JP2022533421A - 核酸、薬物組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 - Google Patents

核酸、薬物組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 Download PDF

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Abstract

キニノーゲン（ＫＮＧ）遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体である。前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、当該ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。前記ｓｉＲＮＡ及びその薬物組成物とｓｉＲＮＡ複合体は、敗血症を効果的に治療及び／又は予防することができる。【選択図】図３

Description

本開示は、キニノーゲン遺伝子発現を抑制できる核酸、核酸を含む薬物組成物とｓｉＲＮＡ複合体に関する。本開示は、さらに、当該核酸、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の調製方法と使用に関する。
敗血症（膿毒症ともいう。Ｓｅｐｓｉｓ）は、感染による全身性炎症反応症候群を指し、細菌又は高度に疑わしい感染病巣があることが、臨床的に確認されている。敗血症は、感染に起因するが、ひとたび発症するとその発生、進行はそれ自身の病理過程と法則に従うため、本質的に感染性因子に対する人体の反応である。
キニノーゲン（Ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ、ＫＮＧ）遺伝子は発現して活性化高分子量キニノーゲン（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ、ＨＭＷＫａ）を生成し、グラム陰性菌細胞表面のリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）と結合してその半減期を延長し得る。ＫＮＧの発現を抑制することで、病原体の寿命を効果的に抑制し、敗血症の進行を緩和して病態を逆転させる目的を達成することができる。したがって、ＫＮＧは、病原体による敗血症及び他の炎症と密接に関連しており、敗血症を治療するためのキーターゲットポイントの一つである。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）というメカニズムに基づき、関心対象の目的遺伝子の発現を配列特異的に抑制又は遮断し、疾患を治療する目的を達成することができる。
ＫＮＧ遺伝子の発現を抑制し、敗血症を治療するｓｉＲＮＡ薬物の開発において、適切なｓｉＲＮＡ及びその修飾、ならびに有効な送達系は、一つのキー技術である。
本開示の発明者は、本開示により提供される以下のようなｓｉＲＮＡ及びその修飾配列を有すること、並びに当該ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、ＫＮＧ遺伝子の発現を特異的に抑制でき、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、肝臓を特異的に標的することができ、肝臓でのＫＮＧ遺伝子の発現を抑制し、敗血症の治療又は予防を実現することができることを意外にも見出した。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＫＮＧ遺伝子発現を抑制できる第１のｓｉＲＮＡを提供し、当該ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、以下のｉ）～ｖｉ）に示す配列から選択される１つである。
ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ１－３’（配列番号 １）、
５’－Ｚ２ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵ－３’（配列番号 ２）
ただし、Ｚ１はＵであり、Ｚ２はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１に対応するヌクレオチドＺ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２に対応するヌクレオチドＺ４が含まれ、前記Ｚ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ５－３’（配列番号 ６１）、
５’－Ｚ６ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵ－３’（配列番号 ６２）
ただし、Ｚ５はＣであり、Ｚ６はＧであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ５に対応するヌクレオチドＺ７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ６に対応するヌクレオチドＺ８が含まれ、前記Ｚ８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ９－３’（配列番号 １２１）、
５’－Ｚ１０ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡ－３’（配列番号 １２２）
ただし、Ｚ９はＵであり、Ｚ１０はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ９に対応するヌクレオチドＺ１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１０に対応するヌクレオチドＺ１２が含まれ、前記Ｚ１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１３－３’（配列番号 １８１）、
５’－Ｚ１４ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣ－３’（配列番号 １８２）
ただし、Ｚ１３はＡであり、Ｚ１４はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１３に対応するヌクレオチドＺ１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１４に対応するヌクレオチドＺ１６が含まれ、前記Ｚ１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１７－３’（配列番号 ２４１）、
５’－Ｚ１８ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣ－３’（配列番号 ２４２）
ただし、Ｚ１７はＵであり、Ｚ１８はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１７に対応するヌクレオチドＺ１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１８に対応するヌクレオチドＺ２０が含まれ、前記Ｚ２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２１－３’（配列番号 ３０１）、
５’－Ｚ２２ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵ－３’（配列番号 ３０２）
ただし、Ｚ２１はＵであり、Ｚ２２はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ２１に対応するヌクレオチドＺ２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２２に対応するヌクレオチドＺ２４が含まれ、前記Ｚ２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、前記ＫＮＧ遺伝子の異常発現による敗血症の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、敗血症に罹患している被験体に投与することを含む、敗血症の治療及び／又は予防方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を細胞と接触させることを含む、前記細胞におけるＫＮＧ遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を含むキットを提供する。
＜引用による本明細書への組み込み＞
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許又は特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、安定性に優れ、ＫＮＧ ｍＲＮＡ抑制活性が高く、オフターゲット効果が低減されており、及び／又は敗血症の症状を顕著に治療又は緩和することができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体外細胞実験で優れた標的ｍＲＮＡ抑制活性を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、肝細胞において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的ｍＲＮＡ発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ｐｓｉＣＨＥＣＫシステムにおいて高い抑制活性を示し、ＩＣ５０が、０．００４８～０．２３２８ｎＭである。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｐｓｉＣＨＥＣＫシステムにおいてＫＮＧ ｍＲＮＡに対して高い抑制活性を示し、異なるｓｉＲＮＡ濃度にてＫＮＧ目的配列に対していずれも抑制効果を示し、特に０．１ｎＭ濃度にて、ＫＮＧ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率がいずれも７５％以上となる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内での安定性及び／又は活性がより高い。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＫＮＧ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＫＮＧ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＫＮＧ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のヒト被験体における肝内ＫＮＧ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト化マウスにおいてＫＮＧ ｍＲＮＡに対して顕著な抑制活性を示し、ＫＮＧ ｍＲＮＡの発現レベルに対する抑制率が５６％に達することができる。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト化マウスにおいて非常に高い抑制活性を示し、ＫＮＧ ｍＲＮＡの発現レベルに対する抑制率がいずれも９７％以上となる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は顕著なオフターゲット効果を示していない。オフターゲット効果とは、例えば非標的遺伝子の正常発現に対する抑制であってもよい。オフターゲット遺伝子発現の結合／抑制は、オンターゲット遺伝子効果よりも５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％低くなると、当該オフターゲット効果は顕著ではないと見なされる。
このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、ＫＮＧ ｍＲＮＡの発現を抑制し、敗血症の症状を効果的に治療及び／又は予防することができ、応用において明るい見通しを有している。
本開示の他の特徴と利点については、後述する発明を実施するための形態部分において詳しく説明する。
濃度の異なる多くのｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、体外ＨＥＫ２９３Ａ細胞でのＲｅｎｉｌｌａの相対残存活性のヒストグラムである。 濃度の異なる多くのｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、ＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるＲｅｎｉｌｌａの相対残存活性に従ってフィッティングされた用量－効果曲線である。 ｓｉＲＮＡ複合体を投与した後、異なる時点でマウス体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるＫＮＧタンパクの相対発現レベルのヒストグラムである。
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示を制限するためのものではないと理解すべきである。
本開示において、ＫＮＧ ｍＲＮＡとは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１１０２４１６．２に示される配列を有するｍＲＮＡを指す。さらに、特に説明がない限り、本開示において用いられる用語「標的遺伝子」とは、上記ＫＮＧ ｍＲＮＡを転写する遺伝子を指し、用語「標的ｍＲＮＡ」とは、上記ＫＮＧ ｍＲＮＡを指す。
（定義）
文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。
文脈において、前記「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。「ヌクレオチドアナログ」とは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドがある。前記「メトキシ修飾ヌクレオチド」とは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という用語は、互換的に使用されてもよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基のそれぞれと他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｇ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的である、またその相補鎖の配列から当該鎖の配列を推定できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。
文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的」とは、関連する２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「実質的に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「完全に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。
文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化したことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであるとき、前者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はその等価物を用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。
文脈において、特に本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体におけるヌクレオチドの種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドホスホルアミダイトモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらに、「ｓｉＲＮＡ複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化学部分がｓｉＲＮＡに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以下の文章では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を単に「複合体」ともいうことがある。ｓｉＲＮＡ複合体は、文脈により、複数のｓｉＲＮＡ複合体の総称、又はある化学式に示されるｓｉＲＮＡ複合体であると理解される。本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることによりｓｉＲＮＡに複合され、最終的に本開示のｓｉＲＮＡ複合体を形成することができる特定の化合物であると理解すべきである。
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに当該記載が事象又は状況が発生した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換され」た「アルキル」は、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及び／又は本質的に不安定ないかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されないと、当業者に理解される。
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１～２０個の炭素原子、例えば、１～１０個の炭素原子、１～８個又は１～６個の炭素原子である。例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキルは、１～６個の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基に言及する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチル」は、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ－プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素－炭素二重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、プロパ－１－エン－１－イル、プロパ－１－エン－２－イル、プロパ－２－エン－１－イル（アリル）、プロパ－２－エン－２－イル等のプロペニルと、ブタ－１－エン－１－イル、ブタ－１－エン－２－イル、２－メチルプロパ－１－エン－１－イル、ブタ－２－エン－１－イル、ブタ－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－１，３－ジエン－２－イル等のブテニルとを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルケニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０個、２～８個又は２～６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素－炭素三重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から２つの水素分子を除去することにより得られる。典型的なアルキニルとしては、エチニルと、プロパ－１－イン－１－イル、プロパ－２－イン－１－イル等のプロピニルと、ブタ－１－イン－１－イル、ブタ－１－イン－３－イル、ブタ－３－イン－１－イル等のブチニルとを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルキニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０、２～８又は２～６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセットであり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ、３－ヘキシルオキシ、３－メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１～１０個、１～８個、１～６個、又は１～４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される、環炭素原子から水素原子を除去して形成された基を指す。前記芳香族単環式又は多環式炭化水素環系は、水素及び６～１８個の炭素原子の炭素のみを含有し、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状、非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を含む。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２－フルオロエチル又はペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
「複素環基」とは、２～１２個の炭素原子と、窒素、酸素又は硫黄から選択される１～６個のヘテロ原子とを含む、安定した３～１８員非芳香族環状基を指す。明細書において特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽和又は完全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。このような複素環基の実例としては、
ジオキサニル、チオフェニル［１，３］ジスルホニル（ｔｈｉｅｎｙｌ［１，３］ｄｉｔｈｉａｎｙｌ）、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、２－オキサピペラジニル、２－オキサピペリジル、２－オキサピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスルホニル（ｔｒｉｔｈｉａｎｙｌ）、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル（ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、チアモルホリニル（ｔｈｉａｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、１－オキソチオモルホリニル（１－ｏｘｏ－ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）及び１，１－ジオキソチオモルホリニル（１，１－ｄｉｏｘｏ－ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）を含むが、これらに限定されない。
「ヘテロアリール」とは、２個～１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～６個のヘテロ原子とを含む、３～１８員芳香環ラジカルから誘導される基を指す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であってもよく、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合される。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３－ベンゾジオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｅｐｉｎｙｌ）、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｏｘａｚｉｎｙｌ）、１，４－ベンゾジオキサン（１，４－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｎｙｌ）、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｙｌ）、ベンゾジオキシニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピロニル、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２－ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル（５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｈ］ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ）、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル（５，６ ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｈ］ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２－ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［３，２－ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、インドール、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル（ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｙｌ）、イソオキサゾリル、５，８－メタノ－５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル（５，８－ｍｅｔｈａｎｏ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ）、ナフチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、１，６－ナフチリジノニル（１，６－ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｏｎｙｌ）、オキサジアゾリル、２－オキソアゼピニル（２－ｏｘｏａｚｅｐｉｎｙｌ）、オキサゾリル、オキシラニル（ｏｘｉｒａｎｙｌ）、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１－フェニル－１Ｈ－ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピリジル、ピリド［３，２－ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル（ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｙｌ）、キノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８－テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８－テトラヒドロピリド［４，５－ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３－ｃ］プリジニル（ｔｈｉｅｎｏ［２，３－ｃ］ｐｒｉｄｉｎｙｌ）及びチオフェニル（ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ／ｔｈｉｅｎｙｌ）を含むが、これらに限定されない。
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能基に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２３～２３１１、及びＧｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，２ｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に開示されており、引用により、上記文献は、それぞれ全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９－フェニルキサンテン－９－イル（Ｐｉｘｙｌ）又は９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンテン－９－イル（Ｍｏｘ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Ｔｒ（トリチル）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）又はＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル）を含む。
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本開示の被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット又は任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「治療」とは、有益又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、被験体が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理的症状を根絶又は改善することにより、被験体に改善が観察されて得られる。
本明細書で用いられる場合、「予防」とは、有益又は所望の結果を得る方法であり、予防効果を含むが、これに限定されない。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行われていないかもしれないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体又は薬物組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある被験体に投与、又は疾患の１又は複数の病理学的症状が報告された被験体に投与することができる。
ある局面では、本開示は、ＫＮＧ遺伝子発現を抑制できる第１から第６のｓｉＲＮＡを提供する。以下、それらについて順に詳しく説明する。
本開示のｓｉＲＮＡは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここで説明を省略する。
本開示のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖とアンチセンス鎖の長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが１９～２６ヌクレオチドである。このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が１９／１９、１９／２０、１９／２１、１９／２２、１９／２３、１９／２４、１９／２５、１９／２６、２０／２０、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２０／２４、２０／２５、２０／２６、２１／２０、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２１／２５、２１／２６、２２／２０、２２／２１、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２２／２６、２３／２０、２３／２１、２３／２２、２３／２３、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は１９／２１、２１／２３又は２３／２５である。
＜第１のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第１のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第１のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第１のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ１－３’（配列番号 １）、
５’－Ｚ２ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵ－３’（配列番号 ２）
ただし、Ｚ１はＵであり、Ｚ２はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１に対応するヌクレオチドＺ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２に対応するヌクレオチドＺ４が含まれ、前記Ｚ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
文脈において、「位置が対応する」とは、ヌクレオチド配列の同一端から、ヌクレオチド配列において同じ位置にあることを指す。例えば、ヌクレオチド配列Ｉの３’端の１番目のヌクレオチドは、位置が配列番号 １の３’端の１番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ４の位置での差異を含み、Ｚ４がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ４の位置での差異であり、Ｚ４がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ３は、Ｚ４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、高い標的ｍＲＮＡ抑制能力を有し、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 ３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 ４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ３－３’（配列番号 ３）、
５’－Ｚ４ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵＧＧ－３’（配列番号 ４）
ただし、前記Ｚ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ３は、Ｚ４と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ３はＵであり、Ｚ４はＡである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号 １に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＧＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡＣＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＧＵＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第２のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第２のｓｉＲＮＡであってもよい。前記第２のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ５－３’（配列番号 ６１）、
５’－Ｚ６ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵ－３’（配列番号 ６２）
ただし、Ｚ５はＣであり、Ｚ６はＧであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ５に対応するヌクレオチドＺ７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ６に対応するヌクレオチドＺ８が含まれ、前記Ｚ８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ６１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ６２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ６２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ８の位置での差異を含み、Ｚ８がＡ、Ｕ又はＣから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ８の位置での差異であり、Ｚ８がＡ、Ｕ又はＣから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ７は、Ｚ８と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、高い標的ｍＲＮＡ抑制能力を有し、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 ６３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 ６４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ７－３’（配列番号 ６３）、
５’－Ｚ８ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵ－３’（配列番号 ６４）
ただし、前記Ｚ８は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ８は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ７は、Ｚ８と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ７はＣであり、Ｚ８はＧである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号 ６１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣＡＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第３のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第３のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第３のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ９－３’（配列番号 １２１）、
５’－Ｚ１０ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡ－３’（配列番号 １２２）
ただし、Ｚ９はＵであり、Ｚ１０はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ９に対応するヌクレオチドＺ１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１０に対応するヌクレオチドＺ１２が含まれ、前記Ｚ１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １２１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １２２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １２２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ１２の位置での差異を含み、Ｚ１２がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ１２の位置での差異であり、Ｚ１２がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ１１は、Ｚ１２と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、高い標的ｍＲＮＡ抑制能力を有し、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 １２３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 １２４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号 １２３）、
５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡ－３’（配列番号 １２４）
ただし、前記Ｚ１２は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１１は、Ｚ１２と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ１１はＵであり、Ｚ１２はＡである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号 １２１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡＧＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第４のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第４のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第４のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１３－３’（配列番号 １８１）、
５’－Ｚ１４ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣ－３’（配列番号 １８２）
ただし、Ｚ１３はＡであり、Ｚ１４はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１３に対応するヌクレオチドＺ１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１４に対応するヌクレオチドＺ１６が含まれ、前記Ｚ１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １８１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １８２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １８２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ１６の位置での差異を含み、Ｚ１６がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ１６の位置での差異であり、Ｚ１６がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ１５は、Ｚ１６と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、高い標的ｍＲＮＡ抑制能力を有し、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 １８３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 １８４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１５－３’（配列番号 １８３）、
５’－Ｚ１６ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣ－３’（配列番号 １８４）
ただし、前記Ｚ１６は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１６は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１５は、Ｚ１６と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ１５はＡであり、Ｚ１６はＵである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号 １８１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基はＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧＵＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第５のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第５のｓｉＲＮＡであってもよい。前記第５のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１７－３’（配列番号 ２４１）、
５’－Ｚ１８ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣ－３’（配列番号 ２４２）
ただし、Ｚ１７はＵであり、Ｚ１８はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１７に対応するヌクレオチドＺ１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１８に対応するヌクレオチドＺ２０が含まれ、前記Ｚ２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ２４１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２４２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２４２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ２０の位置での差異を含み、Ｚ２０がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ２０の位置での差異であり、Ｚ２０がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ１９は、Ｚ２０と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、高い標的ｍＲＮＡ抑制能力を有し、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 ２４３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 ２４４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１９－３’（配列番号 ２４３）、
５’－Ｚ２０ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣ－３’（配列番号 ２４４）
ただし、前記Ｚ２０は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ２０は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１９は、Ｚ２０と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ１９はＵであり、Ｚ２０はＡである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号 ２４１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基はＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＣＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第６のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第６のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第６のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２１－３’（配列番号 ３０１）、
５’－Ｚ２２ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵ－３’（配列番号 ３０２）
ただし、Ｚ２１はＵであり、Ｚ２２はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ２１に対応するヌクレオチドＺ２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２２に対応するヌクレオチドＺ２４が含まれ、前記Ｚ２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ３０１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ３０２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ３０２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ２４の位置での差異を含み、Ｚ２４がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ２４の位置での差異であり、Ｚ２４がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ２３は、Ｚ２４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、高い標的ｍＲＮＡ抑制能力を有し、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 ３０３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 ３０４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２３－３’（配列番号 ３０３）、
５’－Ｚ２４ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵ－３’（配列番号 ３０４）
ただし、前記Ｚ２４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ２４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２３は、Ｚ２４と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ２３はＵであり、Ｚ２４はＡである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号 ３０１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＧＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＣＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＧＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＣＧＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
以下に、ヌクレオチド配列Ｖ、核酸配列、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド修飾、及び修飾配列の説明は、上記の第１～第６のｓｉＲＮＡのいずれか１つに適用可能である。即ち、特に明記されていない場合、以下のｓｉＲＮＡの説明は、第１のｓｉＲＮＡ、第２のｓｉＲＮＡ、第３のｓｉＲＮＡ、第４のｓｉＲＮＡ、第５のｓｉＲＮＡ又は第６のｓｉＲＮＡを１つずつ説明したものと見なされるべきである。例えば、特定のｓｉＲＮＡが指定されていない場合、「前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含む」とは、「第１のｓｉＲＮＡ、第２のｓｉＲＮＡ、第３のｓｉＲＮＡ、第４のｓｉＲＮＡ、第５のｓｉＲＮＡ又は第６のｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含む」ことを意味する。
いくつかの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’突出端（オーバーハング末端）を構成する。これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が１９／２１、２１／２３又は２３／２５であってもよい。
前記ヌクレオチド配列Ｖにおける各ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよく、合成しやすく合成コストを節約するために、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド（ｄＴｄＴ）又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチド（ＵＵ）であり、或いは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの親和力を向上させるために、ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比は１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡはより高い標的ｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。
標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドとは、５’末端で標的ｍＲＮＡの三段目のヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。当該三段目のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列ＩＩと実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列であるか、又はヌクレオチド配列ＩＩ及びヌクレオチド配列ＩＶから構成されるヌクレオチド配列と実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、前記第１のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ３－３’（配列番号 ５）、
５’－Ｚ４ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵＧＧ－３’（配列番号 ６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号 ８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＣＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ３－３’（配列番号 ７）、
５’－Ｚ４ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵＧＧＵＵ－３’（配列番号 ８）
ただし、前記Ｚ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ３は、Ｚ４と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第２のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ６６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ７－３’（配列番号 ６５）、
５’－Ｚ８ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵＣＣ－３’（配列番号 ６６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ６８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＧＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ７－３’（配列番号 ６７）、
５’－Ｚ８ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵＣＣＡＧ－３’（配列番号 ６８）
ただし、前記Ｚ８は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ８は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ７は、Ｚ８と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第３のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 １２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 １２６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号 １２５）、
５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡ－３’（配列番号 １２６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 １２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 １２８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号 １２７）、
５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵ－３’（配列番号 １２８）
ただし、前記Ｚ１２は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１１は、Ｚ１２と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第４のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 １８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 １８６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１５－３’（配列番号 １８５）、
５’－Ｚ１６ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣＵＧ－３’（配列番号 １８６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 １８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 １８８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＡＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１５－３’（配列番号 １８７）、
５’－Ｚ１６ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣＵＧＵＡ－３’（配列番号 １８８）
ただし、前記Ｚ１６は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１６は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１５は、Ｚ１６と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第５のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ２４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ２４６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１９－３’（配列番号 ２４５）、
５’－Ｚ２０ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣＵＣ－３’（配列番号 ２４６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ２４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ２４８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＡＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１９－３’（配列番号 ２４７）、
５’－Ｚ２０ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣＵＣＵＧ－３’（配列番号 ２４８）
ただし、前記Ｚ２０は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ２０は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１９は、Ｚ２０と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第６のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ３０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ３０６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２３－３’（配列番号 ３０５）、
５’－Ｚ２４ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣ－３’（配列番号 ３０６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ３０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ３０８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２３－３’（配列番号 ３０７）、
５’－Ｚ２４ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵ－３’（配列番号 ３０８）
ただし、前記Ｚ２４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ２４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２３は、Ｚ２４と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに記載されているｓｉＫＮａ１、ｓｉＫＮａ２、ｓｉＫＮｂ１、ｓｉＫＮｂ２、ｓｉＫＮｃ１、ｓｉＫＮｃ２、ｓｉＫＮｄ１、ｓｉＫＮｄ２、ｓｉＫＮｅ１、ｓｉＫＮｅ２、ｓｉＫＮｆ１及びｓｉＫＮｆ２である。
前述したように、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドは、いずれも非修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの一部又は全部は、修飾ヌクレオチドであり、ヌクレオチド基上のこれらの修飾により、本開示のｓｉＲＮＡがＫＮＧ遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、或いは、修飾された塩基を有するヌクレオチドを指す。前記修飾ヌクレオチドにより、ｓｉＲＮＡが遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。例えば、Ｊ．Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｇ．Ｆ． Ｄｅｌｅａｖｅｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ． Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ： ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２００８，１３（１９－２０）： ８４２－５５に開示された修飾ヌクレオチドを選択してもよい。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基及び／又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基及び／又は修飾基を有するリボース基である。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
本開示の発明者は、驚くべきことに、本開示に記載されたｓｉＲＮＡにより、動物実験において血漿中安定性と遺伝子サイレンシング効率の高度なバランスが取られていることを見出した。
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの少なくとも第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの少なくとも第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、前記ヌクレオチド配列Ｉにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの少なくとも第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩの少なくとも第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
本開示の文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換された、以下の式（７）に示される構造を有するヌクレオチドを指す。「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド、又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである。
これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。
いくつかの実施形態において、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（８）に示されるメトキシ修飾ヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）である。いくつかの実施形態において、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、例えば、式（９）に示される２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド（２’－ＭＯＥ）であってもよい。いくつかの実施形態において、２’－アミノ修飾ヌクレオチド（２’－ＮＨ２）は式（１０）に示される。いくつかの実施形態において、２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は式（１１）に示される。
Figure 2022533421000002
ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドであってもよい。
ＢＮＡとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’－、４’－位に導入して２’，４’－ＢＮＡヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＢＮＡは、式（１２）に示されるＬＮＡ、式（１３）に示されるＥＮＡ、式（１４）に示されるｃＥＴ ＢＮＡ等であってもよい。
Figure 2022533421000003
非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、非環式ヌクレオチドは、式（１５）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は式（１６）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）であってもよい。
Figure 2022533421000004
上記式（１５）及び式（１６）において、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ－アルキル）から選択される。
イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化した化合物を指す。いくつかの実施形態において、イソヌクレオチドは、式（１７）又は（１８）に示される、塩基がリボース環の１’－位から２’－位又は３’－位に移行した化合物であってもよい。
Figure 2022533421000005
上記式（１７）～式（１８）に示される化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴ等の塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素基から選択される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択されるいずれか１つである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’－フルオロ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’－フルオロリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式（７）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「２’－メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「２’－メトキシリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドのリボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換された、式（８）に示される構造を有する化合物を指す。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに記載されているｓｉＫＮａ１－Ｍ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ２、ｓｉＫＮａ１－Ｍ３、ｓｉＫＮａ２－Ｍ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ２、ｓｉＫＮａ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ２、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ２、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ２、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ２、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ２及びｓｉＫＮｆ２－Ｍ３のいずれか１つである。
上記修飾を有するｓｉＲＮＡは、コストが低いだけでなく、血中のリボヌクレアーゼで核酸を切断しにくくすることができ、これにより、核酸の安定性を向上させ、核酸のヌクレアーゼ加水分解耐性という特性をより高める。そして、上記修飾ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制活性が高い。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である。
Figure 2022533421000006
このような修飾により、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持することができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに記載されているｓｉＫＮａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ２Ｓ及びｓｉＫＮｆ２－Ｍ３Ｓのいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。
慣用の前記５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、当業者に公知であり、例えば、５’－リン酸ヌクレオチドは、以下の構造を有してもよい。
Figure 2022533421000007
また、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）： ２３８～４８には、以下の４種類の５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが開示されている。
Figure 2022533421000008
式中、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ、フッ素から選択され、Ｂａｓｅは塩基を表し、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される。
いくつかの実施形態において、５’－リン酸ヌクレオチドは、式（２）に示される、５’－リン酸修飾を含むヌクレオチドであり、５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（３）に示される、ビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾を含むヌクレオチドであり、又は、式（５）に示される、チオリン酸エステル修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに記載されているｓｉＫＮａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ２ＳＰ１及びｓｉＫＮｆ２－Ｍ３ＳＰ１のいずれか１つである。
本開示の発明者は、本開示により提供される上記ｓｉＲＮＡの血漿とリソソーム安定性が顕著に向上しているだけでなく、標的ｍＲＮＡ抑制活性が高いことを意外にも見出した。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、本分野における通常のｓｉＲＮＡ調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）により得ることができる。ここで、固相合成は、既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができ、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。
＜薬物組成物＞
本開示は、活性成分として上述したｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
前記薬学的に許容可能な担体は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば、Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ （ＰＡＭＡＭ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ－又はＬ－乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ－ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複数があるが、これらに限定されない。
前記薬物組成物におけるｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、各成分の通常の含有量であってもよい。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１～５００）であってもよい。いくつかの実施形態においては、上記重量比が１：（１～５０）である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。
前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５～８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、例えば、ｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。
前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１～３０重量％であってもよい。
前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００～７００ミリオスモル／キログラム（ｍＯｓｍ／ｋｇ）となるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決定することができる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定されず、噴霧により肺に投与、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂質及び／又はＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）脂質を含む。ここで、前記有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａ（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１種又は複数種であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３８０１１３Ａに記載された式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。
Figure 2022533421000009
 式中、
Ｘ１０１又はＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ－Ａ又はＣ－Ａであり、Ａは水素又はＣ１－Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ１０１又はＺ１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ－ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６又はＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘが１～１０の整数であり、
ｎが１～３の整数であり、ｍが０～２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
Figure 2022533421000010
 式中、ｇ、ｅ又はｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）における窒素原子を表す。
いくつかの実施形態において、Ｒ１０３はポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ１０１及びＲ１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アルキル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３～約２０個の炭素原子、例えば、８～約１８個の炭素原子、及び０～４個の二重結合、例えば、０～２個の二重結合を有する。
いくつかの実施形態において、ｎとｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合、Ｒ１０３は、下記式（２０４）～式（２１３）のいずれか１つであってもよい。
Figure 2022533421000011
 式（２０４）～式（２１３）において、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊はＲ１０３と式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子と結合するために置換されてもよい。
式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａの記載により調製されてもよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。
Figure 2022533421000012
前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジパルミトアミド－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］－２０００（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］－２０００）である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質、前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７～８０）：（１９．７～８０）：（０．３～５０）であり、例えば、（５０～７０）：（２０～４０）：（３～２０）であってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍの平均径を有し、一般に約４０ｎｍ～約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均径は約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物において、ｓｉＲＮＡと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１～約１：５０、約１：１～約１：３０、約１：３～約１：２０、約１：４～約１：１８、約１：５～約１：１７、約１：５～約１：１５、約１：５～約１：１２、約１：６～約１：１２又は約１：６～約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示のｓｉＲＮＡと全脂質の重量比は約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在してもよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡと上記薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来のｓｉＲＮＡの代わりに本開示により提供されるｓｉＲＮＡを用いればよい。いくつかの実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。
有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば、８～１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択される１種又は複数種であり、例えばエタノールであってもよい。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡを緩衝塩溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡ水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度が０．０５～０．５Ｍであり、例えば、０．１～０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨを４．０～５．５に調節し、例えば、５．０～５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２～０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１種又は複数種であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってよい。
脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を混合した後、得られた生成物を４０～６０℃で少なくとも２分間、例えば、５～３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る。脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液の体積比は１：（２～５）である。
培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが６．５～８であり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０～２００ｎｍであり、多分散指数が０．３０以下であり、浸透圧が２５０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、例えば、物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが７．２～７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０～１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。
ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われてもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過して除菌してもよい。
＜ｓｉＲＮＡ複合体＞
本開示は、上記ｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
一般的には、前記複合基は、薬学的に許容できる少なくとも１つの標的基及び任意のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基は順に結合されている。いくつかの実施形態において、前記標的基は１～６個である。いくつかの実施形態において、前記標的基は２～４個である。前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複合されてもよい。ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端にある。
いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’－位のヒドロキシ基又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、３’－位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’－５’リン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、ｓｉＲＮＡ鎖の末端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、ｓｉＲＮＡの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。各種の結合方法については、Ｍｕｔｈｉａｈ Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ．ａｌ． ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｒｏｂｕｓｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０ （５）： １１８１～７．を参照することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との間が酸不安定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合が分解され、ｓｉＲＮＡが遊離状態になることができる。分解できない複合方法については、複合基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され、複合によるｓｉＲＮＡ活性への影響をできるだけ低下させることができる。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられるリガンド、例えば、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２に記載された各種のリガンドであってもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、コレステロール、胆汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子と、ポリエチレングリコール等のポリマーと、膜透過性ペプチド等のポリペプチドと、アプタマーと、抗体と、量子ドットと、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類と、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）と、アシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高密度リポタンパク、低密度リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその誘導体により形成されたリガンドから選択される１種又は複数種であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、哺乳動物の肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合されるｓｉＲＮＡの標的細胞への送達を媒介する。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合するいずれか１種のリガンドであってもよい。いくつかの実施形態において、各リガンドは、独立してアシアロ糖タンパク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯＲ）又はアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ、ＡＳＦ）である。いくつかの実施形態において、前記リガンドは、糖又は糖の誘導体である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドはいずれも糖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、単糖、多糖、修飾単糖、修飾多糖又は糖誘導体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの前記リガンドは、単糖、二糖又は三糖であってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも独立して多糖、修飾多糖、単糖、修飾単糖、多糖誘導体又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、リガンドのそれぞれ又は少なくとも１つは、グルコース及びその誘導体、マンナン及びその誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各前記リガンドは、Ｄ－マンノピラノース、Ｌ－マンノピラノース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－キシロフラノース、Ｌ－キシロフラノース、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、α－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－マンノピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニルガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブチリルガラクトサミン、Ｎ－イソブチリルガラクトサミン、２－アミノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－１－カルボキシエチル］－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノース、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジデオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デオキシ－２－スルホアミノ－Ｄ－グルコピラノース、Ｎ－グリコリル－α－ノイラミン酸、５－チオ－β－Ｄ－グルコピラノース、メチル２，３，４－トリス－Ｏ－アセチル－１－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチオ－α－Ｄ－グルコヘプトピラノシド、２，５－アンヒドロ－Ｄ－アロニトリル、リボース、Ｄ－リボース、Ｄ－４－チオリボース、Ｌ－リボース又はＬ－４－チオリボースから独立して選択されてもよい。前記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体における、薬学的に許容できる標的基は、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれｓｉＲＮＡ分子と、標的基としてのガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成されたｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ分子とガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３又は１：４であることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基はＮ－アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価である。
標的基は、適切なリンカーを介してｓｉＲＮＡ分子に結合されてもよく、当業者は、標的基の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。これらのリンカー、標的基の種類及びｓｉＲＮＡへの結合方法については、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。
Figure 2022533421000013
 式中、
ｋは１～３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合される。
Figure 2022533421000014
 ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ－アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素基を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合される。
Figure 2022533421000015
 ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２～４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記ＬＢ部に結合される。
いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－によりＮ－アセチルガラクトサミン分子とｓｉＲＮＡ分子を結合して形成されたｓｉＲＮＡ複合体は、その構造が以下の式（３０４）に示される。
Figure 2022533421000016
 式中、二重螺旋構造はｓｉＲＮＡを表す。
同様に、ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、リンカー－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－により３個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合的に複合され、ｓｉＲＮＡ分子とＧａｌＮＡｃ分子とのモル比が１：３である、構造が以下の式（３０５）に示されるｓｉＲＮＡ複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）３－ｓｉＲＮＡともいう）を得る。
Figure 2022533421000017
 式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。
Figure 2022533421000018
 式中、
ｌは０～３の整数であり、
＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合によりｓｉＲＮＡに結合される部位を表す。
いくつかの実施形態において、ｌ＝２である場合、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０７）に示される構造を有する。
Figure 2022533421000019
 式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
上記ｓｉＲＮＡ複合体は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成されてもよい。例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法が詳しく記載されている。当業者によく知られている方法により、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得る。例えば、ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１には、式（３０５）に示される構造の調製方法が記載されており、Ｒａｊｅｅｖらは、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，９０３－９０８に式（３０７）に示される構造の調製方法を記載した。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０８）に示される構造を有する。
Figure 2022533421000020
 式中、
ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２又はｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
Figure 2022533421000021
 式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは本開示のｓｉＲＮＡである。
Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は独立して、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよい。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１～Ａ２６の基又はその任意の組合せからなる群から選択されてもよく、Ａ１～Ａ２６の構造と定義は以下のとおりである。
Figure 2022533421000022
 式中、各ｊ１は独立して１～２０の整数であり、各ｊ２は独立して１～２０の整数であり、
各Ｒ’は独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、
各Ｒａは独立して、式Ａ２７～Ａ４５基及びその任意の組合せからなる群から選択される。
Figure 2022533421000023
 各Ｒｂは独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、
Figure 2022533421000024
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
便宜上、Ｌ１は、線形アルキレン基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
Ｍ１は、標的基を表し、その定義と選択可能な範囲は上記標的基と同じである。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから独立して選択される１つである。
Ｍ１が哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドである場合、いくつかの実施形態において、ｎ１は、１～３の整数であってもよく、ｎ３は、０～４の整数であってもよく、前記ｓｉＲＮＡ複合体におけるＭ１標的基の個数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２であり、これにより、Ｍ１標的基の個数が少なくとも３であり、Ｍ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記ｓｉＲＮＡ複合体がエンドサイトーシス（細胞内取込み）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分かるように、Ｍ１標的基の個数が３個以上である場合、Ｍ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形態において、ｎ１は１～２の整数であり、ｎ３は０～１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２～３である。
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２又はｍ３は、独立して２～１０の整数から選択される場合、複数のＭ１標的基間の空間位置をＭ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体をより簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２又はｍ３は、それぞれ独立して２～５の整数であり、いくつかの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５が、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からそれぞれ独立して選択される１つである場合、いずれも本開示のｓｉＲＮＡ複合体の性質を変化させることなく、本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ独立してＨ、メチル基又はエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、いずれもＨである。
Ｒ３は、式Ａ５９に示される構造の基であり、ここで、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、調製原料の入手しやすさを考慮し、いくつかの実施形態において、Ｅ１はＯＨ又はＳＨである。
Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮ原子とＡ５９との結合を実現するために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が結合された炭素原子とＮ原子が互いに結合している鎖状構造を指す。したがって、Ｒ２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮ原子に結合することができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合成プロセスにより式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を調製する場合に、Ｒ２基には、窒素含有骨格上のＮ原子に結合される部位及びＲ３におけるＰ原子に結合される部位がともに含まれる必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格上のＮ原子に結合される部位は、Ｎ原子とアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰ原子に結合される部位は、Ｐ原子とリン酸エステル結合を形成し、いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’であってもよい。
Figure 2022533421000025
 式中、
Figure 2022533421000026
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
ｑ２の値の範囲は、１～１０の整数であってもよく、いくつかの実施形態において、ｑ２は１～５の整数である。
Ｌ１は、Ｍ１標的基と窒素含有骨格上のＮを結合し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、式Ａ１～Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３～２５個の原子、３～２０個の原子、４～１５個の原子又は５～１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個の原子である。
いくつかの実施形態において、ｊ１は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ１は３～５の整数である。いくつかの実施形態において、ｊ２は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ２は３～５の整数である。Ｒ’はＣ１－Ｃ４アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１－Ｃ５アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。いくつかの実施形態において、式Ａ１～Ａ２６においてそれぞれｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、Ｍ１標的基と窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現し、Ｍ１標的基間の空間位置をＭ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合にさらに適合させる。
いくつかの実施形態において、当該ｓｉＲＮＡ複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。
Figure 2022533421000027
Figure 2022533421000028
Figure 2022533421000029
Figure 2022533421000030
Figure 2022533421000031
Figure 2022533421000032
Figure 2022533421000033
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡ配列における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合されてもよく、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の端部に結合される。前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を放出し、ＫＮＧ ｍＲＮＡがタンパク質を翻訳する過程を遮断し、ＫＮＧ遺伝子発現を抑制することができる。
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド上の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され（このとき、Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡに含まれるリン酸基のＰ原子と見なすこともできる）、或いは、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における１つのヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合される。
本開示の発明者は、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が、血漿中安定性が顕著に向上し、オフターゲット効果が低減され、高いＫＮＧ ｍＲＮＡサイレンシング活性をさらに示すことを意外にも見出した。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに示されるｓｉＲＮＡの１つであってもよい。これらのｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ複合体は、より高いＫＮＧ ｍＲＮＡサイレンシング活性を示す。
Figure 2022533421000034
Figure 2022533421000035
Figure 2022533421000036
Figure 2022533421000037
Figure 2022533421000038
Figure 2022533421000039
Figure 2022533421000040
Figure 2022533421000041
Figure 2022533421000042
Figure 2022533421000043
Figure 2022533421000044
Figure 2022533421000045
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右の２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。いくつかの実施形態において、Ｐ１は、特定の修飾がＶＰ、Ｐｓ又はＰであることを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体において、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）として存在してもよく、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムイオンＮＨ４ ＋、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮し、いくつかの実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１種又は複数種である。アルカリ金属イオンは、Ｋ＋及び／又はＮａ＋であってもよく、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。いくつかの実施形態において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、ナトリウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品として購入されてもよく、既知の方法により調製されてもよい。
＜式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を調製してもよい。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含み、前記ｓｉＲＮＡは、上記本開示のｓｉＲＮＡである。
また、当該方法は、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分子とも呼ばれる。
Figure 2022533421000046
 式中、
Ｒ４は、式（３０８）に示される化合物におけるＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合可能な基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、共有結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合可能な基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、反応を経てリン酸ジエステル結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡの任意の官能基に複合可能な基であり、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ－基で置換された基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４には、Ｒ２リンカー基又は保護されたＲ２リンカー基、及び反応させることによりｓｉＲＮＡとＡ５９に示される構造を形成することができる官能基が含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡ又はヌクレオシドモノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる第１の官能基と、ヒドロキシ基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる第２の官能基又は前記共有結合により結合された固相担体とを含む。いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸塩である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体であり、前記共有結合は、ヒドロキシ基又はアミノ基により形成されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、－ＯＲｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。
Figure 2022533421000047
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 2022533421000048
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、式（Ｃ３）に示されるように、ホスホルアミダイト基を含み、当該ホスホルアミダイト基は、ヌクレオチド上の任意位置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリング反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子をｓｉＲＮＡに複合することができる。この場合、前記第２の官能基が存在しなくても、式（３２１）に示される化合物は、ヌクレオチドに複合することができ、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の取得に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合成等の方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式（３２１）に示される化合物と、ヌクレオチド配列において末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基を反応させ、後の酸化又は硫化過程においてリン酸ジエステル結合による結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、式（３２１）に示される化合物をｓｉＲＮＡに複合させる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応できる基を含み、前記反応により固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。前記第２の官能基がカルボキシ基又はカルボン酸塩を含む場合、式（３２１）に示される化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。前記第２の官能基がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）に示される化合物と汎用の固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン酸ジエステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。その後、上記固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記第１の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホスホルアミダイト基とカップリングさせる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として固相担体の代わりに式（３２１）に示される化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。
いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、－ＣＯＯ－Ｍ＋で表されてもよく、ここで、Ｍ＋はカチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４ ＋、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。１つの実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、例えば、Ｋ＋又はＮａ＋である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮して、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む。
Figure 2022533421000049
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ｑ２は１～１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 2022533421000050
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。いくつかの実施形態において、ｑ１は１又は２である。いくつかの実施形態において、ｑ２は１～５の整数である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構造を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’－ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’－ビスメトキシトリチル（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
Ｌ１の定義は、前述したとおりである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｍ１標的基を窒素含有骨格上のＮ原子に結合し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するために用いられる。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１～Ａ２６のいずれか１つ又はその組合せを含む。
上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルアミダイト固相合成方法と比較して、上記第１の官能基及び任意の第２の官能基により、複合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌクレオチド配列の末端に結合された、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。これに応じて、特に説明がない限り、以下にｓｉＲＮＡ複合体及び／又は複合分子の調製に関する記載において、「脱保護」、「カップリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、本分野で公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた同様にこれらの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に詳細に説明する。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１に存在する活性ヒドロキシ基が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、当業者に既知のあらゆるヒドロキシ保護基を、Ｍ１における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護されたヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ－で表されてもよく、各Ｙは、独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基及びＣ６－Ｃ１０アリール基からなる群から選択され、前記Ｃ１－Ｃ１０アルキル基及びＣ６－Ｃ１０アリール基は、１又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は、ハロゲン及びＣ１－Ｃ６アルキル基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、各Ｙは、独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１－Ｃ６アルキルフェニル基からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６～Ａ５４からなる群から選択される。
Figure 2022533421000051
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
前述したように、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、ｓｉＲＮＡの他方の鎖を合成し（例えば、上記工程で、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成した場合、固相合成方法に従いｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆も同様である）、センス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさらに含む。具体的には、単離工程において、ヌクレオチド配列及び／又は複合分子に結合される固相担体が切断されるとともに、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１）に示される化合物における各Ｓ１基が、対応するＭ１標的基に変換される）、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又はセンス鎖）が得られ、センス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得る。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、式（３２１）に示される化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基を含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる化合物であり、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）に示される化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、複合基が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；ホスホルアミダイト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のアンチセンス鎖又はセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製してセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、当該二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程；カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイト基である第１の官能基が含まれる式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させ、保護基を除去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の３’末端に結合され、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）に示される化合物（式（３２１）に示される化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基ＯＲｋを含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒｋを除去し、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’の方向に、ホスホルアミダイト固相合成方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成すること、
（４）ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることを含む。
工程（１）において、上記式（３２１）に示される化合物における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱保護条件で、式（３２１）に示される化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、いくつかの実施形態では５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態ではジクロロ酢酸である。脱保護試薬と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態では５０：１～５００：１である。
前記カップリング反応条件及びカップリング試薬は、上記カップリング反応に適した任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件は、反応温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃である。式（３２１）に示される化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１～１：５０であり、いくつかの実施形態では１：２～１：５である。式（３２１）に示される化合物とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態では１：３～１：１０であり、反応時間は２００～３０００秒、いくつかの実施形態では５００～１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態では５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態では無水アセトニトリルである。式（３２１）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製された複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’の方向に、第２のｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖ＳＳを合成する。この場合、複合基は、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件は、ヌクレオシドモノマーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応の条件、酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬の種類と用量を含み、本分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成では、以下の条件を用いてもよい。
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、いくつかの実施形態では５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態ではジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比は２：１～１００：１であってもよく、いくつかの実施形態では３：１～５０：１である。
カップリング反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態では１：５～１：１５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：１００、いくつかの実施形態では１：５０～１：８０であり、反応時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
キャッピング反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒、いくつかの実施形態では１０～１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１：１００～１００：１、いくつかの実施形態では１：１０～１０：１である。キャッピング試薬として等モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる場合、酢酸無水物、Ｎ－メチルイミダゾール、固相担体に結合される核酸配列のモル比は１：１：１０～１０：１０：１であってもよく、いくつかの実施形態では１：１：２～２：２：１である。
酸化反応の条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が１～１００秒、いくつかの実施形態では５～５０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態ではヨウ素である（いくつかの実施形態ではヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は、１：１～１００：１であってもよく、いくつかの実施形態では５：１～５０：１である。いくつかの実施形態では、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行われる。硫化反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が５０～２０００秒、いくつかの実施形態では１００～１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態ではキサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態では１０：１～５００：１である。いくつかの実施形態では、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリジン＝１：３～３：１の混合溶剤で行われる。
全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前に、当該方法は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去するには、ｓｉＲＮＡ合成において通常の切断と脱保護方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６～Ａ５４基の保護基ＹＣＯＯ－をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、２５～３０重量％のアンモニア水であってもよく、濃アンモニア水の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ～０．８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’－ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩と接触させることにより、当該２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この場合、得られた目的とするｓｉＲＮＡ配列における対応するヌクレオチドには、遊離の２’－ヒドロキシ基を有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ～１．０ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。このように式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマトグラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製を完了し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩することができる。
このように得られた式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本的にナトリウムイオンに結合されており、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、基本的にナトリウム塩として存在する。よく知られたイオン交換方法により、水素イオン及び／又は他のカチオンで前記ナトリウムイオンを置換し、他の形式の式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。前記カチオンは、前述したとおりである。
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御することができる。このような検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を測定することができる。
アニール方法も、当業者によく知られているものである。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０～９５℃に加熱し、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このように式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
前記ｓｉＲＮＡ複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成された式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の特徴を明らかにし、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、目的設計の式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体であるとともに、合成されたｓｉＲＮＡの配列が、所望のｓｉＲＮＡの配列、例えば表１に示される配列の１つであると確認することもできる。
式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
Figure 2022533421000052
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ６は、式（３２１）におけるＲ４を提供する基である。いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
Figure 2022533421000053
 式中、Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現できる、ＲｋＯと結合して１つの遊離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この場合、Ｒ４にヒドロキシ保護基としての第１の官能基と第２の官能基が含まれ、前記第２の官能基が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）に示される化合物が得られる。
前記エステル化反応条件は、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が８～４８時間であり、いくつかの実施形態において、前記エステル化反応条件は、反応温度が１０～４０℃であり、反応時間が２０～３０時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例えば、当該触媒は、４－ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第３級アミンであってもよい。いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミンと式（３１３）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～１０：１である。
前記イオン交換作用は、式（３２１）に示される化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオン交換溶液と交換条件を用い、Ｍ＋カチオンを有する複合分子を得ることができ、ここでは詳しい説明を省略する。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度は０．２～０．８Ｍであり、いくつかの実施形態においては、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度は０．４～０．６Ｍであり、式（３１３）に示される化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量は３～６Ｌ／ｍｏｌであり、更なる実施形態においては４～５Ｌ／ｍｏｌである。
任意の適切な単離方法によって、反応混合物から式（３２１）に示される化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３２１）に示される化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出すること、又は、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３２１）に示される化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される化合物の調製方法は、縮合反応条件下で、有機溶剤において、縮合剤、縮合触媒及び第３級アミンの存在下で、上記イオン交換反応により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（３２１）に示される化合物が得られる。
前記固相担体は、ｓｉＲＮＡの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態において、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径１００～４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２～０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は１０～４００μｍｏｌ化合物／グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ）である。いくつかの実施形態において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は５０～２００μｍｏｌ／ｇである。
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量は２０～２００Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５０～１００Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ－ｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰｙＢｏｐ）、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（３－（Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）－１，２，３－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎ－４（３Ｈ）－ｏｎｅ、ＤＥＰＢＴ）及び／又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（Ｏ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であってもよく、いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルである。前記縮合剤と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、他の実施形態において１：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミンと式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される化合物の調製方法は、キャッピング反応条件下で、有機溶剤において、得られた縮合生成物をキャッピング試薬及びアシル化触媒と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前記キャッピング反応の条件は、反応温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が１～１０ｈ、いくつかの実施形態では３～６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、ｓｉＲＮＡ固相合成に用いられるキャッピング試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬１（ｃａｐ１）及びキャッピング試薬２（ｃａｐ２）からなり、キャッピング試薬１は、Ｎ－メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：１０～１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３～１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ－メチルイミダゾールとの体積比は１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～７：１である。前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積比が１：１～１：１０であり、更なる実施形態において１：２～１：６である。
いくつかの実施形態において、前記Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液の体積と式（３２１）に示される化合物の質量との比は５ｍｌ／ｇ～５０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態では１５ｍｌ／ｇ～３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）に示される化合物の質量との比は０．５ｍｌ／ｇ～１０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態では１ｍｌ／ｇ～５ｍｌ／ｇである。
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量は１０～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～３０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、４－ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３２１）に示される化合物との質量比は０．００１：１～１：１であり、いくつかの実施形態では０．０１：１～０．１：１である。
いくつかの実施形態において、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）に示される化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）に示される化合物を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノールから選択され、いくつかの実施形態において、アセトニトリルである。
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３１３）に示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（３２１）に示される化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件は、温度が０～５０℃であってもよく、例えば１５～３５℃である。式（３１３）に示される化合物とホスホルジアミダイトとのモル比は１：１～１：５０であってもよく、例えば１：５～１：１５であり、式（３１３）に示される化合物とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：１００であってもよく、例えば１：５０～１：８０である。反応時間は２００～３０００秒であってもよく、例えば５００～１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）（２－シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品を購入してもよく、又は本分野で公知の方法により合成されてもよい。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、例えば、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水アセトニトリルである。いくつかの実施形態において、式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５～２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）に示される化合物におけるヒドロキシ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３２１）に示される化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される化合物の調製方法は、カップリング反応条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得る。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ３’）に示される構造を有する式（３２１）に示される化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用できる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ３００ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。
Figure 2022533421000054
脱保護反応は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、例えば５０～１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における－ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１～１００：１であり、例えば３：１～５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、次のカップリング反応を行いやすくする。
カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、以上のとおりである。当該カップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルアミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒、例えば１０～１００秒であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の選択と用量は、以上のとおりである。
酸化反応の条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であってもよく、反応時間が１～１００秒、例えば５～５０秒であってもよく、酸化試薬は、例えばヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態ではヨウ素水として提供する）。いくつかの実施形態では、酸化試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１：１～１００：１であり、例えば、５：１～５０：１であってもよい。いくつかの実施形態では、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行われる。
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。
Figure 2022533421000055
 式中、ｑ２、Ｒｋの定義は、前述したとおりである。
この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下及びアミド化反応縮合剤と第３級アミンの存在下で、式（３１４）に示される化合物を式（Ａ－１）に示される化合物又は式（Ａ－２）に示される化合物と接触させ、その後単離する、という調製方法により得ることができる。
Figure 2022533421000056
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記アミド化反応条件は、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が１～４８時間であってもよく、いくつかの実施形態では、前記アミド化反応条件は、反応温度が１０～４０℃であり、反応時間が２～１６時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記アルコール類溶剤は、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノールの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、エタノールである。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１４）に示される化合物に対して、有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、更なる実施形態において３～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩（４－（４，６－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルであり、更なる実施形態において、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１４）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、更なる実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミンと式（３１４）に示される化合物とのモル比が３：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１～１０：１である。
いくつかの実施形態において、式（Ａ－１）及び式（Ａ－２）に示される化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ－１）に示される化合物を調製することができる。同様に、３－アミノ－１，２－プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ－２）に示される化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４～１３、いくつかの実施形態において４～８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ－２）に示される化合物におけるｑ２の異なる値に対応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２＝２であり、類推してもよい。
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３－アミノ－１，２－プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（３１３）に示される化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、これらの変形は、式（３１３）に示される化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当業者が上記方法により容易に実現するものである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）に示される化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１３）に示される化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出すること、及び、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３１３）に示される化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級アミンの存在下で、縮合反応条件下で、式（３２０）に示される化合物を式（３１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
Figure 2022533421000057
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
式（３１６）に示される化合物としては、例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１４，１３６，１６９５８－１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式（３１６）に示される化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、米国特許ＵＳ ８，１０６，０２２ Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）に示される化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件は、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が０．１～２４時間であり、いくつかの実施形態では、反応温度が１０～４０℃であり、反応時間が０．５～１６時間である。
所望の生成物である式（３１４）に示される化合物の構造を考慮すると、前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３２０）に示される化合物とのモル比は、式（３２０）におけるｎ１とｎ３の和に基づいて決定されるべきである。いくつかの実施形態において、例えば、ｎ１＋ｎ３＝３の場合、反応が完全であり、過剰ではないことを確保するために、式（３１６）に示される化合物と前記式（３２０）に示される化合物とのモル比が３：１～３．５：１であってもよく、いくつかの実施形態において、３．０１：１～３．１５：１である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３２０）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩又は１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの１種又は複数種であり、更なる実施形態において、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物であり、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールが等モル量で使用される。前記全アミド化反応縮合剤と式（３１６）に示される化合物とのモル比は１：１～３：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１．０５：１～１．５：１である。
前記第３級アミンは、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルモルホリンであり、前記第３級アミンと式（３１６）に示される化合物とのモル比は２：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）に示される化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１４）に示される化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５～１００：７で勾配溶出すること、及び、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３１４）に示される化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
式（３２０）に示される化合物は、市販品として購入して、又は、当業者により既知の方法を用いて得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれもＨである場合、式（３２０）に示される化合物は、アルファ・エイサー社から市販品として購入することができる。
本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併用してもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと。
＜本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の使用＞
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、敗血症の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、敗血症の予防及び／又は治療方法を提供する。
本開示のｓｉＲＮＡ活性成分を、それを必要とする被験体に投与することにより、ＲＮＡ干渉機構により敗血症を予防及び／又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体は、敗血症の予防及び／又は治療に用いられ、又は敗血症の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。
いくつかの実施形態において、前記敗血症は、通常感染による全身性炎症反応症候群を指し、本質的には感染性因子に対する体の反応である。いくつかの実施形態において、敗血症は、常に重篤な疾患に罹患している患者、例えば重篤な火傷、多発損傷、外科手術後等の患者に発症する。いくつかの実施形態において、敗血症は、糖尿病、慢性閉塞性気管支疾患、白血病、再生不良性貧血及び尿路結石のような慢性疾患に罹患している患者にもよく見られている。
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化して所望の効果を生じさせる方法又は経路により、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体の体循環よりも多くのｓｉＲＮＡ複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体が被験体の基本的な体循環に送達される。本開示が敗血症の予防及び／又は治療手段を提供できるようにすることを考慮すると、いくつかの実施形態において、薬物を肝臓に送達することができる投与方法を採用する。
本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、経口投与又は胃腸外経路、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、半年又は１年に１回又は複数回であってもよい。
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定してもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０（５０％の群体を死亡させる用量）及びＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％の実験対象に陽性反応が発生するときの用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいて、ヒト用量の範囲を得ることができる。
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６～１２週齢、体重１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又は３０～４５ｇのｏｂ／ｏｂマウスに対して、ｓｉＲＮＡの量として、（ｉ）ｓｉＲＮＡ複合体について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態では０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．０５～２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、さらにいくつかの実施形態においては０．１～１５ｍｇ／ｋｇ体重であり、さらにいくつかの実施形態においては０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態では０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．０５～５ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．１～３ｍｇ／ｋｇ体重である。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を肝細胞と接触させ、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を前記肝細胞に導入し、ＲＮＡ干渉機構により肝細胞におけるＫＮＧ遺伝子の発現を抑制する目的を達成することを含む、前記肝細胞におけるＫＮＧ遺伝子の発現の抑制方法を提供する。前記肝細胞は、ＳＭＭＣ－７７２１、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７等の肝がん細胞系又は単離した初代肝細胞から選択されてもよい。
本開示により提供される方法により細胞におけるＫＮＧ遺伝子の発現を抑制する。提供される修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ用量は、一般的に、標的ｍＲＮＡの発現を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ～１μＭ、又は０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達経路（局所か全身か）等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
＜キット＞
本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の少なくとも１種の有効量を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器で修飾ｓｉＲＮＡを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、薬学的に許容できる賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等が含まれてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載された修飾ｓｉＲＮＡを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含んでもよい。
本開示のキットにおいて、前記ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体、及び／又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記薬物組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供することができる。
以下に実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何ら制限されない。
特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。
本開示により合成されたＫＮＧ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体又は陰性対照であるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体で細胞をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、具体的な操作については、メーカーにより提供される説明書を参照のこと。
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。
特に説明がない限り、以下に、体内／体外効果の実験データは、いずれも
Figure 2022533421000058
 で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェアを採用した。
（調製例１）
ｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰの調製
本調製例で、ｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰを合成した。当該ｓｉＲＮＡ複合体に複合されたｓｉＲＮＡは、表３におけるｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰに対応するセンス鎖とアンチセンス鎖配列を有する。
（１－１）Ｌ－１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｌ－１０化合物を合成した。
Figure 2022533421000059
（１－１－１）複合末端セグメントＧＡＬ－５の合成
Figure 2022533421000060
（１－１－１ａ）ＧＡＬ－２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ－１（Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１７７２－０３－８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ－２を得た。
（１－１－１ｂ）ＧＡＬ－３の合成
工程（１－１－１ａ）で得られたＧＡＬ－２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１３ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴及び窒素保護条件で、２４．０ｇのＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７－７７－８、マックリン社から購入、１０８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品ＧＡＬ－３を得た。
（１－１－１ｃ）ＧＡＬ－４の合成
工程（１－１－１ｂ）で得られたＧＡＬ－３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．０ｇの５－ヘキセン－１－オール（ＣＡＳ番号：８２１－４１－０、Ａｄａｍａｓ－ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴及び窒素保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ－４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
（１－１－１ｄ）ＧＡＬ－５の合成
工程（１－１－１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ－４（１４．９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：７７９０－２８－５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８－６７－０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。固形クエン酸で水相のｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．８５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ－５を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ １２．０１ （ｂｒ，１Ｈ），７．８３ （ｄ，Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ，１Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ，１Ｈ），４．９６ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．２，３．２ Ｈｚ，１Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ，１Ｈ），４．０７－３．９５ （ｍ，３Ｈ），３．９２－３．８５ （ｍ，１Ｈ），３．７４－３．６７ （ｍ，１Ｈ），３．４８－３．３９ （ｍ，１Ｈ），２．２０ （ｔ，Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ，２Ｈ），２．１１ （ｓ，３Ｈ），２．００ （ｓ，３Ｈ），１．９０ （ｓ，３Ｈ），１．７７ （ｓ，３Ｈ），１．５５－１．４５ （ｍ，４Ｈ）．
（１－１－２）Ｌ－８の合成
Figure 2022533421000061
Ｊ－０（９．８８６ｇ、５２．５ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）と工程（１－１－１）で得られたＧＡＬ－５（７２．８１９ｇ、１６２．７５ｍｍｏｌ、複数のロットの製品を組み合わせた）を５２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、４４．７８２ｇ、３４６．５０ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（ＰｙＢＯＰ、９０．１５８ｇ、１７３．２５ｍｍｏｌ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、２３．４１０ｇ、１７３．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で４ｈ反応させ、２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム及び２００ｍｌの飽和食塩水を加えて洗浄し、水相をジクロロメタンによって１回あたり１００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：２５～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３８．８ｇの純粋なＬ－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ ７．８４ （ｄ，Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ，３Ｈ），７．２７－７．２３ （ｍ，１Ｈ），７．１３－７．１８ （ｍ，１Ｈ），５．２２ （ｄ，Ｊ ＝ ３．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．９７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．３，３．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．４８ （ｄ，Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ，３Ｈ），４．０９－３．９８ （ｍ，９Ｈ），３．８８ （ｄｄ，Ｊ ＝ １９．３，９．３ Ｈｚ，３Ｈ），３．７５－３．６６ （ｍ，３Ｈ），３．４４－３．３８ （ｍ，３Ｈ），３．１７－３．３０ （ｍ，４Ｈ），３．１０－２．９７ （ｍ，４Ｈ），２．３５－２．２０ （ｍ，６Ｈ），２．１５－２．０８ （ｍ，９Ｈ），２．０７－１．９８ （ｍ，１３Ｈ），１．９４－１．８７ （ｍ，９Ｈ），１．８１－１．７４ （ｍ，９Ｈ），１．６５－１．４２ （ｍ，１８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
（１－１－３ａ）Ａ－１の合成
Figure 2022533421000062
ＤＭＴｒＣｌ（４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド、１０１．６５ｇ、３００ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ－グリセリン酸カルシウム水和物（２８．６３ｇ、１００ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２０ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥まで減圧濃縮し、残りを５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐＨ＝７～８）で、１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５～１：１：１：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１回洗浄し、水相を２００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩減圧し、５０．７ｇの白色固形製品Ａ－１を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４６ （ｄｄｄ，Ｊ ＝ ６．５，２．３，１．１ Ｈｚ，１Ｈ），７．４０－７．２８ （ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８１ （ｍ，４Ｈ），４．８４ （ｄ，Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．３６－４．２４ （ｍ，１Ｈ），４．２９ （ｓ，６Ｈ），３．９２ （ｄｄ，Ｊ ＝ １２．４，７．０ Ｈｚ，１Ｈ），３．６７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １２．３，７．０ Ｈｚ，１Ｈ），２．５２ （ｑ，Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ，６Ｈ），１．０３ （ｔ，Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ，９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６、［Ｍ－Ｈ］－、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。
（１－１－３ｂ）Ｌ－７の合成
Figure 2022533421000063
工程（１－１－２）で得られたＬ－８（４０ｇ、２７．０９ｍｍｏｌ、複数のロットの製品を組み合わせた）と工程（１－１－３ａ）で得られたＡ－１（４１．４１８ｇ、８１．２７ｍｍｏｌ）とを混合し、２７１ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（２４．３１８ｇ、８１．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（２１．００７ｇ、１６２．５４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１．５ｈ攪拌反応させ、８００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、１５０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相を５０ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、粗製品を得た。カラム精製には、２ｋｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２００ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して４０．４ｇの純粋なＬ－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ７．９０－７．７８ （ｍ，４Ｈ），７．７５－７．６４ （ｍ，１Ｈ），７．３８－７．１８ （ｍ，９Ｈ），６．９１－６．８３ （ｍ，４Ｈ），５．２５－５．１０ （ｍ，４Ｈ），４．９７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．２，３．２ Ｈｚ，３Ｈ），４．４８－４．３０ （ｍ，４Ｈ），４．０２ （ｓ，９Ｈ），３．９３－３．８４ （ｍ，３Ｈ），３．７６－３．６６ （ｍ，９Ｈ），３．４５－３．３５ （ｍ，３Ｈ），３．２４－２．９８ （ｍ，１０Ｈ），２．３０－２．２０ （ｍ，２Ｈ），２．１１－１．８８ （ｍ，３１Ｈ），１．８０－１．４０ （ｍ，２８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５、［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
（１－１－４）Ｌ－９の合成
Figure 2022533421000064
工程（１－１－３ｂ）で得られたＬ－７（４０ｇ、２１．４２４７ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（４．２８８ｇ、４２．８４９４ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、５．２３５ｇ、４２．８４９４ｍｍｏｌ）を混合して２１５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１３．８４５ｇ、１０７．１２３５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌し、８００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１ｋｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３１．０ｇの純粋なＬ－９複合分子を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ ８．５８ （ｄ，Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．９４－７．８２ （ｍ，３Ｈ），７．４１－７．２９ （ｍ，５Ｈ），７．２２ （ｄ，Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ，５Ｈ），６．８９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ，４Ｈ），５．４９－５．３７ （ｍ，１Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ，３Ｈ），４．９７ （ｄ，Ｊ ＝ １１．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ，３Ｈ），４．０２ （ｓ，９Ｈ），３．８８ （ｄｄ，Ｊ ＝ １９．４，９．４ Ｈｚ，３Ｈ），３．７７－３．６５ （ｍ，９Ｈ），３．５０－３．３９ （ｍ，６Ｈ），３．１１－２．９０ （ｍ，５Ｈ），２．６１－２．５４ （ｍ，４Ｈ），２．４７－２．４１ （ｍ，２Ｈ），２．２６－２．１７ （ｍ，２Ｈ），２．１５－１．９５ （ｍ，２２Ｈ），１．９２－１．８４ （ｍ，９Ｈ），１．８０－１．７０ （ｍ，１０Ｈ），１．６５－１．３５ （ｍ，１７Ｈ），１．３１－１．１９ （ｍ，４Ｈ），０．９６ （ｔ，Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ，９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８、［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１６６４．７２、実測値：１６６５．０３。
（１－１－５）Ｌ－１０化合物の合成
Figure 2022533421000065
この工程において、Ｌ－９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ－１０化合物を調製した。
工程（１－１－４）で得られたＬ－９複合分子（２２．７５１ｇ、１１ｍｍｏｌ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、６．２５７ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２．８４３ｇ、２２ｍｍｏｌ）を混合し、９００ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（８８ｇ、１００～２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を加え、２５℃で、シェーカーで反応を行い、回転数１５０回転／分間、１８ｈ反応させた後で濾過し、ケーキをＤＣＭで、１回あたり３００ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで、１回あたり３００ｍｌで３回リンスし、真空油ポンプで１８ｈ乾燥させ、その後表２に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング反応を行った。２５℃でシェーカーに静置し、回転数１５０回転／分間で５ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキをアセトニトリルで、１回あたり３００ｍｌで３回リンスし、乾燥まで溶剤を減圧蒸発させ、真空油ポンプで一晩減圧乾燥させ、１０２ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇのＬ－１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ－９複合分子）を得た。
Figure 2022533421000066
 ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積％のＮ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニトリル溶液である。
（１－２）ｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰのセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ－１０化合物を出発として循環させ、表３におけるＬ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰに対応するセンス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’－５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定した。
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の条件は同じであって、即ち温度が２５℃であり、反応時間が７０秒であり、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体における４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比が５：１であった。
各カップリング反応条件は、いずれも同じであって、温度が２５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５であり、反応時間が６００秒であり、カップリング試薬は、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（５－（Ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）－１Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｅ、ＥＴＴ）の０．５Ｍアセトニトリル溶液である
。
各キャッピング条件は、いずれも同じであって、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐＡとＣａｐＢの混合溶液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物：Ｎ－メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１であった。
各酸化反応の条件は同じであって、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であり、酸化試薬が濃度０．０５Ｍのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が３０：１であった。反応をテトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
最後のヌクレオシドモノマーの結合が完了した後、固相担体に結合される核酸配列に対して、切断、脱保護、精製、脱塩を順に行った後、凍結乾燥してセンス鎖を得た。
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、残りの担体を濾過除去し、上清を乾燥まで真空濃縮した。
精製と脱塩の条件は以下のとおりである。分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完了した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０～５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）であり、脱イオン水で溶出した。
検出方法は以下のとおりである。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）を用いてセンス鎖の純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析した。実測値が理論値に一致しており、３’末端にＬ－９複合分子が複合されたセンス鎖ＳＳが合成されたことを示した。
（１－３）ｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰのアンチセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、表３におけるＬ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰに対応するアンチセンス鎖のヌクレオチドの順序に従ってｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰのアンチセンス鎖を合成した。アンチセンス鎖に対しては、５’－末端の１番目のヌクレオチドに５’－リン酸ヌクレオチドを有するので、固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する過程において、アンチセンス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行ってＣＰＲ－Ｉモノマー（蘇州吉瑪、番号Ｃａｔ＃１３－２６０１－ＸＸ）をアンチセンス鎖の５’末端に結合し、５’－リン酸ヌクレオチド修飾を形成したこと以外は、固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩の条件は、センス鎖の合成と同じとした。
Figure 2022533421000067
当該結合において用いられた脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応の条件、切断と脱保護、精製と脱塩の条件は、センス鎖の合成と同じとした。その後、凍結乾燥してアンチセンス鎖を得た。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）によりアンチセンス鎖の純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析した。その結果、実測値が理論値に一致しており、目的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳが合成されたことを示した。
（１－４）ｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰの合成
（１－２）と（１－３）で得られたセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を得、得られた溶液を等モルのセンス鎖とアンチセンス鎖で混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、アニールを行った生成物を得、凍結乾燥させて、凍結乾燥粉末を得た。超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水装置、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いてｓｉＲＮＡ複合体を希釈して濃度を０．２ｍｇ／ｍＬとした後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。実測値が理論値と一致しており、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、Ｌ－９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。その構造は、式（４０３）に示される。前記ｓｉＲＮＡは、表３に示されるｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰに対応するセンス鎖とアンチセンス鎖配列を有する。
Figure 2022533421000068
 ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右の２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。
（調製例２～６）
本開示のｓｉＲＮＡ複合体の合成
それぞれ表３における各ｓｉＲＮＡ複合体に対応するｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖配列に従ってセンス鎖とアンチセンス鎖を合成したこと以外は、調製例１の方法に従い、表３に示される本開示のｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮｂ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＫＮｃ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＫＮｄ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＫＮｅ１Ｍ１ＳＰ及びＬ１０－ｓｉＫＮｆ１Ｍ１ＳＰを合成した。これらのｓｉＲＮＡ複合体に含まれるｓｉＲＮＡは、それぞれ表３における各ｓｉＲＮＡ複合体に対応するセンス鎖とアンチセンス鎖配列を有する。
調製が完了した後、調製例１の方法により、調製された各ｓｉＲＮＡ複合体の分子量をそれぞれ検出したところ、実測値が理論値と一致しており、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、Ｌ－９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。それらの構造はいずれも式（４０３）に示される。これらのｓｉＲＮＡ複合体に含まれるｓｉＲＮＡは、それぞれ表３に示されるｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮｂ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＫＮｃ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＫＮｄ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＫＮｅ１Ｍ１ＳＰ及びＬ１０－ｓｉＫＮｆ１Ｍ１ＳＰに対応する配列を有する。
（調製例７～１４及び比較調製例１５、１６）
＜ｓｉＲＮＡ配列の合成＞
固相合成方法によりそれぞれ表４に示されるｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成し、ＤＥＰＣ処理水を用いて等モルのセンス鎖とアンチセンス鎖の混合物を溶解させた後、アニールを行うことにより、ｓｉＲＮＡ二本鎖を形成し、ｓｉＫＮａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｂ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｃ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｄ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｅ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｆ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮａ０、ｓｉＫＮｃ０、ｓｉＫＮａ０－ｃｏｍ、ＮＣを得た。
Figure 2022533421000069
 ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右の２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す。
上記配列の調製過程において、目的配列に未修飾ヌクレオチドが含まれる場合、切断と脱保護条件で、アンモニア水で処理した後、一本鎖核酸の量に対して、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ－メチルピロリドンで製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースでの２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去した。調製例１の方法によりそれぞれ上記ｓｉＲＮＡの分子量を検出したところ、実測値が理論値と一致しており、得られたｓｉＲＮＡがそれぞれ表４に示される各ｓｉＲＮＡに対応する配列を有することが確認された。
上記の本開示のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体の調製が完了した後、固体粉末として凍結乾燥して保存した。使用する場合、例えば、注射用水、生理食塩水（ＮＳ）、リン酸緩衝液（ＰＢ）又はリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）等を用いて所望の濃度の溶液に改めて溶解させて使用することができる。
（実験例１）
本開示のｓｉＲＮＡの体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での抑制活性
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＨ－ＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）でＨＥＫ２９３Ａ細胞（南京科佰生物科技有限公司から購入）を５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
Ｋｕｍｉｃｏ Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ．ａｌ．， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ： ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｓｅｅｄ ａｒｍ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６－２１５１に記載の方法に従い、被検プラスミドを構築し、評価するｓｉＲＮＡとＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェクションし、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルから、ｓｉＲＮＡの抑制活性を反映した。具体的な工程は、以下のとおりである。
［１］被検プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドを用い、目的配列であるｓｉＲＮＡ標的配列を含む被検プラスミドを構築した。各被験ｓｉＲＮＡについて、目的配列は以下に示される。
ｓｉＫＮａ０の目的配列：
ＡＡＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴＧＴ（配列番号 ３９３）
ｓｉＫＮｃ０の目的配列：
ＴＣＧＡＡＴＴＡＣＣＴＡＣＴＣＡＡＴＴ（配列番号 ３９４）
目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２プラスミドのＸｈｏ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位にクローニングした。
［２］トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を８×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、１６時間後に細胞成長密度が７０～８０％になったとき、培養ウェル中のＨ－ＤＭＥＭ完全培地を全部吸引除去し、１ウェルごとに８０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を加えて培養を１．５時間継続した。
各ｓｉＲＮＡに対して、ＤＥＰＣ処理水により対応する被検プラスミドを希釈して２００ｎｇ／μｌの被検プラスミド希釈標準溶液（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とした。各ｓｉＲＮＡに対して、ＤＥＰＣ処理水によりｓｉＲＮＡを、濃度がそれぞれ１０ｎＭ、３ｎＭ及び１ｎＭ（ｓｉＲＮＡの量として）であるｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を作製した。
濃度が１０ｎＭであるｓｉＲＮＡ希釈標準溶液１μｌ、被検プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（被検プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む１Ａ１溶液を作製した。
濃度が３ｎＭであるｓｉＲＮＡ希釈標準溶液１μｌ、被検プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（被検プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む１Ａ２溶液を作製した。
濃度が１ｎＭであるｓｉＲＮＡ希釈標準溶液１μｌ、被検プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（被検プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む１Ａ３溶液を作製した。
０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００及び１０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含む１Ｂ溶液を作製した。
被検プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（被検プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む１Ｃ溶液を作製した。
各ｓｉＲＮＡに対して、それぞれ１つの１Ｂ溶液と１つの１Ａ１溶液、１つの１Ａ２溶液、１つの１Ａ３溶液を、室温で２０ｍｉｎ培養し、トランスフェクション複合体１Ｘ１、１Ｘ２、１Ｘ３をそれぞれ得た。１つの１Ｂ溶液と１つの１Ｃ溶液を混合し、室温下で２０ｍｉｎ培養してトランスフェクション複合体１Ｘ４を得た。
各ｓｉＲＮＡに対して、３つの培養ウェルに、仕込み量２０μｌ／ウェルでそれぞれトランスフェクション複合体１Ｘ１を加え、均一に混合し、ｓｉＲＮＡの最終濃度が約０．１ｎＭであるコトランスフェクション混合物を得、試験群１とした。
各ｓｉＲＮＡに対して、別の３つの培養ウェルに、仕込み量２０μｌ／ウェルでそれぞれトランスフェクション複合体１Ｘ２を加え、均一に混合し、ｓｉＲＮＡの最終濃度が約０．０３ｎＭであるコトランスフェクション混合物を得、試験群２とした。
各ｓｉＲＮＡに対して、別の３つの培養ウェルに、仕込み量２０μｌ／ウェルでそれぞれトランスフェクション複合体１Ｘ３を加え、均一に混合し、ｓｉＲＮＡの最終濃度が約０．０１ｎＭであるコトランスフェクション混合物を得、試験群３とした。
別の３つの培養ウェルに、仕込み量２０μｌ／ウェルでそれぞれトランスフェクション複合体１Ｘ４を加え、ｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション混合物を得、対照群とした。
ｓｉＲＮＡを含むコトランスフェクション混合物とｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション混合物を培養ウェルで４時間コトランスフェクションさせた後、１ウェルごとに２０％ＦＢＳ含有Ｈ－ＤＭＥＭ完全培地１００μｌを追加した。９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーターに入れて培養を２４時間継続した。
［３］検出
培養ウェル中の培地を吸引除去し、１ウェルごとに１５０μｌのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬とＨ－ＤＭＥＭとの混合溶液（体積比１：１）を加え、均一になるまで十分に混合し、室温で１０ｍｉｎ培養した後、混合液１２０μｌを９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに移し、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＩＩ多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いてＦｉｒｅｆｌｙ化学発光値（Ｆｉｒ）を読み取り、さらに各ウェルに６０μｌのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）試薬を加え、均一になるまで十分に混合し、室温で１０ｍｉｎ培養した後、読み取ったＦｉｒの並び方に従い、マイクロプレートリーダーを用いて各培養ウェルにおけるＲｅｎｉｌｌａの化学発光値（Ｒｅｎ）を読み取った。
各ウェルの発光比Ｒａｔｉｏ＝Ｒｅｎ／Ｆｉｒを算出し、各試験群又は対照群の発光比Ｒａｔｉｏ（試験）又はＲａｔｉｏ（対照）が３つの培養ウェルのＲａｔｉｏの平均であり、対照群の発光比を基準とし、各試験群の発光比を正規化し、Ｒａｔｉｏ（試験）／Ｒａｔｉｏ（対照）の比Ｒを得、それによりＲｅｎｉｌｌａレポーター遺伝子の発現レベル、即ち残存活性を表した。ｓｉＲＮＡの抑制率＝（１－Ｒ）×１００％である。
それぞれｓｉＫＮａ０、ｓｉＫＮｃ０をトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるＲｅｎｉｌｌａレポーター遺伝子の残存活性を図１に示した。
＜比較実験例１＞
参照ｓｉＲＮＡの体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での抑制活性
測定されたｓｉＲＮＡがそれぞれ参照ｓｉＲＮＡ ＮＣ及びｓｉＫＮａ０－ｃｏｍであったこと以外は、実験例２の方法に従い、参照ｓｉＲＮＡ ＮＣ及びｓｉＫＮａ０－ｃｏｍのｐｓｉＣＨＥＣＫシステムにおける残存活性を同時に調べた。
ｓｉＫＮａ０－ｃｏｍの目的配列：
ＣＣＡＡＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴ（配列番号 ３９５）
ＮＣの目的配列は、ｓｉＫＮａ０の目的配列と同じとした。
結果を図１に示した。
図１の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ａ細胞において目的配列に対していずれも優れた抑制作用を示し、かつ、濃度依存的な抑制率を示した。特に、ｓｉＲＮＡ濃度０．１ｎＭで、ｓｉＫＮａ０及びｓｉＫＮｃ０抑制率がいずれも７５％以上であり、良好なＫＮＧ遺伝子発現抑制効果を示した。これと鮮明に対比して、参照ｓｉＫＮａ０－ｃｏｍは、配列がｓｉＫＮａ０と非常に類似するものの、ｓｉＲＮＡ濃度０．１ｎＭでも、目的配列に対する抑制率が５０％未満であり、本開示のｓｉＲＮＡは、意外にも優れたＫＮＧ遺伝子発現抑制効果を示した。
（実験例２）
ｓｉＲＮＡによるｐｓｉＣＨＥＣＫシステムにおける目的配列に対するＩＣ５０の測定
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＨ－ＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）でＨＥＫ２９３Ａ細胞（南京科佰生物科技有限公司から購入）を５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて３７℃で培養した。
Ｋｕｍｉｃｏ Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ．ａｌ．， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ： ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｓｅｅｄ ａｒｍ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６－２１５１に記載の方法に従い、被検プラスミドを構築し、前記被検プラスミドと被験ｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェクションし、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮＡの目的配列抑制活性を反映した。具体的な工程は、以下のとおりである。
［１］被検プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドを用い、目的配列であるｓｉＲＮＡ標的配列を含む被検プラスミドを構築した。被験ｓｉＲＮＡについて、目的配列は以下に示される。
ｓｉＫＮａ１Ｍ１Ｓ目的配列：
ＣＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＡＴＧＧＴＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＴＡＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＡＡＡＴＧＧＣＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＴＴＡＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＣＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＡＴＣＡＡＴＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＡＣＡＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣ （配列番号 ３９６）
ｓｉＫＮｂ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｃ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｄ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｅ１Ｍ１Ｓ及びｓｉＫＮｆ１Ｍ１Ｓの目的配列：
ＣＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＡＴＧＧＴＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＴＡＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＡＡＡＴＧＧＣＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＴＴＡＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＣＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＡＴＣＡＡＴＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＡＣＡＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣ （配列番号 ３９７）
上記目的配列はいずれもヒトＫＮＧ ｍＲＮＡの遺伝子をコードする遺伝子断片であった。
目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２プラスミドのＸｈｏ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位にクローニングした。
［２］トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を８×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、１６時間後に細胞成長密度が７０～８０％になったとき、培養ウェル中のＨ－ＤＭＥＭ完全培地を全て吸引除去し、１ウェルごとに８０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を加えて培養を１．５時間継続した。
ＤＥＰＣ処理水により上記被検プラスミドを希釈して２００ｎｇ／μｌの被検プラスミド希釈標準溶液とした。ＤＥＰＣ処理水を用いて、ｓｉＫＮａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｂ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｃ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｄ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｅ１Ｍ１Ｓ及びｓｉＫＮｆ１Ｍ１Ｓの各ｓｉＲＮＡから、濃度が１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、０．７８１３ｎＭ及び０．３９０６ｎＭである計９種のｓｉＲＮＡ希釈標準溶液をそれぞれ作製した。
各ｓｉＲＮＡに対して、それぞれ２Ａ１～２Ａ９溶液を作製し、各２Ａ１～２Ａ９溶液は、上記９種の濃度のｓｉＲＮＡ希釈標準溶液１μｌ、被検プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（被検プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを順に含む。
１つの１Ｂ溶液と得られた各ｓｉＲＮＡの１つの２Ａ１～２Ａ９の溶液をそれぞれ混合し、それぞれ室温で２０ｍｉｎ培養し、各ｓｉＲＮＡのトランスフェクション複合体２Ｘ１～２Ｘ９を得た。
培養ウェルに、仕込み量２０μｌ／ウェルで各ｓｉＲＮＡのトランスフェクション複合体２Ｘ１～２Ｘ９をそれぞれ加え、均一に混合し、各ｓｉＲＮＡの最終濃度がそれぞれ約１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１２５ｎＭ、０．０６２５ｎＭ、０．０３１２５ｎＭ、０．０１５６２５ｎＭ、０．００７８１３ｎＭ及び０．００３９０６ｎＭであるトランスフェクション複合体を得、各ｓｉＲＮＡのトランスフェクション複合体２Ｘ１～２Ｘ９でそれぞれ３つの培養ウェルをトランスフェクションし、ｓｉＲＮＡを含むコトランスフェクション混合物を得、試験群とした。
別の３つの培養ウェルに、仕込み量２０μｌ／ウェルでトランスフェクション複合体１Ｘ３をそれぞれ加え、ｓｉＲＮＡを含まないコトランスフェクション混合物を得、対照群とした。
ｓｉＲＮＡを含むコトランスフェクション混合物とｓｉＲＮＡを含まないコトランスフェクション混合物を培養ウェルで４時間トランスフェクションさせた後、１ウェルごとに２０％ＦＢＳ含有Ｈ－ＤＭＥＭ完全培地１００μｌを追加した。９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーターに入れて培養を２４時間継続した。
［３］検出
培養ウェル中の培地を吸引除去し、１ウェルごとに１５０μｌのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬とＨ－ＤＭＥＭとの混合溶液（体積比１：１）を加え、均一になるまで十分に混合し、室温で１０ｍｉｎ培養した後、混合液１２０μｌを９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに移し、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＩＩ多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート上の各培養ウェルにおけるＦｉｒｅｆｌｙの化学発光値（Ｆｉｒ）を読み取り、さらに９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート上の各ウェルに６０μｌのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）試薬を加え、均一になるまで十分に混合し、室温で１０ｍｉｎ培養した後、読み取ったＦｉｒの並び方に従い、マイクロプレートリーダーを用いて９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート上の各培養ウェルにおけるＲｅｎｉｌｌａの化学発光値（Ｒｅｎ）を読み取った。
９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート上の各ウェルの発光比Ｒａｔｉｏ＝Ｒｅｎ／Ｆｉｒを算出し、各試験群又は対照群の発光比Ｒａｔｉｏ（試験）又はＲａｔｉｏ（対照）が３つの培養ウェルのＲａｔｉｏの平均であり、対照群の発光比を基準とし、各試験群の発光比を正規化し、Ｒａｔｉｏ（試験）／Ｒａｔｉ（対照）の比Ｒを得、それによりＲｅｎｉｌｌａレポーター遺伝子の相対発現レベル、即ち残存活性を表す。ｓｉＲＮＡの目的配列に対する抑制率＝（１－Ｒ）×１００％である。
濃度の異なる被験ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、ＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるＲｅｎｉｌｌａの相対残存活性から、Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウェアの非直線回帰分析機能によりｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ （ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）用量－効果曲線をフィッティングし、図２Ａ～図２Ｆは順にｓｉＫＮａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｂ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｃ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｄ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｅ１Ｍ１Ｓ及びｓｉＫＮｆ１Ｍ１Ｓの用量－効果曲線を示している。ここで、ｓｉＲＮＡの最終濃度の常用対数値（ｌｇｎＭ）を横座標とし、Ｒｅｎｉｌｌａの相対残存活性（％）を縦座標とし、各黒丸は、対照群に対して試験群の３つの培養ウェルにおけるＲｅｎｉｌｌａの相対残存活性の平均を表す。
フィッティングされた用量－効果曲線に対応する以下のような関数から、被験ｓｉＲＮＡが目的配列を標的するＩＣ５０値を算出した。
Figure 2022533421000070
 式中、
Ｙは、比Ｒ、即ちＲｅｎｉｌｌａの相対残存活性であり、
Ｘは、トランスフェクションｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
Ｘ’は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合に対応するＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線のＸ’における傾きである。
当該用量－効果曲線及び対応する関数から、Ｙ＝５０％である場合に対応するＸ５０値を決定し、各ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値＝１０＾Ｘ５０（ｎＭ）を算出し、ＩＣ５０値を表５にまとめた。
Figure 2022533421000071
図２Ａ～図２Ｆ及び上記表５の結果から分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、体外ＨＥＫ２９３Ａ細胞における目的配列抑制活性が高く、ＩＣ５０が、０．００４８～０．２３２８ｎＭであった。
（実験例３）
本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体のヒト化マウス体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での活性の測定
本試験例で使用されたヒト化マウスの構築は、蘇州大学唐仲英血液学研究中心に委託し、６～８週齢のヒト化マウスを、４匹／群（２匹が雄で２匹が雌である）でランダムに分け、各群のマウスに対してそれぞれ６ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡとして）で、ｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＫＮｃ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＫＮｅ１Ｍ１ＳＰ及びＬ１０－ｓｉＫＮｆ１Ｍ１ＳＰ並びに対照として生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）を皮下注射により単回投与した。各ｓｉＲＮＡ複合体が０．６ｍｇ／ｍＬ（ｓｉＲＮＡとして）の０．９％塩化ナトリウム水溶液として投与され、投与体積がいずれも１０ｍＬ／ｋｇであった。
その後２８日目に動物を死亡させ、それぞれ各マウスの肝組織を回収し、肝臓の左大葉を約１００ｍｇ／マウス取り、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、次に各マウスの肝組織に対して、それぞれ組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて説明書に記載された操作工程に従って抽出して各マウスの肝組織の全ＲＮＡを得た。
ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、その説明書に従って抽出された全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡを含む溶液を得、次に蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）で肝組織におけるＫＮＧ ｍＲＮＡの発現量を検出したこと以外は、実験例２の方法に従い、蛍光定量的ＰＣＲ検出並びにＫＮＧ ｍＲＮＡの相対発現レベル及び抑制率の算出を行った。当該蛍光定量的ＰＣＲ法において、β－ａｃｔｉｎ遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＫＮＧに対するプライマー及びβ－ａｃｔｉｎ遺伝子に対するプライマーを用いてそれぞれＫＮＧ及びβ－ａｃｔｉｎ遺伝子を検出した。検出プライマーの配列を表６に示した。ＫＮＧ ｍＲＮＡ発現量及び抑制率の算出において、対照群は、本実験においてＰＢＳが投与された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が投与された投与群マウスであった。対照群のＫＮＧ ｍＲＮＡ発現量を１００％とし、これに応じて、ＫＮＧ ｍＲＮＡ発現量抑制率を０％とし、試験結果は、対照群のＫＮＧ ｍＲＮＡ発現量で標準化したものであり、結果を表６に示した。
Figure 2022533421000072
比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法を用い、各試験群及び対照群における目的遺伝子ＫＮＧの発現量について相対定量計算を行い、計算方法は以下のとおりである。
ΔＣｔ（試験群）＝Ｃｔ（試験群の目的遺伝子）－Ｃｔ（試験群の内因性参照遺伝子）
ΔＣｔ（対照群）＝Ｃｔ（対照群の目的遺伝子）－Ｃｔ（対照群の内因性参照遺伝子）
ΔΔＣｔ（試験群）＝ΔＣｔ（試験群）－ΔＣｔ（対照群の平均）
ΔΔＣｔ（対照群）＝ΔＣｔ（対照群）－ΔＣｔ（対照群の平均）
ここで、ΔＣｔ（対照群の平均）は、対照群における各マウスそれぞれのΔＣｔ（対照群）の算術平均である。したがって、試験群及び対照群の各マウスはいずれも１つのΔΔＣｔ値に対応している。
対照群を基準とし、試験群のＫＮＧ ｍＲＮＡの発現レベルを正規化し、対照群のＫＮＧ ｍＲＮＡの発現レベルを１００％と定義した。
試験群のＫＮＧ ｍＲＮＡの相対発現レベル＝２－ΔΔＣｔ（試験群）×１００％である。
同一試験群のｓｉＲＮＡに対して、試験群のＫＮＧ ｍＲＮＡの相対発現レベルの平均は、当該濃度で各群のマウスの相対発現レベルの算術平均である。
試験結果は、対照群のＫＮＧ ｍＲＮＡ発現量で標準化したものであり、結果を表７に示した。表７において、ヒトＫＮＧ ｍＲＮＡ抑制率は、対応するｓｉＲＮＡ複合体が投与されたマウスヒトＫＮＧ ｍＲＮＡ抑制率の平均値及びその標準偏差である。
Figure 2022533421000073
表７の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト化マウス肝臓においてヒトＫＮＧ ｍＲＮＡに対していずれも優れた抑制効果を示し、ＫＮＧ ｍＲＮＡに対する抑制率が４８．３５％～５６．２９％であった。
（実験例４）
本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体のヒト化マウス体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのＫＮＧタンパク濃度に対する影響の測定
本実験例で使用されたヒト化マウスは、実験例３と同じとした。試験群では、６～８週齢のヒト化マウスを２匹用い、各マウスに対して、それぞれ６ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡとして）のｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰを皮下注射により単回投与した。ｓｉＲＮＡ複合体Ｌ１０－ｓｉＫＮａ１Ｍ１ＳＰは、０．６ｍｇ／ｍＬ（ｓｉＲＮＡとして）の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積はいずれも１０ｍＬ／ｋｇマウス体重とした。別の１匹のヒト化マウスに対して１×ＰＢＳを投与し、投与体積が１０ｍＬ／ｋｇマウス体重であり、対照群とした。
それぞれ投与当日及び投与後７日目、１４日目、２１日目及び２８日目にマウスを各々採血し（上記各時点を順にＤ０、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８と記載した）、全血サンプルを得た。各マウスの全血サンプルに、抗凝固剤と全血の体積比が１：９（ｖ／ｖ）となる割合で３．８ｗｔ％クエン酸ナトリウム水溶液抗凝固剤を加え、遠心単離し、上清である被験血漿サンプルを得、－８０℃で保存した。
６×タンパクローディングバッファー（ＤＴＴ含有、北京拜爾迪生物技術有限公司から購入、番号ＤＥ０１０５－１ｍＬ）を無菌水で希釈して２×タンパクローディングバッファーとした。それぞれ試験群及び対照群のマウス計３匹のうちの各匹の被験血漿サンプル５μＬを、異なる１．５ｍＬ遠心管に加え、さらに各遠心管にそれぞれ無菌水５μＬ及び２×タンパクローディングバッファー１５μＬを加え、均一に混合した後、金属浴にて１００℃で１０分間変性させ、タンパクサンプル液を得た。
１０％分離用ゲル及び４％濃縮用ゲルを作製した。２００ｍＬの５×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動バッファー（北京拜爾迪生物技術有限公司から購入、番号ＤＥ０１００－５００）に水を加えて８００ｍＬとし、均一に混合して、希釈バッファーを得た。電気泳動槽に希釈バッファーを注いだ。調製された各タンパクサンプル液からそれぞれ１０μＬをとり、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの異なるゲル孔にそれぞれ加え、別のゲル孔にタンパクマーカー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、番号２６６３４）を加え、定電圧１２０Ｖで８０分間電気泳動した後、電気泳動を停止した。
１０×タンパク電気泳動転移バッファー（北京拜爾迪生物技術有限公司、番号ＤＥ０１８１－５００ｍＬ）１００ｍＬに水を加えて８００ｍＬとし、さらに２００ｍＬの無水メタノールを加え、均一に混合し、希釈転移バッファーを得た。メタノールにポリフッ化ビニリデンフィルム（以下、ＰＶＤＦフィルム）を２分間浸した後、希釈転移バッファーにスポンジ、ろ紙及びＰＶＤＦフィルムを浸した。ゲルプレートからゲルを取り出し、下から負極板（黒）─スポンジ─ろ紙─ゲル─ＰＶＤＦフィルム─ろ紙─スポンジ─正極板（白）の順にサンドイッチ板を作り、転写槽に入れた。転写槽をアイスボックスに置き、定電圧１００Ｖで１時間転写した。
転写が完了したＰＶＤＦフィルムを取り出し、８０～１５０ＫＤのタンパクマーカーに対応するＰＶＤＦフィルムをせん断し、せん断したＰＶＤＦフィルムを５ｗｔ％脱脂乳（脱脂粉乳は北京索莱宝科技有限公司から購入、番号Ｄ８３４０）に浸し、シェーカーで２時間ブロッキングした。５ｗｔ％脱脂乳を用いて１：１５００の体積比で一次抗体（ａｎｔｉ－ｈ－ＫＮＧ（蘇州大学唐仲英血液学研究中心から購入））を希釈し、４℃で徹夜培養し、培養したＰＶＤＦフィルムを得た。
２０×ＴＢＳバッファー（北京拜爾迪生物技術有限公司から購入、番号ＤＥ０１９０－５００）５０ｍＬに、１Ｌになるまで水を加えて希釈し、さらに１０００μｌのＴｗｅｅｎ－２０（北京索莱宝科技有限公司から購入、番号Ｔ８２２０）を加えて均一に混合した後、ＴＢＳＴバッファーを作製した。
過剰のＴＢＳＴバッファーで上記培養したＰＶＤＦフィルムを一回に５分間、３回溶出した後、５ｗｔ％脱脂乳を用いて１：２０００の体積比で二次抗体（ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（北京中杉金橋生物技術有限公司から購入、番号ＺＢ－２３０１））を希釈し、室温で１時間シェーカー培養した後、過剰のＴＢＳＴバッファーを用いてＰＶＤＦフィルムを一回に５分間、３回溶出した。洗浄したＰＶＤＦフィルムを得た。
Ｗｅｓｔｅｒｎ発光検出キット（Ｖｉｇｏｒｏｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（北京）有限公司から購入、番号Ｐ００４）を用い、説明書に記載の工程にしたがってタンパク質ブロットを撮影し、具体的な工程として、１：１（ｖ／ｖ）の割合でＡ液とＢ液（Ｗｅｓｔｅｒｎ発光検出キットに含まれる）を混合し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ反応基質液（ＨＲＰ反応基質）を得、洗浄したＰＶＤＦフィルムにＨＲＰ反応基質を塗布した。
ＨＲＰ反応基質を塗布したＰＶＤＦフィルムをイメージャーに置き、説明書に記載の方法に従って明視野モードでタンパクマーカーを撮影した。化学発光モードでタンパク発光バンドを撮影し、露光時間が１０ｍｉｎであった。
タンパクマーカーの撮影結果から分かるように、対照群及び異なる時点での各試験群はいずれも、鮮明なタンパクマーカーを示した。そして、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによりタンパクマーカーを分析し、それぞれ対照群及び異なる時点での各試験群のタンパクブロットバンドの光強度値を得た。分析により、各試験群は、対照群及びＤ０のデータと比べて、投与後の異なる時点でタンパクブロットバンドの光強度値がいずれも顕著に低下したことが判明した。
さらに、対照群のタンパクブロットバンドの光強度値を基準とし、試験群の各時点でのＫＮＧタンパクブロットバンドの光強度値を標準化し、対照群のタンパク発現レベルを１００％と定義し、試験群のＫＮＧタンパクの相対発現レベルは、以下の式により算出した。
ＫＮＧタンパク相対発現レベル＝（試験群ＫＮＧタンパクブロットバンドの光強度値／対照群ＫＮＧタンパクブロットバンドの光強度値）×１００％
ＫＮＧタンパク発現に対する抑制率＝（１－ＫＮＧタンパクの相対発現レベル）×１００％
試験群については、相対発現レベル及び抑制率は、２匹のマウスの試験結果の算術平均である。
図３には、対照群及び異なる採血時点での試験群サンプルのＫＮＧタンパクの相対発現レベルを示した。
図３の結果から分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、マウス体内で被験血漿サンプルにおいてＫＮＧタンパクに対して優れた抑制作用を示した。本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、２８日間の長期間にわたって、被験血漿サンプルでのＫＮＧタンパク抑制率がいずれも９７％以上、ひいては約９９％にも達しており、抑制効果が顕著であった。このことから、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ＫＮＧタンパクの発現を効果的に抑制することができ、したがってＫＮＧ関連疾患、特に敗血症の治療において優れた応用の見込みがあることがわかる。
以上、本開示のいくつかの実施形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段に対して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護範囲に属する。
このほかに説明すべきこととして、上記いくつかの実施形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本開示の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきである。

Claims (71)

  1. センス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、以下のｉ）～ｖｉ）に示す配列から選択される１つであり、
    ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ１－３’（配列番号 １）、
    ５’－Ｚ２ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵ－３’（配列番号 ２）
    ただし、Ｚ１はＵであり、Ｚ２はＡであり、
    前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１に対応するヌクレオチドＺ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２に対応するヌクレオチドＺ４が含まれ、前記Ｚ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ５－３’（配列番号 ６１）、
    ５’－Ｚ６ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵ－３’（配列番号 ６２）
    ただし、Ｚ５はＣであり、Ｚ６はＧであり、
    前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ５に対応するヌクレオチドＺ７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ６に対応するヌクレオチドＺ８が含まれ、前記Ｚ８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ９－３’（配列番号 １２１）、
    ５’－Ｚ１０ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡ－３’（配列番号 １２２）
    ただし、Ｚ９はＵであり、Ｚ１０はＡであり、
    前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ９に対応するヌクレオチドＺ１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１０に対応するヌクレオチドＺ１２が含まれ、前記Ｚ１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１３－３’（配列番号 １８１）、
    ５’－Ｚ１４ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣ－３’（配列番号 １８２）
    ただし、Ｚ１３はＡであり、Ｚ１４はＵであり、
    前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１３に対応するヌクレオチドＺ１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１４に対応するヌクレオチドＺ１６が含まれ、前記Ｚ１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１７－３’（配列番号 ２４１）、
    ５’－Ｚ１８ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣ－３’（配列番号 ２４２）
    ただし、Ｚ１７はＵであり、Ｚ１８はＡであり、
    前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１７に対応するヌクレオチドＺ１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１８に対応するヌクレオチドＺ２０が含まれ、前記Ｚ２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２１－３’（配列番号 ３０１）、
    ５’－Ｚ２２ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵ－３’（配列番号 ３０２）
    ただし、Ｚ２１はＵであり、Ｚ２２はＡであり、
    前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ２１に対応するヌクレオチドＺ２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２２に対応するヌクレオチドＺ２４が含まれ、前記Ｚ２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである、ｓｉＲＮＡ。
  2. 前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ６１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ６２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １２１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １２２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １８１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １８２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ２４１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２４２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ３０１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ３０２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  3. 前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ４の位置での差異を含み、Ｚ４がＵ、Ｃ又はＧから選択され、
    或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ６２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ８の位置での差異を含み、Ｚ８がＡ、Ｕ又はＣから選択され、
    或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １２２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ１２の位置での差異を含み、Ｚ１２がＵ、Ｃ又はＧから選択され、
    或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 １８２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ１６の位置での差異を含み、Ｚ１６がＡ、Ｃ又はＧから選択され、
    或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ２４２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ２０の位置での差異を含み、Ｚ２０がＵ、Ｃ又はＧから選択され、
    或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号 ３０２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ２４の位置での差異を含み、Ｚ２４がＵ、Ｃ又はＧから選択される、請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。
  4. Ｚ３は、Ｚ４と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ７は、Ｚ８と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１１は、Ｚ１２と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１５は、Ｚ１６と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１９は、Ｚ２０と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ２３は、Ｚ２４と相補的なヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  5. 前記センス鎖とアンチセンス鎖の長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが１９～２６ヌクレオチドであり、
    前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 ３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 ４に示されるヌクレオチド配列であり、
    ５’－ＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ３－３’（配列番号 ３）、
    ５’－Ｚ４ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵ－３’（配列番号 ４）
    ただし、Ｚ４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ３は、Ｚ４と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 ６３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 ６４に示されるヌクレオチド配列であり、
    ５’－ＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ７－３’（配列番号 ６３）、
    ５’－Ｚ８ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵ－３’（配列番号 ６４）
    ただし、Ｚ８は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ７は、Ｚ８と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 １２３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 １２４に示されるヌクレオチド配列であり、
    ５’－ＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号 １２３）、
    ５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡ－３’（配列番号 １２４）
    ただし、Ｚ１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１１は、Ｚ１２と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 １８３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 １８４に示されるヌクレオチド配列であり、
    ５’－ＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１５－３’（配列番号 １８３）、
    ５’－Ｚ１６ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣ－３’（配列番号 １８４）
    ただし、Ｚ１６は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１５は、Ｚ１６と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 ２４３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 ２４４に示されるヌクレオチド配列であり、
    ５’－ＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１９－３’（配列番号 ２４３）、
    ５’－Ｚ２０ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣ－３’（配列番号 ２４４）
    ただし、Ｚ２０は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１９は、Ｚ２０と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号 ３０３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号 ３０４に示されるヌクレオチド配列であり、
    ５’－ＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２３－３’（配列番号 ３０３）、
    ５’－Ｚ２４ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵ－３’（配列番号 ３０４）
    ただし、Ｚ２４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２３は、Ｚ２４と相補的なヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  6. Ｚ３はＵであり、Ｚ４はＡであり、或いは、Ｚ７はＣであり、Ｚ８はＧであり、或いは、Ｚ１１はＵであり、Ｚ１２はＡであり、或いは、Ｚ１５はＡであり、Ｚ１６はＵであり、或いは、Ｚ１９はＵであり、Ｚ２０はＡであり、或いは、Ｚ２３はＵであり、Ｚ２４はＡである、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
  7. 前記センス鎖が、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶの長さはそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩはヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、ヌクレオチド配列ＩＶはヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１～６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  8. 前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡＣＣであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵＧＧであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＵＵであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 １８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡＣＡであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧＡであり、
    或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号 ３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＧＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＧＣである、請求項７に記載のｓｉＲＮＡ。
  9. 前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’突出端を構成する、請求項１～８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  10. 前記ヌクレオチド配列Ｖの長さが２ヌクレオチドである、請求項９に記載のｓｉＲＮＡ。
  11. 前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である、請求項９又は１０に記載のｓｉＲＮＡ。
  12. 前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号 ６に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ３－３’（配列番号 ５）、
    ５’－Ｚ４ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵＧＧ－３’（配列番号 ６）
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号 ８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＣＣＡＡＡＧＵＡＡＣＡＡＣＣＡＧＵＵＵＧＺ３－３’（配列番号 ７）、
    ５’－Ｚ４ＣＡＡＡＣＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＵＵＧＧＵＵ－３’（配列番号 ８）
    ただし、前記Ｚ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ４は、Ｚ３と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ６６に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ７－３’（配列番号 ６５）、
    ５’－Ｚ８ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵＣＣ－３’（配列番号 ６６）
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ６８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＧＧＡＵＵＧＡＡＣＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＺ７－３’（配列番号 ６７）、
    ５’－Ｚ８ＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵＵＣＡＡＵＣＣＡＧ－３’（配列番号 ６８）
    ただし、前記Ｚ８は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ７は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ８は、Ｚ７と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 １２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 １２６に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号 １２５）、
    ５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡ－３’（配列番号 １２６）
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 １２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 １２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＣＣＵＡＣＵＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号 １２７）、
    ５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＡＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＵ－３’（配列番号 １２８）
    ただし、前記Ｚ１２は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１１は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１２は、Ｚ１１と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 １８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 １８６に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１５－３’（配列番号 １８５）、
    ５’－Ｚ１６ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣＵＧ－３’（配列番号 １８６）
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 １８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 １８８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＣＡＧＡＵＡＡＵＧＣＡＵＡＣＡＵＣＧＡＵＺ１５－３’（配列番号 １８７）、
    ５’－Ｚ１６ＡＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＣＡＵＵＡＵＣＵＧＵＡ－３’（配列番号 １８８）
    ただし、前記Ｚ１６は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１５は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１６は、Ｚ１５と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ２４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ２４６に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１９－３’（配列番号 ２４５）、
    ５’－Ｚ２０ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣＵＣ－３’（配列番号 ２４６）
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ２４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ２４８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＧＡＧＡＡＵＡＡＣＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＺ１９－３’（配列番号 ２４７）、
    ５’－Ｚ２０ＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵＵＡＵＵＣＵＣＵＧ－３’（配列番号 ２４８）
    ただし、前記Ｚ２０は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１９は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２０は、Ｚ１９と相補的なヌクレオチドであり、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ３０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ３０６に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２３－３’（配列番号 ３０５）、
    ５’－Ｚ２４ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣ－３’（配列番号 ３０６）
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号 ３０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号 ３０８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＧＣＡＡＣＵＵＵＣＵＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＺ２３－３’（配列番号 ３０７）、
    ５’－Ｚ２４ＡＵＣＵＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＡＧＵＵＧＣＧＵ－３’（配列番号 ３０８）
    ただし、前記Ｚ２４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ２３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２４は、Ｚ２３と相補的なヌクレオチドである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  13. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＫＮａ１、ｓｉＫＮａ２、ｓｉＫＮｂ１、ｓｉＫＮｂ２、ｓｉＫＮｃ１、ｓｉＫＮｃ２、ｓｉＫＮｄ１、ｓｉＫＮｄ２、ｓｉＫＮｅ１、ｓｉＫＮｅ２、ｓｉＫＮｆ１及びｓｉＫＮｆ２である、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  14. 前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  15. 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  16. 前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの少なくとも第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの少なくとも第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１５に記載のｓｉＲＮＡ。
  17. ５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。
  18. 各非フルオロ修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  19. ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドが、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであり、ヌクレオチドアナログが、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである、請求項１８に記載のｓｉＲＮＡ。
  20. 各非フルオロ修飾ヌクレオチドが、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項１５～１９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  21. ５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、請求項１７に記載のｓｉＲＮＡ。
  22. ｓｉＫＮａ１－Ｍ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ２、ｓｉＫＮａ１－Ｍ３、ｓｉＫＮａ２－Ｍ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ２、ｓｉＫＮａ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ２、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ２、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ２、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ２、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ３、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ２、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ３、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ２及びｓｉＫＮｆ２－Ｍ３のいずれか１つである、請求項１～２１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  23. 前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基のリン酸ジエステル結合中の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項１４に記載のｓｉＲＮＡ。
  24. 前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項１４又は２３に記載のｓｉＲＮＡ。
    Figure 2022533421000074
  25. 前記ｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基が、
    前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
    前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項２３又は２４に記載のｓｉＲＮＡ。
  26. ｓｉＫＮａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ２Ｓ及びｓｉＫＮｆ２－Ｍ３Ｓのいずれか１つである、請求項１～２５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  27. ｓｉＫＮａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｄ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｅ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＫＮｆ２－Ｍ２ＳＰ１及びｓｉＫＮｆ２－Ｍ３ＳＰ１のいずれか１つである、請求項１～２６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  28. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
  29. 前記ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体の重量比が１：（１～５００）である、請求項２８に記載の薬物組成物。
  30. 前記ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体の重量比が１：（１～５０）である、請求項２９に記載の薬物組成物。
  31. 前記薬学的に許容可能な担体が有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を含み、前記有機アミンが式（２０１）に示される化合物及び／又はその薬学的に許容できる塩であり、
    Figure 2022533421000075
     式中、
    各Ｘ１０１又はＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ－Ａ又はＣ－Ａであり、Ａは水素又はＣ１－Ｃ２０炭化水素鎖であり、
    各Ｙ１０１又はＺ１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ－ＯＨ又はＳＯ２であり、
    各Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６又はＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
    ｘが１～１０の整数であり、
    ｎが１～３の整数であり、ｍが０～２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
    ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成し、
    Figure 2022533421000076
     式中、ｇ、ｅ又はｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）における窒素原子を表す、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の薬物組成物。
  32. 前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンであり、
    Figure 2022533421000077
     前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
    前記ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジパルミトアミド－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］－２０００である、請求項３１に記載の薬物組成物。
  33. 前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７～８０）：（１９．７～８０）：（０．３～５０）である、請求項３１又は３２に記載の薬物組成物。
  34. 前記有機アミン、前記補助脂質、前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（５０～７０）：（２０～４０）：（３～２０）である、請求項３３に記載の薬物組成物。
  35. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含む、ｓｉＲＮＡ複合体。
  36. 前記複合基が薬学的に許容できる標的基及びリンカーを含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合的又は非共有結合的に結合される、請求項３５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  37. 前記リンカーは、式（３０１）に示される構造を有し、
    Figure 2022533421000078
     式中、ｋは１～３の整数であり、
    ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合され、
    Figure 2022533421000079
     ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ－アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素原子を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合され、
    Figure 2022533421000080
     ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２～４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記ＬＢ部に結合される、請求項３６に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  38. 前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０５）に示される構造を有し、
    Figure 2022533421000081
     式中、二重螺旋構造は、前記ｓｉＲＮＡを表す、請求項３５～３７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  39. 前記リンカーは、式（３０６）に示される構造を有し、
    Figure 2022533421000082
     式中、ｌは０～３の整数であり、
    ＊は、前記リンカーでエーテル結合により前記標的基に結合される部位を表し、
    ＃は、前記リンカーでリン酸エステル結合により前記ｓｉＲＮＡに結合される部位を表す、請求項３８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  40. 前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０７）に示される構造を有し、
    Figure 2022533421000083
     式中、二重螺旋構造は、前記ｓｉＲＮＡを表す、請求項３５、３６及び３９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  41. 前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項３６～４０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  42. 前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０８）に示される構造を有し、
    Figure 2022533421000084
     式中、
    ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり、
    各ｍ１、ｍ２又はｍ３はそれぞれ独立して、２～１０から選択される整数であり、
    Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
    Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基であり、
    Figure 2022533421000085
     式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは請求項１～２６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡであり、
    Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
    各Ｌ１は独立して、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
    Figure 2022533421000086
    は、基が共有結合的に結合する部位を表し、
    Ｍ１は標的基を表す、請求項３５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  43. 各Ｌ１は、独立して基Ａ１～Ａ２６及びその任意の組合せからなる群から選択され、
    Figure 2022533421000087
     式中、各ｊ１は独立して１～２０の整数であり、
    各ｊ２は独立して１～２０の整数であり、
    各Ｒ’は独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、
    各Ｒａは独立してＡ２７～Ａ４５基及びその任意の組合せからなる群から選択され、
    Figure 2022533421000088
     各Ｒｂは独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、
    Figure 2022533421000089
    は、基が共有結合的に結合する部位を表す、請求項４２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  44. Ｌ１は、基Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３及びその結合の組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  45. Ｌ１は、基Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１のうちの少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  46. Ｌ１は、基Ａ１、Ａ８及びＡ１０のうちの少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  47. Ｌ１の長さが３～２５個の原子である、請求項４２～４６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  48. Ｌ１の長さが４～１５個の原子である、請求項４７に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  49. ｊ１は２～１０の整数であり、ｊ２は２～１０の整数であり、Ｒ’は、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、Ｒｂは、Ｃ１－Ｃ５アルキルである、請求項４３～４８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  50. ｊ１は３～５の整数であり、ｊ２は３～５の整数であり、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つであり、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８であり、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである、請求項４９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  51. ｎ１は１～２の整数であり、ｎ３は０～１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２～３である、請求項４２～５０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  52. 各ｍ１、ｍ２又はｍ３はそれぞれ独立して２～５の整数である、請求項４２～５１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  53. ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項４２～５２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  54. 各前記標的基が独立して哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体と親和力のあるリガンドである、請求項３５～５３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  55. 各前記標的基が独立してアシアロ糖タンパク質又は糖である、請求項５４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  56. 各前記標的基が、Ｄ－マンノピラノース、Ｌ－マンノピラノース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－キシロフラノース、Ｌ－キシロフラノース、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、α－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－マンノピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニルガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブチリルガラクトサミン、Ｎ－イソブチリルガラクトサミン、２－アミノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－１－カルボキシエチル］－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノース、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジデオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デオキシ－２－スルホアミノ－Ｄ－グルコピラノース、Ｎ－グリコリル－α－ノイラミン酸、５－チオ－β－Ｄ－グルコピラノース、メチル２，３，４－トリス－Ｏ－アセチル－１－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチオ－α－Ｄ－グルコヘプトピラノシド、２，５－アンヒドロ－Ｄ－アロニトリル、リボース、Ｄ－リボース、Ｄ－４－チオリボース、Ｌ－リボース、Ｌ－４－チオリボースから独立して選択される１つである、請求項５５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  57. 前記標的基の少なくとも１つ又は各々がガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンである、請求項５６に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  58. Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、独立してＨ、メチル基又はエチル基である、請求項４２～５７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  59. Ｒ２に窒素含有骨格上のＮに結合される部位及びＲ３中のＰ原子に結合される部位が含まれる、請求項４３～５８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  60. Ｒ２の前記窒素含有骨格上のＮに結合される部位がＮとアミド結合を形成し、前記Ｒ３におけるＰ原子に結合される部位がＰとリン酸エステル結合を形成する、請求項４２～５９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  61. Ｒ２が、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’から選択され、
    Figure 2022533421000090
     は、基が共有結合的に結合する部位を表し、ｑ２が１～１０の整数である、請求項４２～６０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  62. ｑ２は１～５の整数である、請求項６１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  63. 当該ｓｉＲＮＡ複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項３５、４２～６２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
    Figure 2022533421000091
    Figure 2022533421000092
    Figure 2022533421000093
    Figure 2022533421000094
    Figure 2022533421000095
    Figure 2022533421000096
    Figure 2022533421000097
  64. 式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、前記端部とは、前記センス鎖又はアンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す、請求項４２～６３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  65. 式Ａ５９におけるＰ原子は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合される、請求項６４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  66. 式Ａ５９におけるＰ原子は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項６５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  67. 式Ａ５９におけるＰ原子は、リン酸ジエステル結合により前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合される、請求項４２～６６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  68. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３５～６７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体の、敗血症の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用。
  69. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３５～６７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体の有効量を敗血症に罹患している被験体に投与することを含む、敗血症の治療及び／又は予防方法。
  70. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３５～６７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体の有効量を前記肝細胞と接触させることを含む、ＫＮＧ遺伝子発現の抑制方法。
  71. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３５～６７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含むキット。
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