CN108431224B

CN108431224B - 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途

Info

Publication number: CN108431224B
Application number: CN201680046055.3A
Authority: CN
Inventors: 张鸿雁; 高山; 黄渊余
Original assignee: SHENZHEN RIBO BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Suzhou Ruibo Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2036-08-31
Also published as: CN108431224A; WO2017036398A1

Abstract

提供一种抑制RRM2基因表达的siRNA，该siRNA的正义链碱基序列如SEQ ID NO：2所示，反义链碱基序列如SEQ ID NO：3所示，其磷酸‑糖骨架还可具有修饰基团；包含所述siRNA的药物组合物，可以抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤组织生长。

Description

一种小干扰核酸和药物组合物及其用途

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地，涉及一种siRNA(小干扰核酸)、该siRNA的RNA干扰靶核酸、一种药物组合物以及它们的用途。

背景技术

肿瘤目前主要治疗手段仍然是手术、放疗和化疗。虽然目前的治疗方法较以往提高患者的生存率，但仍存在着盲目性，针对性不强。新的化疗药物的不断问世，耐药性成了一个不可忽视的重要问题。以胰腺癌为例，目前，胰腺癌治疗的首选是手术切除，但仅有15-20％的患者确诊时可行手术治疗，胰腺癌患者5年生存率低于5％。胰腺癌对于放疗和化疗均不甚敏感，多数药物客观有效率低于10％。吉西他滨是目前标准胰腺癌化疗的一线治疗药物，但其对于改善患者生存期和生活质量的疗效有限。在进展期的胰腺癌患者，吉西他滨的客观有效率仅12％左右，生存期仅仅轻度延长。总体上说，目前胰腺癌患者仍缺乏有效的治疗手段。

近年来研究表明，细胞信号传导中相关因子的表达异常，肿瘤细胞DNA的合成和修复及其他相关基因的表达异常与耐药的产生存在密切关系。其中，核糖核苷酸还原酶是生物体内唯一的催化四种核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶。该酶是DNA合成和修复的关键酶和限速酶，对细胞的增殖和分化起着调控作用。核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide Reductase，RR)由大亚基M1和小亚基M2组成，两者均为二聚体结构，通常称为RRM1和RRM2。RRM1具有与底物及变构效应物结合的部位，且含有直接供给电子的硫基，控制着底物的特异性及酶活性的开关是肿瘤抑制基因，也是吉西他滨(Gemcitabine)的分子靶点。RRM2是一种铁硫蛋白，它通过络氨酸残基的苯环形成特异的自由基而参加催化反应，既是负责底物转化的催化区，又携带接触抑制区。RRM2是一个同源二聚体，形成两个相同的二价铁中心，稳定一个络氨酰自由基，这些对催化过程中触发电子运输非常重要。而且，目前已经发现RRM2在肿瘤中具有高表达；虽然有文献(CN200680018408.5)报道了含有RRM2的siRNA药物组合物可以用于治疗肝癌，但是，其siRNA体内活性不高；同时由于给药载体的自身缺陷，只能瘤内局部给药，2个siRNA组成的cocktail用药量还在2.5mg/kg，且给药频率高，为每日一次，连续给药3次。这种肝内动脉施用法，施用频率高，给药量大，难以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对RRM2基因的高效siRNA序列，并提供包含有该siRNA序列的药物组合物，该药物组合物可以有效抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤组织生长。本发明与现有技术相比，提供了全新高效的siRNA及其药物组合物，通过系统给药，降低了给药剂量，并延长了给药间隔，具备临床研究及商业化开发的现实性。

第一方面，本发明提供了一种siRNA，其中，该siRNA的正义链碱基序列如SEQ IDNO：2所示，且该siRNA的反义链碱基序列如SEQ ID NO：3所示；且所述siRNA的磷酸-糖骨架分别具有或不具有修饰基团。

第二方面，本发明还提供了一种RNA干扰靶核酸，其中，该RNA干扰靶核酸如SEQ IDNO：4所示。

第三方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的siRNA和药学上可接受的载体，其中，所述药学上可接受的载体含有有机胺、胆固醇和聚乙二醇化磷脂；其中，所述有机胺为如式(1)所示的化合物和/或它的药学上可接受的盐：

其中：R₁和R₂各自独立地为C₁₀-C₂₀的直链烷基；n为1-6的整数；R₃、R₄、R₅和R₆各自独立地为氢或Rx；且R₃、R₄、R₅和R₆中至少一个为Rx；

Rx为Ry为碳链数为C₁₂-C₂₀的直链烷基。

第四方面，本发明提供了如上所述的siRNA和/或如上所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

第五方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括将如上所述的siRNA和/或如上所述的药物组合物给予有需要的患者。

第六方面，本发明提供了一种抑制细胞中RRM2基因表达的方法，该方法包括将如上所述的siRNA和/或如上所述的药物组合物导入所述细胞。

通过上述技术方案，本发明提供了一种对癌症的新的有效治疗手段，该手段可以通过系统给药，降低给药量，拉长给药间隔。具体地，本发明的siRNA通过静脉给药，在给药量为1mg/kg，给药间隔为每周2次的情形下，在体内能取得高达82％的肿瘤抑制率，显著优于文献中瘤旁给药、3天内连续给药3次，每天每次给药2.5mg/kg的治疗方案；同时，采取文献中的siRNA，经过与本发明相似的修饰手段得到的修饰后siRNA，在相同的给药方式下，68％的肿瘤抑制率也远不及本发明的siRNA取得的85％的抑制效率。

此外，由有机胺、辅助脂质、聚乙二醇化磷脂形成的药学上可接受的载体与本发明的siRNA形成的特定药物组合物，与其它常规载体与本发明的siRNA形成的药物组合物相比，具有极高的生物活性，其mRNA抑制效率是其它常规载体形成的药物组合物的2-20倍。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是显示siRRM2-M和无关siRNA(siNC)对PANC-1细胞集落成集的抑制作用的结果图。

图2是显示阿霉素与RBP131载体递送的siRRM2-M联用对胰腺癌肿瘤组织生长的抑制作用的肿瘤体积结果图。

图3是显示阿霉素与RBP131载体递送的siRRM2-M联用对胰腺癌肿瘤组织生长的抑制作用的肿瘤重量结果图。

图4是显示阿霉素与RBP131载体递送的siRRM2-M联用对胰腺癌肿瘤组织生长的抑制作用的肿瘤块照片结果图。

图5是显示RBP131载体递送的siRRM2-M对肝癌肿瘤组织生长的抑制作用的肿瘤重量结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明中，RRM2是指cDNA序列如Genebank注册号:NM_001034.3所示的基因，其RNA序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，本发明的siRNA含有磷酸-糖骨架和碱基。本发明的siRNA含有修饰基团，所述修饰基团不会导致所述siRNA抑制RRM2基因表达的功能明显削弱或丧失。目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，具体可如文献(Watts,J.K.,G.F.Deleavey,andM.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008.13(19-20):p.842-55)所记载。在本发明所述siRNA的一些实施方式中，所述修饰基团为任选取代的糖基及任选的取代的酯基，但不限于此。

其中，优选地，该siRNA的磷酸-糖骨架分别具有如下修饰基团：正义链第1、6、14、16和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基；反义链第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，反义链第3位的糖基为2’-氟代核糖基。

其中，2’-甲氧基核糖基指核糖基的2’-OH被甲氧基取代后形成的基团；2’-氟代核糖基指核糖基的2’-OH被氟取代后形成的基团。在核糖基团的2’-羟基位置引入例如甲氧基或氟后，可使血清中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。

其中，优选地，该siRNA的正义链和/或反义链的第20位和第21位之间的酯基为硫代磷酸酯基。

其中，硫代磷酸酯基是指磷酸二酯基中的一个氧原子被硫原子取代后形成的基团，具体如式(5)所示：

第二方面，本发明还提供了一种RNA干扰靶核酸，其中，该RNA干扰靶核酸如SEQ IDNO：4所示。其中，所述RNA干扰靶核酸是指RRM2 mRNA中，与如SEQ ID NO：3所示的反义链中第1至19位的核酸相互杂交的片段。

第三方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的siRNA和药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如Fe₃O₄、Fe₂O₃)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物等。在本发明的药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，一般地，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，优选为1:(1-50)。

在本发明的药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述pH值缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡糖糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。

根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。优选地，所述药物组合物用于静脉注射给药。

在本发明的药物组合物的一个优选实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一个更优选的实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化磷脂。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化磷脂可分别选自于CN201180060664.1(通过引用将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化磷脂中的一种或多种。

根据本发明的药物组合物一种优选的实施方式，其中，所述药学上可接受的载体含有有机胺、胆固醇和聚乙二醇化磷脂；其中，所述有机胺为如式(1)所示的化合物和/或它的药学上可接受的盐：

Rx为

Ry为碳链数为C₁₂-C₂₀的直链烷基。

特别优选地，所述有机胺为如式(2)所示的有机胺和/或如式(3)所示的有机胺：

所述聚乙二醇化磷脂为1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。

其中，所述药物组合物中，所述有机胺、胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂三者之间的摩尔比可以为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)。

其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，所述药物组合物中，所述有机胺、胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂三者之间的摩尔比为(50-70)：(20-40)：(3-20)。

由本发明的siRNA与上述载体形成的脂质体颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。

在脂质体制剂形式的药物组合物中，本发明的siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本发明的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。

根据本发明特别优选的一种实施方式，其中，所述药物组合物还包括至少一种额外的抗癌化疗剂，该化疗剂与核酸以附加或协同的方式抑制癌细胞。核酸与化疗剂可预先制备为组合制剂，或可以独立地制备并选择适当的时间与剂量施用，以达到组合的效果。优选的，所述抗癌化疗剂为阿霉素。在该优选实施方式中，本发明的siRNA和阿霉素能够发挥优异的增效效果。其中，阿霉素可以独立存放。其中，siRNA可以与阿霉素混合后同时给药，siRNA也可以与阿霉素分别先后给药。

其中，所述癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑瘤、乳腺癌、肾上腺瘤、甲状腺癌、胰腺癌、垂体癌、宫颈癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌例、胆囊癌、肺癌、睾丸癌、前列腺癌、头颈癌(包括口腔癌等)、皮肤癌、肾癌。优选地，如上所述的siRNA和/或如上所述的药物组合物特别适合用于肝癌和/或胰腺癌的治疗。

适于本发明方法的给药途径包括局部给药和全身给药。可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。

适于本发明方法的给药剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。

其中，所述细胞包括但不限于人肝癌细胞系HepG2、人宫颈癌细胞系Hela、人胰腺癌细胞系PANC-1、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。

以下，结合实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基等实验材料均为市售商品。

制备例1

siRNA的序列如表1所示，该siRNA的一条单链具有由SEQ ID NO:2表示的序列，与RRM2的mRNA序列中相应的RNA干扰靶核酸(如SEQ ID NO:4所示)相同，另一条单链具有由SEQ ID NO:3表示的序列，与RRM2的mRNA序列中相应的RNA干扰靶核酸互补。

siRNA的寡聚核苷酸单链按照本领域公知的方法进行化学合成。合成时，在寡聚核苷酸单链的3′末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT。互补的寡聚核苷酸单链退火形成双链，双链的两端分别具有dTdT的3′突出端。合成的寡聚核苷酸的序列见表1。

表1

实施例1

本实施例用来检测siRNA在体外对RRM2 mRNA表达水平的抑制效率。

将人类肝癌细胞株HepG2用含10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM完全培养基接种于24孔板，细胞密度为4×10⁵/孔，每孔0.5mL，37℃培养过夜。

转染的具体操作步骤如下：将100ng制备例1中的siRNA稀释于50μL DEME无血清培养基中，同时将1μL Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen公司)稀释于50μL DEME无血清培养基中，将上述两种溶液在室温下孵育5分钟后混合。混合溶液于室温静置20分钟后，把100μL的上述混合溶液加到接种有PANC-1细胞的24孔板中。siRNA的最终浓度约为10nM。细胞于37℃培养4小时，再加入1mL含10％胎牛血清、2mM的L-谷胺酰胺、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM完全培养基，然后在37℃再培养24小时。

通过荧光定量实时PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别检测转染了siNC、siPC1、siPC2、siRRM2的HepG2细胞中RRM2 mRNA的表达量。具体步骤如下：培养转染的细胞24小时后，用RNeasy mini Kit(Qiagen公司，货号74106)提取细胞中的总RNA。用紫外分光光度计测定提取的RNA样品的OD280和OD260的吸光度，并利用公式：RNA浓度(μg/μL)＝0.04×OD260×稀释倍数，计算RNA样品的浓度。然后用PrimeScript^TM II 1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara公司，货号6210A)合成cDNA，每个样品使用2μg总RNA。在合成cDNA后，按照

Premix Ex Taq^TM II(Takara公司，货号DRR081A)试剂盒的说明书，进行荧光定量实时PCR反应。其中，用于扩增RRM2和作为定量PCR反应的内参的β-actin的PCR引物如表2所示。

表2

siRNA对RRM2 mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(实验孔RRM2mRNA的表达量/实验孔β-Actin mRNA的表达量)/(阴性对照孔RRM2 mRNA的表达量/阴性对照孔β-Actin mRNA的表达量)]×100％。结果如表3所示。

表3

siRNA	mRNA抑制率(％)
		siNC	0
siPC1	65.7
		siPC2	82.4
siRRM2	91.3

从表1可以看出，本发明siRNA的活性显著高于文献(CN200680018408.5)已公开的序列，可以更加高效地抑制靶基因RRM2的表达。

制备例2

合成表4中所列的寡聚核苷酸。表4中的寡聚核苷酸包含修饰的核苷酸残基，互补的寡聚核苷酸链退火形成修饰的siRNA，分别记为siRRM2-M、siPC1-M和siPC2-M。其中，(OMe)代表它左边的核苷酸残基中戊糖基团为2’-甲氧基核糖基，(F)代表它左边的核苷酸残基中戊糖基团为2’-氟代核糖基；(S)代表它两边的脱氧核糖核苷酸dTdT之间的酯基为硫代磷酸酯基。这些siRNA未加修饰前的核苷酸序列分别对应于制备例1中的siRRM2、siPC1和siPC2。

表4

实施例2

本实施例用来检测化学修饰对siRNA血清稳定性的影响。

对制备例2中得到的siRRM2-M、siPC1-M和siPC2-M，以及制备例1中得到的siRRM2、siPC1和siPC2测定其在血清环境中的稳定性。具体步骤如下。

将10μL上述修饰和未修饰的siRNA(20μM)分别与90μL 50％人血浆(Humanplasma，HP，PBS稀释)混合后，在37℃下体外孵育0、2、4、8、24、48和72小时后得到处理样品。处理样品取样10μL，随即进行液氮速冻，冻存于-80℃备用。配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将10μL 5倍稀释的上述样品(稀释液1×PBS，pH 7.4)与4μl上样缓冲液(20mMEDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen公司，货号11494)染色15分钟后成相，通过定量读取电泳主条带(最长片段)的灰度值，计算siRNA降解率。具体的，将0小时的样品作为对照，以处理样品的电泳主条带的灰度值与对照样品的电泳主条带的灰度值的比值计算降解率：72小时降解率＝[1-(72小时的电泳主条带灰度/0小时的电泳主条带灰度)]×100％。结果如表5所示。

表5

由表5可以看出，在人血清环境中，修饰的siRNA的稳定性相比未修饰的siRNA明显增强。

实施例3

本实施例用来检测化学修饰前后siRNA在体外对RRM2 mRNA表达水平的抑制效率。

按照与实施例1相同的方法，对制备例2中得到的siRRM2-M、siPC1-M和siPC2-M，以及制备例1中得到的siRRM2、siPC1和siPC2分别测定其对RRM2mRNA表达水平的抑制效率。转染和荧光定量实时PCR的具体步骤如同实施例1中所述。转染时，对于上述各siRNA采用梯度剂量进行转染，使其终浓度分别为0.5nM、1nM和10nM。作为阴性对照，采用与实施例1中相同的siRNA(siNC)。siRNA对RRM2 mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(实验孔RRM2 mRNA的表达量/实验孔β-Actin mRNA的表达量)/(阴性对照孔RRM2 mRNA的表达量/阴性对照孔β-Actin mRNA的表达量)]×100％。结果如表6所示。

表6

由表6可知，siRRM2-M相对于siPC1-M和siPC2-M具有更强的抑制效率，采用1nM和10nM剂量时，siRRM2-M对于RRM2 mRNA表达量具有与siRRM2类似的抑制效果。在0.5nM剂量时，siRRM2-M相比对应的siRRM2具有更为优异的抑制效果(46％vs.0％)。这或许是由于修饰增强了siRNA的稳定性，并由此增长了siRNA在细胞内的存留时间，从而提高了siRNA的活性抑制。

实施例4

本实施例用来检测修饰后的siRNA对于肝癌肿瘤细胞生长的抑制作用，具体地使用MTT检测siRRM2-M对HepG2细胞的生长抑制作用。

取HepG2细胞5×10³/mL,100μL/孔接种于96孔微量培养板内，培养24小时后，转染制备例2中得到的siRRM2-M、siPC1-M和siPC2-M，每种siRNA的终浓度依次各自为50nM、100nM和200nM。另设无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48小时后，加入MTT(Sigma公司，货号M5655)20μL/孔(用生理盐水配制，5mg/mL)；在培养箱孵育4小时后，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，将细胞培养板在微孔振荡器上震荡5分钟后，用酶标仪测定570nm处的吸光值。试验中每个浓度重复6孔，每次实验至少重复3次。按照下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：肿瘤抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％。细胞活性用上述MTT法评价，siRRM2-M的IC₅₀为65.0nmol/L，siPC1-M的IC₅₀为143.7nmol/L，siPC2-M的IC₅₀为129.2nmol/L。可见，本发明提供的siRRM2-M相对于siPC1-M和siPC2-M具有显著抑制肝癌细胞生长的效果。平行地，在胰腺癌细胞系PANC-1上的实验结果类似(结果未显示)。

实施例5

本实施例用来检测修饰后siRNA对胰腺癌肿瘤细胞周期的阻滞作用，具体地使用流式细胞术检测siRRM2-M对PANC-1细胞周期的阻滞作用。

转染前24小时，在6孔板中以每孔2×10⁵个细胞的密度铺板，培养基为含10％FBS、1％青霉素/链霉素的完全培养基DMEM，培养于37℃的含5％CO₂的细胞培养箱中。使用Lipofectamine 2000转染siRNA，使siNC终浓度为50nM，siRRM2-M终浓度为25nM和50nM；4小时后，补加2mL含10％FBS的DMEM培养基。转染后72小时，收集细胞以1000rpm/min，离心5min，弃去上清；用预冷的PBS洗涤一次，1000rpm/min，离心5min，弃去上清；再用500μL预冷PBS吹打均匀，每个样品再加3mL 70％预冷乙醇固定细胞，轻轻吹打几次，-20℃冻存3小时。2000rpm/min，离心5min，留少量的液体弹匀后，加入5mL含1％FBS的PBS，洗涤细胞一次，2000rpm/min，离心5min。每个样品加入200μL PBS吹打均匀，加入6μL 20mg/mL的RNase，37℃消化30min。在悬液里加入20μL 500μg/mL的荧光染料PI(碘化丙啶，Propidium Iodide，购自Sigma，货号P4170)，避光孵育30min。2000rpm/min，5min离心，去上清，每样品加600mLPBS吹打均匀。转移至流式管中，使用流式细胞仪(购自BD公司，型号FACSCalibur^TM/Calibur)进行DNA含量检测与细胞周期分析，得到DNA含量的分布直方图，计算S期细胞所占比例，结果如表7所示。

表7

siRNA	S期细胞比例(％)
		无处理组	24.74
siNC(50nM)	27.99
		siRRM2-M(25nM)	57.42
siRRM2-M(50nM)	63.46

结果显示，与siNC处理的细胞相比，用siRRM2-M在25nM、50nM转染浓度下处理细胞后，可显著将细胞捕获在S期，抑制细胞增殖。平行地，在肝癌细胞系HepG2上的实验结果类似(结果未显示)。

实施例6

本实施例用来检测修饰后siRNA对胰腺癌肿瘤细胞集落成集的抑制作用。

取指数生长期细胞，按传代培养法收集细胞。用10mL的10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM重悬细胞，进行细胞计数。用6孔板铺板，每孔细胞数分别为300个。铺板后24小时，用Lipofectamine 2000转染siRRM2-M与无关siRNA对照(siNC)，转染浓度为50nM，每个siRNA做3个复孔。转染后72h，用新鲜培养液(10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM)换液。换液后继续培养10天，每三天换一次新鲜培养液。培养10天，采用结晶紫染色法染色：先除去培养基，用PBS洗1-2次，加入0.1％的结晶紫染液(用20％乙醇配结晶紫染液)，染色10分钟，着色足够时弃去培养液，用PBS洗2-3次，待稍干后进行克隆计数、拍照。细胞数≥30时，为一个集落。

图1显示siRRM2-M对PANC-1细胞集落成集的抑制作用。结果显示，相比于无关siRNA(siNC)处理的细胞，用siRRM2-M处理的细胞的集落生成数显著减少，证明抑制RRM2的表达后可以抑制PANC-1细胞的生长。平行地，在肝癌细胞系HepG2上的实验结果类似(结果未显示)。

制备例3

本制备例用来制备siRNA药物组合物RBP131/siRNA及RBP130/siRNA。

将三种干粉脂质化合物(即，有机胺(如式(2)或式(3)所示的物质，其制备方法参见CN201180060664.1中的化合物87或72)、胆固醇、聚乙二醇化脂质(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]))以59:29:12的摩尔比悬浮于乙醇中并混合，三种脂质化合物的总质量浓度约为8.85mg/ml。将待测siRNA(制备例1中的siNC、siRRM2和制备例2中的siRRM2-M、siPC1-M、siPC2-M)溶解于200mM醋酸钠(pH 5.2)溶液中，使siRNA的浓度为0.2mg/ml。以1:3的体积比，快速混合所得到的脂质乙醇溶液和siRNA醋酸钠水溶液。在表8中描述了混合后得到的脂质体制剂的具体组成。

表8脂质体制剂的组成

将混合后得到的脂质体制剂(即，有机胺、胆固醇、聚乙二醇化脂质与siRNA的组合物)在约50℃孵育10分钟。孵育后，使用

切相流系统，中空纤维柱100KDa超滤，超滤交换溶液为pH 7.4的PBS。超滤的同时可以将制剂浓缩或稀释到期望的siRNA浓度。超滤后的制剂在0.22μm滤器上过滤除菌。将由式(2)所示的有机胺、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的脂质混合物称为RBP131，由式(3)所示的有机胺、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的脂质混合物称为RBP130。所得RBP131/siRNA或RBP130/siRNA脂质体制剂在使用前储存在4℃，并检测相关理化性质，RBP131/siRNA和RBP130/siRNA脂质体制剂的理化参数相似，检测结果见表9。

表9 RBP131/siRNA和RBP130/siRNA脂质体制剂的理化参数

检测指征	参数范围
		pH	7.2-7.6
包封率(％)	>90％
		siRNA浓度(mg/ml)	0.10-0.15
粒径(nm)	60-100
		PDI	<0.20
渗透压(mOsm/kg)	300-400

实施例7

本实施例用来检测修饰后siRNA与广谱抗癌药物阿霉素联合使用，对抑制胰腺癌肿瘤组织生长的协同作用。

(1)siRNA药物组合物的制备。

按照制备例3所述的方法，制备药物组合物RBP131/siNC和RBP131/siRRM2-M。

(2)裸鼠皮下胰腺癌模型的制备。

用BLAB/c裸鼠(购于维通利华)，皮下接种胰腺癌细胞：取培养好的PANC-1细胞，用无菌PBS稀释成5×10⁶细胞/100μL，接种于BALB/c小鼠右腋皮下，细胞接种量为100μL/只。测量瘤体大小：皮下接种约2～3天后，观察皮下实体瘤形成情况，待实体瘤长到平均50mm³后备用(检测肿瘤体积的计算方法V＝0.5×a×b×b，其中a为长度，b为宽度)。

(3)siRNA药物组合物与阿霉素联合给药的方法及检测。

动物被随机分到5组，每组8只小鼠。这5组动物做如下处理：(1)1×PBS组；(2)阿霉素(ADM，购于克拉玛尔klamar公司，货号25316-40-9)单用组，剂量为1mg/kg；(3)阿霉素与无关siRNA(siNC)联用组，其中阿霉素剂量为1mg/kg，siNC剂量为5μg/只；(4)阿霉素与siRRM2-M联用组，其中阿霉素剂量为1mg/kg，siRRM2-M剂量为2μg/只；(5)阿霉素与siRRM2-M联用组，其中阿霉素剂量为1mg/kg，siRRM2-M剂量为5μg/只。阿霉素采用腹腔注射给药，一周给三次药物；siRNA均是RBP131包裹的制剂(即RBP131/siNC和RBP131/siRRM2-M)，采用瘤旁注射给药，注射体积为30μL，一周给药两次。给药过程中一直用数显游标卡尺测量肿瘤大小；给药第25天取材，取材时对小鼠进行称重、麻醉和拍照，之后处死小鼠，分离肝脏、脾脏与肿瘤组织，对肝脏、脾脏、肿瘤组织进行称重。

图2、图3和图4显示阿霉素与RBP131载体递送的siRRM2-M联用对肿瘤生长的抑制。结果显示给药期间组(4)和组(5)，即阿霉素联用的RBP131/siRRM2-M(2μg或5μg)组比其他组肿瘤生长速度缓慢。阿霉素与RBP131/siRRM2-M(5μg)联用组，与阿霉素与RBP131/siNC(5μg)联用组相比，瘤重亦有显著下降。给药期间没有发现行为、精神和粪便等异常。肝体比、脾体比正常，体重无明显变化。

实施例8

本实施例用来检测修饰后siRNA对肝癌肿瘤组织生长的抑制作用。

(1)siRNA药物组合物的制备。按照制备例3所述的方法，制备药物组合物RBP131/siNC、RBP131/siRRM2和RBP131/siRRM2-M。

(2)裸鼠肝原位移植瘤模型的制备。

皮下移植瘤的制备与处理：人肝癌细胞HepG2经传代培养，收集对数生长期的细胞制成单细胞悬液，分别接种于4只裸鼠背部皮下，每只裸鼠注射0.2mL，含细胞数2×10⁶个，继续常规饲养，观察裸鼠背部皮下成瘤情况。待肿瘤体积达1000mm³时，采用5％水合氯醛腹腔注射(0.7mL/100g)，对裸鼠进行麻醉。无菌条件下取出肿瘤，去除坏死组织，用眼科剪将肿瘤组织剪切成1mm×1mm×1mm大小的瘤块，置于无血清DMEM培养基中备用。

裸鼠肝原位移植瘤模型制备：50只裸鼠，5％水合氯醛(0.7mL/100g)腹腔注射麻醉，腹部正中横切口暴露肝脏，用10mL注射器针头在肝大叶做1个深1～2mm的隧道，将肿瘤组织植入隧道内，明胶海绵压迫止血后全层关腹。手术后，B超监测肿瘤生长情况，21天左右形成可见肿瘤，肿瘤体积平均约为50mm³。

(3)siRNA药物组合物的处理方法及检测。

将裸鼠随机分成5组，每组10只，这5组动物做如下处理：(1)PBS对照组；(2)RBP131/siNC无关对照组；(3)RBP131/siRRM2样品组；(4)RBP131/siRRM2-M样品组；(5)5-Fu阳性对照组。5-Fu(氟尿嘧啶)是常用的化疗抗肿瘤化合物之一，购自天津金耀氨基酸有限公司。上述5组动物分别通过尾静脉注射进行给药。siRNA给药量为1mg/kg，给药体积为10mL/kg，每周给药2次，共计5次；5-Fu给药量为5mg/kg，给药体积为10mL/kg，每两天给药1次，共计8次。给药后对肿瘤大小进行B超检测，以确定肿瘤生长情况。首次给药后第20天取材，取材时对小鼠进行称重、麻醉和拍照，之后处死小鼠，分离肝脏、脾脏与肿瘤组织，对肝脏、脾脏、肿瘤组织进行称重。

图5显示了RBP131载体递送的siRRM2-M siRNA对肝脏肿瘤生长的抑制情况。结果表明，与PBS对照组相比，通过尾静脉注射系统给予siRRM2-M的药物组合物可以有效抑制肿瘤组织生长，瘤重减小了82％，接近化疗剂5-Fu的水平；而未修饰的siRRM2瘤重只减少了45％。

实施例9

本实施例用于对比不同的siRNA对肝癌肿瘤组织生长的抑制效率。

按照制备例3所述的方法，制备siRNA药物组合物RBP130/siRRM2-M、RBP130/siRRM2-M2、RBP130/siPC1-M、RBP130/siPC2-M和RBP130/si501/842；参见实施例8所述的方法，制备裸鼠肝原位移植瘤模型。

其中，siRRM2-M2是siRRM2的另一种修饰形式，与siRRM2-M相比，其反义链的修饰方式不同；si501/842采用US8946176B2中公开的方法进行修饰，具体的寡聚核苷酸序列见表10所述。

表10

表10中的寡聚核苷酸包含修饰的核苷酸残基，互补的寡聚核苷酸链退火形成修饰的siRNA。其中，(OMe)代表它左边的核苷酸残基中戊糖基团为2’-甲氧基核糖基，(F)代表它左边的核苷酸残基中戊糖基团为2’-氟代核糖基；S代表它两边的脱氧核糖核苷酸dTdT之间的酯基为硫代磷酸酯基；p代表第一位核苷酸残基中5'-端连接磷酸基团(序列中不含p的，表示不含5’-磷酸基团)。

将裸鼠随机分成6组，每组6只，这6组动物做如下处理：(1)PBS对照组；(2)RBP130/siRRM2-M样品组；(3)RBP130/siRRM2-M2样品组；(4)RBP130/siPC1-M样品组；(5)RBP130/siPC2-M样品组；(6)RBP130/si501/842样品组。上述6组动物分别通过尾静脉注射进行给药。siRNA给药量为1mg/kg，给药体积为10mL/kg，每周给药2次，共计5次。给药后对肿瘤大小进行B超检测，以确定肿瘤生长情况。首次给药后第20天取材，取材时对小鼠进行称重、麻醉和拍照，之后处死小鼠，分离肝脏、脾脏与肿瘤组织，对肝脏、脾脏、肿瘤组织进行称重，瘤重抑制率见表11所述。

表11

分组	瘤重抑制率
		1×PBS	0％
RBP130/siRRM2-M	85％
		RBP130/siRRM2-M2	46％
RBP130/siPC1-M	53％
		RBP130/siPC2-M	68％
RBP130/si501/842	83％

与PBS对照组相比，通过尾静脉注射系统给予RBP130/siRRM2-M的药物组合物可以有效抑制肿瘤组织生长，瘤重减小了85％，与RBP130/si501/842的药物组合物对肿瘤组织的生长抑制相当；而给予了RBP130/siPC1-M的药物组合物的处理组中，瘤重减小了53％，给予了RBP130/siPC2-M的药物组合物的处理组中，瘤重减小了68％，给予了RBP130/siRRM2-M2的药物组合物的处理组中，瘤重只减小了46％。通过以上结果可以得知，通过利用本发明的修饰方式，使得含有较少修饰位点的siRRM2-M能达到与含有较多修饰位点的si501/842相当的体内活性，而同时，虽然siRRM2-M2修饰位点也少于si501/842，但体内活性较差。

实施例10

本实验实施例用来检测不同厂商生产的商业化siRNA体内给药载体，包括Invivofectamine 2.0(购自Life technology)、invivo jetPEI(购自PolyPlus-transfection(PT))、Entranster(购自Engreen Biosystem)以及本发明所述的RBP131，包载携带siRRM2-M后，在裸鼠原位肝癌模型(构建方法见实施例8)中对肿瘤大小及RRM2 mRNA表达量的抑制效率。

根据生产商提供的标准操作流程，将本发明的siRRM2-M包裹进上述商业化载体，制备相应的载体/siRNA组合物，分别标记为IVF2.0/RRM2、invivo jetPEI/RRM2、Entranster/RRM2。同时，按照制备例3的方法，制备RBP131/RRM2和RBP130/RRM2组合物。

将36只荷瘤裸鼠(肿瘤体积平均约为50mm³)，随机分成6组(每组6只，均为雄性)，分别为PBS对照组、IVF2.0/RRM2、invivo jetPEI/RRM2、Entranster/RRM2、RBP131/RRM2和RBP130/RRM2样品组。所有动物根据体重计算药量，尾静脉给药，每周2次，共给药6次。IVF2.0/RRM2、invivo jetPEI/RRM2、Entranster/RRM2三组的给药剂量为2.5mg/kg(siRNA)，RBP131/RRM2和RBP130/RRM2组的给药剂量为0.5mg/kg(siRNA)，所有6组的给药体积为10mL/kg。末次给药后第3天将动物处死，处死前对动物进行称重、麻醉和拍照，对动物进行大体解剖，观察体内脏器是否有病变，对肉眼观察有病变的组织用10％福尔马林保存进一步进行病理观察，收集肝脏、脾脏、肿瘤组织并称重，部分肝组织和肿瘤组织用RNAlater(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肿瘤组织，再用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。

采用实时荧光定量PCR检测肝组织中RRM2 mRNA的表达水平。检测方法同实施例1所述，检测引物同表2所述。不同的siRNA药物组合物对肿瘤的抑制效率用瘤重变化表示，方法同实施例8。

表12显示了所测各组供试品对原位肝癌动物肿瘤组织中RRM2 mRNA表达抑制活性，以及瘤重抑制率的检测结果。

表12

结果显示，RBP131/RRM2和RBP130/RRM2对基因表达及肿瘤大小的抑制效果相似。与由其它商业化载体形成的药物组合物中抑制mRNA表达效果最好的IVF2.0/RRM2组相比，RBP131/RRM2和RBP130/RRM2组对肝癌模型小鼠中RRM2 mRNA的抑制率也都提高了35％以上；同时，RBP131/RRM2和RBP130/RRM2组的抑制活性是invivo jetPEI/RRM2组的2倍、是Entranster/RRM2组的近20倍。瘤重抑制率结果与mRNA抑制率相似。进而，考虑到RBP131/RRM2和RBP130/RRM2组的给药剂量仅为其它三组的1/5，相较于由其它商业化载体形成的药物组合物而言，RBP131/RRM2和RBP130/RRM2显示出极高的生物活性。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种siRNA，其中，该siRNA的正义链碱基序列如SEQ ID NO：2所示，且该siRNA的反义链碱基序列如SEQ ID NO：3所示；且所述siRNA的磷酸-糖骨架分别具有如下修饰基团：

正义链第1、6、14、16和18位的糖基为2’-甲氧基核糖基；反义链第2位的糖基为2’-甲氧基核糖基，反义链第3位的糖基为2’-氟代核糖基。

2.根据权利要求1所述的siRNA，其中，该siRNA的正义链和/或反义链的第20位和第21位之间的酯基为硫代磷酸酯基。

3.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1或2中所述的siRNA和药学上可接受的载体；所述siRNA与所述药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体含有有机胺、胆固醇和聚乙二醇化磷脂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述有机胺为如式(1)所示的化合物和/或它的药学上可接受的盐：

Rx为

Ry为碳链数为C₁₂-C₂₀的直链烷基。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述有机胺为如式(2)所示的有机胺和/或如式(3)所示的有机胺：

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中，所述有机胺、胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中，所述有机胺、胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂三者之间的摩尔比为(50-70)：(20-40)：(3-20)。

9.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括至少一种额外的抗癌化疗剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述额外的抗癌化疗剂为阿霉素。

11.权利要求1或2中所述的siRNA和/或权利要求3-10中任意一项所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述癌症为肝癌和/或胰腺癌。