CN113652431A - 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种小干扰核酸和药物组合物及其用途，该siRNA含有正义链和反义链，所述正义链含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，反义链含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；且所述siRNA的磷酸‑糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基为具有或不具有修饰基团的磷酸酯基和核糖基。本公开提供了全新高效的siRNA及其药物组合物，可以有效预防和/或治疗血脂异常。

Description

一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
相关申请
本申请是申请日为2016年12月21日，申请号为201611193911.6的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种小干扰核酸(siRNA)、一种药物组合物以及它们的用途。
背景技术
血脂异常，又名高脂血症，是脂肪代谢或运转异常，使血浆脂质高于正常值的一种全身性疾病。高脂血症的临床表现主要包括两大方面：(1)脂质在真皮内沉积所引起的黄色瘤；(2)脂质在血管内皮沉积所引起的动脉粥样硬化，产生冠心病和周围血管病等。据报道，全世界大约有35％的二型糖尿病患者也患有血脂异常；另外，1800万人患有高脂血症中的高甘油三酯症。我国18岁及以上人群血脂异常患病率约为18.6％，甚至儿童中也有近10％者血脂升高，还有逐渐上升的趋势。血脂异常严重威胁着患者的健康。
现有的治疗血脂异常的药物主要有他汀类、胆固醇吸收抑制剂、树脂类、普罗步考、贝特类和烟酸及其衍生物。这些药物使用后或多或少都会有一些禁忌症和副反应，例如在2001年被曝出有31例服用他汀类降脂药拜斯亭的病人先后死于严重的肌病的案例。因此，亟需开发针对血脂异常的新药物和新疗法。
血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)是一种主要在肝脏表达的分泌蛋白，因其基因结构与血管生成素相似得名。现有研究证实血脂异常与ANGPTL3的高表达量是有相关性的，ANGPTL3通过与脂肪组织结合，抑制脂蛋白脂肪酶的活性来调节脂质代谢。ANGPTL3的低表达可以减缓血脂异常引起的动脉粥样硬化。因此抑制ANGPTL3的活性可以有效预防和/或治疗血脂异常，设计合适的小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)序列可以专一性的降低ANGPTL3的表达。siRNA通过装载入沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，与靶标基因的mRNA的靶核酸互补配对，使靶标基因的mRNA降解从而抑制靶标基因的表达。但是靶核酸存在种属间差异，增加了针对靶核酸的siRNA药物研发的困难，同时siRNA的稳定性较差，系统给药存在易被核酸酶降解的缺点。开发有效预防和/或治疗血脂异常的siRNA及其药物存在临床研究的必要性和商业化的现实性。
发明内容
本公开的目的是提供一种针对ANGPTL3基因的高效siRNA序列和其药物组合物，该药物组合物有效预防和/或治疗血脂异常。
为了实现上述目的，本公开第一方面提供了一种siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列，其中，
正义链5’-CCAAGAGCACCAAGAACUA-3’(SEQ ID NO.2)；
反义链5’-UAGUUCUUGGUGCUCUUGG-3’(SEQ ID NO.3)。
第二方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的siRNA和药学上可接受的载体；所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)，优选为1:(1-50)。
第三方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒含有如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物。
第四方面，本公开提供了如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗血脂异常的药物中的用途。
第五方面，本公开提供了一种预防和/或治疗血脂异常的方法，该方法包括将如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物给予有需要的患者。
第六方面，本公开提供了一种抑制肝细胞中ANGPTL3基因表达的方法，该方法包括将如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物导入所述肝细胞。
通过上述技术方案，本公开提供了一种有效预防和/或治疗血脂异常的全新手段，通过siRNA或者siRNA的药物组合物抑制ANGPTL3基因的表达引起了血液中胆固醇和甘油三酯含量的下降，有效预防和/或治疗血脂异常，具备临床研究的必要性和商业化的现实性。尤其是本公开提供的由有机胺、辅助脂质、聚乙二醇化脂质形成的药学上可接受的载体与本公开的siRNA形成的特定药物组合物，显著抑制了高脂模型小鼠ANGPTL3在肝脏组织中的表达，抑制率达到了90％以上；经本公开药物组合物治疗的高脂模型小鼠血清内的总胆固醇和甘油三酯含量比给药前显著下降，抑制率在30％-50％之间。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是siRNA在体外人血浆中的稳定性检测的电泳图。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
在本公开中，ANGPTL3是指mRNA序列如Genbank注册号NM_014495.3所示的基因。
第一方面，本公开提供了一种siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，其中，
正义链5’-CCAAGAGCACCAAGAACUA-3’(SEQ ID NO.2)；
反义链5’-UAGUUCUUGGUGCUCUUGG-3’(SEQ ID NO.3)。
按照本公开的一个实施方式，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的3’末端还连接有1至3个核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补配对后形成至少一个由1至3个核苷酸构成的3’突出端；优选地，所述3’突出端为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(即dTdT)或尿嘧啶核苷酸(即UU)；更优选地，正义链和反义链都含有3’突出端。
本公开siRNA的靶核酸如SEQ ID NO.1(CCAAGAGCACCAAGAACUA)所示，其中，所述siRNA的靶核酸是指ANGPTL3的mRNA(NM_014495.3)编码区中第658-676位，可以与SEQ IDNO.3所示的反义链相互杂交的片段。
根据本公开的第一方面，所述siRNA的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基，所述siRNA的磷酸-糖骨架中的核糖基中的至少一部分为具有修饰基团的核糖基。具有修饰基团的磷酸酯基和核糖基可以是具有上述作用的各种具有修饰基团的磷酸酯基和核糖基。优选情况下，具有修饰基团的核糖基为2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基或者为2’-羟基被氟取代而成的2’-氟代核糖基，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而成的硫代磷酸酯基。所述硫代磷酸酯基结构如式(1)所示：
Figure BDA0003249058010000051
根据本公开第一方面，本公开的发明人惊奇地发现，该siRNA的磷酸-糖骨架分别具有如下修饰基团时具有更好的使用效果：
所述siRNA的正义链核苷酸序列的第1、2、8、10、11、17和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链核苷酸序列的第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，第4、6、8、13、15和17位的糖基为2’-氟代核糖基；
或者，所述siRNA的正义链核苷酸序列的第1、2、8、11、14和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链核苷酸序列的第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，第7、8和17位的糖基为2’-氟代核糖基；
或者，所述siRNA的正义链核苷酸序列的第1、2、8、10、11、17和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链核苷酸序列的第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，第5、7、8、13、16和17位的糖基为2’-氟代核糖基；
或者，所述siRNA的正义链核苷酸序列的第1、2、8、10、11、17和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链核苷酸序列的第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，第5、8、11、15和17位的糖基为2’-氟代核糖基。
根据本公开的第一方面，优选地，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的3’末端还连接有2至3个核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补配对后形成至少一个由2至3个核苷酸构成的3’突出端；优选地，所述3’突出端为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(即dTdT)或尿嘧啶核苷酸(即UU)；更优选地，所述正义链和反义链都含有3’突出端，且该siRNA的正义链和/或反义链的核苷酸序列第20位和第21位之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
本领域技术人员清楚知晓的是，通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成)可以得到本公开所述的siRNA，其中，固相合成已经有商业化订制服务；本领域技术人员也清楚知晓，通过使用具有相应修饰的核苷酸单体可以将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，其中，制备具有相应修饰的核苷酸单体的方法是本领域技术人员所熟知的，市场上也有商业化的单体供应。
第二方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的siRNA和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如Fe3O4、Fe2O3)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。在本公开的药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，一般地，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，优选为1：(1-50)。
所述药物组合物还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述pH缓冲液可以为pH7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡糖糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为(200-700)mOsm/kg。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。优选地，所述药物组合物用于静脉注射给药。
根据本公开的第二方面，优选情况下，所述药学上可接受的载体优选为含胺的转染试剂，所述的含胺的转染试剂含有有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质；其中，所述有机胺可以选自CN201180060664.1中所述的含胺的转染化合物和/或其药学上可接受的盐。本公开的发明人意外发现，本公开提供的含有siRNA和所述含胺的转染试剂的特定的药物组合物，在进一步提高所述药物组合物的稳定性和对肝脏的靶向性的同时不影响siRNA本身的活性，具有良好的的临床应用前景。更优选地，所述有机胺为如式(2)所示的化合物和/或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003249058010000071
其中：
X1和X2各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C1-C20烃链；
Y和Z各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO2；
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R2是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R3和在式(2)中的氮形成如式(3)或式(4)所示的结构：
Figure BDA0003249058010000081
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N表示在式(2)中的氮原子。
在某些实施方式中，R3是多胺。在其它实施方式中，R3是缩酮。在某些实施方式中，在式(2)中的R1和R2中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在某些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，R3可以是下述式(5)-式(14)中的任一个：
Figure BDA0003249058010000091
其中，式(5)-式(14)中，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R3与在式(2)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(2)中的氮原子的连接。
其中，式(2)所示化合物可以根据CN201180060664.1中的描述制备。
根据本公开的第二方面，特别优选地，所述有机胺为如式(15)所示的有机胺和/或如式(16)所示的有机胺：
Figure BDA0003249058010000101
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
根据本公开的第二方面，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)。
优选地，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(50-70)：(20-40)：(3-20)。
由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
本公开提供的药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。本公开提供的siRNA与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备；优选地，本公开提供的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物可以根据CN201180060664.1中的描述方法制备；更优选地，可以按照如下方法制备：
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，优选为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，优选为乙醇。
将本公开提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中，得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，优选为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，优选为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL，优选为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，优选为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和siRNA水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，优选5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1：(2-5)，优选1:3。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；优选地，pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。
其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，优选使用切相流系统，中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，优选在0.22μm滤器上过滤除菌。
第三方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒含有如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物。
按照本公开提供的试剂盒，siRNA、药学上可接受的载体和/或辅料可以单独存在，以其中两种的混合物的形式存在，或者以最终药物组合物的形式存在。当药学上可接受的载体单独存在且所述载体为上述含胺转染试剂时，有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可以各自独立存在，也可以以其中两种或三种的混合物的形式存在。在一个实施方式中，可使一个容器用于提供siRNA、另外一个或多个容器用于提供有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质，任选地另外一个或多个容器提供辅料。
除了siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以外，所述试剂盒中还可包含实现本公开提供的药物组合物的一种或多种特定应用所必需或有益的组分，如(1)一种或多种用于实现所希望的细胞转染的组分，(2)一种或多种用于实现特定疾病或身体障碍的诊断、治疗或预防的组分，如一种或多种额外的治疗化合物或组合物、一种或多种诊断试剂，(3)一种或多种缓冲剂，(4)阳性或阴性对照样品，(5)赋形剂、稳定剂或防腐剂等。一般来说，所述组分存在于与siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料的容器均不同的容器中。此外，所述试剂盒还可包含用于将siRNA与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分进行混合的说明书。
在本公开提供的试剂盒中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。优选所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料基本上纯净和/或无菌。可任选地在本公开的试剂盒中提供无菌水、生理盐水、PBS中的一种或多种。
第四方面，本公开提供了如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗血脂异常的药物中的用途，其中，所述血脂异常包括但不限于高胆固醇血症、高甘油三酯血症、动脉粥样硬化。
第五方面，本公开提供了一种预防和/或治疗血脂异常的方法，该方法包括将如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物给予有需要的患者。
通过将本公开的siRNA和/或药物组合物给予有需要的患者，可以通过RNA干扰的机制达到预防和/或治疗血脂异常的目的。因此，本公开的siRNA和/或药物组合物可用于预防和/或治疗血脂异常，或用于制备用于预防和/或治疗血脂异常的药物。
本公开所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将siRNA或药物组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将siRNA或药物组合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多siRNA或药物组合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述siRNA或药物组合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗血脂异常的手段，优选能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的siRNA或药物组合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，可以用LD50/ED50的比值来表示。优选显示出高治疗指数的siRNA或药物组合物。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的药物组合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或30-45g的ob/ob小鼠，以所述药物组合物中的siRNA的量计：对于siRNA与药学上可接受的载体形成的药物组合物，其siRNA用量可以为0.001-50mg/kg体重，优选为0.01-10mg/kg体重，更优选为0.05-5mg/kg体重，最优选为0.1-3mg/kg体重；在给予本公开所述的siRNA时，可参考上述用量。
第六方面，本公开提供了一种抑制肝细胞中ANGPTL3基因表达的方法，该方法包括将如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物导入所述肝细胞，通过RNA干扰的机制达到抑制肝细胞中ANGPTL3基因表达的目的。在一个优选的实施方式中，所述细胞为Huh7细胞。
采用本公开提供的方法抑制ANGPTL3基因在细胞中表达，无论使用提供的siRNA还是药物组合物，siRNA用量一般是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处100pM至1μM、或1nM至100nM、或5nM至50nM或至约10nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
除非特别说明，本公开所用到的试剂、培养基等试验材料均为市售商品。
制备例1
siRNA的序列如表2所示，编号为siAN的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中1-19位核苷酸序列与人ANGPTL3 mRNA序列(NM_014495.3)中如SEQ ID NO.1所示的靶核酸相同；该siRNA的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中1-19位核苷酸序列与如表1中SEQ ID NO.1所示的靶核酸互补。编号为siAN2的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中1-19位核苷酸序列与ANGPTL3 mRNA序列中如SEQ ID NO.6所示的靶核酸相同；该siRNA的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中1-19位核苷酸序列与如表1中SEQ ID NO.6所示的靶核酸互补。
如表2所示本制备例还设置了正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的siRNA，编号为siNC。siNC为与ANGPTL3 mRNA无对应作用位点的无关序列，作为阴性对照。
siRNA的寡聚核苷酸单链按照本领域公知的方法进行化学合成，合成时在寡聚核苷酸单链的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT。siRNA互补的正义链和反义链退火形成双链，从而使得双链的两端分别具有dTdT的3’突出端。
表1
Figure BDA0003249058010000151
表2
Figure BDA0003249058010000161
本公开的siRNA在不同物种间具有高度的同源性，具体表现为siAN与人(NM_014495.3)、大鼠(NM_001025065.1)、恒河猴(NM_001086114.2)的靶序列(CCAAGAGCACCAAGAACUA)完全匹配，与小鼠(NM_013913.3)的靶序列(UCAAGAGCACCAAGAACUA，SEQ ID No.11)仅存在1个核苷酸错配。siAN2与siAN相似，与人、大鼠、恒河猴的靶序列完全匹配，与小鼠的靶序列(UAAAAGAAAUAGAAAAGCA，SEQ ID No.12)存在1个核苷酸错配。
实施例1
本实施例用于检测制备例1中得到的siRNA在体外对ANGPTL3 mRNA表达水平的抑制率。
将人类肝癌细胞株Huh7用含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基接种细胞于24孔板，接种密度为4×105细胞/孔，每孔0.5mL培养基，37℃培养过夜。
将24孔板中细胞培养液吸弃，每孔加入0.5mL Opti-MEM无血清培养基。分别将1.5μL浓度为20μM制备例1和制备例2中的siRNA用50μL Opti-MEM无血清培养基稀释；将1μLLipofectamineTM2000(Invitrogen公司)稀释于50μL Opti-MEM无血清培养基中，混匀后室温下孵育5分钟；混合稀释的siRNA和稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混匀，室温静置20分钟，以便允许复合物的形成。在接种有Huh7细胞的24孔板中按照每孔100μL加入上述最终混合溶液。siRNA的最终浓度约为50nM。细胞于37℃培养4小时，再向每孔中加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，继续在37℃培养过夜。
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别检测转染了siNC、siAN和siAN2的Huh7细胞中ANGPTL3 mRNA的表达量。具体步骤为：培养转染的细胞24小时后，使用RNAVzol(Vigorous公司，货号N002)提取细胞中的总RNA；分别取1μg总RNA按照反转录试剂盒(Promega公司，货号A3500)的使用方法反转录得到cDNA。使用2×Ultra SYBRMixture(with ROX)(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0956)试剂盒，以cDNA为模板按照说明书的步骤进行ANGPTL3 mRNA的表达量的检测。其中，用于扩增ANGPTL3和作为内参基因的β-actin的PCR引物如表3所示。
表3
Figure BDA0003249058010000171
siRNA对ANGPTL3 mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(实验组ANGPTL3 mRNA的表达量/实验组β-Actin mRNA的表达量)/(阴性对照组ANGPTL3 mRNA的表达量/阴性对照组β-Actin mRNA的表达量)]×100％。其中，各实验组为分别经制备例1中的siRNA处理的Huh7细胞；阴性对照组(记为Blank)为未经任何siRNA处理的Huh7细胞。结果如表4所示。
表4
Figure BDA0003249058010000172
Figure BDA0003249058010000181
从表4可以看出，本公开的siAN具有异常高的抑制活性(mRNA抑制率达84％)，而与之靶核酸位点相近的siAN2，却几乎没有活性(mRNA抑制率仅为10％)。可见，siAN能够高效抑制靶标ANGPTL3的表达。
制备例2
编号siNC的siRNA正义链和反义链经过化学修饰后得到的siRNA如表5所示，编号为siNC-M；编号siAN的siRNA正义链和反义链经过化学修饰后得到的4组siRNA如表5所示，分别编号为siAN-M1、siAN-M2、siAN-M3、siAN-M4。其中(M)代表其左侧的核苷酸残基中戊糖基团为2’-甲氧基核糖基，(F)代表其左侧的核苷酸残基中戊糖基团为2’-氟代核糖基；S代表其左右两侧的脱氧核糖核苷酸残基dTdT之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
表5
Figure BDA0003249058010000182
实施例2
本实施例用于检测制备例2中得到的siRNA在体外对ANGPTL3 mRNA表达水平的抑制率。实验方法同实施例1，检测结果如表6所示。
表6
siRNA mRNA抑制率(％)
Blank 0
siNC-M -10.8
siAN 82.0
siAN-M1 76.9
siAN-M2 80.8
siAN-M3 71.3
siAN-M4 59.3
从表6可以看出，经化学修饰的siRNA(siAN-M1、siAN-M2、siAN-M3和siAN-M4)与未修饰的siRNA(siAN)相比，其抑制活性相当或稍有降低，但是仍然可以高效抑制靶标ANGPTL3的表达。
实施例3
本实施例用于检测制备例1和制备2中得到的siRNA在体外人血浆中的稳定性。
取浓度为20μM的上述修饰和未修饰的siRNA各10μL分别与90μL 50％人类血浆(Human plasma，PBS稀释)混合后，在37℃下体外孵育0、2、4、6、8、24、48和72小时后得到处理样品。取处理样品10μL，并立即进行液氮速冻，冻存于-80℃备用。8个时间点取样完成后，用1×PBS(pH 7.4)稀释5倍，然后将各样品的每个时间点处理样品取10μL进行20％的PAGE凝胶电泳。配制20％的聚丙烯酰胺凝胶，将使用pH7.4的1×PBS稀释液稀释5倍的上述样品10μL与4μL上样缓冲液(20mM EDTA，36％甘油，0.06％溴酚蓝)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen公司，货号11494)染色15分钟后成相，观察。
图1显示siNC、siNC-M、siAN、siAN-M1、siAN-M2、siAN-M3、siAN-M4的核酸序列在血浆环境中的稳定性检测结果，其中，M为未经人血浆处理的等量的siRNA标记，siNC-M在人血浆环境中稳定存在作为阳性对照。结果显示，siAN加入人血浆后，主带(指与M所示的条带平行的带，代表全长序列)可以保留至8h；而经修饰的siAN-M1、siAN-M2、siAN-M3和siAN-M4，主带在血浆中稳定存在的时间能够延续至72h，大大地推迟了siRNA的降解时间，或不降解，表现出很高的血浆稳定性。
制备例3
本制备例用来制备本公开的siRNA药物组合物。
将三种干粉脂质化合物，即有机胺(如式(15)或式(16)所示，其制备方法参见CN201180060664.1中的化合物87或72)、胆固醇和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]按照59:29:12的摩尔比悬浮于乙醇中并混匀得到脂质乙醇溶液，其总质量浓度为8.85mg/mL。将siNC-M、siAN、siAN-M1、siAN-M2、siAN-M3和siAN-M4分别溶解于200mM醋酸钠(pH5.2)溶液中，使siRNA的浓度为0.2mg/mL得到siRNA醋酸钠水溶液。快速混合1体积脂质乙醇溶液和3体积的siRNA醋酸钠水溶液。混合后脂质体制剂的具体组成如表7所示。
表7
Figure BDA0003249058010000201
将混合后得到的脂质体制剂在50℃孵育10分钟，将孵育后的脂质体制剂使用
Figure BDA0003249058010000202
切相流系统，中空纤维住100KDa超滤，超滤交换溶液为pH7.4的PBS。超滤的同时将制剂的siRNA浓度浓缩或稀释到目标值。超滤后的制剂在0.22μm滤器上过滤除菌。
将由式(15)所示的有机胺、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的含胺的转染试剂称为RBP131；由式(16)所示的有机胺、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的含胺的转染试剂称为RBP130。所得药物组合物RBP131/siRNA或RBP130/siRNA在使用前储存在4℃，并检测相关理化性质，RBP131/siRNA和RBP130/siRNA的理化参数相似，检测结果见表8。
表8
检测指征 结果
pH 7.2-7.6
包封率(％) ≥90％
siRNA浓度(mg/mL) 0.10-0.15
粒径(nm) 60-100
多分散指数 ≤0.2
渗透压(mOsm/kg) 300-400
其中，包封率采用RiboGreen法检测，所用试剂(Quant-iTTM
Figure BDA0003249058010000211
RNAReagent and Kit)购于Thermo Fisher(Invitrogen)公司，货号R11490。根据说明书操作步骤检测样品中siRNA的荧光强度，再按照文献(J.Heyes et.al,Journal of ControlledRelease,107(2005):276–287)所述方法计算包封率：
包封率＝[(Triton处理组荧光强度-无Triton处理组荧光强度)/Triton处理组荧光强度]×100％
其他理化参数采用本领域技术人员熟知的常规技术手段检测。
实施例4
本实施例用于检测制备例3中的RBP131/siRNA药物组合物在正常C57模型小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)体内对肝脏组织中ANGPTL3表达水平的抑制率和对血清中总胆固醇、甘油三酯含量的影响。
(1)小鼠的给药方法
将6-8周龄正常C57模型小鼠随机分成5组，每组6只(雌雄各半)，分别使用1×PBS、RBP131/siAN药物组合物、RBP131/siAN-M1药物组合物、RBP131/siAN-M2药物组合物、RBP131/siAN-M3药物组合物处理5组小鼠。根据小鼠体重计算药量，尾静脉单次给药，siRNA给药剂量为1mg/kg，给药体积为10mL/kg。给药后48h将动物处死，采集全血及肝脏组织。
(2)小鼠肝脏组织ANGPTL3表达水平检测
将采集的肝脏组织放入RNAlater(Sigma Aldrich公司，货号R0901)中保存；使用组织匀浆仪匀浆肝脏组织，再用TRIzol(Thermo Fisher公司，货号15596026)根据说明书操作步骤提取得到总RNA。将总RNA反转录为cDNA，然后采用实时荧光定量PCR方法检测肝组织中ANGPTL3的表达水平；反转录与实时荧光定量PCR具体步骤参照实施例1，用于扩增ANGPTL3和作为内参基因的β-actin的PCR引物如表9所示。siRNA对ANGPTL3表达抑制率的计算参见实施例1。具体结果如表10所示。
表9
Figure BDA0003249058010000221
表10
组别 ANGPTL3表达抑制率(％)
1×PBS 0
RBP131/siAN 88.0
RBP131/siAN-M1 73.0
RBP131/siAN-M2 88.6
RBP131/siAN-M3 88.1
(3)小鼠血液中总胆固醇及甘油三酯含量检测
将采集的全血进行离心得到血清，进一步使用PM4000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇及甘油三酯的含量，检测结果表11所示。
表11
组别 总胆固醇(mmol/L) 甘油三酯水平(mmol/L)
1×PBS 2.34±0.12 0.91±0.05
RBP131/siAN 2.00±0.15 0.61±0.02
RBP131/siAN-M1 1.86±0.19 0.68±0.07
RBP131/siAN-M2 1.79±0.15 0.60±0.02
RBP131/siAN-M3 1.84±0.19 0.62±0.02
经1×PBS与RBP131/siAN药物组合物、RBP131/siAN-M1药物组合物、RBP131/siAN-M2药物组合物、RBP131/siAN-M3药物组合物比较可以看出，本公开所使用的药物组合物在正常小鼠体内对ANGPTL3的表达抑制率达到70％以上，最高可接近90％，并且通过抑制ANGPTL3的表达显著降低了血液中总胆固醇和甘油三酯的含量，对总胆固醇和甘油三酯的抑制率均在30％左右。
此外，采用相同的方法，对制备例3中得到的RBP130/siRNA药物组合物进行了测试，测试结果与RBP131/siRNA药物组合物类似。
实施例5
本实施例用于检测RBP131/siRNA药物组合物在高脂饲料诱导的C57模型小鼠体内对肝脏组织中ANGPTL3表达水平的抑制率和对血清中总胆固醇、甘油三酯含量的影响。
(1)小鼠的处理及给药方法
将普通饲料、猪油、胆固醇和胆盐按照82.8:15.0:2.0:0.2的重量比充分混合，配制成为高脂饲料(购于北京华阜康生物科技股份有限公司)，使用高脂饲料饲喂正常C57小鼠2个月后，检测血清中总胆固醇和甘油三酯的含量，若饲喂高脂饲料的造模小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯的含量显著高于饲喂普通饲料的正常C57小鼠(P≤0.05)，表明高脂模型小鼠诱导成功。
随机选取高脂模型小鼠2组，每组6只(雌雄各半)；同时随机挑选6只正常C57模型小鼠(雌雄各半)作对照，分组结果如下：(1)正常小鼠对照组(记为Normal)；(2)高脂模型小鼠PBS对照组(记为PBS)；(3)高脂模型小鼠RBP131/siAN-M1组(记为RBP131/siAN-M1)。所有动物根据体重计算药量，采用尾静脉注射方式进行给药，siRNA给药量为1mg/kg，给药体积为10mL/kg。每周给药一次，共4次给药，即第0天进行第1次给药，第7天进行第2次给药，第14天进行第3次给药，第21天进行第4次给药。分别于第1次给药前1天(记为-1天)，第2次给药前一天(第6天)、第3次给药前一天(第13天)和末次给药后24h(第22天)采集小鼠全血及肝脏组织。
(2)小鼠肝脏组织ANGPTL3表达水平检测
检测方法参见实施例4，结果如表12所示。
表12
组别 ANGPTL3表达抑制率
Normal 17％
PBS 0％
RBP131/siAN-M1 92％
(3)小鼠血液中总胆固醇及甘油三酯含量检测
检测方法参见实施例4，血清中总胆固醇(CHO)含量检测结果如表13所示，血清中甘油三酯(TG)含量如表14所示。
表13
组别 -1天(mg/dL) 6天(mg/dL) 13天(mg/dL) 22天(mg/dL)
Normal 116.4±7.2 107.3±3.0 104.5±6.6 110.0±4.2
PBS 165.3±7.4 161.0±11.9 158.9±9.5 163.6±12.4
RBP131/siAN-M1 175.2±6.9 137.4±5.3 127.5±4.3 147.2±7.1
表14
组别 -1天(mg/dL) 6天(mg/dL) 13天(mg/dL) 22天(mg/dL)
Normal 98.8±8.4 97.4±3.7 88.6±4.5 76.8±3.9
PBS 81.2±3.7 82.7±3.4 89.6±2.4 86.0±4.4
RBP131/siAN-M1 86.2±2.0 50.0±3.1 52.7±2.3 54.3±4.1
经Normal组、PBS组合与RBP131/siAN-M1组比较可以看出，RBP131/siAN-M1药物组合物显著抑制了ANGPTL3在肝脏组织中的表达，抑制率高达92％；同时对三组小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯的含量进行了监测，结果显示在给药4次后，经RBP131/siAN-M1药物组合物治疗的高脂模型小鼠血清内的总胆固醇和甘油三酯含量比给药前显著下降，对总胆固醇的抑制率在30％左右，对甘油三酯的抑制率在40％左右。药物组合物RBP131/siAN-M1在动物体内可以发挥很好的生物活性，具有极大的临床应用的潜能。
实施例6
本实施例用于检测RBP131/siRNA药物组合物在ob/ob模型小鼠体内对肝脏组织中ANGPTL3表达水平的抑制率和对血清中总胆固醇、甘油三酯含量的影响。
(1)小鼠的给药方法
将6-8周龄ob/ob小鼠(购于常州卡文斯实验动物有限公司)随机分成7组，每组6只，分组如下：(1)PBS对照组；(2)RBP131/siNC-M 1mg/kg组；(3)RBP131/siAN-M1 1mg/kg组；(4)RBP131/siAN-M1 0.5mg/kg组；(5)RBP131/siAN-M2 1mg/kg组；(6)RBP131/siAN-M20.5mg/kg组；(7)RBP131/siAN-M3 1mg/kg组。所有动物根据体重计算药量，采用尾静脉注射方式进行给药，给药体积为10mL/kg。每周给药一次，共4次给药，即第0天进行第一次给药，第7天进行第二次给药，第14天进行第三次给药，第21天进行第四次给药；分别于第1次给药前1天(记为-1天)，第2次给药前一天(第6天)、第3次给药前一天(第13天)、末次给药前一天(第20天)和末次给药后48h(第23天)采集小鼠全血及肝脏组织。
(2)小鼠肝脏组织ANGPTL3表达水平检测
检测方法参见实施例4，结果如表15所示。
表15
组别 mRNA抑制率(％)
PBS 0
siNC-M(1mg/kg) 2.2
siAN-M1(1mg/kg) 90.4
siAN-M1(0.5mg/kg) 66.7
siAN-M2(1mg/kg) 97.8
siAN-M2(0.5mg/kg) 84.4
siAN-M3(1mg/kg) 91.1
(3)小鼠血液中总胆固醇及甘油三酯含量检测
检测方法参见实施例4，血清中总胆固醇(CHO)含量检测结果如表16所示，血清中甘油三酯(TG)含量如表17所示。
表16
Figure BDA0003249058010000261
表17
Figure BDA0003249058010000262
从上述结果比较可以看出，不同剂量下的RBP131/siAN-M1组、RBP131/siAN-M2组、RBP131/siAN-M3组均能显著抑制小鼠肝脏组织中ANGPTL3的表达；0.5mg/kg的本公开RBP131/siRNA药物组合物对ANGPTL3基因表达的抑制率不低于66.7％、1mg/kg的本公开RBP131/siRNA药物组合物对ANGPTL3基因表达的抑制率不低于90.4％；同时对三组小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯的含量进行了监测，结果显示经本公开RBP131/siRNA药物组合物治疗后的小鼠血清中的总胆固醇和甘油三酯的含量明显下降，最优的，对总胆固醇的抑制率在40％左右，对甘油三酯的抑制率在50％左右。
本公开提供的siRNA是一种有效预防和/或治疗血脂异常的全新手段，通过抑制ANGPTL3基因的表达引起了血液中总胆固醇和甘油三酯含量的下降，有效预防和/或治疗血脂异常；另外本公开提供的RBP131/siRNA或RBP130/siRNA药物组合物靶向肝脏，可有效降低肝脏中ANGPTL3基因的表达，预防和/或治疗血脂异常，本公开的药物组合物具备临床研究的必要性和商业化的现实性。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 苏州瑞博生物技术股份有限公司
<120> 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
<130> 4968-D-RIBO
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 2
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 3
uaguucuugg ugcucuugg 19
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 4
ccaagagcac caagaacuan n 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 5
uaguucuugg ugcucuuggn n 21
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
uaaaagaaau agaaaauca 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 7
uaaaagaaau agaaaaucan n 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 8
ugauuuucua uuucuuuuan n 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 9
uucuccgaac gugucacgun n 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 10
acgugacacg uucggagaan n 21
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 11
ucaagagcac caagaacua 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 12
uaaaagaaau agaaaagca 19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 13
accaactata cgctacat 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 14
cctcctgaat aaccctct 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 15
ccaaccgcga gaagatga 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 16
ccagaggcgt acagggatag 20
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 17
uucuccgaac gugucacgun n 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 18
acgugacacg uucggagaan n 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 19
ccaagagcac caagaacuan n 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 20
uaguucuugg ugcucuuggn n 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 21
ccaagagcac caagaacuan n 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 22
uaguucuugg ugcucuuggn n 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 23
ccaagagcac caagaacuan n 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 24
uaguucuugg ugcucuuggn n 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 25
ccaagagcac caagaacuan n 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 26
uaguucuugg ugcucuuggn n 21
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 27
gaggagcagc taaccaactt aat 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 28
tctgcatgtg ctgttgactt aat 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 29
tcagggagta atggttggaa t 21
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 30
ggtctcaaac ataatctggg tca 23

Claims (13)

1.一种siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，
其中，
正义链5’-CCAAGAGCACCAAGAACUA-3’(SEQ ID NO.2)；
反义链5’-UAGUUCUUGGUGCUCUUGG-3’(SEQ ID NO.3)。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的3’末端还连接有1至3个核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补配对后形成至少一个由1至3个核苷酸构成的3’突出端；优选地，所述3’突出端为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸或尿嘧啶核苷酸；更优选地，正义链和反义链都含有3’突出端。
3.根据权利要求1或2所述的siRNA，其中，所述siRNA的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基，所述siRNA的磷酸-糖骨架中的核糖基中的至少一部分为具有修饰基团的核糖基。
4.根据权利要求3所述的siRNA，其中，所述具有修饰基团的核糖基选自2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基和/或2’-羟基被氟取代而成的2’-氟代核糖基；所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而成的硫代磷酸酯基；所述硫代磷酸酯基结构如式(1)所示：
Figure FDA0003249056000000011
5.根据权利要求4所述的siRNA，其中，该siRNA的磷酸-糖骨架分别具有如下修饰基团：
所述siRNA的正义链核苷酸序列的第1、2、8、10、11、17和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链核苷酸序列的第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，第4、6、8、13、15和17位的糖基为2’-氟代核糖基；
或者，
所述siRNA的正义链核苷酸序列的第1、2、8、11、14和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链核苷酸序列的第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，第7、8和17位的糖基为2’-氟代核糖基；
或者，
所述siRNA的正义链核苷酸序列的第1、2、8、10、11、17和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链核苷酸序列的第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，第5、7、8、13、16和17位的糖基为2’-氟代核糖基；
或者，
所述siRNA的正义链核苷酸序列的第1、2、8、10、11、17和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链核苷酸序列的第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，第5、8、11、15和17位的糖基为2’-氟代核糖基。
6.根据权利要求5所述的siRNA，其中，所述siRNA的正义链和/或反义链的核苷酸序列第20位和第21位之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
7.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-6中任意一项所述的siRNA和药学上可接受的载体；所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1：(1-500)；优选地，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为为1：(1-50)。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体含有有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质；其中，所述有机胺为如式(2)所示的化合物和/或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003249056000000031
其中：
X1和X2各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C1-C20烃链；
Y和Z各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO2；
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R2是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R3和在式(2)中的氮形成如式(3)或式(4)所示的结构：
Figure FDA0003249056000000041
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N表示在式(2)中的氮原子。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述有机胺为如式(15)所示的有机胺和/或如式(16)所示的有机胺：
Figure FDA0003249056000000042
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)；优选地，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(50-70)：(20-40)：(3-20)。
11.权利要求1-6中任意一项所述的siRNA和/或权利要求7-10中任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗血脂异常的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
13.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1-6中任意一项所述的siRNA和/或权利要求7-10中任意一项所述的药物组合物。
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CN106146591A (zh) * 2010-01-08 2016-11-23 Isis制药公司 血管生成素样3表达的调节

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