例如，可以监测CD59的活性来确定C5基因的表达抑制。还可以测量一种样品例如血液或肝脏样品中的CH50、AH50、血块形成和/或血清乳酸脱氢酶(LDH)。适合的测定在以下实例部分中进一步描述。
除非另外限定，否则在此使用的所有技术术语和科学术语具有如本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管与在此描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明中体现的iRNA和方法，但以下描述了适合的方法和材料。在此提交的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文结合。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。另外，这些材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。
实例
实例1.iRNA合成
试剂来源
当在此没有专门给出试剂来源时，此种试剂可以从分子生物学试剂的任何供应商获得，其品质/纯度标准符合分子生物学应用。
转录物
进行siRNA设计以鉴定在NCBI基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中被注释的靶向人、恒河猴(猕猴)、小鼠和大鼠C5转录物的siRNA。设计使用以下来自NCBIRefSeq集合的转录物：人-NM_001735.2；恒河猴-XM_001095750.2；小鼠-NM_010406.2；大鼠-XM_345342.4。在数个分开的批次中设计siRNA双链体，包括但不限于含有匹配仅人和恒河猴转录物；仅人、恒河猴和小鼠转录物；仅人、恒河猴、小鼠和大鼠转录物；并且仅小鼠和大鼠转录物的双链体的批次。设计与列出的人转录物和在每次设计批次(以上)中考虑的其他物种转录物共有100％一致性的所有siRNA双链体。
siRNA设计、特异性和功效预测
从每个序列中预测所有可能的19聚体的预测特异性。然后选择缺乏长于7个核苷酸的重复的候选19聚体。这些2971候选人/恒河猴、142人/恒河猴/小鼠、54人/恒河猴/小鼠/大鼠和807小鼠/大鼠siRNA用于使用在python脚本‘BruteForce.py’中实现的穷尽性“brute-force”算法，针对适当转录组的综合搜索(定义为在人、恒河猴、狗、小鼠或大鼠NCBIRefseq组内的NM_和XM_记录的组)中。该脚本接下来语法分析转录物-寡聚物比对，以便基于siRNA与任何潜在的‘脱靶’转录物之间的错配位置和数目产生分数。对该脱靶分数进行加权，以强调siRNA的“种子”区的差异，在从该分子的5'-端起的位置2-9处。
来自brute-force搜索的每个寡聚物-转录物对通过加和各个错配分数给出错配分数；在位置2-9上的错配被计数为2.8，在裂解位点位置10-11上的错配被计数为1.2，并且在区12-19上的错配被计数为1.0。通过对衍生自每个寡聚物的3个相异种子衍生的六聚体的七聚体和八聚体的频率做比较来进行另外的脱靶预测。来自相对于5'起始的位置2-7的六聚体被用来创建2个七聚体和1个八聚体。通过将3'-A添加至该六聚体来创建‘七聚体1’；通过将5'-A添加至该六聚体来创建七聚体2；通过将A添加至该六聚体的5'-端和3'-端这两者上来创建该八聚体。预先计算了人、恒河猴、小鼠或大鼠3'-UTR组(定义为来自NCBI的Refseq数据库的转录组的子序列，其中编码区的末端‘CDS’被清楚定义)中的八聚体和七聚体的频率。使用来自八聚体频率的范围的中间值将八聚体频率归一化成七聚体频率。然后通过计算((3×归一化的八聚体计数)+(2×七聚体2计数)+(1×七聚体1计数))的总和来计算‘mirSeedScore’。
两种siRNA链被指定为根据计算分数的特异性分类：得分高于3为高特异性的、等于3为特异性的，并且在2.2与2.8之间为中等特异性的。通过反义链的特异性对这些双链体进行分类，并且选择其反义寡聚物在第一位置缺乏GC、在位置13和14两处缺乏G、并且在种子区具有3个或更多个U或A的那些双链体。
对于GalNaC-缀合的双链体，通过将反义19聚体(以上描述)延长至靶互补序列的23个核苷酸来设计有义21聚体和反义23聚体寡聚物。对包括在设计批次中的所有物种转录物的互补性进行检查。使用了在至少2个物种中保存100％序列互补性的仅有的23聚体。对于每个双链体，该有义21聚体被指定为反义链的前21个核苷酸的反向补体。
siRNA序列选择
合成总共23个有义和23个反义衍生的人/恒河猴、6个有义和6个反义人/恒河猴/小鼠、6个有义和6个反义衍生的人/恒河猴/小鼠/小鼠/大鼠以及13个有义和13个反义衍生的小鼠/大鼠siRNA19聚体寡聚物，并且形成为双链体。
对于GalNac缀合物设计，将以上19聚体组延长至21个23聚体双链体，并且根据其新物种匹配重新分类。合成27个有义和27个反义衍生的人/恒河猴、1个有义和1个反义人/恒河猴/小鼠、3个有义和3个反义衍生的人/恒河猴/大鼠、4个有义和4个反义衍生的人/恒河猴/小鼠/大鼠以及13个有义和13个反义衍生的小鼠/大鼠21聚体(有义)和23聚体(反义)寡聚物，并且形成为双链体。
C5有义链序列和反义链序列的详细列表示于表3-6中。
siRNA合成
通用中小规模的RNA合成程序
根据标准固相寡核苷酸合成方案，使用可商购的尿苷的5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺单体、4-N-乙酰基胞苷、6-N-苯甲酰基腺苷和2-N-异丁酰基鸟苷和相对应的2'-O-甲基亚磷酰胺和2'-氟代亚磷酰胺，在0.2-500μmol之间的规模下合成RNA寡核苷酸。在0.1-0.15M浓度下制备亚酰胺溶液，并且5-乙硫基-1H-四唑(0.25-0.6M的乙腈溶液)被用作活化剂。在合成过程中，使用0.2M苯基乙酰基二硫化物(PADS)的二甲基吡啶:乙腈(1:1)(v:v)溶液或0.1M3-(二甲基氨基亚甲基)氨基-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)的吡啶溶液用于氧化步骤来引入硫代磷酸酯骨架修饰。在合成完成之后，序列从固体载体上裂解，并且使用甲胺接着三乙胺去保护。存在去除任何2'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基保护基的3HF。
对于5-500μmol之间的合成规模和完全2'修饰的序列(2'-氟代和/或2'-O-甲基或其组合)，或者在35℃下持续16h或者在55℃下持续5.5h使用3:1(v/v)乙醇和浓(28％-32％)氨水去保护寡核苷酸。在氨水去保护之前，在固体载体上用0.5M哌啶的乙腈溶液处理寡核苷酸持续20min。通过LC-MS和阴离子交换HPLC(IEX-HPLC)来分析粗制寡核苷酸。使用以下物质，通过IEXHPLC进行寡核苷酸的纯化：20mM磷酸盐、10％-15％ACN，pH＝8.5(缓冲液A)和20mM磷酸盐、10％-15％ACN、1MNaBr，pH＝8.5(缓冲液B)。通过分析型HPLC分析级分纯度。将具有适合纯度的含产物的级分汇集，并且在脱盐之前在旋转蒸发仪上浓缩。将样品通过尺寸排阻色谱法脱盐并且冻干至干燥。在1×PBS缓冲液中退火等摩尔量的有义链和反义链，以便制备相对应的siRNA双链体。
对于小规模(0.2-1μmol)，在96孔形式下在MerMade192合成仪上进行合成。在完全2'-修饰的序列(2'-氟代和/或2'-O-甲基或其组合)的情况下，在室温下使用甲胺持续30-60min接着在60℃下孵育30min，或在室温下使用3:1(v/v)乙醇和浓(28％-32％)氨水持续30-60min接着在40℃下孵育1.5小时来去保护寡核苷酸。然后在乙腈:丙酮(9:1)的溶液中沉淀粗制寡核苷酸，并且通过离心分离并且倾析上清液。将粗制的寡核苷酸沉淀物重新悬浮于20mMNaOAc缓冲液中，并且通过LC-MS和阴离子交换HPLC来分析。在5mLHiTrapSephadexG25柱(GE卫生保健公司(GEHealthcare))上在96深孔板中将粗制的寡核苷酸序列进行脱盐。在每个孔中，收集相应于各个序列的约1.5mL样品。通过LC-MS和阴离子交换色谱法分析这些纯化脱盐的寡核苷酸。通过在帝肯(Tecan)机械手上退火等摩尔量的有义序列和反义序列来制备双链体。将双链体的浓度调节至10μM的1×PBS缓冲液的溶液。
用于体内分析的GalNAc-缀合的寡核苷酸的合成
使用一种固体载体在0.2-500μmol之间的规模下合成在其3'-末端处与GalNAc配体缀合的寡核苷酸，该固体载体用具有用于寡核苷酸合成的4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的伯羟基基团的Y形接头和通过系链附接的GalNAc配体预先负载。
对于5-500μmol之间规模下的GalNAc缀合物的合成，遵循以上用于RNA的合成方案并且具有以下改编：对于基于聚苯乙烯的合成，在合成过程中使用载体5％二氯乙酸的甲苯溶液来进行DMT裂解。如上所述进行从该载体的裂解和去保护。在不去除最后5'-DMT基团(“存在DMT”)的情况下合成富含硫代磷酸酯序列(通常>5个硫代磷酸酯)，并且在如上所述裂解和去保护之后，通过反向HPLC，使用50mM乙酸铵的水溶液(缓冲液A)和50mM乙酸铵的80％乙腈溶液(缓冲液B)来纯化。通过分析型HPLC和/或LC-MS分析级分纯度。将具有适合纯度的含产物的级分汇集，并且在旋转蒸发仪上浓缩。使用在水中的20％-25％乙酸去除DMT基团直到完成。将样品通过尺寸排阻色谱法脱盐并且冻干至干燥。在1×PBS缓冲液中退火等摩尔量的有义链和反义链，以便制备相对应的siRNA双链体。
对于GalNAc缀合物的小规模合成(0.2-1μmol)，包括具有多个硫代磷酸酯键联的序列，适用以上描述的用于在MerMade平台上合成RNA或含完全2'-F/2'-OMe的序列的方案。在含GalNAc功能化的可控孔度玻璃载体的预填充柱上进行合成。
实例2.体外筛选
细胞培养和转染
将Hep3B细胞(ATCC公司，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))在37℃在5％CO2的气氛中在伊格尔氏最低基础培养基(ATCC公司)(补充有10％FBS、链霉素以及谷氨酰胺(ATCC公司))中生长接近融合，然后通过胰酶消化从该板释放。洗涤细胞并且以0.25×106个细胞/毫升重新悬浮。在转染过程中，以每个孔约20,000个细胞将细胞放置在96孔板上。
在转染之前小于1小时，从C57BL/6雌性小鼠(查尔斯河试验室国际公司(CharlesRiverLabortoriesInternational,Inc.)威明顿(Willmington)，MA)中新鲜分离原代小鼠肝细胞(PMH)，并且将这些细胞生长在原代肝细胞培养基中。以0.11×106个细胞/毫升将细胞重新悬浮在体外GROCP大鼠(平板接种)培养基(Celsis体外技术公司(CelsisInVitroTechnologies)，目录号S01494)中。在转染过程中，以每孔10,000个细胞将细胞放置在BDBioCoat96孔胶原板(BD,356407)上并且在37℃下在5％CO2气氛中进行孵育。
在使用之前立即在37℃水浴中对低温保存的原代食蟹猴肝细胞(Celsis体外技术公司，M003055-P)进行解冻，并且以0.26×106个细胞/毫升将这些细胞重新悬浮于体外GROCP(平板接种)培养基(Celsis体外技术公司，目录号Z99029)中。在转染过程中，以每孔25,000个细胞将细胞涂布在BDBioCoat96孔胶原板(BD,356407)上并且在37℃下在5％CO2气氛中进行孵育。
对于Hep3B、PMH和原代食蟹猴肝细胞，通过向96孔板中的各个孔中将每孔14.8μl的Opti-MEM加上0.2μl的LipofectamineRNAiMax(英杰公司，卡尔斯巴德CA目录号13778-150)添加至5μl的每个siRNA双链体中来进行转染。然后在室温下将混合物孵育20分钟。然后将含有适当细胞数目的不具有抗生素的80μl完全生长培养基添加至siRNA混合物中。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时。
对于GalNAc修饰的序列，在10nM和0.1nM最终双链体浓度下进行单次剂量实验，对于所有其他序列在1nM和0.01nM最终双链体浓度下进行单次剂量实验。对于原代小鼠肝细胞，在3nM、1nM、0.3nM、0.1nM、0.037nM、0.0123nM、0.00412nM和0.00137nM最终双链体浓度下完成剂量响应实验，并且对于Hep3B细胞，在3nM、1nM、0.3nM、0.1nM、0.037nM、0.0123nM、0.00412nM、0.00137nM、0.00046nM、0.00015nM、0.00005nM和0.000017nM下完成剂量响应实验。
自由摄取转染
通过将每孔10μlsiRNA双链体的PBS溶液添加到96孔板中来进行自由摄取实验。然后将对于细胞类型含有适当细胞数目的90μl完全生长培养基添加至siRNA。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时。在500nM和5nM最终双链体浓度下进行单次剂量实验，并且在1000nM、333nM、111nM、37nM、12.3nM、4.12nM、1.37nM、0.46nM最终双链体浓度下完成剂量响应实验。
使用DYNABEADSmRNA分离试剂盒(英杰公司，部件号：610-12)的总RNA分离
收获细胞并且溶解于150μl的溶解/结合缓冲液中，然后使用埃彭道夫(Eppendorf)热混合器(在整个过程中混合速度相同)在850rpm下混合5分钟。将10微升磁珠和80μl溶解/结合缓冲液混合物添加至圆底板，并且混合1分钟。使用磁力支座捕获磁珠并且在不扰动磁珠的情况下移出上清液。在移除上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的磁珠并且混合5分钟。在去除上清液之后，用150μl洗涤缓冲液A洗涤磁珠2次，并且混合1分钟。这些珠粒再次被捕获，并且去除上清液。然后用150μl洗涤缓冲液B洗涤这些珠粒，捕获并且去除上清液。接下来用150μl洗脱缓冲液洗涤这些珠粒，捕获并且去除上清液。最后，允许这些珠粒干燥2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液，并且在70℃下混合5分钟。用磁体捕获这些珠粒持续5分钟。去除55μl的上清液，并且添加至另一个96孔板。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统，福斯特市(FosterCity)，加利福尼亚州，目录号4368813)的cDNA合成
每个反应制备2μl10×缓冲液、0.8μl25×dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μlRNA酶抑制剂和3.2μlH20的主混合物。对于体外筛选的样品，将等体积主混合物和RNA混合至12μl的最终体积，或对于体内筛选的样品，将等体积主混合物和RNA混合至20μl的最终体积。使用Bio-RadC-1000或S-1000热循环仪(赫力仕公司(Hercules)，CA)，通过以下步骤产生cDNA：25℃持续10分钟，37℃持续120分钟，85℃持续5秒，并且在4℃保持。
实时PCR
在384孔板(罗氏公司目录号04887301001)中，将2μl的cDNA添加至每孔含有2μl的H2O、0.5μlGAPDHTaqMan探针(美国生命技术公司对于Hep3B细胞目录号4326317E，对于原代小鼠肝细胞目录号352339E或对于食蟹猴原代肝细胞为定制的探针)、0.5μlC5TaqMan探针(美国生命技术公司对于Hep3B细胞目录号Hs00156197_m1或对于原代小鼠肝细胞为mm00439275_m1或对于食蟹猴原代肝细胞为定制的探针)和5μlLightcycler480探针主混合物的主混合物中。使用ΔΔCt(RQ)测定，在罗氏LC480实时PCR系统(罗氏公司)中进行实时PCR。除非另外指出，对于体外筛选，使用两个生物重复对每个双链体进行检验并且每个实时PCR以一式二份技术重复而进行。对于体内筛选，在一个或多个实验(每组3个小鼠)中对每个双链体进行测试，并且每个实时PCR以一式二份技术重复而进行。
为了计算C5mRNA水平变化的相对倍数，使用ΔΔCt方法分析实时数据并且归一化成用10nMAD-1955转染的细胞或模拟物转染的细胞进行的测定。使用XLFit，使用4参数拟合模型计算IC50，并且归一化成用AD-1955在相同剂量范围内转染的细胞或归一化成其自身的最低剂量。
AD-1955的有义序列和反义序列是：
有义：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQIDNO:13)；
反义：UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQIDNO:14)。
表7示出用指定的GalNAC缀合的修饰的iRNA转染的Hep3B细胞中的单次剂量筛选的结果。数据表达为相对于未处理的细胞余留的信息的百分比。
表8示出用指定的GalNAC缀合的修饰的iRNA转染的原代小鼠肝细胞中的单次剂量转染筛选的结果。数据表达为相对于未处理的细胞余留的信息的百分比。
表9示出使用指定的GalNAC缀合的修饰的iRNA，在原代食蟹猴肝细胞中的单次剂量自由摄取筛选的结果。数据表达为相对于未处理的细胞余留的信息的百分比。
表10示出使用指定的GalNAC缀合的修饰的iRNA，在原代小鼠肝细胞中的单次剂量自由摄取筛选的结果。数据表达为相对于未处理的细胞余留的信息的百分比。
表11示出使用指定的GalNAC缀合的修饰的iRNA，在原代食蟹猴肝细胞中的自由摄取筛选的剂量响应。指定的IC50值表示相对于未处理的细胞的IC50值。
表12示出使用指定的GalNAC缀合的修饰的iRNA，在原代小鼠肝细胞中的自由摄取筛选的剂量响应。指定的IC50值表示相对于未处理的细胞的IC50值。
表13示出用指定的修饰的和未修饰的iRNA转染的Hep3B细胞中的单次剂量筛选的结果。数据表达为相对于未处理的细胞余留的信息的百分比。该0.01nM剂量是单次生物转染，并且该1nM剂量是两次生物转染。
表14示出用指定的修饰的和未修饰的iRNA转染的原代小鼠肝细胞中的单次剂量筛选的结果。数据表达为相对于未处理的细胞余留的信息的百分比。
表15示出用指定的修饰的和未修饰的iRNA转染的Hep3B细胞中的剂量响应。指定的IC50值表示相对于未处理的细胞的IC50值。
表16示出用指定的修饰的和未修饰的iRNA转染的原代小鼠肝细胞中的剂量响应。指定的IC50值表示相对于未处理的细胞的IC50值。
表2：用于核酸序列表示中的核苷酸单体的缩写。应当理解在寡核苷酸中存在时这些单体是由5'-3'-磷酸二酯键相互连接。
表3.C5dsRNA的未修饰的有义链序列和反义链序列
1物种寡聚物名称反映了基因库记录(例如，NM_001735.2)和反义链靶向的基因库记录的核苷酸序列中的位置(例如，1517-1539)。
2小数点后面的数字是指批号。
3UM＝未修饰
表4.C5dsRNA的GalNAC缀合的修饰的有义链序列和反义链序列
4物种寡聚物名称和反义链靶向的基因库记录的核苷酸序列中的位置相应于表3中示出的那些。
表5.C5dsRNA的未修饰的有义链序列和反义链序列
表6.C5dsRNA的修饰的有义链序列和反义链序列
5物种寡聚物名称和反义链靶向的基因库记录的核苷酸序列中的位置相应于表5中示出的那些。
表7-使用GalNAC缀合的iRNA的Hep3B细胞中的C5单次剂量筛选
表8-使用GalNAC缀合的iRNA的原代小鼠肝细胞中的单次剂量转染筛选
表9-使用GalNAC缀合的iRNA的原代食蟹猴肝细胞中的C5单次剂量筛选
表10-使用GalNAC缀合的iRNA的原代小鼠肝细胞中的C5单次剂量自由摄取筛选
表11-使用GalNAC缀合的iRNA的原代食蟹猴肝细胞中的IC50数据
表12-使用GalNAC缀合的iRNA的原代小鼠肝细胞中的IC50数据
表13-使用修饰的和未修饰的iRNA的Hep3B细胞中的C5单次剂量筛选
表14-使用修饰的和未修饰的iRNA的原代小鼠肝细胞中的C5单次剂量筛选
表15-使用修饰的和未修饰的iRNA的Hep3B细胞中的IC50数据
表16-使用修饰的和未修饰的iRNA的原代小鼠肝细胞中的IC50数据
实例3.体内筛选
选择七个GalNAC缀合的iRNA的亚组用于进一步体内评估。
用10mg/kg的GalNAc缀合的双链体或等体积的1×杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(美国生命技术公司，目录号14040133)对C57BL/6小鼠(每组N＝3)进行皮下注射。48小时后，使小鼠安乐死并且解剖肝脏，并在液氮中迅速冷冻。在2000Geno/研磨机(SPEX样品制备公司(SPEXSamplePrep)，新泽西州麦塔成(Metuchen，NJ))中研磨肝脏。使用每个样品近似10mg的肝脏粉末用于RNA分离。首先在组织溶解器II(凯杰公司，加利福利亚州瓦伦西亚(Valencia，CA))中对样品进行均质化，并且然后使用真空/自旋技术，使用RNeasy96通用组织试剂盒(凯杰公司，目录号74881)，根据制造商的方案提取RNA。通过NanoDrop8000(赛默飞科技公司(ThermoScientific)，威明顿，DE)来测量RNA浓度并且调节至100ng/μl。如上所述进行cDNA和RT-PCR。
单次剂量筛选的结果描绘于图2中。表17示出使用指定的GalNAC缀合的修饰的iRNA的体内单次剂量筛选的结果。数据表达为相对于DPBS处理的小鼠的余留mRNA的百分比。“实验”列列出了从其中计算平均值的实验数目。在所分析的所有实验中，从一个组中的所有小鼠计算标准偏差。
表17-体内C5单次剂量筛选
进一步修饰两种最有效的GalNAC缀合的iRNA以包括另外的硫代磷酸酯键联(表18)，并且如上所述在体内确定这些双链体的功效。单次剂量筛选的结果描绘于图3中，并且证实了具有另外的硫代磷酸酯键联的iRNA试剂比不具有或具有较少硫代磷酸酯键联的那些iRNA试剂更有效。
表18-硫代磷酸酯修饰的GalNAC缀合的C5iRNA
考虑到另外的硫代磷酸酯键联对以上描述的iRNA试剂的沉默能力的影响，如上所述在体内确定包括硫代磷酸酯键联的另外GalNAC缀合的iRNA双链体(表19)的功效。这个单次剂量筛选的结果描绘于图4中。
通过向大鼠给予单次2.5mg/kg、10mg/kg或25mg/kg的剂量来确定体内AD-58642的沉默持续时间，并且确定在第7天存在的C5蛋白的量(图5B)和在第4天和第7天存在的C5蛋白的活性(图5A)。如在图5中所证实，在25mg/kg剂量下，到第4天C5蛋白的活性降低50％，并且在第7天，C5蛋白的活性降低大于70％。
通过全血清的蛋白质印迹分析来确定C5蛋白的量。通过溶血测试来确定C5蛋白的活性。简言之，将人C5缺失的人血清的固定稀释物与小鼠血清混合，并且用抗体涂覆的绵羊红血细胞孵育1小时。测量血红蛋白吸光度，并且计算与参比曲线(使用小鼠血清的一系列稀释物制备)相比的％溶血。
还在单次皮下注射1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和25mg/kg的AD-58642之后，在小鼠中测定体内AD-58642的功效。在第5天，使用qPCR在肝脏样品中测定C5mRNA，对于溶血测定C5活性，并且通过全血清的蛋白质印迹分析来确定C5蛋白的量。
如在图6A和图6B中所描绘，虽然与10mg/kg剂量相比，在25mg/kg的剂量下AD-58642抑制C5mRNA的功效仅存在微小改进(即，约5％)，但使用25mg/kg剂量的沉默的平均值是85％，另外，存在IC50是约2.5mg/kg的剂量响应作用。
图7A和图7B和图8证实了AD-58642有效用于降低C5蛋白的量(图8)和C5蛋白活性(图7A和图7B)。
还通过向C57Bl/6(n＝3)小鼠皮下给予单次0.625mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg剂量的AD-58641来确定体内AD-58641沉默的持续时间，并且通过ELISA确定在第5天和第9天存在于这些动物中的C5蛋白的量。简言之，在第0天(放血前)、第5天和第9天收集血清，并且通过ELISA定量C5蛋白的水平。将C5蛋白水平归一化成第0天放血前的水平。如在图9中所描绘，结果证实了存在剂量依赖型有效的和持久的C5血清蛋白敲低。(单次剂量ED50是0.6mg/kg)。
还使用多次给药的给予方案测试化合物AD-58641在C57Bl/6小鼠中的功效。在第0天、第1天、第2天和第3天，以0.625mg/kg、1.25mg/kg或2.5mg/kg剂量皮下给予小鼠化合物AD-58641。如在图10中所示，在第0天和第8天收集血清，并且通过ELISA分析C5蛋白水平。将C5水平归一化成第0天放血前的水平。图10示出在所测试的所有剂量下，多次给药AD-58641实现了C5蛋白的沉默，其中在2.5mg/kg的剂量下C5蛋白的沉默大于90％。
进一步测试化合物AD-58641的功效，并且使用重复给予方案评估该化合物在大鼠中的累积作用。每周两次以2.5mg/kg/剂量或5.0mg/kg/剂量，用化合物AD-58641皮下注射野生型斯普拉道来(SpragueDawley)大鼠，持续3周(q2w×3)。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天、第18天、第25天和第32天收集血清。使用溶血测定来定量血清溶血活性，其中在GVB++缓冲液中用敏化的绵羊大鼠血细胞孵育大鼠血清的1:150稀释物持续3小时，并且通过测量415nm处的吸光度来定量血红蛋白释放(参见图11A)。还通过ELISA确定样品中存在的C5蛋白的量(图11B)。结果证实了在溶血活性方面存在剂量依赖型有效的和持久的降低，从而实现约90％溶血活性抑制。
表19–另外的硫代磷酸酯修饰的GalNAC缀合的C5iRNA
实例4：另外的siRNA的设计、合成和体外筛选
siRNA设计
使用在基因库登记号NM_001735.2中列举的人C5mRNA序列来设计有义链和反义链的长度均是19个核苷酸的C5双链体。最初鉴定出不含有长于7个核苷酸的重复、基本上跨越整个5480核苷酸转录物的569个双链体。然后根据在每个双链体位置处评估核苷酸对的线性模型和有待用于筛选的剂量和细胞系，针对预测的功效对所有569个双链体进行分类。还使用定制的brute分数算法将这些双链体与人RefSeq集合中的所有转录物进行匹配，并且对于与除了C5以外的转录物的最少数目的错配(每个链)进行分类。然后根据以下方法，从569个双链体中选择有待合成和筛选的双链体：在转录物的5’端处开始，在每10±2个核苷酸的“窗口”内选择双链体，该窗口
1)具有最高预测的功效，
2)在两个链中与除了SERPINC1以外的所有转录物具有至少一个错配，
3)还没有被合成并且筛选未其他双链体组的一部分。
如果在满足所有标准的给定窗口内没有鉴定出双链体，跳过所述窗口。
这569个C5有义链序列和反义链序列的详细列表示于表20中。
使用以下方法来确定包含被列于表20中的有义序列和反义序列的双链体的体外功效。
细胞培养和转染
将HepG2细胞(ATCC公司，弗吉尼亚州马纳萨斯)在37℃在5％CO2的气氛中在伊格尔氏最低基础培养基(ATCC公司)(补充有10％FBS、链霉素以及谷氨酰胺(ATCC公司))中生长接近融合，然后通过胰酶消化从该板释放。通过向96孔板中的各个孔中，将每孔14.8μl的Opti-MEM加上0.2μl的LipofectamineRNAiMax(英杰公司，卡尔斯巴德CA目录号13778-150)添加至5μl的164个siRNA双链体中的每一个中来进行转染。然后在室温下将混合物孵育15分钟。然后将含有大约2.5×104个HepG2细胞的不具有抗生素的80μl完全生长培养基添加至siRNA混合物中。在RNA纯化之前，将细胞孵育24小时。在20nM下进行实验，并且包括首次用于实验的细胞和用AD-1955转染的细胞，荧光素酶靶向的siRNA作为阴性对照。
使用DYNABEADSmRNA分离试剂盒(英杰公司，部件号：610-12)的总RNA分离
收获细胞并且溶解于150μl的溶解/结合缓冲液中，然后在平台振荡器上(在整个过程中混合速度相同)在700rpm下混合5分钟。将10微升磁珠和80μl溶解/结合缓冲液混合物添加至圆底板，并且混合1分钟。使用磁台(magneticstand)捕获磁珠，并且在不扰动这些珠粒的情况下去除上清液。在去除上清液之后，将溶解的细胞添加至余留的珠粒并且混合5分钟。在去除上清液之后，用150μl洗涤缓冲液A洗涤磁珠2次，并且混合1分钟。再次捕获珠粒并且去除上清液。然后用150μl洗涤缓冲液B洗涤珠粒，捕获并且去除上清液。接下来用150μl洗脱缓冲液洗涤珠粒，捕获并且去除上清液。允许珠粒干燥2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液，并且在70℃下混合5分钟。用磁体捕获珠粒持续5分钟。去除含有分离的RNA的40μl的上清液，并且添加至另一个96孔板中。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统，福斯特市，加利福尼亚州，目录号4368813)的cDNA合成
将每个反应2μl10×缓冲液、0.8μl25×dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μlRNA酶抑制剂和3.2μlH2O的主混合物添加到10μl总RNA中。使用Bio-RadC-1000或S-1000热循环仪(赫力仕公司，CA)，通过以下步骤产生cDNA：25℃10分钟，37℃120分钟，85℃5秒，在4℃保持。
实时PCR
在384孔板(罗氏公司目录号04887301001)中，将2μl的cDNA添加至每孔含有0.5μl的人GAPDHTaqMan探针(应用生物系统目录号4326317E)、0.5μl人SERPINC1TaqMan探针(应用生物系统目录号Hs00892758_m1)和5μlLightcycler480探针主混合物(罗氏公司目录号04887301001)的主混合物中。在LC480实时PCR机器(罗氏公司)中进行实时PCR。
为了计算变化的相对倍数，使用ΔΔCt方法分析实时数据并且归一化成用20nMAD-1955转染的细胞进行的测定。
表20：另外的C5未修饰的有义链序列和反义链序列
实例5：体内C5沉默
以2.5mg/kg或5mg/kg剂量或媒介物对照，在背部的肩胛骨区域和中背侧区域中用C5-siRNAAD-58641皮下处理三个雌性食蟹猴的组。在每隔两天给定的每轮中，用八次剂量给予两轮给药。收集血清C5，并且在指定时间点上使用专门用于C5检测的ELISA测定(艾博抗公司(Abcam))来评估(图13)。C5水平被归一化成三个剂量前的样品的平均值。通过全血清化学性质、血液学和凝结小组来分析在给药之前和在第23天(在第一轮处理给予的最后剂量后的24小时)收集的样品。
相对于处理前血清C5蛋白水平的血清C5蛋白水平的分析证实了，5mg/kgAD-58641给药方案使血清C5蛋白水平降低高达98％(图12)。在最低点平均血清C5水平降低97％，从而表明大多数的循环的C5是肝来源的。使用皮下给予AD-58641存在有效的、剂量依赖型和持久的血清C5蛋白水平敲低。在第一轮给药之后24小时鉴定出血液学、血清化学性质或凝结参数没有变化。
还使用敏化的绵羊红细胞测定来分析血清溶血活性，以便测量经典途径活性。相对于最大溶血和对照样品中的背景溶血计算溶血百分比。计算并且分析三个动物的平均溶血值+/-SEM(图13)。在5mg/kg给药方案中溶血减少高达94％，其中在最低点平均抑制是92％。在最后剂量之后大于两周维持了溶血减少。
实例6：另外的siRNA的体外筛选
在3’-末端处用脱氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列对示于表20中的C5有义链序列和反义链序列进行修饰(表21)。使用以下方法来确定包含被列于表21中的有义序列和反义序列的双链体的体外功效。
细胞培养和转染
将Hep3B细胞(ATCC公司，弗吉尼亚州马纳萨斯)在37℃在5％CO2的气氛中在EMEM(ATCC公司)(补充有10％FBS)中生长接近融合，然后通过胰酶消化从该板释放。通过将每孔5μl的Opti-MEM加上0.1μl的LipofectamineRNAiMax(英杰公司，卡尔斯巴德CA目录号13778-150)添加至5μl的siRNA双链体中进入384孔板来进行转染，并且在室温下孵育15分钟。然后将含有大约5×103个Hep3B细胞的40μl完全生长培养基添加至siRNA混合物中。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时。在10nM最终双链体浓度下进行实验。
使用DYNABEADSmRNA分离试剂盒(英杰公司，部件号：610-12)的总RNA分离
使用BiotekEL405洗涤器的半自动化方法进行RNA分离。简言之，将细胞溶解于含有2ulDynabeads的75μl溶解/结合缓冲液中，然后在电磁振荡器(联合科技公司(UnionScientific))的设定7上混合10分钟。使用磁台捕获磁珠并且去除上清液。在去除上清液之后，用90μl洗涤缓冲液A接着是90μl洗涤缓冲液B来洗涤磁珠。然后用100ul的洗脱缓冲液洗涤珠粒两次，随后抽出该洗脱缓冲液并且在384孔板中在珠粒结合RNA上直接产生cDNA。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统，福斯特市，加利福尼亚州，目录号4368813)的cDNA合成
将每个反应2μl10×缓冲液、0.8μl25×dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μlRNA酶抑制剂和3.2μlH2O的主混合物直接添加到用于RNA分离的384孔板中的珠粒结合RNA中。然后在电磁振荡器上使板振荡10分钟，并且然后放置于37℃孵育器中持续2小时。在此孵育之后，将板放置于80℃孵育器中振荡7分钟以使酶失活并且从这些珠粒上洗脱RNA/cDNA。
实时PCR
将2μl的cDNA添加至384孔板(罗氏公司目录号04887301001)中的每孔含有0.5μlGAPDHTaqMan探针(应用生物系统目录号4326317E)、0.5μlC5TaqMan探针(应用生物系统目录号Hs00156197_M1)和5μlLightcycler480探针主混合物(罗氏公司目录号04887301001)的主混合物中。在罗氏LC480实时PCR系统(罗氏公司)中完成实时PCR。在至少两次独立的转染中测试每个双链体并且一式两份测定每次转染。
为了计算变化的相对倍数，使用ΔΔCt方法分析实时数据并且归一化成用10nMAD-1955转染的细胞或模拟物转染的细胞进行的测定。
表22示出用指定的dT修饰的iRNA转染的Hep3B细胞中的单次剂量筛选的结果。数据表达为相对于未处理的细胞余留的信息的百分比。
表21.dT修饰的C5iRNA
表22.使用dT修饰的iRNA的Hep3B细胞中的C5单次剂量筛选(10nM)
实例7：另外的siRNA的体内筛选
基于AD-58643的序列，合成另外的四个有义序列和三个反义序列，并且用来制备12种21聚体/25聚体化合物(表23)。通常，用dTdT延长这些化合物的反义链并且双链体具有较少的氟代修饰的核苷酸。
用1mg/kg的这些GalNAc缀合的双链体皮下注射C57BL/6小鼠(每组N＝3)，在第0天放血前和第5天收集血清，并且通过ELISA定量C5蛋白的水平。将C5蛋白水平归一化成第0天放血前的水平。
图14示出使用指定的iRNA的体内单次剂量筛选的结果。数据表达为相对于放血前水平余留的C5蛋白质的百分比。与母体化合物相比具有改进的功效的那些iRNA包括AD-62510、AD-62643、AD-62645、AD-62646、AD-62650和AD-62651。这些iRNA还证实了类似的潜力(IC50是约23-59pM)。
还使用单次给药给予方案，在C57Bl/6小鼠中测试了这些iRNA的功效。以0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg或2.5mg/kg剂量皮下给予小鼠AD-62510、AD-62643、AD-62645、AD-62646、AD-62650和AD-62651。在第0天和第5天收集血清，并且通过ELISA分析C5蛋白水平。将C5水平归一化成第0天放血前的水平。
图15示出针对所有所测试的iRNA存在剂量响应，并且单次给药所有这些iRNA实现了类似于或优于AD-58641的C5蛋白沉默。
通过向C57Bl/6小鼠给予单次1.0mg/kg剂量并且通过ELISA确定在第6天、第13天、第20天、第27天和第34天存在的C5蛋白的量来确定体内AD-62510、AD-62643、AD-62645、AD-62646、AD-62650和AD-62651的沉默持续时间。将C5水平归一化成第0天放血前的水平。
如在图16中所证实，所测试的每个iRNA具有与AD-62643相同的倾向于朝着最佳沉默但在测定误差内的回收率动力学。
进一步测试了AD-62510、AD-62643、AD-62645、AD-62646、AD-62650和AD-62651的功效，并且使用重复给予方案评估这些iRNA在大鼠中的累积作用。在第0天、第4天和第7天，以5.0mg/kg/剂量用这些iRNA中的每一个皮下注射野生型斯普拉道来大鼠。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天、第18天、第25天、第28天和第32天收集血液。如上所述定量血清溶血活性。
图17中描绘的结果证实了所有所测试的iRNA具有有效的和持久的溶血活性降低和与用AD-58641处理所观察到的类似的溶血回收率。
表23：GalNAc缀合的C5dsRNA的修饰的有义链序列和反义链序列

Claims (112)

1.一种用于抑制补体组分C5的表达的双链核糖核酸(dsRNA)试剂，其中所述dsRNA包含一个有义链和一个反义链，其中所述有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
2.一种用于抑制补体组分C5的表达的双链核糖核酸(dsRNA)试剂，其中所述dsRNA包含一个有义链和一个反义链，该反义链包含一个互补区，该互补区包含与表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个中列出的任一个反义序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的dsRNA试剂，其中该有义链和反义链包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：A-118320、A-118321、A-118316、A-118317、A-118332、A-118333、A-118396、A-118397、A-118386、A-118387、A-118312、A-118313、A-118324、A-118325、A-119324、A-119325、A-119332、A-119333、A-119328、A-119329、A-1193221、A-119323、A-119324、A-119325、A-119334、A-119335、A-119330.A-119331、A-119326、A-119327、A-125167、A-125173、A-125647、A-125157、A-125173和A-125127。
4.如权利要求1或2所述的dsRNA试剂，其中该有义链和反义链包含选自下组的序列，该组由表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20表21和表23中的任一个中的任何这些序列组成。
5.如权利要求1或2所述的dsRNA试剂，其中所述dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。
6.一种用于抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一个有义链和一个反义链，
其中所述有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，
其中所述有义链的基本上所有的这些核苷酸和所述反义链的基本上所有的这些核苷酸是修饰的核苷酸，并且
其中所述有义链被缀合到在3'-末端处附接的一个配体上。
7.如权利要求6所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链的所有这些核苷酸和所述反义链的所有这些核苷酸均包含一种修饰。
8.如权利要求5或6所述的dsRNA试剂，其中所述修饰的核苷酸中的至少一个是选自下组，该组由以下各项组成：3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁定核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含核苷酸的非天然碱基、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸。
9.如权利要求8所述的dsRNA试剂，其中所述修饰的核苷酸包含3'-末端脱氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)的一个短序列。
10.如权利要求1、2和6中任一项所述的dsRNA试剂，其中该互补区的长度是至少17个核苷酸。
11.如权利要求1、2和6中任一项所述的dsRNA试剂，其中该互补区的长度是在19个与21个核苷酸之间。
12.如权利要求11所述的dsRNA试剂，其中该互补区的长度是19个核苷酸。
13.如权利要求1、2和6中任一项所述的dsRNA试剂，其中每个链的长度是不多于30个核苷酸。
14.如权利要求1、2和6中任一项所述的dsRNA试剂，其中至少一个链包含具有至少1个核苷酸的一个3'突出端。
15.如权利要求1、2和6中任一项所述的dsRNA试剂，其中至少一个链包含具有至少2个核苷酸的一个3'突出端。
16.如权利要求1或2所述的dsRNA试剂，进一步包含一个配体。
17.如权利要求16所述的dsRNA试剂，其中该配体被缀合到该dsRNA试剂的该有义链的3'端上。
18.如权利要求6或16所述的dsRNA试剂，其中该配体是一种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
19.如权利要求18所述的dsRNA试剂，其中该配体是
20.如权利要求18所述的dsRNA试剂，其中该dsRNA试剂被缀合到以下示意图中所示的该配体上，
并且，其中X是O或S。
21.如权利要求20所述的dsRNA试剂，其中该X是O。
22.如权利要求2所述的dsRNA试剂，其中该互补区由表3、表4、表5、表6、表18、表19、表20、表21和表23中的任一个的这些反义序列中的一个组成。
23.如权利要求1或2所述的dsRNA试剂，其中该dsRNA试剂是选自下组，该组由以下各项组成：AD-58123、AD-58111、AD-58121、AD-58116、AD-58133、AD-58099、AD-58088、AD-58642、AD-58644、AD-58641、AD-58647、AD-58645、AD-58643、AD-58646、AD-62510、AD-62643、AD-62645、AD-62646、AD-62650和AD-62651。
24.一种能够在一种细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5′(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
各np、np'、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、np'、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
25.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中i是0；j是0；i是1；j是1；i和j这两者均是0；或i和j这两者均是1。
26.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中k是0；l是0；k是1；l是1；k和l这两者均是0；或k和l这两者均是1。
27.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中XXX与X'X'X'互补，YYY与Y'Y'Y'互补，并且ZZZ与Z'Z'Z'互补。
28.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。
29.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中该Y'Y'Y'基序出现在从5'-端起该反义链的11、12和13位置处。
30.如权利要求29所述的双链RNAi试剂，其中该Y'是2'-O-甲基。
31.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中式(III)由式(IIIa)表示：
有义：5′np-Na-YYY-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′(IIIa)。
32.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中式(III)由式(IIIb)表示：
有义：5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5′(IIIb)
其中各Nb和Nb'独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
33.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中式(III)由式(IIIc)表示：
有义：5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′(IIIc)
其中各Nb和Nb'独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
34.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中式(III)由式(IIId)表示：
有义：5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5′
(IIId)
其中各Nb和Nb'独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，并且各Na和Na'独立地表示包含2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
35.如权利要求6或24所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是15-30个核苷酸对。
36.如权利要求35所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是17-23个核苷酸对。
37.如权利要求35所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是17-25个核苷酸对。
38.如权利要求35所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是23-27个核苷酸对。
39.如权利要求35所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是19-21个核苷酸对。
40.如权利要求6或24所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是21-23个核苷酸对。
41.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中每个链具有15-30个核苷酸。
42.如权利要求6、24和34中任一项所述的双链RNAi试剂，其中每个链具有19-30个核苷酸。
43.如权利要求6或24所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的这些修饰是选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟代、2'-脱氧、2'-羟基以及其组合。
44.如权利要求43所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰。
45.如权利要求6或24所述的双链RNAi试剂，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
46.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，该配体是
47.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中该配体被附接到该有义链的3'端上。
48.如权利要求47所述的双链RNAi试剂，其中该RNAi试剂被缀合到以下示意图中所示的该配体上
49.如权利要求6或24所述的双链RNAi试剂，其中所述试剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。
50.如权利要求49所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一个链的3'-末端处。
51.如权利要求50所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。
52.如权利要求50所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该有义链。
53.如权利要求49所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一个链的5'-末端处。
54.如权利要求53所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。
55.如权利要求53所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该有义链。
56.如权利要求49所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一个链的5'-末端和3'-末端这两者处。
57.如权利要求56所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。
58.如权利要求6或24所述的双链RNAi试剂，其中在该双链体的该反义链的5'-端的1位置处的碱基对是一个AU碱基对。
59.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中该Y核苷酸含有一种2'-氟代修饰。
60.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中该Y'核苷酸含有一种2'-O-甲基修饰。
61.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中p’>0。
62.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中p'＝2。
63.如权利要求62所述的双链RNAi试剂，其中q'＝0，p＝0，q＝0，并且p'突出端核苷酸与该靶mRNA互补。
64.如权利要求62所述的双链RNAi试剂，其中q'＝0，p＝0，q＝0，并且p'突出端核苷酸与该靶mRNA不互补。
65.如权利要求56所述的双链RNAi试剂，其中该有义链具有总共21个核苷酸，并且该反义链具有总共23个核苷酸。
66.如权利要求61-65中任一项所述的双链RNAi试剂，其中至少一个nP'通过一个硫代磷酸酯键联而被连接到一个相邻核苷酸上。
67.如权利要求66所述的双链RNAi试剂，其中所有nP'均通过硫代磷酸酯键联而被连接到相邻核苷酸上。
68.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中所述RNAi试剂是选自在表4、表18、表19和表23中的任一个中列出的RNAi试剂的组。
69.如权利要求24所述的双链RNAi试剂，其中所述RNAi试剂是选自下组，该组由以下各项组成：AD-58123、AD-58111、AD-58121、AD-58116、AD-58133、AD-58099、AD-58088、AD-58642、AD-58644、AD-58641、AD-58647、AD-58645、AD-58643、AD-58646、AD-62510、AD-62643、AD-62645、AD-62646、AD-62650和AD-62651。
70.一种能够在一种细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5′(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p'、q和q'各自独立地是0-6；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
各np、np'、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、np'、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
71.一种能够在一种细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5′(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
各np、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
p、q和q'各自独立地是0-6；
np'>0并且至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上。
72.一种能够在一种细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5′(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
各np、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
p、q和q'各自独立地是0-6；
np'>0并且至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
73.一种能够在一种细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5′(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
各np、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
p、q和q'各自独立地是0-6；
np'>0并且至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
各Nb和Nb'独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb'上的修饰不同于Y'上的修饰；
其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
74.一种能够在一种细胞中抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包含与编码补体组分C5的mRNA的一部分互补的一个区，其中每个链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义：5′np-Na-YYY-Na-nq3′
反义：3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′(IIIa)
其中：
各np、nq和nq'独立地表示突出端核苷酸，该np、nq和nq'中的每一个可以或可以不存在；
p、q和q'各自独立地是0-6；
np'>0并且至少一个np'通过一个硫代磷酸酯键联被连接到一个相邻核苷酸上；
各Na和Na'独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
YYY和Y'Y'Y'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2'-O-甲基或2'-氟代修饰；
其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联；并且
其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
75.一种用于抑制补体组分C5的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一个有义链和一个反义链，
其中所述有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQIDNO:5的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，
其中所述有义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，
其中所述有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，
其中所述反义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，
其中所述反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且
其中所述有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。
76.如权利要求75所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链的所有这些核苷酸和所述反义链的所有这些核苷酸均是修饰的核苷酸。
77.如权利要求75所述的双链RNAi试剂，其中每个链具有19-30个核苷酸。
78.一种细胞，含有如权利要求1、2、6、24和70-74中任一项所述的dsRNA试剂。
79.一种编码dsRNA试剂的至少一个链的载体，其中所述dsRNA试剂包含与编码补体组分C5的mRNA的至少一部分互补的一个区，其中所述dsRNA的长度是30个碱基对或更少，并且其中所述dsRNA试剂靶向所述mRNA用于裂解。
80.如权利要求79所述的载体，其中该互补区域的长度是至少15个核苷酸。
81.如权利要求79所述的载体，其中该互补区域的长度是19个至21个核苷酸。
82.一种细胞，包含如权利要求79所述的载体。
83.一种用于抑制补体组分C5基因的表达的药物组合物，该组合物包含如权利要求1、2、6、24和70-75中任一项所述的dsRNA试剂或如权利要求79所述的载体。
84.如权利要求83所述的药物组合物，其中以一种无缓冲的溶液给予RNAi试剂。
85.如权利要求84所述的药物组合物，其中所述无缓冲的溶液是盐水或水。
86.如权利要求85所述的药物组合物，其中与一种缓冲溶液一起给予所述RNAi试剂。
87.如权利要求86所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。
88.如权利要求86所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
89.一种药物组合物，包含如权利要求1或2所述的双链RNAi试剂和一种脂质配制品。
90.如权利要求89所述的药物组合物，其中该脂质配制品包含一种LNP。
91.如权利要求89所述的药物组合物，其中该脂质配制品包含一种MC3。
92.一种在一种细胞中抑制补体组分C5表达的方法，该方法包括：
(a)使该细胞与如权利要求1、2、6、24和70-75中任一项所述的双链RNAi试剂或如权利要求83-91中任一项所述的药物组合物接触；并且
(b)使在步骤(a)中产生的该细胞维持足以获得补体组分C5基因的该mRNA转录物降解的时间，从而在该细胞中抑制该补体组分C5基因的表达。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述细胞是在一个受试者内。
94.如权利要求93所述的方法，其中该受试者是人。
95.如权利要求91-93中任一项所述的方法，其中该补体组分C5表达被抑制至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％。
96.一种治疗患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的如权利要求1、2、6、24和70-75中任一项所述的dsRNA试剂或如权利要求83-91中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。
97.一种在患有将受益于补体组分C5表达减少的疾病或病症的受试者中预防至少一种症状的方法，该方法包括向该受试者给予预防有效量的如权利要求1、2、6、24和70-75中任一项所述的dsRNA试剂或如权利要求83-91中任一项所述的药物组合物，从而在患有将受益于C5表达减少的病症的该受试者中预防至少一种症状。
98.如权利要求96或97所述的方法，其中该dsRNA向该受试者的给予引起血管内溶血减少、血红蛋白水平稳定和/或C5蛋白减少。
99.如权利要求96或97所述的方法，其中该病症是一种补体组分C5相关联的疾病。
100.如权利要求99所述的方法，其中该补体组分C5相关联的疾病是选自下组，该组由以下各项组成：阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、哮喘、类风湿性关节炎(RA)；抗磷脂抗体综合征；狼疮肾炎；缺血-再灌注损伤；典型的或感染性溶血性尿毒症综合征(tHUS)；致密沉积物病(DDD)；视神经脊髓炎(NMO)；多灶性运动神经病(MMN)；多发性硬化(MS)；黄斑变性(例如，年龄相关的黄斑变性(AMD))；溶血、肝脏酶升高以及血小板低(HELLP)综合征；血栓性血小板减少性紫癜(TTP)；自发性流产；寡免疫血管炎；大疱性表皮松解症；习惯性流产；先兆子痫、创伤性脑损伤、重症肌无力、冷凝集素病、皮肌炎大疱性类天疱疮、志贺毒素大肠杆菌相关的溶血性尿毒症综合征、C3肾病、抗嗜中性粒细胞细胞质抗体相关联的血管炎、体液和血管移植排斥、移植物功能异常、心肌梗塞、异源移植、脓毒症、冠状动脉病、皮肌炎、格雷夫斯病、动脉粥样硬化、阿耳茨海默氏病、全身性炎症反应脓毒症、脓毒性休克、脊髓损伤、肾小球性肾炎、桥本氏甲状腺炎、I型糖尿病、牛皮癣、天疱疮、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、ITP、肺出血肾炎综合征、德戈斯病、抗磷脂综合征(APS)、灾难性APS(CAPS)、心血管病症、心肌炎、脑血管疾病、外周血管疾病、肾血管疾病、肠系膜/肠血管疾病、血管炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎、全身性红斑狼疮相关联的血管炎、与类风湿性关节炎相关联的血管炎、免疫复合物血管炎、高安氏病、扩张性心肌病、糖尿病性血管病、川畸氏病(动脉炎)、静脉气体栓子(VGE)以及支架放置、旋转式动脉粥样斑块去除术、膜性肾病、格-巴二氏综合征和经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄。
101.如权利要求100所述的方法，其中该补体组分C5相关联的疾病是阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。
102.如权利要求100所述的方法，其中该补体组分C5相关联的疾病是非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)。
103.如权利要求96或97所述的方法，其中该受试者是人。
104.如权利要求96-103中任一项所述的方法，进一步包括向该受试者给予一种抗补体组分C5抗体或其抗原结合片段。
105.如权利要求96-104中任一项所述的方法，其中以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予该dsRNA试剂。
106.如权利要求105所述的方法，其中以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予该dsRNA试剂。
107.如权利要求105所述的方法，其中以选自下组的剂量给予该dsRNA试剂，该组由以下各项组成：0.5mg/kg1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和30mg/kg。
108.如权利要求105所述的方法，其中每周一次向该受试者给予该dsRNA试剂。
109.如权利要求105所述的方法，其中每周两次向该受试者给予该dsRNA试剂。
110.如权利要求105所述的方法，其中每月两次向该受试者给予该dsRNA试剂。
111.如权利要求96-110中任一项所述的方法，其中向该受试者皮下给予该dsRNA试剂。
112.如权利要求96或97所述的方法，进一步包括测量所述受试者中的血红蛋白和/或LDH水平。
CN201480027279.0A 2013-03-14 2014-03-13 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法 Active CN105324485B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111348463.3A CN114015692A (zh) 2013-03-14 2014-03-13 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361782531P 2013-03-14 2013-03-14
US61/782,531 2013-03-14
US201361837399P 2013-06-20 2013-06-20
US61/837,399 2013-06-20
US201361904579P 2013-11-15 2013-11-15
US61/904,579 2013-11-15
US201361912777P 2013-12-06 2013-12-06
US61/912,777 2013-12-06
US201461942367P 2014-02-20 2014-02-20
US61/942,367 2014-02-20
PCT/US2014/025882 WO2014160129A2 (en) 2013-03-14 2014-03-13 Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111348463.3A Division CN114015692A (zh) 2013-03-14 2014-03-13 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105324485A true CN105324485A (zh) 2016-02-10
CN105324485B CN105324485B (zh) 2021-11-23

Family

ID=50678278

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480027279.0A Active CN105324485B (zh) 2013-03-14 2014-03-13 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法
CN202111348463.3A Pending CN114015692A (zh) 2013-03-14 2014-03-13 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111348463.3A Pending CN114015692A (zh) 2013-03-14 2014-03-13 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法

Country Status (33)

Country Link
US (6) US9249415B2 (zh)
EP (2) EP2970974B1 (zh)
JP (4) JP6524060B2 (zh)
KR (4) KR102342916B1 (zh)
CN (2) CN105324485B (zh)
AU (3) AU2014244116B9 (zh)
BR (1) BR112015022876B1 (zh)
CA (2) CA2904654C (zh)
CL (4) CL2015002710A1 (zh)
CR (1) CR20150493A (zh)
CY (1) CY1120289T1 (zh)
DK (1) DK2970974T3 (zh)
DO (1) DOP2015000234A (zh)
EA (1) EA201591707A1 (zh)
ES (1) ES2649490T3 (zh)
GT (1) GT201500293A (zh)
HK (2) HK1221484A1 (zh)
HR (1) HRP20171813T1 (zh)
HU (1) HUE034987T2 (zh)
IL (2) IL265594B (zh)
LT (1) LT2970974T (zh)
ME (1) ME03043B (zh)
MX (2) MX366660B (zh)
NZ (1) NZ712336A (zh)
PE (2) PE20160046A1 (zh)
PL (1) PL2970974T3 (zh)
PT (1) PT2970974T (zh)
RS (1) RS56663B1 (zh)
SG (3) SG11201507400SA (zh)
SI (1) SI2970974T1 (zh)
TW (4) TWI745684B (zh)
UY (2) UY40039A (zh)
WO (1) WO2014160129A2 (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111134115A (zh) * 2019-12-24 2020-05-12 东华大学 一种农药保持剂及其制备方法
WO2020238763A1 (zh) * 2019-05-24 2020-12-03 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
CN114867484A (zh) * 2019-12-26 2022-08-05 卫材R&D管理有限公司 含有抑制补体c5的表达的双链核糖核酸的药物组合物
CN114981430A (zh) * 2019-08-27 2022-08-30 赛伦斯治疗有限责任公司 用于抑制细胞中的c3表达的核酸
US11492620B2 (en) 2017-12-01 2022-11-08 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof
US11633482B2 (en) 2017-12-29 2023-04-25 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
WO2023088455A1 (zh) * 2021-11-22 2023-05-25 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
US11660347B2 (en) 2017-12-01 2023-05-30 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate containing same, preparation method, and use thereof
WO2024008158A1 (zh) * 2022-07-07 2024-01-11 北京福元医药股份有限公司 用于抑制c5基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
US11896674B2 (en) 2018-09-30 2024-02-13 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof
US11918600B2 (en) 2018-08-21 2024-03-05 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate containing nucleic acid, and use thereof

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
CN104105790A (zh) 2011-11-18 2014-10-15 阿尔尼拉姆医药品有限公司 修饰的RNAi试剂
SI2970974T1 (sl) 2013-03-14 2017-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Komplementarna komponenta C5 sestavkov IRNA in postopki njene uporabe
ES2768648T3 (es) 2013-03-29 2020-06-23 Alexion Pharma Inc Composiciones y métodos para aumentar la semivida en suero de un agente terapéutico dirigido a C5 del complemento
ES2745825T3 (es) * 2014-05-01 2020-03-03 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para modular la expresión del factor B del complemento
SG10201913791QA (en) 2014-08-20 2020-03-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded rna agents
WO2016040589A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
EP3194596A1 (en) * 2014-09-16 2017-07-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
JOP20200115A1 (ar) 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
US10036017B2 (en) 2015-02-17 2018-07-31 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of complement component 5(C5) by double-stranded RNA
EP3277715A2 (en) * 2015-03-31 2018-02-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Identifying and treating subpopulations of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) patients
WO2016179342A2 (en) * 2015-05-06 2016-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Factor xii (hageman factor) (f12), kallikrein b, plasma (fletcher factor) 1 (klkb1), and kininogen 1 (kng1) irna compositions and methods of use thereof
EP3307316A1 (en) * 2015-06-12 2018-04-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
JP6715325B2 (ja) * 2015-06-26 2020-07-01 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドＳｕｚｈｏｕ Ｒｉｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物及び結合体、並びにそれらの応用
JP6666002B2 (ja) * 2015-10-07 2020-03-13 国立大学法人京都大学 Ｔｄｐ−４３プロテノパシーの予防又は治療用組成物
WO2017214518A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLETMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSTIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
CN110214005A (zh) * 2016-11-11 2019-09-06 DNALite治疗学公司 用于基因治疗的结构和方法
EP4035659A1 (en) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
KR20230043247A (ko) * 2017-01-31 2023-03-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 C5-관련 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물 및 c5-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법
US10376595B2 (en) 2017-04-03 2019-08-13 Inflarx Gmbh Treatment of inflammatory diseases with inhibitors of C5a activity
TWI826364B (zh) * 2017-04-03 2023-12-21 德商因夫萊亞斯有限公司 活性抑制劑於發炎性疾病之治療
WO2018234118A1 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 Inflarx Gmbh TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES BY INHIBITORS OF C5A ACTIVITY
JP7337044B2 (ja) 2017-07-13 2023-09-01 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｈａｏ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ））遺伝子発現の阻害方法
AU2018360697A1 (en) 2017-11-01 2020-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component C3 iRNA compositions and methods of use thereof
JP7273417B2 (ja) 2017-12-01 2023-05-15 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用
CN110945130B (zh) 2017-12-01 2024-04-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
GB201800620D0 (en) 2018-01-15 2018-02-28 Univ Manchester C3b Binding Polypeptide
EP3597222A1 (en) 2018-07-16 2020-01-22 Easemedcontrol R & D GmbH & Co KG Treatment and diagnosis of unresolved inflammatory diseases
WO2020060987A1 (en) * 2018-09-18 2020-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use
US10526603B1 (en) 2018-10-26 2020-01-07 Eisai R&D Management Co., Ltd. Double-stranded ribonucleic acid capable of suppressing expression of complement C5
KR20220047826A (ko) 2019-08-16 2022-04-19 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 고 농도의 항-c5 제형
WO2021081026A1 (en) 2019-10-22 2021-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
EP4048691A1 (en) 2019-10-25 2022-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing regimens for treating or preventing c5-associated diseases
CN110865182B (zh) * 2019-11-19 2023-06-27 东莞市东阳光诊断产品有限公司 一种阻断剂及其在免疫检测中的应用
CN111041025B (zh) 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
JP6918197B2 (ja) * 2019-12-26 2021-08-11 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 脂質複合体を含む医薬組成物及び脂質ナノ粒子を含む医薬組成物
WO2021154941A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2021178607A1 (en) 2020-03-05 2021-09-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
BR112022021136A2 (pt) 2020-04-30 2022-11-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de fator b de complemento (cfb) e métodos de uso das mesmas
US20230323357A1 (en) * 2020-06-09 2023-10-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR ASSOCIATED FACTOR 6 (TRAF6) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
WO2022056127A2 (en) * 2020-09-09 2022-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing growth factor receptor bound protein 10 (grb10) or growth factor receptor bound protein 14 (grb14) in the liver
WO2023044370A2 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing complement component 3 (c3)
CA3234636A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b (cfb) irna compositions and methods of use thereof
US11957178B2 (en) 2021-11-15 2024-04-16 Apackaging Group Llc Aerosol actuator
WO2023121050A1 (ko) * 2021-12-22 2023-06-29 주식회사 엔에이백신연구소 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1752536A1 (en) * 2004-05-11 2007-02-14 RNAi Co., Ltd. Polynucleotide causing rna interfere and method of regulating gene expression with the use of the same
US20110015252A1 (en) * 2009-06-15 2011-01-20 Kevin Fitzgerald Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2011078672A1 (en) * 2009-12-24 2011-06-30 Prosensa Technologies B.V. Molecule for treating an inflammatory disorder

Family Cites Families (266)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US1861608A (en) 1929-12-21 1932-06-07 Emerson Electric Mfg Co Fan and means for directing the air current therethrough
US1861108A (en) 1930-01-24 1932-05-31 Eugene O Brace Integral clutch and transmission control
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3974808A (en) 1975-07-02 1976-08-17 Ford Motor Company Air intake duct assembly
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4708708A (en) 1982-12-06 1987-11-24 International Paper Company Method and apparatus for skiving and hemming
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
FR2623508B1 (fr) 1987-11-20 1990-04-20 Commissariat Energie Atomique Proteine basique denommee phospholipase a2 isolee de venin de serpent de la famille des elapides et sa sequence en amino-acides, derives et fragments de ladite proteine, leur procede d'obtention, compositions therapeutiques et agents de diagnostic contenant ladite proteine et/ou ses derives et/ou ses fragments
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5032401A (en) 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
NL8901881A (nl) 1989-07-20 1991-02-18 Rockwool Grodan Bv Drainagekoppelelement.
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
WO1991006556A1 (en) 1989-10-24 1991-05-16 Gilead Sciences, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
ATE154246T1 (de) 1990-07-27 1997-06-15 Isis Pharmaceuticals Inc Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
HU217036B (hu) 1990-08-03 1999-11-29 Sanofi Eljárás génexpresszió gátlására alkalmas vegyületek előállítására
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
DE69233087T2 (de) 1991-11-22 2003-12-24 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Verfahren zur Herstellung von Polymerarrays
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
EP0618925B2 (en) 1991-12-24 2012-04-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
CA2135313A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Theodore Choi Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
AU680459B2 (en) 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
CA2156289C (en) 1993-02-19 2006-01-03 Junichi Yano Drug composition containing nucleic acid copolymer
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
AU678085B2 (en) 1993-11-16 1997-05-15 Genta Incorporated Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
JP3269301B2 (ja) 1994-12-28 2002-03-25 豊田合成株式会社 ガラスラン用ゴム配合物
WO1996027606A1 (en) 1995-03-06 1996-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
JPH11508231A (ja) 1995-05-26 1999-07-21 ソマティックス セラピー コーポレイション 安定な脂質／核酸複合体を含む送達ビヒクル
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
ATE285477T1 (de) 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
AU7435296A (en) 1995-10-16 1997-05-07 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6287591B1 (en) 1997-05-14 2001-09-11 Inex Pharmaceuticals Corp. Charged therapeutic agents encapsulated in lipid particles containing four lipid components
CA2294988C (en) 1997-07-01 2015-11-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
PL341762A1 (en) 1997-12-24 2001-05-07 Vertex Pharma Precursors of aspartil protease inhibitors
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
DE69906977T2 (de) 1998-07-20 2004-05-19 Protiva Biotherapeutics Inc., Burnaby In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
AU6298899A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
BR9914772A (pt) 1998-10-09 2001-12-11 Ingene Inc Conjunto de elementos genéticos, vetor, célulahospedeira, conjunto para a produção de umasequência de ácido nucléico, método para aprodução in vivo ou in vitro de uma sequência deácido nucléico, transcrição de cdna, molécula deácido nucléico inibidor, transcrição de mrna,molécula heteroduplex e composiçãofarmacêutica
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
TWI260322B (en) 1999-02-12 2006-08-21 Vertex Pharma Inhibitors of aspartyl protease
AU3243300A (en) 1999-02-23 2000-09-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
PT1178999E (pt) 1999-05-04 2007-06-26 Santaris Pharma As Análogos de l-ribo-lna
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
AU2001227965A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'-p5'phosphoramidates: their synthesis and use
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
WO2002028875A2 (en) 2000-10-04 2002-04-11 Cureon A/S Improved synthesis of purine locked nucleic acid analogues
AU2002323151A1 (en) 2001-08-13 2003-03-03 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
AU2003254334A1 (en) 2002-07-10 2004-02-02 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Rna-interference by single-stranded rna molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
JP2006507841A (ja) 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
ATE555118T1 (de) 2003-08-28 2012-05-15 Takeshi Imanishi Neue synthetische nukleidsäuren vom typ mit quervernetzter n-o-bindung
US7858769B2 (en) 2004-02-10 2010-12-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional siNA)
US7919094B2 (en) 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
ES2381201T3 (es) 2005-03-31 2012-05-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos
WO2006126040A1 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Rosetta Genomics Ltd. Bacterial and bacterial associated mirnas and uses thereof
JP5342881B2 (ja) 2006-01-27 2013-11-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ６−修飾された二環式核酸類似体
WO2007091269A2 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
ES2527695T3 (es) 2006-03-08 2015-01-28 Archemix Llc Aptámeros de unión a complemento y agentes anti-C5 útiles en el tratamiento de trastornos oculares
CN101460178B (zh) 2006-04-07 2016-12-07 艾德拉药物股份有限公司 用于tlr7和tlr8的稳定化的免疫调节性rna(simra)化合物
AU2007303205A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
DK2410054T4 (da) * 2006-10-18 2020-02-10 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisenseforbindelser
CN101657097A (zh) * 2007-03-01 2010-02-24 先进视觉疗法公司 以炎症为特征的疾病的治疗
CA2680760A1 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Novartis Ag C5 antigens and uses thereof
AU2008279509B2 (en) 2007-07-09 2011-07-21 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
JP2011511004A (ja) * 2008-01-31 2011-04-07 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを送達するための最適化された方法
US8940299B2 (en) * 2008-02-28 2015-01-27 Case Western Reserve University Method of treating cancer
US20110182910A1 (en) * 2008-03-06 2011-07-28 Medof M Edward Method of treating t cell mediated disorders
CN102119217B (zh) 2008-04-15 2015-06-03 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
NZ591391A (en) * 2008-10-22 2012-10-26 Quark Pharmaceuticals Inc Non-invasive methods for treating eye disorders using a topical oligonucleotide composition
PT2894165T (pt) 2008-11-10 2023-03-17 Alexion Pharma Inc Métodos e composições para o tratamento de distúrbios associados ao complemento
EP2438168B1 (en) 2009-06-01 2020-02-12 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
TR201811076T4 (tr) 2009-06-10 2018-08-27 Arbutus Biopharma Corp Geliştirilmiş lipit formulasyonu.
RU2012102021A (ru) 2009-06-23 2013-07-27 Алексион Фармасьютикалз, Инк. Биспецифические антитела, которые связываются с белками комплемента
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
WO2011031520A1 (en) 2009-08-27 2011-03-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
US9290736B2 (en) * 2009-11-04 2016-03-22 Case Western Reserve University Compositions and methods of treating T cell mediated disorder
MX2012010116A (es) 2010-03-01 2013-02-26 Alexion Pharma Inc Metodos y composiciones para el tratamiento de la enfermedad de degos.
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
KR102095699B1 (ko) * 2011-11-18 2020-04-02 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
CN104105790A (zh) * 2011-11-18 2014-10-15 阿尔尼拉姆医药品有限公司 修饰的RNAi试剂
EP2850187A4 (en) 2012-05-16 2016-01-20 Rana Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR PTEN EXPRESSION MODULATION
SI2970974T1 (sl) * 2013-03-14 2017-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Komplementarna komponenta C5 sestavkov IRNA in postopki njene uporabe
ES2768648T3 (es) 2013-03-29 2020-06-23 Alexion Pharma Inc Composiciones y métodos para aumentar la semivida en suero de un agente terapéutico dirigido a C5 del complemento
WO2016040589A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
EP3194596A1 (en) 2014-09-16 2017-07-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
EP3307316A1 (en) 2015-06-12 2018-04-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
WO2017214518A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLETMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSTIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
WO2020060987A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1752536A1 (en) * 2004-05-11 2007-02-14 RNAi Co., Ltd. Polynucleotide causing rna interfere and method of regulating gene expression with the use of the same
US20110015252A1 (en) * 2009-06-15 2011-01-20 Kevin Fitzgerald Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2011078672A1 (en) * 2009-12-24 2011-06-30 Prosensa Technologies B.V. Molecule for treating an inflammatory disorder

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11492620B2 (en) 2017-12-01 2022-11-08 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof
US11660347B2 (en) 2017-12-01 2023-05-30 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate containing same, preparation method, and use thereof
US11633482B2 (en) 2017-12-29 2023-04-25 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
US11918600B2 (en) 2018-08-21 2024-03-05 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate containing nucleic acid, and use thereof
US11896674B2 (en) 2018-09-30 2024-02-13 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof
WO2020238763A1 (zh) * 2019-05-24 2020-12-03 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
EP3978029A4 (en) * 2019-05-24 2023-07-19 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND CONJUGATE, METHOD OF MANUFACTURE AND USE
CN114981430A (zh) * 2019-08-27 2022-08-30 赛伦斯治疗有限责任公司 用于抑制细胞中的c3表达的核酸
CN111134115A (zh) * 2019-12-24 2020-05-12 东华大学 一种农药保持剂及其制备方法
CN114867484A (zh) * 2019-12-26 2022-08-05 卫材R&D管理有限公司 含有抑制补体c5的表达的双链核糖核酸的药物组合物
WO2023088455A1 (zh) * 2021-11-22 2023-05-25 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
WO2024008158A1 (zh) * 2022-07-07 2024-01-11 北京福元医药股份有限公司 用于抑制c5基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途

Also Published As

Publication number Publication date
CL2015002710A1 (es) 2016-04-22
ME03043B (me) 2018-10-20
TWI808369B (zh) 2023-07-11
CL2017002014A1 (es) 2018-04-27
WO2014160129A3 (en) 2014-12-04
US20160244763A1 (en) 2016-08-25
GT201500293A (es) 2018-12-18
CL2016000882A1 (es) 2016-12-09
MX2015012796A (es) 2016-02-03
LT2970974T (lt) 2017-12-11
UY35442A (es) 2014-10-31
CN114015692A (zh) 2022-02-08
CN105324485B (zh) 2021-11-23
UY40039A (es) 2023-01-31
SG10201912286TA (en) 2020-02-27
BR112015022876A2 (pt) 2017-11-07
US20200032259A1 (en) 2020-01-30
HK1221484A1 (zh) 2017-06-02
US20220090068A1 (en) 2022-03-24
JP6524060B2 (ja) 2019-06-05
SI2970974T1 (sl) 2017-12-29
JP2016518331A (ja) 2016-06-23
IL265594A (en) 2019-05-30
EP2970974B1 (en) 2017-08-23
KR20210034124A (ko) 2021-03-29
AU2020204161A1 (en) 2020-07-09
IL288931A (en) 2022-02-01
RS56663B1 (sr) 2018-03-30
JP2019142944A (ja) 2019-08-29
CA2904654C (en) 2023-12-05
TWI745684B (zh) 2021-11-11
US11873491B2 (en) 2024-01-16
AU2014244116A1 (en) 2015-10-01
HK1252501A1 (zh) 2019-05-31
TW202325847A (zh) 2023-07-01
US9850488B2 (en) 2017-12-26
KR102342916B1 (ko) 2021-12-24
ES2649490T3 (es) 2018-01-12
PE20211393A1 (es) 2021-07-27
KR102605775B1 (ko) 2023-11-29
DOP2015000234A (es) 2015-12-31
JP2021176868A (ja) 2021-11-11
KR20150127243A (ko) 2015-11-16
EP3312281A2 (en) 2018-04-25
US20150247143A1 (en) 2015-09-03
PT2970974T (pt) 2017-11-29
KR20210156330A (ko) 2021-12-24
AU2014244116B2 (en) 2020-03-26
IL265594B (en) 2022-01-01
AU2023200132A1 (en) 2023-04-13
US11162098B2 (en) 2021-11-02
CA3216595A1 (en) 2014-10-02
PE20160046A1 (es) 2016-02-14
TW202118875A (zh) 2021-05-16
PL2970974T3 (pl) 2018-01-31
JP7404308B2 (ja) 2023-12-25
SG10201700239UA (en) 2017-02-27
JP2024037871A (ja) 2024-03-19
TW201932597A (zh) 2019-08-16
KR20230162998A (ko) 2023-11-29
US20160108401A1 (en) 2016-04-21
MX2019008380A (es) 2019-09-09
NZ712336A (en) 2020-03-27
US9701963B2 (en) 2017-07-11
NZ751385A (en) 2021-05-28
AU2020204161B2 (en) 2022-10-13
EP2970974A2 (en) 2016-01-20
CA2904654A1 (en) 2014-10-02
US20170268005A1 (en) 2017-09-21
HRP20171813T1 (hr) 2017-12-29
DK2970974T3 (en) 2017-12-04
AU2014244116B9 (en) 2020-08-13
TWI660731B (zh) 2019-06-01
BR112015022876B1 (pt) 2022-03-15
EP3312281A3 (en) 2018-06-27
EA201591707A1 (ru) 2016-03-31
CL2019000107A1 (es) 2020-04-03
SG11201507400SA (en) 2015-10-29
TW201505637A (zh) 2015-02-16
CY1120289T1 (el) 2019-07-10
CR20150493A (es) 2016-03-28
US9249415B2 (en) 2016-02-02
MX366660B (es) 2019-07-18
HUE034987T2 (en) 2018-05-02
WO2014160129A2 (en) 2014-10-02
JP6914292B2 (ja) 2021-08-04
KR102234620B1 (ko) 2021-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6914292B2 (ja) 補体成分Ｃ５ ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
JP7057390B2 (ja) 補体成分ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
US20210177884A1 (en) COMPLEMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US20240175017A1 (en) Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
CN105408481A (zh) SERPINA1 iRNA组合物及其使用方法
JP2022050510A (ja) 補体成分Ｃ５ｉＲＮＡ組成物及び発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）を処置するためのその使用方法
EA044245B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ иРНК КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА C5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EA045602B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA К КОМПОНЕНТУ КОМПЛЕМЕНТА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1221484

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant