MX2012010116A

MX2012010116A - Metodos y composiciones para el tratamiento de la enfermedad de degos.

Info

Publication number: MX2012010116A
Application number: MX2012010116A
Authority: MX
Inventors: Cynthia Magro
Original assignee: Alexion Pharma Inc
Priority date: 2010-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2013-02-26
Also published as: US20150174243A1; RU2015145543A; US8999340B2; EP2542255A1; CN102985106A; NZ602219A; JP2016026217A; AU2011223866B2; KR20130009784A; CA2791962A1; ES2615732T3; JP5852021B2; SG183541A1; WO2011109338A1; JP2013521294A; RU2570390C2; AU2011223866A1; JP2016026216A; EP2542255A4; US20130064820A1

Abstract

La presente descripción se refiere, entre otras cosas, a composiciones que contienen un inhibidor de complemento humano y/o un inhibidor de interferón alfa, y al uso de las composiciones en métodos para tratar o prevenir la enfermedad de Degos o papulosis atrófica maligna en un sujeto. En algunas modalidades, el inhibidor es un anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, que se une a una proteína del componente C5 de complemento humano o a un fragmento biológicamente activo de C5, tal como C5a o C5b. En algunas modalidades, el inhibidor es un anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, que se une a interferón alfa o a un receptor de interferón alfa.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD DE PEGOS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama la prioridad y el beneficio de la solicitud de patente provisional Norteamericana serie No. 61/309,393, presentada el 1 de marzo del 2010, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Listado de Secuencias La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que ha sido presentado mediante EFS-Web y está incorporado en su totalidad en la presente invención como referencia. La copia ASCII creada el 25 de febrero del 2011, tiene el nombre de ALXN153.txt, y tiene 61,625 bytes de tamaño.

Campo de la Invención El campo de la presente invención es medicina, inmunología, biología molecular y química de proteína.

Antecedentes de la Invención La enfermedad de Degos (también conocida como enfermedad de Kohlmeier y papulosis atrófica maligna (MAP)), es una vasculopatía rara (alrededor de 200 casos reportados) caracterizada por trombosis en vasos de pequeños a grandes. Ver por ejemplo las Publicaciones de Lester y Rapini (2009) Curr Opin Gastroenterol 25_:66-73 y Englert y asociados, (1984) Br Med J 289:576. Aunque considerada generalmente de etiología desconocida, la enfermedad de Degos ha estado asociada con infecciones virales (por ejemplo, parvovirus B19 y HIV) y trastornos autoinmune tales como lupus eritematoso (LE), dermatomiositis, y síndrome antifosfolípido primario (APS). Ver por ejemplo, las Publicaciones de Crowson y asociados, (2002) J Cutan Patol 29:596-601; Englert y asociados, (1984), supra; Heymann (2009) J Am Acad Dermatol 6J_:505-506; Durie y asociados, (1969) Arch Dermatol 100(5 :575-581; Tsao y asociados, (1997) J Am Acad Dermatol 36:317-319; y Requena y asociados, (1998) J Am Acad Dermatol 3_8:852-856. Algunas formas de la enfermedad de Degos pueden ser familiares. Ver por ejemplo, las Publicaciones de Katz y asociados, (1997) J Am Acad Dermatol 37:480-484 y Penault y asociados, (2004) Ann Dermatol Venereol 1_3J_: 989-993. Degos puede ocurrir en pacientes de cualquier edad, aunque parece que afecta preferentemente a hombres que ha mujeres, en una proporción de aproximadamente 3 a 1. Ver por ejemplo, las Publicaciones de Katz y asociados, (1997), supra; Tórrelo y asociados, (2002) Br J Dermatol 146:916-918: y Wilson y asociados, (2007) Pediatr Dermatol 24(1 ): 18-24.

Degos puede manifestarse como una forma puramente cutánea, benigna o como una forma sistémica, multi órganos, agresiva, ésta última generalmente fatal después de 11 a 12 años de diagnóstico. Scheinfeld (2007) Clin Exp Derm 32:483-487. La característica fenotípica de la enfermedad de Degos cutánea, es la aparición de uno o más pápulos eritomatosos color rojizos en la piel, en donde los pápulos cicatrizan con centros atrofíeos color blanco.

Las muertes ocurren en casi todos los pacientes con la forma sistémica de enfermedad de Degos, teniendo los pacientes una expectativa de vida promedio después de la implicación sistémica, de aproximadamente dos a tres años. Scheinfeld (2007), supra. Los pacientes generalmente mueren de perforación intestinal con o sin complicaciones sépticas. Sin embargo, la muerte puede ser un resultado alternativa de infarto intestinal, colapso cardiopulmonar y/o infarto neurológico y hemorragia. Id. Ver también la publicación de High y asociados, (2004) J Am Acad Dermatol 50(61:895-899.

No se ha definido un tratamiento médico estándar para la enfermedad de Degos. Muchos agentes terapéuticos únicamente tienen éxito marginal y/o en consistente para tratar la enfermedad. Ver por ejemplo la Publicación de Scheinfeld (2007), supra. Por ejemplo, algunos pacientes con Degos se benefician de la terapia de inmunoglobulina intravenosa, pero actualmente parece no haber forma de anticipar cuales pacientes pueden responder a dicha terapia, ver por ejemplo las Publicaciones de Dyrsen y asociados, (2008) J Cutan Patol 35(SUPDI 1 V.20-25: Zhu y asociados, (2007) Br J Dermatol 1_57£1:206-207; y De Breucker y asociados, (2008) Acta Clin Belg 63(21:99-102 (Síntesis).

En virtud de lo anterior, queda claro que existe la necesidad de nuevas metodologías y mejores métodos para tratar a pacientes con enfermedad de Degos.

Breve Descripción de la Invención La presente descripción está basada, al menos en parte, en el descubrimiento por parte del inventor, de que un inhibidor de complemento, es decir el anticuerpo anti-C5 humanizado eculizumab, fue altamente eficaz en el tratamiento de un paciente que padece de la forma sistémica de enfermedad de Degos. Por consiguiente, la descripción presenta una variedad de composiciones y métodos útiles para la prevención y tratamiento de la enfermedad de Degos.

En un aspecto, la presente descripción proporciona un método para tratar a un paciente que padece de enfermedad de Degos, en donde el método comprende administrar al paciente que padece de enfermedad de Degos, un inhibidor de complemento en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad .

En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un paciente que padece de enfermedad de Degos, en donde el método incluye administrar en forma crónica a un paciente que padece de enfermedad de Degos, un inhibidor de complemento en una cantidad y con una frecuencia suficiente para mantener un nivel reducido de actividad de complemento en el paciente, para tratar de esta forma la enfermedad.

En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar enfermedad de Degos, en donde el método comprende: identificar a un paciente que padece, o probablemente padecerá enfermedad de Degos; y administrar al paciente un inhibidor de complemento en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad.

En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar o prevenir (por ejemplo, prevenir el surgimiento de la enfermedad de Degos o prevenir el progreso de la forma cutánea benigna de la enfermedad de Degos a una forma más avanzada de órganos múltiples y/o sistémica de la enfermedad). El método incluye administrar a un paciente que necesita del mismo, un inhibidor de complemento en una cantidad suficiente para tratar o prevenir la enfermedad. En algunas modalidades, el inhibidor puede ser administrado en forma crónica en una cantidad y con una frecuencia para mantener un nivel reducido de activación de complemento en la sangre del paciente durante la duración del tratamiento.

En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, la enfermedad de Degos está asociada con una infección parvoviral B19 o con infección de virus de inmunodeficiencia humana. En algunas modalidades, la enfermedad de Degos es idiopática.

En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, la enfermedad de Degos afecta patológicamente a uno o más del tracto gastrointestinal, el sistema nervioso central, y el sistema cardiovascular. En algunas modalidades, la enfermedad de Degos es una enfermedad de Degos sistémica, de órganos múltiples. En algunas modalidades, la enfermedad de Degos es una forma cutánea de la enfermedad.

En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, la enfermedad de Degos es refractaria para al menos una terapia seleccionada del grupo que consiste en un agente anti-inflamatorio, un anticoagulante, un antitrombótico, y una inmunoglobulina intravenosa. El fármaco anti-inflamatorio puede ser, por ejemplo, uno seleccionado del grupo que consiste en corticoesteroides, fenilbutazona, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, tacrolimus, y mofetil de micofenolato. El anticoagulante o antitrombótico puede ser, por ejemplo, uno seleccionado del grupo que consiste en clopidogrel, aspirina, y dipiridamol.

En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el inhibidor de complemento puede ser, por ejemplo, uno seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido, un análogo de polipéptido, un ácido nucleico, un análogo de ácido nucleico, y una molécula pequeña. En algunas modalidades, el inhibidor de complemento puede ser, por ejemplo, uno seleccionado del grupo que consiste en CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59 soluble, Factor H, factor de veneno de cobra, FUT-175, complestatin, y K76 COOH.

En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el inhibidor de complemento inhibe la expresión de una proteína de componente de complemento humano. En algunas modalidades, el inhibidor de complemento puede inhibir la actividad de una proteína de complemento tal como, pero sin limitarse a, el componente de complemento C1s, el componente de complemento C1r, la convertasa C3, la convertasa C5, o C5b-9.

En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el inhibidor de complemento inhibe la disociación del componente de complemento humano C5, C4, C3, o C2. Por ejemplo, un inhibidor de complemento puede inhibir la disociación del componente de complemento C5, en los fragmentos C5a y C5b.

En algunas modalidades, el inhibidor de complemento es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a una proteína de componente de complemento humano (por ejemplo, una proteína C5). En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígenos del mismo enlaza a la cadena alfa de la proteína C5. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento de enlace de antígeno del mismo, enlaza a la cadena beta de C5. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a la cadena alfa del componente de complemento humano C5, y en donde el anticuerpo (i) inhibe la activación de complemento en un fluido corporal humano, (ii) inhibe el enlace del componente de complemento humano purificado C5 ya sea a un componente de complemento humano C3b o un componente de complemento humano C4b, y (iii) no enlaza al producto de activación de complemento humano libre C5a. En algunas modalidades, el anticuerpo enlaza a la proteína del componente de complemento humano C5, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-26. En algunas modalidades, el inhibidor es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza al componente de complemento C5, el fragmento C5b.

En algunas modalidades, el anticuerpo puede ser el anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento de enlace de antígeno del mismo puede ser uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo humanizado, un anticuerpo recombinante, un diacuerpo, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humano desinmunizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.

En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el inhibidor de complemento es eculizumab o pexelizumab.

Aún en otro aspecto, la descripción presenta un artículo de fabricación que contiene: un contenedor que comprende una etiqueta; y una composición que comprende un inhibidor de complemento, en donde la etiqueta indica que la composición será administrada a un humano que tiene, se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Degos. El inhibidor puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a una proteína del componente de complemento humano C5. El inhibidor puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un fragmento de la proteína del componente de complemento humano C5 tal como C5a o C5b.

En algunas modalidades, el artículo de fabricación incluye uno o más agentes activos adicionales, tales como pero sin limitarse, a uno o más agentes anti-inflamatorios, anticoagulantes, o agentes antitrombóticos.

El inventor también descubrió que el paciente con Degos aquí descrito, tenía elevados niveles de interferón alfa en suero, así como dentro del tejido de piel de biopsia. Sin pretender limitarse a teoría o mecanismo de acción en particular, ya que el interferón alfa activa la inmunidad adaptiva e innata, potenciando los efectos de cualquier disparador antigénico, y la administración de interferón alfa exógena ha sido reportada como una causa de trombosis y ulceración cutánea, el inventor considera que la inhibición de interferón alfa es una estrategia útil para tratar la enfermedad de Degos.

Por consiguiente en otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar un paciente que padece de enfermedad de Degos, en donde el método comprende administrar a un paciente que padece de enfermedad de Degos, un inhibidor de interferón alfa en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad .

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar un paciente que padece de enfermedad de Degos, en donde el método comprende administrar en forma crónica a un paciente que padece de enfermedad de Degos un inhibidor de interferón alfa en una cantidad y con una frecuencia suficiente para mantener un nivel reducido de la actividad de interferón alfa en el paciente, para tratar de esta manera la enfermedad.

En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar enfermedad de Degos, en donde el método incluye: identificar un paciente como padeciendo, o que padecerá enfermedad de Degos; y administrar al paciente un inhibidor de interferón alfa en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar o prevenir (por ejemplo, prevenir el surgimiento de la enfermedad de Degos o prevenir el progreso de la forma cutánea, benigna de la enfermedad de Degos a una forma avanzada, de órganos múltiples y/o sistémica de la enfermedad). El método incluye administrar a un paciente que necesita del mismo, un inhibidor de interferón alfa en una cantidad suficiente para tratar o prevenir la enfermedad. En algunas modalidades, el inhibidor puede ser administrado en forma crónica en una cantidad, y con una frecuencia para mantener un nivel reducido de expresión o actividad de interferón alfa en la sangre del paciente, durante la duración del tratamiento.

En algunas modalidades, el inhibidor de interferón alfa puede ser, por ejemplo, uno seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido, un análogo de polipéptido, un ácido nucleico, un análogo de ácido nucleico, y una molécula pequeña. El inhibidor, puede inhibir por ejemplo la expresión de interferón alfa o un receptor de interferón alfa a través de una célula. El inhibidor puede, por ejemplo, inhibir la actividad de interferón alfa o una proteína receptora de interferón alfa.

En algunas modalidades, el inhibidor de interferón alfa enlaza a interferón alfa. En algunas modalidades, el inhibidor de interferón alfa enlaza a un receptor de interferón alfa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el inhibidor de interferón alfa es un anticuerpo (o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) que enlaza a interferón alfa o a un receptor de interferón alfa. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede ser, por ejemplo, uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo humanizado, un anticuerpo recombinante, un diacuerpo, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humano desinmunizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.

Aún en otro aspecto, la presente descripción presenta un artículo de fabricación que contiene: un contenedor que comprende una etiqueta; y una composición que comprende un inhibidor de interferón alfa, en donde la etiqueta indica que la composición será administrada a un humano que tiene, se sospecha tiene que está en riesgo de desarrollar enfermedad de Degos. El inhibidor de interferón alfa puede ser, por ejemplo, un inhibidor de interferón alfa aquí descrito, tal como un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a interferón alfa o a un receptor de interferón.

En algunas modalidades, el artículo de fabricación incluye uno o más agentes activos adicionales tales como, pero sin limitarse a un agente anti-inflamatorio, un anticoagulante, o un agente antitrombótico.

En algunas modalidades, los métodos aquí descritos pueden incluir administración (ya sea como un agente simple o en combinación con un inhibidor de complemento y/o un inhibidor de interferón alfa) de una terapia dirigida por célula. Por ejemplo, la descripción presenta un método para tratar o prevenir enfermedad de Degos, en donde el método comprende administrar a un paciente que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Degos, una cantidad terapéuticamente efectiva de una terapia dirigida mediante célula B. La terapia dirigida mediante célula B puede ser, por ejemplo, un agente de enlace anti-CD20 tal como, pero sin limitarse a, anticuerpos anti-CD20. Los anticuerpos anti-CD20 terapéuticos, por ejemplo es aprobado para uso clínico o están en desarrollo clínicos que se pueden utilizar en los métodos aquí descritos incluyen sin limitación, rituximab (Biogen Idee), tiuxetan de 90Y-ibritumomab (Biogen Idee), 131l-tositumomab (Glaxo SmitKline), ofatumumab (Genmab), TRU-015 (Trubion), veltuzumab (IMMU-106; Immunomedics), ocrelizumab (Roche), y A E-133v (Applied Molecular Evolution). Ver por ejemplo las Publicaciones de Levene y asociados, (2005), supra; Burge y asociados, (2008,) Clin Ther 30(10): 1806-1816; Kausar y asociados, (2009) Expert Opin Biol Ther 9X11:889-895; Morschhauser y asociados, (2009) J Clin Oncol 27(20):3346-3353; y Milani y Castillo (2009) Curr Opin Mol Ther 11 (2):200-207.

En otro ejemplo, en cualesquiera de los métodos aquí descritos, por ejemplo los métodos en los cuales se administra un inhibidor de complemento y/o un inhibidor de interferón alfa a un paciente con enfermedad de Degos, dichos métodos también pueden incluir administrar una terapia dirigida mediante célula B tal como un anticuerpo anti-CD20.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable y significan cualquier cadena de aminoácidos enlazada por péptido, sin importar la longitud o modificación post-traducción. Las proteínas del componente del complemento aquí descritas (por ejemplo, las proteínas del componente de complemento C2, C3, C4, o C5) pueden contener o ser proteínas tipo natural o pueden ser variantes que no tienen más de 50 (por ejemplo, no más de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 50) sustituciones de aminoácido conservadoras. Las sustituciones conservadoras normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina, y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina, y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina.

Las proteínas del componente de complemento humano aquí descritas, también incluyen "fragmentos de péptido antigénico" de las proteínas, las cuales son más cortas que las proteínas de longitud total, inmaduras (pre-pro), pero retienen al menos el 10% (por ejemplo, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, ai menos 98%, al menos 99%, al menos 99.5%, o 100% o más) de la capacidad de la proteína de longitud total para inducir una respuesta antigénica en un mamífero. Por ejemplo, un fragmento de péptido antigénico de la proteína C5, puede ser cualquier fragmento de la proteína, que sea menor a la proteína inmadura de longitud total, y retenga al menos el 10% de la capacidad de la proteína de longitud total para inducir una respuesta antigénica en un mamífero. Los fragmentos de péptido antigénico de una proteína de componente de complemento, incluyen variantes de eliminación terminal, así como interna de la proteína. Las variantes de eliminación pueden carecer de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segmentos de aminoácido (de dos o más aminoácidos) o aminoácidos simples no contiguos. Los fragmentos de péptido antigénico pueden tener al menos 6 (por ejemplo, al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, o 600 o más) residuos de aminoácido en longitud (por ejemplo, al menos 6 residuos de aminoácido contiguos en cualesquiera de SEC ID NOS: 1-11).

En algunas modalidades, un fragmento de péptido antigénico de una proteína de componente de complemento humano tiene menos de 500 (por ejemplo, menos de 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, o 7) residuos de aminoácido de longitud (por ejemplo, menos de 500 residuos de aminoácido contiguos en cualesquiera de SEC ID NOs: 1-11). En algunas modalidades, el fragmento de péptido antigénico de una proteína de componente de complemento de longitud total, humano y maduro (proteína prepro-C5) tiene al menos 6, aunque menos de 500, residuos de aminoácidos de longitud.

En algunas modalidades, la proteína de componente de complemento humano C5 puede tener una secuencia de aminoácido que es, o es más del 70 (por ejemplo, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100) % idéntica a la proteína humana C5 que tiene la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEC ID NO:1.

El porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácido se define como el porcentaje de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los aminoácidos en una secuencia de referencia, después de alinear la secuencias e introducir aberturas, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia, se puede lograr en diversas formas que están dentro de las habilidades en la técnica, por ejemplo, utilizando el software de computadora públicamente disponible tal como el software tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR).

Los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr una máxima alineación con respecto a la longitud total de las secuencias que están siendo comparadas, pueden ser determinados a través de métodos conocidos.

Las secuencias de aminoácido para las proteínas C5 humanas de ejemplo, así como fragmentos de anticuerpo de los mismos, son conocidas en la técnica y se establecen más adelante.

Tal como se utiliza a lo largo de la presente descripción, el término anticuerpo, se refiere a una molécula de anticuerpo completa o intacta (por ejemplo, IgM, IgG, IgA, IgD, o IgE) que es generada a través de cualquiera de variedad de métodos que son conocidos en la técnica, y se describen en la presente invención. El término "anticuerpo" incluye un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano desinmunizado, y un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo puede ser elaborado en, o derivarse de cualquiera de una variedad de especies, por ejemplo, mamíferos tales como humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, bambús y chimpancés), caballos, ganado, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, conejos, cerdos de guinea, gerbos, hámster, ratas, y ratones. El anticuerpo puede ser un anticuerpo purificado o recombinante.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "fragmento de anticuerpo", "fragmento de enlace de antígeno" o términos similares, se refieren a un fragmento de anticuerpo que retiene la capacidad de enlazar a un antígeno (por ejemplo, una proteína de componente de complemento C5 proteína), por ejemplo, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento Fv de cadena simple (scFv), un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', o un fragmento F(ab')2. Un fragmento scFv es una cadena de polipéptido simple que incluye tanto las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo del cual se deriva. Además, los diacuerpos (Poljak (1994) Structure 2(12): 1121-1123; Hudson y asociados, (1999) J Immunol Metods 23(1-2): 177-189, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia) e intracuerpos (Huston y asociados, (2001) Hum. Antibodies 10(3-ü: 127-142; Wheeler y asociados, (2003) Mol Ther 8(3):355-366; Stocks (2004) Drug Discov Today 9(22): 960-966, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia) que enlazan a la proteína de componente de complemento (por ejemplo, el componente de complemento C5) se pueden incorporar en las composiciones, y utilizarse en los métodos, aquí descritos.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos, técnicos y científicos aquí utilizados tienen los mismos significados a los comúnmente comprendidos por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente descripción. En caso de conflicto, el presente documento, incluyendo las definiciones, tomarán el control. Los métodos y materiales preferidos se describen más adelante, aunque los métodos, y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, también pueden ser utilizados en la práctica o en las pruebas de los métodos y composiciones aquí descritos.

Todas las publicaciones, solicitudes de patente, referencias aquí mencionadas, están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Otras características y ventajas de la presente invención, por ejemplo, métodos para tratar o prevenir la enfermedad de Degos, podrán ser apreciadas a partir de la siguiente descripción, los ejemplos y las reivindicaciones.

Descripción Detallada de la Invención La presente descripción proporciona composiciones que contienen un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo que enlaza a una proteína de componente de complemento humano C5) y métodos para utilizar las composiciones para tratar o prevenir enfermedad de Degos. Sin pretender limitarse en forma alguna, las composiciones de ejemplo (por ejemplo, composiciones y formulaciones farmacéuticas) y los métodos para utilizar las composiciones, se elaboran más adelante y se ejemplifican en los Ejemplos de operación.

La Trayectoria de Complemento El sistema de complemento, actúa junto con otros sistemas inmunológicos del cuerpo, para defender contra intrusión de patógenos celulares y virales. Existen al menos 25 proteínas de complemento, las cuales se encuentran como una recolección compleja de proteínas de plasma y cofactores de membrana. Las proteínas de plasma abarcan hasta el 10% de las globulinas en suero de vertebrados. Los componentes de complemento, logran sus funciones de defensa inmunes, ¡nteractuando en series de eventos de disociación enzimática y enlace de membrana intricados pero precisos. La cascada de complemento resultante, conduce a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunoreguladoras y líticas. Por ejemplo, en la publicación El Manual de Merck (The Merck Manual), Edición 16, se proporciona una síntesis concisa de actividades biológicas asociadas con activación de complemento.

La cascada de complemento, progresa a través de la trayectoria clásica, la trayectoria alternativa o la trayectoria de lectina. Estas trayectorias comparten muchos componentes, y aunque difieren en sus pasos iniciales, convergen y comparten los mismos componentes de "complemento terminal" (C5 a C9), responsables de la activación y destrucción de células objetivo.

La trayectoria de complemento clásica, normalmente es iniciada mediante reconocimiento de anticuerpo de, y enlace a, un sitio antigénico en una célula objetivo. La trayectoria alternativa puede ser independiente de anticuerpo, y puede ser iniciada por ciertas moléculas en las superficies de patógeno. Además, la trayectoria de lectina normalmente es iniciada con enlace de lectina que enlaza a mannosa (MBL) a sustratos de mannosa de alto nivel. Estas trayectorias convergen en el punto en donde el componente de complemento C3 es disociado por una proteasa activa (la cual difiere en cada trayectoria) para producir C3a y C3b. Otras trayectorias que activan el ataque de complemento, pueden actuar posteriormente en la secuencia de eventos que conducen a varios aspectos de la función del complemento.

C3a es una anafilatoxina. C3a enlace a células bacteriana y a otras, así como a ciertos virus y complejos inmune, y las etiqueta para la eliminación de la circulación (C3b en este papel es conocida como opsonina). La función opsónica de C3b, se considera generalmente como la acción anti-infecciosa más importante del sistema de complemento. Los pacientes con lesiones genéticas que bloquean la función de C3b, están propensos a infecciones por una amplia variedad de organismos patógenos, mientras que los pacientes con lesiones posteriores en la secuencia de la casacada de complemento, es decir pacientes con lesiones que bloquean las funciones de C5, estarán más propensos únicamente a infección por Neisseria , y por lo tanto, únicamente un poco más propensos.

C3b también forma un complejo con otros componentes únicos para cada trayectoria para formar una convertasa C5 clásica o alternativa, que disocia C5 en C5a y C5b. Por lo tanto se considera C3 como la proteína central en la secuencia de reacción de complemento, ya que es esencial para las trayectorias tanto alternativas como clásicas. Esta propiedad de C3b es regulada por el Factor I de proteasa de suero, que actúa en C3b para producir iC3b. Aunque aún funcional como opsonin, iC3b no puede formar una C5 convertasa activa.

C5 es una beta globulina de 190 kDa encontrada en suero normal en una concentración de aproximadamente 75 pg/mL (0.4 µ?). C5 es glucosilada con aproximadamente 1.5 a 3 por ciento de su masa atribuida a carbohidrato. C5 madura es un heterodímero de una cadena alfa de 115 kDa de 999 aminoácidos que es enlazada por disulfuro a una cadena beta de 75 kDa de 655 aminoácidos. C5 se sintetiza como un producto de proteína precursora de cadena simple de un gen de una sola copia (Haviland y asociados, (1991) J Immunol 146:362-368). La secuencia de cDNA de la transcripción de este gen, anticipa un precursor pro-C5 secretado con 1658 aminoácidos junto con una secuencia líder de 18 aminoácidos ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6,355,245).

El precursor pro-C5 está disociado después de los aminoácidos 655 y 659, para producir la cadena beta como un fragmento terminal amino (residuos aminoácidos +1 a 655 de la secuencia anterior) y la cadena alfa como un fragmento de terminal carboxilo (los residuos de aminoácido 660 a 1658 de la secuencia anterior), con cuatro aminoácidos (los residuos de aminoácido 656-659 de la secuencia anterior) eliminados entre los dos.

C5a se disocia de la cadena alfa de C5 ya sea mediante convertasa C5 alternativa o clásica como un fragmento terminal amino que comprende los primeros 74 aminoácidos de la cadena alfa (es decir, los residuos de aminoácido 660-733 de la secuencia anterior). Aproximadamente el 20 por ciento de la masa 11 kDa de C5a es atribuida a carbohidrato. El sitio de disociación para la acción de convertasa, está en o inmediatamente adyacente a el residuo de aminoácido 733 de la secuencia anterior. Un compuesto que puede enlazar a, o está adyacente a este sitio de disociación, puede tener el potencial de bloquear el acceso de las enzimas de convertasa C5 al sitio de disociación y de esta forma actuar como un inhibidor de complemento.

C5 también se puede activar por medio de otra actividad de convertasa C5. La digestión de tripsina limitada (ver por ejemplo, las Publicaciones de Minta y Man (1997) J Immunol 119:1597-1602 y Wetsel y Kolb (1982) J Immunol 128:2209-2216) y el tratamiento de ácido (Yamamoto y Gewurz (1978) J Immunol 120:2008 y Damerau y asociados, (1989) Molec Immunol 26.: 1133-1142) también pueden disociar C5 y producir C5b activa.

La disociación de C5 libera C5a, una anafilotoxina potente y factor quimotáctico, y conduce a la formación del complejo de terminal lítico, C5b-9. C5a y C5b-9 también tienen propiedades de activación de célula pleyotrópica , amplificando la liberación de los factores inflamatorios de corriente descendente, tal como enzimas hidrolíticas, especies de oxígeno reactivo, metabolitos de ácido araquidónico y diversas citocinas.

C5b se combina con C6, C7, y C8 para formar el complejo C5b-8 en la superficie de la célula objetivo. Al momento del enlace de diversas moléculas C9, se forma el complejo de ataque de membrana (MAC, C5b-9, complejo de complemento terminal--TCC). Cuando se insertan números suficientes de MACs en las membranas de célula objetivo, las aberturas que crean (poros MAC) transmiten una rápida lisis osmótica de las células objetivo. Las concentraciones no líticas, inferiores de MACs pueden producir otros efectos. En particular, la inserción de membrana de números pequeños de complejos C5b-9 en células endoteliales y plaquetas, puede originar la actividad celular perjudicial. En algunos casos, la activación puede preceder la lisis celular.

Tal como se hace mencionó anteriormente, C3a y C5a son anafilatoxinas. Estos componentes de complemento activados pueden activar la desgranulación de mastocitos, que libera la histamina de los basófilos y mastocitos, y otros transmisores de inflamación, dando como resultado contracción de músculo liso, permeabilidad vascular incrementada, activación de leucocitos y otros fenómenos inflamatorios incluyendo proliferación celular que da como resultado hipercelularidad. C5a también funciona como un péptido quimiotáctico que sirve para atraer granulocitos pro-inflamatorios al sitio de la activación de complemento.

Los receptores C5a se encuentran en las superficies de las células epiteliales, alveolares y bronquiales, y células de músculo liso bronquial. Los receptores C5a también han sido encontrados en eosinófilos, mastocitos, monocitos, neutrófilos y linfocitos activados.

Composiciones Las composiciones aquí descritas pueden contener un inhibidor de complemento humano. Se puede utilizar cualquier compuesto que enlace a, o de otra manera bloquee la generación y/o la actividad de cualesquiera de los componentes de complemento humano, de acuerdo con la presente descripción. Por ejemplo, un inhibidor de complemento puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico, un peptidomimético, o una macromolécula que no es un ácido nucleico o una proteína. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a moléculas orgánicas pequeñas, aptámeros de ARN, aptámeros de L-ARN, Espiegélmeros, compuestos antisentido, ARN de hebra doble, ARN de interferencia pequeña, inhibidores de ácido nucleico asegurados e inhibidores de ácido nucleico de péptido. En algunas modalidades, un inhibidor de complemento puede ser una proteína o fragmento de proteína.

En algunas modalidades, las composiciones contienen anticuerpos específicos para un componente de complemento humano. Algunos compuestos incluyen anticuerpos dirigidos contra los componentes de complemento C1, C2, C3, C4, C5 (o un fragmento del mismo, ver más adelante), C6, C7, C8, C9, Factor D, Factor B, Factor P, MBL, MASP-1, o MASP-2, previniendo de esta forma la generación de la actividad anafilatóxica asociada con C5a y/o previniendo el ensamble del complejo de ataque de membrana (MAC) asociado con C5b. En algunas modalidades, el inhibidor de complemento inhibe la actividad y/o ensamble del complejo C5b-9. Por ejemplo, en algunas modalidades, el inhibidor es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a una de las C6, C7, C8, C9, o C5b para evitar de esta forma el ensamble y/o actividad de la MAC.

Las composiciones también pueden contener formas solubles o que ocurren naturalmente de los compuestos inhibidores de complemento tales como CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59, Factor H, factor de veneno de cobra, FUT-175, complestatina, y K76 COOH. Otros compuestos que pueden ser utilizados para enlazar a o bloquear de otra forma la generación y/o actividad de cualesquiera de componentes de complemento humano, incluyen, pero no se limitan a proteínas, fragmentos de proteína, péptidos, moléculas pequeñas, aptámeros de ARN incluyendo ARC 187 (que está comercialmente disponible en Archemix Corporation, Cambridge, MA), aptámeros de L-ARN, espiegélmeros, compuestos antisentido, inhibidores de proteasa de serina, moléculas que pueden ser utilizadas en la interferencia de ARN (ARNi) tal como ARN de hebra doble incluyendo ARN de interferencia pequeña (siARN), inhibidores de ácido nucleico asegurado (LNA), inhibidores de ácido nucleico de péptido (PNA), etc.

En algunas modalidades, el inhibidor de complemento inhibe la activación del complemento. Por ejemplo, el inhibidor de complemento puede enlazar a, e inhibir la actividad de activación de complemento de C1 (por ejemplo, C1q, C1r, o C1s) o el inhibidor de complemento puede enlazar a, e inhibir (por ejemplo, inhibir la disociación de) C2, C3, o C4. En algunas modalidades, el inhibidor, inhibe la formación o ensamble de la convertasa C3 y/o convertasa C5 de las trayectorias alternativas y/o clásicas del complemento. En algunas modalidades, el inhibidor de complemento inhibe la formación de complemento terminal, por ejemplo, la formación del complejo de ataque de membrana C5b-9. Por ejemplo, un inhibidor de complemento de anticuerpo puede incluir un anticuerpo anti-C5. Dichos anticuerpos anti-C5 pueden interactuar directamente con C5 y/o C5b, para inhibir de esta forma la formación de y/o función fisiológica de C5b.

En algunas modalidades, las composiciones aquí descritas pueden contener un inhibidor del componente de complemento humano C5 (por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a una proteína de componente de complemento humano C5, o un fragmento biológicamente activo de la misma, tal como C5a o C5b). Tal como se utiliza en la presente invención, un "inhibidor del componente de complemento C5" es cualquier agente que inhibe: (i) la expresión o un tráfico o secreción intracelular adecuada por parte de una célula, de una proteína de componente de complemento C5; (ii) la actividad de los fragmentos de disociación C5, C5a o C5b (por ejemplo, el enlace de C5a a sus receptores celulares cognatos o el enlace de C5b a C6 y/o otros componentes del complejo de complemento terminal; ver anteriormente); (iii) la disociación de una proteína C5 humana para formar C5a y C5b; o (iv) el tráfico intracelular adecuado de, o la secreción por parte de una célula, de una proteína de componente de complemento C5. La inhibición de la proteína de componente de complemento C5b incluye la inhibición: la transcripción de un gen que codifica una proteína C5 humana; la degradación incrementada de un mARN que codifica una proteína C5 humana; la inhibición de la traducción de un mARN que codifica una proteína C5 humana; la degradación incrementada de una proteína C5 humana; la inhibición del procesamiento adecuado de una proteína C5 humana pre-pro; o la inhibición del tráfico o secreción adecuada por parte de una célula de una proteína C5 humana. Se conocen en la técnica y se describen en la presente invención, los métodos para determinar si un agente candidato es un inhibidor de un componente de complemento humano C5.

Un inhibidor del componente de complemento humano C5 puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, un polipéptido, un análogo de polipéptido, un ácido nucleico, o un análogo de ácido nucleico.

Una "molécula pequeña" tal como se utiliza en la presente invención, se entiende que se refiere a un agente, el cual tiene un peso molecular menor a aproximadamente 6 kDa y más preferentemente menor a aproximadamente 2.5 kDa. Muchas compañías farmacéuticas tienen extensas bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas que comprenden formaciones de moléculas pequeñas, con frecuencia extractos fúngicos, bacteriales o de alga, que se pueden clasificar con cualesquiera de los ensayos de aplicación. Esta aplicación contemplo el uso, entre otras cosas, de bibliotecas químicas pequeñas, bibliotecas de péptido o recolecciones de productos naturales. Tan y asociados, describió una biblioteca con aproximadamente dos millones de compuestos sintéticos que son compatibles con ensayos a base de célula miniaturizada (J Am Chem Soc (1998) 120:8565-8566). Está dentro del alcance de la presente solicitud, que dicha biblioteca pueda ser utilizada para clasificar inhibidores del componente de complemento humano C5. Existen numerosas bibliotecas de compuestos comercialmente disponibles tal como la Chembridge DIVERSet. Las bibliotecas también están disponibles con investigadores académicos tal como el conjunto Diversity del programa de desarrollo de terapéuticos NCI. También se puede emplear un diseño de fármaco racional. Por ejemplo, el diseño de fármaco racional puede emplear el uso de información estructural de cristal o solución en la proteína de componente de complemento humana C5. Por ejemplo ver las estructura descritas en las Publicaciones de Hagemann y asociados, (2008) J Biol Chem 283(12):7763-75 y Zuiderweg y asociados, (1989) Biochemistry 28(1 ): 172-85. El diseño de fármaco racional también se puede lograr con base en compuestos conocidos, por ejemplo, un inhibidor de C5 conocido (por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a una proteína de componente de complemento humano C5).

Los peptidomiméticos pueden ser compuestos en los cuales se modifica al menos una parte de un polipéptido del sujeto, y la estructura tridimensional del peptidomimético permanece sustancialmente igual a la del polipéptido del sujeto. Los peptidomiméticos pueden ser análogos de un polipéptido del sujeto de la descripción, los cuales, por sí mismos, son polipéptidos que contienen una o más sustituciones u otras modificaciones dentro de la secuencia de polipéptido en cuestión. Como alternativa, al menos una parte de la secuencia de polipéptido del sujeto puede ser reemplazada con una estructura de no péptido, de modo que la estructura tridimensional del polipéptido del sujeto, sea retenida sustancialmente. En otras palabras, uno, dos o tres residuos de aminoácido dentro de la secuencia de polipéptido del sujeto, se pueden reemplazar por una estructura de no péptido. Además, otras porciones de péptido del polipéptido del sujeto, pueden, aunque no necesariamente, ser reemplazadas con una estructura de péptido. Los peptidomiméticos (los análogos tanto de péptido como de no peptidilo) pueden tener propiedades mejoradas (por ejemplo, proteólisis disminuida, retención incrementada o biodisponibilidad incrementada). Los peptidomiméticos generalmente tienen una disponibilidad oral mejorada, lo cual los hace especialmente adecuados para tratamiento de trastornos en un humano o animal. Deberá observarse que los peptidomiméticos pueden o no tener estructuras químicas bidimensionales similares, pero comparten características estructurales tridimensionales comunes y geometría. Cada peptidomimético puede tener además uno o más elementos de enlace adicionales.

Se pueden utilizar inhibidores de ácido nucleico para disminuir la expresión de un gen endógeno, por ejemplo, un gen que codifica un componente de complemento humano C5. El antagonista de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un siARN, un dsARN, una ribozima, un formador de hélice triple, un aptámero, o un ácido nucleico antisentido. Los siARNs son ARNs de hebra doble pequeños (dsARNs), que incluyen opcionalmente salientes. Por ejemplo, la región dúplex de un siARN tiene aproximadamente 18 a 25 nucleótidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, ó 24 nucleótidos de longitud. Las secuencias de siARN pueden ser, en algunas modalidades, exactamente complementarias al mARN objetivo. Los dsARNs y los siARNs en particular, pueden utilizarse para silenciar la expresión de gen en células de mamífero (por ejemplo, células humanas). Ver por ejemplo, las Publicaciones de Clemens y asociados, (2000) Proc Nati Acad Sci USA 9_Z:6499-6503; Billy y asociados, (2001) Proc Nati Acad Sci USA 98:14428-14433; Elbashir y asociados, (2001) Nature 411:494-8; Yang y asociados, (2002) Proc Nati Acad Sci USA 99:9942-9947, y las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 20030166282, 20030143204, 20040038278, y 20030224432. Los agentes antisentido pueden incluir, por ejemplo, de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 80 nucleobases (es decir de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 80 nucleótidos), por ejemplo, de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 50 nucleobases, o de aproximadamente 12 hasta aproximadamente 30 nucleobases. Los compuestos antisentido incluyen ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externos (EGS) oligonucleótidos (oligozimas), y otros ARNs catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que hibridan para el ácido nucleico objetivo, y modulan su expresión. Los compuestos antisentido pueden incluir una extensión de al menos ocho nucleobases consecutivas que son complementarias para una secuencia en el gen objetivo. Un oligonucleótido no necesita ser el 100% complementario a su secuencia de ácido nucleico objetivo, la cual será específicamente hibridizable. Un oligonucleótido es específicamente hibridizable, cuando el enlace del oligonucleótido al objetivo, interfiere con la función normal de la molécula objetivo para originar una pérdida de utilidad, y existe un suficiente grado de complementariedad para evitar un enlace no específico del oligonucleótido a las secuencias no objetivo bajo condiciones en las cuales se desea el enlace específico, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las cuales se llevan a cabo los ensayos. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido con mARN (por ejemplo, un mARN que codifica una proteína C5 humana) puede interferir con una o más funciones normales del mARN. Las funciones de mARN que serán interferidas con la hibridación, incluyen todas las funciones clave tales como, por ejemplo, translocación del ARN al sitio de traducción de proteína, traducción de proteína a partir del ARN, división del ARN para producir una o más especies mARN, y actividad catalítica que puede ser enganchada mediante el ARN. el enlace de la proteína(s) específica al ARN, también podrá ser interferida con la hibridación mediante hibridación de oligonucleótido antisentido para el ARN. Los compuestos antisentido de ejemplo incluyen secuencias de ADN o ARN que hibridan específicamente al ácido nucleico objetivo, por ejemplo el mARN que codifica a una proteína de componente de complemento humano. La región complementaria puede extenderse entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 80 nucleobases. Los compuestos pueden incluir una o más nucleobases modificadas.

Las nucleobases modificadas pueden incluir, por ejemplo, pirimidinas sustituidas-5 tal como 5-yodouracilo, 5-yodocitosina, y C5-propinilo pirimidinas tal como C5-propinilcitosina y C5-propiniluracilo. Otras nucleobases modificadas adecuadas, incluyen, por ejemplo, 8-aza-7-deazapurinas sustituidas-7 y 7-deazapurinas sustituidas-7 tal como, por ejemplo, 7-yodo-7-deazapurinas, 7-ciano-7-deazapurinas, 7-aminocarbonil-7-deazapurinas. Los ejemplos de éstas, incluyen 6-amino-7-yodo-7-deazapurinas, 6-amino-7-ciano-7-deazapurinas, 6-amino-7-aminocarbonil-7-deazapurinas, 2-amino-6-hidroxi-7-yodo-7-deazapurinas, 2-amino-6-hidroxi-7-ciano-7-deazapurinas, y 2-amino-6-hidroxi-7-aminocarbonil-7-deazapurinas. Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,987,071; 5,116,742; y 5,093,246; "ARN y ADN Antisentido, " D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-59: Helene, C. (1991) Anticancer Drug D 6:569-84; Helene (1992) Ann NY Acad Sci 660:27-36: y Maher (1992) Bioassays 14:807-15.

Los aptámeros son secuencias de oligonucleótido cortas, que se pueden utilizar para reconocer y enlazar específicamente casi cualquier molécula, incluyendo proteínas de superficie celular. La evolución sistemática de los ligandos mediante el proceso de enriquecimiento exponencial (SELEX), es poderosa y se puede utilizar para identificar fácilmente dichos aptámeros. Los aptámeros pueden ser elaborados para un amplio rango de proteínas de importancia para terapia y diagnóstico, tal como factores de crecimiento y antígenos de superficie celular. Estos oligonucleótidos se enlazan a sus objetivos con afinidades y especificidades similares a las de los anticuerpos. Ver por ejemplo la Publicación de Ulrich (2006) Handb Exp Pharmacol 173:305-326.

En algunas modalidades, el inhibidor de C5 humano es un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a una proteína de componente de complemento humano C5. (En lo sucesivo, el anticuerpo algunas veces podrá ser referido como un "anticuerpo anti-C5").

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 enlaza a un epítope en la proteína precursora pro-C5 humana. Por ejemplo, el anticuerpo anti-C5 puede enlazar a un epítope en la proteína de componente de complemento humano C5, que comprende, o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 1 (Acceso NCBI No. AAA51925 y Haviland y asociados, supra).

Un "epítope" se refiere al sitio en una proteína (por ejemplo, una proteína de componente de complemento humano C5) que es enlazada por un anticuerpo. Los "epítopes de traslape" incluyen al menos uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) residuo(s) de aminoácido común.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 enlaza a un epítope en la proteína precursora pro-C5 humana que carece de secuencia líder. Por ejemplo, el anticuerpo anti-C5 puede enlazar a un epítope en la proteína de componente de complemento humano C5 que comprende, o consiste en la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:2, la cual es una C5 proteína humana que carece de la secuencia líder terminal amino.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 puede enlazar a un epítope en la cadena alfa de la proteína del componente de complemento humano C5. Por ejemplo, el anticuerpo anti-C5 puede enlazar a un epítope dentro o traslapar con, una proteína que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:3, la cual es la proteina de cadena alfa de componente de complemento humano C5. Los anticuerpos que enlazan a la cadena alfa de C5 se describen por ejemplo en la Publicación de Ames y asociados, (1994) J Immunol 152:4572-4581.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 puede enlazar a un epítope en la cadena beta de la proteína de componente de complemento humano C5. Por ejemplo, el anticuerpo anti-C5 puede enlazar a un epítope dentro de, o traslapar con, una proteína que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO:4, la cual es una proteína de cadena beta de componente de complemento humano C5. Los anticuerpos que enlazan a la cadena beta C5 se describen por ejemplo en las Publicaciones de oongkarndi y asociados, (1982) Immunobiol 162:397; Moongkarndi y asociados, (1983) Immunobiol 165:323: y Mollnes y asociados, (1988) Scand J Immunol 28:307-312.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 puede enlazar a un epítope dentro o traslapar con, un fragmento de péptido antigénico de una proteína de componente de complemento humano C5. Por ejemplo, el anticuerpo ant¡-C5 puede enlazar a un epítope dentro de, o traslapar con, un fragmento de péptido de antígeno de una proteína de componente de complemento humano C5, en donde el fragmento contiene o consiste en, la siguiente secuencia de aminoácido: VIDHQGTKSSKCVRQKVEGSS (SEC ID NO:5) o KSSKC (SEC ID NO:6).

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 puede enlazar a un epítope dentro de, o traslapar con, un fragmento de una proteína de componente de complemento humano C5, en donde el fragmento contiene, o consiste en cualesquiera de las siguientes secuencias de aminoácido (las cuales son fragmentos antigénicos de ejemplo de SEC ID NO: 1): N FSLETWFGKE ILVKTLRVVPEGVKRESYSG VTLDPRG I YGTI SRRK EFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKG SAEAELMSV PVFYVFH YLETG N H WN I FHSD (SEC ID NO:7); SESPVIDHQGTKSSKCVRQKVEGSSSHLVTFTVLPLEIGLHNINFSL ETWFGKEILVKTLRVVPEGVKRESYSGVTLDPRGI YGTISRRKEFP YRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAE AELMSVVPVFYVFHYLETGNHWNI FHSDPLI EKQKLKKKLKEGMLSI MSYARN DYSYS (SEC ID NO: 8); SHKDMQLGRLHMKTLLPVSKPEI SYFPES (SEC ID NO:9); SHKDMQLGRLHMKTLLPVSKPEI RSYFPESWLWEVHLVPRRKQLQ FALPDSLTTWEIQGIGISNTGICVADTVKAKVFKDVFLEMN IPYSVV RGEQIQLKGTVYNYRTSGMQFCVKMSAVEG ICTSESPVI DHQGTK SSKCVRQKVEGSSSHLVTFTVLPLEIGLHNINFSLETWFGKEILVKT LR VPEGVKRESYSGVTLDPRGI YGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEI KRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYV FHYLETGNHWN IFHSDPLI EKQKLKKKLKEGMLSI MSYARN DYSYS (SEC ID NO:10); y DHQGTKSSKCVRQKVEG (SEC ID NO: 11).

Los fragmentos antigénicos de ejemplo adicionales de componente de complemento humano C5 se describen, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 6,355,245, cuya descripción está incorporada a la presente invención como referencia.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 enlaza específicamente a una proteína de componente de complemento humano C5 (por ejemplo, teniendo la proteína C5 humana la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 1). Los términos "enlace específico" o "enlaza en forma específica" se refieren a dos moléculas que forman un complejo (por ejemplo, un complejo entre un anticuerpo y una proteína de componente de complemento C5) que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. Normalmente, el enlace se considera específico cuando la constante de asociación (Ka) es mayor a 106 M"1. Por lo tanto, un anticuerpo que puede enlazar específicamente a una proteína de C5 con Ka de al menos (o mayor a) 106 (por ejemplo, al menos o mayor a 107, 108, 109, 1010, 1011 1012, 1013, 1014, o 1015 o mayor) M'1. Los ejemplos de anticuerpos que enlazan específicamente a una proteína de componente de complemento humano C5 se describen por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 6,355,245, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

En la técnica se conocen métodos para determinar si un anticuerpo enlaza a un antígeno de proteína y/o la afinidad de un anticuerpo para un antígeno de proteína. Por ejemplo, el enlace de un anticuerpo a un antígeno de proteína puede ser detectable y/o cuantificando utilizando una variedad de técnicas, tales como pero sin limitarse a, manchado Western, manchado de punto, método de resonancia de superficie de plasmón (por ejemplo, sistema BIAcore; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.), o ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzima (ELISA). Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Harlow y Lañe (1988) "Anticuerpos: Manual de Laboratorio" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Ingeniería de Anticuerpo: Métodos y Protocolos", Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Ingeniería de Anticuerpo, A Practical Guide," W.H. Freeman y Co., NY; Borrebaek (1995) "Ingeniería de Anticuerpo," 2o Edición, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne y asociados, ( 1993) J Immunol Met 160: 191-198; Jonsson y asociados, (1993) Ann Biol Clin 51_: 19-26; y Jonsson y asociados, (1991) Biotechniques 1J_:620-627. Ver también la Patente Norteamericana No. 6,355,245.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 puede bloquear en forma cruzada el enlace de otro anticuerpo que enlaza a un epítope dentro de, o que traslapa con una proteína de componente de complemento humano C5. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-C5 puede bloquear en forma cruzada el enlace de un anticuerpo que enlaza a un epítope dentro de, o que traslapa con un fragmento de péptido de una proteína de componente de complemento humano C5. El fragmento de péptido puede ser un fragmento de una proteína de componente de complemento humano C5, que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEC ID NOS: 1-11. Por ejemplo, el fragmento de péptido puede contener, o consistir en, la siguiente secuencia de aminoácido: VI DHQGTKSSKCVRQKVEGSS (SEC ID NO:5).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo que bloquea en forma cruzada" se refiere a un anticuerpo que disminuye la cantidad de enlace del anticuerpo anti-C5 a un epítope de una proteína de componente de complemento C5 relativa a la cantidad de enlace del anticuerpo anti-C5 al epítope en la ausencia del anticuerpo. Los métodos adecuados para determinar si un primer anticuerpo bloquea en forma cruzada el enlace del segundo anticuerpo a un epítope, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos de bloqueo cruzado pueden ser identificados comparando el enlace del anticuerpo monoclonal anti-C5 5G1.1 (producido por la línea de célula de hibridoma de la designación ATCC HB-11625; ver la Patente Norteamericana No. 6,355,245) en la presencia y ausencia de un anticuerpo de prueba. El enlace disminuye del anticuerpo 5G1.1 en la presencia del anticuerpo de prueba, en comparación con el enlace del anticuerpo 5G1.1, en la ausencia del anticuerpo de prueba, indica que el anticuerpo de prueba es un anticuerpo de bloqueo cruzado.

En la técnica también se conoce métodos para identificar al epítope al cual enlaza un anticuerpo particular (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5). Por ejemplo, el epítope de enlace de un anticuerpo anti-C5, puede ser identificado midiendo el enlace de un anticuerpo a diversos (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 15, 20, o 30 o más) fragmentos de péptido de traslape de una proteína de componente de complemento C5 (por ejemplo, varios fragmentos de traslape de una proteína que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-11). Cada uno de los diferentes péptidos de traslape posteriormente se enlazan a una dirección única en un soporte sólido, por ejemplo, depósitos separados de una placa de ensayo de depósitos múltiples. Posteriormente, el anticuerpo anti-C5 es interrogado contactándolo con cada uno de los péptidos en la placa de ensayo durante una cantidad de tiempo, y bajo condiciones que permiten que el anticuerpo enlace a su epítope. El anticuerpo anti-C5 no enlazado es eliminado lavando cada uno de los depósitos. Posteriormente, un anticuerpo secundario etiquetado en forma detectable que enlaza al anticuerpo anti-C5, si está presente en un depósito de una placa, se pone en contacto con cada uno de los depósitos, y el anticuerpo secundario no deseado es eliminado mediante pasos de lavado. La presencia o cantidad de la señal detectable producida por el anticuerpo secundario etiquetado en forma detectable en un depósito, es una indicación de que el anticuerpo anti-C5 enlaza al fragmento de péptido particular asociado con el depósito. Ver por ejemplo la Publicación de Harlow y Lañe (supra), Benny K. C. Lo (supra), y la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20060153836, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Un epítope particular al cual enlaza un anticuerpo, puede ser identificado utilizando técnicas cromatográficas BIAcor (ver por ejemplo la Publicación de, Pharmacia BIAtechnology Handbook, "Mapeo de Epítope", Sección 6.3.2, (Mayo 1994); y Johne y asociados, (1993) J Immunol Metods 160:20191-8).

Los anticuerpos anti-C5 aquí descritos, pueden tener actividad en el bloqueo de la generación o actividad de los fragmentos activos C5a y/o C5b de una proteína de componente de complemento C5 (por ejemplo, una proteína C5 humana). A través de este efecto de bloqueo, los anticuerpos anti-C5, inhiben por ejemplo, los efectos pro-inflamatorios de C5a y la generación del complejo de ataque de membrana C5b-9 (MAC) en la superficie de una célula. Los anticuerpos anti-C5 que tienen la capacidad de bloquear la generación de C5a se describen por ejemplo en las Publicaciones de Moongkarndi y asociados, (1982) Immunobiol 162:397 y Moongkarndi y asociados, (1983) Immunobiol 165:323.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, puede reducir la capacidad que tiene una proteína C5 de enlazar al componente de complemento humano C3b (por ejemplo, C3b presente en un complejo de convertasa C5AP o CP) con más del 50 (por ejemplo, más de 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o 95 o más) %. En algunas modalidades, al momento del enlace a una proteína C5, el anticuerpo anti-C5 o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede reducir la capacidad que tiene la proteína C5 proteína a enlazar al componente de complemento C4b (por ejemplo, C4b presente en la convertasa C5 CP) en más del 50 (por ejemplo, más del 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o 95 o más) %. Los métodos para determinar si un anticuerpo puede bloquear la generación o actividad de los fragmentos activos C5a y/o C5b de una proteína de componente de complemento C5, o enlazar al componente de complemento C4b o C3b, son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 6,355,245 y en la Publicación de Wurzner y asociados, (1991) Complement Inflamm 8:328-340.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-C5 enlaza a una región amino-terminal de la cadena alfa de una proteína de componente de complemento C5, pero no enlaza a C5a libre. Los epítopes para un anticuerpo anti-C5 dentro de la región amino-terminal de la cadena alfa incluye, por ejemplo, epítopes dentro de la secuencia humana VIDHQGTKSSKCVRQKVEGSS (SEC ID NO:5).

En algunas modalidades, la composición comprende, y/o el anticuerpo es, eculizumab (Soliris®; Alexion Pharmaceuticals, Inc., Cheshire, CT). (Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Kaplan (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(7): 1017-23; Hill (2005) Clin Adv Hematol Oncol 3(11 ):849-50: y Roter y asociados, (2007) Nature Biotechnology 25(11 ): 1256-1488.) En algunas modalidades, la composición comprende, y/o el anticuerpo es, pexelizumab (Alexion Pharmaceuticals, Inc., Cheshire, CT). Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Whiss (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(6): 870-7; Patel y asociados, (2005) Drugs Today (Barc) 41 (3): 165-7Q: y Thomas y asociados, (1996) Mol Immunol 33(17-18): 1389-401.

En algunas modalidades, el inhibidor C5 es un anticuerpo que enlaza a C5a (algunas veces referido en la presente invención como un anticuerpo "un anticuerpo anti-C5a"). En algunas modalidades, el anticuerpo enlaza a C5a, pero no a C5 de longitud total. Tal como se describe anteriormente, la proforma de C5, una proteína precursora con 1676 residuos de aminoácidos, se procesa a través de una serie de eventos de disociación proteolítica. Los primeros 18 péptidos (numerados -18 a -1) constituyen un péptido de señal que es disociado de la proteína precursora. La proteína con los 1658 aminoácidos restantes es disociada en dos lugares, para formar las cadenas alfa y beta. El primer evento de disociación ocurre entre los residuos de aminoácido 655 y 656. La segunda disociación ocurre entre los residuos de aminoácido 659 a 660. Los dos eventos de disociación dan como resultado la formación de tres fragmentos de polipéptido distinto: (i) un fragmento que comprende los aminoácidos 1 a 655, el cual es referido como la cadena beta; (ii) un fragmento que comprende los aminoácidos 660 a 1658, el cual es referido como la cadena alfa; y (¡ii) un fragmento terapéutico que consiste en los aminoácidos 656 a 659. La cadena alfa y los fragmentos de polipéptido de la cadena beta, se conectan entre sí a través de un enlace de disulfuro y constituyen la proteína C5 madura. La convertasa C5 CP o AP, activa C5 madura disociando la cadena alfa entre los residuos 733 y 734, que da como resultado la liberación del fragmento C5a (aminoácidos 660 a 733). La parte restante de C5 madura es el fragmento C5b, que contiene los residuos 734 a 1658 del disulfuro de cadena alfa enlazado a la cadena alfa.

In vivo, C5a es metabolizado rápidamente mediante una enzima de suero carboxipeptidasa B, para una forma de 73 aminoácidos llamada "C5a des-Arg", la cual ha perdido el residuo de arginina carboxiterminal . Por consiguiente, en algunas modalidades, un anticuerpo que enlaza a C5a también enlaza a C5a des-arginada. En algunas modalidades, un anticuerpo que enlaza a C5a, no enlaza a C5a des-arginada.

En algunas modalidades, el inhibidor C5 es un anticuerpo que enlaza a un neoepítope presente en C5a, es decir, un epítope que queda expuesto al momento de la liberación de C5a del fragmento de cadena alfa de C5 madura. Los anticuerpos que enlazan a C5a (por ejemplo, un neo-epítope presente en C5a) son conocidos en la técnica como métodos para producir dichos anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo que enlaza a C5a, puede tener la especificidad de enlace de un anticuerpo específico de neoepítope C5a descrito en cualesquiera de las Publicaciones de, por ejemplo, Publicación PCT No. WO 01/15731; Ames y asociados, (1994) J Immunol 152(91:4572-4581; Inoue (1989) Complement Inflamm 6(31:219-222: y Patente Norteamericana No. 6,866,845. En otro ejemplo, un anticuerpo que enlaza a C5a, puede tener una especificidad de enlace de un anticuerpo específico de neoepítope C5a comercial, tal como, pero sin limitarse a, sc-52633 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California), 152-1486 (BD Pharmingen/BD Biosciences), ab 11877 (Abeam, Cambridge, Massachusetts), y HM2079 (clon 2952; HyCult Biotechnology, Holanda). En algunas modalidades, un anticuerpo que enlaza a C5a, puede bloquear en forma cruzada el enlace de cualesquiera de los anticuerpos específicos de neoepítope C5a antes mencionados.

En algunas modalidades, el inhibidor C5 puede ser un anticuerpo que enlaza a una proteína C5a de mamífero (por ejemplo, humana). Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazar a una proteína C5a humana, que tiene la siguiente secuencia de aminoácido: TLQKKI EEIAAKYKHS VVKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCI KAFTE CC VVASQLRAN ISHKDMQLGR (SEC ID NO: 12). El anticuerpo puede enlazar a C5a humana, en un epítope dentro de o que traslapa con la secuencia de aminoácido: CCYDGACVNNDETCEQRAAR (SEC ID NO: 13); KCCYDGACVNNDETCEQR (SEC ID NO : 14); VNNDETCEQR (SEC ID NO : 15); VNNDET (SEC ID NO : 16); AARISLGPR (SEC ID NO: 17); CCYDG ACVN N DETCEQRAA (SEC ID NO: 18); CCYDGACVNN DETCEQRA (SEC ID NO: 19); CCYDGACVNN DETCEQR (SEC ID NO:20); CCYDGACV DETCEQ (SEC ID NO:21); CCYDGACV N DETCE (SEC ID NO:22); CYDGACVNN DETCEQ RAAR (SEC ID NO:23); YDGACVNNDETCEQRAAR (SEC ID NO:24); o CYDGACV DETCEQ RAAR (SEC ID NO:25). En algunas modalidades, un anticuerpo puede enlazar a la proteína C5a humana o fragmento de la misma, que contiene una secuencia de aminoácido que contiene, o consiste en, al menos cuatro (por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, o 17 o más) aminoácidos consecutivos ilustrados en cualesquiera de las SEC ID NOs: 12-25. Los fragmentos de proteína C5a adicionales, a los cuales pueden enlazar a un anticuerpo aquí descrito, y los métodos para generar los sitios de combinación de antígeno específicos de C5a adecuados, se establecen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 4,686,100, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

En algunas modalidades, el enlace del anticuerpo a C5a puede inhibir la actividad biológica de C5a. Los métodos para medir la actividad de C5a incluyen, por ejemplo, ensayos de quimiotaxis, RIAs, o ELISAs (ver por ejemplo las Publicaciones de Ward y Zvaifler (1971) J Clin Invest 50(3^:606-16 y Wurzner y asociados, (1991) Complement Inflamm 8:328-340). En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo a C5a puede inhibir la interacción entre C5a y C5aR1. Los métodos adecuados para detectar y/o medir la interacción entre C5a y C5aR1 (en la presencia y ausencia de un anticuerpo) son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Mary y Boulay (1993) Eur J Haematol 51 (5):282-287; Kaneko y asociados, (1995) Immunology 86(1 ): 149-154; Giannini y asociados, (1995) J Biol Chem 270(32): 19166-19172; y la Solicitud de Patente Norteamericana No. 20060160726. Por ejemplo, el enlace de C5a etiquetada en forma detectable (por ejemplo, etiquetada en forma radioactiva) a células mononucleares de sangre periférica que expresan C5aR1, se puede evaluar en la presencia y ausencia de un anticuerpo. Una disminución en la cantidad de C5a etiquetada en forma detectable que enlaza a C5aR1 en la presencia del anticuerpo, tal como se compara con la cantidad de enlace en la ausencia del anticuerpo, es una indicación de que el anticuerpo inhibe la interacción entre C5a y C5aR1. En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo a C5a puede inhibir la interacción entre C5a y C5L2 (ver más adelante). Los métodos para detectar y/o medir la interacción entre C5a y C5L2 son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Ward (2009) J Mol Med 87(4^:375-378 y Chen y asociados, (2007) Nature 446(7132):203-207 (ver más adelante).

En algunas modalidades, el inhibidor C5 es un anticuerpo que enlaza a C5b (algunas veces referido en la presente invención como "un anticuerpo anti-C5b"). En algunas modalidades, el anticuerpo enlaza a C5b, pero no enlaza a C5 de longitud total. La estructura de C5b se describe anteriormente y también se describe con detalle en las Publicaciones de Muller-Eberhard (1985) Biochem Soc Symp 5_0.:235-246; Yamamoto y Gewurz (1978) J Immunol 120(6):2008-2015; y Haviland y asociados, (1991), supra. Tal como se describió anteriormente, C5b se combina con C6, C7, y C8 para formar el complejo C5b-8 en la superficie de la célula objetivo. Los intermediarios del complejo de proteína formados durante la serie de combinaciones incluyen C5b-6 (incluyendo C5b y C6), C5b-7 (incluyendo C5b, C6, y C7), y C5b-8 (incluyendo C5b, C6, C7, y C8). Al momento del enlace de diversas moléculas C9, se forma el complejo de ataque de membrana (MAC, C5b-9 complejo de complemento terminal (TCC)). Cuando se insertan números suficientes de MACs en las membranas de célula objetivo, las aberturas que crean (poros MAC) transmiten una rápida lisis osmótica de las células objetivo.

En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo a C5b, puede inhibir la interacción entre C5b y C6. En algunas modalidades, el enlace del anticuerpo a C5b, puede inhibir el ensamble o la actividad de C5b-9 MAC-TCC. En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo a C5b puede inhibir la lisis celular dependiente de complemento (por ejemplo, in vitro y/o in vivo). Los métodos adecuados para evaluar si un anticuerpo inhibe la lisis dependiente de complemento incluyen, por ejemplo, ensayos hemolíticos u otros ensayos funcionales para detectar la actividad de C5b-9 soluble. Por ejemplo, se puede medir una reducción en la capacidad de Usado celular del complemento en la presencia de un anticuerpo, a través de un ensayo de hemolisis descrito por Kabat y Mayer (eds.)> "Inmunoquímica Experimental, 2o Edición", 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), páginas 135-139, o una variación convencional de dicho ensayo, tal como el método de hemolisis de eritrocito de pollo tal como se describe por ejemplo en la Publicación de Hillmen y asociados, (2004) N Engl J Med 350(6):552.

Los anticuerpos que enlazan a C5b, así como los métodos para elaborar dichos anticuerpos, son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6,355,245. Los anticuerpos anti-C5b comercialmente disponibles, están disponibles en una cantidad de proveedores incluyendo, por ejemplo, Hycult Biotechnology (número de catálogo: HM2080; clon 568) y Abeam™ (ab46151 o ab46168).

En algunas modalidades, el inhibidor C5 es un anticuerpo que enlaza a una forma de C5b de mamífero (por ejemplo, humano). Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazar a una parte de la proteína C5b humana que tiene la siguiente secuencia de aminoácido: QEQTYVISAPKI FRVGASE I VIQVYGYTEAFDATISI KSYPDKKFSY SSGHVHLSSENKFQNSAILTIQPKQLPGGQNPVSYVYLEVVSKHFS KSKRMPITYDNGFLFIHTDKPVYTPDQS VKVRVYSLN DDLKPAKRE TVLTFIDPEGSEVDMVEEIDHIGIISFPDFKIPSNPRYGMWTIKAKYK EDFSTTGTAYFEVKEYVLPHFSVSI EPEYN FIGYKFKFEITIKARYFY NKVVTEADVYITFGIREDLKDDQKEMMQTAMQNTMLI GIAQVTFD SETAVKELSYYSLEDLN NKYLYI AVTVI ESTGG FSEEAE I PG I KYVLS PYKLNLVATPLFLKPGI PYPIKVQVKDSLDQLVGGVPVILNAQTIDV NQETSDLDPSKSVTRVDDG ASFVLNLPSGVTVLEFNVKTDAPDLP EENQAREGYRAIAYSSLSQSYLYIDWTDNHKALLVGEHLN I IVTPKS PYIDKITHYNYLILSKGKIIHFGTREKFSDASYQSINIPVTQNMVPSS RLLVYYIVTGEQTAELVSDSVWLNI EEKCGNQLQVHLSPDADAYSP GQTVSLN ATG DSWVALAAVDSAVYGVQRGAKKPLERVFQFLE KSDLGCGAGGGLNANVFHLAGLTFLTNANADDSQENDEPCKEIL (SEC ID NO:4). En algunas modalidades, el anticuerpo puede enlazar a una parte de proteína C5b humana que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: LHMKTLLPVSKPEIRSYFPESWLWEVHLVPRRKQLQFALPDSLTTW EIQGIGISNTGICVADTVKAKVFKDVFLEMN IPYS VVRGEQIQLKGT VYN YRTSGMQFCVKMSAVEGICTSESPVIDHQGTKSSKCVRQKVE GSSSH LVTFTVLPLEIG LH N I N FSLETWFGKEILVKTLR VVPEGVKR ESYSGVTLDPRGIYGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLV GEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYVFHYLETGNHW NI FHSDPLIEKQKLKKKLKEGMLSIMSYARNDYSYSVWKGGSASTW LTAFALRVLGQVNKYVEQNQNSICNSLLWLVENYQLDNGSFKENS QYQPIKLQGTLPVEARENSLYLTAFTVIGIRKAFDICPLVKIDTALIKA DNFLLENTLPAQSTFTLAISAYALSLGDKTH PQFRSIVSALKREALV KG PPI YRFWKDNLQHKDSSVPNTGTARMVETTAYALLTSLNLKDI YVNPVIKWLSEEQRYGGGFYSTQDTI NAIEGLTEYSLLVKQLRLS MDIDVSYKHKGALHNYKMTDKFLGRPVEVLLNDDLIVSTGFGSGLA TVH VTTVVH KTSTSE EVCSFYLKIDTQDIEASHYRGYGNSDYKR IVA CASYKPSREESSSGSSHAVMDISLPTGISANEEDLKALVEGVDQLF TDYQI KDGHVILQLNSIPSSDFLCVRFRI FELFEVGFLSPATFTVYEY HR DKQCTMFYSTSN IKIQKVCEGAACKCVEADCGQMQEELDLTIS AETRKQTACKPE I AYAYKVSITSITVEN VFVKYKATLLDI YKTG EAVA EKDSEITFIKVTCTNAELVKGRQYLIMGKEALQIKYNFSFRYIYPLDS LTWI EYWPRDTTCSSCQAFLANLDEFAEDIFLNGC (SEC ID NO:26). En algunas modalidades, el anticuerpo puede enlazar a una proteína C5b humana o un fragmento de la misma, que contiene una secuencia de aminoácido que contiene, o consiste en al menos cuatro (por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 o más) aminoácidos consecutivos ilustrados en SEC ID NO:4 o SEC ID NO:26.

Los subfragmentos de ejemplo adicionales de C5b o C5a humana a los cuales puede enlazar un anticuerpo inhibidor de C5, se describen en la Patente Norteamericana No. 6,355,245, cuya descripción está incorporada a la presente invención como referencia.

En algunas modalidades, el inhibidor es un anticuerpo que enlaza específicamente a un polipéptido C5a (por ejemplo, el polipéptido C5a humano que tienen la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 12). En algunas modalidades, el inhibidor es un anticuerpo que enlaza específicamente a un polipéptido C5b.

Los métodos para determinar si un agente particular es un inhibidor del componente de complemento humano C5 se describen en la presente invención y son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la concentración y/o actividad fisiológica de C5a y C5b en un fluido corporal, se puede medir a través de los métodos conocidos en la técnica. Los métodos para medir la concentración o actividad C5a incluyen, por ejemplo, ensayos de quimiotaxis, RIAs, o ELISAs (ver por ejemplo las Publicaciones de Ward y Zvaifler (1971) J Clin Invest 50(3 :606-16 y Wurzner y asociados, (1991) Complement Inflamm 8:328-340). Para C5b, se pueden utilizar ensayos hemolíticos, o ensayos para C5b-9 soluble aquí descritos. Otros ensayos conocidos en la técnica también pueden ser utilizados. Utilizando los ensayos de éstos u otros tipos adecuados, se pueden clasificar los agentes candidatos con la capacidad de inhibir el componente de complemento humano C5 tal como un anticuerpo anti-C5, con el objeto de, por ejemplo, identificar compuestos que son útiles en los métodos aquí descritos, y determinar los niveles de dosificación adecuados de dichos compuestos.

Los métodos para detectar la inhibición de expresión de mARN o una proteína (por ejemplo, inhibición de la expresión de proteína C5 humana o expresión de mARN que codifica la proteína C5 humana) son conocidos en la técnica de la biología molecular, e incluyen, por ejemplo, manchado Northern y técnicas RT-PCR (o RT-PCR cuantitativo) para mARN y para detección de proteína, manchado Western, manchado de punto o técnicas ELISA. Ver por ejemplo las Publicaciones de Sambrook y asociados, (1989) "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, 2o Edición", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Los métodos para determinar si un compuesto candidato inhibe la disociación C5 humano en las formas C5a y C5b, son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Moongkarndi y asociados, (1982) Immunobiol 162:397; Moongkarndi y asociados, (1983) Immunobiol 165:323: Isenman y asociados, (1980) J Immunol 124( 1 ):326-31 : Thomas y asociados, (1996) Mol Immunol 33(17-18^:1389-401: y Evans y asociados, (1995) Mol Immunol 32(16): 1183-95.

La inhibición del componente de complemento humano C5, también puede reducir la capacidad de Usado celular del complemento en fluidos corporales de un sujeto. Dichas reducciones de la capacidad de Usado celular del complemento presente, se pueden medir a través de métodos conocidos en la técnica tales como por ejemplo, a través de un ensayo hemolítico convencional, tal como el ensayo de hemolisis descrito en la Publicación de Kabat y Mayer (eds), "Inmunoquímica Experimental, 2° Edición", 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), páginas 135-139, o una variación convencional de dicho ensayo, tal como el método de hemolisis de eritrocito de pollo tal como se describe por ejemplo, en la Publicación de Hillmen y asociados, (2004) N Engl J Med 350161:552.

En algunas modalidades, las composiciones aquí descritas pueden contener un inhibidor de interferón alfa. Cualquier compuesto que enlaza a, o bloquea de otra forma la generación y/o actividad de interferón alfa se pueden utilizar de acuerdo con la presente descripción. Por ejemplo, un inhibidor de interferón alfa puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico (por ejemplo, un siARN, un dsARN, una ribozima, un formador de hélice triple, un aptámero), un peptidomimético, o una macromolécula que no es un ácido nucleico o una proteína. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a moléculas orgánicas pequeñas, aptámeros ARN, aptámeros de L-ARN, Espiegélmeros, compuestos antisentido, ARN de hebra doble, ARN de interferencia pequeño, inhibidores de ácido nucleico asegurados e inhibidores de ácido nucleico de péptido. En algunas modalidades, un inhibidor de interferón alfa puede ser una proteína o fragmento de proteína. En algunas modalidades, el inhibidor de interferón alfa es un inhibidor del receptor (receptor de interferón alfa) al cual enlaza el interferón alfa. El receptor de interferón alfa humano, se describe por ejemplo en las Publicaciones de Novick y asociados, (1994) Cell 77(3V.391-400; Chill y asociados, (2003) Structure 1 (7V.791-802; y Uze y asociados, (2007) Curr Top Microbiol Immunol 316:71-95. En algunas modalidades, un inhibidor de interferón alfa enlaza a ¡nterferón alfa o su receptor e inhibe la interacción entre interferón alfa y su receptor.

En algunas modalidades, el inhibidor de interferón alfa es un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a una proteína de interferón alfa. (En lo sucesivo, el anticuerpo algunas veces puede ser referido como un "anticuerpo anti-interferón alfa"). Los anticuerpos anti-interferón alfa de ejemplo son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 20090324605, 20070059309, y 20080160030; las Patentes Norteamericanas Nos. 7,087,726 y 4,423,147, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Los anticuerpos anti-interferón alfa de ejemplo adicionales que se pueden utilizar en las composiciones y métodos aquí descritos incluyen, por ejemplo, MEDI-545 (MDX-1103; AstraZeneca/Medimmune).

Métodos para Producir un Anticuerpo Los métodos adecuados para producir un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o un anticuerpo anti-interferón alfa), o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, de acuerdo con la descripción, son conocidos en la técnica (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,355,245) y se describen en la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos anti-C5 monoclonales generados utilizando células que expresan C5 de componente de complemento, un polipéptldo C5, o un fragmento antigénico de un polipéptido C5, como un ¡nmunogen, elevando de esta forma una respuesta inmune en animales de los cuales se pueden aislar células que producen anticuerpo, y a su vez, anticuerpos monoclonales. La secuencia de dichos anticuerpos puede ser determinada, y los anticuerpos o variantes de los mismos producidos mediante técnicas recombinantes. Las técnicas recombinantes pueden ser utilizadas para producir anticuerpos quiméricos, injertados con CDR, humanizados y completamente humanos, con base en la secuencia de los anticuerpos monoclonales, así con los polipéptidos con la capacidad de enlazar al componente de complemento humano C5. En forma similar, los anticuerpos anti-interferón alfa monoclonales pueden ser generados utilizando un polipéptido interferón alfa, o un fragmento antigénico del polipéptido de interferón alfa, como un inmunogen, para elevar de esta forma la respuesta inmune en animales de los cuales se pueden aislar las células que producen anticuerpo, y a su vez, los anticuerpos monoclonales.

Además, los anticuerpos derivados de bibliotecas recombinantes ("anticuerpos de fago"), se pueden seleccionar utilizando polipéptidos antigénicos tales como la proteína de componente de complemento o interferón alfa, como carnada para aislar los anticuerpos o polipéptidos sobre las bases de la especificidad objetivo La producción y aislamiento de los anticuerpos quiméricos y no humanos, está dentro de las habilidades de los expertos en la técnica.

Se puede utilizar tecnología de ADN recombinante para modificar una o más características de los anticuerpos producidos en células no humanas. Por lo tanto, los anticuerpos quiméricos se pueden construir con el objeto de disminuir la inmunogenicidad de los mismos en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Además, se puede minimizar la inmunogenicidad, humanizando los anticuerpos mediante injerto CDR, y opcionalmente, modificación de estructura. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 5,225,539 y 7,393,648, cuyos contenidos están incorporados a la presente invención como referencia.

Los anticuerpos se pueden obtener de suero animal, o en el caso de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, producirse en cultivo celular. Se puede utilizar tecnología de ADN recombinante para producir los anticuerpos de acuerdo con el procedimiento establecido, incluyendo procedimientos en cultivo celular bacteriano, o preferentemente, de mamífero. El sistema de cultivo de célula seleccionado, secreta preferentemente el producto de anticuerpo.

En otra modalidad, un proceso para la producción de un anticuerpo aquí descrito, incluye cultivar una célula huésped, por ejemplo, una célula de E. coli o de mamífero, que ha sido transformada con un vector híbrido. El vector incluye uno o más cartuchos de expresión que contienen un promotor enlazado en forma operable a una primera secuencia de ADN que codifica un péptido de señal enlazado en la estructura de lectura adecuada a una segunda secuencia de ADN que codifica la proteína de anticuerpo. Posteriormente la proteína de anticuerpo se recolecta y se aisla. Opcionalmente, el cartucho de expresión puede incluir un promotor enlazado en forma operable a secuencias de ADN policistrónicas (por ejemplo, bicistrónico) que codifican proteínas de anticuerpo cada una enlazadas en forma operativa a un péptido de señal, en el cuadro de lectura adecuado.

La multiplicación de células de hibridoma o células huésped de mamífero in vitro, se lleva a cabo en un medio de cultivo adecuado, el cual incluye un medio de cultivo estándar acostumbrado (tal como, por ejemplo el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) o medio RPMI 1640), rellenarse opcionalmente con un suero de mamífero (por ejemplo, suero de becerro fetal), o elementos residuales y suplementos que sostienen el crecimiento (por ejemplo, células alimentadoras tales como células de exudado peritoneal de ratón normales, células de bazo, macrófagos de médula ósea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoproteína de baja densidad, ácido oleico o similares). La multiplicación de células huésped que son células bacterianas o células de levadura, igualmente se lleva a cabo en un medio de cultivo adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, para bacterias, el medio de cultivo adecuado incluye medio LE, NZCYM, NZYM, NZM, Caldo Terrific, SOB, SOC, 2 xYT o medio mínimo M9. Para levadura, el medio de cultivo adecuado incluye el medio YPD, YEPD, Medio Mínimo o Medio de Goteo Mínimo Completo.

La producción in vitro proporciona preparaciones de anticuerpo relativamente puras, y permite la producción con escala ascendente para proporcionar grandes cantidades de anticuerpos deseados. Las técnicas para cultivo de célula bacteriana, levadura, planta o de mamífero, son conocidas en la técnica e incluyen cultivo de suspensión homogénea (por ejemplo, en un reactor de elevación de aire o en un reactor con agitación continua), y un cultivo de célula inmovilizada o atrapada (por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, en microgránulos de agarosa o cartuchos de cerámica).

También se pueden obtener grandes cantidades de anticuerpos deseados, multiplicando in vivo las células de mamífero. Para este propósito, se inyectan células de hibridoma que producen los anticuerpos deseados en los mamíferos histocompatibles, para originar el crecimiento de tumores que producen anticuerpos. Opcionalmente, los animales son imprimados con un hidrocarburo, especialmente aceites minerales tales como pristano (tetrametil-pentadecano), antes de la inyección. Después de una a tres semanas, los anticuerpos son aislados de los fluidos corporales de dichos mamíferos. Por ejemplo, las células de hibridoma obtenidas mediante fusión de células de mieloma adecuadas con células de bazo que producen anticuerpos de ratones Balb/c, o células transfectadas derivadas de la línea de célula de hibridoma Sp2/0, que producen los anticuerpos deseados, se inyectan en forma intraperitoneal en ratones Balb/c tratados previamente en forma opcional con pristano. Después de dos a tres semanas, se toma fluido ascítico de los animales.

Las técnicas anteriores, y otras se describen por ejemplo en las Publicaciones de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495-497: Patente Norteamericana No. 4,376,110; Harlow and Lañe, Antibodies: Manual de Laboratorio, (1988) Cold Spring Harbor, cuyas descripciones están incorporadas a la presente invención como referencia. Las técnicas para la preparación de moléculas de anticuerpo recombinante se describen en las referencias anteriores, y también por ejemplo en WO97/08320; Patente Norteamericana No. 5,427,908; Patente Norteamericana No. 5,508,717; Smith (1985) Science 225: 1315-1317; Parmley y Smith (1988) Gene 7_3:305-318; De La Cruz y asociados (1988) Journal of Biológica! Chemistry 263:4318-4322; Patente Norteamericana No. 5,403,484; Patente Norteamericana No. 5,223,409; WO88/06630; W092/15679; Patente Norteamericana No. 5,780,279; Patente Norteamericana No. 5,571,698; Patente Norteamericana No. 6,040,136; Davis y asociados (1999) Cáncer Metástasis Rev 18(4):421 -5: y Taylor y asociados (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Tomizuka y asociados (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97(2): 722-727, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia.

Los sobrenadantes de cultivo celular se clasifican para los anticuerpos deseados, por ejemplo, mediante inmunomanchado, a través de un inmunoensayo de enzimas, por ejemplo un ensayo de emparedado o un ensayo de punto, o un radioinmunoensayo.

Para aislamiento de los anticuerpos, las inmunoglobulinas en los sobrenadantes de cultivo o en el fluido ascítico pueden ser concentradas por ejemplo mediante precipitación con sulfato de amonio, diálisis contra material higroscópico, tal como polietilenglicol , filtración a través de membranas selectivas, o similares. Si es necesario y/o deseado, los anticuerpos se purifican a través de métodos de cromatografía acostumbrados, por ejemplo, filtración de gel, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía sobre DEAE-celulosa y/o cromatografía por (inmuno-) afinidad, por ejemplo, cromatografía por afinidad con uno o más polipéptidos de superficie derivados de una línea de célula que expresa el componente de complemento C5, o con la Proteína A- o -G.

Otra modalidad proporciona un proceso para la preparación de una línea de célula bacteriana que secreta anticuerpos dirigidos contra una proteína (por ejemplo, una proteína de complemento o interferón alfa) en un mamífero adecuado. Se construye una biblioteca de despliegue de fago producida del conejo inmunizado, y se lava con batea para los anticuerpos deseados de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (tal como, por ejemplo, los métodos descritos en las diversas referencias incorporadas como referencia).

También se describen células de hibridoma que secretan los anticuerpos monoclonales. Las células de hibridoma preferidas son genéticamente estables, secretan anticuerpos monoclonales aquí descritos con la especificidad deseada, y se pueden expandir de cultivos de congelación profunda, mediante descongelación y propagación in vitro o como ascitos in vivo.

En otra modalidad, se proporciona un proceso para la preparación de una línea de célula de hibridoma que secrete anticuerpos monoclonales contra una proteína de interés (por ejemplo, la proteína C5 o interferón alfa). En dicho proceso, un mamífero adecuado, por ejemplo un ratón Balb/c, se inmuniza con uno o más antígenos de polipéptido de interés o fragmentos antigénicos de los mismos. Las células que producen anticuerpo del mamífero inmunizado, son crecidas brevemente en cultivo o se fusionan con células de una línea de mieloma adecuada. Las células híbridas obtenidas en la fusión son clonadas, y se seleccionan los clones celulares que secretan los anticuerpos deseados. Los métodos para preparar una línea de célula de hibridoma incluyen inmunizar ratones Balb inyectando en forma subcutánea y/o intraperitoneal una composición inmunogénica que contiene la proteína de interés (o un fragmento inmunogénico de la misma) varias veces, por ejemplo, cuatro a seis veces, durante varios meses, por ejemplo, entre dos y cuatro meses. Las células de bazo de ratones inmunizados se toman de dos a cuatro días después de la última inyección, y se fusionan con células de la línea de célula de mieloma PAI, en la presencia de un promotor de fusión, preferentemente polietilenglicol. Preferentemente, las células de mieloma se fusionan con un exceso de tres a veinte veces de las células de bazo de los ratones inmunizados en una solución que contiene aproximadamente 30% hasta aproximadamente 50% de polietilenglicol con un peso molecular de alrededor de 4000. Después de la fusión, las células se expanden en un medio de cultivo adecuado tal como se describe supra, se suplementaron con un medio de selección, por ejemplo un medio HAT, en intervalos regulares con el objeto de prevenir que las células de mieloma normales sobrecrezcan las células de hibridoma deseadas.

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser "quiméricos". Los anticuerpos quiméricos y fragmentos de enlace de los mismos comprenden partes de dos o más diferentes especies (por ejemplo, ratón y humano). Los anticuerpos quiméricos pueden ser producidos con regiones variables de ratón de la especificidad deseada, divididos en segmentos de gen de dominio constante humano (por ejemplo, patente Norteamericana No. 4,816,567). En esta forma, se pueden modificar anticuerpos no humanos para ser los más adecuados para aplicación clínica humana (por ejemplo, métodos para tratar o prevenir enfermedad de Degos en un sujeto humano).

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención "formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratón). Los mAbs humanizados o con injerto CDR son particularmente útiles como agentes terapéuticos para humanos, debido a que no se despejan de la circulación tan rápido como los anticuerpos de ratón, y normalmente no provocan una reacción inmune adversa. Los métodos para preparar anticuerpos humanizados son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, la humanización puede ser llevada a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (ver las Publicaciones de Jones y asociados( 1986) Nature 321 :522-525; Riechmann y asociados (1988) Nature 332:323-327; y Verhoeyen y asociados (1988) Science 239: 1534-1536), sustituyendo los CDRs de roedor o secuencias CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. También ver por ejemplo la Publicación de Staelens y asociados (2006) Mol Immunol 43_: 1243-1257. En algunas modalidades, las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratón) son anticuerpos humanos (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de región hipervariable (CDR) del anticuerpo receptor, son reemplazados por residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de enlace deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura de la inmunoglobulina humana también son reemplazados por residuos no humanos correspondientes ("retro mutaciones"). Además, se pueden utilizar bibliotecas de despliegue de fago para variar los aminoácidos en posiciones elegidas dentro de la secuencia de anticuerpo. Las propiedades de un anticuerpo humanizado también se ven afectadas por la elección de la estructura humana. Además, los anticuerpos humanizados y quimerizados pueden ser modificados para comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor, o en el anticuerpo donador, con el objeto de mejorar en forma adicional las propiedades de anticuerpo, tal como, por ejemplo, afinidad o función efectora.

Los anticuerpos completamente humanos también se proporcionan en la presente descripción. El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si están presentes), derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácido no codificados mediante secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro, o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano" no incluye anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en las secuencias de estructura humana (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Los anticuerpos humanos o completamente humanos se pueden derivar de ratones transgénicos que llevan los genes de anticuerpo humano (que llevan los exones variables (V), de diversidad (D), de unión (J) y constantes (C)) o de células humanas. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que tienen la capacidad, al momento de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de una producción de inmunoglobulina endógena. Ver por ejemplo las Publicaciones de Jakobovits y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:2551; Jakobovits y asociados (1993) Nature 362:255-258: Bruggemann y asociados (1993) Year in Immunol 7:33; y Duchosal y asociados (1992) Nature 355:258. Las cepas de ratones transgénicos se pueden construir para contener secuencias de genes de inmunoglobulina humana no reajustados. Las secuencias humanas pueden codificar tanto para cadenas pesadas como ligeras de anticuerpos humanos y pueden funcionar correctamente en los ratones, que pasan por reajuste, para proporcionar un amplio repertorio de anticuerpo similar al de los humanos. Los ratones transgénicos pueden ser inmunizados con la proteína objetivo para crear una formación diversa de anticuerpos específicos y su ARN de codificación. Los ácidos nucleicos que codifican los componentes de la cadena de anticuerpo de dichos anticuerpos, posteriormente pueden ser clonados del animal en un vector de despliegue. Normalmente, se clonan las poblaciones separadas de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de cadena pesada y ligera, y posteriormente se recombinan las poblaciones separadas al momento de la inserción en el vector, de modo que cualquier copia determinada del vector, reciba una combinación aleatoria de una cadena pesada y una ligera. El vector está diseñado para expresar cadenas de anticuerpo, de modo que se pueden ensamblar y desplegar en la superficie externa de paquete de despliegue que contiene el vector. Por ejemplo, las cadenas de anticuerpo pueden ser expresadas como proteínas de fusión con una proteína de recubrimiento de fago desde la superficie externa del fago. Posteriormente, se pueden clasificar paquetes de despliegue para el despliegue de anticuerpos que enlazan a un objetivo.

Además, los anticuerpos humanos se pueden derivar de bibliotecas de despliegue de fago (Hoogenboom y asociados (1991) J Mol Biol 227:381 : Marks y asociados (1991) J Mol Biol, 222:581-597: y Vaughan y asociados (1996) Nature Biotech 14:309 (1996)). Las bibliotecas de fago sintéticas pueden ser creadas las cuales utilizan combinaciones aleatorizadas de regiones-V de anticuerpo humano sintéticas. Mediante la selección en el antígeno, se pueden elaborar anticuerpos completamente humanos en donde las regiones V tienen una naturaleza muy similar a la de los humanos. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 6,794,132, 6,680,209, 4,634,666 y la Publicación Ostberg y asociados (1983), Hybridoma 2_:361-367, cuyos contenidos están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia.

Para la generación de anticuerpos humanos, ver también las Publicaciones de Méndez y asociados (1998) Nature Genetics 1_5:146-156 y Green y Jakobovits (1998) J Exp Med 188:483-495, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Los anticuerpos humanos se describen y delinean en forma adicional en las Patentes Norteamericanas Nos.: 5,939,598; 6,673,986; 6,114,598; 6,075,181; 6,162,963; 6,150,584; 6,713,610; y 6,657,103 así como en las Publicaciones de Patente Norteamericana Nos. 2003-0229905 A1, 2004-0010810 A1, US 2004-0093622 A1, 2006-0040363 A1, 2005-0054055 A1, 2005-0076395 A1, 2005-0287630 A1. Ver también las Publicaciones Internacionales Nos. WO 94/02602, WO 96/34096 y WO 98/24893, y la Patente Europea No. EP 0 463 151 B1. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes y referencias antes mencionadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

En un método alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un método de "minilocus". En el método de minilocus, se mimetiza un locus Ig exógeno a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (preferentemente una región constante gamma) se forman en una construcción para la inserción en un animal. Este método se describe por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos.: 5,545,807; 5,545,806; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; y 5,814,318; 5,591,669; 5,612,205; 5,721,367; 5,789,215; 5,643,763; 5,569,825; 5,877,397; 6,300,129; 5,874,299; 6,255,458; y 7,041,871, cuyas descripciones están incorporadas a la presente invención como referencia. Ver también la Patente Norteamericana No. 0 546 073 B1, las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Ver en forma adicional las Publicaciones de Taylor y asociados (1992) Nucleic Acids Res 20.: 6287; Chen y asociados (1993) Int. Immunol. 5: 647; Tuaillon y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90.: 3720-4; Choi y asociados (1993) Nature Genetics 4: 117; Lonberg y asociados (1994) Nature 368: 856-859; Taylor y asociados (1994) International Immunology 6: 579-591; Tuaillon y asociados (1995) J Immunol 154: 6453-65; Fishwild y asociados (1996) Nature Biotechnology 14: 845; y Tuaillon y asociados (2000) Eur J Immunol. 10: 2998-3005, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

En ciertas modalidades, se proporcionan anticuerpos desinmunizados o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos. Los anticuerpos des-inmunizados o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, son anticuerpos que han sido modificados para convertir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de los mismos en no inmunogénico, o menos inmunogénico, para una especie determinada (por ejemplo, para un humano). La des-inmunización se puede lograr modificando el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas para los expertos en el arte (ver por ejemplo las Publicaciones PCT Nos. WO 04/108158 y WO 00/34317). Por ejemplo, se puede des-inmunizar un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, identificando los epítopes de célula T y/o epitopes de célula B potenciales dentro de la secuencia de aminoácido del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, y eliminando uno o más epítopes de célula T y/o epítopes de célula B potenciales del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, por ejemplo, utilizando técnicas recombinantes. El anticuerpo modificado o fragmento de enlace de antígeno del mismo posteriormente puede ser producido opcionalmente y probado para identificar anticuerpos o, fragmentos de enlace de antígeno del mismo que han tenido una o más actividades biológicas deseadas, tal como por ejemplo, afinidad de enlace, pero tienen inmunogenicidad reducida. Los métodos para identificar los epítopes de célula T y/o epítopes de célula B potenciales, se pueden llevar a cabo utilizando técnicas conocidas en el arte, tal como por ejemplo, métodos de cómputo (ver por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 02/069232), técnicas in vitro o in silico y ensayos biológicos o métodos físicos (tal como, por ejemplo, determinación del enlace de péptidos a moléculas MHC, determinación del enlace de los complejos de péptido: MHC a los receptores de célula T de las especies, para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, probar las partes de proteína o péptido de los mismos, utilizando animales transgénicos con moléculas MHC de la especie para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, o probarse con animales transgénicos reconstituidos con células del sistema inmune de las especies, para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo). En varias modalidades, los anticuerpos desinmunizados aquí descritos incluyen fragmentos de enlace de antígeno des-inmunizados, anticuerpos monoclonales Fab, Fv, scFv, Fab' y F(ab')2, anticuerpos de múrido, anticuerpos diseñados por ingeniería (tal como, por ejemplo, anticuerpos quiméricos de cadena simple de injerto CDR humanizados completamente humanos y anticuerpos seleccionados en forma artificial), anticuerpos sintéticos y anticuerpos semi-sintéticos.

En algunas modalidades, el ADN recombinante que comprende un inserto que codifica para un dominio variable de cadena pesada y/o para un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o un anticuerpo anti-interferón alfa) se produce y transfecta en una célula huésped para expresión del anticuerpo. El término ADN incluye codificar ADNs de hebra simple, ADNs de hebra doble que consisten en los ADNs de codificación de los ADNs complementarios de los mismos, o estos propios ADNs complementarios (hebra simple).

Además, se puede sintetizar en forma enzimática o química un ADN que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos anti-C5, para contener la secuencia de ADN auténtica que codifica para un dominio variable de cadena pesada y/o para el dominio variable de cadena ligera, o mutante del mismo. Un mutante del ADN auténtico, es un ADN que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos antes mencionados, en los cuales se elimina, insertan o intercambian uno o más aminoácidos con uno o más de otros aminoácidos. Preferentemente la modificación(s) están fuera de las CDRs del dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo en aplicaciones de optimización de humanización y expresión. El término ADN mutante también abarca mutantes silentes, en donde uno o más nucleótidos son reemplazados por otros nucleótidos con los nuevos codones que codifican para el mismo aminoácido(s). El término secuencia mutante, también incluye una secuencia de degeneración. Las secuencias de degeneración, se degeneran dentro del significado del código genético, en cuanto a que se reemplaza un número no limitado de nucleótidos, por otros nucleótidos sin dar como resultado un cambio de la secuencia de aminoácido originalmente codificada. Dichas secuencias de degeneración pueden ser útiles debido a sus diferentes sitios de restricción y/o frecuencia de codones particulares que son preferidas por el huésped específico, particularmente E. coli, para obtener una expresión óptima del dominio variable de múrido de cadena pesada y/o dominio variable de múrido de cadena ligera.

El término mutante, está proyectado para incluir un mutante de ADN obtenido mediante mutagénesis in vitro del ADN auténtico de acuerdo con métodos conocidos en el arte.

Para el ensamble de moléculas de ¡nmunoglobulina tetraméricas completas, y la expresión de anticuerpos quiméricos, se fusionan los insertos de ADN recombinante que codifican para los dominios variables de cadena pesada y ligera, con los ADNs correspondientes que codifican para los dominios constantes de cadena pesada y ligera, posteriormente se transfieren en las células huésped adecuadas, por ejemplo después de la incorporación en vectores híbridos.

Otra modalidad pertenece a ADNs recombinantes que codifican para un polipéptido recombinante, en donde el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se enlazan por medio de un grupo espaciador, que comprende opcionalmente una secuencia de señal que facilita el procesamiento del anticuerpo en la célula huésped y/o una secuencia de ADN que codifica un péptido que facilita la purificación del anticuerpo y/o un sitio de disociación y/o un espaciador de péptido y/o un agente. El ADN que codifica para un agente, está proyectado para ser un ADN que codifica para el agente útil en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Por lo tanto, las moléculas del agente que son toxinas o enzimas, especialmente enzimas con la capacidad de catalizar la activación de profármacos, están particularmente indicadas. El ADN que codifica dicho agente, tiene la secuencia de una enzima que ocurre naturalmente o una toxina que codifica ADN, o un muíante de la misma, y se pueden preparar a través de métodos conocidos en el arte.

Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de enlace de antígenos de la descripción, pueden ser anticuerpos descubiertos o fragmentos de enlace de antígeno que no son conjugados para otros agentes, por ejemplo, un agente terapéutico o etiqueta detectable. Como alternativa, el anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace de antígeno, se puede conjugar para un agente tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, una molécula pequeña, una hormona, una enzima, un factor de crecimiento, una citocina, una ribozima, un peptidomimético, un químico, un profármaco, una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de codificación (tal como antisentido, ARNi, construcciones de dirección de gen, etc.) o una etiqueta detectable (por ejemplo, un RMN o un agente de contraste de rayos-X, molécula fluorescente, etc.). En ciertas modalidades, se enlaza un anticuerpo anti-C5 o fragmento de enlace de antígenos (por ejemplo, Fab, Fv, scFv de cadena simple, Fab' y F(ab')2) a una molécula que incrementa la vida media del anticuerpo o fragmento de enlace de antígenos (ver anteriormente).

Están disponibles diversos sistemas de vector posibles para la expresión de genes de cadena pesada y cadena ligera clonados, en células de mamífero. Una clase de vectores depende de la integración de las secuencias de gen deseadas en el genoma de célula huésped. Las células que tienen ADN integrado en forma estable, pueden ser seleccionadas mediante la introducción simultánea de genes de resistencia a fármacos tales como gpt E. coli (Mulligan y Berg (1981) Proc Nati Acad Sci USA, 78:2072) o neo Tn5 (Southern y Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327). El gen marcador seleccionable puede ser cualquiera enlazado a las secuencias de gen de ADN para ser expresado o introducido en la misma célula mediante co-transfección (Wigler y asociados (1979) Cell 1_6:77). Una segunda clase de vectores utiliza elementos de ADN que confieren capacidades de réplica autónoma a un plásmido extracromosomal. Estos vectores se pueden derivar de viruses de animal, tal como papilomavirus de bovino (Sarver y asociados (1982) Proc Nati Acad Sci USA, 79.:7147), virus de polioma (Deans y asociados (1984) Proc Nati Acad Sci USA 8J_:1292), o virus SV40 (Lusky y Botchan (1981) Nature 293:79).

Ya que un cADN de inmunoglobulina está comprendido únicamente de secuencias que representan el mARN maduro que codifica una proteína de anticuerpo, se requieren elementos de expresión de gen adicionales que regulan la transcripción del gen y el procesamiento del ARN, para la síntesis de mARN de inmunoglobulina. Estos elementos pueden incluir señales de división, promotores de transcripción, incluyendo promotores inducibles, aumentadores y señales de terminación. Los vectores de expresión de cADN que incorporan dichos elementos incluyen los descritos por Okayama y Berg (1983) Mol Cell Biol 3:280; Cepko y asociados (1984) Cell 37.: 1053; y Kaufman (1985) Proc Nati Acad Sci USA 82:689.

En las modalidades terapéuticas de la presente descripción, se contemplan anticuerpos biespecíf icos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados que tienen especificidades de enlace para al menos dos diferentes antígenos. En este caso, una de las especificidades de enlace es para una proteína de complemento humana o proteína de interferón alfa, y una es para cualquier otro antígeno.

Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresíón de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello (1983) Nature 305:537-539). Se pueden fusionar dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo al menos una parte de las regiones CH2 y CH3 de articulación. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina, y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se transfectan en conjunto en un organismo huésped adecuado. Para detalles adicionales de los métodos actualmente ilustrativos para generar anticuerpos biespecíficos, ver por ejemplo las Publicaciones de Suresh y asociados (1986) Methods in Enzymology 121:210; Publicación PCT No. WO 96/27011; Brennan y asociados (1985) Science 229:81 ; Shalaby y asociados, J Exp Med (1992) 175:217-225: Kostelny y asociados (1992) J Immunol 148(5): 1547-1553; Hollinger y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90.:6444-6448; Gruber y asociados (1994) J Immunol 152:5368: y Tutt y asociados (1991) J Immunol 147:60. Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o de heteroconjugado. Los anticuerpos de heteroconjugado pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de reticulación convenientes. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente Norteamericana No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación.

También se han descrito diversas técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de célula recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cierres de leucina. Ver por ejemplo la Publicación de Kostelny y asociados (1992) J Immunol 148(5): 1547-1553. Los péptidos de cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun pueden enlazarse a porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión genética. Se pueden reducir homodímeros de anticuerpo en la región de articulación para formar monómeros, y posteriormente re-oxidarlos para formar los heterod ímeros de anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci USA 9_0.:6444-6448, ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH), conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) a través de un enlazador el cual es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se forzan para emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, para formar de esta manera dos sitios de enlace de antígeno. También se ha reportado otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros Fv de cadena simple (svFv). Ver por ejemplo la Publicación de Gruber y asociados (1994) J Immunol 152:5368. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" tal como se describe por ejemplo en la Publicación de Zapata y asociados (1995) Protein Eng. 8(10): 1057- 1062. En síntesis, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd tándem (VH-CH1 -VH-CH1 ) que forman un par de regiones de enlace de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

La descripción también abarca formas variantes de anticuerpos biespecíficos, tal como las moléculas de inmunoglobulina de dominio variable doble tetravalente (DVD-lg) descritas en la de Publicación de Wu y asociados (2007) Nat Biotechnol 25(11 ): 1290-1297. Las moléculas DVD-lg están diseñadas de modo que se enlacen en tándem dos diferentes dominios variables de cadena pesada (VL) de dos diferentes anticuerpos de origen, directamente o a través de un enlazador corto mediante técnicas de ADN recombinante, seguido de un dominio constante de cadena ligera. Los métodos para generar moléculas DVD-lg de dos anticuerpos de origen se describen en forma adicional por ejemplo en las Publicaciones PCT Nos. WO 08/024188 y WO 07/024715, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Composiciones y Formulaciones Farmacéuticas Las composiciones que contienen un inhibidor de complemento (por ejemplo, un inhibidor del componente de complemento humano C5, tal como un anticuerpo anti-C5 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, o un inhibidor de interferón alfa) se pueden formular como una composición farmacéutica, por ejemplo, para la administración a un sujeto para tratar enfermedad de Degos'. Las composiciones farmacéuticas generalmente incluirán un transportador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente invención, un "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a, e incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Las composiciones pueden incluir una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo una sal de adición de ácido o una sal de adición base (ver, por ejemplo, la Publicación de Berge y asociados (1977) J Pharm Sci 66.: 1-19).

Las composiciones se pueden formular de acuerdo con métodos estándar. La formulación farmacéutica es una técnica bien establecida, y se describe en forma adicional por ejemplo en la Publicación de Gennaro (2000) "Remington: Ciencia y Práctica de Farmacia" Edición 20, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel y asociados (1999) "Formas de Dosificación Farmacéutica y Sistemas de Suministro de Fármaco", séptima edición, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); y Kibbe (2000) "Manual de la Asociación Farmacéutica Americana de Excipientes Farmacéuticos", tercera edición (ISBN: 091733096X). En algunas modalidades, se puede formular una composición, por ejemplo, como una solución amortiguada en una concentración adecuada y adecuada para almacenarse a una temperatura de 2 a 8°C. En algunas modalidades, se puede formular una composición para almacenarse a una temperatura debajo de 0°C (por ejemplo, -20°C o -80°C).

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en una variedad de formas. Estas formas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende, en parte, del modo de administración proyectado y la aplicación terapéutica. Por ejemplo, las composiciones que contienen un anticuerpo anti-C5 proyectado para suministro sistémico o local, pueden estar en la forma de soluciones inyectables o infusibles. Por consiguiente, las composiciones se pueden formular para administración a través de un modo parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular). La frase "administración parenteral", "administrado en forma parenteral" y otras frases gramaticalmente equivalentes, tal como se utilizan en la presente invención, se refieren a modos de administración además de administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen sin limitación, inyección intravenosa, intranasal, intraocular, pulmonar, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraspinal, epidural, intracerebral, intracraneal, intracarótida e intraesternal e infusión (ver más adelante).

Las composiciones se pueden formular como una solución, microemulsión , dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para almacenamiento estable a una alta concentración. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando un anticuerpo aquí descrito en la cantidad requerida en un solvente adecuado con una, o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtro. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5) y/o un inhibidor de interferón alfa aquí descrito en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico, y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y secado por congelación que produce un polvo del anticuerpo aquí descrito, más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada estéril previamente de la misma. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de tensoactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede proporcionarse incluyendo en la composición un reactivo que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

En ciertas modalidades, el inhibidor de complemento (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o fragmento de enlace de antígeno del mismo) o inhibidor de interferón alfa, se pueden preparar con un transportador que protegerá al compuesto contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tal como acetato de etilen vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. En la técnica se conocen muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones. Ver por ejemplo la Publicación de J.R. Robinson (1978) "Sistemas de Suministro de Fármacos de Liberación Sostenida y Controlada", Marcel Dekker, Inc., Nueva York.

En algunas modalidades, se puede formular un inhibidor aquí descrito en una composición adecuada para administración intrapulmonar (por ejemplo, para administración mediante nebulizador) a un mamífero, tal como un humano. Los métodos para preparar dichas composiciones son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20080202513; en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,112,341 y 6,019,968; y en las Publicaciones PCT Nos. WO 00/061178 y WO 06/122257, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Las formulaciones de inhalador de polvo seco y sistemas adecuados para la administración de formulaciones se describen por ejemplo en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20070235029, en la Publicación PCT No. WO 00/69887; y en la Patente Norteamericana No. 5,997,848.

En algunas modalidades, un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o fragmento de enlace de antígeno del mismo) o inhibidor de interferón alfa aquí descrito se puede modificar, por ejemplo, con una porción que mejora su estabilización y/o retención en la circulación, por ejemplo, en sangre, suero u otros tejidos. La porción de estabilización puede mejorar la estabilidad, o retención del anticuerpo en al menos 1.5 (por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, o 50 o más) veces.

Los inhibidores de ácido nucleico del complemento humano aquí descritos (por ejemplo, un ácido nucleico antisentido o siARN) se pueden incorporar en una construcción de gen que será utilizada como una parte de un protocolo de terapia genética, para suministrar ácidos nucleicos que se pueden utilizar para expresar y producir agentes dentro de las células. Se pueden administrar construcciones de expresión de dichos componentes en cualquier transportador biológicamente efectivo, por ejemplo, cualquier formulación o composición con la capacidad de suministrar en forma efectiva el gen componente a las células in vivo. Los métodos incluyen inserción del gen en cuestión en vectores virales que incluyen retroviruses recombinantes, adenovirus, virus asociado-adeno, lentivirus y virus de herpes simple-1 (HSV-1), o plásmidos eucarióticos o bacterianos recombinantes. Los vectores virales pueden transfectar células directamente; el ADN de plásmido puede ser suministrado con la ayuda, por ejemplo, de liposomas catiónicos (lipofectina) o derivado (por ejemplo, conjugado con anticuerpo), conjugados de polilisina, gramicidina S, envolturas virales artificiales u otros transportadores intracelulares, así como inyección directa de la construcción de gen o precipitación de CaP04 llevada a cabo in vivo. (Ver también, la sección de "Métodos Ex Vivo" que se encuentra más adelante). Los ejemplos de retroviruses adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM los cuales son conocidos por los expertos en la técnica (ver por ejemplo, las Publicaciones de Eglitis y asociados (1985) Science 230: 1395-1398; Danos y Mulligan (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:6460-6464; Wilson y asociados (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:3014-3018: Armentano y asociados (1990) Proc Nati Acad Sci USA 87:6141-6145; Huber y asociados (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:8039-8043; Ferry y asociados (1991) Proc Nati Acad Sci USA 8_8.:8377-8381 ; Chowdhury y asociados (1991) Science 254: 1802-1805; van Beusechem y asociados (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:7640-7644; Kay y asociados (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai y asociados (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89.: 10892-10895; Hwu y asociados (1993) J Immunol 150:4104-4115; las Patentes Norteamericanas Nos. 4,868,116 y 4,980,286; las Publicaciones PCT Nos. WO89/07136, WO89/02468, WO89/05345 y WO92/07573). Otro sistema de suministro de gen viral utiliza vectores derivados de adenovirus (ver por ejemplo las Publicaciones de Berkner y asociados (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld y asociados (1991) Science 252:431-434: y Rosenfeld y asociados (1992) Cell 68.: 143-155). Los vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son conocidos para los expertos en la técnica. Aún otro sistema de vector viral útil para el suministro del gen en cuestión es el virus asociado-adeno (AAV). Ver por ejemplo las Publicaciones de Flotte y asociados (1992) Am J Respir Cell Mol Biol 7:349-356; Samulski y asociados (1989) J Virol 6_3:3822-3828; y McLaughlin y asociados (1989) J Virol 62.: 1963-1973.

En algunas modalidades, más de uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o 10 o más) inhibidor(es) (por ejemplo, uno o más inhibidores de C5) humano se pueden formular juntos. Por ejemplo, se pueden formular juntos un siARN específico de C5 y un anticuerpo anti-C5.

En algunas modalidades, un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un inhibidor de complemento humano tal como un anticuerpo anti-C5 o fragmento de enlace de antígeno del mismo) o inhibidor de interferón alfa aquí descritos, se pueden formular con uno o más agentes activos adicionales útiles para tratar la enfermedad de Degos o aliviar un síntoma de la misma. Por ejemplo, se puede formular un anticuerpo anti-C5 con un agente inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores incluyen, por ejemplo, corticoesteroides, fenilbutazona, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, tacrolimus, y mofetil de micofenolato, ciclofosfamida, y un agente anti-CD20, tal como rituximab (Rituxan™; Biogen Idee, Cambridge, MA). En algunas modalidades, el inhibidor de complemento humano se puede formular para administración a un sujeto, junto con terapia de inmunoglobulina intravenosa (IVIG), transfusión de glóbulos rojos, plasmaferesis, o con intercambio de plasma. Ver, por ejemplo, la publicación de Dyrsen y asociados. (2008), supra y Zhu y asociados. (2007), supra.

En algunas modalidades, el inhibidor de complemento humano se puede formular para terapia de articulaciones (por ejemplo, en forma simultánea o concurrente) con un agente antitrombótico y/o anticoagulante, tal como, pero sin limitarse a, clopidogrel, aspirina, dipiridamol, warfarina (Coumadin), heparina, fenindiona, fondaparinux, idraparinux, e inhibidores de trombina (por ejemplo, argatroban, lepirudin, bivalirudin, o dabigatran). También se puede formular un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5), para utilizarse con un agente fibrinolítico (por ejemplo, ancrod, ácido e-aminocaproico, antiplasmin-a! , prostaciclina, y defibrotida) para el tratamiento de la enfermedad de Degos.

En algunas modalidades, por ejemplo, en donde la enfermedad de Degos está asociada con una infección, el inhibidor de complemento humano y/o el inhibidor de interferón alfa se puede formular con uno o más agentes para utilizarse en el tratamiento de una infección. Por ejemplo, se puede formular un inhibidor C5 con un antibiótico o agente anti-viral.

Cuando el inhibidor de complemento humano será utilizado en combinación con un segundo agente activo, o cuando se utilizarán dos o más inhibidores de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 y un anticuerpo anti-factor B), los agentes se pueden formular por separado o en conjunto. Por ejemplo, se pueden mezclar composiciones farmacéuticas respectivas, por ejemplo, justo antes de la administración, y administrarse juntas o se pueden administrar por separado, por ejemplo, al mismo tiempo o en tiempos diferentes (ver más adelante).

De igual manera, cuando el inhibidor de interferón alfa (por ejemplo, un anticuerpo anti-interferón alfa) será utilizado en combinación con un segundo agente activo, o cuando dos o más inhibidores de interferón alfa serán utilizados, los agentes se pueden formular por separado o juntos.

Tal como se describió anteriormente, se puede formular una composición de modo que incluya una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) o la composición se puede formular para incluir una cantidad sub-terapéutica del inhibidor y una cantidad sub-terapéutica de uno o más agentes activos adicionales, de modo que los componentes en total, sean terapéuticamente efectivos para tratar la enfermedad de Degos. En algunas modalidades, se puede formular una composición para incluir dos o más inhibidores de complemento humano, cada uno en dosis sub-terapéuticas, de modo que los inhibidores en total, estén en una concentración que sea terapéuticamente efectiva para tratar la enfermedad de Degos. Se puede formular una composición de modo que incluya una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de interferón alfa (por ejemplo, un anticuerpo anti-interferón alfa o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) o la composición se puede formular para incluir una cantidad su b-terapéutica del inhibidor y una cantidad sub-terapéutica de uno o más agentes activos adicionales, de modo que los componentes en total, sean terapéuticamente efectivos para tratar la enfermedad de Degos. En algunas modalidades, se puede formular una composición para incluir dos o más inhibidores de interferón alfa, cada una en dosis sub-terapéuticas, de modo que los inhibidores en total, estén en una concentración que sea terapéuticamente efectiva para tratar la enfermedad de Degos. En algunas modalidades, la composición incluye un inhibidor de complemento humano y un inhibidor de interferón alfa. Los métodos para determinar una dosis terapéuticamente efectiva (por ejemplo, una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-C5 o un anticuerpo anti-interferón), son conocidos en la técnica y se describen en la presente invención .

Métodos de Tratamiento Las composiciones antes descritas son útiles, entre otras cosas, en métodos para tratar o prevenir una enfermedad de Degos en un sujeto (por ejemplo, un humano). Las composiciones se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, utilizando una variedad de métodos que dependen, en parte, de la ruta de administración. La ruta puede ser, por ejemplo, inyección o infusión intravenosa (IV), inyección subcutánea (SC), intraperitoneal (IP), o inyección intramuscular.

La administración se puede lograr, por ejemplo, mediante infusión local, inyección, o por medio de un implante. El implante puede ser de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tal como membranas sialásticas, o fibras. El implante puede configurarse para la liberación sostenida o periódica de la composición al sujeto. (Ver, por ejemplo, la Publicación de Patente Norteamericana No. 20080241223; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,501,856; 4,863,457; y 3,710,795; la Patente Europea EP 488401; y la Patente Europea EP 430539, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia). La composición se puede administrar al sujeto por medio de un dispositivo implantable basado en, por ejemplo, sistemas de difusión, erosionables, o convectivos, por ejemplo, bombas osmóticas, implantes biodegradables, sistemas de electrodif usión , sistemas de electro-osmosis, bombas de presión de vapor, bombas electrolíticas, bombas efervescentes, bombas piezoeléctricas, sistemas a base de erosión, o sistemas electromecánicos.

Una dosis adecuada de un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o fragmento del mismo) o un inhibidor de interferón alfa (por ejemplo, un anticuerpo anti-interferón alfa), en donde la dosis tiene la capacidad de tratar o prevenir la enfermedad de Degos en un sujeto, puede depender de una variedad de factores que incluyen, por ejemplo, la edad, sexo, y peso del sujeto que será tratado y el compuesto inhibidor utilizado en particular. Por ejemplo, se puede requerir una dosis diferente de un siARN específico de C5 humano para tratar a un sujeto con la enfermedad de Degos, en comparación con la dosis de un anticuerpo anti-C5 requerido para tratar al mismo paciente. Otros factores que afectan la dosis administrada al sujeto incluyen, por ejemplo, el tipo o severidad de la enfermedad de Degos. Por ejemplo, un sujeto que tiene una forma cutánea de la enfermedad de Degos, puede requerir administración de una diferente dosis del inhibidor, a la de un sujeto con una forma sistémica de la enfermedad de Degos. Otros factores pueden incluir, por ejemplo, otros trastornos médicos que afectan en forma concurrente o previa al sujeto, la salud general del sujeto, la disposición genética del sujeto, la dieta, tiempo de administración, rango de excreción, combinación de fármaco, y cualesquiera otros terapéuticos adicionales que se administren al sujeto. También deberá quedar entendido que una dosis o régimen de tratamiento específico para cualquier sujeto en particular, dependerá del juicio del practicante médico tratante (por ejemplo, doctor o enfermera).

El inhibidor se puede administrar como una dosis fija, o en una dosis de miligramo por kilogramo (mg/kg). En algunas modalidades, la dosis también se puede elegir para reducir o evitar la producción de anticuerpos u otras respuestas inmune del huésped contra uno o más agentes activos que se encuentran en la composición. Aunque no se pretende la limitación en forma alguna, las dosis de ejemplo de un inhibidor de complemento (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5) y/o un inhibidor de interferón alfa incluyen, por ejemplo, 1-100 pg/kg, 0.5-50 pg/kg, 0.1-100 pg/kg, 0.5-25 pg/kg, 1-20 pg/kg, y 1-10 pg/kg, 1-100 mg/kg, 0.5-50 mg/kg, 0.1-100 mg/kg, 0.5-25 mg/kg, 1-20 mg/kg, y 1-10 mg/kg. Las dosis de ejemplo de un anticuerpo aquí descrito incluyen, sin limitación, 0.1 pg/kg, 0.5 pg/kg, 1.0 pg/kg, 2.0 pg/kg, 4 pg kg, y 8 pg/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4 mg/kg, y 8 mg/kg.

En algunas modalidades, a un humano se le puede administrar en forma intravenosa un anticuerpo anti-C5 (por ejemplo, eculizumab) en una dosis de aproximadamente 900 mg aproximadamente cada 12 (por ejemplo, aproximadamente cada 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 30, 42, o 49 o más) días. Ver, por ejemplo, la publicación de Hill y asociados. (2005) Blood ±061212559.

En algunas modalidades, a un humano se le puede administrar en forma intravenosa un anticuerpo anti-C5 (por ejemplo, eculizumab) en una dosis de aproximadamente 600 (por ejemplo, de aproximadamente 625, 650, 700, 725, 750, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, o 1,000 o más) mg cada semana, opcionalmente, durante dos o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, u ocho o más) semanas. Después del tratamiento inicial, al humano se le puede administrar el anticuerpo en una dosis de aproximadamente 900 mg aproximadamente cada 14 (por ejemplo, aproximadamente cada 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 30, 42, o 49 o más) días, por ejemplo, como una dosis de mantenimiento. Ver, por ejemplo, las publicaciones de Hillmen y asociados. (2004) N Engl J Med. 350(6): 552-9 y Dmytrijuk y asociados. (2008) The Oncologist 13(9): 993.

Una composición farmacéutica puede incluir una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor del componente de complemento humano C5 (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o fragmento de enlace de antígeno del mismo) y/o una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de interferón alfa. Dichas cantidades efectivas pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica, con base, en parte, en el efecto del inhibidor administrado, o el efecto de combinación del anticuerpo y uno o más agentes activos adicionales, si se utiliza más de un agente. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5) también puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo (y uno o más agentes activos adicionales) de desarrollar una respuesta deseada en el individuo, por ejemplo, alivio de al menos un parámetro de condición, por ejemplo, alivio de al menos un síntoma de la enfermedad de Degos. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5) puede inhibir (disminuir la severidad de, o eliminar el surgimiento de) y/o prevenir la enfermedad de Degos, y/o cualesquiera de los síntomas de la enfermedad de Degos conocidos en la técnica, o aquí descritos. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales de la composición, son sobrepasados por los efectos terapéuticamente benéficos.

Los términos "cantidad terapéuticamente efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva", o términos similares aquí utilizados, pretenden significar una cantidad de un agente (por ejemplo, un inhibidor de complemento humano) que desarrollará la respuesta médica o biológica deseada (por ejemplo, una mejoría en uno o más síntomas de la enfermedad de Degos). En algunas modalidades, un componente aquí descrito contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor del componente de complemento humano C5. En algunas modalidades, una composición aquí descrita contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a una proteína de componente de complemento C5. En algunas modalidades, la composición contiene dos o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, u 11 o más) diferentes inhibidores de complemento humano, de modo que la composición, como una totalidad, es terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, una composición puede contener un anticuerpo que enlaza a una proteína C5 humana, y un siARN que enlaza a, y promueve la degradación de, un mARN que codifica la proteína C5 humana, en donde el anticuerpo y siARN cada uno están en una concentración que cuando se combinan son terapéuticamente efectivos. En algunas modalidades, la composición contiene el inhibidor y uno o más segundos agentes activos, de modo que la composición, como una totalidad, es terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, la composición puede contener un anticuerpo que enlaza a una proteína C5 humana, y otro agente útil para tratar o prevenir la enfermedad de Degos.

En algunas modalidades, una composición aquí descrita contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-interferón alfa o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

Se puede determinar la toxicidad y la eficacia terapéutica de dichas composiciones, mediante procedimientos farmacéuticos conocidos en cultivos celulares o animales experimentales. Estos procedimientos se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción LD50/ED5o. Las composiciones, o inhibidores de complemento (por ejemplo, anticuerpos anti-C5) de las composiciones, que exhiben altos índices terapéuticos, son las preferidas. Aunque se pueden utilizar composiciones que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado, y minimice el daño potencial a células normales, y de esta forma, reduzca los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales, se pueden utilizar para formular un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de dichos inhibidores, se encuentra generalmente dentro de un rango de concentraciones en circulación del inhibidor(es) (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5, un anticuerpo anti-interferón alfa, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos) que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para un inhibidor del componente de complemento humano C5 (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5) utilizado tal como se describe en la presente descripción (por ejemplo, para tratar o prevenir la enfermedad de Degos), se puede estimar inicialmente la dosis terapéuticamente efectiva a partir de los ensayos de cultivo celular. Los niveles de inhibidor de complemento, por ejemplo, en el plasma de humanos o animales tratados se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto desempeño.

En algunas modalidades, la dosis requerida de un inhibidor de complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5) se puede determinar con base en la concentración de la proteina de complemento en la sangre del sujeto al cual se dirige el inhibidor. Por ejemplo, un sujeto que tiene una mayor concentración de niveles de proteína C5 humana en la circulación, puede requerir una mayor dosis del inhibidor C5 humano, que un sujeto que tiene menores niveles de C5 humana en la circulación. Los métodos para determinar la concentración del complemento humano en la muestra de fluido derivada de la sangre del sujeto, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, en la publicación de Rawal y asociados. (1998) J Biol Chem 273(27): 16828-16835 se describe un método para determinar los niveles C5 en suero.

Un "sujeto", tal como se utiliza en la presente invención, puede ser cualquier mamífero. Por ejemplo, un sujeto puede ser un humano, un primate no humano (por ejemplo, mono, baboon, o chimpancé), un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato, un conejo, un cerdo de guinea, un gerbo, un hámster, una rata, o un ratón. En algunas modalidades, el sujeto es un niño (por ejemplo, un niño humano).

En algunas modalidades, el sujeto es uno que es refractario a cualesquiera de uno o más agentes terapéuticos adicionales que fueron administrados para tratar la enfermedad de Degos.

La "resistencia" a una terapia, "refractario" a terapia, y frases gramaticales similares, tal como se utiliza en la presente invención, se refieren a un estado clínico del paciente, en el cual existe una reducción en la efectividad de una terapia determinada para tratar o curar un trastorno determinado (por ejemplo, la enfermedad de Degos) o una reducción en la efectividad del tratamiento para aliviar uno o más síntomas asociados con el trastorno. Por ejemplo, los beneficios terapéuticos de IV I g a un paciente que padece de la enfermedad de Degos, pueden disminuir con el tiempo, de modo que la enfermedad permanezca o progrese incluso con la terapia IVIg. Ver, por ejemplo, la publicación de De Breucker y asociados. (2008), supra.

Tal como se utiliza en la presente invención, un sujeto que "necesita prevención", "necesita tratamiento", o "necesita del mismo", se refiere a uno, quien a través del juicio de un practicante médico adecuado (por ejemplo, un doctor, una enfermera, o un practicante de enfermera en el caso de humanos; un veterinario en el caso de mamíferos no humanos), puede beneficiarse en forma razonable de un tratamiento determinado (tal como un tratamiento con una composición que comprende un inhibidor del complemento humano o un inhibidor de interferón alfa).

Tal como se utiliza en la presente invención, un sujeto "en riesgo de desarrollar la enfermedad de Degos" es un sujeto que tiene uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, u ocho o más) factores de riesgo de desarrollar el trastorno. Los factores de riesgo de la enfermedad de Degos son bien conocidos en la técnica de la medicina e incluyen, por ejemplo, una predisposición a desarrollar la condición, es decir, un historial familiar de la condición o un estado genético asociado con la enfermedad de Degos, tal como, por ejemplo, una deficiencia de Proteína S. Ver, por ejemplo, la publicación de Gileberte y asociados. (2005) Br J Dermatol 153(3): 666-7. Los factores de riesgo para la enfermedad de Degos también incluyen las condiciones que están asociadas con la enfermedad de Degos, tal como, pero sin limitarse a, infecciones virales (por ejemplo, VIH o infecciones de parvovirus B19), un estado procoagulante (por ejemplo, Leiden Factor V), o una enfermedad autoinmune tal como LE, dermatomiositis, escleroderma, síndrome antifosfolípido. En lo sucesivo, dichas manifestaciones de la enfermedad de Degos pueden ser, cuando sea adecuado, referidas como por ejemplo, "enfermedad de Degos asociada con infección" o "enfermedad de Degos asociada con sistema autoinmune". De lo anterior, quedará claro que los sujetos "en riesgo de desarrollar la enfermedad de Degos", no todos son sujetos dentro de una especie de interés.

Un sujeto "que se sospecha tiene la enfermedad de Degos", es uno. que tiene uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o 10 o más) síntomas de la condición. Los síntomas de la condición son conocidos por los expertos en la técnica de la medicina e incluyen, por ejemplo, lesiones de la piel (por ejemplo, una o más pápulas que surgen o son color piel o rosa, en donde la pápulas progresan a cicatrices oprimidas con centros blancos y eritema y telangiectasis circundante), sangrado gastrointestinal, vómito, fístula enterocutánea, síntoma neurológico (por ejemplo, paraestesia facial y acral, dolores de cabeza, mareos, afagia, paraplegia, parálisis de mirada, epilepsia, pérdida de memoria, o sensación alterada), ataques, diplopia, ptosis, defecto del campo visual, debilidad, acortamiento de la respiración, y dolor en el pecho. En algunas modalidades, la enfermedad de Degos está asociada con la presencia en pacientes de anticuerpos de anticardiolipina, el anticoagulante de lupus, anticuerpos antifosfolípidos, o deposición de IgA vascular. Ver, por ejemplo, las publicaciones de Englert y asociados. (1984), supra; Crowson y asociados. (2002), supra; y Grattan y Burton (1991) Semin Dermatol 10(3): 152-159. De lo anterior, quedará claro que los sujetos "que se sospecha tienen la enfermedad de Degos", no todos son sujetos dentro de una especie de interés.

En algunas modalidades, los métodos pueden incluir identificar al sujeto como uno que tiene, se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Degos. Los métodos adecuados para identificar al sujeto son conocidos en la técnica. Por ejemplo, Ackerman describe un método histológico para identificar en forma positiva una lesión cutánea asociada con la enfermedad de Degos. Am J Dermatopathol (1985) 7(2): 105-7. Tal como se describió anteriormente, la enfermedad de Degos puede estar asociada con la presencia en los pacientes de anticuerpos de anticardiolipina, el anticoagulante de lupus, y/o anticuerpos antifosfolípidos. Los métodos histológicos de diagnóstico, también son ejemplificados en los ejemplos de operación. Los métodos adecuados para detectar la presencia de estos anticuerpos en la sangre de un paciente son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación de Caux y asociados. (1994) Ann Dermatol Venereol 121: 537-542. En algunas modalidades, la enfermedad de Degos puede estar asociada con la deposición IgA dentro de la vasculatura cutánea. Los métodos para detectar dicha deposición son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la publicación de Crowson y asociados. (2002), supra.

Además, tal como se describe en los ejemplos de operación, la enfermedad de Degos puede estar asociada con deposición C5b-9 MAC vascular prominente, así como niveles elevados en suero de proteína reactiva C y factor VIII. Los métodos para detectar cada uno de estos parámetros son ejemplificados en la presente invención.

En algunas modalidades, la composición se puede administrar a un sujeto en forma profiláctica para evitar el progreso de la forma benigna de la enfermedad de Degos a la forma sistémica, de órganos múltiples de la enfermedad. Por ejemplo, un sujeto quien tiene una forma cutánea de la enfermedad de Degos, se le puede administrar una composición aquí descrita para evitar o disminuir la probabilidad de desarrollar en el paciente la forma sistémica, letal de la enfermedad de Degos. En forma similar, un sujeto que tiene una infección parvoviral B19 asociada con la enfermedad de Degos, una infección de VIH, o una enfermedad autoinmune, se le puede administrar una composición aquí descrita, para evitar o disminuir la probabilidad del desarrollo de la enfermedad de Degos en el paciente.

El término "prevenir" es reconocido en la técnica, y cuando se utiliza en relación con una condición, quedará bien entendido en la técnica, que incluye la administración de una composición que reduce la frecuencia de, o retarda el desarrollo de, síntomas de una condición médica en un sujeto, relativos a un sujeto quien no recibe la composición. Por lo tanto, la prevención de la enfermedad de Degos incluye, por ejemplo, disminuir el progreso de la forma benigna de la enfermedad de Degos a la forma sistémica, de órganos múltiples de la enfermedad en una población de pacientes que reciben un tratamiento profiláctico relativo a una población de control no tratada, y/o reducir la severidad y/o retardar el desarrollo del uno o más síntomas de la enfermedad en una población tratada versus una población de control no tratada, por ejemplo, a través de una cantidad estadística y/o clínicamente significativa.

En algunas modalidades, el inhibidor del complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) y/o el inhibidor de interferón alfa se puede administrar a un sujeto como una monoterapia. Como alternativa, tal como se describe anteriormente, el inhibidor puede ser administrado a un sujeto como una terapia de combinación con otro tratamiento, por ejemplo, otro tratamiento para la enfermedad de Degos. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir administrar al sujeto (por ejemplo, un paciente humano) uno o más agentes adicionales (por ejemplo, agentes anti-coagulantes o anti-inflamatorios) que proporcionan un beneficio terapéutico al sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Degos. En algunas modalidades, el inhibidor del complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5) o inhibidor de interferón alfa y el uno o más agentes activos adicionales, se administran al mismo tiempo. En otras modalidades, el inhibidor se administra primero en tiempo, y uno o más agentes activos adicionales se administran después. En algunas modalidades, el uno o más agentes activos adicionales se administran primero en tiempo, y el inhibidor se administra después.

El inhibidor del complemento humano o inhibidor de interferón alfa, pueden reemplazar o aumentar una terapia administrada en forma previa o actual. Por ejemplo, al momento del tratamiento con un anticuerpo anti-C5 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, la administración del uno o más agentes activos adicionales puede terminar o disminuir, por ejemplo, se puede administrar en niveles menores. En algunas modalidades, se mantiene la administración de la terapia previa. En algunas modalidades, se mantendrá una terapia previa hasta que el nivel del inhibidor del complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5) o inhibidor de interferón alfa, alcance un nivel suficiente para proporcionar un efecto terapéutico. Las dos terapias se pueden administrar en combinación.

El monitoreo de un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) para la mejoría de una enfermedad de Degos, tal como aquí se define, significa evaluar al sujeto con respecto a un cambio en un parámetro de la enfermedad, por ejemplo, una mejoría en uno o más síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, un practicante médico puede revisar el grado de deposición C5b-9 MAC vascular, antes y después del tratamiento, utilizando un inhibidor de complemento aquí descrito. Dichos síntomas incluyen cualesquiera de los síntomas de la enfermedad de Degos aquí descritos. En algunas modalidades, la evaluación se lleva a cabo al menos 1 hora, por ejemplo, al menos 2, 4, 6, 8, 12, 24, o 48 horas, o al menos 1 día, 2 días, 4 días, 10 días, 13 días, 20 días o más, o al menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 10 semanas, 13 semanas, 20 semanas o más, después de una administración. El sujeto puede ser evaluado en uno o más de los siguientes períodos: antes del comienzo del tratamiento; durante el tratamiento; o después de que se haya administrado uno o más elementos. La evaluación puede incluir evaluar la necesidad del tratamiento adicional, por ejemplo, evaluar si se debe alterar la dosificación, frecuencia de administración, o duración del tratamiento. También puede incluir evaluar la necesidad de agregar o eliminar una modalidad terapéutica seleccionada, por ejemplo, agregar o eliminar cualesquiera de los tratamientos para la enfermedad de Degos aquí descritos.

Metodologías ex vivo. Cuando el inhibidor del complemento humano o inhibidor de interferón alfa es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) o un ácido nucleico (por ejemplo, un siARN o ácido nucleico anti-sentido), una estrategia ex vivo para tratar o prevenir la enfermedad de Degos, puede implicar transfectar o translucir una o más células obtenidas de un sujeto con un polinucleótido que codifica la proteína o ácido nucleico. Por ejemplo, las células pueden ser transfectadas con un vector simple que codifica una cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-C5 o las células pueden ser transfectadas con un primer vector que codifica una cadena pesada y un segundo vector que codifica una cadena ligera del anticuerpo.

Posteriormente, las células transfectadas o transducidas son regresadas al sujeto. Las células pueden ser cualquiera de un amplio rango de tipos, incluyendo, sin limitación, células hematopoyéticas (por ejemplo, células de médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, células T, o células B), fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, o células de músculo. Dichas células pueden actuar como una fuente (por ejemplo, fuente sostenida o periódica) del inhibidor de complemento (por ejemplo, el anticuerpo anti-C5 o fragmento de enlace de antígeno del mismo, o siARN anti-C5) o un inhibidor de interferón alfa durante tanto conforme sobrevivan en el sujeto. En algunas modalidades, los vectores y/o células se pueden configurar para la expresión inducible o reprimible del anticuerpo (ver, por ejemplo, la publicación de Schockett y asociados. (1996) Proc Nati Acad Sci EUA 93: 5173-5176 y la Patente Norteamericana No. 7,056,897).

Preferentemente, las células se obtienen del sujeto (autólogo), pero se pueden obtener potencialmente de un sujeto de la misma especie además de la del sujeto (alogeneica).

Los métodos adecuados para obtener células de un sujeto y transducir o transfectar células son conocidos en la técnica de la biología molecular. Por ejemplo, el paso de transducción se puede lograr a través de cualesquiera medios estándar utilizados para la terapia genética ex vivo, incluyendo fosfato de calcio, lipofección, electroporación, infección viral (ver anteriormente), y transferencia biolística de gen. Ver, por ejemplo, las publicaciones de Sambrook y asociados, (supra) y Ausubel y asociados. (1992) "Protocolos Actuales en Biología Molecular", Greene Publishing Associates. Como alternativa, se pueden utilizar liposomas o micropartículas poliméricas. Se pueden seleccionar las células que han sido transducidas en forma exitosa, por ejemplo, para la expresión de la secuencia de codificación o de un gen de resistencia a fármacos.

EQUIPOS La descripción también presenta artículos de fabricación o equipos, que incluyen un contenedor con una etiqueta; y una composición que contiene uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o 10 o más) inhibidor(es) del complemento humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 o fragmento de enlace de antígeno del mismo) y/o uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o 10 o más) inhibidores de interferón alfa (por ejemplo, un anticuerpo anti-interferón alfa). La etiqueta indica que la composición será administrada a un sujeto (por ejemplo, un humano) que tiene, se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Degos. El equipo puede, opcionalmente, incluir un medio para administrar la composición al sujeto. Por ejemplo, los equipos pueden incluir una o más jeringas.

En algunas modalidades, los equipos pueden contener dos o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o 10 o más) diferentes tipos de inhibidores de complemento humano. Por ejemplo, un equipo puede contener un anticuerpo anti-C5 (o fragmento de enlace de antígeno del mismo) y un siARN que enlaza a un mARN que codifica una proteína C5 humana. En algunas modalidades, El equipo puede contener un anticuerpo anti-C5, un siARN, y un inhibidor de molécula pequeña del complemento.

En algunas modalidades, los equipos pueden incluir además uno o más agentes activos adicionales, tal como cualesquiera de los aquí descritos. Por ejemplo, los equipos pueden incluir uno o más agentes anti-coagulantes, antitrombóticos, o anti-inflamatorios. Los equipos también pueden incluir una o más terapias dirigidas mediante célula B, tal como un anticuerpo anti-CD20. Los equipos pueden incluir opcionalmente uno o más medios para detectar la presencia de anticuerpos de anti-cardiolipina, el anticoagulante de lupus, anticuerpos de antifosfolípidos, y/o deposición IgA vascular.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, no limitar la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1. Materiales y Métodos Microscopio de luz de rutina. Secciones de cinco mieras de grosor de tejido fijado en formalina, incrustado en parafina, se mancharon con hematoxilina y eosina, y se revisaron mediante microscopio de luz convencional.

Evaluación inmunohistoquímica para MxA. Se colocaron las rodajas para utilizarse en detección de proteína MxA en retenedores Tissue Tek Slide Holders y platos de manchado (Miles, Elkhart, IL), y se sumergieron en 200 mL de amortiguador EDTA, pH 8.0 (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). Después de un período de incubación de 30 minutos con los anticuerpos primarios, se llevó a cabo el manchado utilizando el equipo comercialmente disponible Vision BioSystems Define Kit, apegándose al protocolo. La incubación con los anticuerpos primarios se llevó a cabo utilizando las siguientes diluciones: anticuerpo antí-MxA 1:1600. Se realizó una evaluación semi-cualitativa con respecto al grado de manchado, con base en un porcentaje aproximado de células manchadas para un marcador particular, así como la distribución del manchado a través de la rodaja. Las rodajas fueron deslizadas en la cubierta utilizando un sistema Shandon Cónsul®-Mount Histology (Producto No. 9990440) en un deslizador de cubierta automático Cónsul (ThermoShandon, Pittsburgh, PA). Ver, la publicación de Magro y asociados. (2009) J Cutan Pathol (4 de noviembre, encabezado de impresión de la publicación electrónica; PMID: 19891658).

Estudios de inmunofluorescencia en tejido. Se llevaron a cabo los siguientes estudios de inmunofluorescencia (tal como se describen en la publicación de Crowson y Magro (1996) Human Pathol 27.: 15-19), en material de biopsia de piel obtenido en el medio de transporte de Michael y almacenado subsecuentemente a una temperatura de -30°C. Se llevaron a cabo estudios de inmunofluorescencia directa (DIF) para inmunoglobulina G (IgG), IgA, IgM, fibrina, y componente de complemento C3 (DAKO, Carpintería, CA, EUA) en piel con lesión mediante la colocación de anticuerpos primarios conjugados con fluoresceína en secciones de biopsia individuales. Se utilizó una metodología de inmunofluorescencia indirecta (IF) con anticuerpo anti-ratón de conejo conjugado con fluoresceína, para detectar la presencia de C5b-9 MAC (DAKO), por medio de su enlace a un anticuerpo anti-C5b-9 primario contactado inicialmente con una sección de biopsia.

Microscopio de electrones. Se colocó el tejido de biopsia de piel en una fijación de glutaraldehído para revisión ultraestructural.

Cultivo celular para inmunof luorescencia indirecta y estudios de manchado Western. Se cultivaron células endoteliales microvasculares de sangre dérmica, humanas neonatales, HMVEC-dBINeo (Lonza, Walkersville, MD), a una temperatura de 37°C en un medio completo (Medio EGM®-2 Basal suplementados con reactivos EGM®-2 MV BulletKit® y 5% de Premium FBS) (Lonza) con 5% de C02- Las células se cultivaron durante un tiempo suficiente para alcanzar del 75% al 80% de confluencia en los frascos de cultivo. Posteriormente, las células se lavaron con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) caliente, y se recolectaron utilizando una solución de 1X tripsina-EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Después de un lavado adicional con PBS, las células se volvieron a revestir en un medio complete calentado previamente sobre rodajas de la cámara de cultivo de tejido (Nunc Lab-Tek™ Chamber Slide System, 2 depósitos en Permanox™, Sigma-Aldrich) a una densidad de 2 x 104 células/mL. Las rodajas de la cámara fueron cultivadas durante 24 horas a una temperatura de 37°C con 5% de C02, tiempo después del cual se desechó el medio. Después de la eliminación del medio, se eliminaron las rodajas de cada cámara, se enjuagaron en PBS, y posteriormente se secaron con aire en combinación con toallas de papel para eliminar el PBS en exceso. Las rodajas secas posteriormente fueron almacenadas a una temperatura de -80°C en un contenedor hermético hasta que se revisaron utilizando el microscopio de inmunofluorescencia.

Estudios de Manchado Western. Se lisaron células HMVEC-dBINeo cultivadas utilizando un amortiguador de lisis que consiste en 0.05M de fluoruro de sodio, 1% de Tritón X-100, 50 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 150 mM de NaCI, 1 mM de ortovanadato de sodio, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y una dilución 1:200 de un conjunto de Cocktail del Inhibidor de Proteasa Calbiochem III (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) durante 30 minutos a una temperatura de 4°C con vortizado ocasional. Posteriormente, los Usados se despejaron de los núcleos y otro material insoluble mediante microcentrifugación. Posteriormente, se agregó un amortiguador de carga de gel de sulfato dodecilo de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) que contiene ß-mercaptoetanol (concentración final al 5%) al Usado celular (dilución 1:4 del amortiguador del carga 5X en el Usado) antes de hervir durante dos minutos. Posteriormente, los Usados fueron resueltos mediante electroforesis a través de un gradiente de 8% a 16% de geles Tris-HCI SDS-PAGE (BioRad, Hercules, CA) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Whatman Protran™ (Sigma-Aldrich). Las membranas se incubaron durante seis horas a temperatura ambiente con una solución de bloqueo de leche descremada al 3% en solución salina amortiguada por Tris con Tween-20 al 0.1% (TBS-T) en un agitador orbital, y posteriormente se ajustaron en un múltiple de manchado Miniblotter 25 (Immunetics, Cambridge, MA). Los depósitos Miniblotter fueron rellenados ya sea con suero del paciente o suero de control saludable diluido 1:250 en TBS-T que contiene 0.2% de albúmina de suero bovino, y el Miniblotter se meció suavemente durante la noche a una temperatura de 4°C en un agitador orbital. Posteriormente los sueros fueron eliminados, los depósitos se lavaron dos veces con TBS-T, y las membranas se eliminaron del aparato. Después de un lavado extenso adicional con TBS-T, las membranas se mancharon durante dos horas a temperatura ambiente con una dilución 1:20,000 de anticuerpo secundario Ig anti-humano de cabra (cadena pesada y ligera) conjugado mediante peroxidasa de rábano (SouthernBiotech, Birmingham, AL). Después de un lavado extensor de las membranas con TBS-T, se detectaron complejos de anticuerpo utilizando el substrato Quimioluminiscente Supersignal® West Pico (Thermo Scientific, Rockford, IL), con bandas quimioluminiscentes visualizadas en la película de auto-radiografía HyBlot CL™ (Denville Scientific, Inc., Metuchen, NJ).

Estudios de inmunof lluorescencia indirecta para detectar la presencia de anticuerpos de célula anti-endotelial. Se diluyeron muestras de suero en un factor de dilución de 1:100 y se incubaron con células endoteliales cutáneas humanas. Se detectó el enlace de anticuerpo utilizando un IgG anti-humano de cabra conjugado con fluoresceína (diluido 1:100 en PBS; Caltag, Burlingame, CA). Se visualizaron complejos de anticuerpo-fluorescente utilizando un microscopio Olympus, y se registraron las imágenes dentro de una cámara digital.

Ejemplo 2. Resultados Historia clínica. Durante un período de dos años, un hombre saludable previamente de 43 años de edad desarrolló lesiones cutáneas pequeñas asintomáticas, definidas inicialmente por lesiones papulares evaluadas pasando a cicatrices blancas deprimidas. El 23 de julio de 2009, el paciente ingresó a la sala de emergencia con un historial de tres días de fiebres bajas, intermitentes acompañadas por severo dolor abdominal y vómito color verdoso. Se llevó a cabo una laparatomía de exploración - se eliminó un pequeño segmento del intestino. Tanto las muestras de piel como de intestino mostraron cambios clásicos asociados con la enfermedad de Degos. No se detectaron anticuerpos de anticardiolipina, anticuerpos de glucoproteína anti-beta 2, o anticoagulante de lupus. Las pruebas de laboratorio adicionales confirmaron niveles en suero anormalmente elevados del factor VIII (199 arriba de lo normal), niveles elevados del factor von Willebrand (VWF) (217 arriba de lo normal), y niveles incrementados del factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF). Aunque las proteínas del componente de complemento C2, C3 y C4 fueron determinadas dentro de los niveles normales, se elevaron los niveles de C5.

Se llevó a cabo una toracocentesis en el paciente para liberar el pneumotórax. El paciente inició una dosis intravenosa de globulina gamma y Lovenox® en 490 mg diariamente. Durante la visita de seguimiento el 12 de agosto del 2009, el paciente había perdido 15 libras debido al apetito disminuido atribuible al dolor abdominal persistente. Un examen respiratorio del paciente demostró sonidos de respiración disminuida en las regiones de basilares. Los niveles del paciente de proteína reactiva C, VWF, y VEGF permanecieron elevados en 6.51, 177, y 971, respectivamente. Después de cuatro tratamientos de IVIG, hubo cierta mejoría en las lesiones de la piel del paciente, aunque el paciente continuó padeciendo de dolor abdominal. En octubre de 2009, el paciente desarrolló dolor de pecho y acortamiento de la respiración, lo cual necesitó admisión hospitalaria. El paciente se descompensó rápidamente en forma hemodinámica, y se instaló en una unidad médica de cuidados intensivos. El paciente observó tener una fracción de expulsión de 14% asociada con una gran efusión pericardial y pleural. Se obtuvo una biopsia pericardial que confirmó una microangiopatía trombótica severa consistente con la enfermedad de Degos. También se observó deposición C5b-9 vascular. Posteriormente, se administró al paciente eculizumab. Ocurrió una mejoría casi inmediata en la condición del paciente. Por ejemplo, mejoró en forma dramática la fracción de expulsión del paciente. A las 24 horas de recibir el eculizumab, el paciente fue extubado y transferido al piso médico. Durante las siguientes semanas, el paciente estuvo sintomáticamente mejor, y hubo una mejoría objetiva en la apariencia de las lesiones de su piel.

Patología. Se obtuvieron tres conjuntos de biopsias de piel del paciente. El tiempo en el cual estas biopsias se llevaron a cabo estuvo temporalmente asociado con variaciones en la intervención del tratamiento. El primer conjunto se obtuvo del paciente antes de la administración ya sea de IVIG o eculizumab al paciente, e incluyó dos fases de evolución de sus lesiones de piel. Una biopsia fue de una lesión papular elevada que revela el golpeteo del depósito de mucina mesenquimal, un descubrimiento morfológico que conduce a un diagnóstico erróneo inicial de lupus eritematoso de tumid dos años previos. La revisión de la vasculatura reveló anormalidades incluyendo hinchazón, necrosis, y separación de célula endotelial con depósito de fibrina luminal y mural focal. Una biopsia de la pápula con cicatrización oprimida de porcelaína asociada con la enfermedad de Degos clásica, demostró un adelgazamiento epidérmico prominente y fibrosis dérmica con goteo vascular. Los bazos demostraron una microangiopatía trombótica oclusiva extensa, con degeneraciones/necrosis de célula endotelial y desecho de célula endotelial en el lumen vascular. Todas las biopsias revelaron una escasez de células inflamatorias. La muestra de intestino mostró una vasculopatía obliterativa extensa, que afecta las arterias de mayor calibre de la submucosa.

Varias semanas después de comenzar IVIG, se obtuvo otra biopsia de piel, cuyo análisis reveló los cambios isquémicos cutáneos persistentes incluyendo mucina, fibrosis y adelgazamiento epitelial. Sin embargo, hubo una reducción en el grado de lesión vascular activa.

No se observaron bazos que contienen depósito de fibrina mural y luminar significativos. Se obtuvo un conjunto de biopsias adicionales (el tercer conjunto) del paciente, dos semanas después de la administración de eculizumab. El análisis del tejido con biopsia reveló fibroplasias superficiales con goteo vascular. Los bazos fueron adelgazados, lo que refleja una reduplicación de la zona de membrana de base. Únicamente bazos raros, exhibieron daño y trombosis de célula endotelial.

Evaluación de interferón alfa en muestras de tejido.

Hubo una extensa expresión de proteína MxA en células endoteliales, células inflamatorias, y keratinocitos epidérmicos.

Estudios de inmunof luorescencia C5b-9. Los estudios de inmunofluorescencia indirecta revelaron depósitos extensos de C5b-9 dentro de la vasculatura cutánea del primer conjunto de biopsias antes de comenzar con IVIG y/o eculizumab. El patrón de deposición fue tanto intraluminal como mural. El grado de deposición fue muy prominente, lo que implica varios bazos a través de la dermis. Aunque I VI G redujo la deposición C5b-9 en cierto grado, la extensión de deposición de C5b-9 observada en biopsias obtenidas del paciente después de terapia eculizumab, fue marcadamente disminuida. Únicamente tres bazos mostraron deposición C5b-9 mural.

Microscopio de Electrones. Los análisis ultraestructurales de tejido de biopsia obtenido previo al tratamiento, mostraron estructuras reticulares tubulares extensas en los keratinocitos epidérmicos y en células endoteliales a través de la dermis. El revestimiento de células endoteliales, mostró cambios degenerativos profundos con separación de las células de los lúmenes del bazo. Las zonas de membrana de bases vasculares fueron reduplicadas y también fueron mostradas mediante deposición de colágeno.

Ensayo de anticuerpo de célula anti-endotelial. El suero del paciente obtenido antes del tratamiento con eculizumab y el suero obtenido dos semanas después del tratamiento con eculizumab, se incubaron con células endoteliales cutáneas y anticuerpos anti-lgG humanos conjugados fluoresceína. Se observó una decoración nuclear granular en la mayor parte de las células endoteliales en las muestras de tratamiento pre- y post-eculizumab. No se observó manchado cuando el suero del paciente fue contactado con células endoteliales de vena umbilical humanas.

Estudios de manchado Western utilizando lisados de célula endotelial. También se utilizó el suero del paciente pre-y post-tratamiento, en un análisis de manchado Western para identificar la proteína o proteínas a las cuales enlazaron los anticuerpos humano-anti-humano en el suero del paciente. Tal como se describió anteriormente, se incubó el suero pre- y post-tratamiento con una membrana que contiene proteínas de célula endotelial resueltas por tamaño y cualquier enlace de anticuerpos a las proteínas de la membrana fue detectado por medio de un anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína. Se observó una banda distinta de inmuno-reactividad que corresponde a un peso molecular de 92 kDa. No se identificó una banda de reactividad similar en casos de control normales o en manchados Western de lisados de células endoteliales de vena umbilical humana.

Evaluación de niveles de interferón alfa en suero. Los niveles de interferón alfa en la sangre periférica del paciente fueron muy altos - midiendo 20.56, lo cual fue comparable con pacientes que tienen lupus eritematoso, y varias veces más que los niveles de interferón alfa en sangre de pacientes saludables.

Discusión. El paciente aquí descrito desarrolló isquemia intestinal, pericardial, miocardial y cutánea multifocal, atribuible a lesión de célula endotelial prominente. Los síntomas del paciente fueron consistentes con la enfermedad de Degos. Utilizando células endoteliales cutáneas como substrato, hubo evidencia de anticuerpos de célula anti-endotelial utilizando técnicas de inmunofluorescencia indirecta y manchado Western. Se aisló un epítope antigénico dominante con base en el análisis de Manchado Western, aunque su identidad permanece no clara. En virtud del descubrimiento de que los anticuerpos de célula anti-endoteliales no fueron reactivos con las células de vena umbilical humana, es probable que los anticuerpos de célula anti-endotelial observados en este paciente fueran selectivos de órganos, por lo cual depende del sitio la inmunogenicidad para el epítope a base de célula endotelial seleccionada.

Los estudios aquí descritos implican lesión endotelial transmitida por complemento como el probable mecanismo efector en el paciente con la enfermedad de Degos tratado con eculizumab. Hubo una respuesta patológica y clínica objetiva, dramática a la administración del fármaco.

La expresión de interferón alfa estuvo marcadamente incrementada en el suero del paciente, así como dentro de su tejido. El interferón alfa es conocido por activar la inmunidad de adaptación e innata, potenciando los efectos de cualquier activador antigénico. La administración de interferón alfa exógeno ha sido reportada como causa de trombosis y ulceración cutánea. La signatura de interferón alfa del paciente en la sangre periférica, fue remarcadamente similar a la observada en pacientes con SLE, aunque no tuvo características clínicas específicas de lupus eritematoso sistémico. Los descubrimientos aquí descritos soportan una conclusión de que la inhibición de interferón alfa en pacientes con la enfermedad de Degos puede ser útil para tratar la enfermedad.

En conclusión, eculizumab define una modalidad terapéutica importante para tratar la enfermedad de Degos, la cual de otra manera es fatal. El disparador exacto para la activación de la secuencia de la cascada de complemento, permanece no claro. Aunque los anticuerpos de la célula anti-endotelial (por ejemplo, anticuerpos que enlazan a un antígeno 92 kDa presente en células endoteliales) que provocan la activación de la secuencia de cascada de complemento clásica, pueden ser causantes de la deposición de C5b-9, el desempeño del epítope que se dispersa en el curso natural de la lesión de tejido, excluye el establecimiento de un efecto causante directo de estos anticuerpos. Sin embargo, en cierto punto en el curso clínico del paciente, las terapias adicionales dirigidas a célula B para reducir la producción de estos anticuerpos, pueden ser útiles para el tratamiento de la enfermedad de Degos, siempre que persistan los anticuerpos.

Aunque la presente descripción ha sido descrita con referencia a las modalidades específicas de la misma, deberá quedar entendido para los expertos en la técnica, que se pueden realizar diversos cambios, y se pueden substituir equivalentes sin apartarse del espíritu y alcance real de la presente descripción. Además, se pueden realizar muchas modificaciones para adaptar una situación, material, composición de materia, proceso, paso o pasos del proceso particulares al objetivo, espíritu y alcance de la presente descripción. Todas de dichas modificaciones están proyectadas para estar dentro del alcance de la presente descripción.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar a un paciente que padece de la enfermedad de Degos, en donde el método comprende administrar a un paciente que padece la enfermedad de Degos, un inhibidor de complemento en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad.

2. Un método para tratar a un paciente que padece la enfermedad de Degos, en donde el método comprende administrar en forma crónica al paciente que padece de la enfermedad de Degos, un inhibidor de complemento en una cantidad y con una frecuencia suficiente para mantener un nivel reducido de actividad de complemento en el paciente para tratar de esta manera la enfermedad.

3. Un método para tratar la enfermedad de Degos, en donde el método comprende: identificar a un paciente como estando, o que probablemente estará, afectado con la enfermedad de Degos; y administrar al paciente un inhibidor de complemento en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad.

4. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque la enfermedad de Degos está asociada con una infección parvoviral B19 o una infección de virus de inmunodeficiencia humana.

5. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque la enfermedad de Degos es idiopática.

6. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado porque la enfermedad de Degos afecta patológicamente el tracto gastrointestinal.

7. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado porque la enfermedad de Degos afecta patológicamente el sistema nervioso central.

8. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 7, caracterizado porque la enfermedad de Degos afecta patológicamente el sistema cardiovascular.

9. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 8, caracterizado porque la enfermedad de Degos es la enfermedad de Degos sistémica, de órganos múltiples.

10. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizado porque la enfermedad de Degos es refractaria para al menos una terapia seleccionada del grupo que consiste en un agente antiinflamatorio, un anticoagulante, un antitrombótico, y una ¡nmunoglobulina intravenosa.

11. El método tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque el fármaco anti-inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en corticoesteroides, fenilbutazona, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, tacrolimus, y mofetil de micofenolato.

12. El método tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque el anticoagulante o antitrombótico es seleccionado del grupo que consiste en clopidogrel, aspirina, y dipiridamol.

13. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizado porque el inhibidor de complemento se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido, un análogo de polipéptido, un ácido nucleico, un análogo de ácido nucleico, y una molécula pequeña.

14. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el inhibidor de complemento se selecciona del grupo que consiste en CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59 soluble, Factor H, factor de veneno de cobra, FUT-175, complestatina, y K76 COOH.

15. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizado porque el inhibidor de complemento inhibe la expresión de una proteína de componente de complemento humana.

16. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizado porque el inhibidor de complemento inhibe la activación o la actividad del componente de complemento C1s o el componente de complemento C 1 r.

17. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizado porque el inhibidor de complemento inhibe la disociación del componente de complemento humano C5, C4, C3, o C2.

18. El método tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el inhibidor de complemento inhibe la disociación del componente de complemento C5 en fragmentos C5a y C5b.

19. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 13 o de la 15 a la 18, caracterizado porque el inhibidor de complemento es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a una proteína de componente de complemento humana.

20. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo fragmento de enlace de antígeno del mismo enlaza a una proteína de componente de complemento humano C5.

21. El método tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a la cadena alfa de la proteína de componente de complemento C5.

22. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a la cadena alfa del componente de complemento humano C5, y en donde el anticuerpo (i) inhibe la activación de complemento en el fluido corporal humano, (ii) inhibe el enlace del componente de complemento humano C5 purificado, ya sea del componente de complemento humano C3b o el componente de complemento humano C4b, y (iii) no enlaza al C5a libre del producto de activación de complemento humano.

23. El método tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a la proteína de componente de complemento humano C5 que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 1-26.

24. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido comprende un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza al fragmento de componente de complemento C5, C5b.

25. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 24, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

26. El método tal como se describe en cualesquiera de reivindicaciones de la 19 a la 24, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humanizado, un anticuerpo recombinante, un diacuerpo, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humano deshumanizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.

27. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizado porque el inhibidor es eculizumab.

28. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizado porque el inhibidor es pexelizumab.

29. Un artículo de fabricación que comprende: un contenedor que comprende una etiqueta; y una composición que comprende un inhibidor de complemento, en donde la etiqueta indica que la composición será administrada a un humano que tiene, se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Degos.

30. El artículo de fabricación tal como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el inhibidor es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a una proteína de componente de complemento humano C5.

31. El artículo de fabricación tal como se describe en la reivindicación 29 ó 30, caracterizado porque el inhibidor es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un fragmento de la proteína de componente de complemento humano C5.

32. El artículo de fabricación tal como se describe en la reivindicación 31, caracterizado porque el fragmento de la proteína de componente de complemento humano C5 es C5a o C5b.

33. El artículo de fabricación tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 29 a la 32, caracterizado porque comprende además uno o más agentes activos adicionales.

34. El artículo de fabricación tal como se describe en la reivindicación 33, caracterizado porque el uno o más agentes activos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en un agente anti-inflamatorio, un anticoagulante, y un agente antitrombótico.

35. Un método para tratar a un paciente que padece la enfermedad de Degos, caracterizado porque el método comprende administrar a un paciente que padece la enfermedad de Degos, un inhibidor de interferón alfa en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad.

36. Un método para tratar a un paciente que padece la enfermedad de Degos, caracterizado porque el método comprende administrar en forma crónica a un paciente que padece la enfermedad de Degos, un inhibidor de interferón alfa en una cantidad y con una frecuencia suficiente para mantener un nivel reducido de expresión o actividad de interferón alfa en el paciente, para tratar de esta forma la enfermedad.

37. Un método para tratar la enfermedad de Degos, caracterizado porque el método comprende: identificar a un paciente como estando, o que probablemente estará, afectado con la enfermedad de Degos; y administrar al paciente un inhibidor de interferón alfa en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad.

38. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 35 a la 37, caracterizado porque la enfermedad de Degos es una forma sistémica, de órganos múltiples de la enfermedad de Degos.

39. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 35 a la 38, caracterizado porque el inhibidor de interferón alfa se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido, un análogo de polipéptido, un ácido nucleico, un análogo de ácido nucleico, y una molécula pequeña.

40. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 35 a la 39, caracterizado porque el inhibidor de interferón alfa inhibe la expresión de interferón alfa o un receptor de interferón alfa a través de una célula.

41. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 35 a la 39, caracterizado porque el inhibidor de interferón alfa inhibe la actividad de interferón alfa o un receptor de interferón alfa.

42. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 35 a la 39, caracterizado porque el inhibidor de ¡nterferón alfa enlaza a la proteína de interferón alfa.

43. El método tal como se describe en la reivindicación 42, caracterizado porque el inhibidor de interferón alfa es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a la proteína de interferón alfa.

44. El método tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 35 a la 39, caracterizado porque el inhibidor de interferón alfa enlaza a un receptor de interferón alfa.

45. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el inhibidor de interferón alfa es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un receptor de interferón alfa.

46. El método tal como se describe en la reivindicación 43 ó 45, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

47. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humanizado, un anticuerpo recombinante, un diacuerpo, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humano deshumanizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.

48. Un artículo de fabricación que comprende: un contenedor que comprende una etiqueta; y una composición que comprende un inhibidor de interferón alfa, en donde la etiqueta indica que la composición será administrada a un humano que tiene, se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Degos.

49. El artículo de fabricación tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el inhibidor es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a interferón alfa.

50. El artículo de fabricación tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el inhibidor es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza a un receptor de interferón alfa.

51. El artículo de fabricación tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 48 a la 50, caracterizado porque comprende además uno o más agentes activos adicionales.

52. El artículo de fabricación tal como se describe en la reivindicación 51, caracterizado porque el uno o más agentes activos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en un agente anti-inflamatorio, un anticoagulante, y un agente antitrombótico.