WO2016052442A1 - 細胞質送達ペプチド - Google Patents

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WO2016052442A1
WO2016052442A1 PCT/JP2015/077395 JP2015077395W WO2016052442A1 WO 2016052442 A1 WO2016052442 A1 WO 2016052442A1 JP 2015077395 W JP2015077395 W JP 2015077395W WO 2016052442 A1 WO2016052442 A1 WO 2016052442A1
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WO
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group
peptide
cytoplasm
substance
vector
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PCT/JP2015/077395
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English (en)
French (fr)
Inventor
史朗 二木
美沙穂 秋柴
祥正 川口
敏秀 武内
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国立大学法人京都大学
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans

Definitions

  • the present invention relates to a peptide for delivering a target substance to the cytoplasm, a cytoplasmic delivery agent and a substance introduction agent.
  • Non-patent Document 1 various biosensors utilizing the recognition ability of natural proteins have been developed (Non-patent Document 1), and application to intracellular measurement is expected.
  • Non-patent Document 1 When introducing such chemically modified proteins from the outside of the cell into the cell, a considerable amount of the protein added from the outside of the cell is retained in the endosome and is not released or diffused into the cytoplasm. In many cases, the desired function of intracellular visualization and measurement of these proteins cannot be exhibited.
  • Typical examples of endosome destabilizing peptides that release proteins and drugs encapsulated in endosomes into the cytoplasm include GALA (Non-patent Document 2), influenza hemagglutinin-HA2 protein-derived peptide (Non-patent Document 3), and the like. These are pH-dependent membrane fusion peptides that exhibit membrane fusion properties when the pH in the endosome reaches about 5, damage the endosomal membrane, and release inclusions into the cytoplasm.
  • Non-patent Document 4 a conjugate of HIV-1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Tat peptide and HA2 peptide known as a membrane-permeable peptide (Non-patent Document 4) has been reported, and is used for intracellular introduction of physiologically active proteins such as a fusion protein of Cre and Tat. Examples have been reported.
  • physiologically active proteins, nucleic acids, drugs, or fluorescently labeled proteins or sensor molecules introduced from outside the cell can be introduced into the cytoplasm where the function and activity are expressed. Is desirable.
  • the conventional method has a problem in that these molecules taken up by endocytosis, which is a physiological uptake mechanism of cells, cannot be released from the endosome into the cytoplasm with satisfactory efficiency. From the viewpoint of delivery of biopharmaceuticals into cells, it is expected to effectively deliver proteins, nucleic acids, and pharmaceuticals such as antibodies incorporated by endocytosis to the cytoplasm. No method has been reported that can release the drug into the cytoplasm with satisfactory efficiency.
  • An object of the present invention is to deliver a target substance such as a protein, a nucleic acid, and a drug incorporated by endocytosis to the cytoplasm with high efficiency.
  • the present inventor can enhance the release of target substances such as antibodies, sensor molecules, nucleic acids, drugs, etc. from the endosome into the cytoplasm by substituting some of the amino acids of the basic amphiphilic peptide Lycotoxin with acidic amino acids. I found.
  • the present invention provides the following cytoplasmic delivery agent and substance introduction agent for a target substance such as a peptide, protein, nucleic acid, and pharmaceutical.
  • a target substance such as a peptide, protein, nucleic acid, and pharmaceutical.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an acyl group, an alkoxycarbonyl group, an aralkyloxycarbonyl group or an aryloxycarbonyl group
  • R 2 represents a hydroxyl group (OH), an amino group (NH 2 ), SR 2a , SK-R 2a or SKL-R 2a (R 2a represents OH or NH 2 ), an alkoxy group, an aralkyloxy group or an aryloxy group, provided that the amino acid is an L-type amino acid. Or a D-type amino acid.
  • Item 2. The peptide according to Item 1, wherein X 1 represents L, X 2 represents A, X 3 represents E, and X 4 represents Q.
  • Item 3. Item 4.
  • Item 4. A cytoplasmic delivery agent comprising the peptide according to any one of Items 1 to 3.
  • Item 5. A substance introduction agent that targets the cytoplasm, comprising the peptide according to any one of Items 1 to 3 in a vector.
  • Item 6. Item 4. A substance introduction agent that targets the cytoplasm, wherein the peptide according to any one of Items 1 to 3 and a target substance are covalently bonded directly or via a spacer.
  • Item 7. A substance that targets the cytoplasm, wherein the peptide according to any one of Items 1 to 3 and the target substance form a non-covalent complex directly or through another molecule that interacts with the target substance. Introducing agent.
  • Item 8. Item 6.
  • Item 9. Item 6. The substance introduction agent according to Item 5, wherein the peptide is bound to a component of the vector directly or via a spacer.
  • Item 10. Item 10. The substance introduction agent according to Item 5, 8 or 9, wherein the peptide is encapsulated in a vector together with a target substance.
  • the substance introduction agent according to Item 5, 8 or 9, wherein the vector is a liposome, nanogel or polymer micelle.
  • Item 12. Item 12. The substance introduction agent according to Item 11, wherein the vector is a liposome.
  • Item 13. Item 10.
  • the substance introduction agent according to Item 9 wherein the component of the vector is cholesterol, and the vector contains a complex containing cholesterol and the peptide according to any one of Items 1 to 3.
  • Item 14. Item 11. The substance introduction agent according to Item 6, 7, 8, or 10, wherein the target substance is a protein, nucleic acid, or medicine.
  • Item 15. Item 15. The substance introduction agent according to Item 14, wherein the target substance is an antibody.
  • the basic amphipathic peptide Lycotoxin of the present invention or a variant in which three amino acid residues at the C-terminus are deleted and a part of the amino acid is replaced with an acidic amino acid effectively interacts with the cell surface.
  • target substances intracellularly introduced molecules
  • proteins such as antibodies, nucleic acids, and drugs.
  • the peptide of the present invention induces destabilization of endosomal membranes due to the decrease of pH in endosomes and changes in membrane components accompanying endosomal maturation, and the antibodies, sensor molecules, nucleic acids, pharmaceuticals that migrate into endosomes with the peptides It has the effect of promoting the release of the target substance into the cytoplasm.
  • the peptide of the present invention allows the intracellular localization and behavior of the target substance, such as proteins and sensor molecules subjected to chemical modification including fluorescent labeling, into the cytoplasm, and the intracellular environment. There is an effect that enables measurement and control.
  • the peptide of the present invention has an effect of delivering a physiologically active substance having a large size such as an antibody or a nucleic acid into the cytoplasm.
  • the peptide of the present invention is a derivative of the following “Lycotoxin” 1.
  • Lycotoxin 1 IWLTALKFLGKHAAKHLAKQQLSKL-amide (SEQ ID NO: 1) Specifically, the peptide of the present invention comprises L (Leu) at 9 position corresponding to X 1 of Lycotoxin 1, A (Ala) at 13 position corresponding to X 2 , and L (17 at position 17 corresponding to X 3 Leu), a peptide in which at least one of Q (Gln) at position 21 corresponding to X 4 is substituted with acidic amino acid E (Glu) or D (Asp), preferably E (Glu).
  • Preferred amino acids for substitution with acidic amino acids are X 2 , X 3 and X 4 , preferably X 3 and X 4 , and particularly preferably X 3 .
  • the 3 amino acids (SKL) at the C-terminus of Lycotoxin 1 may be deleted.
  • SKL only C-terminal L may be deleted, KL may be deleted, or SKL may be deleted.
  • the N-terminus may be acylated or alkoxycarbonylated, aralkyloxycarbonylated, aryloxycarbonylated, and the C-terminus may be esterified such as amide, alkoxycarbonyl, aralkyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl, etc. Good.
  • each amino acid of Lycotoxin 1 represented by a one-letter symbol may be an L-type amino acid or a D-type amino acid.
  • the number of D-type amino acids may be one or more, but preferably all amino acids are L-type amino acids or all amino acids are D-type amino acids. Since G (Gly) does not have an asymmetric carbon, it is treated as an L-type amino acid in this specification.
  • R 1 -IWLTALKFEGKHAAKHLAKQQLSKL-R 2 (IA) R 1 -IWLTALKFLGKHEAKHLAKQQLSKL-R 2 (IB) R 1 -IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQLSKL-R 2 (IC) R 1 -IWLTALKFLGKHEAKHEAKQQLSKL-R 2 (ID) R 1 -IWLTALKFLGKHAAKHEAKQELSKL-R 2 (IE) R 1 -IWLTALKFLGKHAAKHDAKQQLSKL-R 2 (IF) R 1 -iwltalkflGkhaakheakqqlskl-R 2 (IG) R 1 -IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQL-R 2 (IH) (In the formula, the small letter alphabet of IG represents a D-type amino acid.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • the N-terminus is an amino group (NH 2 )
  • R 1 is an acyl group, an alkoxycarbonyl group, an aralkyloxycarbonyl group, or an aryloxycarbonyl group
  • the N-terminus is an acylamide or alkoxy group, respectively. It becomes urethane such as carbonylamino, aralkyloxycarbonylamino, and aryloxycarbonylamino.
  • R 2 is a hydroxyl group (OH), the C terminal is a carboxyl group (COOH), and when R 2 is an amino group (NH 2 ), the C terminal is an amide group (CONH 2 ).
  • acyl group examples include acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, lauroyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, isostearoyl, oleoyl, linoloyl, etc., straight chain having 2 to 22, preferably 2 to 18 carbon atoms Or the acyl group which has a branch is mentioned. Further, it may be an acyl group containing an aromatic group such as 1-pyreneacetyl and 1-pyrenebutyryl.
  • alkoxycarbonyl group examples include cholesteryloxycarbonyl group, tert-butyloxycarbonyl group, phytosteryloxycarbonyl group, stearyloxycarbonyl group, palmityloxycarbonyl group, 2-octyldodecyloxycarbonyl group, and behenyloxycarbonyl group. Can be mentioned.
  • Aralkyloxycarbonyl group includes benzyloxycarbonyl group, phenethyloxycarbonyl group, fluorenylmethyloxycarbonyl group, anthrylmethyloxycarbonyl group, biphenylylmethyloxycarbonyl group, tetrahydronaphthylmethyloxycarbonyl group, chromanylmethyloxy Examples thereof include a carbonyl group, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylmethyloxycarbonyl group, indanylmethyloxycarbonyl group, phenanthrylmethyloxycarbonyl group and the like.
  • aryloxycarbonyl group fluorenyloxycarbonyl group, phenyloxycarbonyl group, naphthyloxycarbonyl group, anthryloxycarbonyl group, biphenylyloxycarbonyl group, tetrahydronaphthyloxycarbonyl group, chromanyloxycarbonyl group, 2, Examples include 3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenyloxycarbonyl group, indanyloxycarbonyl group, and phenanthryloxycarbonyl group.
  • the alkoxycarbonyl group, aralkyloxycarbonyl group or aryloxycarbonyl group may be directly bonded to the peptide of the present invention, but PEG (polyethylene glycol), amide group (-CONH-, -NHCO-), ester group (- Via an appropriate spacer such as COO-,-O-CO-), ether group (-O-), amino group (-NH-), alkylene (methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc.), amino acid, etc. And may bind to the peptide of the present invention.
  • L17-PEG12-Chol obtained in the Examples has a cholesteryl group bonded to the peptide of the present invention via a spacer, and is included in a complex containing cholesterol as a component of the vector and the peptide of the present invention. Is done.
  • the C-terminus is COOH
  • R 2 is an amino group
  • the C-terminus is CONH 2
  • R 2 is alkoxy, aralkyloxy, or aryloxy
  • the C-terminus is the corresponding ester.
  • alkoxy group examples include cholesteryloxy group, phytosteryloxy group, stearyloxy group, palmityloxy group, 2-octyldodecyloxy group, and behenyloxy group.
  • Aralkyloxy groups include benzyloxy, phenethyloxy, fluorenylmethyloxy, anthrylmethyloxy, biphenylylmethyloxy, tetrahydronaphthylmethyloxy, chromanylmethyloxy, 2,3-dihydro Examples include a 1,4-dioxanaphthalenylmethyloxy group, an indanylmethyloxy group, and a phenanthrylmethyloxy group.
  • Aryloxy groups include fluorenyloxy, phenyloxy, naphthyloxy, anthryloxy, biphenylyloxy, tetrahydronaphthyloxy, chromanyloxy, 2,3-dihydro-1,4- Examples include a dioxanaphthalenyloxy group, an indanyloxy group, and a phenanthryloxy group.
  • target substances to be delivered to the cytoplasm include physiologically active substances such as proteins, peptides, nucleic acids, pharmaceuticals, sugars or labeling substances thereof, synthetic polymers, liposomes, organic / inorganic / semiconductor fine particles, and the like.
  • Proteins include antibodies, enzymes, cell signaling factors, transcription factors, DNA or RNA binding proteins, intracellular organ components such as nuclei, mitochondria, and cytoskeleton, ubiquitin-proteasome related proteins such as ubiquitin and heat shock proteins, and caspases.
  • Apoptosis-related proteins such as p53, cell cycle regulatory proteins such as p53, and lectins.
  • proteins having gene cutting / recombination ability such as Cre recombinase, TALEN, and Cas9 are also included.
  • antibodies in addition to immunoglobulins, fragment proteins thereof and single chain antibodies derived from camelids are also included.
  • targets for these antibodies include kinases, transcription factors such as HIF-1, cytoskeletal proteins such as microtubules, and the like.
  • peptides include helical peptides and cyclic peptides that regulate intracellular protein interactions, fragment peptides of intracellular proteins, DNA / RNA binding peptides, various enzyme substrates / inhibitors, and antigenic peptides for cancer vaccine production. It is done.
  • Examples of the drug include an antitumor agent and an antiviral agent
  • examples of the sugar include dextran and sialic acid
  • examples of the nucleic acid include DNA and RNA (preferably siRNA, miRNA, shRNA, rRNA, ribozyme, antisense RNA, etc. ), DNA / RNA aptamers and chemically modified products thereof.
  • a complex of a protein such as Cas9 / sgRNA and a nucleic acid is also included.
  • bioactive substances such as the above proteins and nucleic acids are modified with fluorophores, quantum dots, radioisotopes, fluorescent proteins, luciferases, photocrosslinkers, etc.
  • Stable isotope-labeled proteins for intracellular NMR measurement and the like can also be mentioned as introduction substances.
  • the fluorophore can be modified with a fluorophore whose fluorescence characteristics change according to the intracellular environment, if necessary.
  • the substance to be introduced does not need to be limited to the above, and it is used in combination with other cell introduction agents such as membrane-permeable peptides and various transfection reagents to further improve the efficiency of translocation into these cytoplasms. It is also possible to use the method.
  • the peptide of the present invention may be administered in a mixture with the target substance, or may be covalently bound to the target substance directly or through an appropriate spacer, or directly or via other molecules that interact with the target substance.
  • a complex may be formed covalently.
  • it may be contained in a vector (cell introduction agent) encapsulated in endosomes.
  • the peptide of the present invention may be contained inside a vector, and may be bound directly to a component of the vector or via a spacer.
  • the peptide of the present invention may be included on the surface of a vector by forming a complex non-covalently via another molecule that interacts with a component of the vector.
  • the peptide of the present invention can be encapsulated in the vector together with the target substance, and the transition from the endosome to the cytoplasm can be promoted after the target substance is taken into the endosome.
  • the transition of the target substance from the endosome to the cytoplasm can be promoted, but there is no specificity for introduction into a specific cell. Therefore, the target substance can be introduced into the cytoplasm of a specific cell by supplying the peptide of the present invention and the target substance to the target cell by DDS, or by combining the cell-specific vector and the peptide of the present invention.
  • cell-specific vectors include vectors in which cell-specific antibodies, ligands and the like are introduced on the surface.
  • the vector include liposomes (cationic liposomes, anionic liposomes), lipofectamine, polymer micelles composed of block copolymers containing hydrophilic segments and hydrophobic segments, nanogels, synthetic polymers and nanoparticles.
  • liposomes cationic liposomes, anionic liposomes
  • lipofectamine polymer micelles composed of block copolymers containing hydrophilic segments and hydrophobic segments
  • nanogels nanogels
  • synthetic polymers and nanoparticles synthetic polymers and nanoparticles.
  • lipophilic large groups such as cholesteryl oxycarbonyl group or C-terminal to the cholesteryl group at the N-terminus, or phosphatidylethanolamine, etc.
  • the liposome containing the peptide of the present invention can be obtained by binding the phospholipid of the present invention with an ester bond or an amide bond via an appropriate spacer as required.
  • Spacers include PEG (polyethylene glycol), amide groups (-CONH-, -NHCO-), ester groups (-COO-, -O-CO-), ether groups (-O-), amino groups (-NH- ), Alkylene (methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc.), amino acids and the like. Amino acids may be linked via the side chain COOH or NH 2 groups.
  • the peptide of the present invention and the target substance can form a non-covalent complex directly or via another molecule that interacts with the target substance.
  • a non-covalent complex as shown in FIG. (a) Complex of [Peptide showing affinity for antibody (selected using phage display system) and conjugate of peptide of the present invention] and antibody
  • the biological species to which the target substance is to be delivered to the cell is a vertebrate, preferably It is a mammal. Examples of mammals include humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs, and the like.
  • Example 1 Peptide structure and production Lycotoxin 1 (1): IWLTALKFLGKHAAKHLAKQQLSKL-amide (SEQ ID NO: 1) L9E (L9) (2): IWLTALKFEGKHAAKHLAKQQLSKL-amide (SEQ ID NO: 2) A13E (A13) (3): IWLTALKFLGKHEAKHLAKQQLSKL-amide (SEQ ID NO: 3) L17E (L17) (4): IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQLSKL-amide (SEQ ID NO: 4) A13E / L17E (A13L17) (5): IWLTALKFLGKHEAKHEAKQQLSKL-amide (SEQ ID NO: 5) L17E / Q21E (L17Q21) (6): IWLTALKFLGKHAAKHEAKQELSKL-amide (SEQ ID NO: 6) L17D (7): IWLTALKFLGKHAAKHDAKQQLSKL-amide (
  • the peptide was obtained by solid phase synthesis.
  • the physical property values of the obtained peptide are shown below.
  • Physical value of Lycotoxin 1 (1) (MALDI-TOFMS): Theoretical value (M + H) + 2844.7; Actual value 2844.5 Physical properties of L9E (L9) (2): Theoretical value (M + H) + 2860.5; measured value 2859.1 Physical properties of A13E (A13) (3): Theoretical value (M + H) + 2902.5; Actual value 2901.1 Physical properties of L17E (L17) (4): Theoretical value (M + H) + 2860.6; measured value 2860.5 Physical properties of A13E / L17E (A13L17) (5): Theoretical value (M + H) + 2918.5; Actual value 2917.4 Physical properties of L17E / Q21E (L17Q21) (6): Theoretical value (M + H) + 2861.4; Actual value 2860.4 Physical properties of L17D
  • Example 2 Intracellular introduction of macromolecular drug model (10 kDa dextran) HeLa cells and Alexa488-dextran (Molecular Probes) in the presence of the nine peptides of the present invention (2) to (10) (40 ⁇ M) obtained in Example 1 , 10 kDa) (250 ⁇ g / mL) for 1 h in ⁇ -MEM ( ⁇ ), cells were washed, further cultured for 3 h in ⁇ -MEM (+), and then observed with a confocal microscope.
  • the results of peptide L17 (4), peptide L17Q21 (6) and no peptide addition are shown in FIG.
  • Alexa488-dextran (10 kDa) was seen to flow out and diffuse into the cytoplasm.
  • diffusion of Alexa488-dextran was observed in about 17% of cells in L17 (4) and its D amino acid substitution product (8), and about 30% in L17Q21 (6).
  • the percentage of cells with diffusion when treated with other peptides is approximately 20% for A13 (3) and L17D (7); approximately 15% for A13L17) (5) and L17E ⁇ (23-25) (9) It was about% 5% at L9 (2).
  • L17E ⁇ (20-25) (10) only about 2% diffusion was observed, and no diffusion was observed when no peptide was added.
  • Example 3 Intracellular introduction of antibody (Alexa488-human polyclonal IgG: approx. 150 kDa) HeLa cells and Alexa488-IgG (150 ⁇ g / mL) in ⁇ -MEM (-) for 1 h in the presence of L17 (4) peptide (40 ⁇ M) The cells were treated, washed, and further cultured in ⁇ -MEM (+) for 3 h, and then observed with a confocal microscope without fixing the cells. The results are shown in FIG.
  • Alexa488-IgG The diffusion of Alexa488-IgG is observed in about 50% of the cells treated with L17 (4).
  • Example 4 Intracellular introduction of anti-tubulin antibody FITC-anti-alpha Tubulin antibody (Abcam, 150 ⁇ g / mL) treated in ⁇ -MEM ( ⁇ ) for 1 h in the presence of L17 (4) (40 ⁇ M), washed cells, After further culturing in ⁇ -MEM (+) for 3 h, observation with a confocal microscope revealed that the antibody was transferred to the cytoplasm and stained intracellularly (FIG. 3).
  • Embodiment 5 Introduction of rhodamine-labeled phalloidin into living cells Rhodamine-labeled phalloidin (Invitrogen, 66 nM), a cell membrane impermeable F-actin stain, was added in ⁇ -MEM (-) for 15 min in the presence of L17 (4) peptide (40 ⁇ M) Treatment, cells were washed, and further cultured for 2.5 h in ⁇ -MEM (+), followed by observation with a confocal microscope. As a result, transfer of phalloidin to the cytoplasm and intracellular staining were observed (FIG. 4).
  • Example 6 Intracellular site-specific gene recombination by introduction of exogenous Cre recombinase (about 38 kDa) When Cre is introduced into the cell (cytoplasm), Cre moves to the nucleus and performs site-specific gene recombination targeting the loxP sequence. Induce. The cells before gene recombination express DsRed and turn red, and cells that have undergone gene recombination with Cre emit green fluorescence due to EGFP expression (FIG. 5).
  • a Cre- (His) 6 fusion protein prepared using genetic engineering techniques, 5 ⁇ M in the presence of L17 (4) 40 ⁇ M Treatment (1 h in ⁇ -MEM ( ⁇ )). The cells were washed, cultured with ⁇ -MEM (+) for 24 hours, and then observed with a confocal microscope (FIG. 6). Color development of EGFP indicating genetic recombination is seen in 20% or more of cells.
  • Example 7 Comparison of endosomal inclusion release activity with HA2 peptide HA2 peptide (GLFGAI AGFIENGWEGMI DGWYG-amide: Plank, C. et al. J. Biol. Chem. 269: 12918-12924 (1994)) is a typical pH-sensitive membrane fusion Peptide is widely used for cytoplasmic release of endosomal inclusions.
  • Alexa488-dextran (10 kDa) 250 ⁇ g / mL was treated with peptide (40 ⁇ M) in PBS (-) for 15-min, cells were washed, and further cultured for 3 h in ⁇ -MEM (+). Focus microscope observation. In HA2, Alexa488-dextran was hardly transferred into the cell and released into the cytoplasm (FIG. 7).
  • Example 8 FIG. Applicability of the present invention to HeLa cells other than HeLa cells COS-7 (African green monkey kidney-derived cells), NIH3T3 (mouse fibroblasts) under the same conditions as in Example 2 in the presence of L17 (4) as a high-molecular drug model Cells) and HUVEC (human umbilical vein endothelial cells), these cells also showed effective diffusion into the cytoplasm (FIG. 8).
  • COS-7 African green monkey kidney-derived cells
  • NIH3T3 mouse fibroblasts
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • Example 9 Cytotoxicity test by intracellular introduction of Saporin toxin (Effective effect of L17 (SEQ ID NO: 4) on delivery of toxin protein to cytoplasm)
  • Saporin is a strong toxin (ribosome-inactivating protein) of about 30 kDa [1], but the membrane permeability (intracellular migration) of saporin is low.
  • Proapoptotic domain peptide is a 14-residue amphipathic cationic peptide that does not exhibit cytotoxicity outside the cell, but when it enters the cytoplasm, it destroys the mitochondrial membrane and induces cell death due to apoptosis.
  • the inventors' group does not induce apoptotic death when PAD alone is administered to cells, but with octaarginine (R8), one of the representative cell-penetrating peptides (CPP). It has been confirmed that apoptotic death can be induced by administration of conjugates (R8-PAD, RRRRRRRRGGklaklaklaklaklaklak-amide, lowercase amino acids are D-type amino acids) [3-6].
  • L17 SEQ ID NO: 4
  • the existing introduction method that has the effect of promoting delivery into the cell (cytoplasm) containing CPP and that the desired effect (physiological activity etc.) can be obtained more effectively
  • the apoptotic cell death-inducing activity of R8-PAD in the presence of L17 was examined.
  • Example 11 Applicability in the presence of serum (intracellular introduction of model drug 10 kDa dextran) Alexa488-dextran (10 kDa) (250 ⁇ g / mL) and L17 (4) (40 ⁇ M) were mixed in ⁇ -MEM (+), added to HeLa cells, and treated for 1 h. The cells were then washed and immediately observed with a confocal microscope.
  • the peptide of the present invention exhibited cytoplasmic delivery ability even in the presence of serum.
  • Example 12 Intracellular introduction of inclusions (carboxyfluorescein) using L17 (SEQ ID NO: 4) modified liposomes
  • L17 SEQ ID NO: 4
  • DOPE 2-dioleoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • cholesterol cholesterol
  • Liposomes (1 mM) and L17-PEG 12 -Chol (2 ⁇ M) were mixed in equal amounts and incubated for 15 min to present L17 on the liposome surface. Further, this was mixed 1: 2 with ⁇ -MEM ( ⁇ ), added to HeLa cells, and treated for 1 h. Thereafter, the cells were washed, further cultured for 3 hours in ⁇ -MEM (+), and then observed with a confocal microscope. The results are shown in FIG.
  • a DMF solution containing 5 equivalents of di-tert-butyl dicarbonate and 5 equivalents of N-methylmorpholine was added to the peptide resin, and the N-terminus of the peptide resin was Boc protected.
  • deprotection of the side chain amino group of the C-terminal Lys was performed by gently shaking in hexafluoroisopropanol (HFIP) / dichloromethane (1: 4) at room temperature for 3 h.
  • Fmoc-PEG 12 modification of the lysine side chain is modified with Fmoc-PEG 12 -propanoic acid (3 eq), O- (1H-Benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) (3 equivalents), 1-Hydroxy-benzotriazole (HOBt) (3 equivalents), N, N-Diisopropylethylamine (DIEA) (6 equivalents) in DMF solution was added and shaken overnight. Fmoc was deprotected by adding 20% piperidine / DMF solution and repeating 10 min shaking twice.
  • ⁇ Liposome preparation method> The solution was placed in an eggplant-shaped flask as a chloroform solution so as to be DOPE / DOPC / Chol (5: 2.5: 2.5), substituted with N 2 , and then stirred using a vortex mixer. After removing the organic solvent by a rotary evaporator, it was left overnight under reduced pressure using a vacuum pump in order to completely remove the organic solvent from the lipid film.
  • a carboxyfluorescein buffer solution (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 100 mM carboxyfluorescein (pH 7.4)) was added to the eggplant flask in which the thin film lipid was formed so that the total lipid concentration was 8 mM, and N 2 substitution was immediately performed.
  • MLVs multilamellar liposomes
  • LUV single membrane liposomes
  • PULSin (16 ⁇ L) to Alexa488-IgG (4 ⁇ g) / 20 mM Hepes (200 ⁇ L) and incubate for 15 min. After washing the HeLa cells with ⁇ -MEM ( ⁇ ), add ⁇ -MEM ( ⁇ ) (1.8 mL) and the above Alexa488-IgG / PULSin mixture (200 ⁇ L), and incubate at 37 C for 2 h, followed by nuclear staining Reagent “Hoechst33342” (30 ⁇ g) was added and incubated for 15 minutes.
  • Antibody signals are observed in the cells, but only endosome-like punctate signals are observed, and IgG such as when using the L17 peptide (SEQ ID NO: 4) described in Example 3 (FIG. 2) is used. Effective diffusion into the cytoplasm was not observed.
  • Example 13 Control experiment. Intracellular introduction of anti-tubulin antibody using L17 L17 (SEQ ID NO: 4) (40 ⁇ M) was administered to HeLa cells together with anti-Tubulin antibody (Abcam, 100 ⁇ g / mL) and incubated for 1 h. After washing, the cells were fixed and permeabilized, and stained with a fluorescently labeled secondary antibody (anti-mouse antibody (Alexa488), Invitrogen, 1/400, 1 h). A signal was obtained suggesting effective diffusion of the antibody into the cytoplasm.
  • L17 L17 SEQ ID NO: 4
  • Anti-Tubulin antibody Abcam, 100 ⁇ g / mL
  • Example 4 directly observed the delivery of FITC-labeled antibody to the cytoplasm, whereas here, the introduction example of HVJ-E described above (comparison) As in Example 2), a non-fluorescently labeled antibody was introduced into the cytoplasm, the cells were fixed, and the intracellular antibody was detected with a fluorescently labeled secondary antibody.
  • Example 14 Intracellular introduction of polymer drug model (10 kDa dextran) Intracellular introduction test of polymer drug model (10 kDa dextran) was performed under the same conditions as in Example 2 except that peptides other than L17 were used. The results are shown in FIGS.

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Abstract

エンドサイトーシスで取り込まれたタンパク質を高効率で細胞質に送達する。 下記式（Ｉ）： R１-IWLTALKFX１GKHX２AKHX３AKQX４L-R２　（Ｉ） （式中、Ｘ１はL、E又はDを示す。Ｘ２はA、E又はDを示す。Ｘ３はL、E又はDを示す。Ｘ４はQ、E又はDを示す。但しＸ１～Ｘ４の少なくとも１つはE又はDを示す。Ｒ１は水素原子、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基又はアリールオキシカルボニル基を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、S-R2a、SK-R2a又はSKL-R2a（R2aはOH又はNH2を示す。）、アルコキシ基、アラルキルオキシ基又はアリールオキシ基を示す。但し、アミノ酸はＬ型アミノ酸とＤ型アミノ酸のいずれであってもよい。）で表されるペプチド。

Description

細胞質送達ペプチド
　本発明は、目的物質を細胞質に送達するためのペプチド、細胞質送達剤及び物質導入剤に関するものである。
　タンパク質、核酸の生細胞内への導入は細胞機能の計測・解析や細胞機能の調節に非常に有用なアプローチである。例えば、現在、蛍光タンパク質との融合により、種々の細胞内タンパク質の局在や挙動の観察が行われている。しかし、蛍光タンパク質の融合による細胞内局在や挙動への影響やタンパク質活性への影響は捨てきれず、また、融合タンパク質の細胞内発現量の調節も難しい。従って、これらの厳密な評価においては、複数の方法での検証が望ましい。融合する蛍光タンパク質の蛍光特性にも制約があり、適切な蛍光団で化学標識したタンパク質を細胞内に導入できればこの問題の解決に資する。また、近年、天然タンパク質の認識能を活用した種々のバイオセンサーが開発されてきており（非特許文献１）、細胞内計測への応用が期待されている。しかし、このような化学修飾されたタンパク質を細胞外から細胞内へと導入しようとする際に、細胞外から加えたタンパク質の少なからぬ量がエンドソームに保持され、細胞質へと放出・拡散しないために、これらのタンパク質の細胞内可視化や計測の所望の機能を発揮できない場合が多い。
　一方、近年、種々のバイオ高分子医薬品の開発が急速に進んでいる。中でも抗体は非常に高い標的特異性を持つため、低分子医薬品に代わる分子標的薬として世界中で開発が進められている。しかし、一般に抗体は細胞質内に移行しないため、その標的は細胞膜上の受容体もしくは細胞外の疾患関連因子に限られているのが現状である。細胞質中には細胞骨格関連タンパク質や、キナーゼ関連因子など種々の疾病治療に際して標的となりうるものが多い。そのため、高分子の効率的細胞内導入法が確立すれば、抗体医薬の適用範囲は大幅に拡大する。さらにsiRNAなどの核酸(DNA、RNA)、医薬も細胞内導入の目的物質である。
　以上により、抗体を始めとする生理活性タンパク質、核酸、医薬を生細胞の細胞質へ効果的に導入する方法の確立が求められている。
　エンドソームに内包されたタンパク質や薬物を細胞質に放出する代表的なエンドソーム不安定化ペプチドとして、GALA（非特許文献２）、インフルエンザ・ヘマグルチニン HA2 タンパク質由来ペプチド（非特許文献３）などが挙げられる。これらは、pH依存的膜融合ペプチドであり、エンドソーム内のpHが5程度になると膜融合性を発揮し、エンドソーム膜を傷害し、内包物を細胞質に放出するとされる。また、膜透過ペプチドとして知られるHIV-1 TatペプチドとHA2ペプチドの連結体（非特許文献４）なども報告されており、CreとTatの融合タンパク質等の生理活性タンパク質の細胞内導入に用いられた例が報告されている。
　また、高い膜傷害性を有するハチ毒メリチンにおいて、塩基性アミノ酸のリジンを pH 感受性のマレイン酸誘導体で保護し、エンドソーム内での pH 低下により保護基が脱離することにより、エンドソーム膜を選択的に損傷させ、エンドソーム内包物を細胞質に放出される試みも報告されている（非特許文献５）。
　さらに、ポリエチレンイミンなどのポリカチオン性ポリマーのプロトン化の程度が pH の低下に伴い上昇することにより、エンドソームの膨潤を誘起し、内容物（核酸など）を細胞質に放出することが報告されている（プロトンスポンジ効果：非特許文献６）。また種々のpH感受性ポリマーが遺伝子導入に用いられている（特許文献１）。
特開2009-007547
Takaokaら、Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 4088 Subbaraoら、Biochemistry 1987, 26, 2964 Maedaら、PNAS 1981, 78, 4133 Wadiaら、Nature Med. 2004, 10, 310 Rozemaら、Bioconjug. Chem., 2003, 14, 51 Boussifら、PNAS 1995, 92, 7297
　効果的な細胞機能の計測・解析のためには、細胞外から導入する生理活性タンパク質、核酸、医薬、あるいは蛍光標識タンパク質やセンサー分子の大部分が機能・活性発現の場である細胞質に導入できることが望ましい。しかし、従来の方法では、細胞の生理的取込機構であるエンドサイトーシスにより取り込まれたこれらの分子を、満足できる効率でエンドソームから細胞質へ放出することができないことが問題点であった。バイオ医薬品の細胞内への送達という観点からも、エンドサイトーシスで取り込まれた抗体などのタンパク質、核酸、医薬を効果的に細胞質に送達することが期待されるが、抗体などのタンパク質、核酸、医薬を満足できる効率で細胞質に放出できる方法は報告されていない。
　本発明は、エンドサイトーシスで取り込まれたタンパク質、核酸、医薬などの目的物質を高効率で細胞質に送達することを目的とする。
　本発明者は、塩基性両親媒性ペプチド Lycotoxin のアミノ酸の一部を酸性アミノ酸と置換することで、抗体やセンサー分子、核酸、医薬などの目的物質のエンドソームから細胞質への放出を亢進させ得ることを見出した。
　本発明は以下のペプチド、タンパク質、核酸、医薬などの目的物質の細胞質送達剤及び物質導入剤を提供するものである
項１．　下記式（Ｉ）：
R１-IWLTALKFX１GKHX２AKHX３AKQX４L-R２　　　（Ｉ）
（式中、Ｘ１はL、E又はDを示す。Ｘ２はA、E又はDを示す。Ｘ３はL、E又はDを示す。Ｘ４はQ、E又はDを示す。但しＸ１～Ｘ４の少なくとも１つはE又はDを示す。Ｒ１は水素原子、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基又はアリールオキシカルボニル基を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、S-R2a、SK-R2a又はSKL-R2a（R2aはOH又はNH2を示す。）、アルコキシ基、アラルキルオキシ基又はアリールオキシ基を示す。但し、アミノ酸はＬ型アミノ酸とＤ型アミノ酸のいずれであってもよい。）で表されるペプチド。
項２．　Ｘ１はLを示し、Ｘ２はAを示し、Ｘ３はEを示し、Ｘ４はQを示す、項１に記載のペプチド。
項３．　下記のIA～IHのいずれかである、項１に記載のペプチド
R１-IWLTALKFEGKHAAKHLAKQQLSKL-R2a（IA）
R１-IWLTALKFLGKHEAKHLAKQQLSKL-R2a（IB）
R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQLSKL-R2a（IC）
R１-IWLTALKFLGKHEAKHEAKQQLSKL-R2a（ID）
R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQELSKL-R2a（IE）
R１-IWLTALKFLGKHAAKHDAKQQLSKL-R2a（IF）
R１-iwltalkflGkhaakheakqqlskl-R2a（IG）
R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQL-R2a（IH）
(式中、Ｒ１は水素原子を示し、Ｒ２ａはアミノ基を示し、IGの小文字のアルファベットはD型アミノ酸を示す。）で表されるペプチド。
項４．　項１～３のいずれか1項に記載のペプチドからなる細胞質送達剤。
項５．　項１～３のいずれか１項に記載のペプチドをベクターに含む、細胞質を標的とする物質導入剤。
項６．　項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと目的物質が直接あるいはスペーサーを介して共有結合されてなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
項７．　項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと目的物質が直接、あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的な複合体を形成してなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
項８．　目的物質をベクターに内包する、項５に記載の細胞質を標的とする物質導入剤。
項９．　前記ペプチドがベクターの構成成分に直接又はスペーサーを介して結合されている、項５に記載の物質導入剤。
項１０．　前記ペプチドが目的物質とともにベクターに内包されている、項５、８又は９に記載の物質導入剤。
項１１．　前記ベクターが、リポソーム、ナノゲル又はポリマーミセルである、項５、８又は９に記載の物質導入剤。
項１２．　ベクターがリポソームである、項１１に記載の物質導入剤。
項１３．　ベクターの構成成分がコレステロールであり、前記ベクターがコレステロールと項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを含む複合体を含む、項９に記載の物質導入剤。
項１４．　目的物質がタンパク質、核酸又は医薬である項６，７，８又は１０に記載の物質導入剤。
項１５．　目的物質が抗体である項１４に記載の物質導入剤。
　本発明の塩基性両親媒性ペプチド Lycotoxin またはＣ末の３アミノ酸残基を欠失したその改変体でアミノ酸の一部を酸性アミノ酸と置換した変異体は、細胞表面と効果的に相互作用することにより、抗体などのタンパク質、核酸、医薬などの目的物質（細胞内導入分子）とともに、エンドソーム内に取り込まれる効果を奏する。
　本発明のペプチドは、エンドソーム内における pH の減少ならびにエンドソーム成熟化に伴う膜構成成分の変化に伴いエンドソーム膜の不安定化を誘起し、ペプチドとともにエンドソーム内に移行した抗体やセンサー分子、核酸、医薬などの目的物質の細胞質への放出を促進する効果を奏する。
　本発明のペプチドは、蛍光標識をはじめとした化学修飾を施したタンパク質やセンサー分子などの目的物質の細胞質内への送達を通して、当該目的物質の細胞内局在や挙動、また、細胞内環境の計測・制御を可能にする効果を奏する。
　本発明のペプチドは、抗体、核酸のようなサイズの大きな生理活性物質を細胞質内に送達する効果を奏する。
本発明のペプチドの存在下又は非存在下に Alexa488-dextran を細胞導入した結果を示す共焦点顕微鏡写真 抗体(Alexa488-ヒトポリクローナル IgG: 約 150 kDa)の生細胞内導入の結果を示す共焦点顕微鏡写真 抗チューブリン抗体の生細胞内導入 ローダミン標識ファロイジンの生細胞内導入 実施例６の実験の概要 外因性 Cre リコンビナーゼ(約 38 kDa)導入による細胞内部位特異的遺伝子組み換えの結果を示す共焦点顕微鏡写真 本発明のL17 (4)ペプチドと HA2 ペプチドとのエンドソーム内包物放出活性の比較を示す共焦点顕微鏡写真 本発明の HeLa 細胞以外への適用性を示す共焦点顕微鏡写真 Saporin 毒素の細胞内導入による細胞毒性試験 R8-PAD の細胞内導入による細胞毒性試験 血清存在下での本発明ペプチドの使用 L17 (配列番号4)修飾リポソームを用いた内包物(carboxyfluorescein)の細胞内導入 市販試薬（PULSin）とのエンドソーム内包物放出活性の比較 HVJ-E を用いた抗チューブリン抗体の細胞内導入 L17 (4)存在下及び非存在下でのL17を用いた抗チューブリン抗体の細胞内導入(対照実験) 高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入 高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入 高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入 複合体形成による目的物質の細胞導入を示す実施形態
　本発明のペプチドは、以下の Lycotoxin 1の誘導体である。
　　Lycotoxin 1:    IWLTALKFLGKHAAKHLAKQQLSKL-amide(配列番号１)
　具体的には、本発明のペプチドは、Lycotoxin 1のX１に対応する９位のL(Leu)、X2に対応する１３位のA(Ala)、X3に対応する１７位のL(Leu)、X4に対応する２１位のQ(Gln)の少なくとも１種を酸性アミノ酸であるE(Glu)又はD(Asp)、好ましくはE(Glu)に置換されたペプチドである。酸性アミノ酸に置換する好ましいアミノ酸はX2、X3、X4であり、好ましくはX3、X4であり、特に好ましくはX3である。
　Lycotoxin 1のＣ末端の３個のアミノ酸（SKL）は欠失していてもよい。SKLは、C末端のLのみ欠失してもよく、KLが欠失してもよく、SKLが欠失してもよい。
　さらに、Ｎ末端はアシル化もしくはアルコキシカルボニル化、アラルキルオキシカルボニル化、アリールオキシカルボニル化されていてもよく、Ｃ末端はアミド、アルコキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルなどのエステル化されていてもよい。
　さらに１文字記号で表される Lycotoxin 1の各アミノ酸はＬ型アミノ酸でもよく、Ｄ型アミノ酸でもよい。Lycotoxin 1がＤ型アミノ酸を含む場合、Ｄ型アミノ酸の数は１個でも２個以上でもよいが、好ましくは全てのアミノ酸がＬ型アミノ酸であるか、全てのアミノ酸がＤ型アミノ酸である。なお、G(Gly)は不斉炭素を有しないので、本明細書においてL型アミノ酸として扱う。
　本発明の好ましいペプチド(IA)～(IH)を以下に示す。
R１-IWLTALKFEGKHAAKHLAKQQLSKL-R２（IA）
R１-IWLTALKFLGKHEAKHLAKQQLSKL-R２（IB）
R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQLSKL-R２（IC）
R１-IWLTALKFLGKHEAKHEAKQQLSKL-R２（ID）
R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQELSKL-R２（IE）
R１-IWLTALKFLGKHAAKHDAKQQLSKL-R２（IF）
R１-iwltalkflGkhaakheakqqlskl-R２（IG）
R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQL-R２（IH）
（式中、IGの小文字のアルファベットはD型アミノ酸を示す。R1、R2は前記に定義される通りである。）
　より好ましいペプチドは(IC)、(IE)と(IG)であり、特に好ましくは(IC)あるいは(IG)である。これらのペプチドはエンドソームから細胞質に目的物質を高効率で放出させることができる。
　Ｒ１が水素原子のとき、Ｎ末端はアミノ基（ＮＨ２）であり、Ｒ１がアシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基のときＮ末端は、各々アシルアミド、或いはアルコキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノなどのウレタンになる。
　Ｒ２が水酸基（OH）のときＣ末端はカルボキシル基（COOH）であり、Ｒ２がアミノ基(NH2)のとき、Ｃ末端はアミド基(CONH2)になる。Ｒ２がS-R2a、SK-R2a又はSKL-R2a（R2aはOH又はNH2を示す。）のとき、Ｃ末端にはS(Ser)、SK(Ser-Lys)、SKL(Ser-Lys-Leu))が結合し、その末端はCOOH（R2a=OH）またはCONH2（R2a= NH2）となる。
　アシル基としては、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、イソステアロイル、オレオイル、リノロイルなどの炭素数２～２２、好ましくは２～１８の直鎖又は分岐を有するアシル基が挙げられる。また、1-ピレンアセチル、1-ピレンブチリルなどのように芳香族基を含むアシル基であってもよい。
　アルコキシカルボニル基としては、コレステリルオキシカルボニル基、tert-ブチルオキシカルボニル基、フィトステリルオキシカルボニル基、ステアリルオキシカルボニル基、パルミチルオキシカルボニル基、２－オクチルドデシルオキシカルボニル基、ベヘニルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　アラルキルオキシカルボニル基としては、ベンジルオキシカルボニル基、フェネチルオキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、アントリルメチルオキシカルボニル基、ビフェニリルメチルオキシカルボニル基、テトラヒドロナフチルメチルオキシカルボニル基、クロマニルメチルオキシカルボニル基、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチルオキシカルボニル基、インダニルメチルオキシカルボニル基及びフェナントリルメチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　アリールオキシカルボニル基としては、フルオレニルオキシカルボニル基、フェニルオキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基、アントリルオキシカルボニル基、ビフェニリルオキシカルボニル基、テトラヒドロナフチルオキシカルボニル基、クロマニルオキシカルボニル基、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルオキシカルボニル基、インダニルオキシカルボニル基及びフェナントリルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基又はアリールオキシカルボニル基は、本発明のペプチドと直接結合してもよいが、PEG(ポリエチレングリコール)、アミド基(-CONH-、-NHCO-)、エステル基（-COO-,-O-CO-）、エーテル基(-O-)、アミノ基(-NH-)、アルキレン（メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンなど）、アミノ酸などの適当なスペーサーを介して本発明のペプチドと結合してもよい。例えば、実施例で得られた L17-PEG12-Chol は、コレステリル基がスペーサーを介して本発明のペプチドに結合されており、ベクターの構成成分であるコレステロールと本発明のペプチドを含む複合体に包含される。
　Ｒ２が水酸基のとき、Ｃ末端はＣＯＯＨであり、Ｒ２がアミノ基のときＣ末端はＣＯＮＨ２になり、Ｒ２がアルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシのとき、Ｃ末端は対応するエステルになる。
　アルコキシ基としては、コレステリルオキシ基、フィトステリルオキシ基、ステアリルオキシ基、パルミチルオキシ基、２－オクチルドデシルオキシ基、ベヘニルオキシ基などが挙げられる。
　アラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、フルオレニルメチルオキシ基、アントリルメチルオキシ基、ビフェニリルメチルオキシ基、テトラヒドロナフチルメチルオキシ基、クロマニルメチルオキシ基、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチルオキシ基、インダニルメチルオキシ基及びフェナントリルメチルオキシ基などが挙げられる。
　アリールオキシ基としては、フルオレニルオキシ基、フェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、アントリルオキシ基、ビフェニリルオキシ基、テトラヒドロナフチルオキシ基、クロマニルオキシ基、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルオキシ基、インダニルオキシ基及びフェナントリルオキシ基などが挙げられる。
　細胞質に送達する目的物質としては、生理活性物質、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、医薬、糖あるいはこれらの標識物質、また、合成高分子、リポソーム、有機／無機／半導体微粒子などが挙げられる。タンパク質としては抗体、酵素、細胞情報伝達因子、転写因子、ＤＮＡあるいはＲＮＡ結合タンパク質、核・ミトコンドリア・細胞骨格などの細胞内器官構成タンパク質、ユビキチンや熱ショックタンパク質などのユビキチン-プロテアソーム系関連タンパク質やカスパーゼなどのアポトーシス関連タンパク質、ｐ５３などの細胞周期調節タンパク質、レクチンなどが挙げられる。また、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９などの遺伝子切断・組み換え能を有するタンパク質も含まれる。抗体に関しては、免疫グロブリンに加え、その断片タンパク質やラクダ科動物由来の一本鎖抗体も含まれる。これらの抗体の標的としては、キナーゼ類、ＨＩＦ-１などの転写因子類、微小管などの細胞骨格タンパク質類などが挙げられる。ペプチドとしては、細胞内タンパク質相互作用を調節するヘリックスペプチドや環状ペプチド、細胞内タンパク質の断片ペプチド、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合ペプチド、各種酵素基質・阻害剤、がんワクチン産生のための抗原ペプチドなどが挙げられる。医薬としては抗腫瘍剤、抗ウイルス剤などが挙げられ、糖としてはデキストラン、シアル酸などが挙げられ、核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ（好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡなど）、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーならびにこれらの化学修飾体が挙げられる。また、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡなどのタンパク質と核酸の複合体も含まれる。また、細胞内での生理活性や機能の向上のために上記の生理活性物質に必要に応じて化学修飾を施した誘導体を導入することも可能である。
　細胞内可視化・計測・相互作用解析のために上記のタンパク質や核酸などの生理活性物質を蛍光団、量子ドット、放射性同位元素、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、光架橋団等で修飾を行ったものや、細胞内ＮＭＲ測定などのための安定同位体標識タンパク質も導入物質として挙げられる。蛍光団としては、必要に応じて細胞内環境に応じて蛍光特性が変化する蛍光団で修飾することも可能である。
　導入物質は特に以上のものに限定される必要はなく、膜透過性を有するペプチド、各種トランスフェクション試薬など他の細胞導入剤と併用し、これらの細胞質内移行効率の更なる向上のために本法を用いることも可能である。
　本発明のペプチドは目的物質と混合して投与するほか、目的物質に直接あるいは適当なスペーサーを介して共有結合的に結合してもよく、直接あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的に複合体を形成してもよい。さらに、エンドソームに内包されるベクター(細胞導入剤)に含ませてもよい。例えば、本発明のペプチドは、ベクターの内部に含まれていてもよく、ベクターの構成成分に直接又はスペーサーを介して結合されていてもよい。あるいは、本発明のペプチドがベクターの構成成分と相互作用する他分子を介して非共有結合的に複合体を形成することで、ベクターの表面に含ませてもよい。さらにベクターの内部に目的物質とともに本発明のペプチドを内包させて、目的物質がエンドソームに取り込まれた後に、エンドソームから細胞質への移行を促進することができる。本発明のペプチドを目的物質と共存させると、目的物質のエンドソームから細胞質への移行を促進することができるが、特定の細胞へ導入するための特異性はない。したがって、本発明のペプチドと目的物質をＤＤＳにより標的細胞に供給するか、細胞特異的なベクターと本発明のペプチドを組み合わせることにより、特定細胞の細胞質に目的物質を導入することができる。細胞特異的なベクターとして、細胞特異的な抗体、リガンドなどが表面に導入されたベクターが例示される。ベクターとしてはリポソーム（カチオニックリポソーム、アニオニックリポソーム）、リポフェクタミン、親水性セグメントと疎水性セグメントを含むブロックコポリマーから構成される高分子ミセル、ナノゲル、合成ポリマーやナノ粒子などが挙げられる。例えばベクターがリポソームの場合には、Ｒ１として炭素数１０以上のアシル基を使用するか、Ｎ末端にコレステリルオキシカルボニル基やＣ末端にコレステリル基などの脂溶性の大きい基、あるいはホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質を必要に応じて適当なスペーサーを介してエステル結合又はアミド結合で本発明のペプチドと結合させることで、本発明のペプチドを含むリポソームを得ることができる。スペーサーとしては、PEG(ポリエチレングリコール)、アミド基(-CONH-、-NHCO-)、エステル基（-COO-,-O-CO-）、エーテル基(-O-)、アミノ基(-NH-)、アルキレン（メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンなど）、アミノ酸などが挙げられる。アミノ酸は側鎖の COOH または NH2基を介して結合してもよい。さらに、本発明のペプチドと目的物質は、直接、あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的な複合体を形成することができる。このような非共有結合的な複合体としては、図19に示されるように、
(a)［抗体と親和性を示すペプチド（ファージディスプレイ系などを用いて選択）と本発明のペプチドのコンジュゲート］と抗体との複合体
(b)核酸と本発明のペプチドとの非共有結合的な複合体
(c)［本発明のペプチドと核酸相互作用分子とのコンジュゲート］と核酸との非共有結合的な複合体
等が挙げられる
　目的物質を細胞に送達すべき生物種は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
１．ペプチドの構造及び製造
Lycotoxin 1 (1):        IWLTALKFLGKHAAKHLAKQQLSKL-amide（配列番号１）
L9E (L9) (2):           IWLTALKFEGKHAAKHLAKQQLSKL-amide（配列番号２）
A13E (A13) (3):         IWLTALKFLGKHEAKHLAKQQLSKL-amide（配列番号３）
L17E (L17) (4):         IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQLSKL-amide（配列番号４）
A13E/L17E (A13L17) (5): IWLTALKFLGKHEAKHEAKQQLSKL-amide（配列番号５）
L17E/Q21E (L17Q21) (6): IWLTALKFLGKHAAKHEAKQELSKL-amide（配列番号６）
L17D (7):　　           IWLTALKFLGKHAAKHDAKQQLSKL-amide（配列番号７）
L17E (d-置換体) (8):    iwltalkflGkhaakheakqqlskl-amide（配列番号８）
L17E Δ(23-25) (9):     IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQL-amide（配列番号９）   
L17E Δ(20-25) (10):    IWLTALKFLGKHAAKHEAK-amide（配列番号１０）   
（配列番号８中の小文字のアルファベットはD型アミノ酸を示す。）
　溶血性ペプチド(1)の配列中のアミノ酸をグルタミン酸(E)又はアスパラギン酸（D）に置換することにより、エンドソーム膜選択的に不安定化するペプチドを得た。ペプチドは、固相合成により得た。得られたペプチドの物性値を以下に示す。
Lycotoxin 1 (1)の物性値(MALDI-TOFMS): 理論値(M+H)+ 2844.7; 実測値 2844.5
L9E (L9) (2)の物性値: 理論値(M+H)+ 2860.5; 実測値 2859.1
A13E (A13) (3)の物性値: 理論値(M+H)+ 2902.5; 実測値 2901.1
L17E (L17) (4)の物性値: 理論値(M+H)+ 2860.6; 実測値 2860.5
A13E/L17E (A13L17) (5)の物性値: 理論値(M+H)+ 2918.5; 実測値 2917.4
L17E/Q21E (L17Q21) (6)の物性値: 理論値(M+H)+ 2861.4; 実測値 2860.4
L17D (7) の物性値: 理論値(M+H)+ 2846.4; 実測値 2846.4
L17E (d-置換体) (8) の物性値: 理論値(M+H)+ 2860.5; 実測値 2860.5
L17E Δ(23-25) (9) の物性値: 理論値(M+H)+ 2532.1; 実測値 2531.4
L17E Δ(20-25) (10) の物性値: 理論値(M+H)+ 2162.6; 実測値 2161.2
　Lycotoxin 1 (1)の膜傷害性は、文献（Yan L., Adams M.E. J. Biol. Chem. 273:2059-2066 (1998)）に記載されている。
実施例２．高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入
　実施例１で得られた９種の本発明のペプチド（2）～(10)(40 μM)存在下、HeLa細胞とAlexa488-dextran (Molecular Probes、10 kDa) (250 μg/mL)をα-MEM(－)中1 h処理、細胞を洗浄し、α-MEM(+)中でさらに3 h培養後、共焦点顕微鏡で観察した。ペプチドL17(4)、ペプチドL17Q21 (6)及びペプチド添加なしの結果を図１に示す。
　ペプチド存在下では Alexa488-dextran (10 kDa) の顕著な細胞質への流出・拡散が見られた。特にL17 (4)ならびにそのDアミノ酸置換体(8)では約 50%、L17Q21 (6)では約 30%の細胞でAlexa488-dextranの拡散が認められた。その他のペプチドで処理した場合の拡散が見られる細胞の割合は、A13 (3)ならびにL17D (7)で約 20%; A13L17 (5)ならびにL17E Δ(23-25) (9)で約15%; L9 (2)で約 5%であった。L17E Δ(20-25) (10)では約 2%の拡散が見られたのみであり、ペプチド不添加時には拡散は全く認められなかった。
実施例３．抗体(Alexa488-ヒトポリクローナルIgG: 約150 kDa)の細胞内導入
　L17 (4)ペプチド(40 μM)存在下、HeLa 細胞と Alexa488-IgG (150 μg/mL)をα-MEM(－)中1 h処理、細胞を洗浄し、α-MEM(+)中でさらに3 h培養後、細胞を固定することなく、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。
　L17 (4)で処理した細胞の約 50%にAlexa488-IgGの拡散が認められる。
実施例４．抗チューブリン抗体の生細胞内導入
　FITC-抗alpha Tubulin抗体(Abcam、150 μg/mL)をL17 (4)(40 μM)存在下α-MEM(－)中1 h処理、細胞を洗浄し、α-MEM(+)中でさらに3 h培養後、共焦点顕微鏡で観察した結果、抗体の細胞質への移行と細胞内染色が見られた（図３）。
実施例５．ローダミン標識ファロイジンの生細胞内導入
　細胞膜非透過性のF-アクチン染色剤であるローダミン標識ファロイジン (Invitrogen、66 nM)をL17 (4)ペプチド(40 μM)存在下α-MEM(－)中15 min処理、細胞を洗浄し、α-MEM(+)中でさらに2.5 h培養後、共焦点顕微鏡で観察した結果、ファロイジンの細胞質への移行と細胞内染色が見られた（図４）。
実施例６．外因性Creリコンビナーゼ(約 38 kDa)導入による細胞内部位特異的遺伝子組み換え
　Cre が細胞内（細胞質）に導入されれば、Cre は核に移行し、loxP配列を標的とした部位特異的遺伝子組み換えを誘導する。遺伝子組み換えが起こる前の細胞はDsRedを発現し赤色に、Creによる遺伝子組み換えが生じた細胞はEGFPの発現により緑色の蛍光を発する(図５)。
　loxP-DsRed-loxP-EGFP をコードするプラスミドをトランスフェクションしたHeLa細胞に、Cre-(His)6融合タンパク質（遺伝子工学的手法を用いて作製、5 μM）をL17 (4) 40 μM存在下で処理（α-MEM(－)中1 h）。細胞を洗浄し、α-MEM(+)で24 h培養後、共焦点顕微鏡観察した(図６)。
20%以上の細胞で遺伝子組み換えを示すEGFPの発色が見られる。
実施例７．HA2 ペプチドとのエンドソーム内包物放出活性の比較
　HA2 ペプチド（GLFGAI AGFIENGWEGMI DGWYG-amide: Plank, C. et al. J. Biol. Chem. 269:12918-12924 (1994)）は代表的なpH感受性膜融合ペプチドでエンドソーム内包物の細胞質の放出のために汎用されている。
　Alexa488-dextran (10 kDa) (250 μg/mL)をペプチド(40 μM)存在下PBS(－)中15 min処理、細胞を洗浄し、α-MEM(+)中でさらに3 h培養後、共焦点顕微鏡観察。HA2 ではAlexa488-dextranの細胞内への移行と細胞質への放出は殆ど認められなかった（図７）。
実施例８．本発明の HeLa 細胞以外への適用性
　高分子薬物モデルとしての10 kDa dextranをL17 (4)存在下、実施例２と同条件でCOS-7（アフリカミドリザル腎臓由来細胞）、NIH3T3（マウス線維芽細胞）、HUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)とインキュベーションすることによりこれらの細胞においても効果的な細胞質への拡散が見られた(図８)。
実施例９．Saporin 毒素の細胞内導入による細胞毒性試験（L17(配列番号4)による毒素タンパク質の細胞質への送達促進効果）
　Saporinは約 30 kDaの強毒素（リボゾーム不活化タンパク質）である[1]が、saporin の膜透過性（細胞内移行性）は低い。Saporin (Sigma-Aldrich、10 μg/mL)をL17 (配列番号4)ペプチド(40 μM)存在下、α-MEM(－)中で1 h処理後、細胞を洗浄し、α-MEM(+)中でさらに6 h培養し、WST-1試薬(Roche)により細胞生存率を測定した。その結果、L17非存在下では、コントロールの細胞(saporinを投与しなかった細胞：cont)に比べ、約 20%程度の毒性にとどまったが、L17存在下では、約 80%の細胞毒性がみられた (図９)。
実施例１０．R8-PADの細胞内導入におけるL17の併用効果（既存の細胞内導入法に対するL17の併用による生理活性の向上）
　Proapoptotic domain peptide (PAD)は14 残基からなる両親媒性のカチオン性ペプチドであり、細胞外では細胞毒性を示さないが、細胞質に移行するとミトコンドリア膜を破壊し、アポトーシスによる細胞死を誘導することが報告されている[2]。発明者らのグループは、細胞に対してのPAD単独投与ではアポトーシス死は誘導されないが、代表的な細胞透過性ペプチド(cell-penetrating peptide, CPP)の一つであるオクタアルギニン(R8)とのコンジュゲート(R8-PAD, RRRRRRRRGGklaklakklaklak-amide, 小文字のアミノ酸はD型アミノ酸)の投与により、アポトーシス死が誘導可能となることを確認している[3-6]。
　ここではCPPを含む細胞内（細胞質）への送達促進効果を有する既存の導入法とL17(配列番号4) との併用により、より効果的に所望の効果（生理活性等）が得られることを示す目的で、L17共存下におけるR8-PADのアポトーシス細胞死誘導活性を調べた。
　R8-PAD (5 μM)をL17 (40 μM)存在下、α-MEM(－)中で1 h処理後、細胞を洗浄し、α-MEM(+)中でさらに6 h、および、12 h 培養し、WST-1 assayにより細胞生存率を測定した。その結果、6 h後では、R8-PADを投与しなかった細胞(cont)に対してR8-PAD単独投与により得られた細胞死は約 25%であったが、L17 (4)添加時には約 50%の細胞死が誘導できた。さらに、12 h 後には、R8-PAD単独では約 50%の細胞死を誘導したのみであったのに対し、L17 (4)存在下では、約 80%の細胞死がみられた(図１０)。
　本実施例により、既存の細胞内送達法にL17を併用することによって、さらに優れた効果を発現することが確認された。
＜ペプチドの構造＞
R8-PAD:  RRRRRRRRGGklaklakklaklak-amide　（小文字のアミノ酸はD型アミノ酸）
＜ペプチド合成＞
　H-RRRRRRRRGGklaklakklaklak-resin（アルギニン側鎖はPbf(=2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobezofuran-5-sulfonyl)基、リジン側鎖はBoc(=tert-butyloxycarbonyl)基で保護）を Fmoc 固相合成法により自動合成した。最終脱保護および樹脂からの切り出しはTFA-EDT (95 : 5)で室温 3 h処理することにより行った。その後、逆相HPLCにより精製した。合成したペプチドはMALDI-TOF MSにより測定し、理論分子量との一致を確認した（理論値(M+H)+ 2887.6 ; 実測値 2887.7）。
参考文献
[1] Stirpe, F.; Gasperi-Campani, A.; Barbieri, L.; Falasca, A.; Abbondanza, A.; Stevens, W. A. Ribosome-inactivating proteins from the seeds of Saponaria officinalis L. (soapwort), of Agrostemma githago L. (corn cockle) and of Asparagus officinalis L. (asparagus), and from the latex of Hura crepitans L. (sandbox tree). Biochem. J. 1983, 216, 17-25. 
[2] Ellerby, H. M.; Arap, W.; Ellerby, L. M.; Kain, R.; Andrusiak, R.; Rio, G. D.; Krajewski, S.; Lombardo, C. R.; Rao, R.; Ruoslahti, E.; Bredesen, D. E.; Pasqualini, R. Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides. Nat. Med. 1999, 5, 1032-1038.
[3] Nakase, I.; Niwa, M.; Takeuchi, T.; Sonomura, K.; Kawabata, N.; Koike, Y.; Takehashi, M.; Tanaka, S.; Ueda, K.; Simpson, J. C.; Jones, A. T.; Sugiura, Y.; Futaki, S. Cellular uptake of arginine-rich peptides: roles for macropinocytosis and actin rearrangement. Mol. Ther. 2004, 10, 1011-1022.
[4] Futaki, S.; Niwa, M.; Nakase, I.; Tadokoro, A.; Zhang, Y.; Nagaoka, M.; Wakako, N.; Sugiura, Y. Arginine carrier peptide bearing Ni(II) chelator to promote cellular uptake of histidine-tagged proteins. Bioconjugate Chem. 2004, 15, 475-481.
[5] Watkins, C. L.; Brennan, P.; Fegan, C.; Takayama, K.; Nakase, I.; Futaki, S.; Jones, A. T. Cellular uptake, distribution and cytotoxicity of the hydrophobic cell penetrating peptide sequence PFVYLI linked to the proapoptotic domain peptide PAD. J. Controlled Release 2009, 140, 237-244.
[6] Takayama, K.; Hirose, H.; Tanaka, G.; Pujals, S.; Katayama, S.; Nakase, I.; Futaki, S. Effect of the attachment of a penetration accelerating sequence and the influence of hydrophobicity on octaarginine-mediated intracellular delivery. Mol. Pharm. 2012, 9, 1222-1230. 
実施例１１：血清存在下での適用可能性（モデル薬物10 kDa dextranの細胞内導入）
　Alexa488-dextran (10 kDa)(250 μg/mL)とL17 (4)(40 μM)をα-MEM(+)中で混合し、HeLa 細胞に添加し、１ h処理した。その後細胞を洗浄し、直ちに共焦点顕微鏡で観察した。
　血清存在下(10% (v/v) 非働化ウシ血清)でも、約 50％の細胞でAlexa488-dextranの拡散が認められ、これは血清非存在下（約 55％）とほぼ同等であった。
　本実施例により、血清存在下でも本発明のペプチドは細胞質送達能を発揮することが確認された。
実施例１２．L17 (配列番号4)修飾リポソームを用いた内包物(carboxyfluorescein)の細胞内導入
　モデル薬物としてcarboxyfluoresceinを内包した大きな一枚膜リポソーム（LUV） (直径100 μm)を押し出し法により作製した(組成：1,2-ジオレオイル-3-sn-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)/1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)/コレステロール(Chol)=5:2.5:2.5)。リポソーム (1 mM)とL17-PEG12-Chol (2 μM)を等量混合し、15 minインキュベートすることでリポソーム表面にL17を提示させた。さらに、これをα-MEM(-)と1:2で混合し、HeLa 細胞に添加し、1 h処理した。その後、細胞を洗浄し、α-MEM (+)中でさらに3 h培養後、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図１２に示す。
　L17修飾リポソームを添加した細胞において carboxyfluorescein の細胞質への拡散が認められるが、非修飾のものを添加した細胞では有意な拡散は認められなかった。本発明のペプチドが、リポソームを用いたバイオ医薬（タンパク質・核酸医薬等）への適用（細胞質への拡散促進）が可能であることが実証された。
＜ペプチドの構造＞
L17-PEG12-Chol:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
理論値(M+H)+ 4112.5 ; 実測値 4112.7
＜ペプチド合成法＞
　Rink アミド樹脂を用い、Fmoc 固相合成法によりIWLTALKFLGKHAAKHEAKQQLSKLGK*配列に対応するペプチド樹脂を合成した（側鎖アミノ酸はTrp(Boc)、Thr(tert-Bu)、Lys(Boc)(C末端のLys以外)、Lys(Mtt)（C末端のLys(*印)）、His(Trt)、Glu(tert-Bu)、Gln(Trt)、Ser(tert-Bu)を使用。Mtt=4-メチルトリチル）。 5 当量の di-tert-butyl dicarbonate、5 当量のN-methylmorpholine を含む DMF 溶液をペプチド樹脂に添加し、ペプチド樹脂のN末端をBoc保護した。次いでC末端Lysの側鎖アミノ基の脱保護（Mtt基の除去）を、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)/ジクロロメタン(1:4)中、室温で3 h緩やかに振とうすることで行った。リシン側鎖の Fmoc-PEG12修飾を、Fmoc-PEG12-propanoic acid (3 当量)、O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)(3 当量)、1-Hydroxy-benzotriazole(HOBt)(3 当量)、N,N-Diisopropylethylamine (DIEA)(6 当量)を含むDMF溶液を加え、一夜振とうすることにより行った。Fmocの脱保護を20% piperidine/DMF溶液を添加し、10 minの振とうを2回繰り返すことで行った。cholesteryl hemisuccinate(3 当量)、HBTU(3 当量)、HOBt(3 当量)、DIEA(6 当量)を含むDMF溶液を加え、2 h振とうすることでPEG12と cholesterolがC末端に付加されたペプチド樹脂を得た。最終脱保護および樹脂からの切り出しはトリフルオロ酢酸(TFA)-エタンジチオール(EDT) (95 : 5)で室温 3 h処理することにより行った。合成したペプチドの質量を MALDI-TOF MS により測定し、理論分子量との一致を確認した。実測値 4112.7 [理論値(M+H)+ 4112.5]。
＜リポソーム調製法＞
　DOPE/DOPC/Chol (5 : 2.5 : 2.5)になるようにクロロホルム溶液としてナス型フラスコに入れ、N2置換した後に、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。ロータリーエバポレータにより、有機溶媒を除去した後、脂質フィルムから完全に有機溶媒を除くために、真空ポンプを用いて減圧下に一夜おいた。薄膜脂質を形成したナスフラスコに全脂質濃度が8 mMになるように、carboxyfluorescein 緩衝液 (10 mM HEPES、150 mM NaCl、100 mM carboxyfluorescein (pH 7.4))を加え、直ちにN2置換を行った。その後、10 min間振とうを行い多重膜リポソーム (MLVs)を作製し、凍結融解を5回繰り返した。エクストルージョン法により粒径が100 nmの一枚膜リポソーム (LUV)を作製した。その後、リポソームに内包されなかった carboxyfluorescein をゲルろ過により除去した。
比較例１．市販試薬（PULSin）とのエンドソーム内包物放出活性の比較
　汎用される市販のタンパク質・抗体導入試薬である PULSin Kit (ポリプラストランスフェクション社、http://www.funakoshi.co.jp/contents/2259)を用いて抗体(Alexa488-ヒトポリクローナルIgG: 約 150 kDa)の細胞内導入を行い、この効率をL17(配列番号4)を用いた場合（実施例３の実験結果）と比較を行った。
　PULSinの使用説明書に従い、Alexa488-IgG (4 μg)/20 mM Hepes (200 μL)にPULSin (16 μL)を添加し、15 minインキュベーション。HeLa細胞をα-MEM(－) で洗浄後、α-MEM(－) (1.8 mL)ならびに上記のAlexa488-IgG/PULSinの混合物(200 μL)を加え、37 ℃、2 hインキュベーション後、核染色試薬 Hoechst33342 (30 μg)を加え、15 minインキュベーションした。
　細胞内に抗体のシグナルは認められるが、エンドソーム様の点状シグナルが観察されるだけであり、実施例３（図２）記載のL17ペプチド(配列番号4)を使った場合のようなIgGの効果的な細胞質への拡散は見られなかった。
比較例２．市販のIgG抗体導入試薬（GenomONE-CAb、石原産業）を用いた抗チューブリン抗体の細胞内導入
　GenomONE-Cabの取扱説明書記載の推奨プロトコールに準拠し、HVJ-Eに封入したanti-Tubulin antibody (Abcam、0.9 μg)を細胞（70%コンフルエント）に投与（血清非存在下）し、１ hインキュベーションした。Wash 後さらに１ h、α-MEM(+)中でインキュベートし、固定及び膜透過処理して蛍光標識二次抗体で染色（anti-mouse antibody(Alexa488), Invitrogen、1/400、1 h）したが、細胞内には抗体がエンドソーム内に保持されているかあるいは細胞内で凝集していることを示すドット状のシグナルが認められただけであり、抗体の細胞質への顕著な拡散は認められなかった。
　なお、プロトコールでは、抗体導入後、細胞を固定し、蛍光標識 2 次抗体を用いて抗体の分布を観察する場合、完全長のIgG (whole molecule)を用いると非特異的な結合が起こり、特異的な染色像が得られない場合があるため F(ab’)2断片の使用が推奨されている。本実験は抗チューブリン抗体の細胞質への拡散を検出することが目的であるため、完全長の蛍光標識 2 次抗体を用いた。
実施例１３（対照実験）．L17を用いた抗チューブリン抗体の細胞内導入
　L17（配列番号4）(40 μM)をanti-Tubulin antibody(Abcam、100 μg/mL) とともに HeLa 細胞に投与し、１ hインキュベートした。Wash 後細胞を固定・膜透過処理し、蛍光標識二次抗体で染色（anti-mouse antibody(Alexa488), Invitrogen、1/400、1 h）した。抗体の効果的な細胞質への拡散を示唆するシグナルが得られた。本実施例は、実施例４と同様の実験だが、実施例４はFITC標識した抗体の細胞質への送達を直接観察しているのに対し、ここでは、上記のHVJ-E の導入例（比較例２）と同じく非蛍光標識の抗体を細胞質へ導入した後、細胞を固定し、蛍光標識した2次抗体により細胞内の抗体を検出した。
実施例１４．高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入
　L17 以外のペプチドを用いた以外は実施例２と同じ条件で、高分子薬物モデル(10 kDa dextran)の細胞内導入試験を行った。結果を図１６、図１７に示す。
　L17E（配列番号4）の17位のE（グルタミン酸）をD（アスパラギン酸）に置換してもほぼ同程度の10 kDa dextran の細胞内移行（細胞質への拡散）がみられた。
　L17Eの配列中のアミノ酸を全てD型に置換してもL17Eと同一あるいはそれ以上の10 kDa dextran の細胞質への拡散がみられた。
　L17E の C 端側3残基を欠失(L17E Δ(23-25)) させても 10 kDa dextran の細胞質への拡散がみられたが、6残基欠失(L17E Δ(20-25))させると細胞質への移行効率は顕著に低下した。この結果により、1-22位の重要性が明らかになった。
１．生細胞へのタンパク質・生理活性物質導入試薬・導入キット
２．分子細胞生物学・医学分野における基礎研究（細胞内可視化、計測、相互作用解析、細胞活性制御等）
３．創薬分野における抗体医薬品・バイオ医薬品等の細胞内活性評価のための基礎研究（バイオ医薬品設計支援手法）
４．抗体医薬品・核酸医薬品・バイオ医薬品の ex vivo・in vivo細胞内送達

Claims (15)

  1. 下記式（Ｉ）：
    R１-IWLTALKFX１GKHX２AKHX３AKQX４L-R２　　　（Ｉ）
    （式中、Ｘ１はL、E又はDを示す。Ｘ２はA、E又はDを示す。Ｘ３はL、E又はDを示す。Ｘ４はQ、E又はDを示す。但しＸ１～Ｘ４の少なくとも１つはE又はDを示す。Ｒ１は水素原子、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基又はアリールオキシカルボニル基を示す。Ｒ２は水酸基（OH）、アミノ基(NH2)、S-R2a、SK-R2a又はSKL-R2a（R2aはOH又はNH2を示す。）、アルコキシ基、アラルキルオキシ基又はアリールオキシ基を示す。但し、アミノ酸はＬ型アミノ酸とＤ型アミノ酸のいずれであってもよい。）で表されるペプチド。
  2. Ｘ１はLを示し、Ｘ２はAを示し、Ｘ３はEを示し、Ｘ４はQを示す、請求項１に記載のペプチド。
  3. 下記のIA～IHのいずれかである、請求項１に記載のペプチド
    R１-IWLTALKFEGKHAAKHLAKQQLSKL-R2a（IA）
    R１-IWLTALKFLGKHEAKHLAKQQLSKL-R2a（IB）
    R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQLSKL-R2a（IC）
    R１-IWLTALKFLGKHEAKHEAKQQLSKL-R2a（ID）
    R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQELSKL-R2a（IE）
    R１-IWLTALKFLGKHAAKHDAKQQLSKL-R2a（IF）
    R１-iwltalkflGkhaakheakqqlskl-R2a（IG）
    R１-IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQL-R2a（IH）
    (式中、Ｒ１は水素原子を示し、Ｒ２ａはアミノ基を示し、IGの小文字のアルファベットはD型アミノ酸を示す。）で表されるペプチド。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドからなる細胞質送達剤。
  5. 請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドをベクターに含む、細胞質を標的とする物質導入剤。
  6. 請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと目的物質が直接あるいはスペーサーを介して共有結合されてなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
  7. 請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと目的物質が直接、あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的な複合体を形成してなる、細胞質を標的とする物質導入剤。
  8. 目的物質をベクターに内包する、請求項５に記載の細胞質を標的とする物質導入剤。
  9. 前記ペプチドがベクターの構成成分に直接又はスペーサーを介して結合されている、請求項５に記載の物質導入剤。
  10. 前記ペプチドが目的物質とともにベクターに内包されている、請求項５、８又は９に記載の物質導入剤。
  11. 前記ベクターが、リポソーム、ナノゲル又はポリマーミセルである、請求項５、８又は９に記載の物質導入剤。
  12. ベクターがリポソームである、請求項１１に記載の物質導入剤。
  13. ベクターの構成成分がコレステロールであり、前記ベクターがコレステロールと請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを含む複合体を含む、請求項９に記載の物質導入剤。
  14. 目的物質がタンパク質、核酸又は医薬である請求項６，７，８又は１０に記載の物質導入剤。
  15. 目的物質が抗体である請求項１４に記載の物質導入剤。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018174158A1 (ja) 2017-03-22 2018-09-27 国立大学法人京都大学 細胞質送達ペプチド
JPWO2018168904A1 (ja) * 2017-03-15 2020-01-16 積水化学工業株式会社 合わせガラス用中間膜及び合わせガラス
WO2021020462A1 (ja) * 2019-07-29 2021-02-04 国立大学法人京都大学 細胞内送達ペプチド
WO2021040022A1 (ja) * 2019-08-30 2021-03-04 公立大学法人大阪 膜透過性ペプチド及びその利用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKISHIBA MISAO ET AL.: "Novel Peptide Sequence for Endosome Disruption Derived from Natural Hemolytic Peptide", PEPTIDE SCINECE 2014, 23 April 2015 (2015-04-23), pages 33 - 34, ISBN: 978-4-931541-15-3 *
HUGHES STEPHEN R. ET AL.: "Cell -Penetrating Recombinant Peptides for Potential Use in Agricultural Pest Control Applications", PHARMACEUTICALS, vol. 5, 2012, pages 1054 - 1063 *
OHMORI NAOYA ET AL.: "The Enhancing Effect of Anionic alpha-Helical Peptide on Cationic Peptide- Mediating Transfection Systems", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 235, 1997, pages 726 - 729 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2018168904A1 (ja) * 2017-03-15 2020-01-16 積水化学工業株式会社 合わせガラス用中間膜及び合わせガラス
JP7221690B2 (ja) 2017-03-15 2023-02-14 積水化学工業株式会社 合わせガラス用中間膜
WO2018174158A1 (ja) 2017-03-22 2018-09-27 国立大学法人京都大学 細胞質送達ペプチド
US20200046840A1 (en) * 2017-03-22 2020-02-13 Kyoto University Peptide for cytosolic delivery
JPWO2018174158A1 (ja) * 2017-03-22 2020-03-05 国立大学法人京都大学 細胞質送達ペプチド
EP3604520A4 (en) * 2017-03-22 2020-12-16 Kyoto University PEPTIDE FOR CYTOSOLIC ADMINISTRATION
US11179471B2 (en) * 2017-03-22 2021-11-23 Kyoto University Peptide for cytosolic delivery
JP7068711B2 (ja) 2017-03-22 2022-05-17 国立大学法人京都大学 細胞質送達ペプチド
WO2021020462A1 (ja) * 2019-07-29 2021-02-04 国立大学法人京都大学 細胞内送達ペプチド
WO2021040022A1 (ja) * 2019-08-30 2021-03-04 公立大学法人大阪 膜透過性ペプチド及びその利用

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