CN103813808A - 用于载物递送进入细胞的系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及命名为NickFect的用于细胞内载物递送的系统,该系统包括至少一种组分A,其共价地连接至细胞穿透肽B和/或肽或非肽构建体C。所述递送系统NickFect涉及与载物非共价或共价复合的化学修饰的新的细胞穿透肽(CPP),用于有效的细胞递送。
Description
技术领域
本发明涉及命名为NickFect的用于细胞内载物(cargo)递送的系统,该系统包含至少一种组分A,其共价连接至细胞穿透肽B和/或肽或非肽构建体C。所述递送系统NickFect涉及与载物非共价或共价复合(络合)的化学修饰的新的细胞穿透肽(CPP)用于有效的细胞递送。更精确地,本发明涉及包含无毒性的肽递送载体的建构物(构建体),其具有增加的稳定性且更有效地从胞内溶酶体逃脱并且其能够与载物形成稳定的复合物(络合物),其在血清的存在下保持完整。
本发明涉及一种递送系统,其具有所形成的纳米颗粒的整体负电荷,用于寡核苷酸递送。
本发明还涉及一种递送系统,其包含分支的CPP,其中脂肪酸修饰的TP10或它的部分通过赖氨酸或它们的类似物的α、β、γ、ε-氨基连接至两亲性肽和/或α-螺旋肽或肽片段。
此外,本发明涉及用于体外或体内将载物(RNA、DNA、药物、质粒、小环(minicircles)等)递送进入靶细胞的细胞质或细胞核的方法。本发明还涉及该系统在疾病的诊断中作为研究工具和作为靶向系统的用途、包含上述系统的组合物特别是药物组合物、以该系统覆盖的材料以及具有进入材料的递送系统的材料。最后还涉及新的细胞穿透肽。
背景技术
疏水性细胞膜是封闭细胞内容物的脂双层。它的功能是作为屏障:通常,仅小的和/或疏水性分子可以穿过,并且防止其它大分子如裸露DNA、RNA或蛋白质进入细胞内部。虽然在过去的十年中设计了几种策略来解决此问题,但不能穿过质膜仍然是成就目前的药物研究和开发(R&D)要克服的主要障碍之一。
在过去的40年中,已开发了若干种目的在于调节基因表达的基于寡核苷酸(ON)的方法。除了其它因素以外,这类方法的效率还取决于ON有效摄取进入细胞以及随后的内体逃逸。用于基因调节的其它最基本的方法涉及使用细菌载体来表达感兴趣的基因。除了评价不同基因的功能方面以外,极具吸引力的策略是在临床环境中利用,即基因治疗。最初考虑基因治疗用于遗传性基因疾病的矫正治疗,例如,通过剪接-校正寡核苷酸。然而,在过去的15年中,用于癌症疾病的实验性基因治疗已成为最常见的应用,虽然也已经研究了其它获得性疾病[1]。
已经出现利用较短ON序列来干扰基因表达的其它通用策略。最近已严格地开发了基于双链RNA分子的、长度为20-25个核苷酸的干扰RNA(siRNA)的反义方法,将其用于进行基因沉默或剪接校正ON(SCO),并用于操作剪接模式[2,3]。虽然是用于调节基因表达的有效生物分子,但它们的亲水性本性和大小(在大小超过1MDa的质粒的情况下)会阻止细胞内化。
因此,为了促进目前的基因治疗,需要各种细胞递送系统来将不同分子转运进入细胞,但它们的大多数具有一些缺点,如高细胞毒性、固有的免疫原性、低转染效率等(表1)。
表1:递送载体
因此,细胞穿透肽具有作为体外和体内递送载体的巨大潜力和希望,因此它们可以用于研究和医学领域。细胞穿透肽(CPP),也称作蛋白转导结构域(PTD)是一类肽,在过去的几十年中,作为用于递送各种各样的载物的无毒性载体其已引起广泛关注。这些肽通常长度小于30个氨基酸(aa)并具有净正电荷和/或两亲性并且在体外和体内均能递送有效载荷穿过细胞膜[5]。今天有数百种已知的CPP。为了促进胞内递送,应该以共价或非共价方式将CPP与载物(寡核苷酸、质粒、小环等)连接。肽与ON或任何其它生物分子的共价连接是费力的程序,并且通常需要高浓度的肽连接体以获得显著的生物学响应。在非共价复合物的情况下,有效浓度是在纳摩尔范围内,并且可以通过在水中将肽和生物分子溶液混合在一起持续1小时来实现非共价复合物的形成。
发明内容
本发明提供了一种用于细胞内载物递送的系统,该系统包含一系列新的细胞穿透肽,其克服了非共价基因递送、低的和非均匀递送以及毒性的缺点。
附图说明
图1A.修饰的荧光素酶基因的前体mRNA(Pre-mRNA)。将来自在核苷酸705处携带点突变的B-球蛋白基因的内含子2插入荧光素酶基因。使用SCO阻滞此位点将剪接重定向至功能性mRNA。图1B、图1C.NickFect递送系统的一般示意性结构,其中实线表示共价结合而虚线则是非共价结合。
图2.在使用磷酸化CPP(NF1、NF5)或硬脂基-TP10和与200nM SCO复合(络合)的Lipofectamine2000处理以后的剪接校正。
在无血清DMEM中,使用不同摩尔比(5:1、7:1、10:1)的肽:2′-OMeON复合物(络合物)处理Hela pLuc705细胞4小时,其后,将培养基更换为完全生长培养基并另外温育20小时。根据制造商方案使用Lipofectamine2000。结果清楚地表明,除磷酸化以外,在肽主链中的修饰是增加剪接校正效力所必要的。
图3.在低的肽:ON摩尔比下,NickFect是有效的转染载体。在200nMON浓度下、以1:1、3:1、5:1、7:1、10:1、15:1的摩尔比将复合物施加至在SFM(A)和在FM(B)中的Hela pLuc705细胞。根据制造商方案使用Lipofectamine2000。NickFect1诱导了剪接校正的显著增加并且需要极低量的肽以获得生物学响应。
图4.在化学修饰的硬脂基-TP10类似物(NF11)中,在酪氨酸部分或苏氨酸部分处引入磷酰基对剪接校正活性的影响。在200nM ON浓度下、以3:1、5:1、7:1的摩尔比将复合物施加至在SFM(A)和在FM(B)中的Hela pLuc705细胞。根据制造商方案使用Lipofectamine2000。新的磷酸化的CPP诱导剪接校正的显著增加并且需要极低量的肽和ON来获得生物学响应。和NF2相比,在完全培养基中NF1更有效地起作用。
图5.嗜溶酶体试剂氯喹对剪接校正活性的影响。在有氯喹和没有氯喹存在的条件下,在200nM ON浓度下以最有效摩尔比率(7:1)将在SFM中的肽-ON复合物NF1、NF2和硬脂基-TP10施加至细胞。
图6.和LipofectamineTM2000相比,寡核苷酸-肽复合物对Hela细胞的生存力的影响。在以不同摩尔比添加肽:2’-OMe ON复合物之后24小时,通过MTS分析来测量细胞生存力。在200nM浓度下施加ON。在最有效浓度下NF1和NF2都没有毒性。
图7.NF1、NF2介导siRNA递送进入EGFP-CHO细胞,其正在稳定表达GFP蛋白。用在无血清DMEM培养基中的在MR20、MR25、MR30、MR40下的siRNA:肽复合物处理细胞4小时并使用HAM完全培养基处理细胞20小时。其后,洗涤、胰蛋白酶消化并通过流式细胞计数分析细胞。
图8.NF51、NF52、NF53和NF61作为递送载体用于在HEK293细胞中的pGL3质粒转染。
图9.NF51、NF52、NF53和NF61作为递送载体用于在CHO细胞中的pGL3质粒转染。
具体实施方式
本发明提供了一系列新的化学修饰的递送载体,NickFect,其基于TP10序列(AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2),并且使用非共价或共价方式可以将其用于体外或体内将不同载物(RNA、DNA、质粒、小环、药物等)有效递送进入靶细胞的细胞质和/或细胞核。新的递送系统,NickFect,能够与载物形成稳定的、紧密包装的、规则的并且是球形的纳米颗粒。形成的纳米颗粒具有与质膜和/或核膜更好的相互作用性质,并且可以更有效地内化进入细胞。
上述NickFect可以用于诊断疾病、用于基因治疗、用于肿瘤治疗和用于其它药物用途、作为研究工具和作为靶向系统。
更精确地,本发明涉及建构物(构建体),该建构物无毒性,具有增加的稳定性且更有效地逃离胞内溶酶体并且其能够与载物形成稳定的复合物,在血清的存在下其保持完整。
和商用转染试剂LipofectamineTM2000相比,在细胞内运送各种ON和质粒方面,NickFect递送载体更加有效,同时毒性更低。NickFect的低毒性使得它们适用于在敏感的细胞系统中和体内转染,而由于在需要的浓度下它的高毒性,LipofectamineTM2000仅可以体外使用。
NickFect转染100%的细胞群体,而在优化处理以后Lipofectamine仅转染60-80%,其取决于细胞系。
NickFect可以以粉末长期存储,而在+4℃下生产者保证LipofectamineTM2000的稳定性仅有6个月。
此外,对于RNA和DNA细胞递送,NickFect递送载体比常规使用的CPP更加有效。最重要的,仅需要极低量的肽和ON以获得生物学响应。
NickFect不仅对于运输在细胞的细胞核中起作用的ON化合物是活性的,而且可以有效地用于递送细胞质活性的ON如siRNA。对于递送siRNA进入细胞,NF1和Lipofectamine2000是同样活性的。虽然在任何给定siRNA浓度下Lipofectamine/siRNA复合物很少产生超过80%的下调的基因表达,但与siRNA复合的NickFect1在低siRNA浓度下带来几乎完全的RNAi。
本发明涉及命名为NickFect的用于细胞内载物递送的系统,该系统包含至少一种细胞穿透肽B,其在一些场合下包含共价连接的组分A和/或肽或非肽构建体C,其是靶向部分。所述递送系统NickFect能够通过共价或非共价连接来递送载物(图1B)。
细胞递送系统可以包含一种以上的肽B、一种以上的组分A和一种以上的靶向组分C,它们彼此以任何顺序相连接而没有任何载物。
可以将上述递送系统连接至可以被递送进入细胞、组织或穿过细胞层的一种或多种载物。
本发明还涉及新型的细胞穿透肽以及如何产生NickFect建构物(构建体)的方法。
作为靶向部分的组分C能够到达感兴趣的特定细胞或组织。靶向部分可以是适体或靶向肽如归巢肽或受体配体。
已经表明,以非天然氨基酸(例如鸟氨酸)替换天然氨基酸和通过使用非α-氨基用于肽键形成来改变其二级结构稳定了CPP并使得NickFect成为用于有效胞内递送质粒的非常有效的载体。
组分A
组分A包含磷酸基(PO3)或任何带负电荷的部分(Asp、Glu、碳水化合物等)。组分A甚至可以是具有整体负电荷的肽序列。可以将一种直链脂族组分A连接至肽B,或者可以借助于赖氨酸分支间隔子将两种类似或不同的组分A连接至肽B。
插入一个或若干个带负电荷的部分(新路径),已知作为细胞穿透肽会具有正的净电荷。
肽B
肽B包括化学修饰的细胞穿透肽TP10,其具有共价连接至肽主链的任何脂肪酸(例如硬脂酸)。
肽B还包含细胞穿透肽,脂肪酸修饰的TP10,其中在位置3处,以Lys取代Tyr,Orn用于随后加入带负电荷的分子或/基团,其中Thr、Ser用作酪氨酸类似物并且使用Asp或Glu用于在肽主链中插入羧基。
肽B还包含细胞穿透肽,脂肪酸修饰的TP10,其中在位置8处,以Thr、Ser、Tyr、Asp或Glu、任何其它亲水性氨基酸取代Ile以提高α-螺旋的亲水性。
肽B还可以是脂肪酸修饰的TP10,其中以亮氨酸异构体和/或类似物(例如正亮氨酸)取代至少一个亮氨酸。
肽B还可以是脂肪酸修饰的TP10,其中由赖氨酸异构体和/或衍生物或鸟氨酸异构体和/或类似物取代至少一个赖氨酸。
由非天然氨基酸替换天然氨基酸的使得肽对血清蛋白酶更加稳定。
肽B可以是包含脂肪酸修饰的TP10肽和/或其片段(例如甘丙肽(Galanin)、肥大脱粒肽(Mastoparan))的分支肽,其通过赖氨酸或它们的类似物的α、β、γ、δ、ε-氨基连接至两亲肽和/或α-螺旋肽和/或肽片段(例如NPY、P物质、缓激肽、模型序列如(Ala-Leu)n、TP10、甘丙肽、肥大脱粒肽)(图1C)。
可以同时进行这些修饰的若干种。
构建体C
肽或非肽构建体C包含能够到达兴趣的特定细胞或组织的靶向组分,并且其与肽B共价或非共价地连接。
构建体C是细胞或肿瘤归巢肽、适体、受体配体、包含连接至失活肽的可切割位点的间隔子、肽配体、细胞毒性肽、用于已知或未知受体的生物活性肽配体、选择性地结合至某种组织或细胞类型或核定位序列(NLS)的肽序列。
间隔子
间隔子可以用与将组分A、C和载物连接至组分B。
间隔子可以是包含一个或若干个赖氨酸和/或鸟氨酸残基的直链的或支链的部分。
载物
通过共价组装或复合物形成将载物连接至递送系统。
载物可以选自由以下各项组成的组中:寡核苷酸和其修饰变体、单链寡核苷酸(DNA、RNA、PNA、LNA和合成寡核苷酸)、双链寡核苷酸(siRNA、shRNA、诱饵dsDNA等)、质粒、小环和其其它变体、用于抑制病毒复制或抗病毒ON的合成核苷酸类似物。
载物可以是检测标记显像剂、标记分子、荧光标记、适体、受体配体、包含连接至失活肽的可切割位点的间隔子、肽配体、细胞毒性肽、生物活性肽、抗体、诊断剂、蛋白质、药物例如抗癌药物或抗生素。
作为载物的抗癌药物可以选自烷化剂、抗代谢物和细胞毒性抗生素。
在本发明的进一步的方面,在疾病的诊断中、在基因治疗中可以使用根据本发明的建构物(构建体)作为研究工具、作为靶向系统和作为药物组合物。
现在将通过简要描述附图、材料和方法、包括图和图例以及样品序列的实施例来进一步说明本发明,但应当明了,本发明的范围并不限于任何具体提及的实施方式或细节。
表2.NickFect(NF)的样品序列
名称 | 序列 |
NickFect1 | 硬脂基-AGY(PO3)LLGKTNLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect2 | 硬脂基-AGYLLGKT(PO3)NLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect3 | 硬脂基-AGY(PO3)LLGKT(PO3)NLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect4 | AGY(PO3)LLGK(硬脂基)TNLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect5 | 硬脂基-AGY(PO3)LLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect6 | 硬脂基-AGK(K-2PO3)LLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect7 | AGK(K-2PO3)LLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect11 | 硬脂基-AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect12 | 硬脂基-AGYLLGKSNLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect13 | 硬脂基-AGYLLGKYNLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect14 | 硬脂基-AGDLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect15 | 硬脂基-AGELLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect21 | AGYLLGK(硬脂基)TNLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect22 | AGYLLGK(硬脂基)SNLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect23 | AGYLLGK(硬脂基)YNLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect24 | AGDLLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect25 | AGELLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect31 | 硬脂基-AGK(K-Glu2)LLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect32 | 硬脂基-AGK(K-Asp2)LLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect33 | 硬脂基-AGK(K-Asp,Glu)LLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect34 | 硬脂基-AGYLLGK(K-Glu2)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect35 | 硬脂基-AGYLLGK(K-Asp2)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect36 | 硬脂基-AGYLLGK(K-Asp,Glu)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect37 | 硬脂基-AGO(K-Glu2)LLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect38 | 硬脂基-AGO(K-Asp2)LLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect39 | 硬脂基-AGO(K-Glu,Asp)LLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect41 | AGK(K-Glu2)LLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect42 | AGK(K-Asp2)LLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect43 | AGK(K-Asp,Glu)LLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect51 | δ-(硬脂基-AGYLLG)O INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect52 | α,ε(硬脂基-AGYLLG)2K INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect53 | ε-(硬脂基-AGYLLG)K INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect54 | α-(RPPGFSPFR)-ε-(硬脂基-AGYLLG.)-K INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect55 | α-(ALALLL)-ε-(硬脂基-AGYLLG)-K INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect56 | α-(RPKPQQFGLM)-δ-(硬脂基-AGYLLG)O INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect64 | 硬脂基-AGYLLGOINLOALAALAOOIL-NH2 |
NickFect71 | AGYLLGO(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect72 | AGYLLGO(硬脂基)INLOALAALAKKIL-NH2 |
NickFect73 | AGYLLGO(硬脂基)INLOALAALAOKIL-NH2 |
NickFect73 | AGYLLGO(硬脂基)INLOALAALAOOIL-NH2 |
NickFect81 | 硬脂基-AGYLLGKIN-Nle-KALAALAKKIL-NH2 |
NickFect82 | 硬脂基-AGYL-Nle-GKIN-Nle-KALAALAKKIL-NH2 |
NickFect82 | 硬脂基-AGYL-Nle-GKIN-Nle-KA-Nle-AALAKKIL-NH2 |
NickFect91 | K(Asp2)AGYLLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect92 | K(Glu2)AGYLLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect93 | K(Asp,Glu)AGYLLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect94 | K(Asp,硬脂基)AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 |
NickFect95 | O(Asp2)AGYLLGK(硬脂基)INLKALAALAKKIL-NH2 |
实施例和实验
下文通过实施例和与NickFect和PepFect系统以及还与Lipofectamine2000作为阳性对照的比较描述了本发明,其中Lipofectamine2000是目前用于体外的市场领先的转染试剂。首先,描述了递送载体的改进和改造。然后描述了各种方法的测试以说明多用途的NickFect如何用于递送剪接校正寡核苷酸、质粒、和siRNA。另外,相比于已经按照制造商的方案使用的Lipofectamine2000,由更低的细胞毒性、均匀和有效的转染示出了NickFect肽的整体改善。已经在一种以上的细胞类型中并且在大多数情况下在血清存在下进行所有实验。
材料和方法
合成肽
利用使用Rink-酰胺MBHA(甲基苄基羟胺)树脂(Fluka)作为固相的Fmoc(芴甲氧羰基)固相肽合成策略(Fields and Noble,1990),在自动化肽合成仪(Applied Biosystems,ABI433A,USA)上以0.1mmol规模以逐步合成方式合成肽以获得C-端酰胺化的肽。在室温下,在二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1:1)中,通过使用5当量硬脂酸(Sigma,德国)、3当量HOBt和3当量HBTU(MultiSyntech,德国)、6当量DIEA(Sigma,德国)处理肽基树脂过夜,以将硬脂酸人工地连接至肽的N端。为了合成磷酸化的肽,使用了磷酸苏氨酸Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH(Fluka,德国)和磷酸酪氨酸Fmoc-Tyr(PO(OBzl)OH)-OH(Merck,德国)单体,并在室温下在DCM/DMF/NMP/DMSO(3:3:3:1;v:v:v:v)混合物中通过使用3当量的磷酸单体、3当量HOBt和3当量HBTU、6当量DIEA处理肽基树脂3小时人工地进行连接以提高产量。使用标准方案(95%TFA/2.5%TIS/2.5%H2O)进行最后的切割。使用C18柱(Phenomenex Jupiter C4,5μm,300A,250×10mm)并使用包含0.1%TFA的20-80%的乙腈/水的梯度通过反相HPLC纯化肽。通过MALDI-TOF质谱法(The Voyager-DETM PROBiospectrometryTM System)以正线性模式并使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质(Sigma-Aldrich)来分析肽的特性(identity)。基于准确称量载物的稀释度确定肽的摩尔浓度。在表1中示出肽的序列。
自Microsynth AG(瑞士)购买Cy5标记和未标记硫代磷酸2’-O-甲基RNA寡核苷酸(CCU CUU ACC UCA GUU ACA)。
细胞培养
在37℃、5%CO2下,在具有glutamax并补充有0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠、10%FBS、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中生长HeLa pLuc705细胞(由R.Kole和B.Leblue惠赠)和HEK293细胞。在具有glutamax并补充有0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠、10%FBS、100U/ml青霉素、和100mg/ml链霉素的DMEM-F12培养基中生长CHO细胞。细胞在37℃下在5%CO2气氛中生长。所有培养基和化学品均购自PAA LaboratoriesGmbH(德国)。
复合物形成
形成SCO/CPP复合物:以10%的最终处理体积(即50μl)在双蒸水中,以不同摩尔比(1:0-1:20)混合硫代磷酸2′-OMe寡核苷酸与CPP。在室温下形成复合物持续1小时,同时在24-孔板中将细胞培养基更换成新鲜的无血清DMEM(450μl)。其后,将复合物加入每个孔中。当使用LipofectamineTM2000(Invitrogen,USA)时,在OPTIMEM培养基(Invitrogen,USA)中根据制造商的方案制备复合物。
形成质粒/CPP复合物:以1/10的最终处理体积(50μl)在双蒸水中,在不同的电荷比(1:1-1:5)下将0.5μg的pGL3荧光素酶表达质粒或pEGFP绿色荧光蛋白表达载体与CPP混合。1小时以后,将复合物加入到在450μl新鲜无血清培养基中生长的细胞中。当使用Lipofectamine2000时,根据制造商的方案(Promega,USA)制备复合物。
凝胶阻滞试验
在Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液中,在100V下,复合物在2%琼脂糖凝胶中电泳30分钟以后,利用Cy5标记的ON并通过Typhoon VariableMode Imager(Amersham,瑞典)来分析寡核苷酸/CPP复合物的形成。
在100V下,在包含溴乙啶(Sigma,德国)的TAE缓冲液中,在2%琼脂糖凝胶上电泳1小时,分析质粒/CPP复合物。
剪接校正试验
在实验前24小时,在24-孔板中接种细胞(50,000个)以在接种一天后达到约60%汇合。在500μl无血清或含血清的培养基中,在200nM寡核苷酸浓度下,使用6种不同摩尔比(1:1、3:1、5:1、7:1、10:1、15:1)的肽:2′-OMe ON复合物来处理细胞4小时,接着添加1ml10%含血清培养基并温育另外20小时。其后,使用PBS缓冲液洗涤细胞,并在4℃下使用100μl的在HEPES–Krebs–Ringer(HKR)缓冲液中的0.1%TritonX-100(曲通X-100)溶解30分钟。根据制造商的建议,在GLOMAXTM96微孔板光度计(Promega,瑞典)上使用Promega的荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性,并通过使用用于蛋白质浓度测量的DC蛋白质测定法(Bio-Rad,USA)归一化为蛋白质含量。将LipofectamineTM2000用作用于测量转染效率的阳性对照并将裸寡核苷酸(naked oligonucleotides)用作阴性对照。
在使用1-萘基磷酸钠一水合物-N7000(最终浓度为200μM)的实验中,在使用肽:2’-OMe ON复合物处理细胞30分钟以前,将抑制剂加入培养基。在将复合物加入细胞2小时以后,除去培养基并使用新鲜培养基更换以避免抑制剂的毒性效应。在使用氯喹的实验中,将氯喹(最终浓度为100μM)连同肽:2’-OMe ON复合物一起加入细胞以促进内体逃逸。在将复合物和氯喹加入细胞4小时以后,使用新鲜培养基更换培养基以避免氯喹的毒性作用。
质粒转染
在实验以前24小时将50000个CHO(中国仓鼠卵巢细胞)或HEK293(人胚肾293细胞(Human Embryonic Kidney293细胞))细胞接种在24-孔板中。在无血清或完全培养基中,以不同的电荷比(1:1、1:2、1:3、1:5)使用质粒:CPP复合物处理细胞4小时。根据制造商的方案使用LipofectamineTM2000(Invitrogen,瑞典)。
在处理4小时以后,添加500μl完全生长培养基并温育另外20小时。其后,使用HKR洗涤细胞两次,并在室温下利用100μl的在HKR缓冲液中的0.2%Triton X-100溶解30分钟。在pGL3质粒的情况下,在GLOMAXTM96微孔板光度计(Promega,瑞典)上使用Promega的荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性,而在pEGFP载体的情况下,在基于Biotek Synergy Mx单色器的多模式微量板读数器(BioTek Instruments,Inc.,USA)上完成荧光素测量。将数据归一化为使用DC蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories,Inc,USA)测得的蛋白质含量。
FACS(siRNA下调)
在实验以前24小时,在96-孔板中接种EGFP-CHO细胞(10000)以在实验当天达到60%汇合。为了形成复合物,在十分之一的最终处理体积(即10μl)中并在MQ水中将肽(100μM贮备溶液)与siRNA(10μM贮备溶液)混合。使用在无血清DMEM中的以下最终浓度:100nM siRNA、MR20、MR25、MR30、MR40。
在室温下形成复合物60分钟并加入至在100μl生长培养基中的细胞中。4小时以后,将100μl新鲜培养基加入孔中并温育细胞另外20小时。根据制造商(Invitrogen)的建议使用LF2000进行处理。24小时以后,除去培养基。使用PBS冲洗细胞,并在37℃下使用在PBS中的胰蛋白酶/EDTA自培养板中脱离若干分钟。使用含5%胎牛血清(FBS)的PBS悬浮细胞。
使用BD FacsCanto流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)进行流式细胞计数分析。由散射图(前向散射光(FSC)与侧散射光(SSC)图)确定存活细胞的群体。每个样品分析了来自存活细胞群体的最少10,000个事件。
毒性测量
根据制造商的说明使用CellTiter96水性非放射性细胞增殖测定(MTS)研究了细胞增殖。简而言之,在实验前1天,在96-孔板上完全DMEM中接种10000个Hela pLuc705细胞/孔。在无血清培养基中,使用4种不同摩尔比(5:1、7:1、10:1和20:1)的肽:2’-OMe ON复合物处理细胞4小时,接着添加包含10%血清的培养基并温育另外20小时。根据制造商(Promega Biotech AB,瑞典)的一般方案添加MTS。通过在代谢活性细胞中发现的脱氢酶来完成MTS到水溶性甲臜(formazan)的转化。在490nm处测量甲臜产物的吸光率,其与在培养物中的活细胞的数目成正比。在Tecan Sunrise微孔板吸光率读取器(Tecan Group Ltd.,瑞士)上测量吸光率并且使用GraphPad Prism软件5.0(Graphpad Software,CA,USA)确定存活细胞的百分比。
参考文献
1.Cross,D.&Burmester,J.K.Gene therapy for cancer treatment:past,present and future.Clin Med Res4,218-27(2006).
2.Kim,D.H.&Rossi,J.J.Strategies for silencing human diseaseusing RNA interference.Nat Rev Genet8,173-84(2007).
3.Mercatante,D.R.,Sazani,P.&Kole,R.Modification of alternativesplicing by antisense oligonucleotides as a potential chemotherapyfor cancer and other diseases.Curr Cancer Drug Targets1,211-30(2001).
4.EL-Andaloussi,S.,Holm,T.&Langel,?.Cell-penetrating peptides:mechanisms and applications.Curr Pharm Des11,3597-611(2005).
5.Mae,M.&Langel,U.Cell-penetrating peptides as vectors forpeptide,protein and oligonucleotide delivery.Curr OpinPharmacol6,509-14(2006).
6.El-Andaloussi,S.,Jarver,P.,Johansson,H.J.&Langel,U.Cargo-dependent cytotoxicity and delivery efficacy ofcell-penetrating peptides:a comparative study.Biochem J407,285-92(2007).
7.Abes,S.et al.Vectorization of morpholino oligomers by the(R-Ahx-R)4peptide allows efficient splicing correction in theabsence of endosomolytic agents.J Control Release116,304-13(2006).
8.Bendifallah,N.et al.Evaluation of cell-penetrating peptides(CPPs)as vehicles for intracellular delivery of antisense peptide nucleicacid(PNA).Bioconjug Chem17,750-8(2006).
9.Lundberg,P.,El-Andaloussi,S.,Sutlu,T.,Johansson,H.&Langel,U.Delivery of short interfering RNA using endosomolyticcell-penetrating peptides.Faseb J21,2664-71(2007).
10.Derossi,D.,Joliot,A.H.,Chassaing,G.&Prochiantz,A.The thirdhelix of the Antennapedia homeodomain translocates throughbiological membranes.J Biol Chem269,10444-50(1994).
11.Soomets,U.et al.Deletion analogues of transportan.BiochimBiophys Acta1467,165-76(2000).
12.El-Andaloussi,S.,Johansson,H.J.,Holm,T.&Langel,U.A NovelCell-penetrating Peptide,M918,for Efficient Delivery of Proteinsand Peptide Nucleic Acids.Mol Ther15,1820-6(2007).
13.Wender,P.A.et al.The design,synthesis,and evaluation ofmolecules that enable or enhance cellular uptake:peptoid moleculartransporters.Proc Natl Acad Sci U S A97,13003-8(2000).
14.Kang,S.H.,Cho,M.J.&Kole,R.Up-regulation of luciferase geneexpression with antisense oligonucleotides:implications andapplications in functional assay development.Biochemistry37,6235-9(1998).
15.Morris,M.C.,Vidal,P.,Chaloin,L.,Heitz,F.&Divita,G.A newpeptide vector for efficient delivery of oligonucleotides intomammalian cells.Nucleic Acids Res25,2730-6(1997).
16.Morris,M.C.,Chaloin,L.,Mery,J.,Heitz,F.&Divita,G.A novelpotent strategy for gene delivery using a single peptide vector as acarrier.Nucleic Acids Res27,3510-7(1999).
17.Du,L.,Pollard,J.M.&Gatti,R.A.Correction of prototypic ATMsplicing mutations and aberrant ATM function with antisensemorpholino oligonucleotides.Proc Natl Acad Sci U S A104,6007-12(2007).
18.Garcia-Blanco,M.A.,Baraniak,A.P.&Lasda,E.L.Alternativesplicing in disease and therapy.Nat Biotechnol22,535-46(2004)。
Claims (23)
1.一种包括细胞穿透肽B的用于载物递送进入细胞的系统,所述系统可以包括共价连接的组分A和共价或非共价连接的肽或非肽构建体C,作为用于将载物递送进入细胞的靶向部分。
2.根据权利要求1所述的系统,其中,肽B包括化学修饰的细胞穿透肽TP10,所述细胞穿透肽TP10具有共价连接至主链的任何脂肪酸(例如硬脂酸)。
3.根据权利要求1-2所述的系统,其中,由Lys、Orn、Thr、Ser、Asp或Glu取代在位置3处的Tyr。
4.根据权利要求1-3所述的系统,其中,由Lys、Orn、Thr、Ser、Tyr、Asp、Glu或任何其它亲水性氨基酸取代在位置8处的Ile。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统,其中,由亮氨酸的异构体和/或类似物(例如正亮氨酸)取代至少一个Leu。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的系统,其中,由赖氨酸的异构体和/或类似物(例如鸟氨酸)取代至少一个赖氨酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统,其中,肽B是包含通过赖氨酸或它们的类似物的α、β、γ、δ、ε-氨基连接至两亲性肽和/或α-螺旋肽和/或肽片段(例如NPY、P物质、缓激肽、模型序列如(Ala-Leu)n、TP10、甘丙肽、肥大脱粒肽)的脂肪酸修饰的TP10肽和/或它的片段(例如甘丙肽、肥大脱粒肽)的分支肽。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的递送系统,其中,将一个或多个组分A直接地或通过间隔子连接至肽B。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的递送系统,其中,连接的组分A可以是不同的。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的系统,其中,组分A包含磷酸基(PO3)或任何带负电荷的部分(选自由Asp、Glu、碳水化合物但不限于此组成的组中)或者甚至可以是具有整体负电荷的肽序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的系统,包含至少一种组分C,所述组分C是靶向部分。
12.根据权利要求11所述的系统,其中,所述靶向部分是细胞或肿瘤归巢肽、适体、受体配体、包含连接至失活肽的可切割位点的间隔子、肽配体、细胞毒性肽、用于已知或未知受体的生物活性肽配体、选择性地结合至某种组织或细胞类型的肽序列、或核定位序列(NLS)。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统,进一步包括载物,其中一种或多种载物共价地和/或非共价地连接至组分B。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的系统,其中,将一种或多种组分A、一种或多种组分C以及一种或多种载物连接至肽B。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的系统,包含一种以上的肽B。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的系统,其中,使用间隔臂来连接至少一种组分C和载物。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的系统,其中,所述载物选自由以下各项组成的组中但不限于此:寡核苷酸和其修饰变体,包括单链寡核苷酸(DNA、RNA、PNA、LNA和它们的类似物)、双链寡核苷酸(siRNA、shRNA、诱饵DNA);质粒和其其它变体;合成核苷酸类似物。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的系统,其中,所述载物选自由以下各项组成的组中:细胞或肿瘤归巢肽、适体、受体配体、包含连接至失活肽的可切割位点的间隔子、肽配体、细胞毒性肽、生物活性肽、抗体、诊断剂、蛋白质、药物例如抗癌药物或抗生素。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的系统,进一步包括至少一种显像剂和/或标记分子。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的系统,包含在连接循环中的清除调节剂,如PEG。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的系统,其中,所形成的肽B和载物纳米颗粒的总表面电荷是负的。
22.一种组合物,包含一种以上的根据权利要求1-21中任一项所述的递送系统。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的系统在疾病的诊断中作为研究工具、作为靶向系统和作为药物组合物的用途。
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Cited By (1)
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Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US9234048B2 (en) | 2012-01-18 | 2016-01-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Boronate-mediated delivery of molecules into cells |
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GB201900443D0 (en) * | 2019-01-11 | 2019-02-27 | Univ Tartu | Cell-penetrating peptides |
US20230221307A1 (en) * | 2019-09-06 | 2023-07-13 | Alessandro GORI | Conjugated composed of membrane-targeting peptides for extracellular vesicles isolation, analysis and their integration thereof |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010039088A1 (en) * | 2008-09-16 | 2010-04-08 | Kariem Ahmed | Chemically modified cell-penetrating peptides for improved delivery of gene modulating compounds |
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---|---|---|---|---|
MXPA05010773A (es) * | 2003-04-09 | 2005-12-12 | Neose Technologies Inc | Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos. |
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010039088A1 (en) * | 2008-09-16 | 2010-04-08 | Kariem Ahmed | Chemically modified cell-penetrating peptides for improved delivery of gene modulating compounds |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108473574A (zh) * | 2015-10-20 | 2018-08-31 | 索伦托治疗有限公司 | 细胞内递送化合物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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US20140038281A1 (en) | 2014-02-06 |
WO2012113846A1 (en) | 2012-08-30 |
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