MX2012011515A - Entidades quimicas simples novedosas y metodos de suministro de oligonucleotidos. - Google Patents

Entidades quimicas simples novedosas y metodos de suministro de oligonucleotidos.

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Anthony W Shaw
Steven L Colletti
Thomas J Tucker
Jeffey G Aaronson
Stanley F Barnett
Rene Bartz
Vasant R Jadhav
Aaron A Momose
David M Tellers
Weimin Wang
Yu Yuan
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Merck Sharp & Dohme
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Abstract

En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: (1) un oligonucleótido; (2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótidos en cualquier extremo 3' y/o 5'; (3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID Nos: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.

Description

ENTIDADES QUÍMICAS SIMPLES NOVEDOSAS Y MÉTODOS DE SUMINISTRO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Están en marcha esfuerzos científicos enfocados al suministro de oligonucleótidos sistémicamente para fines terapéuticos. Tres propuestas destacadas para el suministro de oligonucleótidos incluyen: 1) encapsulacion en nanopartículas (LNP), 2) conjugación con polímero, y 3) conjugación química simple. La conjugación química simple normalmente utiliza un ligando de direccionamiento, o un lípido, o un grupo de solubilización, o un péptido endosomolítico o un péptido penetrador de célula, y/o una combinación de dos o los cuatro unidos a un oligonucleótido. En el conjugado pueden estar presentes enlazadores y también otras funcionalidades. Se conocen conjugados químicos simples y la unión del oligonucleótido ocurre en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido, en ambos extremos, o internamente; véanse WO 2005/04 859; WO 2008/036825 y WO 2009/126933.
Los conjugados químicos simples de la presente invención deben contener un péptido, que puede ser considerado un componente endosomolítico, un péptido penetrador de célula y/o un péptido fusogénico, en el extremo 5' y/o 3' del oligonucleótido. También pueden estar presentes enlazadores entre el péptido y el oligonucleótido. Opcionalmente están presentes otras funcionalidades tales como ligandos de direccionamiento, agentes solubilizantes, lípidos, y/o agentes de enmascaramiento. Normalmente el oligonucleótido es un ARNci. Además, el oligonucleótido es la cadena de pasajero o la cadena guía del ARNci.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: (1 ) un oligonucleótido; (2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; (3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1. Porcentaje de hemolisis a pH 5.4 y 7.5 para el péptido: WHHWWHWWHHWWHHW (SEQ ID NO: 2).
Figura 2. Porcentaje de hemolisis a pH 5.4 y 7.5 para el péptido: AcLHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHLGGGRKRRQRRRPPQC (SEQ ID NO: 57).
Figura 3. Porcentaje de hemolisis a pH 5.4 y 7.5 para el péptido: m(Peg)44HLLHLLLHLWLHLLHLLLHLLC (SEQ ID NO: 33).
Figura 4. Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 3-6 (protocolo de b-DNA).
Figura 5. Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 6-6 (protocolo de b-DNA).
Figura 6. Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 8-5 (protocolo de b-DNA).
Figura 7. Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 8-9 (protocolo de b-DNA).
Figura 8. Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 9-7 (protocolo de b-DNA).
Figura 9. Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 8-7 (protocolo de b-DNA).
Figura 10.- Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 13-4 (protocolo de b-DNA).
Figura 1 1. Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 12-3 (protocolo de b-DNA).
Figura 12. Concentración de ARNm de SSB en células HeLa tratadas con el compuesto 13-5 (protocolo de b-DNA).
Figura 13. Concentración de ARNm de SSB en células HEK293T tratadas con el compuesto 3-8 (protocolo de luciferasa doble).
Figura 14. Concentración de ARNm de SSB en células HEK293T tratadas con el compuesto 15-1 (protocolo de luciferasa doble).
Figura 15. Concentración relativa de ARNm de SSB en tejido de retina de rata, 3 días después de una sola dosis intravítrea de los compuestos indicados.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 1 , en donde los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores; y opcionalmente uno o más lípidos, grupos de solubilización y/o ligandos de direccionamiento unidos al oligonucleótido.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1) un oligonucleótido; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al oligonucleótido en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En otra modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser ¡guales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
En una modalidad, la presente invención describe una composición modular que comprende: 1 ) un ARNci; 2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados del cuadro 2, en donde los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'; 3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
Para ilustrar la invención mediante dibujos, la invención presenta una composición modular que comprende un oligonucleótido (O), uno o más enlazadores (L), uno o más péptidos (P), y uno o más lípidos (X), ligandos de direccionamiento (X) y/o grupos de solubilización (X).
La composición modular puede tener la siguiente fórmula: P-L-O-L-P La composición modular puede tener la siguiente fórmula: P-L-O-X La composición modular puede tener la siguiente fórmula: P-L-O Un ejemplo de una composición modular es: ARNci Cadena de pasajero p 1- ,???? ?? J- p Cadena guía Este ejemplo se usa como una guía. El experto en la materia reconocerá que existe una variedad de permutaciones para poner los componentes deseados en la cadena de pasajero y de guía.
Cuando el oligonucleótido es un oligonucleótido de doble cadena, el "P-L" y el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización, se pueden localizar en la misma cadena o en cadenas diferentes.
En algunas modalidades, el "P-L" y el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización, se pueden localizar en la misma cadena.
En algunas modalidades, el "P-L" y el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización, están en la cadena de pasajero.
En algunas modalidades, el "P-L" y el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización, están en la cadena guía.
En algunas modalidades, el "P-L" y el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización, están localizados en diferentes cadenas.
En algunas modalidades el "P-L" está en la cadena de pasajero, mientras que el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización están en la cadena guía.
En algunas modalidades, el "P-L" y el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización, están en diferentes cadenas pero en el mismo extremo terminal del olígonucleótido de doble cadena.
En algunas modalidades, el "P-L" y el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización, están en diferentes cadenas y en extremos terminales opuestos del olígonucleótido de doble cadena.
En algunas modalidades, en lugar del lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización indicados en las modalidades anteriores, se puede usar un "P-L" adicional de naturaleza idéntica o diferente.
En algunas modalidades, el "P-L" se puede localizar en múltiples extremos terminales de la cadena de pasajero o guía, y el lípido, ligando de direccionamiento y/o grupo de solubilización se pueden localizar en los extremos terminales restantes de las cadenas de pasajero y guía.
En algunas modalidades, están presentes en el olígonucleótido un "P-L' y dos o más lípidos, ligandos de direccionamiento y/o grupos de solubilización.
En algunas modalidades, están presentes en el olígonucleótido dos o más "P-L" y dos o más lípidos, ligandos de direccionamiento y/o grupos de solubilización.
En algunas modalidades, cuando el olígonucleótido es un olígonucleótido de doble cadena y están presentes múltiples componentes "P- L" y/o lípidos, ligandos de direccionamiento y/o grupos de solubilización, todos estos componentes múltiples "P-L" y/o lípidos, ligandos de direccionamiento y/o grupos de solubilización, pueden estar presentes en una cadena o en las dos cadenas del oligonucleótido de doble cadena.
Cuando están presentes múltiples componentes "P-L" y/o lípidos, ligandos de direccionamiento y/o grupos de solubilización, todos ellos pueden ser iguales o diferentes.
En otro aspecto, la invención incluye un método de suministro de un oligonucleótido a una célula. El método incluye (a) proveer u obtener una composición modular de la invención; (b) poner en contacto una célula con la composición modular; y (c) permitir que la célula interne la composición modular.
El método se puede realizar in vitro, ex vivo o in vivo, por ejemplo, para tratar a un sujeto identificado en necesidad de un oligonucleótido. Un sujeto en necesidad de dicho oligonucleótido es un sujeto, por ejemplo un humano, en necesidad de tener controlada negativamente o silenciada la expresión de uno o más genes, por ejemplo, un gen relacionado con un trastorno.
En un aspecto, la invención provee un método para inhibir la expresión de uno o más genes. El método comprende poner en contacto una o más células con una cantidad eficaz de un oligonucleótido de la invención, en donde la cantidad eficaz es una cantidad que suprime la expresión de dichos genes. El método se puede realizar in vitro, ex vivo o in vivo.
Los métodos y composiciones de la invención, por ejemplo la composición modular descrita en la presente, se pueden usar con cualquier oligonucleótido conocido. Además, los métodos y composiciones de la invención se pueden usar para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno conocido, y para el tratamiento de cualquier sujeto, por ejemplo cualquier animal, cualquier mamífero, tal como por ejemplo cualquier humano. El experto en la materia también reconocerá que los métodos y composiciones de la invención se pueden usar para el tratamiento de cualquier enfermedad que resultara aliviada por la regulación negativa o silenciamiento de uno o más genes.
Los métodos y composiciones de la invención, por ejemplo la composición modular descrita en la presente, se pueden usar en cualquier administración y/o formulación descrita en la presente, o cualquier administración o formulación conocida. Además de las vías de administración descritas en la presente, el experto en la materia también apreciará que se pueden usar otras vías de administración para administrar la composición modular de la invención.
Oligonucleótido Como se usa en la presente, un "oligonucleótido" es un ARN o ADN de una cadena o de doble cadena, modificado o no modificado. Ejemplos de los ARN modificados incluyen los que tienen mayor resistencia a la degradación de nucleasa que los ARN no modificados. Ejemplos adicionales incluyen los que tienen una modificación en el 2'-azúcar, una modificación de base, una modificación en un tramo saliente de una sola cadena, por ejemplo un tramo saliente 3' de una sola cadena o, particularmente si es una sola cadena, una modificación en 5' que incluye uno o más grupos fosfato o uno o más análogos de un grupo fosfato. En WO 2009/126933, que se incorpora aquí como referencia, se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los oligonucleótidos.
En una modalidad, un oligonucleótido es un oligonucleótido de antisentido, microARN o ARNci. El oligonucleótido preferido es un ARNci. Otro oligonucleótido preferido es la cadena de pasajero de un ARNci. Otro oligonucleótido preferido es la cadena guía de un ARNci.
ARNci El ARNci dirige el silenciamiento específico de secuencia del ARNm mediante un proceso conocido como interferencia de ARN (i-ARN). El proceso ocurre en una amplia variedad de organismos que incluyen mamíferos y otros vertebrados. Los métodos para preparar y administrar ARNci y su uso para desactivar específicamente la función de un gen son conocidos. El ARNci incluye ARNci modificado y no modificado. En WO 2009/126933, que se incorpora aquí como referencia, se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional del ARNci.
Se conocen varias vías de suministro ejemplares que se pueden usar para administrar el ARNci a un sujeto. Además, el ARNci se puede formular de acuerdo con cualquier método ejemplar conocido. En WO 2009/126933, que se incorpora aquí como referencia, se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de la formulación y administración del ARNci.
Péptidos Para moléculas de fármacos macromoleculares y fármacos hidrofílicos, que no pueden atravesar fácilmente las membranas de bicapa, se piensa que el atrapamiento en los compartimientos endosómicos/lisosómicos de la célula es el obstáculo más grande para el suministro eficiente a su sitio de acción. Sin desear limitarse por teoría, se cree que el uso de péptidos facilita el escape del oligonucleótido de estos compartimientos endosómicos/lisosómicos o la translocalización del oligonucleótido a través de la membrana celular y su liberación en el compartimiento citosólico. En algunas modalidades, los péptidos de la presente invención pueden ser péptidos policatiónicos o anfifílicos o polianiónicos, o peptidomiméticos que muestran actividad de membrana dependiente del pH y/o fusogenicidad. Un peptidomimético puede ser una cadena pequeña similar a una proteína diseñada para imitar a un péptido.
En algunas modalidades, el péptido es un agente de penetración de célula, preferiblemente un agente de penetración de célula helicoidal. Estos péptidos se denominan comúnmente péptidos penetradores de célula; véase por ejemplo "Handbook of Cell Penetrating Peptides", ed. Langel, U.¡ 2007, CRC Press, Boca Ratón, Florida. Preferiblemente, el componente es antipático. Preferiblemente el agente helicoidal es un agente de alfa-hélice que tiene preferiblemente una fase lipofílica y una fase lipofóbica. Un agente de penetración de célula puede ser, por ejemplo, un péptido de penetración de célula, péptido catiónico, péptido antipático o péptido hidrofóbico, por ejemplo que consiste principalmente en Tyr, Trp y Phe, péptido dendrímero, péptido restringido o péptido entrelazado. Ejemplos de péptidos de penetración de célula incluyen Tat, Penetratin y MPG. Para la presente invención, se cree que los péptidos penetradores de célula pueden ser un péptido "de suministro", que puede llevar moléculas polares grandes que incluyen péptidos, oligonucleótidos y proteínas, a través de las membranas celulares. Los péptidos de penetración de célula pueden ser lineales o cíclicos e incluyen D-aminoácidos, secuencias "retro-inversas", enlaces no peptídicos o pseudopeptídicos, imitadores de peptidilo. Además, el péptido y los imitadores de péptido pueden ser modificados, por ejemplo, pueden ser glicosilados, pegilados o metilados. En WO 2009/126933, que se incorpora aquí como referencia, se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los péptidos. La síntesis de los péptidos es muy conocida.
Los péptidos se pueden conjugar en cualquier extremo o en ambos, agregando al extremo C o N una cisteína u otra porción que contiene tiol. Cuando no están funcionalizados en el extremo N, los péptidos se pueden bloquear con un grupo acetilo, o se pueden bloquear con un lípido, un PEG, o una porción de direccionamiento. Cuando el extremo C de los péptidos no está conjugado o no está funcionalizado, se puede bloquear como una amida, o se puede bloquear con un lípido, un PEG, o una porción de direccionamiento.
Los péptidos de la presente invención son: HFHHFFHHFFHFFHHFFHHF (SEQ ID NO: 1); WHHWWHWWHHWWHHW (SEQ ID NO: 2); HWHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 3); HLHHWLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 4); HLHHLWHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 5); HLHHLLHHLWHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 6); HLHHLLHHLLHWLHHLLHHL (SEQ ID NO: 7); HLHHLLHHLLHLLHHWLHHL (SEQ ID NO: 8); HLHHLLHHLLHLLHHLWHHL (SEQ ID NO: 9); HPHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 10); HLHHPLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 1 1 ); HLHHLPHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 12); HLHHLLHHLPHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 13); HLHHLLHHLLHLLHHLPHHL (SEQ ID NO: 14); HLHHLLHHLLHLLHHLLHHP (SEQ ID NO: 15); ELEELLEELLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 16); ELHHLLHELLHLLHELLHHL (SEQ ID NO: 17); GLWRALWRLLRSLWRLLWRAC (SEQ ID NO: 18); GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: ); HLHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 20); HWHHWWHHWWHWWHHWWHHW (SEQ ID NO: 21 ); HLHHLLHHWLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 22); HLHHLLHHLLHLWHHLLHHL (SEQ ID NO: 23); HLHHLLHHLLHLLHHLLHHW (SEQ ID NO: 24); HHHHHHHHHHLLLLLLLLLL (SEQ ID NO: 25); HHHHHHHLLLLLLL (SEQ ID NO: 26); LTTLLTLLTTLLTTL (SEQ ID NO: 27); KLLKLLKLWLKLLKLLLKLL (SEQ ID NO: 28); LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 29); FLGGIISFFKRLF (SEQ ID NO: 30); FIGGIISFIKKLF (SEQ ID NO: 31 ); FIGGIISLIKKLF (SEQ ID NO: 32); HLLHLLLHLWLHLLHLLLHLL (SEQ ID NO: 33); GIGGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (SEQ ID NO: 34); RQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID NO: 35); RKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 36); GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV (SEQ ID NO: 37); GGGARKKAAKAARKKAAKAARKKAAKAARKKAAKAAK (SEQ NO: 38); GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 39); RRRRRRRRR (SEQ ID NO: 40); WEAKLAKALAKALAKH I LAKALAKALKACEA (SEQ ID NO: 41 ); WEAALAEALAEALAEH LAEALAEAEALEALAA (SEQ ID NO: 42); D(NHC12H25)NleKNIeKNIeHNIeKNIeHNIe (SEQ ID NO: 43); KLLKLLLKLWLKLLKLLLKLL (SEQ ID NO: 44); GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYG (SEQ ID NO: 45); GLFHAIAAHFIHGGWHGLIHGWYG (SEQ ID NO: 46); GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYG (SEQ ID NO: 47); GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG (SEQ ID NO: 48); GLFKAIAKFIKGGWKGLIKGWYG (SEQ ID NO: 49); GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 50); GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYGRQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID NO: 51 ); GLFHAIAAHFIHGGWHGLIHGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 52); GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 53); GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 54); GLFKAIAKFIKGGWKGLIKGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 55); GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGEQE (SEQ ID NO: 56); LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHLGGGRKKRRQRRRPP Q (SEQ ID NO: 57); RKKRRQRRRPPQGGGLHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHH L (SEQ ID NO: 58); y LIRLWSHIHIWFQWRRLKWKKK (SEQ ID NO:59); en donde opcionalmente los péptidos están conjugados en cualquier extremo por la adición de una cisteína u otra porción que contiene tiol al extremo C o N; o cuando no están funcionalizados en el extremo N, opcionalmente los péptidos están bloqueados con un grupo acetilo, un lípido, PEG o una porción de direccionamiento; o cuando no están funcionalizados en el extremo C, opcionalmente los péptidos están bloqueados con una amida, lípido, PEG o una porción de direccionamiento.
Los péptidos (P) preferidos son: KLLKLLLKLWLKLLKLLLKLL (SEQ ID NO: 28); LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHL (SEQ ID NO: 29); HLLHLLLHLWLHLLHLLLHLL (SEQ ID NO: 33); RKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 36); RQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID NO: 40); GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 50); GLFEAIAGFIENGWEGMIDGWYGRQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID NO: 51 ); GLFHAIAAHFIHGGWHGLIHGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 52); GLFEAIAEFIEGGWEGUEGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 53) ; GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 54) ; GLFKAIAKFIKGGWKGLIKGWYGYGRKKRRQRR (SEQ ID NO: 55); GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGEQE (SEQ ID NO: 56); LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHLGGGRKKRRQRRRPP Q (SEQ ID NO: 57); RKKRRQRRRPPQGGGLHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHH L (SEQ ID NO: 58); y LIRLWSHIHIWFQWRRLKWKKK (SEQ ID NO:59); en donde opcionalmente los péptidos están conjugados en cualquier extremo por la adición de una cisteína u otra porción que contiene tiol al extremo C o N; o cuando no están funcionalizados en el extremo N, opcionalmente los péptidos están bloqueados con un grupo acetilo, un lípido, PEG o una porción de direccionamiento; o cuando no están funcionalizados en el extremo C, opcionalmente los péptidos están bloqueados con una amida, lípido, PEG o una porción de direccionamiento.
Enlazadores Los enlaces covalentes entre el péptido y el oligonucleótido de la composición modular de la invención, son mediados por un enlazador. Este enlazador puede ser escindible o no escindible, dependiendo de la aplicación. En algunas modalidades se puede usar un enlazador escindible para liberar el oligonucleótido después de transportarlo del endosoma al citoplasma. La naturaleza buscada de la interacción de la conjugación o acoplamiento, o el efecto biológico deseado, determinarán la elección del grupo enlazador. Los grupos enlazadores se pueden combinar o ramificar para proveer arquitecturas más complejas. En WO 2009/126933, que se incorpora aquí como referencia, se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los enlazadores.
Los enlazadores de la presente invención se muestran en el cuadro 1 : CUADRO 1 Los enlazadores preferidos se muestran en el cuadro 2: CUADRO 2 Están disponibles enlazadores comerciales de varios proveedores tales como Pierce o Quanta Biodesign, incluyendo combinaciones de dichos enlazadores. Los enlazadores también se pueden combinar para producir arquitecturas ramificadas más complejas que acomodan de 1 a 8 péptidos, como se ilustra en el siguiente ejemplo: Liqandos de direccionamiento Las composiciones modulares de la presente invención pueden comprender un ligando de direccionamiento. En algunas modalidades, este ligando de direccionamiento puede dirigir la composición modular a una célula particular. Por ejemplo, el ligando de direccionamiento puede unirse de manera específica o inespecífica a una molécula de superficie de una célula objetivo. La porción de direccionamiento puede ser una molécula con una afinidad específica por una célula objetivo. Las porciones de direccionamiento pueden incluir anticuerpos dirigidos contra una proteína encontrada sobre la superficie de una célula objetivo, o el ligando o una porción de unión de receptor de un ligando para una molécula encontrada sobre la superficie de una célula objetivo. En WO 2009/126933, que se incorpora aquí como referencia, se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los lígandos de díreccionamiento.
Los ligandos de díreccionamiento se seleccionan del grupo que consiste en un anticuerpo, una porción de unión de ligando de un receptor, un ligando para un receptor, un aptámero, D-galactosa, N-acetil-D-galactosa (GalNAc), N-acetil-D-galactosa multivalente, D-manosa, colesterol, un ácido graso, una lipoproteína, folato, tirotropina, melanotropina, proteína tensoactiva A, mucina, carbohidrato, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamína, mañosa multivalente, fructosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, transferina, bifosfonato, poliglutamato, poliaspartato, una porción lipofílíca que incrementa la unión con la proteína plasmática, un esteroide, ácido biliar, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un imitador del péptido RGD, ibuprofeno, naproxeno, aspirina, folato, y análogos y derivados de los mismos.
Los ligandos de díreccionamiento preferidos se seleccionan del grupo que consiste en D-galactosa, N-acetil-D-galactosa (GalNAc), GalNAc2 y GalNAc3, colesterol, folato, y análogos y derivados de los mismos.
Lípidos Las porciones lipofílicas, tales como colesterol o ácidos grasos, cuando se unen a moléculas muy hidrofílicas, tales como ácidos nucleicos, pueden incrementar sustancialmente la unión con la proteína plasmática y consecuentemente la vida media en circulación. Además, los grupos lipofilicos pueden aumentar la captación celular. Por ejemplo, los lípidos se pueden unir a algunas proteínas plasmáticas, tales como lipoproteínas, y se ha mostrado consecuentemente que aumentan la captación en tejidos específicos que expresan los receptores de lipoproteína correspondientes (por ejemplo, LDL-receptor o el receptor barredor SR-B1 ). Los conjugados lipofilicos también se pueden considerar como un enfoque de suministro dirigido, y potencialmente se podría mejorar su tráfico intracelular mediante la combinación con agentes endosomolíticos.
Las porciones lipofílicas ejemplares que incrementan la unión con la proteína plasmática incluyen, sin limitación, esteróles, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicérido, fosfolípidos, esfingolípidos, ácido adamantano acético, ácido 1 -pireno-butírico, dihidrotestosterona, 1 ,3-bis-0-(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1 ,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03-(oleoil)litocólico, ácido 03-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo, fenoxazina, aspirina, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E y biotina, etc. En WO 2009/126933, que se incorpora aquí como referencia, se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los lípidos.
El lípido preferido es el colesterol.
Agentes solubilizantes La composición modular puede comprender una o más de otras porciones/ligandos que pueden incrementar la solubilidad acuosa, la vida media en circulación y/o la captación celular. Estas pueden incluir sustancias naturales tales como una proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL), o globulina); o un carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosán, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico). Estas porciones también pueden ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético o poliaminoácidos sintéticos. Los ejemplos incluyen polilisina (PLL), ácido poli-L-aspártico, ácido poli-L-glutámico, copolímero de estireno - anhídrido del ácido maleico, copolímero de poli(L-láctido-co-glicólido), copolímero de éter divinílico - anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG, por ejemplo, PEG-0.5K, PEG-2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG-20K, PEG-40K), metil-PEG (mPEG), [mPEG]2, alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, poli(2-ácido etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida, o polifosfazina. En WO 2009/126933, que se incorpora aquí como referencia, se pueden encontrar ejemplos y una descripción adicional de los agentes solubilizantes.
El grupo solubilizante preferido es PEG 0.5K a 30K.
Método de tratamiento En un aspecto, la invención presenta un método de tratamiento de un sujeto en riesgo de padecer, o que padece, una enfermedad que se puede aliviar por la administración de la composición modular de la invención. El método comprende administrar la composición modular de la invención a un sujeto en necesidad del mismo, tratando de esta manera al sujeto. El oligonucleótido que se administra dependerá de la enfermedad tratada. Véase WO 2009/126933 para consultar detalles adicionales con respecto a los métodos de tratamiento para indicaciones específicas.
Formulación Existen muchos métodos para preparar conjugados de compuestos de oligonucleótido. Las técnicas serán familiares para los expertos en la materia. Una referencia útil para tales reacciones es "Bioconjugate Techniques", Hermanson, G. T., Academic Press, San Diego, CA, 1996. Otras referencias incluyen WO 2005/041859; WO 2008/036825 y WO 2009/126933.
EJEMPLOS La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos que no se deben considerar como limitativos. El contenido de todas las referencias, solicitudes de patente pendientes y patentes publicadas citadas en toda esta solicitud, se incorporan expresamente en la presente como referencia. Los ARNci descritos en la presente se diseñaron para hacer blanco en el gen SSB (antígeno B del síndrome de Sjogren; NM_009278.4), expresado ubicuamente.
Los grupos enlazadores se pueden conectar a las cadenas de oligonucleótido en un punto de enlace (LAP) y pueden incluir cualquier porción que contiene carbono; en algunas modalidades tienen por lo menos un átomo de oxígeno, por lo menos un átomo de fósforo, y/o por lo menos un átomo de nitrógeno. En algunas modalidades, el átomo de fósforo forma parte de un grupo fosfato o fosforotioato terminal en el grupo enlazador, que puede servir como un punto de conexión para la cadena del oligonucleótido. En algunas modalidades, el átomo de nitrógeno forma parte de un grupo éter, éster, amino o amido (NHC(O)-) en el grupo enlazador, que puede servir como un punto de conexión para los enlazadores de interés, unidad endosomolítica, péptido penetrador de célula, grupo de solubilización, lípido, grupo de direccionamiento, o enlazadores adicionales de interés. Estos grupos enlazadores terminales incluyen, sin limitación, una porción de hexilo de C6, hidroxi secundario de C5, tiol de C3 o tiol de C6. Un ejemplo de las secuencias de ARN descritas más abajo es hexilo de CQ. [(CH2)6 H2].
Las secuencias de ARNci descritas en los ejemplos de la presente son de la siguiente manera: R1 R1 p Pasajero [omeG][omeC][omeC]AA[omeU]A[omeU][omeC][omeU]G[omeU]-[omeC]A[omeU][omeC]AAA[(CH2)6NH2] R1q Guía [p][fluU][fluU][fluU]GA[fluU]GA[fluC]AGA[fluU][fluU][fluU][fluU]GG- [fluCs][rUs]U R1 cq Guía colesterol [p][fluU][fluU][fluU]GA[fluU]GA[fluC]AGA[fluU][fluU][fluU][fluU]GG-[fluCs][rUs]U[5Col] R2 R2p Pasajero [(CH2)6NH2][iB][dA][fluC][dA][clA][fluC][dA][dG][clA][fluC][fluU]-[fluU][fluU][dA][dA][fluU][dG][fluU][dA][dA][dTs]dT[iB] R2q Guía [fluU][fluU]A[fluC][omeA][fluU][fluU][omeA][omeA][omeA][omeG]-[fluU][fluC][flu3][omeG][fluU][fluU][omeG][fluU][omeUs][omeU] R3 R3p Pasajero [(CH2)6NH2][iB][dA][dA][dA][fluU][fluC][dA][fluU][dG][dG][fluU][dG] [dA][dA][dA][flu][dA][dA][dA][dA][dTs]dT[iB] R3q Guía UUU[fluU][omeA][fluU][fluU][fluU][fluC][omeA][fluC][fluC][omeA]-[fluU][omeG][omeA][fluU][fluU][fluU][omeUs][omeU] R4 R4p Pasajero [omeA][omeC]AA[omeC][omeU]GA[omeC3[omeU][omeU][omeU] AA[omeU]G[omeU]AA[(CH2)6NH2] R4g Guía [p][fluU][fluU]A[fluC]A[fluU][fluU]AAAG[fluU][fluC][fluU]G[fluU]-[fluU]G[fluUs][rUs]U R4cg Guia colesterol [p][fluU][fluU]A[fluC]A[fluU][fluU]AAAG[fluU][fluC][fluU]G[fluU]-[fluU]G[fluUs][rUs]U[5 Col] R5 R5cp Pasajero colesterol [(CH2)6NH2][omeA][omeC]AA[omeC][omeU]GA[omeC][omeU]-[omeU][omeU]AA[omeU]G[ome]AA[5Col] R6 R6p pasajero [(CH2)6NH2][omeA][omeC]AA[omeC][omeU]GA[omeC][omeU]-[omeU][omeU]AA[omeU]G[ome]AA[C3SH] R7 R7p Pasajero [omeA][omeC]AA[omeC][omeU]GA[omeC][omeU][omeU][orneU] AA[omeU]G[omeU]AA[C3SH] R8 R8p Pasajero [(CH2)6NH2][omeA][omeC]AA[omeC][omeU]GA[omeC][omeU]-[omeU][omeU]AA[omeU]G[omeU]AA[(CH2)6NH2] R9 R9cp Pasajero [(CH2)6NH2][¡B)[fluA][omeC][fluA][fluA][omeC][fluA][fluG][fluA]-[omeC][omeU][omeU][omeU][fluA][fluA][omeU][fluG][omeU][fluA][fluA][dTs]-dT[iB][5Col] R9q Guia [p]dT[fluU][omeA][omeC][fluA][omeU][omeU][fluA][fluA][fluA][fluG] [omeU][omeC][fluU][fluG][omeU][omeU][fluG][omeU][omeUs][omeU] Los péptidos descritos en los ejemplos de la presente son de la siguiente manera: P1 CRQIKIWFQNRRMKWKKGGNH2 (SEQ ID NO: 35); P2 D(NHCi2H25)NleKNIeKNIeHNIeKNIeHNIeCNH2 (SEQ ID NO: 43); P3 CD(NHCi2H25)NleKNIeKNIeHNIeKNIeHNIeNH2 (SEQ ID NO: 43); P4 [HS(CH2)2CO]KLLKLLLKLWLKLLKLLLKLLNH2 (SEQ ID NO: 28); P5 m(Peg)44LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHLCNH2 (SEQ ID NO: 29); P6 CRKKRRQRRRPPQNH2 (SEQ ID NO: 36); P7 CLHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLLHHLNH2 (SEQ ID NO: 29); P8 HS(CH2)2CONH(Peg)27LHLLHHLLHHLHHLLHHLLHLLHHLL-HHLNH2 (SEQ ID NO 29); y P9 CGLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRRNH2 (SEQ ID NO: 54).
EJEMPLO 1 Paso 1 Una solución de 15.2 mg (2.40 µ????) de R1 p en 1 .5 mi de agua, pH 8.3, se enfrió a 0°C y se trató con una solución de 7.7 mg (0.018 mmol) de 1-1 en 1.0 mi de acetonitrilo, añadido gota a gota. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 0.5 h. El producto de reacción crudo se diluyó con 18 mi de agua y el pH se ajustó a 6.0 con ácido acético. La solución resultante se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 13.5 mg del producto deseado 1-2 como un polvo esponjoso amorfo blanco; masa medida = 6635.
Paso 2 Una solución de 3 mg (0.452 µ?t???) de 1-2 en 570 µ? de formamida:agua 3:1 y 30 µ? de TEAA 2M, se trató con una solución de 2.23 mg (0.904 µ?t???) de P1 en 600 µ? de formamida:agua 3:1 , y la solución resultante se agitó a t.a. durante 1.5 h. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B, 70:30 - 0:80 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 6.8; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, 50% formamida, pH 6.8). El pico del producto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 0.7 mg del conjugado deseado 1 -3 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El rendimiento del producto se determinó mediante análisis de UV (260 nm) del material liofilizado reconstituido en amortiguador de PBS pH 7.4.
Paso 3 Una solución de 0.7 mg (0.077 µ?t???) de 1-3 reconstituido se trató con una solución de 0.63 mg (0.092 µ????) de R1g en 65 µ? de amortiguador PBS pH 7.4. La solución resultante se calentó a 95° C por un minuto, se enfrió y se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 1.5 mg del producto dúplex deseado 1 -4 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El producto dúplex se confirmó por medio de MS; masa medida = cadena de pasajero: 9098, cadena guía: 6786.
Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 1-4: Masa medida = 15317, dúplex 1-6 Masa medida = 15881 , dúplex 1-7 Masa medida = 15467, dúplex 1-8 Masa medida = 9280, pasajero; 6785, gula 1-9 Masa medida = 19500, dúplex EJEMPLO 2 Paso 1 Una solución de 15.00 mg (2.14 pmol) de R3p en 1 mi de agua a pH 8.3 se trató con una solución de 6.38 mg (15.00 pmol) de 2-1 en 1 mi de acetonitrilo. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y el producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de intercambio aniónico (columna de intercambio aniónico Resource Q de 6 mi; A - 50% Tris 0.02 mM /50% formamida; B = 50% Tris 0.02 mM - NaOCI4 400 mM /50% formamida, gradiente 30-100 % A:B durante 30 min, flujo 10 ml/min). Las fracciones puras se combinaron y el producto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación 3X contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 300. El material acuoso combinado se congeló y se liofilizó durante la noche para producir 7.31 mg del producto deseado 2-2 como un polvo blanco amorfo.
LC/MS: masa medida = 7387; pureza = >99%.
Paso 2 Una solución de 5.00 mg (0.673 pmol) de 2-2 en 950 µ? de formamida:agua 3:1 se trató con 50 µ? de TEAA, y la solución se trató con una solución de 3.32 mg (1.347 pmol) de P1 en 1000 µ? de formamida:agua 3: 1 . La solución resultante se agitó durante 18h y el producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de intercambio aniónico (columna de intercambio aniónico Resource Q de 6 mi; A - 50% Tris 0.02 mM /50% formamida; B = 50% Tris 0.02 mM - NaOCI4 400 mM /50% formamida, gradiente de A:B 30-100 % durante 30 min, flujo 10 ml/min). Las fracciones purificadas se combinaron y el producto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación 3X contra agua. El material acuoso combinado se congeló y se liofilizó durante la noche para producir 5.18 mg del producto deseado 2-3 como un polvo amorfo blanco.
LC/MS: masa medida - 9737; pureza = >99%; no hubo exceso de péptido según se determinó por HPLC y MS.
Paso 3 Una solución de 5.00 mg (0.51 1 µ????) de 2-3 en 200 µ? de PBS pH 7.4 se trató con una solución de 3.39 mg (0.51 1 µ?t???) de R3g en 100 µ? de PBS pH 7.4. La solución resultante se calentó a 95 °C durante un minuto y se enfrió a t.a. La solución se diluyó con agua y se dializó 3x contra agua. El material acuoso se congeló y se liofilizó durante la noche para producir 3.22 mg del producto deseado 2-4 como un polvo amorfo blanco.
LC/MS: masa medida: pasajero = 9737, guía = 6631. Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 2-4: 2-5 Masa medida = 17500, dúplex 2-6 Masa medida = 15340, dúplex H H2NNIeHNIeKNIeHNIeKN[eKNIe(NHC12H25)DC (P3) Masa medida = 8286, pasajero; 6785, guía EJEMPLO 3 CRQIK(WFQNRRMKWKKGGNH2 P1 formamida:agua:DMSO, 3:1:1 37% Paso 1 Una solución de 63 mg (0.283 mmol) de 3-2 en 1 .5 mi de acetonitrilo se trató con 43.9 mg (0.339 mmol) de diisopropiletilamina. La solución resultante se agregó lentamente, gota a gota, a una solución de 300 mg (0.566 mmol) de 3-1 en 1.5 mi de acetonitrilo. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18h y se concentró al vacío. El aceite resultante se separó en una LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson usando una columna Phenomenex Gemini C18, para producir 60 mg (35%) del producto deseado 3-3 como un aceite claro. 1H RMN (CDCI3): 2.54 (t, 2H), 2.83 (m, 4H), 2.90 (t, 2H), 2.96 (t, 2H), 3.58 (m, 2H), 3.66 (m,10H), 3.72 (br m, 6H), (t, 2H), 3.84 (t, 2H), 7.21 (m, 1 H), 7.72 (m, 2H), 8.54 (d, 1 H).
Paso 2 A una solución de 90 mg (0.013 mmol) de R5cp en 10 mi de agua a pH 8.3 se le agregó una solución de 54.9 mg (0.091 mmol) de 3-3 en 10 mi de acetonitrilo. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La reacción se concentró al vacío para eliminar el acetonitrilo y se diluyó con 50 mi de agua. La solución resultante se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 90 mg (94%) del producto deseado 3-4 como un polvo esponjoso amorfo blanco.
LC/MS, masa medida = 7417; pureza = 90%.
Paso 3 Una solución de 4.00 mg (0.539 µ?t???) de 3-4 en 1 mi de formamida:agua:DMSO 3: 1 :1 se trató con una solución de 4.00 mg (1.635 ymol) de P1 en 1 mi de formamida:agua:DMSO 3: 1 :1 , y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 h. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson usando una columna DNA Pac 100 y un gradiente lineal de A:B 70:30 (A = 50% formamida /50% Tris-CI/pH7.4 20 mM; B = 50% formamida /50% Tris-CI 20 mM /NaOCI4 400 mM /pH7.4). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 2 mg del conjugado deseado 3-5 como un polvo esponjoso amorfo blanco.
LC/MS: masa medida = 9769, pureza = 95%, sin péptido residual.
Paso 4 Una solución de 2.00 mg (0.205 pmol) de 3-5 en 1 mi de amortiguador PBS pH 7.4 se trató con una solución de 1.38 mg (0.205 µ?t???) de R4g en 0.25 mi de amortiguador PBS pH 7.4. La solución resultante se calentó a 95 °C durante un minuto, se enfrió y se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 1.2 mg del dúplex deseado 3-6 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El dúplex se confirmó por MS, masa medida = 9770, cadena de pasajero; 6733, cadena guía.
El siguiente compuesto se preparó de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 3-5: 3-Sa Masa medida = 7770 Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 3-6: 3-8 Masa medida = 1 1692, pasajero; 6783, guía EJEMPLO 4 Paso 1 Una solución de 3.13 mi (29.1 mmol) de 4-1 y 15.24 mi (87 mmol) de DIPEA en 150 mi de THF en un matraz de fondo redondo purgado con nitrógeno, se enfrió a 0°C y se trató con una solución de 14.3 g (58.2 mmol) de 4-2 en 60 mi de THF, añadida gota a gota. La solución resultante se agitó a 0°C durante una hora y luego se dejó calentar a temperatura ambiente. El producto de reacción crudo se diluyó con 300 mi de DCM y se lavó con 150 mi de NaOH 1 N. La capa orgánica se separó y se concentró al vacío, y después se purificó por cromatografía de vaporización instantánea (DCM:MeOH, 1 % NH4OH, 9: 1 ) para producir 6.84 g de 4-3. 1H RMN (CDCI3): 1.45 (s, 18H), 2.73 (bt, 4H), 3.21 (m, 4H), 4.89 (bs, 2H).
Paso 2 Una solución de 5.44 g (17.93 mmol) de 4-3 en 55 mi de DCM se trató con 2.77 g (17.93 mmol) de 4-4, añadido en una porción. La solución resultante se agitó durante 0.5 h, después de lo cual la mezcla de reacción cruda se concentró al vacío y se purificó por cromatografía de vaporización instantánea (gradiente lineal de A:B 100:0 - 0:100 % [A= hexano, B = acetato de etilo]), para producir 7.2 g de 4-5 como un sólido blanco. 1H RMN (CDCI3): 1.44 (sd, 18H), 3.25-3.40 (m, 6H), 3.52 (bt, 2H), 4.19 (s, 2H), 4.42 (s, 2H), 4.88 (bt, 1 H), 5.33 (bs, 1 H).
Masa medida = 420.5 (M+1 ).
Paso 3 Se trató 1.0 g (2.38 mmol) de 4-5 con 32.5 mi de HCI anhidro 4 M en dioxano, dando como resultado el desprendimiento de gas y un precipitado blanco después de 15 minutos. La suspensión resultante se filtró y el sólido amorfo se disolvió en agua, luego se liofilizó para producir 380 mg de 4-6. 1H RMN (DMSO): 2.9-3.1 (m, 4H), 3.53 (bq, 4H), 4.15 (s, 2H), 4.33 (s, 2H), 8.14 (ds, 6H).
Masa medida = 220.3 (M+1 ).
Paso 4 Una suspensión de 30 mg (0.087 mmol) de 4-6 y 76 µ? (0.436 mmol) de DIPEA en 300 µ? de DMSO, se trató con una solución de 76.75 mg (0.18 mmol) de 2-1 en 300 µ? de DMSO. La suspensión resultante se calentó a 50°C durante 40 minutos, con sonicación intermitente para lograr homogeneidad. El producto de reacción crudo se diluyó con 1.5 mi de DMSO y se acidificó con 1 .6 mi de TFA acuoso al 0.1 %. La solución se purificó por LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson, usando una columna Phenomenex Gemini C18 (gradiente lineal de A:B, 95:5 - 5:95 % [A=agua con 0.1 % de TFA, B = acetonitrilo con 0.1 % de TFA]), para producir 43.40 mg de 4-7. 1H RMN (DMSO): 1.20 (m, 2H), 1.3-1.5 (m, 8H), 2.03 (bq, 4H), 3.01 (m, 8H), 3.1 -3.3 (m, 8H), 4.09 (s, 2H), 4.24 (s, 2H), 7.25 (m, 2H), 7.7-7.95 (m, 8H), 8.45 (m, 2H). Masa medida = 421.0 (M+2).
Paso 5 Se dializaron con centrifugación 50 mg (7.91 µ?t???) de R1 p tres veces, contra TEAA 250 mM, después dos veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir el aducto de trietilamonio 4-8 como un polvo esponjoso amorfo blanco.
Paso 6 Una solución de 39.9 mg (0.047 mmol) de 4-7 y 18.04 mg (0.047 mmol) de HATU en 650 µ? de DMSO, se trató con 12.2 µ? (0.071 mmol) de DIPEA. Después de 20 minutos, la solución resultante se agregó a una solución de 50 mg (7.91 pmol) de 4-8 y 12.2 µ? (0.071 mmol) de DIPEA en 2.65 mi de DMSO. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 0.5 h. El producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson, usando una columna Waters phenil Xbridge (gradiente lineal de A:B 95:5 - 5:95 % [A= agua con TEAA 250 mM, B = acetonitrilo con TEAA 250 mM]). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 34 mg del conjugado deseado 4-9 como un polvo esponjoso amorfo blanco, masa medida = 7147.
Paso 7 Una solución de 5 mg (0.700 µ????) de 4-9 en 950 µ? de formamida:agua 3:1 y 50 µ? de TEAA 2M, se trató con una solución de 3.45 mg (1.40 µ????) de P1 en 1.0 mi de formamida:agua 3:1 , y la solución resultante se agitó a t.a. durante 0.5 h. Se le agregaron a la reacción 1.72 mg (0.7 µ?t???) más de P1. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson, usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B 100:0 -0: 100 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 6.8; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, 50% formamida, pH 6.8). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir el conjugado deseado 4-10 como un sólido amorfo, que se tomó directamente para el siguiente paso.
Paso 8 Una suspensión de 4-10 en 2.0 mi de PBS pH 7.4 se trató con una solución de 2.37 mg (0.350 µ????) de R1g añadida en una porción. La suspensión resultante se calentó a 95° C y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se observó algo de heterogeneidad, llevando a la adición de 2.37 mg (0.35 pmol) de R1g y repitiendo el proceso de calentamiento con sonicación intermitente. La solución resultante se enfrió y se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir el producto dúplex deseado como un polvo esponjoso amorfo blanco. El dúplex se confirmó por MS; masa medida = 18636.
El siguiente compuesto se preparó de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 4-11 : 4-12 Masa medida = 17239, dúplex EJEMPLO 5 Paso 1 Una suspensión de 60 mg (0.174 mmol) de 4-6 y 152.4 µ? (0.872 mmol) de DIPEA en 600 µ? de DMSO se trató con una solución de 156 mg (0.366 mmol) de 1-1 en 600 µ? de DMSO. La suspensión resultante se calentó a 50°C durante 1.5 h con agitación. El producto de reacción crudo se diluyó con 1 .5 mi de DMSO y se acidificó con 1.6 mi de TFA acuoso al 0.1 %. La solución se purificó por LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson, usando una columna Phenomenex Gemini C18 (gradiente lineal de A:B 95:5 - 5:95 % [A=agua con 0.1 % de TFA, B = acetonitrilo con 0.1 % de TFA]) para producir 1 10.15 mg de 5-1. 1H RMN (DMSO): 2.25-2.35 (m, 8H), 3.1-3.4 (m, 16H), 3.46 (s, 8H), 3.55-3.65 (m, 8H), 4.09 (s, 2H), 4.24 (s, 2H), 7.003 (s, 4H), 7.91 (bt, 1 H), 8.01 (s, 2H). Masa medida = 421 .0 (M+2).
Paso 2 Una solución de 55.8 mg (0.050 mmol) de 5-1 y 18.94 mg (0.050 mmol) de HATU en 585 µ? de DMSO se trató con 1 1.19 µ? (0.064 mmol) de DIPEA. Después de 10 minutos, la solución resultante se le agregó a una solución de 45 mg (7.12 pmol) de 4-8 y 1 1.19 pl (0.064 mmol) de DIPEA en 2.65 mi de DMSO. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. El producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson, usando una columna Waters phenil Xbridge (gradiente lineal de A:B 95:5 - 5:95 % [A= agua con TEAA 250 mM, B = acetonitrilo con TEAA 250 mM]). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 23.5 mg del conjugado deseado 5-2 como un polvo esponjoso amorfo blanco, masa medida = 7146.
Paso 3 Una solución de 5 mg (0.700 pmol) de 5-2 en 950 µ? de formamida:agua 3: 1 y 50 µ? de TEAA 2M se trató con una solución de 3.45 mg (1.40 µ?t???) de ?1 en 1.0 mi de formamida:agua 3:1 , y la solución resultante se agitó a ta. durante 0.5 h. Se le agregaron a la reacción 1.72 mg (0.7 pmol) más de P1. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson, usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B 100:0 - 0: 100 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 6.8; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, 50% formamida, pH 6.8). El pico del producto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir el conjugado deseado 5-3 como un sólido amorfo cuya forma impidió la determinación del rendimiento. Masa medida = 12090.
Paso 4 Una suspensión de 5-3 en 300 µ? de PBS pH 7.4 se trató con una solución de 2.02 mg (0.298 µ????) de R1g en 200 µ? de PBS pH 7.4, añadida en una porción La suspensión resultante se calentó a 95° C y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se le agregó una solución de 1.15 mg (0.169 µ????) de R1g en 1 15 µ? de PBS pH 7.4 y se repitió el proceso de calentamiento. La solución resultante se enfrió y se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir el producto dúplex deseado 5-4 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El dúplex se confirmó por MS; masa medida = 18859.
El siguiente compuesto se preparó de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 5-4: 5-5 Masa medida = 17461 , dúplex EJEMPLO 6 1g PBS 1X 90X, 1 min 6-6 Paso 1 A una solución de 6-2 (58.6 mg, 0.189 mmol) y diisopropilamina (52.8 µ?, 0.303 mmol) en 1 .5 mi de DMF a 0 °C, se le agregó EDCI (39.2 mg, 0.303 mmol) y la mezcla de reacción resultante se agitó 10 min. Después de 10 min se le agregó 6-1 (100 mg, 0.152 mmol) sólido al recipiente de reacción en una porción, seguido por la adición de diisopropilamina (26.5 µ?, 0.152 mmol), y la mezcla de reacción se calentó lentamente a temperatura ambiente durante 30 min. Después de que el análisis de LC-MS indicó el consumo completo del material inicial, la mezcla de reacción se diluyó a 2.5 mi con MeCN/H20 1/1 , y se purificó por HPLC de fase inversa en C18 (MeCN 10-55 % en H20 durante 15 min). Las fracciones recolectadas se combinaron y el producto se liofilizó para producir 6-3 como un polvo blanco (40-70 % de rendimiento).
MS: 837.
El siguiente compuesto se preparó como se describe arriba: Paso 2 Una solución de 6-3 (1.50 mg, 1.79 pmol) en 400 µ? de formamida/H20 /TEAA 2 M = 3/1/0.1 , se trató con una solución del péptido P1 (1 1.0 mg, 4.47 pmol) en 200 µ? de formamida/H20 /TEAA 2M = 3/1/0.1 . La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después del consumo completo de 6-3 se le agregó TCEP HCI (5.12 mg, 17.9 pmol) y la mezcla de reacción se calentó a 37 °C. Después de 30 min, un análisis de LC-MS indicó la reducción completa del enlace disulfuro y la mezcla de reacción se diluyó a 2.5 mi con MeCN/H20 1/1. La purificación por HPLC de fase inversa en C18 (MeCN 10-60% en H20 durante 15 min) y liofilización, produjeron 6-4 como un sólido blanco.
MS: 5672.
Paso 3 Una solución de 1 -2 (3.00 mg, 0.452 pmol) en 400 µ? de formamida /amortiguador Tris HCI pH 6.8 = 3/1 , se trató con una solución de 6-6 (3.08 mg, 0.543 pmol) en 400 µ? de formamida /amortiguador Tris HCI pH 6.8 = 3/1. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después del consumo completo de 1-2, la mezcla de reacción se purificó a través de una columna de intercambio aniónico Resource Q (50-100 % de B en A; A: formamida/H20= 1/1 , Tris-HCI 20 mM, pH-7.4, B: formamida/H20 1/1 , Tris-HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, pH-7.4). La fracción combinada de producto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación 4 veces contra agua, con una membrana de corte de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 6-5 como un sólido blanco; masa = 12313.
Paso 4 A una solución de 6-5 (0.90 mg, 0.073 µ????) en 400 µ? de amortiguador PBS 1X se le agregó una solución de R1g (0.51 mg, 0.075 pmol) en 400 µ? de PBS 1X. La solución resultante se calentó a 90 °C durante 1 min y luego se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla de reacción de apareamiento se diluyó con agua y se dializó con centrifugación 4 veces contra agua, con una membrana de corte de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 6-6 como un sólido blanco; masa de la cadena de pasajero = 12313, de la cadena guía = 6865.
El siguiente compuesto se preparó como se describe arriba: 6-7 masa = 1231 3, cadena de pasajero; 7380, cadena gula EJEMPLO 7 agua 92% por los dos pasos 75 PBS pH 7.4 95°C /1 min R4g >99% de recuperación CRKKRRQRRRPPQ-NH2 Paso 1 Una solución de 10 mg (1.54 µ?t???) de R6p en 1.46 mi de agua se trató con 37.5 µ? de TEAA 2M, 15 µ? (0.015 mmol) de DTT 1 M en agua, y 15 µ? (0.108 mmol) de TEA. La solución resultante se agitó durante 0.5 h y después se desaló usando una columna NAP-25 eluida con 2.5 mi de agua desionizada, para producir 7-1. El producto se tomó directamente para el siguiente paso.
Paso 2 Una solución de 7-1 del paso anterior en 2.5 mi de agua destilada se trató con 1 .8 mg (5.02 µ?t???) de 7-2 añadido en una porción. La solución resultante se agitó durante 10 minutos y después se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 9.55 mg de 7-3 como un polvo esponjoso amorfo blanco, que se tomó sin purificación para lo siguiente.
Paso 3 Una solución de 2.37 mg (2.82 pmol) de 4-8 y 1 .07 mg (2.82 pmol) de HATU en 130 µ? de D SO se trató con 0.50 pl (2.82 pmol) de DIPEA. Después de 10 minutos, la solución resultante se le agregó a una solución de 9.55 mg (1 .41 pmol) de 7-3 y 2.46 µ? (0.014 mmol) de DIPEA en 530 µ? de DMSO. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. El producto de reacción crudo se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 10.25 mg de 7-4 como un polvo esponjoso amorfo blanco, que se tomó sin purificación para lo siguiente.
Paso 4 Una solución de 5 mg (0.652 µ?t???) de 7-4 en 950 µ? de formamida:agua 3:1 y 50 µ? de TEAA 2M, se trató con una solución de 2.32 mg (1 .32 pmol) de P6 en 1.0 mi de formamida: agua 3:1 , y la solución resultante se agitó a t.a. durante 0.5 h. Se le agregaron a la reacción 1.16 mg (0.652 pmol) más de 1 -4. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson, usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B 100:0 -0: 100 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 7.4; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, 50% formamida, pH 7.4). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 2.77 mg del conjugado deseado 7-5.
Masa medida = 10976.
Paso 5 Una suspensión de 1 mg (0.092 µp???) de 7-5 en 100 µ? de PBS pH 7.4 se trató con una solución de 0.5 mg (0.074 pmol) de R4g en 100 µ? de PBS pH 7.4, añadido en una porción. La suspensión resultante se calentó a 95° C y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La solución resultante se enfrió y se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 1.5 mg del producto dúplex deseado 7-6 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El dúplex se confirmó por MS, masa medida = 1771 1.
Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 7-6: 7-7 Masa medida = 18305, dúplex 15 7-8 Masa medida = 19183, dúplex 81 EJEMPLO 8 H?NGG KW MRRNQFWl IQRC Paso 1 Una solución de 50 mg (7.89 pmol) de R4p en 3.6 mi de agua a pH 8.3 se trató con una solución de 30.9 mg (0.055 mmol) de 8-1 en 400 µ? de acetonitrilo. La solución resultante se agitó durante 10 minutos. El producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson, usando una columna Waters phenil Xbridge (gradiente lineal de A:B 95:5 - 5:95 % [A= agua con TEAA 250 mM, B = acetonitrilo con TEAA 250 mM]). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 32.3 mg del conjugado deseado 8-2 como un polvo esponjoso amorfo blanco; masa medida = 6778.
Paso 2 Una solución de 5 mg (0.709 µ????) de 8-2 en 950 µ? de formamida:agua 3: 1 y 150 µ? de TEAA 2M, se trató con una solución de 8.201 mg (1 .475 µ????) de 8-3 (sintetizado de igual manera que en el ejemplo 6, pasos 1 y 2) en 1.0 mi de formamida: agua 3:1 , y la solución resultante se agitó a t.a. durante 0.5 h. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson, usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B 100:0 -0: 100 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 7.4; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, 50% formamida, pH 7.4). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir el conjugado deseado 8-4 como un sólido amorfo que se tomó directamente para el siguiente paso.
Paso 3 Una suspensión de 8-4 en PBS pH 7.4 se trató con una solución de 1.25 mg (0.186 pmol) de R4g añadida en una porción. La suspensión resultante se calentó a 95° C y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La solución resultante se enfrió y se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 3.68 mg del producto dúplex deseado 8-5 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El dúplex se confirmó por MS; masa medida = 12230, cadena de pasajero; 6733 cadena guía.
Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 8-5: 8-6 Masa medida = 19558, dúplex 8-8 Masa medida = 199) 1 , dúplex 19845, dúplex 8-10 Masa medida = 20439, dúplex EJEMPLO 9 9-7 Paso 1 Una solución de 50 mg (7.69 µ?t???) de R6p en 4 mi de agua a pH 8.3 se trató con 108 mg (0.054 mmol) de 9-1 añadido en una porción. La solución resultante se agitó durante 10 minutos. El producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson, usando una columna Waters phenil Xbridge (gradiente lineal de A:B 95:5 -5:95 % [A= agua con TEAA 250 mM, B = acetonitrilo con TEAA 250 mM]). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 47.39 mg del conjugado deseado 9-2 como un polvo esponjoso amorfo blanco; masa medida = distribución alrededor de 8400.
Paso 2 Una solución de 51 mg (6 µ????) de 9-2 en 5.85 mi agua se trató con 150 µ? de TEAA 2M, 60 µ? (0.060 mmol) de DTT 1 M en agua, y 60 µ? (0.430 mmol) de TEA. La solución resultante se agitó durante 0.5 h y después se desaló usando tres columnas NAP-25 eluidas cada vez con 3.0 mi de agua desionizada, para producir 9-3. El producto se tomó directamente para el siguiente paso.
Paso 3 Una solución de 8.89 mg (0.017 mmol) de 9-4 en 9 mi de acetonitrilo se trató con una solución de 9-3 en 4.5 mi de agua desionizada del paso anterior, añadida gota a gota. La solución resultante se agitó durante 15 minutos y después se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 19.07 mg de 9-5 como un polvo esponjoso amorfo blanco, que se tomó sin purificación para lo siguiente.
Paso 4 Una solución de 5 mg (0.562 pmol) de 9-5 en 950 µ? de formamida:agua 3: 1 y 150 µ? de TEAA 2M se trató con una solución de 6.25 mg (1 .123 pmol) de 8-3 en 1.0 mi de formamida:agua 3: 1 , y la solución resultante se agitó a t.a. durante 0.5 h. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson, usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B 100:0 - 0: 100 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 7.4; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, 50% formamida, pH 7.4). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 3.6 mg del conjugado deseado 9-6 como un sólido amorfo.
Paso 5 Una solución de 1.58 mg (0.109 µ????) de 9-6 en PBS pH 7.4 se trató con una solución de 0.882 mg (0.131 µ?t???) de R4g, añadida en una porción. La solución resultante se calentó a 95° C y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La solución resultante se enfrió y se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 2.35 mg del producto dúplex deseado 9-7 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El dúplex se confirmó por MS; masa medida = distribución de la cadena de pasajero alrededor de 14.5 kD, cadena guía 6732.
Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 9-7: 9-8 Masa medida = ~21.8 kDa , dúplex 9-9 Masa medida = ~21.8 kDa , dúplex 9-10 Masa medida = -22.1 kDa , dúplex 9-11 Masa medida = -22.7 kDa , dúplex 15 9-12 Masa medida = -23.3 kDa, dúplex EJEMPLO 10 5 o 1. Formamida/agua =3:1 TEAA 2.5% v/v, P7 2. 10 eq. TCEP'HCI R4g PBS I 90°C, 1 min 10-6 Paso 1 A una solución de R7p (10.0 mg, 1.54 µ????) en 0.5 mi de amortiguador Tris-HCI (pH=8.0) se le agregó PEG1000-Mal 10-2 polidisperso (3.08 mg, 3.08 pmol) en 0.5 mi de MeCN a temperatura ambiente, y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 15 min. Después de que un análisis de LC-MS indicó el consumo completo del R7p inicial, se le agregó SMPEG24 10-1 (10.8 mg, 7.71 µ????) en 0.5 mi de MeCN, y la mezcla de reacción se agitó durante 2 h más. La reacción se apagó agregando agua y se dializó con centrifugación 5 veces contra agua, con una membrana de corte de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 10-3 crudo como un sólido blanco, y se usó en el siguiente paso sin más purificación.
MS ~9000 con unidad de PEG polidisperso.
Paso 2 Una solución de 6-5' (1 .70 mg, 2.35 pmol) en 500 µ? de formamida/H20 TEAA 2M = 3/1/0.1 se trató con una solución del péptido P7 (19.6 mg, 5.17 µ????) en 500 µ? de formamida/H20/TEAA 2M = 3/1/0.1 . La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después del consumo completo de 6-5', se le agregó TCEP-HCI (6.80 mg, 23.5 pmol) y la mezcla de reacción se calentó a 37 °C. Después de 2 h, un análisis de LC-MS indicó la reducción completa del enlace disulfuro y la mezcla de reacción se diluyó a 2.5 mi con MeCN/H20 1/1. La purificación por HPLC en C3 de fase inversa (MeCN 40-90% en H20 durante 15 min) y liofilización, produjeron 10-4 como un sólido blanco.
MS: 8189.
El siguiente compuesto se preparó de la misma manera que se preparó 10-4: Paso 3 Una solución de 10-3 (6.00 mg, 0.682 pmol) en 400 µ? de DMSO se trató con una solución del péptido 10-4 (5.67 mg, 0.682 mol) en 400 µ? de DMSO. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El producto se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superdex™ 75 10/300 (Tris-HCI 200 mM, NaCI 2 M, pH=8.0). La fracción combinada de producto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación 5 veces contra agua, con una membrana de corte de PM 10,000. El producto dializado se liofilizó para producir 10-5 como un sólido blanco; masa ~17,200 con unidad de PEG polidisperso.
Paso 4 A una solución de 10-5 (1.90 mg, 0.1 1 1 pmol) en 400 µ? de PBS 1 X se le agregó una solución de R4g (0.845 mg, 0.122 µ?t???) en 400 µ? de PBS 1X. La solución resultante se calentó a 90 °C durante 1 min y luego se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla de reacción de apareamiento se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, con una membrana de corte de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 10-6 como un sólido blanco; masa de la cadena de pasajero ~17,200 con unidad de PEG polidisperso; cadena guía = 6732.
El siguiente compuesto se preparó como se describe arriba: masa de la cadena de pasajero -17,200 con unidad de PEG polidisperso; cadena guía= 6911 EJEMPLO 11 11-4 Paso 1 Una solución de 25 mg (3.95 mol) de R6p en 2.5 µ? de agua a pH 8.3 se trató con una solución de 23.92 mg (0.028 mmol) de 11 -1 en 500 µ? de acetonitrilo. La solución resultante se agitó durante 10 minutos. El producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson, usando una columna Waters phenil Xbridge (gradiente lineal de A:B 95:5 - 5:95 % [A= agua con TEAA 250 mM, B = acetonitrilo con TEAA 250 mM]). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 12.57 mg del conjugado deseado 11-2 como un polvo esponjoso amorfo blanco; masa medida = 7085.
Paso 2 Una solución de 5 mg (0.706 pmol) de 11-2 en 950 µ? de formamida:agua 3:1 y 150 µ? de TEAA 2M, se trató con una solución de 7.85 mg (1.41 1 µp???) de 8-4 en 1.0 mi de formamida:agua 3:1 , y la solución resultante se agitó a t.a. durante 0.5 h. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson, usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B 100:0 - 0:100 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 7.4; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM , 50% formamida, pH 7.4). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 5.4 mg del conjugado deseado 11 -3 como un sólido amorfo.
Paso 3 Una suspensión de 5.1 mg (0.403 µ????) de 11-3 en 500 µ? de PBS pH 7.4 se trató con una solución de 3.26 mg (0.484 pmol) de R4g, añadida en una porción. La suspensión resultante se calentó a 95° C y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La solución resultante se enfrió y se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 7.55 mg de el producto dúplex deseado 11 -4 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El dúplex se confirmó por MS¡ masa medida = 19378.
El siguiente compuesto se preparó de manera similar a la que se describe arriba para la síntesis de 11 -4: 11-5 Masa medida = 19979, dúplex EJEMPLO 12 12-1 CGLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGR KRRORRNHj P9 formam¡da:agua 3:1 TEAA 10% 12-2 PBS/pH 7.4 R4g 95°/ 1 min. 12-3 Paso 1 Una solución de 50.00 mg (7.89 pmol) de R4p en 3600 µ? de agua a pH 8.3 se trató con una solución de 30.90 mg (55.00 pmol) de 8-1 en 400 µ? de acetonitrilo, y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de fase inversa (Gilson; gradiente de 5-95% B; A= TEAA 200 mM, B = ACN; 20 min de gradiente; columna Waters Phenil XBridge). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se congeló y se liofilizó durante la noche para producir 32 mg del producto deseado 12-1 aislado como un polvo esponjoso amorfo blanco; 10747.
Paso 2 Una solución de 2.35 mg (0.347 pmol) de 12-1 en 500 µ? de formamida:agua 3: 1 se trató con una solución de 2.83 mg (0.693 µ????) de P9 en 450 µ? de formamida:agua 3:1 con 50 µ? añadidos de TEAA. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 h, y el producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico (columna Resource Q; gradiente de B 10-100%; A = 50% Tris 0.02 mM /50% formamida; B = 50% Tris 0.02 mM - NaOCI4 400 mM /50% formamida; gradiente A:B 30-100 % durante 30 min, flujo 10 ml/min). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó 3X contra agua. El producto dializado acuoso se congeló y se liofiiizó durante la noche para producir 1.37 mg del producto deseado 12-2 como un sólido cristalino.
LC/MS, masa medida = 10747; pureza = 96%, sin péptido residual.
Paso 3 Una solución de 1 .37 mg (0.131 mol) de 12-2 en 500 µ? de PBS pH 7.4 se trató con una solución de 0.792 mg (0.1 18 pmol) de R4g en 500 µ? de PBS pH 7.4, y la solución resultante se calentó a 95 °C durante un minuto. La solución resultante se enfrió a t a., se diluyó con agua y se dializó 3x contra agua (membrana de diálisis de centrifugación de PM 3000). El producto dializado acuoso se congeló y se liofiiizó durante la noche para producir 1.45 mg del producto deseado 12-3 como un polvo amorfo blanco.
LC/MS, masa medida de la cadena pasajera = 10747, cadena guía = 6733, dúplex = 17481. 113 Paso 1 A una solución de R4p (20.0 mg, 3.16 pmol) en 1.0 mi de amortiguador Tris-HCI (pH=8.0) se le agregó 13-1 (13.65 mg, 9.47 µ?t???) en 1.0 mi de MeCN a temperatura ambiente, y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 45 min. Después de que un análisis de LC-MS indicó el consumo completo del R4p inicial, la mezcla de reacción se diluyó a 2.5 mi con MeCN/H20 = 1/1. La purificación por HPLC de fase inversa X-Bridge™ (MeCN 10-60% en H2O durante 15 min) y liofilización, produjeron 13-2 como un sólido blanco.
MS: 7659.
Paso 2 Una solución de 13-2 (2.00 mg, 0.261 µ????) en 400 µ? de DMSO se trató con una solución del péptido 10-4 (2.57 mg, 0.313 µ????) en 400 µ? de DMSO. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El producto se purificó por cromatografía de intercambio amónico en una columna DNA pack 200 (50-100% de B en A, A: formamida/H20= 1/1 , Tris-HCI 20 mM, pH=7.4, B: formam¡da/H20 = 1/1 , Tris-HCI 20 mM, NaCIO4 400 mM, pH-7.4). La fracción combinada de producto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación 4 veces contra agua, con una membrana de corte de PM 10,000. El producto dializado se liofilizó para producir 13-3 como un sólido blanco; masa = 15745.
Paso 3 A una solución de 13-3 (0.70 mg, 0.044 µ????) en 400 µ? de PBS 1 X se le agregó una solución de R4g (0.33 mg, 0.049 µ?t???) en 400 µ? de PBS 1 X. La solución resultante se calentó a 90 °C durante 1 min y luego se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla de reacción de apareamiento se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, con una membrana de corte de PM 10,000. El producto dializado se liofilizó para producir 13-4 como un sólido blanco; masa de la cadena de pasajero = 15745, cadena guía = 6732.
El siguiente compuesto se preparó de manera similar a la que se describe arriba para preparar 13-4: Masa medida = 22548, dúplex EJEMPLO 14 14-4 Paso 1 Una solución de 20 mg (3.07 µ?t???) de R8p en 1 .44 mi de agua a pH 8.3 se trató con una solución de 19.60 mg (0.021 mmol) de 14-1 en 160 µ? de acetonitrilo. La solución resultante se agitó durante 15 minutos. El producto de reacción crudo se purificó por LC preparativa de fase inversa en un aparato Gilson, usando una columna Waters phenil Xbridge (gradiente lineal de A:B 95:5 - 5:95 % [A= agua con TEAA 250 mM, B = acetonitrilo con TEAA 250 mM]). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 21 .60 mg del conjugado deseado 14-2 como un polvo esponjoso amorfo blanco; masa medida = 8106.
Paso 2 Una solución de 5 mg (0.617 µ?t??G) de 14-2 en 950 µ? de formamida:agua 3:1 y 150 µ? de TEAA 2M se trató con una solución de 13.72 mg (2.467 pmol) de 8-3 en 1.0 mi de formamida:agua 3:1 , y la solución resultante se agitó a t.a. durante 0.5 h. El producto de reacción crudo se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson, usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B 100:0 - 0: 100 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 7.4; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, 50% formamida, pH 7.4). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 4.5 mg del conjugado deseado 14-3 como un sólido amorfo.
Paso 3 Una suspensión de 1.5 mg (0.079 pmol) de 11-3 en 700 agua se trató con una solución de 0.584 mg (0.087 pmol) de 7-7, añadida en una porción. La suspensión resultante se calentó a 95° C y se dejó enfriar a temperatura ambiente; después se decantó en una membrana de diálisis de PM 3000. El sólido remanente se solubilizó usando formamida:agua 1 :1 y se combinó con el material decantado en la membrana de diálisis. La solución resultante se dializó con centrifugación tres veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 1.26 mg del producto dúplex deseado 14-4 como un polvo esponjoso amorfo blanco. El dúplex se confirmó por MS; masa medida = 25740.
EJEMPLO 15 Una solución de 5.00 mg (0.573 pmol) de 3-5a en 950 pl de formamida:agua 3: 1 con 150 µ? de TEAA 2M se trató con una solución de 10.07 mg (1 .145 µ?t???) de 10-4a en 1 mi de formamida:agua 3: 1 , y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. El producto de reacción crudo se trató con 7.77 mg (1.145 pmol) de R9g y el dúplex se purificó por cromatografía preparativa de intercambio aniónico en un aparato Gilson, usando una columna ResourceQ de 6 mi y un gradiente lineal de A:B 95:5 - 5:95 % (A = Tris.HCI 20 mM, 50% formamida, pH 7.4; B = Tris.HCI 20 mM, NaCI04 400 mM, 50% formamida, pH 7.4). El pico del producto supuesto se diluyó con agua y se dializó con centrifugación cuatro veces contra agua, usando una membrana de diálisis de PM 3000. El producto dializado se liofilizó para producir 3.93 mg del conjugado deseado 15-1 como un sólido amorfo esponjoso blanco; masa medida = 24253 (dúplex).
Pruebas Se recolectan 2-3 tubos de sangre en tubos Vacutainer con 10 mi de EDTA. Se revisa si las muestras presentan hemolisis llevando una muestra de 1 -200 µ? a un tubo de microcentrífuga y centrifugando a la velocidad máxima durante 2 minutos. Se observa en los sobrenadantes la evidencia de hemolisis y se desechan las muestras hemolizadas. Las muestras remanentes se reúnen; se llevan 5 mi de la sangre reunida a un tubo de centrífuga de 50 mi y se tratan con -35 mi del amortiguador apropiado: fosfato dibásico 100 mM a pH 5.4 o a pH 7.5. Para las muestras que puedan tener problemas de solubilidad en los amortiguadores de fosfato, sustituir con lo siguiente: el amortiguador de pH 7.5 contiene NaCI 150 mM, Hepes 20 mM; el amortiguador de pH 5.4 contiene NaCI 150 mM, MES 20 mM. Las muestras se invierten para mezclarse y se les centrifuga a 3000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y el proceso de repite 2X. Los RBC se resuspenden a un volumen total de 50 mi del amortiguador de pH deseado y se guardan sobre hielo. Se preparan diluciones en serie de los compuestos que se van a probar en una placa de 96 pocilios Easy-Wash o de fondo en V, en amortiguador o en agua según sea apropiado. La prueba estándar usa una serie de dilución de 2 veces de 10 puntos. Normalmente las diluciones del compuesto se preparan a una concentración 10X en un volumen final de 25 µ?. La concentración más alta probada depende del material y su solubilidad respectiva. Una concentración típica es de 100 µ?. Se incluye amortiguador solo y Tritón X-100 al 1 % en PBS como controles negativo y positivo, respectivamente. Se preparan diluciones como pocilios duplicados o sencillos dependiendo del número de muestras que se van a probar y la cantidad de material disponible para la prueba. A cada pocilio se le agregan 175 µ? del amortiguador apropiado. Usando la punta de una pipeta de orificio ancho se les agregan manualmente 50 µ? de la suspensión de RBC lavados. Las muestras se trituran aproximadamente 6-8X para mezclarse y se incuban durante 30 minutos en un cuarto tibio a 37 °C o en una incubadora. La placa se cubre con una tapa de evaporación baja durante este proceso. La placa se retira del cuarto tibio o la incubadora y se centrifuga a -3000 rpm durante 5 minutos. Se transfieren 150 µ? del sobrenadante a una placa blanca de 96 pocilios de fondo transparente y se lee la absorbancia a 541 nm. Para los cálculos, de todas las muestras se resta la absorbancia de fondo tratando separadamente cada grupo de pH. Se calcula el porcentaje de hemolisis de cada muestra como un % de la muestra de Tritón X- 00 (100% de hemolisis). Los datos se grafican; en las figuras 1-3 se muestran curvas de muestra. La línea de cuadrados de las gráficas representa el % de hemolisis a pH 5.4 y la línea de diamantes de las gráficas representa el % de hemolisis a pH 7.5.
Protocolo general de la prueba bDNA de ARNci Los ARNci descritos en la presente se diseñaron para hacer blanco en el gen expresado ubicuamente SSB (antígeno del síndrome de Sjogren; NM_009278.4). La secuencia del ARNci usado es homologa en transcritos de humano, ratón y rata. Para probar la actividad silenciadora de los conjugados de ARNci, células HeLa (línea de células de cáncer cervical humano) en medio (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal de becerro (FCS), se sembraron placas y se dejaron cultivando durante la noche (37 °C, 5% de CO2). Al día siguiente, el medio se reemplazó con medio libre de suero que contenía los conjugados de ARNci a concentraciones que varían de 10 a 0.0015 µ?, y se dejó sobre las células un total de 72 horas (37 °C, 5% de CO2). La concentración del ARNm de SSB se determinó usando la prueba de ADN ramificado, b-DNA, según las instrucciones del fabricante (bDNA 1.0, kit # Q0002 de Panomics Quantigene). La viabilidad celular se determinó usando la prueba MTS (Promega, No. catálogo TB245), y todos los datos se normalizaron con respecto a la concentración en las células no tratadas.
Como se muestra en las figuras 4-1 1 , las células HeLa se trataron con los compuestos indicados durante 72 horas de manera dependiente de la dosis, y se determinó la concentración del ARNm de SSB por medio de la prueba de b-DNA.
Protocolo general de la prueba de luciferasa doble para ARNci Para probar la actividad silenciadora de los conjugados de ARNci, células HEK293T transfectadas establemente con vector de luciferasa se sembraron en medio (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal de becerro (FCS), y se dejaron cultivando durante la noche (37 °C, 5% de C02). Este sistema celular reportero contiene una construcción de luciferasa doble de Renilla-luciérnaga [Ren/FF] y tiene los sitios objetivo de SSB incorporados en la 3'-UTR de la luciferasa de Renilla. Al día siguiente, el medio se reemplazó con medio libre de suero que contenía los conjugados de ARNci a concentraciones que varían de 10 a 0.01 µ?, y se dejó sobre las células un total de 24 h (37 °C, 5% de C02). La concentración de proteína de luciérnaga y Renilla se determinó usando la prueba Dual-Glo de Promega según las instrucciones del proveedor (Promega, No. catálogo E2920). La señal de luciérnaga se usó como un control de la viabilidad celular, y la actividad de la luciferasa de Renilla/luciérnaga se usó para knoc down específico de ARNm. Todos los datos se normalizaron con respecto a la concentración en las células no tratadas.
Como se muestra en las figuras 12-14, las células HEK293T se trataron con los compuestos indicados durante 24 h de manera dependiente de la dosis, y se determinó la concentración del ARNm de SSB por medio de la prueba de b-DNA.
Protocolo de cribado ocular Todos los procedimientos que incluyen animales se hicieron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales para Investigación Oftálmica y de la Visión, y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Merck Research Laboratories, West Point, PA. Se compraron ratas noruegas machos (6-8 semanas) de Charles River Laboratories. Los ARNci se prepararon asépticamente para minimizar el riesgo de infección. Para administración intravítrea, las ratas se anestesiaron con ketamina/xilazina (40-90 /5-10 mg/kg, i.m.) y se aplicó 1 % de clorhidrato de proparacaína (1 -2 gotas) en el ojo como anestésico tópico. Para inyección intravítrea se usó un par de fórceps limpios para hacer una proptosis suave y mantener en posición el ojo, y se usó una jeringa con aguja puntiaguda 30G para inyectar 5 µ? de ARNci de prueba o vehículo de control en el cuerpo vitreo, justo en la parte posterior del limbo. El día del sacrificio, las ratas se sometieron a eutanasia con pentobarbital sódico (150-200 mg/kg, i.p.). Después de enucleación, el cuerpo vitreo, la retina y el RPE/coroides se disecaron y se congelaron. El tejido retinal se homogeneizó en amortiguador de lisis RLT (Quaigen, No. catálogo 79216), y ARN total se purificó usando el kit Rneasy 96 de Qiagen (No. catálogo 74181 ). El ARN total se analizó entonces por medio de PCR cuantitativa para determinar la concentración relativa del ARNm del gen objetivo SSB con genes de mantenimiento como GAPDH y PPIB. La figura 15 detalla las concentraciones relativas del ARNm de SSB en el tejido de retina de rata 3 días después de una sola dosis intravítrea de los compuestos indicados.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1 .- Una composición modular que comprende: (1) un ARNci; (2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y (3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1 -59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
2 - La composición modular de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'.
3. - La composición modular de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'.
4. - Una composición modular que comprende: (1 ) un ARNci; (2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y (3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 1-59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
5. - La composición modular de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'.
6. - La composición modular de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'.
7.- Una composición modular que comprende: (1 ) un ARNci; (2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y (3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
8. - La composición modular de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'.
9. - La composición modular de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'.
10 - Una composición modular que comprende: (1 ) un ARNci; (2) uno o más enlazadores que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de en donde los enlazadores están unidos al ARNci en cualquier extremo 3' y/o 5'; y (3) uno o más péptidos que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados de los SEQ ID NOs: 28, 29, 33, 36, 40, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 y 59, en donde los péptidos están unidos a los enlazadores.
1 1. - La composición modular de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque los enlazadores están unidos a la cadena guía del ARNci en el extremo 3' y/o 5'.
12. - La composición modular de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque los enlazadores están unidos a la cadena de pasajero del ARNci en el extremo 3' y/o 5'.
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