CN102892420A

CN102892420A - 用于递送寡核苷酸的新型单一化学实体和方法

Info

Publication number: CN102892420A
Application number: CN201180017855XA
Authority: CN
Inventors: J.G.阿龙森; S.F.巴內特; R.巴茨; S.L.科勒特蒂; V.R.贾德哈夫; A.A.莫莫塞; A.W.肖; D.M.特勒斯; T.J.图克; W.王; Y.袁
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2011-04-04
Publication date: 2013-01-23
Also published as: EP2555777A4; US20130041133A1; JP2013523149A; AU2011238501A1; CA2792942A1; RU2012147589A; EP2555777A1; EP2555777B1; WO2011126974A1; MX2012011515A; US8691580B2; BR112012021269A2; KR20130040811A

Abstract

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；3）选自SEQ ID NOs:1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头；和任选地连接至寡核苷酸的一个或多个脂质、增溶基和/或靶向配体。

Description

用于递送寡核苷酸的新型单一化学实体和方法

发明背景

集中于用于治疗目的的寡核苷酸全身性递送的科学努力正在进行中。关于寡核苷酸递送的三种突出方法包括1）脂质纳米颗粒（LNP）封装，2）聚合物缀合和3）单一化学缀合（single chemical conjugation）。单一化学缀合一般采用连接至寡核苷酸的靶向配体或脂质或可溶基团或内体裂解肽（endosomolytic peptide）或细胞穿透肽和/或两种或所有四种的组合。接头可以存在于缀合物以及其他功能性中。单一化学缀合是已知的，并且寡核苷酸的连接在寡核苷酸的5'或3'末端、在两个末端或内部发生。参见WO2005/041859；WO2008/036825和WO2009/126933。

本发明的单一化学缀合物必须含有在寡核苷酸的5'和/或3'末端上的可以视为内吞体裂解组分的肽、细胞穿透肽和/或基因融合肽（fusogenic peptide）。接头还必须存在于肽和寡核苷酸之间。其他功能性例如靶向配体、增溶剂、脂质和/或掩蔽剂是任选存在的。一般地，寡核苷酸是siRNA。进一步地，寡核苷酸是siRNA的过客链（passenger strand）或引导链。

发明概述

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物（modular composition），其包含1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头；和任选地连接至寡核苷酸的一个或多个脂质、增溶基和/或靶向配体。

在另一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在另一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至siRNA；和3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至siRNA的引导链；3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至siRNA的过客链；3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头；和任选地连接至寡核苷酸的一个或多个脂质、增溶基和/或靶向配体。

在另一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在另一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至siRNA；和3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至siRNA的引导链；3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至siRNA的过客链；3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头；和任选地连接至寡核苷酸的一个或多个脂质、增溶基和/或靶向配体。

在另一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在另一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至siRNA；和3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至siRNA的引导链；3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至siRNA的过客链；3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头；和任选地连接至寡核苷酸的一个或多个脂质、增溶基和/或靶向配体。

在另一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在另一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至siRNA；和3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至siRNA的引导链；3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至siRNA的过客链；3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头。

附图简述

图1 对于下述肽在pH 5.4和7.5的溶血百分比：WHHWWHWWHHWWHHW（SEQ ID NO: 2）。

图2 对于下述肽在pH 5.4和7.5的溶血百分比：AcLHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHLGGGRKKRRQRRRPPQC（SEQ ID NO: 57）。

图3 对于下述肽在pH 5.4和7.5的溶血百分比：m（Peg）44HLLHLLLHLWLHLLHLLLHLLC （SEQ ID NO:33）。

图4 在用化合物3-6（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图5 在用化合物6-6（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图6 在用化合物8-5（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图7 在用化合物8-9（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图8 在用化合物9-7（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图9 在用化合物8-7（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图10 在用化合物13-4（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图11 在用化合物12-3（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图12 在用化合物13-5（b-DNA方案）处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。

图13 在用化合物3-8（双萤光素酶方案）处理的HEK293T细胞中的SSB mRNA水平。

图14 在用化合物15-1（双萤光素酶方案）处理的HEK293T细胞中的SSB mRNA水平。

图15 在所示化合物的单次玻璃体内剂量后3天，在大鼠视网膜组织中SSB mRNA的相对水平。

发明详述

在一个实施方案中，本发明公开了模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至寡核苷酸；3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至接头；和任选地连接至寡核苷酸的一个或多个脂质、增溶基和/或靶向配体。

为了经由草图（cartoon）举例说明本发明，本发明特征在于模块组合物，其包含寡核苷酸（O）、接头（L）、肽（P）以及任选脂质（X）、靶向配体（X）和/或增溶基（X）。

模块组合物可以具有式：

P-L-O-L-P。

模块组合物可以具有式：

P-L-O-X。

模块组合物可以具有式：

P-L-O。

模块组合物的例子是：

这个例子用作指导。本领域技术人员将认识到存在用于将所需组分置于过客和引导链的多种排列。

当寡核苷酸是双链寡核苷酸时，“P-L”和脂质、靶向配体和/或增溶基可以位于相同链或不同链上。

在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或增溶基在相同链上。

在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或增溶基在过客链上。

在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或增溶基在引导链上。

在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或增溶基在不同链上。

在某些实施方案中，“P-L”在过客链上，而脂质、靶向配体和/或增溶基在引导链上。

在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或增溶基在不同链上，但在双链寡核苷酸的相同末端上。

在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或增溶基在不同链上，并且在双链寡核苷酸的相反末端上。

在某些实施方案中，等同或不同性质的另外“P-L”可以用于代替上述实施方案中提到的脂质、靶向配体和/或增溶基。

在某些实施方案中，“P-L”可以位于过客或引导链的多个末端上，并且脂质、靶向配体和/或增溶基可以位于过客和引导链的剩余末端上。

在某些实施方案中，一个“P-L”和两个或更多个脂质、靶向配体和/或增溶基存在于寡核苷酸上。

在某些实施方案中，两个或更多个“P-L”和两个或更多个脂质、靶向配体和/或增溶基存在于寡核苷酸上。

在某些实施方案中，当寡核苷酸是双链寡核苷酸，并且存在多个“P-L”组分和/或脂质、靶向配体和/或增溶基时，此类多个“P-L”组分和/或脂质、靶向配体和/或增溶基可以都存在于双链寡核苷酸的一条链或两条链中。

当存在多个“P-L”组分和/或脂质、靶向配体和/或增溶基时，它们可以都是相同的或不同的。

在另一个方面，本发明包括将寡核苷酸递送给细胞的方法。该方法包括（a）提供或获得本发明的模块组合物；（b）使细胞与模块组合物接触；和（c）允许细胞将模块组合物内在化。

该方法可以在体外、离体或在体内执行，例如以治疗鉴定为需要寡核苷酸的受试者。需要所述寡核苷酸的受试者是需要下调或沉默一种或多种基因例如与病症有关的基因表达的受试者，例如人。

在一个方面，本发明提供了用于抑制一种或多种基因表达的方法。该方法包括使一种或多种细胞与有效量的本发明的寡核苷酸接触，其中所述有效量是抑制一种或多种基因表达的量。该方法可以在体外、离体或在体内执行。

本发明的方法和组合物例如本文描述的模块组合物可以与本领域已知的任何寡核苷酸一起使用。此外，本发明的方法和组合物可以用于治疗本领域已知的任何疾病或病症，和用于治疗任何受试者，例如任何动物、任何哺乳动物例如任何人。本领域普通技术人员还将认识到本发明的方法和组合物可以用于治疗将获益于下调或沉默一种或多种基因的任何疾病。

本发明的方法和组合物例如本文描述的模块组合物可以与本文描述的任何剂量和/或制剂或本领域已知的任何剂量或制剂一起使用。除本文描述的施用途径外，普通技术人员还应理解其他施用途径可以用于施用本发明的模块组合物。

寡核苷酸

如本文使用的，“寡核苷酸”是双链或单链、未经修饰或经修饰的RNA或DNA。经修饰的RNAs的例子包括比未经修饰的RNAs对核酸酶降解具有更大抵抗力的那些。进一步例子包括具有2'糖修饰，碱基修饰，单链突出端例如3'单链突出端中的修饰，或特别地如果是单链的，那么包括一个或多个磷酸基或一个或多个磷酸基类似物的5'修饰的那些。寡核苷酸的例子和进一步描述可以在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。

在一个实施方案中，寡核苷酸是反义、miRNA或siRNA。优选寡核苷酸是siRNA。另一种优选寡核苷酸是siRNA的过客链。另一种优选寡核苷酸是siRNA的引导链。

siRNA

siRNA通过称为RNA干扰（RNAi）的过程指导mRNA的序列特异性沉默。该过程在广泛多样的生物包括哺乳动物及其他脊椎动物中发生。用于制备且施用siRNA的方法及其用于特异性灭活基因功能的用途是已知的。siRNA包括经修饰的和未经修饰的siRNA。siRNA的例子和进一步描述可以在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。

可以用于将siRNA施用于受试者的许多示例性递送途径是已知的。此外，siRNA可以根据本领域已知的任何示例性方法进行配制。siRNA制剂和施用的例子和进一步描述可以在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。

肽

对于不能容易地跨越双层膜的大分子药物和亲水性药物分子，在细胞的胞内体/溶酶体区室中的诱陷被认为是有效递送至其作用部位的最大障碍。不希望受理论束缚，认为肽的使用将促进寡核苷酸自这些胞内体/溶酶体区室逃出或寡核苷酸易位跨越细胞膜且释放到细胞溶质区室内。在特定实施方案中，本发明的肽可以是聚阳离子或两亲或聚阴离子肽或拟肽，其显示pH依赖性膜活性和/或融合性（fusogenicity）。拟肽可以是设计为模拟肽的小蛋白质样链。

在某些实施方案中，肽是细胞渗透剂，优选螺旋细胞渗透剂。这些肽通常被称为细胞渗透肽。参见例如，“Handbook of Cell Penetrating Peptides”编辑，Langel，U.；2007，CRC Press，Boca Raton，Florida。优选地，组分是两亲的。螺旋试剂优选是α-螺旋试剂，其优选具有亲脂和疏脂相。细胞渗透剂可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、例如主要由Tyr、Trp和Phe组成的两亲肽或疏水肽、树枝状肽、限制性肽（constrained peptide）或交联肽。细胞渗透肽的例子包括Tat、Penetratin和MPG。对于本发明，认为细胞渗透肽可以是“递送”肽，其可以携带大的极性分子包括肽、寡核苷酸和蛋白质跨越细胞膜。细胞渗透肽可以是线性或环状的，并且包括D-氨基酸、“反转型（retro-inverso）”序列、非肽或假肽键、肽基模拟物。此外，肽和肽模拟物可以是经修饰的，例如糖基化的、加入聚乙二醇的或甲基化的。肽的例子和进一步描述可以在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。肽的合成是本领域众所周知的。

肽可以通过半胱氨酸或其他含硫醇部分对于C或N末端的添加在任一末端或两个末端缀合。当在N末端上未官能化时，肽可以通过乙酰基加帽，或可以用脂质、PEG或靶向部分加帽。当肽的C末端是未缀合或未官能化的时，它可以作为酰胺加帽，或可以用脂质、PEG或靶向部分加帽。

本发明的肽是：

其中所述肽任选通过半胱氨酸或其他含硫醇部分对于C或N末端的添加在任一末端缀合；或

当在N末端上未官能化时，肽任选通过乙酰基、脂质、peg或靶向部分加帽；或

当在C末端上未官能化时，肽任选通过酰胺、脂质、peg或靶向部分加帽。

优选的肽（P）是：

接头

在本发明的模块组合物的肽和寡核苷酸之间的共价键通过接头介导。这种接头可以是可切割的或不可切割的，取决于应用。在特定实施方案中，可切割接头可以用于在从内体转移到细胞质后释放寡核苷酸。缀合或偶联相互作用的预期性质或所需生物学效应将决定接头基团的选择。接头基团可以是组合的或分支的，以提供更复杂的体系结构。接头的例子和进一步描述可以在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。

本发明的接头在表1中示出。

表1

优选接头显示于表2中：

表2

商业接头包括所述接头的组合可从多个供应商例如Pierce或Quanta Biodesign获得。接头还可以是组合的，以产生容纳1 – 8种肽的更复杂的分支体系结构，如下文一个此类例子中举例说明的。

靶向配体

本发明的模块组合物可以包含靶向配体。在某些实施方案中，这种靶向配体可以将模块组合物导向特定细胞。例如，靶向配体可以与靶细胞表面上的分子特异性或非特异性结合。靶向部分可以是对于靶细胞具有特异性亲和力的分子。靶向部分可以包括针对靶细胞的表面上发现的蛋白质的抗体，或对于在靶细胞的表面上发现的分子的配体或配体的受体结合部分。靶向配体的例子和进一步描述可以在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。

靶向配体选自抗体、受体的配体结合部分、关于受体的配体、适体、D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖（GalNAc）、多价N-乙酰-D-半乳糖、D-甘露糖、胆固醇、脂肪酸、脂蛋白、叶酸酯、促甲状腺素、促黑素、表面活性蛋白A、粘蛋白、碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-葡糖胺、多价甘露糖、多价果糖、糖基化聚氨基酸、转铁蛋白（transferin）、双膦酸酯、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、增强血浆蛋白质结合的亲脂部分、类固醇、胆酸、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物、布洛芬、萘普生、阿司匹林、叶酸酯及其类似物和衍生物。

优选靶向配体选自D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖（GalNAc）、GalNAc2和GalNAc3、胆固醇、叶酸酯及其类似物和衍生物。

脂质

当连接至高度亲水分子例如核酸时，亲脂部分例如胆固醇或脂肪酸可以基本上增强血浆蛋白质结合且因而增强循环半衰期。此外，亲脂基团可以增加细胞摄取。例如，脂质可以结合特定血浆蛋白质，例如脂蛋白，其因而已显示增加表达相应脂蛋白受体（例如LDL-受体或清除受体SR-B1）的特异性组织中的摄取。亲脂性缀合物还可以视为靶向递送方法，并且其细胞内运输可以潜在地通过与内体裂解性试剂组合得到进一步改善。

增强血浆蛋白质结合的示例性亲脂部分包括但不限于类固醇、胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、双氢睾酮、1,3-双-O（十六烷基）甘油、香叶基氧代己基、十六烷基甘油、莰醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-（油酰基）石胆酸、O3-（油酰基）胆烯酸、二甲氧三苯甲基、吩噁嗪、阿司匹林、萘普生、布洛芬、维生素E和生物素等。脂质的例子和进一步描述可以在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。

优选脂质是胆固醇。

增溶剂

模块组合物可以包含可以增强水性可溶性、循环半衰期和/或细胞摄取的一种或多种其他部分/配体。这些可以包括天然存在的物质，例如蛋白质（例如人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白）；或碳水化合物（例如葡聚糖、支链淀粉、壳多糖、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸）。这些部分还可以是重组或合成分子，例如合成聚合物或合成聚氨基酸。例子包括聚赖氨酸（PLL）、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚（L-丙交酯共乙交酯）共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺共聚物（HMPA）、聚乙二醇（PEG例如PEG-0.5K、PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG--40K）、甲基- PEG（mPEG）、[mPEG]2、聚乙烯醇（PVA）、聚氨基甲酸酯、聚（2乙基丙烯酸（acryllic acid））、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。增溶剂的例子和进一步描述可以在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。

优选增溶基是PEG 0.5K至30K。

治疗方法

在一个方面，本发明的特征在于治疗处于疾病危险中或受疾病折磨的受试者的方法，所述疾病可以获益于本发明的模块组合物的施用。该方法包括给有此需要的受试者施用本发明的模块组合物，从而治疗受试者。施用的寡核苷酸将取决于待治疗的疾病。关于有关特异性适应症的治疗方法的另外细节参见WO2009/126933。

制剂

存在用于制备寡核苷酸化合物的缀合物的众多方法。该技术对于本领域技术人员应是熟悉的。关于此类反应的有用参考文献是Bioconjugate Techniques，Hermanson，G. T.，Academic Press，San Diego，CA，1996。其他参考文献包括WO2005/041859；WO2008/036825和WO2009/126933。

实施例

本发明通过下述实施例进一步举例说明，所述实施例不应解释为进一步的限制。本申请自始至终引用的所有参考文献、悬而未决的专利申请和公开专利的内容在此特别引入作为参考。本文描述的siRNAs设计为靶向遍在表达的基因SSB（干燥综合征抗原B；NM_009278.4）。

接头基团可以在连接附着点（LAP）上连接至一条或多条寡核苷酸链，并且可以包括任何含碳部分，在某些实施方案中，具有至少一个氧原子、至少一个磷原子和/或至少一个氮原子。在某些实施方案中，磷原子形成在接头基团上的末端磷酸基或硫代硫酸酯基团的部分，其可以充当用于寡核苷酸链的连接点。在特定实施方案中，氮原子形成接头基团上的末端醚、酯、氨基或酰氨基（NHC（O）-）的部分，其可以充当关于目的接头、内体裂解性单元、细胞渗透肽、增溶基、脂质、靶向基团或另外的目的接头的连接点。这些末端接头基团包括但不限于C₆己基、C₅仲羟基、C₃硫醇或C₆硫醇部分。来自下文描述的RNA序列的例子是C6己基：[（CH₂）₆ NH₂]。

本文实施例中所述的siRNA序列如下：

R1

R1p 过客

R1g引导

R1cg胆固醇引导

R2

R2p过客

R2g引导

R3

R3p过客

R3g引导

R4

R4p过客

R4g引导

R4cg胆固醇引导

R5

R5cp胆固醇过客

R6

R6p过客

R7

R7p过客

R8

R8p过客

R9

R9cp过客

R9g引导

。

本文实施例中所述的肽如下：

。

实施例1

步骤1

将15.2 mg（2.40 μmol）R1p的1.5 mL pH 8.3水溶液冷却至0℃，并且用逐滴加入的7.7 mg（0.018 mmol）1-1的1.0 mL乙腈溶液处理。将所得到的溶液在室温搅拌0.5小时。将粗反应用18 mL水稀释，并且用乙酸将pH调整至6.0。使用MW 3000透析膜，将所得到的溶液针对水离心透析四次。将透析物（dialyte）冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的13.5 mg所需产物1-2，测量的质量= 6635。

步骤2

将3 mg（0.452 μmol）1-2的570 uL 3:1甲酰胺:水和30 μl 2M TEAA溶液用2.23 mg（0.904 μmol）P1的600 μL 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在RT搅拌1.5小时。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和70:30- 0:80% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 6.8；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 6.8）。将产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的0.7 mg所需缀合物1-3。通过重构的冻干材料的pH 7.4 PBS缓冲液溶液的UV测定（260 nm）评估产物收率。

步骤3

将0.7 mg（0.077 μmol）重构的1-3溶液用0.63 mg（0.092 μmol）R1g的65 μl pH 7.4 PBS缓冲液溶液处理。将所得到的溶液加热至95℃一分钟，冷却且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的1.5 mg所需双链体产物1-4。通过MS证实双链体，测量的质量 = 过客链：9098，引导链：6786。

以与上文对于1-4合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例2

步骤1

将15.00 mg（2.14 μmol）R3p的1 ml pH 8.3水溶液用6.38 mg（15.00 μmol）2-1的1 ml乙腈溶液处理。将所得到的溶液在室温搅拌1小时，并且通过阴离子交换制备型LC（6 ml Resource Q 阴离子交换柱；A = 50% 0.02 mmol Tris /50%甲酰胺；B = 50% 0.02 mmol Tris - 400 mmol NaOCl4 /50%甲酰胺 30-100% A:B梯度，30分钟内，10 ml/分钟流动）纯化粗反应。将纯馏分合并，用水稀释，且使用MW 300透析膜，相对于水离心透析3X。将合并的水性材料冷冻且冻干过夜，以给出作为无定形白色粉末的7.31 mg所需产物2-2。LC/MS：测量的质量 = 7387；纯度 = >99%。

步骤2

将5.00 mg（0.673 μmol）2-2的950 μl 3:1甲酰胺:水溶液用50 μl TEAA处理，并且将该溶液用3.32 mg（1.347 μmol）P1的1000 μl 3:1甲酰胺:水溶液处理。将所得到的溶液搅拌18小时，并且通过阴离子交换制备型LC（6 ml Resource Q 阴离子交换柱；A = 50% 0.02 mmol Tris /50%甲酰胺；B = 50% 0.02 mmol Tris - 400 mmol NaOCl4 /50%甲酰胺 30-100% A:B梯度，30分钟内，10 ml/分钟流动）纯化粗反应。将纯化的馏分合并，用水稀释，且相对于水离心透析3X。将合并的水性材料冷冻且冻干过夜，以给出作为白色无定形粉末的5.18 mg所需产物2-3。LC/MS：测量的质量 = 9737；纯度 = >99%，如通过HPLC和MS测定的，不存在过量肽。

步骤3

将5.00 mg（0.511 μmol）2-3的200 μl pH 7.4 PBS缓冲液溶液用3.39 mg（0.511 μmol）R3g 的100 μl pH 7.4 PBS溶液处理。将所得到的溶液在95℃加热一分钟，且冷却至RT。将溶液用水稀释，并且相对于水透析3x。将水性材料冷冻且冻干过夜，以提供作为白色无定形粉末的3.22 mg所需产物2-4。LC/MS：测量的质量过客 = 9737，引导 = 6631。

以与上文对于2-4合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例3

步骤1

将63 mg（0.283 mmol）3-2的1.5 ml乙腈溶液用43.9 mg（0.339 mmol）二异丙基乙胺溶液处理。将所得到的溶液缓慢地逐滴加入300 mg（0.566 mmol）3-1的1.5 ml乙腈溶液中。将所得到的溶液在室温搅拌18小时，且在真空中浓缩。将所得到的油在Gilson仪器上反相制备型LC分离，使用Phenomenex Gemini C18柱，以给出作为澄清油的60 mg（35%）所需产物3-3。1H NMR（CDCl3）: 2.54（t，2H），2.83（m,4H），2.90（t,2H），2.96（t,2H），3.58（m,2H），3.66（m,10H），3.72（br m,6H）,（t,2H），3.84（t,2H），7.21（m.1H），7.72（m,2H），8.54（d,1H）。

步骤2

将54.9 mg（0.091 mmol）3-3的10 ml乙腈溶液加入90 mg（0.013 mmol）R5cp的10 ml pH 8.3水溶液中。将所得到的溶液在室温搅拌18小时。将反应在真空中浓缩，以去除乙腈，并且用50 ml水稀释。使用MW 3000透析膜，将所得到的溶液针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的90 mg（94%）所需产物3-4。LC/MS测量的质量 = 7417 ；纯度 = 90%。

步骤3

将4.00 mg（0.539 μmol）3-4的1 ml 3:1:1甲酰胺:水:DMSO溶液用4.00 mg（1.635 μmol） P1的1 ml 3:1:1甲酰胺:水:DMSO溶液处理，并且将所得到的溶液在室温搅拌5小时。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用DNA Pac 100柱和70:30- A:B线性梯度（A = 50%甲酰胺/50% 20 mM Tris-Cl/pH7.4 ；B = 50%甲酰胺/50% 20 mM Tris-Cl/400 mM NaOCl₄ /pH7.4）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的2 mg所需缀合物3-5。LC/MS:测量的质量 = 9769，纯度 = 95%，不存在残留肽。

步骤4

将2.00 mg（0.205 μmol）3-5的1 ml pH 7.4 PBS缓冲液溶液用1.38 mg（0.205 μmol）R4g的0.25 ml pH 7.4 PBS缓冲液溶液处理。将所得到的溶液加热至95℃一分钟，冷却且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的1.2 mg所需双链体3-6。通过MS证实双链体，测量的质量 = 过客链9770，引导链6733。

以与上文对于3-5合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

以与上文对于3-6合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例4

步骤1

将在氮吹扫的圆底烧瓶中的3.13 mL（29.1 mmol）4-1和15.24 mL（87 mmol）DIPEA的150 mL THF溶液冷却至0℃，并且用逐滴加入的14.3 g（58.2 mmol）4-2的60 mL THF溶液处理。将所得到的溶液在0℃搅拌一小时，并且允许加温至室温。将粗反应用300 mL DCM稀释且用150 mL 1 N NaOH洗涤。将有机层分离且在真空中浓缩，随后通过快速层析（9:1 DCM: MeOH，1% NH₄OH）纯化，以给出6.84 g 4-3. ¹H NMR（CDCl₃）: 1.45（s,18H），2.73（bt,4H），3.21（m,4H），4.89（bs，2H）。

步骤2

将5.44 g（17.93 mmol）4-3的55 mL DCM溶液用以一份加入的2.77 g（17.93 mmol）4-4处理。将所得到的溶液搅拌0.5小时，这之后将粗反应混合物在真空中浓缩，且通过快速层析（100:0- 0:100% A:B线性梯度[A= 己烷，B = 乙酸乙酯]）纯化，以给出作为白色固体的7.2 g 4-5。¹H NMR（CDCl₃）: 1.44（sd,18H），3.25-3.40（m,6H），3.52（bt,2H），4.19（s,2H），4.42（s,2H），4.88（bt,1H），5.33（bs,1H）。测量的质量 = 420.5（M+1）。

步骤3

将1.0 g（2.38 mmol）4-5用32.5 ml无水HCl 4 M的二噁烷溶液处理，在15分钟后导致气体逸出和白色沉淀物。将所得到的浆过滤且将无定形固体溶解于水中，随后冻干以给出380 mg 4-6。¹H NMR（DMSO）: 2.9-3.1（m,4H），3.53（bq,4H），4.15（s,2H），4.33（s,2H），8.14（ds,6H）。测量的质量 = 220.3（M+1）。

步骤4

将30 mg（0.087 mmol）4-6和76 uL（0.436 mmol）DIPEA在300 μL DMSO中的浆用76.75 mg（0.18 mmol）2-1的300 μL DMSO溶液处理。将所得到的浆在50℃加热40分钟，伴随间断超声处理以达到同质性。将粗反应用1.5 mL DMSO稀释且用1.6 mL 0.1% TFA水溶液酸化。将溶液在Gilson仪器上反相制备型LC纯化，使用Phenomenex Gemini C18柱（95:5- 5:95% A:B线性梯度[A=含0.1% TFA的水，B = 含0.1% TFA的乙腈]），以给出43.40 mg 4-7。¹H NMR（DMSO）: 1.20（m,2H），1.3-1.5（m,8H），2.03（bq,4H），3.01（m,8H），3.1-3.3（m,8H），4.09（s,2H），4.24（s,2H），7.25（m,2H），7.7-7.95（m,8H），8.45（m,2H）。测量的质量 =421.0（M+2）。

步骤5

使用MW 3000透析膜，将50 mg（7.91 μmol）R1p针对250 mM TEAA离心透析三次，随后针对水离心透析两次。将透析物（dialate）冻干，以给出作为松散的白色无定形粉末的三乙铵（triethylammonium）加合物4-8。

步骤6

将39.9 mg（0.047 mmol）4-7和18.04 mg（0.047 mmol）HATU的650 μL DMSO溶液用12.2 μL（0.071 mmol）DIPEA处理。在20分钟后，将所得到的溶液加入50 mg（7.91 μmol）4-8和12.2 μL（0.071 mmol）DIPEA的2.65 mL DMSO溶液。将所得到的溶液在室温搅拌0.5小时。将粗反应在Gilson仪器上反相制备型LC纯化，使用Waters苯基Xbridge柱（95:5- 5:95% A:B线性梯度[A=含250 mM TEAA的水，B =含250 mM TEAA的乙腈]）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的34 mg所需缀合物4-9。测量的质量 = 7147。

步骤7

将5 mg（0.700 μmol）4-9的950 μL 3:1甲酰胺:水和50 μL 2M TEAA溶液用3.45 mg（1.40 μmol）P1的1.0 mL 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在RT搅拌0.5小时。将另外1.72 mg（0.7 μmol）P1加入反应中。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和100:0- 0:100% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 6.8；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 6.8）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为无定形固体的所需缀合物4-10，其在下一个步骤直接采用。

步骤8

将4-10在2.0 mL pH 7.4 PBS中的浆用以一份加入的2.37 mg（0.350 μmol）R1g溶液处理。将所得到的浆加热至95℃，且允许冷却至室温。观察到某些异质性，提示2.37 mg（0.35 μmol）R1g的添加且重复加热过程，伴随间断超声处理。将所得到的溶液冷却，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的所需双链体产物。通过MS证实双链体，测量的质量 = 18636。

以与上文对于4-11合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例5

步骤1

将60 mg（0.174 mmol）4-6和152.4 μL（0.872 mmol）DIPEA在600 μL DMSO中的浆用156 mg（0.366 mmol）1-1的600 μL DMSO溶液处理。将所得到的浆在50℃加热1.5小时，伴随搅动。将粗反应用1.5 mL DMSO稀释且用1.6 mL 0.1% TFA水溶液酸化。将溶液在Gilson仪器上反相制备型LC纯化，使用Phenomenex Gemini C18柱（95:5- 5:95% A:B线性梯度[A=含0.1% TFA的水，B = 含0.1% TFA的乙腈]），以给出110.15 mg 5-1。¹H NMR（DMSO）: 2.25-2.35（m,8H），3.1-3.4（m,16H），3.46（s,8H），3.55-3.65（m,8H）， 4.09（s,2H），4.24（s,2H），7.003（s,4H），7.91（bt,1H），8.01（s,2H）。测量的质量 =421.0（M+2）。

步骤2

将55.8 mg（0.050 mmol）5-1和18.94 mg（0.050 mmol）HATU的585 μL DMSO溶液用11.19 μL（0.064 mmol）DIPEA处理。在10分钟后，将所得到的溶液加入45 mg（7.12 μmol）4-8和11.19 μL（0.064 mmol）DIPEA的2.65 mL DMSO溶液。将所得到的溶液在室温搅拌15分钟。将粗反应在Gilson仪器上反相制备型LC纯化，使用Waters苯基Xbridge柱（95:5- 5:95% A:B线性梯度[A=含250 mM TEAA的水，B =含250 mM TEAA的乙腈]）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的23.5 mg所需缀合物5-2。测量的质量 = 7146。

步骤3

将5 mg（0.700 μmol）5-2的950 μL 3:1甲酰胺:水和50 μL 2M TEAA溶液用3.45 mg（1.40 μmol）P1的1.0 mL 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在RT搅拌0.5小时。将另外1.72 mg（0.7 μmol）P1加入反应中。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和100:0- 0:100% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 6.8；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 6.8）。将产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为无定形固体的所需缀合物5-3，其形式妨碍收率评估。测量的质量 = 12090。

步骤4

将5-3在300 μL pH 7.4 PBS中的浆用以一份加入的2.02 mg（0.298 μmol）R1g的200 μL pH 7.4 PBS溶液处理。将所得到的浆加热至95℃，且允许冷却至室温。加入1.15 mg（0.169 μmol）R1g的115 μL pH 7.4 PBS溶液，并且重复加热过程。将所得到的溶液冷却，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的所需双链体产物5-4。通过MS证实双链体，测量的质量 = 18859。

以与上文对于5-4合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例6

步骤1

在0℃，向6-2（58.6 mg，0.189 mmol）和二异丙胺（52.8 μL，0.303 mmol）的1.5 mL DMF溶液中加入EDCI（39.2 mg，0.303 mmol），并且将所得到的反应混合物搅拌10分钟。在10分钟后，将固体6-1（100 mg，0.152 mmol）以一份加入反应器皿中，随后为二异丙胺（26.5 μL，0.152 mmol）的添加，并且在30分钟内将反应混合物缓慢加温至室温。在LC-MS分析指示原材料的完全消耗后，将反应混合物用MeCN/H₂O=1/1稀释至2.5 mL，并且通过C18反相HPLC（10-55% MeCN的H₂O溶液，15分钟内）纯化。将收集的馏分合并且冻干，以给出作为白色粉末（40-70%收率）的6-3，MS: 837。

如下所述制备下述化合物：

步骤2

将6-3（1.50 mg，1.79 μmol）的400 μL甲酰胺/H₂O/2 M TEAA=3/1/0.1溶液用肽P1（11.0 mg，4.47 μmol）的200 μl甲酰胺/H₂O/2 M TEAA=3/1/0.1溶液处理。将所得到的溶液在室温搅拌2小时。在6-3完全消耗后，加入TCEP·HCl（5.12 mg，17.9 μmol）并且将反应混合物加热至37℃。在30分钟后，LC-MS分析指示二硫键的完全还原，并且将反应混合物用MeCN/H₂O=1/1稀释至2.5 mL。通过C18反相HPLC（10-55% MeCN的H₂O溶液，15分钟内）纯化和冻干提供作为白色固体的6-4，MS: 5672。

步骤3

将1-2（3.00 mg，0.452 μmol）的400 μL甲酰胺/pH=6.8 Tris·HCl缓冲液=3/1溶液用6-6（3.08 mg，0.543 μmol）的400 μl甲酰胺/pH=6.8 Tris·HCl缓冲液=3/1溶液处理。将所得到的溶液在室温搅拌2小时。在1-2完全消耗后，通过阴离子交换Resource Q柱（50-100% B的A溶液，A:甲酰胺/H₂O=1/1，20 mmol Tris·HCl，pH=7.4，B:甲酰胺/H₂O=1/1，20 mmol Tris·HCl，400 mmol NaClO₄，pH=7.4）纯化反应混合物。将合并的产物馏分用水稀释，并且使用MW 3000截止膜，针对水离心透析4次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的6-5，质量= 12313。

步骤4

向6-5（0.90 mg，0.073 μmol）的400 μL PBS 1X缓冲液溶液中加入R1g（0.51 mg，0.075 μmol）的400 μl PBS 1X缓冲液溶液。将所得到的溶液在90℃加热1分钟且冷却至室温。将退火的反应混合物用水稀释，并且用MW 3000截止膜，针对水离心透析4次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的6-6，过客链质量= 12313，引导链=6865。

如下所述制备下述化合物：

过客链质量 = 12313，引导链=7380。

实施例7

步骤1

将10 mg（1.54 μmol）R6p的1.46 mL水溶液用37.5 μL 2M TEAA、15 μL（0.015 mmol）1M DTT的水溶液和15 μL（0.108 mmol）TEA处理。将所得到的溶液搅动0.5小时，并且随后使用由2.5 mL DI水洗脱的NAP-25柱脱盐，以给出7-1。随后在下一个步骤直接采用产物。

步骤2

将来自先前步骤的7-1的2.5 mL DI水溶液用以一份加入的1.8 mg（5.02 μmol）7-2处理。将所得到的溶液搅拌10分钟，并且随后使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的9.55 mg 7-3，其无需进一步纯化带入下一步。

步骤3

将2.37 mg（2.82 μmol）4-8和1.07 mg（2.82 μmol）HATU的130 μL DMSO溶液用0.50 uL（2.82 μmol）DIPEA处理。在10分钟后，将所得到的溶液加入9.55 mg（1.41 μmol）7-3和2.46 μL（0.014 mmol）DIPEA的530 μL DMSO溶液。将所得到的溶液在室温搅拌10分钟。使用MW 3000透析膜，将粗反应针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的10.25 t 7-4，其无需进一步纯化带入下一步。

步骤4

将5 mg（0.652 μmol）7-4的950 uL 3:1甲酰胺:水和50 μL 2M TEAA溶液用2.32 mg（1.32 μmol）P6的1.0 mL 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在RT搅拌0.5小时。将另外1.16 mg（0.652 μmol）1-4加入反应中。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和100:0- 0:100% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 7.4；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 7.4）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供2.77 mg所需缀合物7-5。测量的质量 = 10976。

步骤5

将1 mg（0.092 μmol）7-5在100 μL pH 7.4 PBS中的浆用以一份加入的0.5 mg（0.074 μmol）R4g的100 μL pH 7.4 PBS溶液处理。将所得到的浆加热至95℃，且允许冷却至室温。将所得到的溶液冷却，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的1.5 mg所需双链体产物7-6。通过MS证实双链体，测量的质量 = 17711。

以与上文对于7-6合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例8

步骤1

将50 mg（7.89 μmol）R4p的3.6 mL pH 8.3水溶液用30.9 mg（0.055 mmol）8-1的400 uL乙腈溶液处理。将所得到的溶液搅拌10分钟。将粗反应在Gilson仪器上反相制备型LC纯化，使用Waters苯基Xbridge柱（95:5- 5:95% A:B线性梯度[A=含250 mM TEAA的水，B =含250 mM TEAA的乙腈]）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的32.3 mg所需缀合物8-2，测量的质量 = 6778。

步骤2

将5 mg（0.709 μmol）8-2的950 μL 3:1甲酰胺:水和150 μL 2M TEAA溶液用8.201 mg（1.475 μmol）8-3（以与实施例6，步骤1和2中所述那种等同的方式合成）的1.0 mL 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在RT搅拌0.5小时。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和100:0- 0:100% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 7.4；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 7.4）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为无定形固体的所需缀合物8-4，其在下一个步骤直接采用。

步骤3

将8-4在pH 7.4 PBS中的浆用以一份加入的1.25 mg（0.186 μmol）R4g溶液处理。将所得到的浆加热至95℃，且允许冷却至室温。将所得到的溶液冷却，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的3.68 mg所需双链体产物8-5。通过MS证实双链体，测量的质量 = 过客链12230，引导链 6733。

以与上文对于8-5合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例9

步骤1

将50 mg（7.69 μmol）R6p的4 mL pH 8.3水溶液用以一份加入的108 mg（0.054 mmol）9-1处理。将所得到的溶液搅拌10分钟。将粗反应在Gilson仪器上反相制备型LC纯化，使用Waters苯基Xbridge柱（95:5- 5:95% A:B线性梯度[A=含250 mM TEAA的水，B =含250 mM TEAA的乙腈]）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的47.39 mg所需缀合物9-2，测量的质量 = 分布在大约8400。

步骤2

将51 mg（6 μmol）9-2的5.85 mL水溶液用150 μL 2M TEAA，60 μL（0.060 mmol）1M DTT的水溶液和60 μL（0.430 mmol）TEA处理。将所得到的溶液搅动0.5小时，并且随后使用各由3.0 mL DI水洗脱的三个NAP-25柱脱盐，以给出9-3。随后在下一个步骤直接采用产物。

步骤3

将8.89 mg（0.017 mmol）9-4的9 mL乙腈溶液用逐滴加入的来自先前步骤的9-3的4.5 mL DI水溶液处理。将所得到的溶液搅拌15分钟，并且随后使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的19.07 mg 9-5，其无需进一步纯化带入下一步。

步骤4

将5 mg（0.562 μmol）9-5的950 μL 3:1甲酰胺:水和150 μL 2M TEAA溶液用6.25 mg（1.123 μmol）8-3的1.0 mL 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在RT搅拌0.5小时。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和100:0- 0:100% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 7.4；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 7.4）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为无定形固体的3.6 mg所需缀合物9-6。

步骤5

将1.58 mg（0.109 μmol）9-6的pH 7.4 PBS溶液用以一份加入的0.882 mg（0.131 μmol）R4g溶液处理。将所得到的溶液加热至95℃，且允许冷却至室温。将所得到的溶液冷却，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的2.35 mg所需双链体产物9-7。通过MS证实双链体，测量的质量 = 过客链分布在约14.5 kD，引导链 6732。

以与上文对于9-7合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例10

步骤1

在室温，向R7p（10.0 mg，1.54 μmol）的0.5 mL Tris·HCl缓冲液（pH=8.0）溶液中加入多分散的PEG1000-Mal 10-2（3.08 mg，3.08 μmol）的0.5 mL MeCN溶液，并且将所得到的反应混合物搅拌15分钟。在LC-MS分析指示起始R7p的完全消耗后，加入SMPEG24 10-1（10.8 mg，7.71 μmol）的0.5 mL MeCN溶液，并且将反应混合物搅拌另外2小时。通过加入水猝灭反应，并且用MW 3000截止膜，针对水离心透析5次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的10-3，且无需进一步纯化用于下一个步骤， MS~9000，具有多分散的PEG单元。

步骤2

将6-5'（1.70 mg，2.35 μmol）的500 μL甲酰胺/H₂O/2 M TEAA=3/1/0.1溶液用肽P7（19.6 mg，5.17 μmol）的500 μl甲酰胺/H₂O/2 M TEAA=3/1/0.1溶液处理。将所得到的溶液在室温搅拌2小时。在6-5'完全消耗后，加入TCEP·HCl（6.80 mg，23.5 μmol）并且将反应混合物加热至37℃。在2小时后，LC-MS分析指示二硫键的完全还原，并且将反应混合物用MeCN/H₂O=1/1稀释至2.5 mL。通过C3反相HPLC（40-90% MeCN的H₂O溶液，15分钟内）纯化和冻干提供作为白色固体的10-4，MS: 8189。

以与上文对于10-4合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

步骤3

将10-3（6.00 mg，0.682 μmol）的400 μL DMSO溶液用肽10-4（5.67 mg，0.682 μmol）的400 μl DMSO溶液处理。将所得到的溶液在室温搅拌过夜。通过尺寸排阻层析在Superdex^TM 75 10/300柱（200 mmol Tris·HCl，2 M NaCl，pH=8.0）上纯化产物。将合并的产物馏分用水稀释，并且用MW 10,000截止膜，针对水离心透析5次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的10-5，质量~17,200，具有多分散的PEG单元。

步骤4

向10-5（1.90 mg，0.111 μmol）的400 μL PBS 1X缓冲液溶液中加入R4g（0.845 mg，0.122 μmol）的400 μl PBS 1X缓冲液溶液。将所得到的溶液在90℃加热1分钟且冷却至室温。将退火的反应混合物用水稀释，并且用MW 3000截止膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的10-6，过客链质量= ~17,200，具有多分散的PEG单元，引导链=6732。

如下所述制备下述化合物：

过客链质量~17,200，具有多分散的PEG单元，引导链=6911。

实施例11

步骤1

将25 mg（3.95 μmol）R6p的2.5 mL pH 8.3水溶液用23.92 mg（0.028 mmol）11-1的500 μL乙腈溶液处理。将所得到的溶液搅拌10分钟。将粗反应在Gilson仪器上反相制备型LC纯化，使用Waters苯基Xbridge柱（95:5- 5:95% A:B线性梯度[A=含250 mM TEAA的水，B =含250 mM TEAA的乙腈]）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的12.57 mg所需缀合物11-2，测量的质量 = 7085。

步骤2

将5 mg（0.706 μmol）11-2的950 μL 3:1甲酰胺:水和150 μL 2M TEAA溶液用7.85 mg（1.411 μmol）8-4的1.0 mL 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在RT搅拌0.5小时。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和100:0- 0:100% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 7.4；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 7.4）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为无定形固体的5.4 mg所需缀合物11-3。

步骤3

将5.1 mg（0.403 μmol）11-3在500 uL pH 7.4 PBS中的浆用以一份加入的3.26 mg（0.484 μmol）R4g溶液处理。将所得到的悬液加热至95℃，且允许冷却至室温。将所得到的溶液冷却，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的7.55 mg所需双链体产物11-4。通过MS证实双链体，测量的质量 = 19378。

以与上文对于11-4合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例12

步骤1

将50.00 mg（7.89 μmol）R4p的3600 μl pH 8.3水溶液用30.90 mg（55.00 μmol）8-1的400 μl乙腈溶液处理，并且将所得到的溶液在室温搅拌30分钟。通过反相制备型LC（Gilson；5-95% B梯度；A= 200 mM TEAA，B = ACN；20分钟梯度；Waters苯基XBridge柱）纯化粗反应。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冷冻且冻干过夜，以提供作为松散的白色无定形粉末的32 mg所需产物12-1。10747。

步骤2

将2.35 mg（0.347 μmol）12-1的500 μl 3:1甲酰胺:水溶液用2.83 mg（0.693 μmol）P9的450 μl 3:1甲酰胺:水溶液处理，伴随50 μl TEAA的加入。将反应在室温搅拌18小时，并且通过阴离子交换制备型层析（Resource Q柱；10-100% B 梯度；A = 50% 0.02 mmol Tris /50%甲酰胺；B = 50% 0.02 mmol Tris - 400 mmol NaOCl4 /50%甲酰胺 30-100% A:B梯度，30分钟内，10 ml/分钟流动）纯化粗反应。将可疑产物峰用水稀释，相对于水透析3X。将水性透析物冷冻且冻干过夜，以给出作为玻璃状固体的1.37 mg所需产物12-2。LC/MS:测量的质量 = 10747；纯度 = 96%，不存在残留肽。

步骤3

将1.37 mg（0.131 μmol）12-2的500 μl pH 7.4 PBS溶液用0.792 mg（0.118 μmol）R4g的500 μl pH 7.4 PBS溶液处理，并且将所得到的溶液在95℃加热一分钟。将所得到的溶液冷却至RT，用水稀释且针对水透析3x（MW 3000离心透析膜）。将透析物水溶液冷冻且冻干过夜，以给出作为白色无定形粉末的1.45 mg所需产物12-3。LC/MS测量的质量过客 = 10747，引导 = 6733，双链体 = 17481。

实施例13

步骤1

在室温，向R4p（20.0 mg，3.16 μmol）的1.0 mL Tris·HCl缓冲液（pH=8.0）溶液中加入13-1（13.65 mg，9.47 μmol）的1.0 mL MeCN溶液，并且将所得到的反应混合物搅拌45分钟。在LC-MS分析指示起始R7p的完全消耗后，用MeCN/H₂O=1/1将反应混合物稀释至2.5 mL。通过X-Bridge^TM反相HPLC（10-60% MeCN的H₂O溶液，15分钟内）纯化和冻干提供作为白色固体的13-2，MS: 7659。

步骤2

将13-2（2.00 mg，0.261 μmol）的400 μL DMSO溶液用肽10-4 （2.57 mg，0.313 μmol）的400 μl DMSO溶液处理。将所得到的溶液在室温搅拌过夜。通过阴离子交换层析在DNA填充200柱（50-100% B的A溶液，A:甲酰胺/H₂O=1/1，20 mmol Tris·HCl，pH=7.4，B:甲酰胺/H₂O=1/1，20 mmol Tris·HCl，400 mmol NaClO₄，pH=7.4）上纯化产物。将合并的产物馏分用水稀释，并且用MW 10,000截止膜，针对水离心透析4次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的13-3，质量 = 15745。

步骤3

向13-3（0.70 mg，0.044 μmol）的400 μL PBS 1X缓冲液溶液中加入R4g（0.33 mg，0.049 μmol）的400 μl PBS 1X缓冲液溶液。将所得到的溶液在90℃加热1分钟且冷却至室温。将退火的反应混合物用水稀释，并且用MW 10,000截止膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的13-4，过客链质量= 15745，引导链=6732。

以与上文对于13-4合成描述的那种相似的方式制备下述化合物：

实施例14

步骤1

将20 mg（3.07 μmol）R8p的1.44 mL pH 8.3水溶液用19.60 mg（0.021 mmol）14-1的160 μL乙腈溶液处理。将所得到的溶液搅拌15分钟。将粗反应在Gilson仪器上反相制备型LC纯化，使用Waters苯基Xbridge柱（95:5- 5:95% A:B线性梯度[A=含250 mM TEAA的水，B =含250 mM TEAA的乙腈]）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的21.60 mg所需缀合物14-2，测量的质量 = 8106。

步骤2

将5 mg（0.617 μmol）14-2的950 μL 3:1甲酰胺:水和150 μL 2M TEAA溶液用13.72 mg（2.467 μmol）8-3的1.0 mL 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在RT搅拌0.5小时。将粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和100:0- 0:100% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 7.4；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 7.4）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为无定形固体的4.5 mg所需缀合物14-3。

步骤3

将1.5 mg（0.079 μmol）11-3在700 μL水中的浆用以一份加入的0.584 mg（0.087 μmol）7-7溶液处理。将所得到的悬液加热至95℃，且允许冷却至室温，随后倾析到MW 3000透析膜内。使用1:1甲酰胺:水将剩余固体溶解，并且与透析膜中倾析的材料合并。使用MW 3000透析膜，将所得到的溶液针对水离心透析三次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的1.26 mg所需双链体产物14-4。通过MS证实双链体，测量的质量 = 25740。

实施例15

将5.00 mg（0.573 μmol）3-5a的含150 μl 2M TEAA 的950 μl 3:1甲酰胺:水溶液用10.07 mg（1.145 μmol）10-4a的1 ml 3:1甲酰胺:水溶液处理，并且将所得到的溶液在室温搅拌15分钟。将粗反应用7.77 mg（1.145 μmol）R9g处理，并且通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上纯化，使用6 mL ResourceQ柱和95:5- 5:95% A:B线性梯度（A = 20 mM Tris.HCl，50%甲酰胺，pH 7.4；B = 20 mM Tris.HCl，400 mM NaClO4，50%甲酰胺，pH 7.4）。将可疑产物峰用水稀释，并且使用MW 3000透析膜，针对水离心透析四次。将透析物冻干，以提供作为松散的白色无定形粉末的3.93 mg所需缀合物15-1，测量的质量 = 24253（双链体）。

测定

RBC裂解测定方案

将2-3管血液收集到10 ml EDTA Vacutainer管中。通过将1-200 μL样品移出至微量离心机管，并且在微量离心机中以最大限度速度离心2分钟，检查样品的溶血。就溶血的证据观察上清液，其中弃去发生溶血的样品。将剩余样品合并。将5 ml合并的血液移出至50 ml离心管，并且用~ 35 ml合适缓冲液处理：pH 5.4或7.5的100mM二碱式磷酸盐。对于在磷酸盐缓冲液中可能具有可溶性问题的样品，替代以下述：pH 7.5缓冲液含有150 mM NaCl，20 mM Hepes；pH 5.4缓冲液含有150 mM NaCl，20 mM MES。将样品倒转以混合，并且以3000 rpm离心5分钟。将上清液抽吸且将该过程重复2X。将RBC重悬浮至50 ml所需pH缓冲液的总体积且贮存于冰上。在V形底或Easy-Wash 96孔板中按需要在缓冲液或水中制备待测试的化合物的系列稀释。标准测定使用10点2倍连续稀释。化合物稀释物一般以10X浓度在25 μL最终体积中制备。测试的最高浓度取决于材料及其各自的可溶性。一般浓度是100 μM。包括单独的缓冲液和1% Triton X-100的PBS溶液分别作为阴性和阳性对照。取决于待测试的样品数目和可用于测试的材料量，稀释物可以作为一式两份或单个孔制备。将175 μL合适的pH缓冲液加入每个孔中。使用大孔吸管端手工加入50 μL洗涤的RBC悬液。将样品研磨约6-8X以混合，并且在37℃温室或温箱中温育30分钟。在这个过程期间将板用低蒸发盖覆盖。将板从温室或温箱中取出，并且以~3000rpm离心5分钟。将150 μL上清液转移至透明底部96孔白色板，并且在541 nM处阅读吸光度。对于计算，从所有样品中扣除本底吸光度，其中每个pH分组分开处理。%溶血对于每个样品计算为% Triton X-100样品（100%溶血）。将数据标绘并且样品曲线显示于下文图1-3中。正方形曲线代表在pH 5.4的%溶血，并且菱形曲线代表在pH 7.5的%溶血。

siRNA bDNA测定一般方案

本文描述的siRNAs设计为靶向遍在表达的基因SSB（干燥综合征抗原B；NM_009278.4）。使用的siRNA序列在人、小鼠和大鼠转录物中是同源的。为了测试siRNA缀合物的沉默活性，将HeLa（人宫颈癌细胞系）细胞在补充有10%胎牛血清（FCS）的培养基（DMEM）中铺平板，且允许培养过夜（37℃，5%CO₂）。在第二天时，将培养基替换为含有浓度范围为10-0.0015 μM的siRNA缀合物的无血清培养基，并且留在细胞上总共72小时（37℃，5%CO₂）。根据供应商的说明书（Panomics Quantigene 1.0 bDNA试剂盒# QG0002），使用分支-DNA测定分析SSB mRNA水平。使用MTS测定（Promega目录# TB245）评估细胞生存，并且将所有数据针对来自未处理细胞的水平标准化。

如图4-11中所示，将HeLa细胞用所示化合物以剂量依赖性方式处理72小时，并且通过b-DNA测定分析SSB mRNA水平。

siRNA双萤光素酶测定一般方案

为了测试siRNA缀合物的沉默活性，将由萤光素酶载体稳定转染的HEK293T细胞在补充有10%胎牛血清（FCS）的培养基（DMEM）中铺平板，且允许培养过夜（37℃，5%CO₂）。这种报道细胞系统含有海肾-萤火虫（Renilla-Firefly）双萤光素酶构建体，并且具有掺入海肾萤光素酶的3' UTR中的SSB靶位点。第二天，将培养基替换为含有浓度范围为10-0.01 μM的siRNA缀合物的无血清培养基，并且留在细胞上总共24小时（37℃，5%CO₂）。根据供应商的说明书（Promega目录#E2920），使用来自Promega的Dual-Glo测定分析萤火虫和海肾蛋白质水平。萤火虫信号用作关于细胞生存的对照，并且海肾/萤火虫萤光素酶活性用于特异性mRNA敲低。将所有数据针对来自未处理细胞的水平标准化。

如图12-14中所示，将HEK293T细胞用所示化合物以剂量依赖性方式处理24小时，并且通过b-DNA测定分析SSB mRNA水平。

眼筛选方案

涉及动物的所有程序都依照ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research执行，并且由Merck Research Laboratories，West Point，PA的Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC）批准。雄性Brown Norway大鼠（6-8周）购自Charles River Laboratories。将siRNAs无菌制备以使感染的危险降到最低。对于玻璃体内给药，将大鼠用氯胺酮/赛拉嗪（40-90/5-10 mg/kg，IM）麻醉，并且将1%盐酸丙美卡因（1-2滴）作为局部麻醉剂应用于眼。对于玻璃体内注射，一对清洁的镊子用于轻轻proctose且使眼在合适的位置，并且30G尖针注射器用于将5ul测试siRNA或对照载体注射到紧在边缘后的玻璃体内。在处死当天，将大鼠用戊巴比妥钠（150-200 mg/kg，IP）实施安乐死。在去核后，将玻璃体、视网膜和RPE/脉络膜解剖且冷冻。将视网膜组织在RLT裂解缓冲液（Quaigen目录# 79216）中匀浆化，并且使用Qiagen Rneasy 96试剂盒（目录# 74181）纯化总RNA。随后通过定量PCR分析总RNA，以测定靶基因SSB与管家基因如GAPDH和PPIB的相对mRNA水平。图15详述了在单次玻璃体内给药所示化合物后3天，在大鼠视网膜组织中SSB mRNA的相对水平。

序列表

<110> Merck Sharp & Dohme Corp.

Aaronson, Jeffrey G.

Barnett, Stanley F.

Bartz, Rene

Colletti, Steven L.

Jadhav, Vasant R.

Momose, Aaron A.

Shaw, Anthony W.

Tellers, David M.

Tucker, Thomas J.

Wang, Weimin

Yuan, Yu

<120> 用于递送寡核苷酸的新型单一化学实体和方法

<130> MRL-MIS-00023

<150> 61/322,422

<151> 2010-04-09

<160> 59

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 1

His Phe His His Phe Phe His His Phe Phe His Phe Phe His His Phe

1 5 10 15

Phe His His Phe

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 2

Trp His His Trp Trp His Trp Trp His His Trp Trp His His Trp

1 5 10 15

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 3

His Trp His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 4

His Leu His His Trp Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 5

His Leu His His Leu Trp His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 6

His Leu His His Leu Leu His His Leu Trp His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 7

His Leu His His Leu Leu His His Leu Leu His Trp Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 8

His Leu His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Trp

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 9

His Leu His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Trp His His Leu

20

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 10

His Pro His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 11

His Leu His His Pro Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 12

His Leu His His Leu Pro His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 13

His Leu His His Leu Leu His His Leu Pro His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 14

His Leu His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Pro His His Leu

20

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 15

His Leu His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Pro

20

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 16

Glu Leu Glu Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 17

Glu Leu His His Leu Leu His Glu Leu Leu His Leu Leu His Glu Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 18

Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu

1 5 10 15

Leu Trp Arg Ala Cys

20

<210> 19

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 19

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

20 25 30

Arg

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 20

His Leu His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 21

His Trp His His Trp Trp His His Trp Trp His Trp Trp His His Trp

1 5 10 15

Trp His His Trp

20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 22

His Leu His His Leu Leu His His Trp Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 23

His Leu His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Trp His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Leu

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 24

His Leu His His Leu Leu His His Leu Leu His Leu Leu His His Leu

1 5 10 15

Leu His His Trp

20

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 25

His His His His His His His His His His Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu

20

<210> 26

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 26

His His His His His His His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 27

Leu Thr Thr Leu Leu Thr Leu Leu Thr Thr Leu Leu Thr Thr Leu

1 5 10 15

<210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 28

Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Leu Trp Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu

1 5 10 15

Leu Lys Leu Leu

20

<210> 29

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 29

Leu His Leu Leu His His Leu Leu His His Leu His His Leu Leu His

1 5 10 15

His Leu Leu His Leu Leu His His Leu Leu His His Leu

20 25

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 30

Phe Leu Gly Gly Ile Ile Ser Phe Phe Lys Arg Leu Phe

1 5 10

<210> 31

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 31

Phe Ile Gly Gly Ile Ile Ser Phe Ile Lys Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 32

Phe Ile Gly Gly Ile Ile Ser Leu Ile Lys Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 33

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 33

His Leu Leu His Leu Leu Leu His Leu Trp Leu His Leu Leu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu His Leu Leu

20

<210> 34

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 34

Gly Ile Gly Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala

1 5 10 15

Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln

20 25

<210> 35

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 35

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

Gly Gly

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 36

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 37

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 37

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 38

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 38

Gly Gly Gly Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Ala Arg Lys Lys Ala

1 5 10 15

Ala Lys Ala Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Ala Arg Lys Lys Ala

20 25 30

Ala Lys Ala Ala Lys

35

<210> 39

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 39

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 40

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 41

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 41

Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His

1 5 10 15

Ile Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala

20 25 30

<210> 42

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 42

Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala

20 25 30

<210> 43

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<221> 变体

<222> 2, 4, 6, 8, 10, 12

<223> Xaa = 正亮氨酸

<221> CARBOHYD

<222> (1)...(1)

<223> NHC12H25

<400> 43

Asp Xaa Lys Xaa Lys Xaa His Xaa Lys Xaa His Xaa

1 5 10

<210> 44

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 44

Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Trp Leu Lys Leu Leu Lys Leu

1 5 10 15

Leu Leu Lys Leu Leu

20

<210> 45

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 45

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly

20

<210> 46

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 46

Gly Leu Phe His Ala Ile Ala Ala His Phe Ile His Gly Gly Trp His

1 5 10 15

Gly Leu Ile His Gly Trp Tyr Gly

20

<210> 47

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 47

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Leu Ile Glu Gly Trp Tyr Gly

20

<210> 48

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 48

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly

20

<210> 49

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 49

Gly Leu Phe Lys Ala Ile Ala Lys Phe Ile Lys Gly Gly Trp Lys Gly

1 5 10 15

Leu Ile Lys Gly Trp Tyr Gly

20

<210> 50

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 50

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

20 25 30

Arg

<210> 51

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 51

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn

20 25 30

Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly

35 40

<210> 52

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 52

Gly Leu Phe His Ala Ile Ala Ala His Phe Ile His Gly Gly Trp His

1 5 10 15

Gly Leu Ile His Gly Trp Tyr Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln

20 25 30

Arg Arg

<210> 53

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 53

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Leu Ile Glu Gly Trp Tyr Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

20 25 30

Arg

<210> 54

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 54

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

20 25 30

Arg

<210> 55

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 55

Gly Leu Phe Lys Ala Ile Ala Lys Phe Ile Lys Gly Gly Trp Lys Gly

1 5 10 15

Leu Ile Lys Gly Trp Tyr Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

20 25 30

Arg

<210> 56

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 56

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys

1 5 10 15

Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Glu Gln

20 25 30

Glu

<210> 57

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 57

Leu His Leu Leu His His Leu Leu His His Leu His His Leu Leu His

1 5 10 15

His Leu Leu His Leu Leu His His Leu Leu His His Leu Gly Gly Gly

20 25 30

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

35 40

<210> 58

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 58

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Gly Gly Leu

1 5 10 15

His Leu Leu His His Leu Leu His His Leu His His Leu Leu His His

20 25 30

Leu Leu His Leu Leu His His Leu Leu His His Leu

35 40

<210> 59

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸序列

<400> 59

Leu Ile Arg Leu Trp Ser His Ile His Ile Trp Phe Gln Trp Arg Arg

1 5 10 15

Leu Lys Trp Lys Lys Lys

20

Claims

1.一种模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至siRNA；和3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至所述接头。

2.权利要求1的模块组合物，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至所述siRNA的引导链。

3.权利要求1的模块组合物，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至所述siRNA的过客链。

4.一种模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至siRNA；和3）选自SEQ ID NOs: 1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至所述接头。

5.权利要求4的模块组合物，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至所述siRNA的引导链。

6.权利要求4的模块组合物，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至所述siRNA的过客链。

7.一种模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至siRNA；和3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至所述接头。

8.权利要求7的模块组合物，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至所述siRNA的引导链。

9.权利要求7的模块组合物，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至所述siRNA的过客链。

10.一种模块组合物，其包含1）siRNA；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在任何3'和/或5'末端连接至siRNA；和3）选自SEQ ID NOs: 28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽连接至所述接头。

11.权利要求10的模块组合物，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至所述siRNA的引导链。

12.权利要求10的模块组合物，其中所述接头在3'和/或5'末端连接至所述siRNA的过客链。