JP2023171772A - 複合体及びその調製方法と使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】活性薬物と複合体を形成することにより活性薬物を送達するための化合物及びその調製方法と使用法を提供する。【解決手段】本開示は、活性剤、例えばオリゴヌクレオチドと複合体を形成するための化合物であって、式(321)に示される構造を有する化合物を提供する。本開示は、対応する複合体をさらに提供する。本開示の複合体は、肝細胞を特異的に標的し、オリゴヌクレオチド薬物の体内送達に関連する問題を効果的に解決でき、毒性が低く、送達されるオリゴヌクレオチドの高度な安定化を維持するとともに、優れた送達効率をさらに有する。TIFF2023171772000155.tif39156【選択図】図16
Description
本開示は、薬物の分野に関し、具体的には、活性薬物と複合体を形成することにより活
性薬物を送達するための化合物及びその調製方法と使用に関する。本開示は、さらに当該
化合物により形成された複合体に関する。
性薬物を送達するための化合物及びその調製方法と使用に関する。本開示は、さらに当該
化合物により形成された複合体に関する。
低分子核酸薬物の開発では、送達系は、キー技術の一つである。
そのうち、肝細胞に対する標的複合送達技術である低分子核酸送達系がある。
本発明の1つの側面によれば、本開示は、式(321)に示される構造を有する化合物
を提供する。
を提供する。
n1は1~3の整数であり、n3は0~4の整数であり、
各m1、m2及びm3は、それぞれ独立して2~10の整数であり、R10、R11、
R12、R13、R14及びR15は、それぞれ独立してH、C1-C10アルキル基、
C1-C10ハロゲン化アルキル基及びC1-C10アルコキシ基から選択され、
R4は、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各L1は、長さ1~70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数
の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニ
レン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロ
シクリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1
つ又は複数で任意に置換され、L1は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール
基、C5-C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C
10アルキル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH
、-OC1-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C
10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化
アルキル基、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-N
H2、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C
10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基
)、-NH(C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-
C(O)O(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-
C10アルキル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC
(O)(C1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C1
0アルキル)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(
O)(フェニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アル
キルフェニル基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C
10アルキル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-S
O2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C
10アルキル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル
基)、-NHSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル
基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各S1は独立してM1であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒド
ロキシ保護基で保護され、
各M1が、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。
いくつかの実施形態において、各L1は独立してA1~A26の基及びその任意の組合
せからなる群から選択される。
せからなる群から選択される。
各j2は独立して1~20の整数であり、
各R’は独立してC1-C10アルキル基であり、
各Raは独立してA27~A45及びその任意の組合せからなる群から選択される。
本発明の1つの側面において、本開示は、式(1)に示される構造を有する複合体を提
供する。
供する。
n1は1~3の整数であり、n3は0~4の整数であり、
m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2~10の整数であり、
R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1-C
10アルキル基、C1-C10ハロゲン化アルキル又はC1-C10アルコキシ基から選
択され、
R3は活性薬物であり、
R2は、長さ1~20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の
炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニレ
ン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロシ
クリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ
又は複数で任意に置換され、R2は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基
、C5-C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C1
0アルキル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、
-OC1-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C1
0アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化ア
ルキル基、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH
2、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C1
0アルキル基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基)
、-NH(C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C
(O)O(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C
10アルキル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(
O)(C1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10
アルキル)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O
)(フェニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキ
ルフェニル基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C1
0アルキル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO
2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C1
0アルキル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基
)、-NHSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基
)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各L1は独立して、長さ1~70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1
又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10
アルケニレン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C1
8ヘテロシクリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるい
ずれか1つ又は複数で任意に置換され、L1は、C1-C10アルキル基、C6-C10
アリール基、C5-C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-O
C1-C10アルキル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキ
ル-OH、-OC1-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-S
C1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハ
ロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アル
キル-NH2、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(
C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフ
ェニル基)、-NH(C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO
2H、-C(O)O(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)
(C1-C10アルキル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、
-NHC(O)(C1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C
1-C10アルキル)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキ
ル)C(O)(フェニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C
10アルキルフェニル基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)
C1-C10アルキル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基
)、-SO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(
C1-C10アルキル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10
アルキル基)、-NHSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化
アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各M1は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される1つである。
いくつかの実施形態において、各L1は、A1~A26の基及びその任意の組合せから
なる群から独立して選択される。
なる群から独立して選択される。
各j2は独立して1~20の整数であり、
各R’は独立してC1-C10アルキル基であり、
各Raは、独立して式A27~A45の基及びその任意の組合せから選択される。
本発明の1つの側面において、本明細書は、本明細書で開示された複合体の、肝細胞に
おける特定の遺伝子の発現による病理状態又は疾患の治療及び/又は予防のための薬物の
調製における使用を提供する。
おける特定の遺伝子の発現による病理状態又は疾患の治療及び/又は予防のための薬物の
調製における使用を提供する。
本発明の1つの側面において、本明細書は、被験体に本明細書で開示された複合体の有
効量を投与することを含む、必要のある被験体において、肝細胞における特定の遺伝子の
発現による病理状態又は疾患を治療する方法を提供する。
効量を投与することを含む、必要のある被験体において、肝細胞における特定の遺伝子の
発現による病理状態又は疾患を治療する方法を提供する。
本発明の1つの側面において、本明細書は、本明細書で開示された複合体と接触させる
ことを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
ことを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
本発明の1つの側面において、本明細書は、本明細書で開示された複合体を含むキット
を提供する。
を提供する。
本開示の他の特徴と利点については、以下の文章において詳しく説明する。
[引用による組み込み]
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許又は特
許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用によ
り本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許又は特
許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用によ
り本明細書に組み込まれる。
添付の請求項では、本発明の新規な特徴を詳しく説明しており、本発明の特徴と利点に
ついては、説明的な実施形態について述べた以下の詳しい記載及び図面によって、よりよ
く理解されるであろう。これらの説明的な実施形態は、本発明の原理を利用するものであ
る。
siRNA複合体の体外トリトソーム(Tritosome)における安定性試験の半定量的結果を示す。
試験siRNA複合体の体外でのヒト血漿における安定性試験の半定量的結果を示す。
試験siRNA複合体の体外でのサル血漿における安定性試験の半定量的結果を示す。
10mg/kgの用量で、ラット血漿における複合体24(図4)、10mg/kgの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体24(図5)、50mg/kgの用量で、ラット血漿における複合体24(図6)、50mg/kgの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体24(図7)、10mg/kgの用量で、ラット血漿における複合体25(図8)、10mg/kgの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体25(図9)、50mg/kgの用量で、ラット血漿における複合体25(図10)、50mg/kgの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体25(図11)、のPK/TK血漿濃度又は組織濃度の経時的代謝曲線を示す。
複合体24がGSCMの発現を抑制するIC50値の測定を示し、それぞれGSSM、PSCM及びPSSMと比較する。
本開示の複合体による体内でのHBV mRNAに対する抑制作用を示す。
本開示の複合体によるHBVトランスジェニックマウスの血清中のHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
本開示の複合体によるHBVトランスジェニックマウスの血清中のHBV DNA発現に対する経時的な抑制作用を示す。
本開示の複合体25によるHBVトランスジェニックマウスの血清中のHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
本開示の複合体によるM-TgモデルにおけるHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
本開示の複合体によるM-TgモデルにおけるHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
本開示の複合体による1.28copyのHBV-TgモデルにおけるHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
本開示の複合体による標的mRNAとオフターゲットmRNAに対する抑制作用を示す。
本開示の複合体による体内でのHBV mRNAに対する抑制作用を示す。
本開示の複合体によるHBVトランスジェニックマウスの血清中のHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
本開示の複合体によるHBVトランスジェニックマウスの血清中のHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
85日目における本開示の複合体によるHBV mRNAに対する体内抑制作用を示す。
複合体43によるHBVトランスジェニックマウスの血清中のHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
複合体43によるHBVトランスジェニックマウスの血清中のHBV DNA発現に対する経時的な抑制作用を示す。
複合体167のヒト由来とマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を示す。
複合体168による1.28copyのHBV-TgモデルにおけるHBsAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
複合体168による1.28copyのHBV-TgモデルにおけるHBeAg発現に対する経時的な抑制作用を示す。
複合体168による1.28copyのHBV-TgモデルにおけるHBV DNA発現に対する経時的な抑制作用を示す。
14日目及び28日目のANGPTL mRNA発現の抑制率を示す。
本開示の複合体による脂質に対する抑制率を示し、血清中の総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)で表す。
複合体115による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)で表す。
複合体115及び111による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)で表す。
異なる用量で複合体111による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)で表す。
複合体25及び169による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)で表す。
ANGPTL mRNA発現の抑制率を示す。
14日目の、肝臓におけるAPOC3発現の抑制率を示す
異なる用量の複合体144による脂質に対する抑制率を示し、血清総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)で表す。
異なる用量の複合体170による脂質に対する抑制率を示し、血清総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)で表す。
本開示の複合体による脂質に対する抑制率を示し、血清総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)で表す。
ついては、説明的な実施形態について述べた以下の詳しい記載及び図面によって、よりよ
く理解されるであろう。これらの説明的な実施形態は、本発明の原理を利用するものであ
る。
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される
発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、いかなる
点でも本開示を限定することを意図しない。
発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、いかなる
点でも本開示を限定することを意図しない。
(定義)
本開示の文脈において、特に説明がない限り、大文字C、G、U及びAは、ヌクレオチ
ドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2
’-メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接
する1つのヌクレオチドが2’-フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字s
は、当該文字sの左右に隣接する2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結
合されていることを表し、P1は、当該P1の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’
-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、特
に、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてVPで表される)、
5’-リン酸ヌクレオチド(以下の実施例においてPで表される)又は5’-チオリン酸
エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてPsで表される)を指している。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、大文字C、G、U及びAは、ヌクレオチ
ドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2
’-メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接
する1つのヌクレオチドが2’-フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字s
は、当該文字sの左右に隣接する2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結
合されていることを表し、P1は、当該P1の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’
-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、特
に、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてVPで表される)、
5’-リン酸ヌクレオチド(以下の実施例においてPで表される)又は5’-チオリン酸
エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてPsで表される)を指している。
本開示の文脈において、説明される「相補」又は「逆相補」は、互換的に使用されても
よく、本分野において周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基のそ
れぞれと他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。DNAにおいて、
プリン塩基であるアデニン(A)は、常にピリミジン塩基であるチミン(T)(又は、R
NAにおいてウラシル(U)である)と対合し、プリン塩基であるグアニン(G)は、常
にピリミジン塩基であるシトシン(C)と対合する。各塩基対は、いずれも1つのプリン
と1つのピリミジンを含む。鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン(又はウラシル)
と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖が相補的であり
、鎖の塩基配列がその相補鎖の配列から推知できると考えられる。これに応じて、「ミス
マッチ」は、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しない
ことを意味する。
よく、本分野において周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基のそ
れぞれと他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。DNAにおいて、
プリン塩基であるアデニン(A)は、常にピリミジン塩基であるチミン(T)(又は、R
NAにおいてウラシル(U)である)と対合し、プリン塩基であるグアニン(G)は、常
にピリミジン塩基であるシトシン(C)と対合する。各塩基対は、いずれも1つのプリン
と1つのピリミジンを含む。鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン(又はウラシル)
と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖が相補的であり
、鎖の塩基配列がその相補鎖の配列から推知できると考えられる。これに応じて、「ミス
マッチ」は、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しない
ことを意味する。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的である」とは、2つ
のヌクレオチド配列間に3つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「基本的に完
全に逆相補的である」とは、2つのヌクレオチド配列間に1つ以下の塩基ミスマッチが存
在することを指し、「完全に逆相補的である」とは、2つのヌクレオチド配列間に塩基ミ
スマッチが存在しないことを指す。
のヌクレオチド配列間に3つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「基本的に完
全に逆相補的である」とは、2つのヌクレオチド配列間に1つ以下の塩基ミスマッチが存
在することを指し、「完全に逆相補的である」とは、2つのヌクレオチド配列間に塩基ミ
スマッチが存在しないことを指す。
本開示の文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列との間の「
ヌクレオチド差異」とは、ヌクレオチド配列間に同じ位置のヌクレオチドの塩基が変化し
たことを指し、例えば、第2の配列においてヌクレオチド塩基がAであり、第1の配列の
同じ位置での塩基がU、C、G又はTである場合に、当該位置で2つの配列間にヌクレオ
チド差異が存在すると考えられる。いくつかの実施形態において、ある位置のヌクレオチ
ドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを用いる場合、当該位置でヌ
クレオチド差異が存在するとも考えられる。
ヌクレオチド差異」とは、ヌクレオチド配列間に同じ位置のヌクレオチドの塩基が変化し
たことを指し、例えば、第2の配列においてヌクレオチド塩基がAであり、第1の配列の
同じ位置での塩基がU、C、G又はTである場合に、当該位置で2つの配列間にヌクレオ
チド差異が存在すると考えられる。いくつかの実施形態において、ある位置のヌクレオチ
ドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを用いる場合、当該位置でヌ
クレオチド差異が存在するとも考えられる。
本開示の文脈において、特に本開示に記載された複合分子又はsiRNA複合体の調製
方法を説明する際に、特に説明がない限り、ヌクレオシドモノマー(nucleosid
e monomer)とは、調製するRNA配列に応じて、前記「未修飾又は修飾RNA
ホスホルアミダイト(unmodified or modified RNA pho
sphoramidite)」がそれぞれいわれる固相ホスホルアミダイト合成に用いら
れることを指す。固相ホスホルアミダイト合成は、本分野においてRNAを合成する周知
の方法である。本開示の他の場所で、RNAホスホルアミダイトは、ヌクレオシドホスホ
ルアミダイト(nucleoside phosphoramidite)とも呼ばれる
。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
方法を説明する際に、特に説明がない限り、ヌクレオシドモノマー(nucleosid
e monomer)とは、調製するRNA配列に応じて、前記「未修飾又は修飾RNA
ホスホルアミダイト(unmodified or modified RNA pho
sphoramidite)」がそれぞれいわれる固相ホスホルアミダイト合成に用いら
れることを指す。固相ホスホルアミダイト合成は、本分野においてRNAを合成する周知
の方法である。本開示の他の場所で、RNAホスホルアミダイトは、ヌクレオシドホスホ
ルアミダイト(nucleoside phosphoramidite)とも呼ばれる
。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
本明細書で用いられる場合、2つの文字間又は記号間のものでないダッシュ(「-」)
は、置換基の結合点を示すために用いられている。例えば、-C1-C10アルキル-N
H2は、C1-C10アルキル基により結合する。
は、置換基の結合点を示すために用いられている。例えば、-C1-C10アルキル-N
H2は、C1-C10アルキル基により結合する。
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は
状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに当該記載が事象又は状況が発生
した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換されたアルキル」は
、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。1又は複数の置換
基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及
び/又は本質的に不安定ないかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されない
と、当業者に理解される。
状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに当該記載が事象又は状況が発生
した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換されたアルキル」は
、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。1又は複数の置換
基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及
び/又は本質的に不安定ないかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されない
と、当業者に理解される。
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分
岐鎖を指し、前記特定の数は、通常1~20個の炭素原子、例えば、1~10個の炭素原
子、1~8個又は1~6個の炭素原子である。例えば、C1-C6アルキルは、1~6個
の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を言及
する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。した
がって、例えば、「ブチル」は、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル及びtert
-ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、n-プロピル及びイソプロピルを含む。
アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが2つの結合点を有
する残基を指す。
岐鎖を指し、前記特定の数は、通常1~20個の炭素原子、例えば、1~10個の炭素原
子、1~8個又は1~6個の炭素原子である。例えば、C1-C6アルキルは、1~6個
の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を言及
する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。した
がって、例えば、「ブチル」は、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル及びtert
-ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、n-プロピル及びイソプロピルを含む。
アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが2つの結合点を有
する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも1つの炭素-炭素二重結
合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素-炭素二重結合は、親アルキ
ルの隣接する炭素原子から1分子の水素を除去することにより得られる。当該基は、二重
結合がシス又はトランス配置であってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、
プロパ-1-エン-1-イル、プロパ-1-エン-2-イル、プロパ-2-エン-1-イ
ル(アリル)、プロパ-2-エン-2-イル等のプロペニルと、ブタ-1-エン-1-イ
ル、ブタ-1-エン-2-イル、2-メチルプロパ-1-エン-1-イル、ブタ-2-エ
ン-1-イル、ブタ-2-エン-2-イル、ブタ-1,3-ジエン-1-イル、ブタ-1
,3-ジエン-2-イル等のブテニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形
態において、アルケニルは、2~20個の炭素原子を有するが、他の実施形態においては
、2~10個、2~8個又は2~6個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニル
のサブセットであり、アルケニルと同じであるが2つの結合点を有する残基を指す。
合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素-炭素二重結合は、親アルキ
ルの隣接する炭素原子から1分子の水素を除去することにより得られる。当該基は、二重
結合がシス又はトランス配置であってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、
プロパ-1-エン-1-イル、プロパ-1-エン-2-イル、プロパ-2-エン-1-イ
ル(アリル)、プロパ-2-エン-2-イル等のプロペニルと、ブタ-1-エン-1-イ
ル、ブタ-1-エン-2-イル、2-メチルプロパ-1-エン-1-イル、ブタ-2-エ
ン-1-イル、ブタ-2-エン-2-イル、ブタ-1,3-ジエン-1-イル、ブタ-1
,3-ジエン-2-イル等のブテニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形
態において、アルケニルは、2~20個の炭素原子を有するが、他の実施形態においては
、2~10個、2~8個又は2~6個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニル
のサブセットであり、アルケニルと同じであるが2つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも1つの炭素-炭素三重結
合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素-炭素三重結合は、親アル
キルの隣接する炭素原子から2分子の水素を除去することにより得られる。典型的なアル
キニルとしては、エチニルと、プロパ-1-イン-1-イル、プロパ-2-イン-1-イ
ル等のプロピニルと、ブタ-1-イン-1-イル、ブタ-1-イン-3-イル、ブタ-3
-イン-1-イル等のブチニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態にお
いて、アルキニルは、2~20個の炭素原子を有するが、他の実施形態においては、2~
10、2~8又は2~6個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセッ
トであり、アルキニルと同じであるが2つの結合点を有する残基を指す。
合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素-炭素三重結合は、親アル
キルの隣接する炭素原子から2分子の水素を除去することにより得られる。典型的なアル
キニルとしては、エチニルと、プロパ-1-イン-1-イル、プロパ-2-イン-1-イ
ル等のプロピニルと、ブタ-1-イン-1-イル、ブタ-1-イン-3-イル、ブタ-3
-イン-1-イル等のブチニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態にお
いて、アルキニルは、2~20個の炭素原子を有するが、他の実施形態においては、2~
10、2~8又は2~6個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセッ
トであり、アルキニルと同じであるが2つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭
素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、
n-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、2-ペンチル
オキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、2-ヘキシルオキ
シ、3-ヘキシルオキシ、3-メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常1~
10個、1~8個、1~6個又は1~4個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、
n-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、2-ペンチル
オキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、2-ヘキシルオキ
シ、3-ヘキシルオキシ、3-メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常1~
10個、1~8個、1~6個又は1~4個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、環炭素原子から水素原子を除去するこ
とにより芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される基を指す。前記芳香族単環
式又は多環式炭化水素環系は、水素及び6~18個の炭素原子の炭素のみを含有し、この
環系中の環の少なくとも1つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う
環状、非局在化(4n+2)π-電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレ
ニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサ
ブセットであり、アリールと同じであるが2つの結合点を有する残基を指す。
とにより芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される基を指す。前記芳香族単環
式又は多環式炭化水素環系は、水素及び6~18個の炭素原子の炭素のみを含有し、この
環系中の環の少なくとも1つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う
環状、非局在化(4n+2)π-電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレ
ニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサ
ブセットであり、アリールと同じであるが2つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「シクロアルキル」とは、通常3~7個の環炭素原子を有
する非芳香族炭素環を指す。環は、飽和であってもよいし、1又は複数の炭素-炭素二重
結合を有してもよい。シクロアルキルの実例としては、シクロプロピル、シクロブチル、
シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニル、並びにノル
ボルナン(norbornane)等の架橋及びカゴ状環状基を含む。
する非芳香族炭素環を指す。環は、飽和であってもよいし、1又は複数の炭素-炭素二重
結合を有してもよい。シクロアルキルの実例としては、シクロプロピル、シクロブチル、
シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニル、並びにノル
ボルナン(norbornane)等の架橋及びカゴ状環状基を含む。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロゲン」とは、フルオロ、ク
ロロ、ブロモ及びヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を
含む。
ロロ、ブロモ及びヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を
含む。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が1又
は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル
基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル
、2-フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル
基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル
、2-フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
「複素環基」とは、2~12個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される1~
6個のヘテロ原子とを含む、安定した3~18員非芳香族環状基を指す。明細書において
特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋
環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。1又は
複数の窒素原子(存在する場合)は、任意に4級化される。複素環基は、一部飽和又は完
全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することが
できる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル[1,3]ジ
スルホニル(thienyl[1,3]dithianyl)、デカヒドロイソキノリニ
ル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、
モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、2-オキサピペ
ラジニル、2-オキサピペリジル、2-オキサピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリ
ジル、ピペラジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル
、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスルホニル(trithianyl)、テ
トラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、1-オキソチオモルホリニ
ル及び1,1-ジオキソチオモルホリニルを含むが、これらに限定されない。
6個のヘテロ原子とを含む、安定した3~18員非芳香族環状基を指す。明細書において
特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋
環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。1又は
複数の窒素原子(存在する場合)は、任意に4級化される。複素環基は、一部飽和又は完
全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することが
できる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル[1,3]ジ
スルホニル(thienyl[1,3]dithianyl)、デカヒドロイソキノリニ
ル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、
モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、2-オキサピペ
ラジニル、2-オキサピペリジル、2-オキサピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリ
ジル、ピペラジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル
、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスルホニル(trithianyl)、テ
トラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、1-オキソチオモルホリニ
ル及び1,1-ジオキソチオモルホリニルを含むが、これらに限定されない。
「ヘテロアリール」とは、2個~17個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択さ
れる1~6個のヘテロ原子とを含む、3~18員芳香族環ラジカルから誘導される基を指
す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であっ
てもよく、この環系中の環の少なくとも1つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッ
ケル理論に従う環状非局在化(4n+2)π-電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環
又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。1又は複
数の窒素原子(存在する場合)は、任意に4級化される。ヘテロアリールは、環中の任意
の原子により分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル
、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、1,3-ベンゾジオキサゾリ
ル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ[d]チアゾリル、ベンゾチアジアゾリ
ル、ベンゾ[b][1,4]ジオキセピニル(benzo[b][1,4]dioxep
inyl)、ベンゾ[b][1,4]オキサジニル、1,4-ベンゾジオキサニル、ベン
ゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル(benzodioxol
yl)、ベンゾジジオキシニル(benzodioxinyl)、ベンゾピラニル、ベン
ゾピロニル、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ[3
,2-d]ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ[4,6]イミダゾ[1,2-a
]ピリジル、カルバゾリル、シンノリル、シクロペンタ[d]ピリミジニル、6,7-ジ
ヒドロ-5H-シクロペンタ[4,5]チエノ[2,3-d]ピリミジニル、5,6-ジ
ヒドロベンゾ[h]キナゾリニル、5,6-ジヒドロベンゾ[h]シンノリル、6,7-
ジヒドロ-5H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-c]ピリダジニル、ジベンゾ
フリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ[3,2-c]ピリジル、5
,6,7,8,9,10-ヘキサヒドロシクロオクタ[d]ピリミジニル、5,6,7,
8,9,10-ヘキサヒドロシクロオクタ[d]ピリダジニル、5,6,7,8,9,1
0-ヘキサヒドロシクロオクタ[d]ピリジル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダ
ゾリル、インドール、インダゾリル、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル
、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、5,8-メタノール-5,6,7
,8-テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジニル、1,6-ナフチリジノニル、オキサ
ジアゾリル、2-オキサアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、5,6,6a,7,
8,9,10,10a-オクタヒドロベンゾ[H]キナゾリニル、1-フェニル-1H-
ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリ
ジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジニル、ピリ
ジル、ピリド[3,2-d]ピリミジニル、ピリド[3,4-d]ピリミジニル、ピラジ
ニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリ
ル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、5,6,7,8-テトラヒドロキナゾリニル
、5,6,7,8-テトラヒドロベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d]ピリミジニル、
6,7,8,9-テトラヒドロ-5H-シクロヘプタ[4,5]チエノ[2,3-d]ピ
リミジニル、5,6,7,8-テトラヒドロピリド[4,5-c]ピリダジニル、チアゾ
リル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ[2,3-
d]ピリミジニル、チエノ[3,2-d]ピリミジニル、チエノ[2,3-c]ピリジル
及びチオフェニル(即ち、チエニル)を含むが、これらに限定されない。
れる1~6個のヘテロ原子とを含む、3~18員芳香族環ラジカルから誘導される基を指
す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であっ
てもよく、この環系中の環の少なくとも1つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッ
ケル理論に従う環状非局在化(4n+2)π-電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環
又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。1又は複
数の窒素原子(存在する場合)は、任意に4級化される。ヘテロアリールは、環中の任意
の原子により分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル
、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、1,3-ベンゾジオキサゾリ
ル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ[d]チアゾリル、ベンゾチアジアゾリ
ル、ベンゾ[b][1,4]ジオキセピニル(benzo[b][1,4]dioxep
inyl)、ベンゾ[b][1,4]オキサジニル、1,4-ベンゾジオキサニル、ベン
ゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル(benzodioxol
yl)、ベンゾジジオキシニル(benzodioxinyl)、ベンゾピラニル、ベン
ゾピロニル、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ[3
,2-d]ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ[4,6]イミダゾ[1,2-a
]ピリジル、カルバゾリル、シンノリル、シクロペンタ[d]ピリミジニル、6,7-ジ
ヒドロ-5H-シクロペンタ[4,5]チエノ[2,3-d]ピリミジニル、5,6-ジ
ヒドロベンゾ[h]キナゾリニル、5,6-ジヒドロベンゾ[h]シンノリル、6,7-
ジヒドロ-5H-ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2-c]ピリダジニル、ジベンゾ
フリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ[3,2-c]ピリジル、5
,6,7,8,9,10-ヘキサヒドロシクロオクタ[d]ピリミジニル、5,6,7,
8,9,10-ヘキサヒドロシクロオクタ[d]ピリダジニル、5,6,7,8,9,1
0-ヘキサヒドロシクロオクタ[d]ピリジル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダ
ゾリル、インドール、インダゾリル、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル
、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、5,8-メタノール-5,6,7
,8-テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジニル、1,6-ナフチリジノニル、オキサ
ジアゾリル、2-オキサアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、5,6,6a,7,
8,9,10,10a-オクタヒドロベンゾ[H]キナゾリニル、1-フェニル-1H-
ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリ
ジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジニル、ピリ
ジル、ピリド[3,2-d]ピリミジニル、ピリド[3,4-d]ピリミジニル、ピラジ
ニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリ
ル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、5,6,7,8-テトラヒドロキナゾリニル
、5,6,7,8-テトラヒドロベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d]ピリミジニル、
6,7,8,9-テトラヒドロ-5H-シクロヘプタ[4,5]チエノ[2,3-d]ピ
リミジニル、5,6,7,8-テトラヒドロピリド[4,5-c]ピリダジニル、チアゾ
リル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ[2,3-
d]ピリミジニル、チエノ[3,2-d]ピリミジニル、チエノ[2,3-c]ピリジル
及びチオフェニル(即ち、チエニル)を含むが、これらに限定されない。
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は
、化学官能基を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質
的に損傷することなく分子中の当該官能基に付加する、及びそれから除去することができ
る。代表的なヒドロキシ保護基は、Beaucageら、Tetrahedron 19
92,48,2223~2311、及びGreeneとWuts,Protective
Groups in Organic Synthesis,第二版、第二章、Joh
n Wiley & Sons,New York,1991に開示されており、それら
は、それぞれ引用により全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態におい
て、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去されることができる。いく
つかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例として
は、ジメトキシトリチル(DMT)、モノメトキシトリチル、9-フェニルキサンテン-
9-イル(Pixyl)「9-phenylxanthen-9-yl(Pixyl)」
及び9-(p-メトキシフェニル)キサンテン-9-イル(Mox)「9-(p-met
hoxyphenyl)xanthen-9-yl(Mox)」を含む。いくつかの実施
形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Tr(
トリチル)、MMTr(4-メトキシトリチル)、DMTr(4,4’-ジメトキシトリ
チル)及びTMTr(4,4’,4’’-トリメトキシトリチル)を含む。
、化学官能基を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質
的に損傷することなく分子中の当該官能基に付加する、及びそれから除去することができ
る。代表的なヒドロキシ保護基は、Beaucageら、Tetrahedron 19
92,48,2223~2311、及びGreeneとWuts,Protective
Groups in Organic Synthesis,第二版、第二章、Joh
n Wiley & Sons,New York,1991に開示されており、それら
は、それぞれ引用により全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態におい
て、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去されることができる。いく
つかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例として
は、ジメトキシトリチル(DMT)、モノメトキシトリチル、9-フェニルキサンテン-
9-イル(Pixyl)「9-phenylxanthen-9-yl(Pixyl)」
及び9-(p-メトキシフェニル)キサンテン-9-イル(Mox)「9-(p-met
hoxyphenyl)xanthen-9-yl(Mox)」を含む。いくつかの実施
形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Tr(
トリチル)、MMTr(4-メトキシトリチル)、DMTr(4,4’-ジメトキシトリ
チル)及びTMTr(4,4’,4’’-トリメトキシトリチル)を含む。
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物
又は有袋動物を指す。本発明の被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザ
ル又は他の種類のマカク属のサル)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット
及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
又は有袋動物を指す。本発明の被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザ
ル又は他の種類のマカク属のサル)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット
及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「治療」、「軽減」又は「改善」は、ここで互換的に使用
されてもよい。これらの用語は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含
むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善する
ことを意味する。また、治療効果は、患者が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性
があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する1又は複数の生理的症状を根絶又は改善す
ることにより、患者に改善が観察されて得られる。
されてもよい。これらの用語は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含
むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善する
ことを意味する。また、治療効果は、患者が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性
があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する1又は複数の生理的症状を根絶又は改善す
ることにより、患者に改善が観察されて得られる。
本明細書で用いられる場合、「防止」と「予防」は互換的に使用されてもよい。これら
の用語は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されな
い。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行っていないかもしれないが、
複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある患者に投与し、又は疾患の1又は
複数の生理的症状が報告された被験体に投与することができる。
の用語は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されな
い。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行っていないかもしれないが、
複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある患者に投与し、又は疾患の1又は
複数の生理的症状が報告された被験体に投与することができる。
<複合分子>
1つの側面において、本明細書には、活性剤又は活性薬物を送達するための複合分子が
開示されている。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、組織
特異的標的に用いられる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子
は、細胞表面の受容体と結合する。この目的のために、いかなる細胞表面の受容体又はバ
イオマーカー又はその一部も、適切であると考えられる。いくつかの実施形態において、
本明細書で開示された複合分子は、特定の組織に特有の受容体に特異的に結合し、組織特
異的標的を実現する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、
肝細胞表面の受容体を特異的に標的し、肝組織を特異的に標的する。いくつかの実施形態
において、本明細書で開示された複合分子は、肝細胞に特有の細胞表面の受容体を特異的
に標的する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、肝表面の
アシアロ糖タンパク質受容体(asialoglycoprotein recepto
r、ASGPR)を特異的に標的する。
1つの側面において、本明細書には、活性剤又は活性薬物を送達するための複合分子が
開示されている。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、組織
特異的標的に用いられる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子
は、細胞表面の受容体と結合する。この目的のために、いかなる細胞表面の受容体又はバ
イオマーカー又はその一部も、適切であると考えられる。いくつかの実施形態において、
本明細書で開示された複合分子は、特定の組織に特有の受容体に特異的に結合し、組織特
異的標的を実現する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、
肝細胞表面の受容体を特異的に標的し、肝組織を特異的に標的する。いくつかの実施形態
において、本明細書で開示された複合分子は、肝細胞に特有の細胞表面の受容体を特異的
に標的する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、肝表面の
アシアロ糖タンパク質受容体(asialoglycoprotein recepto
r、ASGPR)を特異的に標的する。
本明細書で用いられる場合、「活性剤」及び「活性薬物」は互換的に使用されてもよく
、いずれも本明細書で開示された複合分子により送達されることができる分子を指す。い
くつかの実施形態において、活性剤は、肝細胞に送達されることが望まれる試薬である。
これらの試薬は、当業者によく知られており、機能性ヌクレオチド、例えば、機能性オリ
ゴヌクレオチド、特に本明細書で開示されたものを含むが、これらに限定されない。
、いずれも本明細書で開示された複合分子により送達されることができる分子を指す。い
くつかの実施形態において、活性剤は、肝細胞に送達されることが望まれる試薬である。
これらの試薬は、当業者によく知られており、機能性ヌクレオチド、例えば、機能性オリ
ゴヌクレオチド、特に本明細書で開示されたものを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本開示は、式(321)に示される構造を有する複合分
子を提供する。
子を提供する。
n1は1~3の整数であり、n3は0~4の整数であり、
m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2~10の整数であり、R10、R11、R1
2、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1-C10アルキル基、C1-
C10ハロゲン化アルキル基及びC1-C10アルコキシ基から選択され、
R4が、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各L1は、長さ1~70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数
の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニ
レン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロ
シクリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数
で任意に置換され、L1は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-
C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキ
ル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1
-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキ
ルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基
、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N
(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキ
ル基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基)、-NH
(C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O
(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アル
キル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C
1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル
)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェ
ニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニ
ル基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C10アルキ
ル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1
-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキ
ル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-N
HSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)からな
る群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各S1は独立してM1であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒド
ロキシ保護基で保護され、
各M1は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。
いくつかの実施形態において、n1は、1~3の整数であってもよく、n3は、0~4
の整数であってもよく、前記複合分子において少なくとも2つのS1基が存在することを
確保する。いくつかの実施形態において、n1+n3≧2であり、これにより、当該複合
分子により形成された複合体において、M1リガンドの個数が少なくとも3個であり、M
1リガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、細胞内取
込み作用により複合体が細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分か
るように、M1リガンドの個数が3個以上である場合、M1リガンドと肝細胞表面のアシ
アロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、
構造/プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形
態において、n1は1~2の整数であり、n3は0~1の整数であり、かつ、n1+n3
=2~3である。
の整数であってもよく、前記複合分子において少なくとも2つのS1基が存在することを
確保する。いくつかの実施形態において、n1+n3≧2であり、これにより、当該複合
分子により形成された複合体において、M1リガンドの個数が少なくとも3個であり、M
1リガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、細胞内取
込み作用により複合体が細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分か
るように、M1リガンドの個数が3個以上である場合、M1リガンドと肝細胞表面のアシ
アロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、
構造/プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形
態において、n1は1~2の整数であり、n3は0~1の整数であり、かつ、n1+n3
=2~3である。
いくつかの実施形態において、m1、m2及びm3は、それぞれ独立して2~10の整
数から選択される場合、当該複合分子により形成された複合体において、複数のM1リガ
ンド間の空間位置をM1リガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に
適合させることができると考えられる。本開示により提供される複合分子をより簡略化し
、より合成しやすく、及び/又はコストを低下させるために、本開示のいくつかの実施形
態によれば、m1、m2及びm3は、それぞれ独立して2~5の整数であり、1つの実施
形態において、m1=m2=m3である。
数から選択される場合、当該複合分子により形成された複合体において、複数のM1リガ
ンド間の空間位置をM1リガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に
適合させることができると考えられる。本開示により提供される複合分子をより簡略化し
、より合成しやすく、及び/又はコストを低下させるために、本開示のいくつかの実施形
態によれば、m1、m2及びm3は、それぞれ独立して2~5の整数であり、1つの実施
形態において、m1=m2=m3である。
R10、R11、R12、R13、R14及びR15がそれぞれ独立してH、C1-C
10アルキル基、C1-C10ハロゲン化アルキル基及びC1-C10アルコキシから選
択される場合、本開示により提供される複合分子の性質を変化させることなく、いずれも
本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形
態において、R10、R11、R12、R13、R14及びR15は、それぞれ独立して
H、メチル基又はエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、R10、R1
1、R12、R13、R14及びR15は、いずれもHである。
10アルキル基、C1-C10ハロゲン化アルキル基及びC1-C10アルコキシから選
択される場合、本開示により提供される複合分子の性質を変化させることなく、いずれも
本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形
態において、R10、R11、R12、R13、R14及びR15は、それぞれ独立して
H、メチル基又はエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、R10、R1
1、R12、R13、R14及びR15は、いずれもHである。
R4は、本開示の複合分子により送達される活性剤に結合できる基である。いくつかの
実施形態において、R4は、待本開示の複合分子により送達されるオリゴヌクレオチドに
結合できる基である。いくつかの実施形態において、R4は、共有結合によりオリゴヌク
レオチドに結合することができる基である。いくつかの実施形態において、R4は、リン
酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに結合することができる基である。いくつか
の実施形態において、R4は、窒素含有骨格上のN原子との結合を実現し、オリゴヌクレ
オチド複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。本開示の文脈におい
て、「窒素含有骨格」とは、鎖構造を指し、結合されるR10、R11、R12、R13
、R14及びR15の炭素原子とN原子が互いに結合されている。いくつかの実施形態に
おいて、R4は、適当な方法で窒素含有骨格上のN原子に結合されることができる基であ
ってもよい。いくつかの実施形態において、R4には、窒素含有骨格上のN原子に結合さ
れる部位及び反応させてリン酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに複合されるこ
とができる任意の官能基が含まれる。
実施形態において、R4は、待本開示の複合分子により送達されるオリゴヌクレオチドに
結合できる基である。いくつかの実施形態において、R4は、共有結合によりオリゴヌク
レオチドに結合することができる基である。いくつかの実施形態において、R4は、リン
酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに結合することができる基である。いくつか
の実施形態において、R4は、窒素含有骨格上のN原子との結合を実現し、オリゴヌクレ
オチド複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。本開示の文脈におい
て、「窒素含有骨格」とは、鎖構造を指し、結合されるR10、R11、R12、R13
、R14及びR15の炭素原子とN原子が互いに結合されている。いくつかの実施形態に
おいて、R4は、適当な方法で窒素含有骨格上のN原子に結合されることができる基であ
ってもよい。いくつかの実施形態において、R4には、窒素含有骨格上のN原子に結合さ
れる部位及び反応させてリン酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに複合されるこ
とができる任意の官能基が含まれる。
いくつかの実施形態において、R4は、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチド上の
基と反応してリン酸エステル結合を形成することができる第1の官能基、及びヒドロキシ
基もしくはアミノ基と共有結合を形成することができる第2の官能基を含み、又は、前記
共有結合により結合された固相担体を含む。いくつかの実施形態において、第1の官能基
は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの
実施形態において、第2の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸
塩である。いくつかの実施形態において、第2の官能基は、ヒドロキシ基又はアミノ基に
より形成された共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体である。いくつか
の実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又
はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹
脂である。
基と反応してリン酸エステル結合を形成することができる第1の官能基、及びヒドロキシ
基もしくはアミノ基と共有結合を形成することができる第2の官能基を含み、又は、前記
共有結合により結合された固相担体を含む。いくつかの実施形態において、第1の官能基
は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの
実施形態において、第2の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸
塩である。いくつかの実施形態において、第2の官能基は、ヒドロキシ基又はアミノ基に
より形成された共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体である。いくつか
の実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又
はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹
脂である。
いくつかの実施形態において、前記第1の官能基は、ヒドロキシ基、-ORk又は式(
C3)に示される基を含み、及び/又は前記第2の官能基は、式(C1)、(C2)、(
C3)、(C1’)又は(C3’)に示される基を含む。
C3)に示される基を含み、及び/又は前記第2の官能基は、式(C1)、(C2)、(
C3)、(C1’)又は(C3’)に示される基を含む。
いくつかの実施形態において、第1の官能基は、ホスホルアミダイト官能基、例えば、
式(C3)に示される基を含み、当該ホスホルアミダイト官能基は、ヌクレオチド上の任
意位置のヒドロキシ基、例えば、2’位のヒドロキシ基又は3’位のヒドロキシ基とカッ
プリングし、酸化を介してリン酸ジエステル結合を形成し、複合分子をオリゴヌクレオチ
ドに複合させることができる。したがって、第2の官能基が存在しなくても、本明細書で
開示された複合分子は、ヌクレオチドに複合されることができる。この場合に、複合分子
は、ヌクレオチド配列における末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基と反応することに適し
ており、後の酸化過程においてリン酸ジエステル結合を形成することによって、本開示の
複合分子をオリゴヌクレオチドに複合する。
式(C3)に示される基を含み、当該ホスホルアミダイト官能基は、ヌクレオチド上の任
意位置のヒドロキシ基、例えば、2’位のヒドロキシ基又は3’位のヒドロキシ基とカッ
プリングし、酸化を介してリン酸ジエステル結合を形成し、複合分子をオリゴヌクレオチ
ドに複合させることができる。したがって、第2の官能基が存在しなくても、本明細書で
開示された複合分子は、ヌクレオチドに複合されることができる。この場合に、複合分子
は、ヌクレオチド配列における末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基と反応することに適し
ており、後の酸化過程においてリン酸ジエステル結合を形成することによって、本開示の
複合分子をオリゴヌクレオチドに複合する。
いくつかの実施形態において、前記第1の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。
いくつかの実施形態において、前記第2の官能基は、固相担体と反応性のある基を含み、
固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、第2の官能基は、式
(C1)、(C2)又は(C3)に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホ
スホルアミダイトを含む。カルボキシ基又はカルボン酸塩は、固相担体、例えば、樹脂に
おけるヒドロキシ基又はアミノ基とエステル化反応又はアミド化反応し、カルボン酸エス
テル結合により結合される固相担体又はアミド結合により結合される固相担体を含む複合
分子を形成することができる。ホスホルアミダイトは、汎用の固相担体、例えば、樹脂に
おけるヒドロキシ基とカップリング反応し、後の酸化を介してリン酸ジエステル結合によ
り結合される固相担体を形成することができる。これにより、本発明の1つの側面によれ
ば、このような複合分子により本開示の複合体を調製する方法を提供する。いくつかの実
施形態において、当該方法は、まず、複合分子と固相担体を縮合又はカップリング反応に
よって結合し、その後、固相ホスホルアミダイト合成方法によりヌクレオシドモノマーを
加え、オリゴヌクレオチドに複合される本開示の複合分子を含む本開示の複合体を得るこ
とを含む。いくつかの実施形態において、ホスホルアミダイト固相合成過程において、第
1の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件でヌクレオシド上のホスホル
アミダイト基とカップリングする。
いくつかの実施形態において、前記第2の官能基は、固相担体と反応性のある基を含み、
固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、第2の官能基は、式
(C1)、(C2)又は(C3)に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホ
スホルアミダイトを含む。カルボキシ基又はカルボン酸塩は、固相担体、例えば、樹脂に
おけるヒドロキシ基又はアミノ基とエステル化反応又はアミド化反応し、カルボン酸エス
テル結合により結合される固相担体又はアミド結合により結合される固相担体を含む複合
分子を形成することができる。ホスホルアミダイトは、汎用の固相担体、例えば、樹脂に
おけるヒドロキシ基とカップリング反応し、後の酸化を介してリン酸ジエステル結合によ
り結合される固相担体を形成することができる。これにより、本発明の1つの側面によれ
ば、このような複合分子により本開示の複合体を調製する方法を提供する。いくつかの実
施形態において、当該方法は、まず、複合分子と固相担体を縮合又はカップリング反応に
よって結合し、その後、固相ホスホルアミダイト合成方法によりヌクレオシドモノマーを
加え、オリゴヌクレオチドに複合される本開示の複合分子を含む本開示の複合体を得るこ
とを含む。いくつかの実施形態において、ホスホルアミダイト固相合成過程において、第
1の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件でヌクレオシド上のホスホル
アミダイト基とカップリングする。
いくつかの実施形態において、R4は、ヒドロキシ基もしくは保護されたヒドロキシ基
を含む第1の官能基、及びカルボン酸エステル結合、アミド結合もしくはリン酸ジエステ
ル結合、又はカルボン酸エステル結合、アミド結合もしくはリン酸ジエステル結合により
結合された固相担体を含む第2の官能基を含む。いくつかの実施形態において、第2の官
能基は、式(C1’)又は(C3’)に示される基である。いくつかの実施形態において
、第2の官能基が固相担体を含む場合、前記固相担体を含む複合分子は、本開示の複合体
の調製に用いられる。したがって、本発明の1つの側面において、前記複合分子により本
開示の複合体を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、固
相担体を含む複合分子とヌクレオシドモノマーをホスホルアミダイト固相合成方法に従い
反応させ、本開示の複合分子をオリゴヌクレオチドに複合することを含む。いくつかの実
施形態において、前記固相担体を含む複合分子は、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホス
ホルアミダイトを有する複合分子と固相担体とを反応させて内部で得ることができる。い
くつかの実施形態において、複合分子は、供給者により提供されてもよい。
を含む第1の官能基、及びカルボン酸エステル結合、アミド結合もしくはリン酸ジエステ
ル結合、又はカルボン酸エステル結合、アミド結合もしくはリン酸ジエステル結合により
結合された固相担体を含む第2の官能基を含む。いくつかの実施形態において、第2の官
能基は、式(C1’)又は(C3’)に示される基である。いくつかの実施形態において
、第2の官能基が固相担体を含む場合、前記固相担体を含む複合分子は、本開示の複合体
の調製に用いられる。したがって、本発明の1つの側面において、前記複合分子により本
開示の複合体を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、固
相担体を含む複合分子とヌクレオシドモノマーをホスホルアミダイト固相合成方法に従い
反応させ、本開示の複合分子をオリゴヌクレオチドに複合することを含む。いくつかの実
施形態において、前記固相担体を含む複合分子は、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホス
ホルアミダイトを有する複合分子と固相担体とを反応させて内部で得ることができる。い
くつかの実施形態において、複合分子は、供給者により提供されてもよい。
いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、-COO-M+で表されてもよく、こ
こで、M+は、カチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンNH4 +
又は有機アンモニウムカチオンから選択される。いくつかの実施形態において、前記金属
イオンは、アルカリ金属イオン、例えば、K+又はNa+であってもよい。溶解性を向上
させ、反応をスムーズに行う考慮から、いくつかの実施形態において、有機アンモニウム
カチオンは、第3級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は第4級アンモニウ
ムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はN,N
-ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムカチオンである。いくつか
の実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はN,N-ジイ
ソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
こで、M+は、カチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンNH4 +
又は有機アンモニウムカチオンから選択される。いくつかの実施形態において、前記金属
イオンは、アルカリ金属イオン、例えば、K+又はNa+であってもよい。溶解性を向上
させ、反応をスムーズに行う考慮から、いくつかの実施形態において、有機アンモニウム
カチオンは、第3級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は第4級アンモニウ
ムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はN,N
-ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムカチオンである。いくつか
の実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はN,N-ジイ
ソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
本開示のいくつかの実施形態において、R4は、式(B9)、(B10)、(B9’)
、(B10’)、(B11)、(B12)、(B11’)又は(B12’)に示される基
である。
、(B10’)、(B11)、(B12)、(B11’)又は(B12’)に示される基
である。
り、M+はカチオンであり、Rkはヒドロキシ保護基であり、SPSは固相担体を表し、
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。いくつかの実施形態において、q1は1又
は2である。いくつかの実施形態において、q2は1~5の整数である。いくつかの実施
形態において、R4は、式(B9)又は(B10)に示される基を含む。いくつかの実施
形態において、R4は、式(B11)又は(B12)に示される基を含む。
いくつかの実施形態において、Rkは、Tr(トリチル基)、MMTr(4-メトキシ
トリチル基)、DMTr(4,4’-ジメトキシトリチル基)、TMTr(4,4’,4
’-トリメトキシトリチル基)の1又は複数である。いくつかの実施形態において、Rk
はDMTrである。
トリチル基)、DMTr(4,4’-ジメトキシトリチル基)、TMTr(4,4’,4
’-トリメトキシトリチル基)の1又は複数である。いくつかの実施形態において、Rk
はDMTrである。
L1は、長さ1~70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の
炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニレ
ン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロシ
クリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で
任意に置換され、L1は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-C
10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキル
基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1-
C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキル
フェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基、
ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N(
C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキル
基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基)、-NH(
C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O(
C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキ
ル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C1
-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル)
C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェニ
ル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニル
基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C10アルキル
基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1-
C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキル
基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-NH
SO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)からなる
群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有する。便宜上、L1は、線形アルキレン基
として定義されるが、例えば上述の取替及び/又は置換によって生じるアミンやアルケニ
ル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。
本開示の目的のために、L1の長さは、2つの結合点を結合する鎖における原子数である
。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環(例えば、ヘ
テロシクリレン又はヘテロアリーレン)を、1個の原子とする。
炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニレ
ン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロシ
クリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で
任意に置換され、L1は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-C
10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキル
基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1-
C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキル
フェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基、
ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N(
C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキル
基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基)、-NH(
C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O(
C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキ
ル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C1
-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル)
C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェニ
ル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニル
基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C10アルキル
基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1-
C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキル
基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-NH
SO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)からなる
群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有する。便宜上、L1は、線形アルキレン基
として定義されるが、例えば上述の取替及び/又は置換によって生じるアミンやアルケニ
ル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。
本開示の目的のために、L1の長さは、2つの結合点を結合する鎖における原子数である
。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環(例えば、ヘ
テロシクリレン又はヘテロアリーレン)を、1個の原子とする。
いくつかの実施形態において、L1は、M1リガンド(又は対応するS1基)と窒素含
有骨格上のN原子を結合し、本開示の複合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす
。いくつかの実施形態において、L1は、式A1~A26の基のいずれか1つ又はその任
意の組合せから選択される。いくつかの実施形態において、L1は、A1、A4、A5、
A6、A8、A10、A11及びA13のいずれか1つ又は任意の組合せである。いくつ
かの実施形態において、L1は、A1、A4、A8、A10及びA11の少なくとも2つ
の組合せである。いくつかの実施形態において、L1は、A1、A8、A10の少なくと
も2つの組合せである。
有骨格上のN原子を結合し、本開示の複合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす
。いくつかの実施形態において、L1は、式A1~A26の基のいずれか1つ又はその任
意の組合せから選択される。いくつかの実施形態において、L1は、A1、A4、A5、
A6、A8、A10、A11及びA13のいずれか1つ又は任意の組合せである。いくつ
かの実施形態において、L1は、A1、A4、A8、A10及びA11の少なくとも2つ
の組合せである。いくつかの実施形態において、L1は、A1、A8、A10の少なくと
も2つの組合せである。
いくつかの実施形態において、L1の長さは、3~25、3~20、4~15又は5~
12個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、L1の長さは、3、4、5
、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
0、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55又は60個の
原子である。本開示に係るいくつかの実施形態において、j1は2~10の整数であり、
いくつかの実施形態において、j1は3~5の整数である。いくつかの実施形態において
、j2は2~10の整数であり、いくつかの実施形態において、j2は3~5の整数であ
る。R’はC1-C4アルキル基であり、いくつかの実施形態において、R’は、メチル
基、エチル基及びイソプロピル基の1つである。Raは、A27、A28、A29、A3
0及びA31の1つであり、いくつかの実施形態において、Raは、A27又はA28で
ある。Rbは、C1-C5アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Rbは、メ
チル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の1つである。いくつかの実施形態にお
いて、それぞれ式A1~A26におけるj1、j2、R’、Ra、Rbを選択することに
より、複合分子により形成されたオリゴヌクレオチド複合体において、M1リガンドと窒
素含有骨格上のN原子との結合を実現し、M1リガンド間の空間位置をM1リガンドと肝
細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合により適合させる。
12個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、L1の長さは、3、4、5
、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
0、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55又は60個の
原子である。本開示に係るいくつかの実施形態において、j1は2~10の整数であり、
いくつかの実施形態において、j1は3~5の整数である。いくつかの実施形態において
、j2は2~10の整数であり、いくつかの実施形態において、j2は3~5の整数であ
る。R’はC1-C4アルキル基であり、いくつかの実施形態において、R’は、メチル
基、エチル基及びイソプロピル基の1つである。Raは、A27、A28、A29、A3
0及びA31の1つであり、いくつかの実施形態において、Raは、A27又はA28で
ある。Rbは、C1-C5アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Rbは、メ
チル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の1つである。いくつかの実施形態にお
いて、それぞれ式A1~A26におけるj1、j2、R’、Ra、Rbを選択することに
より、複合分子により形成されたオリゴヌクレオチド複合体において、M1リガンドと窒
素含有骨格上のN原子との結合を実現し、M1リガンド間の空間位置をM1リガンドと肝
細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合により適合させる。
各M1は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつか
の実施形態において、少なくとも1つのM1は、肝細胞表面の受容体と結合できるリガン
ドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのM1は、哺乳動物の細胞表面
の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの
M1は、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態にお
いて、少なくとも1つのM1は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)と
結合できるリガンドである。
の実施形態において、少なくとも1つのM1は、肝細胞表面の受容体と結合できるリガン
ドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのM1は、哺乳動物の細胞表面
の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの
M1は、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態にお
いて、少なくとも1つのM1は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)と
結合できるリガンドである。
いくつかの実施形態において、M1は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タン
パク質受容体(ASGPR)に対して親和力を有する可能性があるいずれか1つのリガン
ドであり、これらのリガンドの種類は、当業者に公知である。いくつかの実施形態におい
て、少なくとも1つのM1は糖である。いくつかの実施形態において、各M1は糖である
。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのM1は、単糖、二糖、三糖又は多糖で
ある。いくつかの実施形態において、各M1は、単糖、二糖、三糖又は多糖である。いく
つかの実施形態において、少なくとも1つのM1は修飾糖である。いくつかの実施形態に
おいて、各M1は修飾糖である。いくつかの実施形態において、各M1は、独立して多糖
、修飾多糖、単糖又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、M1の
それぞれ又は少なくとも1つは、独立してグルコース及びその誘導体、マンノース及びそ
の誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその
誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導
体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる
群から選択されることが可能である。
パク質受容体(ASGPR)に対して親和力を有する可能性があるいずれか1つのリガン
ドであり、これらのリガンドの種類は、当業者に公知である。いくつかの実施形態におい
て、少なくとも1つのM1は糖である。いくつかの実施形態において、各M1は糖である
。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのM1は、単糖、二糖、三糖又は多糖で
ある。いくつかの実施形態において、各M1は、単糖、二糖、三糖又は多糖である。いく
つかの実施形態において、少なくとも1つのM1は修飾糖である。いくつかの実施形態に
おいて、各M1は修飾糖である。いくつかの実施形態において、各M1は、独立して多糖
、修飾多糖、単糖又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、M1の
それぞれ又は少なくとも1つは、独立してグルコース及びその誘導体、マンノース及びそ
の誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその
誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導
体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる
群から選択されることが可能である。
いくつかの実施形態において、M1のそれぞれ又は少なくとも1つは、独立してD-マ
ンノピラノース、L-マンノピラノース、D-アラビノース、D-キシロフラノース、L
-キシロフラノース、D-グルコース、L-グルコース、D-ガラクトース、L-ガラク
トース、α-D-マンノフラノース、β-D-マンノフラノース、α-D-マンノピラノ
ース、β-D-マンノピラノース、α-D-グルコピラノース、β-D-グルコピラノー
ス、α-D-グルコフラノース、β-D-グルコフラノース、α-D-フルクトフラノー
ス、α-D-フルクトピラノース、α-D-ガラクトピラノース、β-D-ガラクトピラ
ノース、α-D-ガラクトフラノース、β-D-ガラクトフラノース、グルコサミン、シ
アル酸、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-トリフルオロアセチルガラ
クトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブチリルガラクトサミン、N-
イソブチリルガラクトサミン、2-アミノ-3-O-[(R)-1-カルボキシエチル]
-2-デオキシ-β-D-グルコピラノース、2-デオキシ-2-メチルアミノ-L-グ
ルコピラノース、4,6-ジデオキシ-4-ホルムアミド-2,3-ジ-O-メチル-D
-マンノピラノース、2-デオキシ-2-スルホアミノ-D-グルコピラノース、N-グ
リコリル-α-ノイラミン酸、5-チオ-β-D-グルコピラノース、メチル2,3,4
-トリス-O-アセチル-1-チオ-6-O-トリチル-α-D-グルコピラノシド、4
-チオ-β-D-ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7-テトラ-O-アセチル-
2-デオキシ-1,5-ジチオ-α-D-グルコヘプトピラノシド、2,5-アンヒドロ
-D-アロノニトリル(2,5-anhydro-D-allononitrile)、
リボース、D-リボース、D-4-チオリボース、L-リボース、L-4-チオリボース
から選択されることが可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのM1
はN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)である。いくつかの実施形態において、
各M1は、いずれもN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)である。リガンドの選
択については、例えば、CN105378082Aの開示内容を参照してもよく、引用に
よりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
ンノピラノース、L-マンノピラノース、D-アラビノース、D-キシロフラノース、L
-キシロフラノース、D-グルコース、L-グルコース、D-ガラクトース、L-ガラク
トース、α-D-マンノフラノース、β-D-マンノフラノース、α-D-マンノピラノ
ース、β-D-マンノピラノース、α-D-グルコピラノース、β-D-グルコピラノー
ス、α-D-グルコフラノース、β-D-グルコフラノース、α-D-フルクトフラノー
ス、α-D-フルクトピラノース、α-D-ガラクトピラノース、β-D-ガラクトピラ
ノース、α-D-ガラクトフラノース、β-D-ガラクトフラノース、グルコサミン、シ
アル酸、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-トリフルオロアセチルガラ
クトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブチリルガラクトサミン、N-
イソブチリルガラクトサミン、2-アミノ-3-O-[(R)-1-カルボキシエチル]
-2-デオキシ-β-D-グルコピラノース、2-デオキシ-2-メチルアミノ-L-グ
ルコピラノース、4,6-ジデオキシ-4-ホルムアミド-2,3-ジ-O-メチル-D
-マンノピラノース、2-デオキシ-2-スルホアミノ-D-グルコピラノース、N-グ
リコリル-α-ノイラミン酸、5-チオ-β-D-グルコピラノース、メチル2,3,4
-トリス-O-アセチル-1-チオ-6-O-トリチル-α-D-グルコピラノシド、4
-チオ-β-D-ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7-テトラ-O-アセチル-
2-デオキシ-1,5-ジチオ-α-D-グルコヘプトピラノシド、2,5-アンヒドロ
-D-アロノニトリル(2,5-anhydro-D-allononitrile)、
リボース、D-リボース、D-4-チオリボース、L-リボース、L-4-チオリボース
から選択されることが可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのM1
はN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)である。いくつかの実施形態において、
各M1は、いずれもN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)である。リガンドの選
択については、例えば、CN105378082Aの開示内容を参照してもよく、引用に
よりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
CN105378082Aには、修飾オリゴヌクレオチド及び複合基を含む化合物が開
示されており、前記複合基は、少なくとも1つのリン結合基又は中性結合基及び1又は複
数のリガンドを含む。各リガンドは、多糖、修飾多糖、マンノース、ガラクトース、マン
ノース誘導体、ガラクトース誘導体、D-マンノピラノース、L-マンノピラノース、D
-アラビノース、D-キシロフラノース、L-キシロフラノース、D-グルコース、L-
グルコース、D-ガラクトース、L-ガラクトース、α-D-マンノフラノース、β-D
-マンノフラノース、α-D-マンノピラノース、β-D-マンノピラノース、α-D-
グルコピラノース、β-D-グルコピラノース、α-D-グルコフラノース、β-D-グ
ルコフラノース、α-D-フルクトフラノース、α-D-フルクトピラノース、α-D-
ガラクトピラノース、β-D-ガラクトピラノース、α-D-ガラクトフラノース、β-
D-ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、α-D-ガラクトサミン、N-アセ
チルガラクトサミン、2-アミノ-3-O-[(R)-1-カルボキシエチル]-2-デ
オキシ-β-D-グルコピラノース、2-デオキシ-2-メチルアミノ-L-グルコピラ
ノース、4,6-ジデオキシ-4-ホルムアミド-2,3-ジ-O-メチル-D-マンノ
ピラノース、2-デオキシ-2-スルホアミノ-D-グルコピラノース、N-グリコリル
-α-ノイラミン酸、5-チオ-β-D-グルコピラノース、メチル2,3,4-トリス
-O-アセチル-1-チオ-6-O-トリチル-α-D-グルコピラノシド、4-チオ-
β-D-ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7-テトラ-O-アセチル-2-デオ
キシ-1,5-ジチオ-α-D-グルコヘプトピラノシド、2,5-アンヒドロ-D-ア
ロノニトリル、リボース、D-リボース、D-4-チオリボース、L-リボース又はL-
4-チオリボースから選択される。当該化合物は、細胞における核酸転写物の量又は活性
を低下させることができるといわれている。
示されており、前記複合基は、少なくとも1つのリン結合基又は中性結合基及び1又は複
数のリガンドを含む。各リガンドは、多糖、修飾多糖、マンノース、ガラクトース、マン
ノース誘導体、ガラクトース誘導体、D-マンノピラノース、L-マンノピラノース、D
-アラビノース、D-キシロフラノース、L-キシロフラノース、D-グルコース、L-
グルコース、D-ガラクトース、L-ガラクトース、α-D-マンノフラノース、β-D
-マンノフラノース、α-D-マンノピラノース、β-D-マンノピラノース、α-D-
グルコピラノース、β-D-グルコピラノース、α-D-グルコフラノース、β-D-グ
ルコフラノース、α-D-フルクトフラノース、α-D-フルクトピラノース、α-D-
ガラクトピラノース、β-D-ガラクトピラノース、α-D-ガラクトフラノース、β-
D-ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、α-D-ガラクトサミン、N-アセ
チルガラクトサミン、2-アミノ-3-O-[(R)-1-カルボキシエチル]-2-デ
オキシ-β-D-グルコピラノース、2-デオキシ-2-メチルアミノ-L-グルコピラ
ノース、4,6-ジデオキシ-4-ホルムアミド-2,3-ジ-O-メチル-D-マンノ
ピラノース、2-デオキシ-2-スルホアミノ-D-グルコピラノース、N-グリコリル
-α-ノイラミン酸、5-チオ-β-D-グルコピラノース、メチル2,3,4-トリス
-O-アセチル-1-チオ-6-O-トリチル-α-D-グルコピラノシド、4-チオ-
β-D-ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7-テトラ-O-アセチル-2-デオ
キシ-1,5-ジチオ-α-D-グルコヘプトピラノシド、2,5-アンヒドロ-D-ア
ロノニトリル、リボース、D-リボース、D-4-チオリボース、L-リボース又はL-
4-チオリボースから選択される。当該化合物は、細胞における核酸転写物の量又は活性
を低下させることができるといわれている。
WO2016077321A1には、HBV遺伝子を特異的に標的する多くのsiRN
A及びその送達方法が開示されており、siRNAのヌクレオチドを修飾することにより
、siRNAの血清安定性を向上させる。当該文献には、siRNA複合体がさらに開示
されており、さらには、複数種のsiRNA複合体が具体的に開示されている。
A及びその送達方法が開示されており、siRNAのヌクレオチドを修飾することにより
、siRNAの血清安定性を向上させる。当該文献には、siRNA複合体がさらに開示
されており、さらには、複数種のsiRNA複合体が具体的に開示されている。
WO2016168286A1には、ANGPTL3遺伝子を特異的に標的する多くの
siRNA及びその送達方法が開示されており、siRNAのヌクレオチドを修飾するこ
とにより、siRNAの血清安定性を向上させる。当該文献には、siRNA複合体がさ
らに開示されている。
siRNA及びその送達方法が開示されており、siRNAのヌクレオチドを修飾するこ
とにより、siRNAの血清安定性を向上させる。当該文献には、siRNA複合体がさ
らに開示されている。
N-アセチルガラクトサミン(N-acetylgalgactosamine、Ga
lNAc)は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体と結合するリガンドである。アシア
ロ糖タンパク質受容体(asialoglycoprotein receptor、A
SGPR)は、肝細胞により特異的に発現される細胞内取込み型受容体である。近年、N
-アセチルガラクトサミン(GalNAc)は、標的分子として用いられ、低分子RNA
を肝臓に送達する。例えば、アルナイラム社(Alnylam pharmaceuti
cals,Inc.)は、GalNAc複合技術に基づくsiRNAが、マウス体内で干
渉活性を発揮することをはじめて報告した(Nairら、J.Am.Chem.Soc.
,2014,136,16958-16961)。文章には、3つのクラスターのGal
NAcに複合されるsiRNAが、体内及び体外実験においていずれも良好な送達活性を
示すことが報告された。皮下投与するマウス体内実験から、単回用量のED50が1mg
/kgであり、単回注射用量が1ml以下であることが確認された。長期間投与実験にお
いて、1週間に1回皮下注射することにより、9ヶ月と長い安定した干渉活性を得ること
ができる。
lNAc)は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体と結合するリガンドである。アシア
ロ糖タンパク質受容体(asialoglycoprotein receptor、A
SGPR)は、肝細胞により特異的に発現される細胞内取込み型受容体である。近年、N
-アセチルガラクトサミン(GalNAc)は、標的分子として用いられ、低分子RNA
を肝臓に送達する。例えば、アルナイラム社(Alnylam pharmaceuti
cals,Inc.)は、GalNAc複合技術に基づくsiRNAが、マウス体内で干
渉活性を発揮することをはじめて報告した(Nairら、J.Am.Chem.Soc.
,2014,136,16958-16961)。文章には、3つのクラスターのGal
NAcに複合されるsiRNAが、体内及び体外実験においていずれも良好な送達活性を
示すことが報告された。皮下投与するマウス体内実験から、単回用量のED50が1mg
/kgであり、単回注射用量が1ml以下であることが確認された。長期間投与実験にお
いて、1週間に1回皮下注射することにより、9ヶ月と長い安定した干渉活性を得ること
ができる。
いくつかの実施形態において、S1は、独立してM1である。いくつかの実施形態にお
いて、S1は、独立してM1において少なくとも1つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保
護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、S1は、独立してM1におけ
る活性ヒドロキシ基(存在する場合)が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。い
くつかの実施形態において、当業者によく知られているいかなるヒドロキシ保護基も、M
1における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態
において、保護されたヒドロキシ基は、式YCOO-で表され、各Yは、独立してC1-
C10アルキル及びC6-C10アリールからなる群から選択され、ハロゲン置換基及び
C1-C6アルキルから選択される1又は複数の置換基で任意に置換されてもよい。いく
つかの実施形態において、各Yは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル
基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モノクロロメチル
基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びC1
-C6アルキルフェニル基からなる群から独立して選択される。
いて、S1は、独立してM1において少なくとも1つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保
護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、S1は、独立してM1におけ
る活性ヒドロキシ基(存在する場合)が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。い
くつかの実施形態において、当業者によく知られているいかなるヒドロキシ保護基も、M
1における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態
において、保護されたヒドロキシ基は、式YCOO-で表され、各Yは、独立してC1-
C10アルキル及びC6-C10アリールからなる群から選択され、ハロゲン置換基及び
C1-C6アルキルから選択される1又は複数の置換基で任意に置換されてもよい。いく
つかの実施形態において、各Yは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル
基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モノクロロメチル
基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びC1
-C6アルキルフェニル基からなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、各S1は、それぞれ独立して式A46~A54の基から
なる群から選択される。
なる群から選択される。
いくつかの実施形態において、S1は式A49又はA50である。
いくつかの実施形態において、各Yは、独立してメチル基、トリフルオロメチル基、ジ
フルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モ
ノクロロメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェ
ニル基及びアルキルフェニル基の1つである。本開示の複合分子を簡略化する目的で、い
くつかの実施形態において、Yはメチル基である。
フルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モ
ノクロロメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェ
ニル基及びアルキルフェニル基の1つである。本開示の複合分子を簡略化する目的で、い
くつかの実施形態において、Yはメチル基である。
いくつかの実施形態において、本開示の複合分子は、式(403)、(404)、(4
05)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、
(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418
)、(419)、(420)、(421)又は(422)に示される構造を有する。
05)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、
(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418
)、(419)、(420)、(421)又は(422)に示される構造を有する。
以上の式(403)~(422)中、XはO又はNHであり、Rkはヒドロキシ保護基
であり、M+は、金属カチオン、アンモニウムカチオン、第3級アミンにより形成された
カチオン又は第4級アンモニウムカチオンの1つである。いくつかの実施形態において、
M+は、
である。
であり、M+は、金属カチオン、アンモニウムカチオン、第3級アミンにより形成された
カチオン又は第4級アンモニウムカチオンの1つである。いくつかの実施形態において、
M+は、
である。
いくつかの実施形態において、本開示の複合分子は、式(423)、(424)、(4
25)、(426)、(427)、(428)、(429)、(430)、(431)、
(432)、(433)、(434)、(435)、(436)、(437)、(438
)、(439)、(440)、(441)又は(442)に示される構造を有してもよい
。
25)、(426)、(427)、(428)、(429)、(430)、(431)、
(432)、(433)、(434)、(435)、(436)、(437)、(438
)、(439)、(440)、(441)又は(442)に示される構造を有してもよい
。
以上の式(423)~(442)中、XはO又はNHであり、Rkはヒドロキシ保護基
であり、SPSは固相担体を表す。
であり、SPSは固相担体を表す。
いくつかの実施形態において、本開示の複合分子は、式(503)、(504)、(5
05)、(506)、(507)、(508)、(509)、(510)、(511)、
(512)、(513)、(514)、(515)、(516)、(517)、(518
)、(519)、(520)、(521)又は(522)に示される構造を有する。
05)、(506)、(507)、(508)、(509)、(510)、(511)、
(512)、(513)、(514)、(515)、(516)、(517)、(518
)、(519)、(520)、(521)又は(522)に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、本開示の複合分子は、式(523)、(524)、(5
25)、(526)、(527)、(528)、(529)、(530)、(531)、
(532)、(533)、(534)、(535)、(536)、(537)、(538
)、(539)、(540)、(541)又は(542)に示される構造を有してもよい
。
25)、(526)、(527)、(528)、(529)、(530)、(531)、
(532)、(533)、(534)、(535)、(536)、(537)、(538
)、(539)、(540)、(541)又は(542)に示される構造を有してもよい
。
以上の式(523)~(542)中、SPSは固相担体を表し、DMTrは4,4’-
ジメトキシトリチルを表す。
ジメトキシトリチルを表す。
<本開示の複合分子の調製>
当業者は、任意の合理的な合成経路により本開示の複合分子を調製してもよい。
当業者は、任意の合理的な合成経路により本開示の複合分子を調製してもよい。
本開示のいくつかの実施形態において、式(321)に示される複合分子の調製方法は
、有機溶剤において、エステル化反応条件で、アルカリとエステル化触媒の存在下で、式
(313)に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式
(321)に示される化合物を得ることを含む。
、有機溶剤において、エステル化反応条件で、アルカリとエステル化触媒の存在下で、式
(313)に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式
(321)に示される化合物を得ることを含む。
n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、
L1、S1それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。Riは、窒素含
有骨格上のN原子と結合し、RkOと結合して遊離ヒドロキシ基が結合できる任意の基で
あり、Rkはヒドロキシ保護基である。この場合、R4に第1の官能基であるヒドロキシ
保護基及び第2の官能基である式(C1)又は(C2)に示される基が含まれる、式(3
21)の化合物が得られる。いくつかの実施形態において、R6はB7又はB8である。
L1、S1それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。Riは、窒素含
有骨格上のN原子と結合し、RkOと結合して遊離ヒドロキシ基が結合できる任意の基で
あり、Rkはヒドロキシ保護基である。この場合、R4に第1の官能基であるヒドロキシ
保護基及び第2の官能基である式(C1)又は(C2)に示される基が含まれる、式(3
21)の化合物が得られる。いくつかの実施形態において、R6はB7又はB8である。
前記エステル化反応条件としては、反応温度が0~100℃であり、反応時間が8~4
8時間であることを含み、1つの実施形態において、前記エステル化反応条件としては、
反応温度が10~40℃であり、反応時間が20~30時間であることを含む。
8時間であることを含み、1つの実施形態において、前記エステル化反応条件としては、
反応温度が10~40℃であり、反応時間が20~30時間であることを含む。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲ
ン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド及びN,N-
ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前
記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランである。いくつかの実施形
態において、前記エーテル溶剤は、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエ
ーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び
1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有
機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式(313)に示される化合物に対して、前記有
機溶剤の用量が3~50L/molであり、いくつかの実施形態において、5~20L/
molである。
ン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド及びN,N-
ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前
記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランである。いくつかの実施形
態において、前記エーテル溶剤は、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエ
ーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び
1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有
機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式(313)に示される化合物に対して、前記有
機溶剤の用量が3~50L/molであり、いくつかの実施形態において、5~20L/
molである。
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水
物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の1つであり、いくつかの実施形態において
、前記環状酸無水物はコハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式(313)に示
される化合物とのモル比が1:1~10:1であり、いくつかの実施形態において、2:
1~5:1である。
物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の1つであり、いくつかの実施形態において
、前記環状酸無水物はコハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式(313)に示
される化合物とのモル比が1:1~10:1であり、いくつかの実施形態において、2:
1~5:1である。
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例
えば、当該触媒は、4-ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式(313
)に示される化合物とのモル比が1:1~10:1であり、いくつかの実施形態において
、2:1~5:1である。
えば、当該触媒は、4-ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式(313
)に示される化合物とのモル比が1:1~10:1であり、いくつかの実施形態において
、2:1~5:1である。
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組
合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、塩基は第3級アミンであ
る。いくつかの実施形態において、前記第3級アミンは、トリエチルアミン又はN,N-
ジイソプロピルエチルアミンである。前記第3級アミンと式(313)に示される化合物
とのモル比が1:1~20:1であり、いくつかの実施形態において、3:1~10:1
である。
合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、塩基は第3級アミンであ
る。いくつかの実施形態において、前記第3級アミンは、トリエチルアミン又はN,N-
ジイソプロピルエチルアミンである。前記第3級アミンと式(313)に示される化合物
とのモル比が1:1~20:1であり、いくつかの実施形態において、3:1~10:1
である。
前記イオン交換作用は、式(321)の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の
形式に変換するためのものであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオ
ン交換溶液と交換条件を用い、M+カチオンを有する複合分子を得ることができる。いく
つかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用い
て行われる。いくつかの実施形態において、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が
0.2~0.8Mであり、いくつかの実施形態において、前記トリエチルアミンリン酸塩
溶液の濃度が0.4~0.6Mである。いくつかの実施形態において、式(313)の化
合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量が3~6L/molであり、他
のいくつかの実施形態において、4~5L/molである。
形式に変換するためのものであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオ
ン交換溶液と交換条件を用い、M+カチオンを有する複合分子を得ることができる。いく
つかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用い
て行われる。いくつかの実施形態において、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が
0.2~0.8Mであり、いくつかの実施形態において、前記トリエチルアミンリン酸塩
溶液の濃度が0.4~0.6Mである。いくつかの実施形態において、式(313)の化
合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量が3~6L/molであり、他
のいくつかの実施形態において、4~5L/molである。
任意の適切な単離方法により反応混合物から式(321)の化合物を単離することがで
きる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法に
より式(321)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精製:200~3
00メッシュのシリカゲル充填剤を、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:
メタノール=100:18~100:20で勾配溶出する、又は、(2)逆相精製:C1
8、C8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶
出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式(321)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
きる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法に
より式(321)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精製:200~3
00メッシュのシリカゲル充填剤を、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:
メタノール=100:18~100:20で勾配溶出する、又は、(2)逆相精製:C1
8、C8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶
出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式(321)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式(321)の化合物の調製方法は、縮合反応条件で、
有機溶剤において、縮合剤、縮合触媒及び第3級アミンの存在下で、上記イオン交換生成
物をアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合
、R4に第1の官能基であるヒドロキシ保護基及び第2の官能基である式(C1’)に示
される基が含まれる式(321)の化合物が得られる。
有機溶剤において、縮合剤、縮合触媒及び第3級アミンの存在下で、上記イオン交換生成
物をアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合
、R4に第1の官能基であるヒドロキシ保護基及び第2の官能基である式(C1’)に示
される基が含まれる式(321)の化合物が得られる。
前記固相担体は、siRNAの固相合成に用いられる担体の1つであり、そのうちのい
くつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ
官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担
体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態において、前記アミノ
樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径100~400メッシュ(mesh)、表面における
アミノ基又はヒドロキシ基の担持量0.2~0.5mmol/gというパラメーターを有
する。式(321)に示される化合物と固相担体との比が10~400μmol化合物/
グラムの固相担体(μmol/g)である。いくつかの実施形態において、前記式(32
1)に示される化合物と固相担体との比が50~200μmol/gである。
くつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ
官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担
体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態において、前記アミノ
樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径100~400メッシュ(mesh)、表面における
アミノ基又はヒドロキシ基の担持量0.2~0.5mmol/gというパラメーターを有
する。式(321)に示される化合物と固相担体との比が10~400μmol化合物/
グラムの固相担体(μmol/g)である。いくつかの実施形態において、前記式(32
1)に示される化合物と固相担体との比が50~200μmol/gである。
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いく
つかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ溶剤、エーテル溶
剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド及
びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。いくつかの実施形態に
おいて、前記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランであり、前記エ
ーテル溶剤は、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエーテルであり、前記
ハロゲン化アルキル溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエ
タンの1種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニ
トリルである。式(313)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が20~200L/
molであり、1つの実施形態において、50~100L/molである。
つかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ溶剤、エーテル溶
剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド及
びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。いくつかの実施形態に
おいて、前記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランであり、前記エ
ーテル溶剤は、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエーテルであり、前記
ハロゲン化アルキル溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエ
タンの1種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニ
トリルである。式(313)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が20~200L/
molであり、1つの実施形態において、50~100L/molである。
いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ
トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、3-ジエトキシホスホリル-
1,2,3-ベンゾトリアゾール4(3H)-オン及び/又はO-ベンゾトリアゾール-
テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであってもよい。いくつかの実施形
態において、前記縮合剤は、O-ベンゾトリアゾール-テトラメチルウロニウムヘキサフ
ルオロホスフェートである。前記縮合剤と式(313)に示される化合物とのモル比が1
:1~20:1であり、他の実施形態において1:1~5:1である。
トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、3-ジエトキシホスホリル-
1,2,3-ベンゾトリアゾール4(3H)-オン及び/又はO-ベンゾトリアゾール-
テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであってもよい。いくつかの実施形
態において、前記縮合剤は、O-ベンゾトリアゾール-テトラメチルウロニウムヘキサフ
ルオロホスフェートである。前記縮合剤と式(313)に示される化合物とのモル比が1
:1~20:1であり、他の実施形態において1:1~5:1である。
いくつかの実施形態において、前記第3級アミンは、トリエチルアミン及び/又はN,
N-ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、N,N-ジイソ
プロピルエチルアミンであり、前記第3級アミンと式(313)に示される化合物とのモ
ル比が1:1~20:1であり、いくつかの実施形態において、1:1~5:1である。
N-ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、N,N-ジイソ
プロピルエチルアミンであり、前記第3級アミンと式(313)に示される化合物とのモ
ル比が1:1~20:1であり、いくつかの実施形態において、1:1~5:1である。
いくつかの実施形態において、式(321)の化合物の調製方法は、得られた縮合反応
生成物をキャッピング反応条件で、有機溶剤において、キャッピング試薬及びアシル化触
媒と接触させ、単離して式(321)に示される化合物を得ることをさらに含む。前記キ
ャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるため
に、まだ反応していないすべての活性官能基を除去することである。前記キャッピング反
応の条件としては、反応温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態において、15~
35℃であり、反応時間が1~10hであり、いくつかの実施形態において、3~6hで
ある。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、siRNA固相合成に用いられるキ
ャッピング試薬であってもよい。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は
、キャッピング試薬A(capA)及びキャッピング試薬B(capB)からなる。キャ
ッピング試薬Aは、N-メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、N-
メチルイミダゾールのピリジン/アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとア
セトニトリルとの体積比が1:10~1:1である。いくつかの実施形態において、1:
3~1:1である。いくつかの実施形態において、ピリジンとアセトニトリルの総体積と
N-メチルイミダゾールとの体積比が1:1~10:1であり、いくつかの実施形態にお
いて、3:1~7:1である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬Bは
、酢酸無水物であり、いくつかの実施形態において、キャッピング試薬Bは、酢酸無水物
のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積比が1:1
~1:10であり、他のいくつかの実施形態において1:2~1:6である。
生成物をキャッピング反応条件で、有機溶剤において、キャッピング試薬及びアシル化触
媒と接触させ、単離して式(321)に示される化合物を得ることをさらに含む。前記キ
ャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるため
に、まだ反応していないすべての活性官能基を除去することである。前記キャッピング反
応の条件としては、反応温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態において、15~
35℃であり、反応時間が1~10hであり、いくつかの実施形態において、3~6hで
ある。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、siRNA固相合成に用いられるキ
ャッピング試薬であってもよい。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は
、キャッピング試薬A(capA)及びキャッピング試薬B(capB)からなる。キャ
ッピング試薬Aは、N-メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、N-
メチルイミダゾールのピリジン/アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとア
セトニトリルとの体積比が1:10~1:1である。いくつかの実施形態において、1:
3~1:1である。いくつかの実施形態において、ピリジンとアセトニトリルの総体積と
N-メチルイミダゾールとの体積比が1:1~10:1であり、いくつかの実施形態にお
いて、3:1~7:1である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬Bは
、酢酸無水物であり、いくつかの実施形態において、キャッピング試薬Bは、酢酸無水物
のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積比が1:1
~1:10であり、他のいくつかの実施形態において1:2~1:6である。
いくつかの実施形態において、前記N-メチルイミダゾールのピリジン/アセトニトリ
ル混合溶液の体積と式(313)の化合物の質量との比が5ml/g~50ml/gであ
り、いくつかの実施形態において、15ml/g~30ml/gである。前記酢酸無水物
のアセトニトリル溶液の体積と式(313)の化合物の質量との比が0.5ml/g~1
0ml/gであり、いくつかの実施形態において、1ml/g~5ml/gである。
ル混合溶液の体積と式(313)の化合物の質量との比が5ml/g~50ml/gであ
り、いくつかの実施形態において、15ml/g~30ml/gである。前記酢酸無水物
のアセトニトリル溶液の体積と式(313)の化合物の質量との比が0.5ml/g~1
0ml/gであり、いくつかの実施形態において、1ml/g~5ml/gである。
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬は、等モル量の酢酸無水物とN-メチ
ルイミダゾールである。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル
、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,
N-ジメチルホルムアミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種で
ある。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式(31
3)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が10~50L/molであり、いくつかの
実施形態において、5~30L/molである。
ルイミダゾールである。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル
、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,
N-ジメチルホルムアミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種で
ある。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式(31
3)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が10~50L/molであり、いくつかの
実施形態において、5~30L/molである。
いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、エステル化又はアミド化反応に使
用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実
施形態において、前記アシル化触媒は、4-ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と
式(313)に示される化合物との質量比が0.001:1~1:1であり、いくつかの
実施形態において、0.01:1~0.1:1である。
用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実
施形態において、前記アシル化触媒は、4-ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と
式(313)に示される化合物との質量比が0.001:1~1:1であり、いくつかの
実施形態において、0.01:1~0.1:1である。
いくつかの実施形態において、任意の適切な方法により反応混合物から式(321)の
化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し
、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することによ
り、式(321)の化合物を得ることができ、前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロ
ロメタン又はメタノールから選択され、いくつかの実施形態において、有機溶剤は、アセ
トニトリルである。
化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し
、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することによ
り、式(321)の化合物を得ることができ、前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロ
ロメタン又はメタノールから選択され、いくつかの実施形態において、有機溶剤は、アセ
トニトリルである。
いくつかの実施形態において、式(321)に示される複合分子の調製方法は、有機溶
剤において、カップリング反応条件で、カップリング試薬の存在下で、式(313)に示
される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式(321)に示される化合
物を得ることを含む。この場合、R4に第1の官能基であるヒドロキシ保護基及び第2の
官能基である式(C3)に示される基が含まれる式(321)の化合物が得られる。
剤において、カップリング反応条件で、カップリング試薬の存在下で、式(313)に示
される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式(321)に示される化合
物を得ることを含む。この場合、R4に第1の官能基であるヒドロキシ保護基及び第2の
官能基である式(C3)に示される基が含まれる式(321)の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件としては、温度が0~50℃であ
り、例えば15~35℃であり、式(313)の化合物とホスホルジアミダイトとのモル
比が1:1~1:50であってもよく、例えば1:5~1:15である。式(313)の
化合物とカップリング試薬とのモル比が1:1~1:100であってもよく、例えば1:
50~1:80である。反応時間が200~3000秒であってもよく、例えば500~
1500秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス(ジイソプロピルアミノ)
(2-シアノエトキシ)ホスフィンであってもよく、市販品として購入されてもよく、又
は本分野で公知の方法により調製されてもよい。カップリング試薬は、1H-テトラゾー
ル、5-エチルチオ-1H-テトラゾール、5-ベンジルチオ-1H-テトラゾールの1
種又は複数種から選択され、例えば、5-エチルチオ-1H-テトラゾールである。前記
カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル
、無水DMF、無水ジクロロメタンから選択される1種又は複数種であり、無水アセトニ
トリルであることが好ましい。式(313)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が3
~50L/molであってもよく、例えば、5~20L/molであってもよい。当該カ
ップリング反応を行うことにより、式(313)の化合物におけるヒドロキシ基とホスホ
ルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式(321)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
り、例えば15~35℃であり、式(313)の化合物とホスホルジアミダイトとのモル
比が1:1~1:50であってもよく、例えば1:5~1:15である。式(313)の
化合物とカップリング試薬とのモル比が1:1~1:100であってもよく、例えば1:
50~1:80である。反応時間が200~3000秒であってもよく、例えば500~
1500秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス(ジイソプロピルアミノ)
(2-シアノエトキシ)ホスフィンであってもよく、市販品として購入されてもよく、又
は本分野で公知の方法により調製されてもよい。カップリング試薬は、1H-テトラゾー
ル、5-エチルチオ-1H-テトラゾール、5-ベンジルチオ-1H-テトラゾールの1
種又は複数種から選択され、例えば、5-エチルチオ-1H-テトラゾールである。前記
カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル
、無水DMF、無水ジクロロメタンから選択される1種又は複数種であり、無水アセトニ
トリルであることが好ましい。式(313)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が3
~50L/molであってもよく、例えば、5~20L/molであってもよい。当該カ
ップリング反応を行うことにより、式(313)の化合物におけるヒドロキシ基とホスホ
ルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式(321)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式(321)の化合物の調製方法は、カップリング反応
条件で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離生成物をヒドロキシ基含
有固相担体と接触させることをさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い
、単離して式(321)の化合物を得る。この場合、R4に第1の官能基であるヒドロキ
シ保護基及び第2の官能基である式(C3’)に示される基が含まれる式(321)の化
合物が得られる。
条件で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離生成物をヒドロキシ基含
有固相担体と接触させることをさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い
、単離して式(321)の化合物を得る。この場合、R4に第1の官能基であるヒドロキ
シ保護基及び第2の官能基である式(C3’)に示される基が含まれる式(321)の化
合物が得られる。
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、核酸固相合成に使用できる固相担体で
あり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体(例えば、NittoPhase
(登録商標)HL UnyLinkerTM 300 Oligonucleotide
Synthesis Support、Kinovate Life Science
s、構造が式B80に示される)であってもよい。
あり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体(例えば、NittoPhase
(登録商標)HL UnyLinkerTM 300 Oligonucleotide
Synthesis Support、Kinovate Life Science
s、構造が式B80に示される)であってもよい。
脱保護反応は、本分野において周知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件
としては、温度が0~50℃であり、例えば15~35℃であり、反応時間が30~30
0秒、例えば50~150秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸
、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される1種又は複数種であってよく、いくつかの実
施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における-
DMTr(4,4’-ジメトキシトリチル)保護基とのモル比が2:1~100:1であ
ってもよく、例えば3:1~50:1である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担
体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、後のカップリング反応を行うこ
とができる。
としては、温度が0~50℃であり、例えば15~35℃であり、反応時間が30~30
0秒、例えば50~150秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸
、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される1種又は複数種であってよく、いくつかの実
施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における-
DMTr(4,4’-ジメトキシトリチル)保護基とのモル比が2:1~100:1であ
ってもよく、例えば3:1~50:1である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担
体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、後のカップリング反応を行うこ
とができる。
カップリング反応条件及びカップリング試薬は、以上のように選択してもよい。当該カ
ップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホル
アミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
ップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホル
アミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件としては、温度が0~50℃であ
り、例えば15~35℃であり、反応時間が5~500秒であり、例えば10~100秒
である。キャッピング試薬と用量は、以上のように選択してもよい。
り、例えば15~35℃であり、反応時間が5~500秒であり、例えば10~100秒
である。キャッピング試薬と用量は、以上のように選択してもよい。
酸化反応条件としては、温度が0~50℃であってもよく、例えば、15~35℃であ
ってもよく、反応時間が1~100秒、例えば5~50秒であり、酸化試薬は、例えば、
ヨウ素であってもよい(いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する)。いく
つかの実施形態において、酸化試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が1:1
~100:1であり、5:1~50:1であることが好ましい。いくつかの実施形態にお
いて、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン:水:ピリジン=3:1:1~1:1:3の
混合溶剤で行われる。
ってもよく、反応時間が1~100秒、例えば5~50秒であり、酸化試薬は、例えば、
ヨウ素であってもよい(いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する)。いく
つかの実施形態において、酸化試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が1:1
~100:1であり、5:1~50:1であることが好ましい。いくつかの実施形態にお
いて、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン:水:ピリジン=3:1:1~1:1:3の
混合溶剤で行われる。
いくつかの実施形態において、R6は、式B7又はB8であり、この場合、式(313
)に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件で、アミド化反応縮合剤及
び第3級アミンの存在下で、式(314)に示される化合物を式(A-1)に示される化
合物又は式(A-2)に示される化合物と接触させ、単離して式(313)に示される化
合物を得る、という調製方法により得ることができる。
)に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件で、アミド化反応縮合剤及
び第3級アミンの存在下で、式(314)に示される化合物を式(A-1)に示される化
合物又は式(A-2)に示される化合物と接触させ、単離して式(313)に示される化
合物を得る、という調製方法により得ることができる。
前記アミド化反応条件としては、反応温度が0~100℃であり、反応時間が1~48
時間であってもよい。いくつかの実施形態において、前記アミド化反応条件としては、反
応温度が10~40℃であり、反応時間が2~16時間である。
時間であってもよい。いくつかの実施形態において、前記アミド化反応条件としては、反
応温度が10~40℃であり、反応時間が2~16時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール溶剤、エポキシ溶剤、エー
テル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムア
ミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。いくつかの実施
形態において、前記アルコール溶剤は、メタノール、エタノール及びプロパノールの1種
又は複数種であり、他のいくつかの実施形態において、エタノールである。いくつかの実
施形態において、前記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランである
。いくつかの実施形態において、前記エーテル溶剤は、エチルエーテル及び/又はメチル
tert-ブチルエーテルである。いくつかの実施形態において、前記ハロゲン化アルキ
ル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエタンの1種又は
複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。
式(314)の化合物に対して、有機溶剤の用量が3~50L/molであり、1つの実
施形態において、3~20L/molである。
テル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムア
ミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。いくつかの実施
形態において、前記アルコール溶剤は、メタノール、エタノール及びプロパノールの1種
又は複数種であり、他のいくつかの実施形態において、エタノールである。いくつかの実
施形態において、前記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランである
。いくつかの実施形態において、前記エーテル溶剤は、エチルエーテル及び/又はメチル
tert-ブチルエーテルである。いくつかの実施形態において、前記ハロゲン化アルキ
ル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエタンの1種又は
複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。
式(314)の化合物に対して、有機溶剤の用量が3~50L/molであり、1つの実
施形態において、3~20L/molである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール-1-
イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、3-ジエトキシ
ホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン、4-(4,6-
ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩、2-エトキシ-1-
エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)又はO-ベンゾトリアゾー
ル-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、さらなる実施形態にお
いて、3-ジエトキシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン4(3H)-オ
ンである。前記アミド化反応縮合剤と式(314)に示される化合物とのモル比が1:1
~10:1であってもよく、いくつかの実施形態において、2.5:1~5:1である。
イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、3-ジエトキシ
ホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン、4-(4,6-
ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩、2-エトキシ-1-
エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)又はO-ベンゾトリアゾー
ル-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、さらなる実施形態にお
いて、3-ジエトキシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン4(3H)-オ
ンである。前記アミド化反応縮合剤と式(314)に示される化合物とのモル比が1:1
~10:1であってもよく、いくつかの実施形態において、2.5:1~5:1である。
いくつかの実施形態において、前記第3級アミンは、トリエチルアミン又はN,N-ジ
イソプロピルエチルアミンであり、さらなる実施形態において、N,N-ジイソプロピル
エチルアミンである。前記第3級アミンと式(314)に示される化合物とのモル比が3
:1~20:1であり、1つの実施形態において、5:1~10:1である。
イソプロピルエチルアミンであり、さらなる実施形態において、N,N-ジイソプロピル
エチルアミンである。前記第3級アミンと式(314)に示される化合物とのモル比が3
:1~20:1であり、1つの実施形態において、5:1~10:1である。
いくつかの実施形態において、式(A-1)及び式(A-2)の化合物は、任意の適当
な方法により調製されてもよい。例えば、RkがDMTr基である場合、グリセリン酸カ
ルシウムとDMTrClを反応させて式(A-1)の化合物を調製することができる。同
様に、3-アミノ-1,2-プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、DMTr
Clと反応させて式(A-2)の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭
素原子数4~13、1つの実施形態においては4~8の環状酸無水物であってもよい。当
業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、(A-2)の化合物
におけるq2の異なる値に対応し、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場
合、q2=1であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、q2=2であり
、以下類推してもよい。
な方法により調製されてもよい。例えば、RkがDMTr基である場合、グリセリン酸カ
ルシウムとDMTrClを反応させて式(A-1)の化合物を調製することができる。同
様に、3-アミノ-1,2-プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、DMTr
Clと反応させて式(A-2)の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭
素原子数4~13、1つの実施形態においては4~8の環状酸無水物であってもよい。当
業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、(A-2)の化合物
におけるq2の異なる値に対応し、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場
合、q2=1であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、q2=2であり
、以下類推してもよい。
いくつかの変形において、式(314)に示される化合物を、前記環状酸無水物、3-
アミノ-1,2-プロパンジオール及びDMTrClと順に反応させることにより、式(
313)の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、こ
れらの変形は、式(313)の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当
業者が上記方法により容易に実現されるものである。
アミノ-1,2-プロパンジオール及びDMTrClと順に反応させることにより、式(
313)の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、こ
れらの変形は、式(313)の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当
業者が上記方法により容易に実現されるものである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式(313)の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(313)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロ
ロメタン:N,N-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5~1:1:1:0.6で
勾配溶出する、(2)逆相精製:C18、C8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリ
ル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出するという2つのクロマトグラフィー条件で単離
することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式(313)の
化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができ
る。
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(313)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロ
ロメタン:N,N-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5~1:1:1:0.6で
勾配溶出する、(2)逆相精製:C18、C8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリ
ル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出するという2つのクロマトグラフィー条件で単離
することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式(313)の
化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができ
る。
いくつかの実施形態において、式(314)に示される化合物は、有機溶剤において、
脱保護反応条件下で、式(315)に示される化合物をハロ酢酸と接触させ、単離して前
記式(314)に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
脱保護反応条件下で、式(315)に示される化合物をハロ酢酸と接触させ、単離して前
記式(314)に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
前記ハロ酢酸は、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、クロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸か
ら選択される1種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸
である。
ら選択される1種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸
である。
前記脱保護反応条件としては、反応温度が0~100℃であり、反応時間が0.1~2
4時間であってもよく、1つの実施形態において、反応温度が10~40℃であり、反応
時間が0.5~16時間である。
4時間であってもよく、1つの実施形態において、反応温度が10~40℃であり、反応
時間が0.5~16時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲ
ン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド及びN,N-
ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。前記エポキシ溶剤は、1つの実施
形態において、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル溶剤は、
いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエーテ
ルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタ
ン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種であり、いくつかの
実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式(315)の化合物に対
して、有機溶剤の用量が3~50L/molであり、さらなる実施形態において、5~2
0L/molである。
ン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド及びN,N-
ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。前記エポキシ溶剤は、1つの実施
形態において、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル溶剤は、
いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエーテ
ルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタ
ン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種であり、いくつかの
実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式(315)の化合物に対
して、有機溶剤の用量が3~50L/molであり、さらなる実施形態において、5~2
0L/molである。
前記ハロ酢酸と前記式(315)に示される化合物とのモル比が5:1~100:1で
あってもよく、いくつかの実施形態において、10:1~50:1である。
あってもよく、いくつかの実施形態において、10:1~50:1である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式(314)の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(314)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン:メタノール=10
0:30~100:40で勾配溶出する、(2)逆相精製:C18及びC8逆相充填剤を
、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出するという2つのク
ロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直
接に除去して式(314)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま
後の反応に用いることができる。
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(314)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン:メタノール=10
0:30~100:40で勾配溶出する、(2)逆相精製:C18及びC8逆相充填剤を
、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出するという2つのク
ロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直
接に除去して式(314)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま
後の反応に用いることができる。
式(315)に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第3級ア
ミンの存在下及び縮合反応条件下で、式(317)に示される化合物を式(316)に示
される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
ミンの存在下及び縮合反応条件下で、式(317)に示される化合物を式(316)に示
される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
式(316)の化合物としては、例えば、J. Am. Chem. Soc. 20
14,136,16958-16961に開示された化合物を用いてもよく、又は、式(
316)の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、US 8
,106,022 B2の実施例1に開示された方法を参照していくつかの式(316)
の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書
に組み込まれる。
14,136,16958-16961に開示された化合物を用いてもよく、又は、式(
316)の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、US 8
,106,022 B2の実施例1に開示された方法を参照していくつかの式(316)
の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書
に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件としては、反応温度が0~100℃で
あり、反応時間が0.1~24時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が1
0~40℃であり、反応時間が0.5~16時間である。
あり、反応時間が0.1~24時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が1
0~40℃であり、反応時間が0.5~16時間である。
前記式(316)に示される化合物と前記式(317)に示される化合物とのモル比が
2:1~10:1であってもよく、いくつかの実施形態において、2.5:1~5:1で
ある。
2:1~10:1であってもよく、いくつかの実施形態において、2.5:1~5:1で
ある。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ溶剤、エー
テル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムア
ミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。前記エポキシ溶
剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランであり、
前記エーテル溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び/又はメチルt
ert-ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、1つの実施形態におい
て、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種で
あり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式(31
7)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が3~50L/molであってもよく、1つ
の実施形態において、5~20L/molである。
テル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムア
ミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。前記エポキシ溶
剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び/又はテトラヒドロフランであり、
前記エーテル溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び/又はメチルt
ert-ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、1つの実施形態におい
て、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種で
あり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式(31
7)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が3~50L/molであってもよく、1つ
の実施形態において、5~20L/molである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール-1-
イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、3-ジエトキシ
ホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン(DEPBT)、
O-ベンゾトリアゾール-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又は4-
(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩であり、さ
らなる実施形態において、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチ
ルモルホリン塩酸塩であってもよい。前記アミド化反応縮合剤と式(317)に示される
化合物とのモル比が2:1~10:1であり、いくつかの実施形態において、2.5:1
~5:1である。
イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、3-ジエトキシ
ホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン(DEPBT)、
O-ベンゾトリアゾール-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又は4-
(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩であり、さ
らなる実施形態において、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチ
ルモルホリン塩酸塩であってもよい。前記アミド化反応縮合剤と式(317)に示される
化合物とのモル比が2:1~10:1であり、いくつかの実施形態において、2.5:1
~5:1である。
前記第3級アミンは、N-メチルモルホリン、トリエチルアミン又はN,N-ジイソプ
ロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、N-メチルモルホリ
ンであり、前記第3級アミンと式(317)に示される化合物とのモル比が3:1~20
:1であってもよく、いくつかの実施形態において、5:1~10:1である。
ロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、N-メチルモルホリ
ンであり、前記第3級アミンと式(317)に示される化合物とのモル比が3:1~20
:1であってもよく、いくつかの実施形態において、5:1~10:1である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式(315)の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(315)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン:メタノール=10
0:5~100:7で勾配溶出する、(2)逆相精製:C18及びC8逆相充填剤を、メ
タノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出するという2つのクロマ
トグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に
除去して式(315)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の
反応に用いることができる。
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(315)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン:メタノール=10
0:5~100:7で勾配溶出する、(2)逆相精製:C18及びC8逆相充填剤を、メ
タノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出するという2つのクロマ
トグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に
除去して式(315)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の
反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式(317)の化合物と十分な量の式(316)の化合
物を一度反応させるだけで所望の式(315)の化合物を生成し、式(315)の化合物
は、各S1-L1基同士が同じである。いくつかの実施形態において、必要に応じて、式
(317)の化合物を、異なる式(316)の化合物、即ち、L1及び/又はS1が異な
る式(316)の化合物とバッチ反応させることにより、生成された式(315)の化合
物に2種類以上のS1及び/又はL1を含ませることができる。例えば、1eqの式(3
17)の化合物と2eqの第1の式(316)の化合物を接触させ、式(317)の化合
物における2つの末端第一級アミン基に第1のS1-L1基を結合した後、続いて(n3
+n1-1)eqの第2の式(316)の化合物と接触させ(n3及びn1の定義と値の
範囲は、前述したとおりである)、式(317)の化合物における(n3+n1-1)個
の第二級アミン基に第2のS1-L1基を結合することができる。
物を一度反応させるだけで所望の式(315)の化合物を生成し、式(315)の化合物
は、各S1-L1基同士が同じである。いくつかの実施形態において、必要に応じて、式
(317)の化合物を、異なる式(316)の化合物、即ち、L1及び/又はS1が異な
る式(316)の化合物とバッチ反応させることにより、生成された式(315)の化合
物に2種類以上のS1及び/又はL1を含ませることができる。例えば、1eqの式(3
17)の化合物と2eqの第1の式(316)の化合物を接触させ、式(317)の化合
物における2つの末端第一級アミン基に第1のS1-L1基を結合した後、続いて(n3
+n1-1)eqの第2の式(316)の化合物と接触させ(n3及びn1の定義と値の
範囲は、前述したとおりである)、式(317)の化合物における(n3+n1-1)個
の第二級アミン基に第2のS1-L1基を結合することができる。
いくつかの実施形態において、式(317)に示される化合物は、有機溶剤の存在下で
、脱保護反応条件下で、式(318)に示される化合物をメチルアミン水溶液と接触させ
、単離して式(317)に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることがで
きる。
、脱保護反応条件下で、式(318)に示される化合物をメチルアミン水溶液と接触させ
、単離して式(317)に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることがで
きる。
前記脱保護反応条件としては、反応温度が0~150℃であり、反応時間が5~72時
間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が20~80℃であり、反応
時間が10~30時間である。
間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が20~80℃であり、反応
時間が10~30時間である。
前記有機溶剤は、アルコールから選択されてもよく、いくつかの実施形態において、メ
タノール、エタノール及びイソプロパノールの1つであり、いくつかの実施形態において
、メタノールであり、式(318)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が1~20L
/molであってもよく、1つの実施形態において、1.5~10L/molである。
タノール、エタノール及びイソプロパノールの1つであり、いくつかの実施形態において
、メタノールであり、式(318)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が1~20L
/molであってもよく、1つの実施形態において、1.5~10L/molである。
前記メチルアミン水溶液の濃度が30~40質量%であってもよく、メチルアミンと式
(318)に示される化合物とのモル比が10:1~500:1であってもよく、いくつ
かの実施形態において、50:1~200:1である。
(318)に示される化合物とのモル比が10:1~500:1であってもよく、いくつ
かの実施形態において、50:1~200:1である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式(317)の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(317)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン:メタノール:アン
モニア水(25wt%)=1:1:0.05~1:1:0.25で勾配溶出する、(2)
逆相精製:C18及びC8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1
:0.1で勾配溶出するという2つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。
いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式(317)の化合物の粗製品を得
ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(317)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン:メタノール:アン
モニア水(25wt%)=1:1:0.05~1:1:0.25で勾配溶出する、(2)
逆相精製:C18及びC8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1
:0.1で勾配溶出するという2つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。
いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式(317)の化合物の粗製品を得
ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式(318)に示される化合物は、有機溶剤の存在下で
、置換反応条件で、式(319)に示される化合物を、トリフェニルクロロメタン(Tr
Cl)、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタ
ン又はトリエチルフェニルクロロメタン、いくつかの実施形態においてトリフェニルクロ
ロメタン(TrCl)と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることがで
きる。
、置換反応条件で、式(319)に示される化合物を、トリフェニルクロロメタン(Tr
Cl)、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタ
ン又はトリエチルフェニルクロロメタン、いくつかの実施形態においてトリフェニルクロ
ロメタン(TrCl)と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることがで
きる。
前記置換反応条件としては、反応温度が0~100℃であり、反応時間が5~72時間
であってもよく、1つの実施形態において、反応温度が10~40℃であり、反応時間が
10~30時間である。
であってもよく、1つの実施形態において、反応温度が10~40℃であり、反応時間が
10~30時間である。
トリフェニルクロロメタン(TrCl)、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フ
ェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンは、市販品と
して得られることができ、トリフェニルクロロメタン(TrCl)、ジフェニルエチルフ
ェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルク
ロロメタンと式(319)に示される化合物とのモル比が1:1~10:1であってもよ
く、いくつかの実施形態において、1:1~3:1である。
ェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンは、市販品と
して得られることができ、トリフェニルクロロメタン(TrCl)、ジフェニルエチルフ
ェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルク
ロロメタンと式(319)に示される化合物とのモル比が1:1~10:1であってもよ
く、いくつかの実施形態において、1:1~3:1である。
前記有機溶剤は、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルス
ルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの
1種又は複数種であってもよい。前記エポキシ溶剤は、いくつかの実施形態において、ジ
オキサン及び/又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル溶剤は、1つの実施形態に
おいて、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエーテルであり、前記ハロゲ
ン化アルキル溶剤は、1つの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び
1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種であり、1つの実施形態において、前記有機溶
剤は、ジクロロメタンである。式(319)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が3
~50L/molであり、1つの実施形態において、5~20L/molである。
ルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの
1種又は複数種であってもよい。前記エポキシ溶剤は、いくつかの実施形態において、ジ
オキサン及び/又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル溶剤は、1つの実施形態に
おいて、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエーテルであり、前記ハロゲ
ン化アルキル溶剤は、1つの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び
1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種であり、1つの実施形態において、前記有機溶
剤は、ジクロロメタンである。式(319)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が3
~50L/molであり、1つの実施形態において、5~20L/molである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式(318)の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(318)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール:ジクロロメタン=0.
01:1~0.5:1で、又はメタノール:ジクロロメタン:酢酸エチル:石油エーテル
=0.1:1:1:1~1:1:1:1で勾配溶出する、(2)逆相精製:C18及びC
8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出する
という2つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式(318)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(318)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール:ジクロロメタン=0.
01:1~0.5:1で、又はメタノール:ジクロロメタン:酢酸エチル:石油エーテル
=0.1:1:1:1~1:1:1:1で勾配溶出する、(2)逆相精製:C18及びC
8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出する
という2つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式(318)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式(319)に示される化合物は、有機溶剤において、
置換反応条件で、式(320)に示される化合物をトリフルオロ酢酸エチルと接触させ、
単離して式(319)に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができ
る。
置換反応条件で、式(320)に示される化合物をトリフルオロ酢酸エチルと接触させ、
単離して式(319)に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができ
る。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ溶剤、エー
テル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムア
ミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。いくつかの実施
形態において、前記エポキシ溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び/又
はテトラヒドロフランであり、いくつかの実施形態において、前記エーテル溶剤は、1つ
の実施形態において、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエーテルであり
、いくつかの実施形態において、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、1つの実施形態におい
て、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種で
あり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式(32
0)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が1~50L/molであり、いくつかの実
施形態において、1~20L/molである。
テル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムア
ミド及びN,N-ジイソプロピルエチルアミンの1種又は複数種である。いくつかの実施
形態において、前記エポキシ溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び/又
はテトラヒドロフランであり、いくつかの実施形態において、前記エーテル溶剤は、1つ
の実施形態において、エチルエーテル及び/又はメチルtert-ブチルエーテルであり
、いくつかの実施形態において、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、1つの実施形態におい
て、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び1,2-ジクロロエタンの1種又は複数種で
あり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式(32
0)の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が1~50L/molであり、いくつかの実
施形態において、1~20L/molである。
前記置換反応条件としては、反応温度が0~100℃であり、反応時間が5~72時間
であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が10~40℃であり、反応時
間が10~30時間である。
であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が10~40℃であり、反応時
間が10~30時間である。
式(320)の化合物は、市販品として得られ、又は、当業者により既知の方法を用い
て得ることができる。例えば、m1=m2=m3=3、n1=1、n3=2であり、R1
0、R11、R12、R13、R14、R15がいずれもHである場合、式(320)の
化合物は、アルファ・エイサー社(Alfa Aesar Inc.)から市販品として
得ることができる。
て得ることができる。例えば、m1=m2=m3=3、n1=1、n3=2であり、R1
0、R11、R12、R13、R14、R15がいずれもHである場合、式(320)の
化合物は、アルファ・エイサー社(Alfa Aesar Inc.)から市販品として
得ることができる。
前記トリフルオロ酢酸エチルと式(320)に示される化合物とのモル比が2:1~1
0:1であってもよく、1つの実施形態において、3:1~5:1である。
0:1であってもよく、1つの実施形態において、3:1~5:1である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式(319)の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(319)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール:ジクロロメタン=0.
01:1~0.5:1で、又はメタノール:ジクロロメタン:酢酸エチル:石油エーテル
=0.1:1:1:1~1:1:1:1で勾配溶出する、(2)逆相精製:C18及びC
8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出する
という2つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式(319)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式(319)の化合物を単離することができ、例えば、(1)順相精
製:200~300メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール:ジクロロメタン=0.
01:1~0.5:1で、又はメタノール:ジクロロメタン:酢酸エチル:石油エーテル
=0.1:1:1:1~1:1:1:1で勾配溶出する、(2)逆相精製:C18及びC
8逆相充填剤を、メタノール:アセトニトリル=0.1:1~1:0.1で勾配溶出する
という2つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式(319)の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
<複合体>
他の側面において、本開示は、式(1)に示される構造を有する複合体を提供する。
他の側面において、本開示は、式(1)に示される構造を有する複合体を提供する。
n1は1~3の整数であり、n3は0~4の整数であり、
各m1、m2及びm3が独立して2~10の整数であり、
各R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1-
C10アルキル基、C1-C10ハロゲン化アルキル又はC1-C10アルコキシ基から
選択され、いくつかの実施形態において、R10、R11、R12、R13、R14及び
R15がそれぞれ独立してH、メチル基又はエチル基から選択され、
R3は活性薬物であり、いくつかの実施形態において、R3が機能性オリゴヌクレオチ
ドを含み、
R2は、長さ1~20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の
炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニレ
ン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロシ
クリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基から選択される1又は複数で任意に置換
され、R2は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-C10ヘテロ
アリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキル基、-OC
1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1-C10ハロ
ゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキルフェニル基
、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置
換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N(C1-C1
0アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキル基)、-N
(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基)、-NH(C1-C1
0アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O(C1-C1
0アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-
CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10ア
ルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(
C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェニル基)、-
C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニル基、-C(
O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C10アルキル基、-SO
2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1-C10ハロ
ゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキル基)、-S
O2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-NHSO2(フ
ェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)から選択されるいず
れか1つ又は複数の基で任意に置換され、
各L1は、長さ1~70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数
の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニ
レン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロ
シクリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数
で任意に置換され、L1は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-
C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキ
ル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1
-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキ
ルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基
、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N
(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキ
ル基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基)、-NH
(C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O
(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アル
キル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C
1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル
)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェ
ニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニ
ル基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C10アルキ
ル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1
-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキ
ル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-N
HSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)からな
る群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、いくつかの実施形態において、L1
は、式A1~A26の基又はその任意の組合せから選択されてもよく、A1~A26の構
造と定義は、前述したとおりである。
n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15及
びM1は、前述したように定義される。
びM1は、前述したように定義される。
いくつかの実施形態において、R2は、式(321)の化合物におけるR4基が反応を
経て活性薬物に結合して形成された結合基である。いくつかの実施形態において、R2は
、式(321)の化合物におけるR4基が反応を経て機能性オリゴヌクレオチドに結合し
て形成された結合基である。いくつかの実施形態において、R2基には、窒素含有骨格上
のN原子に結合される結合部位及びR3におけるP原子に結合される結合部位がともに含
まれる。いくつかの実施形態において、R2における窒素含有骨格上のN原子に結合され
る部位は、N原子とアミド結合を形成し、前記R3におけるP原子に結合される部位は、
P原子とリン酸エステル結合を形成する。いくつかの実施形態において、R2は、B5、
B6、B5’又はB6’であってもよい。
経て活性薬物に結合して形成された結合基である。いくつかの実施形態において、R2は
、式(321)の化合物におけるR4基が反応を経て機能性オリゴヌクレオチドに結合し
て形成された結合基である。いくつかの実施形態において、R2基には、窒素含有骨格上
のN原子に結合される結合部位及びR3におけるP原子に結合される結合部位がともに含
まれる。いくつかの実施形態において、R2における窒素含有骨格上のN原子に結合され
る部位は、N原子とアミド結合を形成し、前記R3におけるP原子に結合される部位は、
P原子とリン酸エステル結合を形成する。いくつかの実施形態において、R2は、B5、
B6、B5’又はB6’であってもよい。
いくつかの実施形態において、R3は、A59に示される構造の基である。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」基又は分子とは、対応するリガ
ンドと共有結合を形成できる基又は分子を指し、複合基又は分子及びそのリガンドは、い
ずれも特定の機能を有する。これに応じて、「複合体」とは、当該化学基とそのリガンド
が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらには、「オリゴヌクレ
オチド複合体」は、特定の機能を有する1又は複数の複合基がオリゴヌクレオチドに共有
結合的に結合して形成された化合物を表す。いくつかの実施形態において、本明細書で開
示された複合体は、オリゴヌクレオチド複合体である。本開示の文脈において、「複合分
子」は、反応することによりオリゴヌクレオチドに複合され、最終的に本開示のオリゴヌ
クレオチド複合体を形成することができる特定の化合物である。いくつかの実施形態にお
いて、オリゴヌクレオチドはsiRNAであり、この場合、本開示の複合体は、siRN
A複合体である。
ンドと共有結合を形成できる基又は分子を指し、複合基又は分子及びそのリガンドは、い
ずれも特定の機能を有する。これに応じて、「複合体」とは、当該化学基とそのリガンド
が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらには、「オリゴヌクレ
オチド複合体」は、特定の機能を有する1又は複数の複合基がオリゴヌクレオチドに共有
結合的に結合して形成された化合物を表す。いくつかの実施形態において、本明細書で開
示された複合体は、オリゴヌクレオチド複合体である。本開示の文脈において、「複合分
子」は、反応することによりオリゴヌクレオチドに複合され、最終的に本開示のオリゴヌ
クレオチド複合体を形成することができる特定の化合物である。いくつかの実施形態にお
いて、オリゴヌクレオチドはsiRNAであり、この場合、本開示の複合体は、siRN
A複合体である。
いくつかの実施形態において、複合体は、式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)
、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(
16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)又は(22)に示される構
造を有する。
、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(
16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)又は(22)に示される構
造を有する。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体におけるオリゴヌク
レオチドは、機能性オリゴヌクレオチドである。機能性オリゴヌクレオチドとは、標的配
列との間に安定的で特異的なハイブリダイゼーションを生じさせることで、RNA活性化
(RNA activation、RNAa)、RNA干渉(RNA interfer
ence、RNAi)、アンチセンス核酸技術、エキソンスキッピング(exon sk
ipping)技術等の原理により、標的遺伝子の発現を上向き調節又は下向き調節し、
又はmRNAの選択的スプライシングシングを引き起こすことができるオリゴヌクレオチ
ドを指す。いくつかの側面において、機能性オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質との
間に安定的で特異的な結合を生じることができる核酸構造であってもよい。また、当業者
であれば容易に理解できるように、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA自体又はその断
片)も、同様に、本開示により提供される複合分子と複合して複合体を形成することによ
り、標的送達、例えば、肝標的送達を実現し、mRNAから転写されてきたタンパク質の
発現を調節することに適用される。したがって、文脈において、「機能性オリゴヌクレオ
チド」の概念は、mRNA又はその断片を含んでもよい。
レオチドは、機能性オリゴヌクレオチドである。機能性オリゴヌクレオチドとは、標的配
列との間に安定的で特異的なハイブリダイゼーションを生じさせることで、RNA活性化
(RNA activation、RNAa)、RNA干渉(RNA interfer
ence、RNAi)、アンチセンス核酸技術、エキソンスキッピング(exon sk
ipping)技術等の原理により、標的遺伝子の発現を上向き調節又は下向き調節し、
又はmRNAの選択的スプライシングシングを引き起こすことができるオリゴヌクレオチ
ドを指す。いくつかの側面において、機能性オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質との
間に安定的で特異的な結合を生じることができる核酸構造であってもよい。また、当業者
であれば容易に理解できるように、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA自体又はその断
片)も、同様に、本開示により提供される複合分子と複合して複合体を形成することによ
り、標的送達、例えば、肝標的送達を実現し、mRNAから転写されてきたタンパク質の
発現を調節することに適用される。したがって、文脈において、「機能性オリゴヌクレオ
チド」の概念は、mRNA又はその断片を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列と相互に作
用し、標的配列分子の正常機能に影響することができ、例えば、mRNAの開裂や翻訳阻
害、又は、エキソンスキッピングによるmRNAの選択的スプライシングシングなどを発
生させる。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列の
塩基と相補的である。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、
標的配列における80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%又は99%以上の塩基と相補的であり、又は標的配列と完全に相補的であることが
可能である。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列
と相補的でない1、2又は3個の塩基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前
記機能性オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び
修飾を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌク
レオチドは、一本鎖のDNA、RNA又はDNA-RNAキメラ(chimera)、又
は、二本鎖のDNA、RNA又はDNA-RNAハイブリッド(hybrid)である。
用し、標的配列分子の正常機能に影響することができ、例えば、mRNAの開裂や翻訳阻
害、又は、エキソンスキッピングによるmRNAの選択的スプライシングシングなどを発
生させる。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列の
塩基と相補的である。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、
標的配列における80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%又は99%以上の塩基と相補的であり、又は標的配列と完全に相補的であることが
可能である。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列
と相補的でない1、2又は3個の塩基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前
記機能性オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び
修飾を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌク
レオチドは、一本鎖のDNA、RNA又はDNA-RNAキメラ(chimera)、又
は、二本鎖のDNA、RNA又はDNA-RNAハイブリッド(hybrid)である。
これにより、いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体に適し
た機能性オリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(m
icroRNA)、抗マイクロRNA(antimiR)、マイクロRNA拮抗剤(an
tagomir)、マイクロRNA模倣物(microRNA mimics)、デコイ
オリゴヌクレオチド(decoy)、免疫刺激物(immune stimulator
y)、G-四重鎖(G-quadruplex)、選択的スプライスバリアント(spl
ice altering)、一本鎖RNA(ssRNA)、アンチセンス核酸(ant
isense)、核酸アプタマー(Nucleic Acid Aptamer)、低分
子活性化RNA(small activating RNA、saRNA)、ステムル
ープRNA(stem-loop RNA)又はDNAの1つであってもよい。WO20
15/006740A2には、異なるリガンドがオリゴヌクレオチドに複合される複合体
が開示されており、リガンドは、リンカー(linker)によりオリゴヌクレオチドに
結合される。前記オリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロR
NA(microRNA)、抗マイクロRNA(antimiR)、マイクロRNA拮抗
剤(antagomir)、マイクロRNA模倣物(microRNA mimics)
、デコイオリゴヌクレオチド(decoy)、免疫刺激物(immune stimul
atory)、G-四重鎖(G-quadruplex)、選択的スプライスバリアント
(splice altering)、一本鎖RNA(ssRNA)、アンチセンス核酸
(antisense)、アプタマー(aptamer)、ステムループRNA(ste
m-loop RNA)又はDNAから選択される1つである。これらの複合体は、オリ
ゴヌクレオチドの体内送達において良好な安定性を示す。さらなる実施形態において、本
開示のオリゴヌクレオチド複合体に適した機能性オリゴヌクレオチドは、WO20090
82607A2、WO2009073809A2又はWO2015006740A2に開
示されたオリゴヌクレオチドであり、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込
まれる。
た機能性オリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(m
icroRNA)、抗マイクロRNA(antimiR)、マイクロRNA拮抗剤(an
tagomir)、マイクロRNA模倣物(microRNA mimics)、デコイ
オリゴヌクレオチド(decoy)、免疫刺激物(immune stimulator
y)、G-四重鎖(G-quadruplex)、選択的スプライスバリアント(spl
ice altering)、一本鎖RNA(ssRNA)、アンチセンス核酸(ant
isense)、核酸アプタマー(Nucleic Acid Aptamer)、低分
子活性化RNA(small activating RNA、saRNA)、ステムル
ープRNA(stem-loop RNA)又はDNAの1つであってもよい。WO20
15/006740A2には、異なるリガンドがオリゴヌクレオチドに複合される複合体
が開示されており、リガンドは、リンカー(linker)によりオリゴヌクレオチドに
結合される。前記オリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロR
NA(microRNA)、抗マイクロRNA(antimiR)、マイクロRNA拮抗
剤(antagomir)、マイクロRNA模倣物(microRNA mimics)
、デコイオリゴヌクレオチド(decoy)、免疫刺激物(immune stimul
atory)、G-四重鎖(G-quadruplex)、選択的スプライスバリアント
(splice altering)、一本鎖RNA(ssRNA)、アンチセンス核酸
(antisense)、アプタマー(aptamer)、ステムループRNA(ste
m-loop RNA)又はDNAから選択される1つである。これらの複合体は、オリ
ゴヌクレオチドの体内送達において良好な安定性を示す。さらなる実施形態において、本
開示のオリゴヌクレオチド複合体に適した機能性オリゴヌクレオチドは、WO20090
82607A2、WO2009073809A2又はWO2015006740A2に開
示されたオリゴヌクレオチドであり、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込
まれる。
本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、活性剤、例えば、機能性オリゴヌクレオチドの
肝標的送達効率を向上させることにより、特定の細胞、例えば、肝細胞における特定の遺
伝子の異常発現を調節し、機能性オリゴヌクレオチドと細胞における標的配列との間の相
互作用を強化することができる。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝
臓に発現する内因性遺伝子であってもよく、肝臓で繁殖する病原体遺伝子であってもよい
。肝細胞に異常に発現する遺伝子は、例えば、ApoB、ApoC、ANGPTL3、P
CSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、H
BV、HCV等の遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態において、前記肝細胞に異
常に発現する遺伝子は、HBV遺伝子、ANGPTL3遺伝子又はAPOC3遺伝子であ
る。本開示の文脈において、HBV遺伝子とは、Genbank登録番号NC_0039
77.1に示される配列を有する遺伝子を指し、ANGPTL3遺伝子とは、Genba
nk登録番号NM_014495.3に示されるmRNA配列を有する遺伝子を指し、A
POC3遺伝子とは、Genbank登録番号NM_000040.1に示されるmRN
A配列を有する遺伝子を指す。
肝標的送達効率を向上させることにより、特定の細胞、例えば、肝細胞における特定の遺
伝子の異常発現を調節し、機能性オリゴヌクレオチドと細胞における標的配列との間の相
互作用を強化することができる。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝
臓に発現する内因性遺伝子であってもよく、肝臓で繁殖する病原体遺伝子であってもよい
。肝細胞に異常に発現する遺伝子は、例えば、ApoB、ApoC、ANGPTL3、P
CSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、H
BV、HCV等の遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態において、前記肝細胞に異
常に発現する遺伝子は、HBV遺伝子、ANGPTL3遺伝子又はAPOC3遺伝子であ
る。本開示の文脈において、HBV遺伝子とは、Genbank登録番号NC_0039
77.1に示される配列を有する遺伝子を指し、ANGPTL3遺伝子とは、Genba
nk登録番号NM_014495.3に示されるmRNA配列を有する遺伝子を指し、A
POC3遺伝子とは、Genbank登録番号NM_000040.1に示されるmRN
A配列を有する遺伝子を指す。
いくつかの実施形態において、「標的配列」は、標的mRNAである。本開示の文脈に
おいて、「標的mRNA」とは、例えば、肝細胞に異常に発現する遺伝子が対応するmR
NAを指し、過剰発現遺伝子が対応するmRNAであってもよいし、過少発現遺伝子が対
応するmRNAであってもよい。いくつかの実施形態において、疾患はmRNAの過剰発
現に起因する場合が多いので、標的mRNAは、過剰発現遺伝子が対応するmRNAであ
ることが好ましい。本開示のいくつかの実施形態において、上記異常発現遺伝子に対応す
る標的mRNAは、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TI
MP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等の遺伝子が
対応するmRNAであってもよい。いくつかの実施形態において、前記標的mRNAは、
対応するHBV遺伝子、ANGPTL3遺伝子又はAPOC3遺伝子から転写されたmR
NAであってもよい。
おいて、「標的mRNA」とは、例えば、肝細胞に異常に発現する遺伝子が対応するmR
NAを指し、過剰発現遺伝子が対応するmRNAであってもよいし、過少発現遺伝子が対
応するmRNAであってもよい。いくつかの実施形態において、疾患はmRNAの過剰発
現に起因する場合が多いので、標的mRNAは、過剰発現遺伝子が対応するmRNAであ
ることが好ましい。本開示のいくつかの実施形態において、上記異常発現遺伝子に対応す
る標的mRNAは、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TI
MP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等の遺伝子が
対応するmRNAであってもよい。いくつかの実施形態において、前記標的mRNAは、
対応するHBV遺伝子、ANGPTL3遺伝子又はAPOC3遺伝子から転写されたmR
NAであってもよい。
式A59におけるP原子は、オリゴヌクレオチド配列における任意の可能な位置に結合
されてもよく、例えば、オリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチドに結合されてもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリゴ
ヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、一本鎖RNA又はアプタマー)で
ある。この場合、式A59におけるP原子は、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域
に結合されてもよく、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域とは、前記一本鎖オリゴ
ヌクレオチドにおいてその一端から前の4個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態
において、式A59におけるP原子は、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの任意の末端に結
合される。
されてもよく、例えば、オリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチドに結合されてもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリゴ
ヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、一本鎖RNA又はアプタマー)で
ある。この場合、式A59におけるP原子は、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域
に結合されてもよく、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域とは、前記一本鎖オリゴ
ヌクレオチドにおいてその一端から前の4個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態
において、式A59におけるP原子は、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの任意の末端に結
合される。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリ
ゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、siRNA、microRNA
又はDNA)であり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖を含
む。いくつかの実施形態において、前記式A59におけるP原子は、前記二本鎖オリゴヌ
クレオチドにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端領域に結合され、前記末端領域と
は、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の4個のヌクレオチド
を指し、いくつかの実施形態において、式A59におけるP原子は、前記センス鎖又は前
記アンチセンス鎖の任意の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式A59にお
けるP原子は、前記センス鎖の3’末端に結合される。式A59におけるP原子が二本鎖
オリゴヌクレオチドのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、本開示により提供される
オリゴヌクレオチド複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独の二本鎖
オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を放出し、標的mRNAがタンパク質を翻訳する過
程を遮断し、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
ゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、siRNA、microRNA
又はDNA)であり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖を含
む。いくつかの実施形態において、前記式A59におけるP原子は、前記二本鎖オリゴヌ
クレオチドにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端領域に結合され、前記末端領域と
は、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の4個のヌクレオチド
を指し、いくつかの実施形態において、式A59におけるP原子は、前記センス鎖又は前
記アンチセンス鎖の任意の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式A59にお
けるP原子は、前記センス鎖の3’末端に結合される。式A59におけるP原子が二本鎖
オリゴヌクレオチドのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、本開示により提供される
オリゴヌクレオチド複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独の二本鎖
オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を放出し、標的mRNAがタンパク質を翻訳する過
程を遮断し、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
式A59におけるP原子は、オリゴヌクレオチド配列におけるヌクレオチド上の任意の
可能な位置、例えば、ヌクレオチドの5’位、ヌクレオチドの2’位、ヌクレオチドの3
’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式A5
9におけるP原子は、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記オリゴヌクレオチ
ド配列におけるヌクレオチドの2’位、3’位又は5’位に結合されてもよい。いくつか
の具体的な実施形態において、式A59におけるP原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配
列においてセンス鎖の3’末端のヌクレオチドの3’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子
に結合され、又は、式A59におけるP原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配列において
センス鎖におけるヌクレオチドの2’-ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌク
レオチドに結合され、又は、式A59におけるP原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配列
においてセンス鎖の5’末端のヌクレオチドの5’ヒドロキシ基中の水素原子を置換する
ことによりヌクレオチドに結合される。
可能な位置、例えば、ヌクレオチドの5’位、ヌクレオチドの2’位、ヌクレオチドの3
’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式A5
9におけるP原子は、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記オリゴヌクレオチ
ド配列におけるヌクレオチドの2’位、3’位又は5’位に結合されてもよい。いくつか
の具体的な実施形態において、式A59におけるP原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配
列においてセンス鎖の3’末端のヌクレオチドの3’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子
に結合され、又は、式A59におけるP原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配列において
センス鎖におけるヌクレオチドの2’-ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌク
レオチドに結合され、又は、式A59におけるP原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配列
においてセンス鎖の5’末端のヌクレオチドの5’ヒドロキシ基中の水素原子を置換する
ことによりヌクレオチドに結合される。
限定されることを望まないが、以下の実施形態及び実施例において、本開示のオリゴヌ
クレオチド複合体における機能性オリゴヌクレオチドが低分子干渉RNA(siRNA)
である場合を詳しく説明する。この場合、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、siR
NA複合体である。本明細書の文脈において、説明の便宜上、これらの実施形態における
siRNA複合体を、本開示のsiRNA複合体とも称する。これは、本開示のオリゴヌ
クレオチド複合体におけるオリゴヌクレオチドがsiRNAでしかあり得ないことを示す
ものではなく、逆に、前記オリゴヌクレオチド、ひいては活性薬物は、本開示の他の代替
物又は当業者によく知られている他の代替物であってもよい。siRNA複合体の詳しい
説明により、他の活性薬物又は機能性オリゴヌクレオチドが、本開示により提供される複
合分子に複合される際にも、類似の作用を有するものと予想することができる。
クレオチド複合体における機能性オリゴヌクレオチドが低分子干渉RNA(siRNA)
である場合を詳しく説明する。この場合、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、siR
NA複合体である。本明細書の文脈において、説明の便宜上、これらの実施形態における
siRNA複合体を、本開示のsiRNA複合体とも称する。これは、本開示のオリゴヌ
クレオチド複合体におけるオリゴヌクレオチドがsiRNAでしかあり得ないことを示す
ものではなく、逆に、前記オリゴヌクレオチド、ひいては活性薬物は、本開示の他の代替
物又は当業者によく知られている他の代替物であってもよい。siRNA複合体の詳しい
説明により、他の活性薬物又は機能性オリゴヌクレオチドが、本開示により提供される複
合分子に複合される際にも、類似の作用を有するものと予想することができる。
siRNAが構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、
リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知である。通常、活性化、即ち、機能性s
iRNAの長さは、約12~40ヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、約
15~30ヌクレオチドであり、前記siRNAにおける各ヌクレオチドは、独立して修
飾又は未修飾のヌクレオチドであってもよく、安定性を向上させるために、前記siRN
Aにおける少なくとも1つのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知である。通常、活性化、即ち、機能性s
iRNAの長さは、約12~40ヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、約
15~30ヌクレオチドであり、前記siRNAにおける各ヌクレオチドは、独立して修
飾又は未修飾のヌクレオチドであってもよく、安定性を向上させるために、前記siRN
Aにおける少なくとも1つのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
本開示の発明者は、以下の実施形態に記載されるsiRNAが高い活性及び/又は安定
性を有するので、本開示において発明の目的とするsiRNAとして用いることができる
ことを見出した。
性を有するので、本開示において発明の目的とするsiRNAとして用いることができる
ことを見出した。
いくつかの実施形態において、本開示のsiRNA複合体のsiRNA(以下、本開示
のsiRNAともいう)における各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾の
ヌクレオチドであり、当該siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス
鎖は、ヌクレオチド配列1を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列2を含む。
前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2は、長さがいずれも10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25
ヌクレオチドであり、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖相補領域を形成し、前記ヌクレ
オチド配列2は、第1のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で相補的であり、前記第
1のヌクレオチド配列断片は、標的mRNAにおけるヌクレオチド配列断片である。
のsiRNAともいう)における各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾の
ヌクレオチドであり、当該siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス
鎖は、ヌクレオチド配列1を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列2を含む。
前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2は、長さがいずれも10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25
ヌクレオチドであり、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖相補領域を形成し、前記ヌクレ
オチド配列2は、第1のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で相補的であり、前記第
1のヌクレオチド配列断片は、標的mRNAにおけるヌクレオチド配列断片である。
いくつかの実施形態において、本開示のsiRNAとは、3mg/kgの濃度で、少な
くとも50%のHBV遺伝子発現、少なくとも50%のANGPTL3遺伝子発現又は少
なくとも50%のAPOC3遺伝子発現を抑制できるsiRNAを指す。いくつかの実施
形態において、本開示のsiRNAとは、濃度が3mg/kgであるとき、少なくとも5
5%、60%、65%、70%、75%又は80%のHBV遺伝子、ANGPTL3遺伝
子又はAPOC3遺伝子発現を抑制できるものを指す。
くとも50%のHBV遺伝子発現、少なくとも50%のANGPTL3遺伝子発現又は少
なくとも50%のAPOC3遺伝子発現を抑制できるsiRNAを指す。いくつかの実施
形態において、本開示のsiRNAとは、濃度が3mg/kgであるとき、少なくとも5
5%、60%、65%、70%、75%又は80%のHBV遺伝子、ANGPTL3遺伝
子又はAPOC3遺伝子発現を抑制できるものを指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列1と前記第1のヌクレオチド配列
断片とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が3個以下であり、前記ヌクレオチド配列2
とヌクレオチド配列Bとは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が3個以下であり、前記ヌ
クレオチド配列Bは、前記第1のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的なヌクレオチド
配列である。制限されることを望まないが、これらの特定のヌクレオチド差異により、s
iRNA複合体の抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらの特定のヌクレオチド
差異を含むsiRNA複合体も、本開示の保護範囲内にある。
断片とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が3個以下であり、前記ヌクレオチド配列2
とヌクレオチド配列Bとは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が3個以下であり、前記ヌ
クレオチド配列Bは、前記第1のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的なヌクレオチド
配列である。制限されることを望まないが、これらの特定のヌクレオチド差異により、s
iRNA複合体の抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらの特定のヌクレオチド
差異を含むsiRNA複合体も、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2は、
基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。
基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列1と前記第1のヌクレオチド配列
断片は、ヌクレオチド差異が1つ以下であり、及び/又は前記ヌクレオチド配列2と前記
ヌクレオチド配列Bは、ヌクレオチド差異が1つ以下である。いくつかの実施形態におい
て、前記ヌクレオチド配列2と前記ヌクレオチド配列Bとの間のヌクレオチド差異は、5
’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列2における1番目のヌクレオチド
Z’の位置での差異を含む。いくつかの実施形態において、5’末端から3’末端に向か
って、前記ヌクレオチド配列1における最後のヌクレオチドZは、Z’と相補的なヌクレ
オチドである。
断片は、ヌクレオチド差異が1つ以下であり、及び/又は前記ヌクレオチド配列2と前記
ヌクレオチド配列Bは、ヌクレオチド差異が1つ以下である。いくつかの実施形態におい
て、前記ヌクレオチド配列2と前記ヌクレオチド配列Bとの間のヌクレオチド差異は、5
’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列2における1番目のヌクレオチド
Z’の位置での差異を含む。いくつかの実施形態において、5’末端から3’末端に向か
って、前記ヌクレオチド配列1における最後のヌクレオチドZは、Z’と相補的なヌクレ
オチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列3をさらに含み、前
記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列4をさらに含み、前記ヌクレオチド配列3と前記
ヌクレオチド配列4は、長さが等しく、いずれも1~4ヌクレオチドであり、前記ヌクレ
オチド配列3は、前記ヌクレオチド配列1の5’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列
4は、前記ヌクレオチド配列2の3’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列4は、第2
のヌクレオチド配列断片と相補的であり、当該第2のヌクレオチド配列断片とは、標的m
RNAにおいて前記第1のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列
4と同じヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列
3と前記ヌクレオチド配列4は、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。し
たがって、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、19~23ヌクレオチドであって
もよい。
記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列4をさらに含み、前記ヌクレオチド配列3と前記
ヌクレオチド配列4は、長さが等しく、いずれも1~4ヌクレオチドであり、前記ヌクレ
オチド配列3は、前記ヌクレオチド配列1の5’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列
4は、前記ヌクレオチド配列2の3’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列4は、第2
のヌクレオチド配列断片と相補的であり、当該第2のヌクレオチド配列断片とは、標的m
RNAにおいて前記第1のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列
4と同じヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列
3と前記ヌクレオチド配列4は、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。し
たがって、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、19~23ヌクレオチドであって
もよい。
いくつかの実施形態において、本開示のsiRNAは、ヌクレオチド配列5をさらに含
み、前記ヌクレオチド配列5は、長さが1~3ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖
の3’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の3’オーバーハング端(overhang
)を構成し、いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列5の長さが1又は2ヌ
クレオチドである。このように、いくつかの実施形態において、本開示のsiRNAのセ
ンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、19/20、19/21、20/21、20/2
2、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24又は23/25であ
ってもよい。
み、前記ヌクレオチド配列5は、長さが1~3ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖
の3’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の3’オーバーハング端(overhang
)を構成し、いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列5の長さが1又は2ヌ
クレオチドである。このように、いくつかの実施形態において、本開示のsiRNAのセ
ンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、19/20、19/21、20/21、20/2
2、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24又は23/25であ
ってもよい。
1つの実施形態において、前記ヌクレオチド配列5の長さが2ヌクレオチドであり、5
’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列5は、連続した2個のチミジンデ
オキシヌクレオチド、又は連続した2個のウリジンヌクレオチドであり、又は、第3のヌ
クレオチド配列断片と相補的であり、前記第3のヌクレオチド配列断片とは、標的mRN
Aにおいて前記第1のヌクレオチド配列断片に隣接し、又は前記第2のヌクレオチド配列
断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列5に等しいヌクレオチド配列を指す。いくつ
かの実施形態において、本開示のsiRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が1
9/21又は21/23であり、このとき、本開示のsiRNAは、顕著な肝細胞mRN
Aサイレンシング活性を有する。
’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列5は、連続した2個のチミジンデ
オキシヌクレオチド、又は連続した2個のウリジンヌクレオチドであり、又は、第3のヌ
クレオチド配列断片と相補的であり、前記第3のヌクレオチド配列断片とは、標的mRN
Aにおいて前記第1のヌクレオチド配列断片に隣接し、又は前記第2のヌクレオチド配列
断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列5に等しいヌクレオチド配列を指す。いくつ
かの実施形態において、本開示のsiRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が1
9/21又は21/23であり、このとき、本開示のsiRNAは、顕著な肝細胞mRN
Aサイレンシング活性を有する。
いくつかの実施形態において、本開示のsiRNAにおけるヌクレオチドは、それぞれ
独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示の
siRNAは、修飾ヌクレオチド基を含まず、いくつかの実施形態において、本開示のs
iRNAは、修飾ヌクレオチド基を含む。
独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示の
siRNAは、修飾ヌクレオチド基を含まず、いくつかの実施形態において、本開示のs
iRNAは、修飾ヌクレオチド基を含む。
現在、本分野においては、骨格修飾(ヌクレオチド間結合修飾ともいい、例えば、リン
酸基修飾)、リボース基修飾及び塩基修飾等を含む、siRNAの修飾に使用できる複数
種の方法がある(例えば、Watts,J.K.,G.F.Deleavey and
M.J.Damha,Chemically Modified siRNA:tool
s and applications. Drug Discov Today,20
08.13(19-20):p.842~55を参照し、引用によりその内容が全体とし
て本明細書に組み込まれる)。
酸基修飾)、リボース基修飾及び塩基修飾等を含む、siRNAの修飾に使用できる複数
種の方法がある(例えば、Watts,J.K.,G.F.Deleavey and
M.J.Damha,Chemically Modified siRNA:tool
s and applications. Drug Discov Today,20
08.13(19-20):p.842~55を参照し、引用によりその内容が全体とし
て本明細書に組み込まれる)。
本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」は、そのリボース基が修
飾され、例えば、2’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド、ヌクレオチ
ドアナログ、又は修飾塩基を有するヌクレオチドを含む。
飾され、例えば、2’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド、ヌクレオチ
ドアナログ、又は修飾塩基を有するヌクレオチドを含む。
本開示のいくつかの実施形態において、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の少なく
とも1つのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであり、及び/又は少なくとも1つのリン
酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖
と前記アンチセンス鎖において少なくとも1本の一本鎖のリン酸-リボース骨格中のリン
酸エステル基及び/又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル
基及び/又は修飾基を有するリボース基(又は修飾リン酸エステル基及び/又は修飾リボ
ース基)である。本開示のいくつかの実施形態において、前記センス鎖及び/又は前記ア
ンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。
とも1つのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであり、及び/又は少なくとも1つのリン
酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖
と前記アンチセンス鎖において少なくとも1本の一本鎖のリン酸-リボース骨格中のリン
酸エステル基及び/又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル
基及び/又は修飾基を有するリボース基(又は修飾リン酸エステル基及び/又は修飾リボ
ース基)である。本開示のいくつかの実施形態において、前記センス鎖及び/又は前記ア
ンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖における各ヌクレオチドは
、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ
基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、以下の式(207)に示される構造を有す
る。
基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、以下の式(207)に示される構造を有す
る。
「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキ
シ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつ
かの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、独立して、ヌクレオチドのリ
ボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオ
チドアナログである。
シ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつ
かの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、独立して、ヌクレオチドのリ
ボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオ
チドアナログである。
リボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、当業
者に公知であり、これらのヌクレオチドは、例えば、2’-アルコキシ修飾ヌクレオチド
、2’-置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、2’-アルキル修飾ヌクレオチド、2’-置
換アルキル修飾ヌクレオチド、2’-アミノ修飾ヌクレオチド、2’-置換アミノ修飾ヌ
クレオチド又は2’-デオキシヌクレオチドである。
者に公知であり、これらのヌクレオチドは、例えば、2’-アルコキシ修飾ヌクレオチド
、2’-置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、2’-アルキル修飾ヌクレオチド、2’-置
換アルキル修飾ヌクレオチド、2’-アミノ修飾ヌクレオチド、2’-置換アミノ修飾ヌ
クレオチド又は2’-デオキシヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、2’-アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式(208)に
示される、メトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、2’-置換
アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式(209)に示される、2’-O-メトキシエチル修
飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、2’-アミノ修飾ヌクレオチドは
、式(210)に示される。いくつかの実施形態において、2’-デオキシヌクレオチド
(DNA)は、式(211)に示される。
示される、メトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、2’-置換
アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式(209)に示される、2’-O-メトキシエチル修
飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、2’-アミノ修飾ヌクレオチドは
、式(210)に示される。いくつかの実施形態において、2’-デオキシヌクレオチド
(DNA)は、式(211)に示される。
ヌクレオチドアナログとは、核酸におけるヌクレオチドの代わりとなることができるが
、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、
ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと異なる基を指す。いく
つかの実施形態において、前記ヌクレオチドアナログは、例えば、イソヌクレオチド、架
橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)ヌクレオチド又は非環式
ヌクレオチドであってもよい。
、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、
ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと異なる基を指す。いく
つかの実施形態において、前記ヌクレオチドアナログは、例えば、イソヌクレオチド、架
橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)ヌクレオチド又は非環式
ヌクレオチドであってもよい。
BNAヌクレオチドとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。BNAは、
五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」C3’-エンド糖パッカリングを有する
架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボース環の2’-、4’-位に取り込んで
2’、4’-BNAヌクレオチド、例えば、式(212)に示されるLNA、式(213
)に示されるENA、及び式(214)に示されるcET BNAを提供する。
五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」C3’-エンド糖パッカリングを有する
架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボース環の2’-、4’-位に取り込んで
2’、4’-BNAヌクレオチド、例えば、式(212)に示されるLNA、式(213
)に示されるENA、及び式(214)に示されるcET BNAを提供する。
非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチド、例えば、式(
215)に示されるアンロックド核酸(UNA)ヌクレオチド、及び式(216)に示さ
れるグリセロール核酸(GNA)ヌクレオチドである。
215)に示されるアンロックド核酸(UNA)ヌクレオチド、及び式(216)に示さ
れるグリセロール核酸(GNA)ヌクレオチドである。
イソヌクレオチドとは、塩基のリボース環における位置が変化したヌクレオチドを指し
、例えば、式(217)又は(218)に示される、塩基がリボース環の1’-位から2
’-位又は3’-位に移行した化合物である。
、例えば、式(217)又は(218)に示される、塩基がリボース環の1’-位から2
’-位又は3’-位に移行した化合物である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、LNA、
ENA、cET、UNA又はGNAである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ
修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌク
レオチドは、リボース基の2’-ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指
す。
ENA、cET、UNA又はGNAである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ
修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌク
レオチドは、リボース基の2’-ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指
す。
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「2’-フルオロ修飾ヌクレオチド」
、「リボース基の2’-ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「2’-
フルオロリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチ
ドの2’-ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式(207)に示される構造を有するも
のを指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「2’-メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リ
ボース基の2’-ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「2’-メト
キシリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドリ
ボース基の2’-ヒドロキシ基がメトキシで置換された、式(208)に示されるものを
指す。
、「リボース基の2’-ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「2’-
フルオロリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチ
ドの2’-ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式(207)に示される構造を有するも
のを指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「2’-メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リ
ボース基の2’-ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「2’-メト
キシリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドリ
ボース基の2’-ヒドロキシ基がメトキシで置換された、式(208)に示されるものを
指す。
いくつかの実施形態において、本開示のsiRNAは、以下の修飾を有するsiRNA
である。すなわち、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけ
る前記ヌクレオチド配列1の第7、8、9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチド
であり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであ
り、及び/又は前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列2の第2、6、14
、16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖におい
て他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態にお
いて、本開示のsiRNAは、以下の修飾を有するsiRNAである。すなわち、5’末
端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖における前記ヌクレオチド配列1
の第5、7、8、9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖
において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、及び/又は前記ア
ンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列2の第2、6、8、9、14、16位のヌ
クレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置の
ヌクレオチドが2’-メトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、
本開示のsiRNAは、以下の修飾を有するsiRNAである。すなわち、5’末端から
3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖における前記ヌクレオチド配列1の第7
、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において
他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、及び/又は5’末端から3
’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖における前記ヌクレオチド配列2の
第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アン
チセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
である。すなわち、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけ
る前記ヌクレオチド配列1の第7、8、9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチド
であり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであ
り、及び/又は前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列2の第2、6、14
、16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖におい
て他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態にお
いて、本開示のsiRNAは、以下の修飾を有するsiRNAである。すなわち、5’末
端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖における前記ヌクレオチド配列1
の第5、7、8、9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖
において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、及び/又は前記ア
ンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列2の第2、6、8、9、14、16位のヌ
クレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置の
ヌクレオチドが2’-メトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、
本開示のsiRNAは、以下の修飾を有するsiRNAである。すなわち、5’末端から
3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖における前記ヌクレオチド配列1の第7
、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において
他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、及び/又は5’末端から3
’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖における前記ヌクレオチド配列2の
第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アン
チセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
本開示に記載されたsiRNAのいくつかの具体的な実施形態において、前記ヌクレオ
チドは、リン酸基修飾を含む。本開示の文脈において、リン酸基上の修飾は、1つの実施
形態において、以下の式(201)に示されるチオリン酸(phosphorthioa
te)修飾であり、即ち、硫黄原子でリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子を置
換することにより、チオリン酸ジエステル結合でリン酸ジエステル結合を置換する。いく
つかの実施形態において、当該修飾により、siRNAの構造を安定化させ、塩基対合の
高い特異性と高い親和力を維持する。
チドは、リン酸基修飾を含む。本開示の文脈において、リン酸基上の修飾は、1つの実施
形態において、以下の式(201)に示されるチオリン酸(phosphorthioa
te)修飾であり、即ち、硫黄原子でリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子を置
換することにより、チオリン酸ジエステル結合でリン酸ジエステル結合を置換する。いく
つかの実施形態において、当該修飾により、siRNAの構造を安定化させ、塩基対合の
高い特異性と高い親和力を維持する。
本開示のいくつかの実施形態により、前記siRNAにおいて、チオリン酸エステル基
は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレ
オチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の2番目のヌクレオチドと3番
目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せの少なくとも1つに結合されて存在
する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の5’末端を除
く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エス
テル基は、センス鎖の3’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの
実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合
されて存在する。
前記センス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間
、
前記アンチセンス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間
、
前記アンチセンス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間
、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間
。
は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレ
オチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の2番目のヌクレオチドと3番
目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せの少なくとも1つに結合されて存在
する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の5’末端を除
く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エス
テル基は、センス鎖の3’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの
実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合
されて存在する。
前記センス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間
、
前記アンチセンス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間
、
前記アンチセンス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間
、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間
。
本開示のいくつかの実施形態により、前記siRNA分子のアンチセンス鎖配列の5’
末端のヌクレオチドは、5’-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修飾ヌクレ
オチドである。
末端のヌクレオチドは、5’-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修飾ヌクレ
オチドである。
いくつかの実施形態において、5’-リン酸ヌクレオチドは、式(202)に示される
構造を有してもよい。
構造を有してもよい。
慣用の前記5’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドの種類は、当業者に公知であり、例
えば、Anastasia Khvorova and Jonathan K. Wa
tts,The chemical evolution of oligonucle
otide therapies of clinical utility. Nat
ure Biotechnology,2017,35(3):238~48には、以下
の式(203)~(206)に示される4つのヌクレオチドが開示されている。
えば、Anastasia Khvorova and Jonathan K. Wa
tts,The chemical evolution of oligonucle
otide therapies of clinical utility. Nat
ure Biotechnology,2017,35(3):238~48には、以下
の式(203)~(206)に示される4つのヌクレオチドが開示されている。
いくつかの実施形態において、5’-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修
飾ヌクレオチドは、式(203)に示される、ビニルリン酸エステル(vinylpho
sphonate、VP)修飾を含むヌクレオチド、式(202)に示される、5’-リ
ン酸ヌクレオチド、又は、式(205)に示される、5’-チオリン酸修飾ヌクレオチド
である。
飾ヌクレオチドは、式(203)に示される、ビニルリン酸エステル(vinylpho
sphonate、VP)修飾を含むヌクレオチド、式(202)に示される、5’-リ
ン酸ヌクレオチド、又は、式(205)に示される、5’-チオリン酸修飾ヌクレオチド
である。
本開示の発明者は、本開示に記載されたsiRNA複合体は、血清安定性が顕著に向上
しているとともに、明らかに低下していない標的mRNAサイレンシング活性及び優れた
体内遺伝子発現抑制効果をさらに示していることを、意外にも見出した。それにより、本
開示のsiRNA複合体が高い体内送達効率を有することが示された。本開示のいくつか
の実施形態により、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、例えば、表1A~1Fに示さ
れるsiRNAを含むsiRNA複合体である。
しているとともに、明らかに低下していない標的mRNAサイレンシング活性及び優れた
体内遺伝子発現抑制効果をさらに示していることを、意外にも見出した。それにより、本
開示のsiRNA複合体が高い体内送達効率を有することが示された。本開示のいくつか
の実施形態により、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、例えば、表1A~1Fに示さ
れるsiRNAを含むsiRNA複合体である。
[表1]
siRNA配列
*S:センス鎖、AS:アンチセンス鎖
siRNA配列
上記の表において、大文字C、G、U、Aは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字
mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’-メトキシ修飾ヌクレオチ
ドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2
’-フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字sの左右に隣接
する2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、P
1は、当該P1の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’-リン酸ヌクレオチド又は5
’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、いくつかの実施形態において、
ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてVPで表される)、5’
-リン酸ヌクレオチド(以下の実施例においてPで表される)又はチオリン酸エステル修
飾ヌクレオチド(以下の実施例においてPsで表される)である。
mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’-メトキシ修飾ヌクレオチ
ドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2
’-フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字sの左右に隣接
する2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、P
1は、当該P1の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’-リン酸ヌクレオチド又は5
’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、いくつかの実施形態において、
ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてVPで表される)、5’
-リン酸ヌクレオチド(以下の実施例においてPで表される)又はチオリン酸エステル修
飾ヌクレオチド(以下の実施例においてPsで表される)である。
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマ
ーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたsiRNAに導入するこ
とができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌク
レオチド基をsiRNAに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌク
レオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製してもよい。
ーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたsiRNAに導入するこ
とができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌク
レオチド基をsiRNAに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌク
レオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製してもよい。
<オリゴヌクレオチド複合体の調製>
任意の合理的な合成経路により本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製してもよい。
例えば、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、以下の方法により調製することができる
。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれ前記オリゴヌクレオチド
のヌクレオチドの種類と順序により、3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順
に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化
又は硫化の4つの反応を含むことを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、カ
ップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式(321)に示される化合物
を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式(
321)に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することを
さらに含む。
任意の合理的な合成経路により本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製してもよい。
例えば、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、以下の方法により調製することができる
。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれ前記オリゴヌクレオチド
のヌクレオチドの種類と順序により、3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順
に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化
又は硫化の4つの反応を含むことを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、カ
ップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式(321)に示される化合物
を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式(
321)に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することを
さらに含む。
いくつかの実施形態において、当該方法は、保護基を除去して固相担体から切断し、単
離精製する工程をさらに含む。
離精製する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレオチドで
あり、前記調製方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式(
321)に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の3’端のヌクレオシドモノマ
ーと接触させ、式(321)に示される化合物を配列における1番目のヌクレオチドに結
合させ、3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、二本鎖オリゴヌク
レオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、(321)の化合物は
、R4に、第1の官能基である保護されたヒドロキシ基、及び第2の官能基である式(C
1’)又は(C3’)に示される基が含まれる、式(321)に示される化合物であり、
1番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式(321)の化合物を脱保護し、各ヌ
クレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の4つ
の反応を含み、複合分子が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程と、
3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合して二本鎖オリゴヌクレオチド
の他方の鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピ
ング、酸化又は硫化の4つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精
製してセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
あり、前記調製方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式(
321)に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の3’端のヌクレオシドモノマ
ーと接触させ、式(321)に示される化合物を配列における1番目のヌクレオチドに結
合させ、3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、二本鎖オリゴヌク
レオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、(321)の化合物は
、R4に、第1の官能基である保護されたヒドロキシ基、及び第2の官能基である式(C
1’)又は(C3’)に示される基が含まれる、式(321)に示される化合物であり、
1番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式(321)の化合物を脱保護し、各ヌ
クレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の4つ
の反応を含み、複合分子が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程と、
3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合して二本鎖オリゴヌクレオチド
の他方の鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピ
ング、酸化又は硫化の4つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精
製してセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレオチドで
あり、前記調製方法は、3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、二
本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマ
ーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の4つの反応を含み、固
相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程と、
カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式(321)に示される化合
物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触さ
せ、R4にホスホルアミダイトである第1の官能基が含まれる式(321)の化合物をセ
ンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させる工程と、保護基を除去して固相担体から切断し、
単離精製してオリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工
程を含む。前記オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖に複合分子が結合され
ている。
あり、前記調製方法は、3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、二
本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマ
ーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の4つの反応を含み、固
相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程と、
カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式(321)に示される化合
物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触さ
せ、R4にホスホルアミダイトである第1の官能基が含まれる式(321)の化合物をセ
ンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させる工程と、保護基を除去して固相担体から切断し、
単離精製してオリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工
程を含む。前記オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖に複合分子が結合され
ている。
いくつかの実施形態において、式A59におけるP原子は、siRNAにおけるセンス
鎖の3’末端に結合され、本開示のsiRNA複合体の調製方法は、
(1)上記固相担体が結合された式(321)の化合物(以下、固相担体が結合された
L複合分子ともいう)における保護基Rkを除去し、カップリング反応条件下及びカップ
リング試薬の存在下で、当該固相担体が結合されたL複合分子をヌクレオシドモノマーと
接触させ、L複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
(2)当該L複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、
3’-5’の方向に従いホスホルアミダイト固相合成方法によりsiRNAのセンス鎖を
合成すること、
(3)ホスホルアミダイト固相合成方法により、siRNAのアンチセンス鎖を合成す
ること、
(4)siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のsi
RNA複合体を得ることを含む。
鎖の3’末端に結合され、本開示のsiRNA複合体の調製方法は、
(1)上記固相担体が結合された式(321)の化合物(以下、固相担体が結合された
L複合分子ともいう)における保護基Rkを除去し、カップリング反応条件下及びカップ
リング試薬の存在下で、当該固相担体が結合されたL複合分子をヌクレオシドモノマーと
接触させ、L複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
(2)当該L複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、
3’-5’の方向に従いホスホルアミダイト固相合成方法によりsiRNAのセンス鎖を
合成すること、
(3)ホスホルアミダイト固相合成方法により、siRNAのアンチセンス鎖を合成す
ること、
(4)siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のsi
RNA複合体を得ることを含む。
工程(1)において、当該固相担体が結合されたL複合分子における保護基Rkを除去
する方法は、脱保護条件で、式(321)の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む
。脱保護条件としては、温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態において、15~
35℃であり、反応時間が30~300秒であり、いくつかの実施形態において、50~
150秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、ク
ロロ酢酸から選択される1種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジ
クロロ酢酸である。脱保護試薬と式(321)の化合物のモル比が10:1~1000:
1であってもよく、いくつかの実施形態において、50:1~500:1である。
する方法は、脱保護条件で、式(321)の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む
。脱保護条件としては、温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態において、15~
35℃であり、反応時間が30~300秒であり、いくつかの実施形態において、50~
150秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、ク
ロロ酢酸から選択される1種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジ
クロロ酢酸である。脱保護試薬と式(321)の化合物のモル比が10:1~1000:
1であってもよく、いくつかの実施形態において、50:1~500:1である。
前記カップリング反応条件とカップリング試薬としては、上記カップリング反応に適し
た任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成
方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いる。
た任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成
方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いる。
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件としては、反応温度が0~
50℃であり、いくつかの実施形態において、15~35℃である。式(321)の化合
物とヌクレオシドモノマーとのモル比が1:1~1:50であってもよく、いくつかの実
施形態において、1:2~1:5であり、式(321)の化合物とカップリング試薬との
モル比が1:1~1:50であってもよく、いくつかの実施形態において、1:3~1:
10であり、反応時間が200~3000秒であってもよく、いくつかの実施形態におい
て、500~1500秒である。カップリング試薬は、1H-テトラゾール、5-エチル
チオ1H-テトラゾール、5-ベンジルチオ1H-テトラゾールから選択される1種又は
複数種であってよく、いくつかの実施形態において、5-エチルチオ1H-テトラゾール
である。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水ア
セトニトリル、無水DMF、無水ジクロロメタンから選択される1種又は複数種であって
よく、いくつかの実施形態において、無水アセトニトリルである。式(321)の化合物
に対して、前記有機溶剤の用量が3~50L/molであってもよく、いくつかの実施形
態において、5~20L/molである。
50℃であり、いくつかの実施形態において、15~35℃である。式(321)の化合
物とヌクレオシドモノマーとのモル比が1:1~1:50であってもよく、いくつかの実
施形態において、1:2~1:5であり、式(321)の化合物とカップリング試薬との
モル比が1:1~1:50であってもよく、いくつかの実施形態において、1:3~1:
10であり、反応時間が200~3000秒であってもよく、いくつかの実施形態におい
て、500~1500秒である。カップリング試薬は、1H-テトラゾール、5-エチル
チオ1H-テトラゾール、5-ベンジルチオ1H-テトラゾールから選択される1種又は
複数種であってよく、いくつかの実施形態において、5-エチルチオ1H-テトラゾール
である。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水ア
セトニトリル、無水DMF、無水ジクロロメタンから選択される1種又は複数種であって
よく、いくつかの実施形態において、無水アセトニトリルである。式(321)の化合物
に対して、前記有機溶剤の用量が3~50L/molであってもよく、いくつかの実施形
態において、5~20L/molである。
工程(2)において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製さ
れたL複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、3’-5
’の方向に従いsiRNA複合体のセンス鎖Sを合成する。この場合、L複合分子は、得
られたセンス鎖の3’末端に結合される。
れたL複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、3’-5
’の方向に従いsiRNA複合体のセンス鎖Sを合成する。この場合、L複合分子は、得
られたセンス鎖の3’末端に結合される。
工程(2)及び(3)における前記固相合成の他の条件としては、ヌクレオシドモノマ
ーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の
種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、
酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬の種類と用量を含み、本明細書では、本
分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
ーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の
種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、
酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬の種類と用量を含み、本明細書では、本
分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
例えば、いくつかの実施形態において、工程(2)及び(3)において、前記固相合成
では、以下の条件を用いてもよい。
では、以下の条件を用いてもよい。
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件としては、温度が0~50℃であり、いくつかの実
施形態において、15~35℃であり、反応時間が30~300秒であり、いくつかの実
施形態において、50~150秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ
酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される1種又は複数種であってよく、いくつか
の実施形態において、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における4,4’-ジ
メトキシトリチル保護基とのモル比は、2:1~100:1であってもよく、いくつかの
実施形態において、3:1~50:1である。
施形態において、15~35℃であり、反応時間が30~300秒であり、いくつかの実
施形態において、50~150秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ
酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される1種又は複数種であってよく、いくつか
の実施形態において、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における4,4’-ジ
メトキシトリチル保護基とのモル比は、2:1~100:1であってもよく、いくつかの
実施形態において、3:1~50:1である。
カップリング反応条件としては、温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態におい
て、15~35℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモ
ル比が1:1~1:50であってもよく、いくつかの実施形態において、1:5~1:1
5であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が1:1~1:
100であってもよく、いくつかの実施形態において、1:50~1:80であり、反応
時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
て、15~35℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモ
ル比が1:1~1:50であってもよく、いくつかの実施形態において、1:5~1:1
5であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が1:1~1:
100であってもよく、いくつかの実施形態において、1:50~1:80であり、反応
時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
キャッピング反応条件としては、温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態におい
て、15~35℃であり、反応時間が5~500秒であり、いくつかの実施形態において
、10~100秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング
試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が1:100~100:1であっ
てもよく、いくつかの実施形態において、1:10~10:1である。キャッピング試薬
として等モル量の酢酸無水物とN-メチルイミダゾールを用いる場合に、酢酸無水物、N
-メチルイミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比が1:1:10~10
:10:1であってもよく、いくつかの実施形態において、1:1:2~2:2:1であ
る。
て、15~35℃であり、反応時間が5~500秒であり、いくつかの実施形態において
、10~100秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング
試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が1:100~100:1であっ
てもよく、いくつかの実施形態において、1:10~10:1である。キャッピング試薬
として等モル量の酢酸無水物とN-メチルイミダゾールを用いる場合に、酢酸無水物、N
-メチルイミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比が1:1:10~10
:10:1であってもよく、いくつかの実施形態において、1:1:2~2:2:1であ
る。
酸化反応条件としては、温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態において、15
~35℃であり、反応時間が1~100秒であり、いくつかの実施形態において、5~5
0秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態において、ヨウ素である(さらなる実施形
態において、ヨウ素水として提供する)。酸化試薬と、カップリング工程において固相担
体に結合される核酸配列とのモル比が、1:1~100:1であってもよく、いくつかの
実施形態において、5:1~50:1である。いくつかの実施形態において、前記酸化反
応は、テトラヒドロフラン:水:ピリジン=3:1:1~1:1:3の混合溶剤で行われ
る。硫化反応条件としては、温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態において、1
5~35℃であり、反応時間が50~2000秒であり、いくつかの実施形態において、
100~1000秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態において、キサンタンヒド
リドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列との
モル比が、10:1~1000:1であってもよく、いくつかの実施形態において、10
:1~500:1である。いくつかの実施形態において、前記硫化反応は、アセトニトリ
ル:ピリジン=1:3~3:1の混合溶剤で行われる。
~35℃であり、反応時間が1~100秒であり、いくつかの実施形態において、5~5
0秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態において、ヨウ素である(さらなる実施形
態において、ヨウ素水として提供する)。酸化試薬と、カップリング工程において固相担
体に結合される核酸配列とのモル比が、1:1~100:1であってもよく、いくつかの
実施形態において、5:1~50:1である。いくつかの実施形態において、前記酸化反
応は、テトラヒドロフラン:水:ピリジン=3:1:1~1:1:3の混合溶剤で行われ
る。硫化反応条件としては、温度が0~50℃であり、いくつかの実施形態において、1
5~35℃であり、反応時間が50~2000秒であり、いくつかの実施形態において、
100~1000秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態において、キサンタンヒド
リドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列との
モル比が、10:1~1000:1であってもよく、いくつかの実施形態において、10
:1~500:1である。いくつかの実施形態において、前記硫化反応は、アセトニトリ
ル:ピリジン=1:3~3:1の混合溶剤で行われる。
本開示により提供される方法により、全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニ
ールする前、当該方法は、siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさ
らに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を
固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩
することを含む。
ールする前、当該方法は、siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさ
らに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を
固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩
することを含む。
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド
上の保護基を除去するには、siRNA合成において通常の切断と脱保護方法により行わ
れてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水
と接触させ、脱保護過程において、A46~A54の基の保護基YCOO-をヒドロキシ
基に変換させ、S1基を対応するM1基に変換させ、式(1)に示される複合体を生成す
る。ここで、前記濃アンモニア水は、濃度が25~30重量%のアンモニア水であっても
よく、濃アンモニア水の用量は、目的とするsiRNA配列に対して0.2ml/μmo
l~0.8ml/μmolであってもよい。
上の保護基を除去するには、siRNA合成において通常の切断と脱保護方法により行わ
れてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水
と接触させ、脱保護過程において、A46~A54の基の保護基YCOO-をヒドロキシ
基に変換させ、S1基を対応するM1基に変換させ、式(1)に示される複合体を生成す
る。ここで、前記濃アンモニア水は、濃度が25~30重量%のアンモニア水であっても
よく、濃アンモニア水の用量は、目的とするsiRNA配列に対して0.2ml/μmo
l~0.8ml/μmolであってもよい。
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも1つの2’-TBDMS保護がある場合、前
記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩
と接触させることにより、当該2’-TBDMS保護を除去することをさらに含む。この
場合、得られた目的とするsiRNA配列には、対応するヌクレオシドにおいて遊離の2
’-ヒドロキシ基を有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的と
するsiRNA配列に対して0.4ml/μmol~1.0ml/μmolであってもよ
い。このように本開示のsiRNA複合体を得ることができる。
記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩
と接触させることにより、当該2’-TBDMS保護を除去することをさらに含む。この
場合、得られた目的とするsiRNA配列には、対応するヌクレオシドにおいて遊離の2
’-ヒドロキシ基を有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的と
するsiRNA配列に対して0.4ml/μmol~1.0ml/μmolであってもよ
い。このように本開示のsiRNA複合体を得ることができる。
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマト
グラフィー精製カラムを用いて、NaBr又はNaClの勾配溶出によって、核酸の精製
を行い、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩す
ることができる。
グラフィー精製カラムを用いて、NaBr又はNaClの勾配溶出によって、核酸の精製
を行い、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩す
ることができる。
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御す
ることができる。検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフ
ィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS)
により分子量を測定することができる。
ることができる。検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフ
ィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS)
により分子量を測定することができる。
アニール方法も、当業者によく知られている。例えば、簡単に合成されたセンス鎖(S
鎖)とアンチセンス鎖(AS鎖)を等モル比で注射用水に混合して70~95℃に加熱し
、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このよう
に本開示のsiRNA複合体を得ることができる。
鎖)とアンチセンス鎖(AS鎖)を等モル比で注射用水に混合して70~95℃に加熱し
、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このよう
に本開示のsiRNA複合体を得ることができる。
本開示の複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフ
ィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等の方法により合成されたsiRN
A複合体の特徴を明らかにし、合成されたsiRNA複合体が、目的設計のsiRNA複
合体であるとともに、合成されたsiRNAの配列が、合成するsiRNAの配列と一致
し、例えば、上記表1に示される配列の1つと一致していると確認することもできる。
ィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等の方法により合成されたsiRN
A複合体の特徴を明らかにし、合成されたsiRNA複合体が、目的設計のsiRNA複
合体であるとともに、合成されたsiRNAの配列が、合成するsiRNAの配列と一致
し、例えば、上記表1に示される配列の1つと一致していると確認することもできる。
<本開示の複合体の使用>
本開示に示されるように、前記複合体は、ある活性剤を細胞に送達し、このような送達
を必要とする可能性がある疾患又は状況を治療又は予防するために用いることができる。
何ら理論に束縛されることを望まないが、複合分子の空間配列は、標的細胞表面の受容体
面に特に有効であり、負荷された活性剤を細胞と接触させると考えられる。いくつかの実
施形態において、このような複合体は、肝細胞を標的するオリゴヌクレオチド複合体であ
る。
本開示に示されるように、前記複合体は、ある活性剤を細胞に送達し、このような送達
を必要とする可能性がある疾患又は状況を治療又は予防するために用いることができる。
何ら理論に束縛されることを望まないが、複合分子の空間配列は、標的細胞表面の受容体
面に特に有効であり、負荷された活性剤を細胞と接触させると考えられる。いくつかの実
施形態において、このような複合体は、肝細胞を標的するオリゴヌクレオチド複合体であ
る。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、優れた肝標的特
異性を有するので、複合された機能性オリゴヌクレオチドを肝部に効率よく送達し、肝細
胞における特定の遺伝子の発現を効果的に調節することができる。よって、本開示のオリ
ゴヌクレオチド複合体は、広い応用の将来性がある。
異性を有するので、複合された機能性オリゴヌクレオチドを肝部に効率よく送達し、肝細
胞における特定の遺伝子の発現を効果的に調節することができる。よって、本開示のオリ
ゴヌクレオチド複合体は、広い応用の将来性がある。
本開示のいくつかの実施形態により、本開示は、本開示のオリゴヌクレオチド複合体の
、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び/又は予防
のための薬物の調製への使用を提供する。前記特定の遺伝子は、肝臓に発現する内因性遺
伝子であってもよいし、肝臓で繁殖する病原体遺伝子であってもよい。いくつかの実施形
態において、前記特定の遺伝子は、例えば、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PC
SK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HB
V又はHCVである。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、B型肝炎ウイ
ルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子又はアポリポタンパクC3遺伝子で
ある。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及
び脂質異常(血中脂質異常)から選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異
常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。
、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び/又は予防
のための薬物の調製への使用を提供する。前記特定の遺伝子は、肝臓に発現する内因性遺
伝子であってもよいし、肝臓で繁殖する病原体遺伝子であってもよい。いくつかの実施形
態において、前記特定の遺伝子は、例えば、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PC
SK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HB
V又はHCVである。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、B型肝炎ウイ
ルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子又はアポリポタンパクC3遺伝子で
ある。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及
び脂質異常(血中脂質異常)から選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異
常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。
いくつかの実施形態において、本明細書は、必要のある患者に本開示のオリゴヌクレオ
チド複合体を投与することを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状
態又は疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記特定の
遺伝子は、例えば、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TI
MP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV又はHCVである。い
くつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポ
エチン様タンパク質3遺伝子及びアポリポタンパクC3遺伝子から選択される。これに応
じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から
選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高
トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。いくつかの実施形態において、本
開示により提供される複合体は、望まない細胞増殖を特徴とする疾患、血液疾患、代謝性
疾患及び炎症を特徴とする疾患を含む、他の肝臓疾患を治療するために用いることもでき
る。肝臓の増殖性疾患は、良性又は悪性疾患、例えば、癌、肝細胞癌(HCC)、肝転移
又は肝芽腫であってもよい。肝臓血液学的又は炎症性疾患は、血液凝固因子、補体媒介炎
症又は線維化に関する疾患であってもよい。肝臓の代謝性疾患は、脂質異常及びグルコー
スの調節の不規則性を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、肝疾患に関与す
る遺伝子配列と高度に相同な配列を有する1又は複数のオリゴヌクレオチドを使用するこ
とを含む。
チド複合体を投与することを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状
態又は疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記特定の
遺伝子は、例えば、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TI
MP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV又はHCVである。い
くつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポ
エチン様タンパク質3遺伝子及びアポリポタンパクC3遺伝子から選択される。これに応
じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から
選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高
トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。いくつかの実施形態において、本
開示により提供される複合体は、望まない細胞増殖を特徴とする疾患、血液疾患、代謝性
疾患及び炎症を特徴とする疾患を含む、他の肝臓疾患を治療するために用いることもでき
る。肝臓の増殖性疾患は、良性又は悪性疾患、例えば、癌、肝細胞癌(HCC)、肝転移
又は肝芽腫であってもよい。肝臓血液学的又は炎症性疾患は、血液凝固因子、補体媒介炎
症又は線維化に関する疾患であってもよい。肝臓の代謝性疾患は、脂質異常及びグルコー
スの調節の不規則性を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、肝疾患に関与す
る遺伝子配列と高度に相同な配列を有する1又は複数のオリゴヌクレオチドを使用するこ
とを含む。
本開示のいくつかの実施形態により、本開示は、本開示のsiRNA複合を前記肝細胞
と接触させることを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
と接触させることを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
本開示のオリゴヌクレオチド複合体を、必要のある患者に投与することにより、遺伝子
発現を調節する機構により肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾
患を予防及び/又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のオリゴ
ヌクレオチド複合体は、本明細書で開示された病理学的状態又は疾患の予防及び/又は治
療に用い、又は本明細書で開示された病理学的状態又は疾患の予防及び/又は治療のため
の薬物の調製に用いることができる。
発現を調節する機構により肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾
患を予防及び/又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のオリゴ
ヌクレオチド複合体は、本明細書で開示された病理学的状態又は疾患の予防及び/又は治
療に用い、又は本明細書で開示された病理学的状態又は疾患の予防及び/又は治療のため
の薬物の調製に用いることができる。
本明細書で用いられる用語「薬剤投与/投与」とは、オリゴヌクレオチド複合体等の複
合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化することにより所望の効果を生じさせる方法
又は経路により、複合体を被験体の体内に送達することを指す。本開示の方法に適した投
与経路は、局所投与と全身投与を含むが、これらのみに限られていない。一般的には、局
所投与により、被験体の体循環よりも多くのオリゴヌクレオチド複合体が特定の部位に送
達されるが、全身投与により、前記オリゴヌクレオチド複合体が患者の体循環に送達され
る。本開示が肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の予防及び
/又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、いくつかの実施形態におい
て、薬物を肝臓に送達することができる投与方法を採用する。
合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化することにより所望の効果を生じさせる方法
又は経路により、複合体を被験体の体内に送達することを指す。本開示の方法に適した投
与経路は、局所投与と全身投与を含むが、これらのみに限られていない。一般的には、局
所投与により、被験体の体循環よりも多くのオリゴヌクレオチド複合体が特定の部位に送
達されるが、全身投与により、前記オリゴヌクレオチド複合体が患者の体循環に送達され
る。本開示が肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の予防及び
/又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、いくつかの実施形態におい
て、薬物を肝臓に送達することができる投与方法を採用する。
本分野で既知の任意の適切な経路で患者に投与することができ、前記経路としては、経
口投与又は胃腸外経路(非経口経路)、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経
皮投与、気管内投与(エアロゾル)、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与(口腔
内投与と舌下投与を含む)を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、1日、1
週間、2週間、1ヶ月又は1年に1回若しくは複数回であってもよい。
口投与又は胃腸外経路(非経口経路)、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経
皮投与、気管内投与(エアロゾル)、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与(口腔
内投与と舌下投与を含む)を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、1日、1
週間、2週間、1ヶ月又は1年に1回若しくは複数回であってもよい。
本開示に記載されたオリゴヌクレオチド複合体の用量は、本分野における通常の用量で
あってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に患者の年齢、体重及び性別により
確認されてもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定
し、例えば、LD50(50%の群体を死亡させる用量)及びED50(定量的反応にお
いて、50%の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において
、50%の実験対象に陽性反応を発生させることができる場合の用量を指す)を測定して
もよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいてヒト用量の範囲を得
ることができる。
あってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に患者の年齢、体重及び性別により
確認されてもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定
し、例えば、LD50(50%の群体を死亡させる用量)及びED50(定量的反応にお
いて、50%の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において
、50%の実験対象に陽性反応を発生させることができる場合の用量を指す)を測定して
もよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいてヒト用量の範囲を得
ることができる。
本開示に記載された複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、6~12週齢、体
重18~25gのC57BL/6J又はC3H/HeNCrlVrマウスに対して、前記
オリゴヌクレオチド複合体におけるオリゴヌクレオチドの量として計算し、機能性オリゴ
ヌクレオチドと複合分子により形成されたオリゴヌクレオチド複合体を送達するためには
、複合体により送達されたオリゴヌクレオチドの用量は、0.001~100mg/kg
体重であってもよく、いくつかの実施形態において、0.01~50mg/kg体重であ
り、いくつかの実施形態において、0.05~20mg/kg体重であり、他のいくつか
の実施形態において、0.1~15mg/kg体重であり、他のいくつかの実施形態にお
いて、0.1~10mg/kg体重である。本開示に記載されたオリゴヌクレオチド複合
体を投与する場合、上記用量を参照してもよい。
重18~25gのC57BL/6J又はC3H/HeNCrlVrマウスに対して、前記
オリゴヌクレオチド複合体におけるオリゴヌクレオチドの量として計算し、機能性オリゴ
ヌクレオチドと複合分子により形成されたオリゴヌクレオチド複合体を送達するためには
、複合体により送達されたオリゴヌクレオチドの用量は、0.001~100mg/kg
体重であってもよく、いくつかの実施形態において、0.01~50mg/kg体重であ
り、いくつかの実施形態において、0.05~20mg/kg体重であり、他のいくつか
の実施形態において、0.1~15mg/kg体重であり、他のいくつかの実施形態にお
いて、0.1~10mg/kg体重である。本開示に記載されたオリゴヌクレオチド複合
体を投与する場合、上記用量を参照してもよい。
また、本開示のオリゴヌクレオチド複合体を、特定の遺伝子が異常に発現している肝細
胞に導入することにより、遺伝子発現調節機構により肝細胞における当該特定の遺伝子の
発現の抑制という目的を達成することもできる。いくつかの実施形態において、前記肝細
胞は、肝炎細胞であり、いくつかの実施形態において、HepG2.2.15細胞である
。いくつかの実施形態において、前記肝細胞は、Hep3B、HepG2、Huh7等の
肝癌細胞系又は単離した初代肝細胞から選択されてもよく、いくつかの実施形態において
、Huh7肝癌細胞である。
胞に導入することにより、遺伝子発現調節機構により肝細胞における当該特定の遺伝子の
発現の抑制という目的を達成することもできる。いくつかの実施形態において、前記肝細
胞は、肝炎細胞であり、いくつかの実施形態において、HepG2.2.15細胞である
。いくつかの実施形態において、前記肝細胞は、Hep3B、HepG2、Huh7等の
肝癌細胞系又は単離した初代肝細胞から選択されてもよく、いくつかの実施形態において
、Huh7肝癌細胞である。
本開示により提供される方法により特定の遺伝子の肝細胞における発現を抑制する場合
に、提供されるオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリゴヌクレオチドの用量は、
当業者が得ようとする効果により容易に確定するものである。例えば、いくつかの実施形
態において、前記オリゴヌクレオチド複合体は、siRNA複合体であり、提供されるs
iRNA複合体におけるsiRNA用量は、標的遺伝子の発現を低減するのに十分であり
、1pM~1μM、0.01nM~100nM、又は0.05nM~50nM又は0.0
5nM~約5nMの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は
、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達経路(局
所か全身か)等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞
又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
(発明の効果)
に、提供されるオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリゴヌクレオチドの用量は、
当業者が得ようとする効果により容易に確定するものである。例えば、いくつかの実施形
態において、前記オリゴヌクレオチド複合体は、siRNA複合体であり、提供されるs
iRNA複合体におけるsiRNA用量は、標的遺伝子の発現を低減するのに十分であり
、1pM~1μM、0.01nM~100nM、又は0.05nM~50nM又は0.0
5nM~約5nMの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は
、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達経路(局
所か全身か)等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞
又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
(発明の効果)
いくつかの実施形態において、本開示により提供される複合体は、体内でより高いオリ
ゴヌクレオチド送達効率、より低い毒性、よりよい安定性及び/又はより高い活性を有す
る。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、40
%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の標的遺伝子発現抑制率を示す
。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、40%
、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のHBV遺伝子発現抑制率を示す
。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、40%
、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の肝内HBV遺伝子発現抑制率を
示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、4
0%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の動物モデルにおける肝内H
BV遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なく
とも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のヒ
ト対象におけるHBV発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体
は、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は
95%のHBV表面抗原発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により
提供されるsiRNA、siRNA組成物又はsiRNA複合体は、少なくとも20%、
30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のANGPTL3
遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも
20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の肝内A
NGPTL3遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は
、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は9
5%の動物モデルにおける肝内ANGPTL3遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施
形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%
、70%、80%、90%又は95%のヒト対象におけるANGPTL3遺伝子発現抑制
率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%
、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のAPOC3遺伝子発現
抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、3
0%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の肝内APOC3遺
伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも2
0%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の動物モデ
ルにおける肝内APOC3遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開
示の複合体は、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%又は95%のヒト対象におけるAPOC3遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実
施形態において、本開示の複合体は、明らかなオフターゲット効果を示していない。オフ
ターゲット効果は、例えば、標的遺伝子でない遺伝子の発現の抑制であってもよい。オフ
ターゲット遺伝子発現の結合/抑制がオンターゲット遺伝子効果に比べて50%、40%
、30%、20%又は10%のレベルを下回る場合、当該オフターゲット効果が顕著では
ないと考えられている。
ゴヌクレオチド送達効率、より低い毒性、よりよい安定性及び/又はより高い活性を有す
る。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、40
%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の標的遺伝子発現抑制率を示す
。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、40%
、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のHBV遺伝子発現抑制率を示す
。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、40%
、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の肝内HBV遺伝子発現抑制率を
示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、4
0%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の動物モデルにおける肝内H
BV遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なく
とも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のヒ
ト対象におけるHBV発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体
は、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は
95%のHBV表面抗原発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により
提供されるsiRNA、siRNA組成物又はsiRNA複合体は、少なくとも20%、
30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のANGPTL3
遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも
20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の肝内A
NGPTL3遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は
、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は9
5%の動物モデルにおける肝内ANGPTL3遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施
形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%
、70%、80%、90%又は95%のヒト対象におけるANGPTL3遺伝子発現抑制
率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、30%
、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のAPOC3遺伝子発現
抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも20%、3
0%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の肝内APOC3遺
伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも2
0%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の動物モデ
ルにおける肝内APOC3遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開
示の複合体は、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%又は95%のヒト対象におけるAPOC3遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実
施形態において、本開示の複合体は、明らかなオフターゲット効果を示していない。オフ
ターゲット効果は、例えば、標的遺伝子でない遺伝子の発現の抑制であってもよい。オフ
ターゲット遺伝子発現の結合/抑制がオンターゲット遺伝子効果に比べて50%、40%
、30%、20%又は10%のレベルを下回る場合、当該オフターゲット効果が顕著では
ないと考えられている。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本開示の複合体は、siRNAを肝臓に効果的
に送達し、優れたHBV遺伝子発現抑制性質を示すことができる。例えば、低いオフター
ゲット効果を有するとともに、1mg/kgの用量でB型肝炎モデルマウスの肝臓におけ
る87.4%~92.2%のHBV遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において
、本開示のsiRNA複合体は、B型肝炎モデルマウスにおけるHBV表面抗原の発現を
効果的に低下させ、3mg/kgの用量で96.9%のHBV表面抗原発現抑制率及び9
5.4%のHBV DNA抑制率を達成することができる。いくつかの実施形態において
、本発明により提供される複合体は、最長140日間の期間にわたって、低用量でHBV
発現に対して優れた抑制作用を示す。
に送達し、優れたHBV遺伝子発現抑制性質を示すことができる。例えば、低いオフター
ゲット効果を有するとともに、1mg/kgの用量でB型肝炎モデルマウスの肝臓におけ
る87.4%~92.2%のHBV遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において
、本開示のsiRNA複合体は、B型肝炎モデルマウスにおけるHBV表面抗原の発現を
効果的に低下させ、3mg/kgの用量で96.9%のHBV表面抗原発現抑制率及び9
5.4%のHBV DNA抑制率を達成することができる。いくつかの実施形態において
、本発明により提供される複合体は、最長140日間の期間にわたって、低用量でHBV
発現に対して優れた抑制作用を示す。
本開示の1つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、siRNAを肝
臓に効果的に送達し、優れたHBV遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低い
オフターゲット効果を有するとともに、1mg/kgの用量でB型肝炎モデルマウスの肝
臓における少なくとも69.3%、又は78.1~89.1%のHBV遺伝子発現を抑制
する。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、B型肝炎モデルマウスにおける
HBV表面抗原の発現を効果的に低下させ、3mg/kgの用量で98.4%のHBV表
面抗原発現抑制率及び95.8%のHBV DNA抑制率を達成する。いくつかの実施形
態において、参照複合体に比べて、本発明により提供される特異的複合体は、最長84日
間の期間にわたって、低用量でHBV発現に対して優れた抑制作用を示す。
臓に効果的に送達し、優れたHBV遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低い
オフターゲット効果を有するとともに、1mg/kgの用量でB型肝炎モデルマウスの肝
臓における少なくとも69.3%、又は78.1~89.1%のHBV遺伝子発現を抑制
する。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、B型肝炎モデルマウスにおける
HBV表面抗原の発現を効果的に低下させ、3mg/kgの用量で98.4%のHBV表
面抗原発現抑制率及び95.8%のHBV DNA抑制率を達成する。いくつかの実施形
態において、参照複合体に比べて、本発明により提供される特異的複合体は、最長84日
間の期間にわたって、低用量でHBV発現に対して優れた抑制作用を示す。
本開示の1つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、siRNAを肝
臓に効果的に送達し、優れたHBV遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低い
オフターゲット効果を有するとともに、1mg/kgの用量でB型肝炎モデルマウスの肝
臓における少なくとも48.5%、又は76.8~80.0%のHBV遺伝子発現を抑制
することができる。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、さらに、B型肝炎
モデルマウスにおけるHBV表面抗原の発現を効果的に低下させ、ひいては3mg/kg
の用量で84.6%のHBV表面抗原発現抑制率及び85.6%のHBV DNA抑制率
を達成する。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本発明により提供され
る複合体は、最長21日間の期間にわたって、低用量でHBV発現に対してより高い抑制
作用を示す。
臓に効果的に送達し、優れたHBV遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低い
オフターゲット効果を有するとともに、1mg/kgの用量でB型肝炎モデルマウスの肝
臓における少なくとも48.5%、又は76.8~80.0%のHBV遺伝子発現を抑制
することができる。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、さらに、B型肝炎
モデルマウスにおけるHBV表面抗原の発現を効果的に低下させ、ひいては3mg/kg
の用量で84.6%のHBV表面抗原発現抑制率及び85.6%のHBV DNA抑制率
を達成する。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本発明により提供され
る複合体は、最長21日間の期間にわたって、低用量でHBV発現に対してより高い抑制
作用を示す。
本開示の1つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、siRNAを肝
臓に効果的に送達し、優れたHBV遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低い
オフターゲット効果を有するとともに、1mg/kgの用量でB型肝炎モデルマウスの肝
臓における少なくとも60.1%、又は、1つの実施形態において、80.7~84.5
%のHBV X遺伝子領域の遺伝子発現を抑制することができる。いくつかの実施形態に
おいて、本開示の複合体は、さらに、B型肝炎モデルマウスにおけるHBV表面抗原の発
現を効果的に低下させ、ひいては3mg/kgの用量で94.8%のHBV表面抗原発現
抑制率及び95.8%のHBV DNA抑制率を達成する。いくつかの実施形態において
、参照複合体に比べて、本発明により提供される複合体は、最長56日間の期間にわたっ
て、低用量でHBV発現に対して優れた抑制作用を示す。
臓に効果的に送達し、優れたHBV遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低い
オフターゲット効果を有するとともに、1mg/kgの用量でB型肝炎モデルマウスの肝
臓における少なくとも60.1%、又は、1つの実施形態において、80.7~84.5
%のHBV X遺伝子領域の遺伝子発現を抑制することができる。いくつかの実施形態に
おいて、本開示の複合体は、さらに、B型肝炎モデルマウスにおけるHBV表面抗原の発
現を効果的に低下させ、ひいては3mg/kgの用量で94.8%のHBV表面抗原発現
抑制率及び95.8%のHBV DNA抑制率を達成する。いくつかの実施形態において
、参照複合体に比べて、本発明により提供される複合体は、最長56日間の期間にわたっ
て、低用量でHBV発現に対して優れた抑制作用を示す。
本開示の1つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、siRNAを肝
臓に効果的に送達し、優れたANGPTL3遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例え
ば、1mg/kgの用量で高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも57.3%の
ANGPTL3遺伝子発現を抑制し、3mg/kgの用量で、遺伝子抑制率が最大90.
4%である。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本開示により提供され
る複合体は、低用量と低使用頻度では、最長49日間の期間にわたって優れたANGPT
L3発現抑制と脂質低下作用を示す。
臓に効果的に送達し、優れたANGPTL3遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例え
ば、1mg/kgの用量で高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも57.3%の
ANGPTL3遺伝子発現を抑制し、3mg/kgの用量で、遺伝子抑制率が最大90.
4%である。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本開示により提供され
る複合体は、低用量と低使用頻度では、最長49日間の期間にわたって優れたANGPT
L3発現抑制と脂質低下作用を示す。
本開示の1つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、siRNAを肝
臓に効果的に送達し、優れたAPOC3遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、
3mg/kgの用量で高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも75%のAPOC
3遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本開示に
より提供される複合体は、低用量と低使用頻度で、最長65日間の期間にわたって優れた
脂質抑制作用を示す。
臓に効果的に送達し、優れたAPOC3遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、
3mg/kgの用量で高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも75%のAPOC
3遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本開示に
より提供される複合体は、低用量と低使用頻度で、最長65日間の期間にわたって優れた
脂質抑制作用を示す。
ある実施形態において、本開示に記載された複合体は、動物モデルにおいて低い毒性を
示し、良好な安全性を示す。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の複合体につ
いて、C57BL/6Jマウスにおいて有効濃度の100倍まで(有効濃度を3mg/k
gとして)投与しても、明らかな毒性反応が認められない。
示し、良好な安全性を示す。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の複合体につ
いて、C57BL/6Jマウスにおいて有効濃度の100倍まで(有効濃度を3mg/k
gとして)投与しても、明らかな毒性反応が認められない。
上記例示から、本明細書により提供される複合体は、標的細胞表面の受容体に有効であ
り、負荷された活性剤を、受容体を発現する細胞に送達することが示される。また、複合
分子がそれ以外の細胞表面の受容体およびそれ以外の活性剤に適応でき、これらの受容体
を発現する細胞の活性剤を標的化することができると考えられる。
り、負荷された活性剤を、受容体を発現する細胞に送達することが示される。また、複合
分子がそれ以外の細胞表面の受容体およびそれ以外の活性剤に適応でき、これらの受容体
を発現する細胞の活性剤を標的化することができると考えられる。
<キット>
他の側面において、本明細書は、以上のような複合体を含むキットを提供する。
他の側面において、本明細書は、以上のような複合体を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、1つの容器におい
て複合体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、薬
学的に許容できる添加剤を含む容器を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によ
り提供されるキットは、薬学的に許容できる添加剤、例えば、安定化剤又は防腐剤をさら
に含む。いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、少なくとも
1種の追加の治療剤を含む。いくつかの実施形態において、当該キットは、本開示に記載
された複合体を含む治療剤と異なる少なくとも1種の追加の治療剤を容器に含む。いくつ
かの実施形態において、前記キットは、複合体と薬学的に許容できる添加剤又は他の成分
(存在する場合)を混合するための説明書を含む。
て複合体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、薬
学的に許容できる添加剤を含む容器を含む。いくつかの実施形態において、本明細書によ
り提供されるキットは、薬学的に許容できる添加剤、例えば、安定化剤又は防腐剤をさら
に含む。いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、少なくとも
1種の追加の治療剤を含む。いくつかの実施形態において、当該キットは、本開示に記載
された複合体を含む治療剤と異なる少なくとも1種の追加の治療剤を容器に含む。いくつ
かの実施形態において、前記キットは、複合体と薬学的に許容できる添加剤又は他の成分
(存在する場合)を混合するための説明書を含む。
本開示のキットにおいて、前記複合体及び/又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の
形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつか
の実施形態において、複合体及び/又は薬学的に許容できる添加剤は、基本的にクリーン
及び/又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供す
る。
形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつか
の実施形態において、複合体及び/又は薬学的に許容できる添加剤は、基本的にクリーン
及び/又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供す
る。
以下に実施例により本開示を詳しく記述する。特に説明がない限り、以下の実施例で用
いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、real-t
ime PCR等の操作は、いずれもMolecular Cloning(Cold
Spring Harbor LBboratory Press(1989))に記載
された方法を参照して行われる。
いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、real-t
ime PCR等の操作は、いずれもMolecular Cloning(Cold
Spring Harbor LBboratory Press(1989))に記載
された方法を参照して行われる。
HEK239A細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、20
%ウシ胎児血清(FBS、Hyclone)、0.2v%シアノマイシン二重耐性物(c
yanomycin biresistant)(ペニシリン-ストレプトマイシン(P
enicillin-Streptomycin)、Gibco、Invitrogen
)を含むDMEM完全培地(Hyclone)で37℃で5%CO2/95%空気含有イ
ンキュベーターにおいて培養した。
%ウシ胎児血清(FBS、Hyclone)、0.2v%シアノマイシン二重耐性物(c
yanomycin biresistant)(ペニシリン-ストレプトマイシン(P
enicillin-Streptomycin)、Gibco、Invitrogen
)を含むDMEM完全培地(Hyclone)で37℃で5%CO2/95%空気含有イ
ンキュベーターにおいて培養した。
Huh7細胞は、中国科学院幹細胞バンクから購入され、10%のウシ胎児血清(FB
S、Hyclone)、1%非必須アミノ酸(NEAA、Corning)を含むDME
M完全培地(Hyclone)で37℃で5%CO2/95%空気含有インキュベーター
において培養した。
S、Hyclone)、1%非必須アミノ酸(NEAA、Corning)を含むDME
M完全培地(Hyclone)で37℃で5%CO2/95%空気含有インキュベーター
において培養した。
別に説明がない限り、以下の調製例12~調製例15で合成されたsiRNA複合体で
細胞をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてLipofec
tamineTM2000(Invitrogen)を用い、具体的な操作については、
メーカーにより提供される説明書を参照のこと。
細胞をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてLipofec
tamineTM2000(Invitrogen)を用い、具体的な操作については、
メーカーにより提供される説明書を参照のこと。
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比(v/v)として
計算される。
計算される。
別に説明がない限り、用いられる動物モデルは以下のとおりである。
C57BL/6Jマウス:北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
SDラット:北京維通利華実験動物技術有限公司により提供される。
HBVトランスジェニックマウスC57B/6N-Tg(1.28HBV)/Vst(
genotype A):北京維通達生物技術有限公司から購入する。実験前にCOI>
104のマウス(以下、単に1.28copyマウスともいう)を選択した。
HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Br
i/J:北京大学医学部実験動物科学部から購入する。実験前にS/CoV>10のマウ
スを選択した。
HBVトランスジェニックマウス:M-TgHBVと命名され、上海市公衆衛生センタ
ー動物部から購入され、トランスジェニックマウスの作製方法は、Ren J.ら、J.
Medical Virology. 2006,78:551~560に記載された
。
AAV-HBVトランスジェニックマウス:文献の方法(董小岩ら、Chin J B
iotech 2010,May 25,26(5):679~686)により調製され
た。rAAV8-1.3HBV、D型(ayw)ウイルス(北京五加和分子医学研究所有
限公司から購入され、1×1012ウイルスゲノム(v.g.)/mL、ロット番号20
16123011)について、無菌PBSでrAAV8-1.3HBVを5×1011v
.g./mLに希釈し、マウス1匹あたり希釈されたrAAV8-1.3HBVを200
μL注射した(即ち、マウス1匹あたり1×1011v.g.注射した)。ウイルスを注
射した後の28日目に、全てのマウスに対して眼窩採血(約100μL)を行い、血清を
回収してHBsAg及びHBV DNAを検出するために用いられた。
低濃度AAV-HBVトランスジェニックマウス:実験前に、ウイルスを無菌PBSで
1×1011v.g./mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLのウイルスを注射し
、即ち、マウス1匹あたり1×1010v.g.注射したこと以外、上記とほぼ同じモデ
リング方法を採用した。
BALB/cマウス:6~8週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
ob/obマウス:6~8週齢、常州キャヴェンス実験動物有限公司から購入する。
ヒトAPOC3トランスジェニックマウス:B6、CBA-Tg(APOC3)370
7Bres/J、Jackson Labから購入する。
メタボリックシンドロームサル:全て雄性、北京大学分子医学研究所非ヒト霊長類研究
センターにより提供される。
C57BL/6Jマウス:北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
SDラット:北京維通利華実験動物技術有限公司により提供される。
HBVトランスジェニックマウスC57B/6N-Tg(1.28HBV)/Vst(
genotype A):北京維通達生物技術有限公司から購入する。実験前にCOI>
104のマウス(以下、単に1.28copyマウスともいう)を選択した。
HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Br
i/J:北京大学医学部実験動物科学部から購入する。実験前にS/CoV>10のマウ
スを選択した。
HBVトランスジェニックマウス:M-TgHBVと命名され、上海市公衆衛生センタ
ー動物部から購入され、トランスジェニックマウスの作製方法は、Ren J.ら、J.
Medical Virology. 2006,78:551~560に記載された
。
AAV-HBVトランスジェニックマウス:文献の方法(董小岩ら、Chin J B
iotech 2010,May 25,26(5):679~686)により調製され
た。rAAV8-1.3HBV、D型(ayw)ウイルス(北京五加和分子医学研究所有
限公司から購入され、1×1012ウイルスゲノム(v.g.)/mL、ロット番号20
16123011)について、無菌PBSでrAAV8-1.3HBVを5×1011v
.g./mLに希釈し、マウス1匹あたり希釈されたrAAV8-1.3HBVを200
μL注射した(即ち、マウス1匹あたり1×1011v.g.注射した)。ウイルスを注
射した後の28日目に、全てのマウスに対して眼窩採血(約100μL)を行い、血清を
回収してHBsAg及びHBV DNAを検出するために用いられた。
低濃度AAV-HBVトランスジェニックマウス:実験前に、ウイルスを無菌PBSで
1×1011v.g./mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLのウイルスを注射し
、即ち、マウス1匹あたり1×1010v.g.注射したこと以外、上記とほぼ同じモデ
リング方法を採用した。
BALB/cマウス:6~8週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
ob/obマウス:6~8週齢、常州キャヴェンス実験動物有限公司から購入する。
ヒトAPOC3トランスジェニックマウス:B6、CBA-Tg(APOC3)370
7Bres/J、Jackson Labから購入する。
メタボリックシンドロームサル:全て雄性、北京大学分子医学研究所非ヒト霊長類研究
センターにより提供される。
(調製例1)L-9複合分子(複合分子1)の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子1(以下、L-9複合分子ともいう)を合
成した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子1(以下、L-9複合分子ともいう)を合
成した。
(1-1)GAL-5の合成(L-9複合分子の末端セグメントの分子)
(1-1a)GAL-2の合成
100.0gのGAL-1(N-アセチル-D-ガラクトサミン塩酸塩、CAS番号:
1772-03-8、寧波弘翔生化公司から購入、463.8mmol)を1000ml
の無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で540mlの酢酸無水物(Enox社から購入、
5565.6mmol)を加え、室温で1.5時間攪拌反応した。反応液を10Lの氷水
に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを2Lの氷水で洗浄した後、完全に溶解させるまでア
セトニトリル/トルエン混合溶剤(アセトニトリル:トルエンの体積比=1:1)を加え
、溶剤を蒸発乾固し、130.0gの白色固形製品GAL-2を得た。
100.0gのGAL-1(N-アセチル-D-ガラクトサミン塩酸塩、CAS番号:
1772-03-8、寧波弘翔生化公司から購入、463.8mmol)を1000ml
の無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で540mlの酢酸無水物(Enox社から購入、
5565.6mmol)を加え、室温で1.5時間攪拌反応した。反応液を10Lの氷水
に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを2Lの氷水で洗浄した後、完全に溶解させるまでア
セトニトリル/トルエン混合溶剤(アセトニトリル:トルエンの体積比=1:1)を加え
、溶剤を蒸発乾固し、130.0gの白色固形製品GAL-2を得た。
(1-1b)GAL-3の合成
工程(1-1a)で得られたGAL-2(35.1g、90.0mmol)213ml
の無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、24.0gの
TMSOTf(CAS番号:27607-77-8、マックリン社から購入、108.0
mmol)を加え、室温で一晩反応させた。
工程(1-1a)で得られたGAL-2(35.1g、90.0mmol)213ml
の無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、24.0gの
TMSOTf(CAS番号:27607-77-8、マックリン社から購入、108.0
mmol)を加え、室温で一晩反応させた。
反応液に400mlのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、1Lの飽和炭
酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタン
により1回あたり300mlで2回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ300mlの飽和
炭酸水素ナトリウム水溶液及び300mlの飽和食塩水で洗浄してから、洗浄して得られ
た有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、26.9g
の淡黄色の粘稠な水飴状製品GAL-3を得た。
酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタン
により1回あたり300mlで2回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ300mlの飽和
炭酸水素ナトリウム水溶液及び300mlの飽和食塩水で洗浄してから、洗浄して得られ
た有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、26.9g
の淡黄色の粘稠な水飴状製品GAL-3を得た。
(1-1c)GAL-4の合成
工程(1-1b)で得られたGAL-3(26.9g、81.7mmol)を136m
lの無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した4Å分子篩粉30gを加え、9.
0gの5-ヘキセン-1-オール(CAS番号:821-41-0、Adamas-be
ta社から購入、89.9mmol)を加え、室温で30分間攪拌し、氷浴下で窒素保護
下で9.08gのTMSOTf(40.9mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた
。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に300mlのジクロロエタンを加えて希釈し、珪藻
土で濾過し、500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて10分間攪拌し洗浄し
、有機相を分離し、残りの水相を300mlのジクロロエタンで1回抽出し、全ての有機
相をあわせ、それぞれ300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び300mlの飽和
食塩水で洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、溶剤を減圧蒸発乾固し、41.3gの黄色水飴状製品GAL-4を得、精製すること
なく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(1-1b)で得られたGAL-3(26.9g、81.7mmol)を136m
lの無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した4Å分子篩粉30gを加え、9.
0gの5-ヘキセン-1-オール(CAS番号:821-41-0、Adamas-be
ta社から購入、89.9mmol)を加え、室温で30分間攪拌し、氷浴下で窒素保護
下で9.08gのTMSOTf(40.9mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた
。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に300mlのジクロロエタンを加えて希釈し、珪藻
土で濾過し、500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて10分間攪拌し洗浄し
、有機相を分離し、残りの水相を300mlのジクロロエタンで1回抽出し、全ての有機
相をあわせ、それぞれ300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び300mlの飽和
食塩水で洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、溶剤を減圧蒸発乾固し、41.3gの黄色水飴状製品GAL-4を得、精製すること
なく、そのまま次の酸化反応を行った。
(1-1d)GAL-5の合成
工程(1-1c)に記載された方法により得られたGAL-4(14.9g、34.7
mmol)を77mlのジクロロメタンと77mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解さ
せ、それぞれ103mlの脱イオン水及び29.7gの過ヨウ素酸ナトリウム(CAS番
号:7790-28-5、Aladdin社から購入、138.8mmol)を加え、氷
水浴下で10分間攪拌し、塩化ルテニウム(III)(CAS番号:14898-67-
0、Energy社から購入、238mg、1.145mmol)を加え、室温で一晩反
応させた。反応液に300mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加え
てpHを約7.5に調整し、有機相を分離し、残りの水相をジクロロメタンで1回あたり
200mlで3回抽出し、抽出して得られた有機相を捨てた。抽出して得られた水相を固
形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し
、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、6.85g
の白色泡状固形製品GAL-5を得た。
工程(1-1c)に記載された方法により得られたGAL-4(14.9g、34.7
mmol)を77mlのジクロロメタンと77mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解さ
せ、それぞれ103mlの脱イオン水及び29.7gの過ヨウ素酸ナトリウム(CAS番
号:7790-28-5、Aladdin社から購入、138.8mmol)を加え、氷
水浴下で10分間攪拌し、塩化ルテニウム(III)(CAS番号:14898-67-
0、Energy社から購入、238mg、1.145mmol)を加え、室温で一晩反
応させた。反応液に300mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加え
てpHを約7.5に調整し、有機相を分離し、残りの水相をジクロロメタンで1回あたり
200mlで3回抽出し、抽出して得られた有機相を捨てた。抽出して得られた水相を固
形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し
、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、6.85g
の白色泡状固形製品GAL-5を得た。
以下、上記方法により得られたGAL-5化合物を用い、以下のプロセス経路でL-9
複合分子を合成した。
複合分子を合成した。
(1-2)M-11-T3の合成:
アセトニトリルに溶解させ、トリエチルアミン(4.048g、40mmol)を加えて
氷水浴で0℃まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル(5.683g、40mmol)を加
え、室温で22h反応させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を18h発泡
乾燥させ、5.342gの固形粗製品M-11-T3を得、さらに精製することなく、そ
のまま後の反応に用いた。MS m/z:C15H22F9N4O3、[M+H]+、理
論値:477.35、実測値:477.65。
(1-3)M-11-T3-Trの合成:
溶解させ、得られた反応液にTrCl(3.345g、12mmol)及びトリエチルア
ミン(1.518g、15mmol)を加え、室温で20h攪拌反応させ、反応溶液を1
回あたり20mlの飽和炭酸水素ナトリウムで2回洗浄し、さらに20mlの飽和食塩水
で1回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後有機溶剤を減圧蒸発
乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、7.763gの固形粗製品M-11
-T3-Trを得た。MS m/z:C34H36F9N4O3、[M+Na]+、理論
値:741.25、実測値:741.53。固形粗製品M-11-T3-Trは、精製す
ることなく、引き続き次のM-18-Trの合成に使用した。
(1-4)M-18-Trの合成:
)を100mlのメタノールに溶解させ、100mlのメチルアミン水溶液(40質量%
)を加え、50℃で23h攪拌反応させ、不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固
し、残存物に200mlの体積比1:1のDCM:メタノール混合溶剤を加え、50ml
の飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで3回
抽出し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後溶剤を減圧
蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、200~300メッシュの順相
シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンで
シリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニア水(25wt%)
=1:1:0.05~1:1:0.25で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発
乾固し、真空油ポンプで残存物を発泡乾燥させて2.887gの純粋品M-18-Trを
得た。1H NMR (400 MHz,DMSO) δ7.47-7.39 (m,6
H),7.32-7.24 (m,6H),7.19-7.12 (m,3H),2.6
0-2.47 (m,4H),2.46-2.19 (m,13H),1.70-1.5
5 (m,4H),1.40 (p,J =6.8 Hz,2H). MS m/z:
C28H39N4、[M+H]+、理論値:431.65、実測値:432.61。
(1-5)L-5-Trの合成:
1-1)で得られたGAL-5(6.93g、15.48mmol)を混合して47ml
のアセトニトリルに溶解させ、N-メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol
)及び4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩
(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。
200mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、100mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶
液で有機相を洗浄し、100mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を無水硫酸ナト
リウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200~300
メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリ
エチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5~
100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して7.49gの純粋品
L-5-Trを得た。1H NMR (400 MHz,DMSO) δ7.83-7.
10 (m,4H),7.67-7.60 (m,1H),7.44-7.34 (m,
6H),7.33-7.24 (m,6H),7.20-7.15 (m,3H),5.
22 (s,3H),4.97 (d,J =11.3 Hz,3H),4.49 (d
,J =8.4 Hz,3H),4.06-3.07 (m,9H),3.95-3.8
3 (m,3H),3.77-3.64 (m,3H),3.45-3.35 (m,3
H),3.12-2.87 (m,8H),2.30-2.15 (m,3H),2.1
1-1.98 (m,22H),1.95-1.84 (m,11H),1.81-1.
61 (m,14H),1.54-1.36 (m,14H). MS m/z:C85
H119N7O30、[M+H]+、理論値:1718.81、実測値:1718.03
。
(1-6)L-8の合成:
lのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol
)を加え、室温で2h反応させ、得られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて
希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7~8となるように調節し、
単離した水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、全ての有機相をあわ
せ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た
。精製には、200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、10wt%トリエチルア
ミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジク
ロロメタン:メタノール=100:30~100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回
収し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.26gの純粋品L-8を得た。1H NMR (40
0 MHz,DMSO) δ 7.84 (d,J =9.0 Hz,3H),7.27
-7.23 (m,1H),7.13-7.18 (m,1H),5.22 (d,J
=3.1 Hz,3H),4.97 (dd,J =11.3,3.1 Hz,3H),
4.48 (d,J =8.4 Hz,3H),4.09-3.98 (m,9H),3
.88 (dd,J =19.3,9.3 Hz,3H),3.75-3.66 (m,
3H),3.44-3.38 (m,3H),3.17-3.30 (m,4H),3.
10-2.97 (m,4H),2.35-2.20 (m,6H),2.15-2.0
8 (m,9H),2.07-1.98 (m,13H),1.94-1.87 (m,
9H),1.81-1.74 (m,9H),1.65-1.42 (m,18H).
MS m/z:C85H119N7O30、[M+H]+、理論値:1477.59、実
測値:1477.23。
(1-7a)A-1の合成
mmol)を450mlの無水ピリジンに溶解させ、DL-グリセリン酸カルシウム水和
物(12.88g、45.0mmol)を加え、45℃で22h反応させ、得られた反応
液を濾過し、ケーキを200mlのDCMでリンスし、濾液を乾燥させるまで減圧濃縮し
、残存物を500mlのジクロロメタンに改めて溶解させ、0.5Mトリエチルアミンリ
ン酸塩(pH=7~8)で1回あたり200mlで2回洗浄し、単離した水相をジクロロ
メタンで1回あたり200mlで2回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾
燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を200~300メッシュの順相シリカ
ゲルカラムで精製し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール=1:1
:1:0.35~1:1:1:0.55で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減
圧蒸発乾固し、残存物を500mlのジクロロメタンに改めて溶解させ、200mlの0
.5Mトリエチルアミンリン酸塩で1回洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり20
0mlで2回抽出し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、
溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩減圧乾燥させ、20.7gの白色固
形製品A-1を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.4
6 (ddd,J =6.5,2.3,1.1 Hz,1H),7.40-7.28 (
m,7H),6.89-6.81 (m,4H),4.84 (d,J =5.0 Hz
,1H),4.36-4.24 (m,1H),4.29 (s,6H),3.92 (
dd,J =12.4,7.0 Hz,1H),3.67 (dd,J =12.3,7
.0 Hz,1H),2.52 (q,J =6.3 Hz,6H),1.03 (t,
J =6.3 Hz,9H). MS m/z:C24H23O6、[M-H]-、理論
値:407.15、実測値:406.92。
(1-7b)L-7の合成:
-7a)で得られたA-1(2.342g、4.596mmol)を混合し、16mlの
ジクロロメタンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリ
アジン4(3H)-オン(DEPBT、1.375g、4.596mmol)を加え、さ
らにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.191mmol)を加え、25℃
で2h攪拌反応させ、10mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジク
ロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、10mlの飽和
食塩水で有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで2回抽
出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減
圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、4.900gの粗製品を得た
。粗製品をカラムで精製し、120gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い
、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミン
を含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:
N,N-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5~1:1:1:0.6で勾配溶出し
、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.336gの純粋品L-7を得た。
1H NMR (400 MHz,DMSO) δ7.90-7.78 (m,4H),
7.75-7.64 (m,1H),7.38-7.18 (m,9H),6.91-6
.83 (m,4H),5.25-5.10 (m,4H),4.97 (dd,J =
11.2,3.2 Hz,3H),4.48-4.30 (m,4H),4.02 (s
,9H),3.93-3.84 (m,3H),3.76-3.66 (m,9H),3
.45-3.35 (m,3H),3.24-2.98 (m,10H),2.30-2
.20 (m,2H),2.11-1.88 (m,31H),1.80-1.40 (
m,28H). MS m/z:C90H128N7O35、[M-DMTr]+、理論
値:1564.65、実測値:1564.88。
(1-8)L-9の合成:
水物(0.378g、3.78mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、
0.462g、3.78mmol)を混合して13mlのジクロロメタンに溶解させ、さ
らにDIPEA(0.814g、6.30mmol)を加え、25℃で24h攪拌した。
5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で得られた反応液を洗浄し、単離した水相を
ジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固
して2.774gの粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、60gの200~300メ
ッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し
、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン
:メタノール=100:18~100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤
を減圧蒸発乾固して1.874gの純粋品L-9複合分子(複合分子1)を得た。1H
NMR (400 MHz,DMSO) δ 8.58 (d,J =4.2 Hz,1
H),7.94-7.82 (m,3H),7.41-7.29 (m,5H),7.2
2 (d,J =8.1 Hz,5H),6.89 (d,J =8.3 Hz,4H)
,5.49-5.37 (m,1H),5.21 (d,J =3.0 Hz,3H),
4.97 (d,J =11.1 Hz,3H),4.49 (d,J =8.2 Hz
,3H),4.02 (s,9H),3.88 (dd,J =19.4、9.4 Hz
,3H),3.77-3.65 (m,9H),3.50-3.39 (m,6H),3
.11-2.90 (m,5H),2.61-2.54 (m,4H),2.47-2.
41 (m,2H),2.26-2.17 (m,2H),2.15-1.95 (m,
22H),1.92-1.84 (m,9H),1.80-1.70 (m,10H),
1.65-1.35 (m,17H)、1.31-1.19 (m,4H),0.96
(t,J =7.1 Hz,9H). MS m/z:C94H132N7O38、[M
-DMTr]+、理論値:1664.72、実測値:1665.03。得られたL-9複
合分子の構造が式(503)に示される。
(調製例2)P-9複合分子(複合分子2)の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子2(以下、P-9複合分子ともいう)を合
成した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子2(以下、P-9複合分子ともいう)を合
成した。
(2-1)GAL5-C4-1の合成
40mlのN,N-ジメチルホルムアミドに上記(1-1)に記載された方法により得
られたGAL-5(13.43g、30.0mmol)、4-アミノ酸tert-ブチル
エステル塩酸塩(5.87g、30.0mmol)、O-ベンゾトリアゾール-テトラメ
チルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(13.65g、36.0mmol)及びジ
イソプロピルエチルアミン(11.63g、90.0mmol)を加え、均一に溶解させ
た後室温で5時間攪拌反応させた。得られた反応液に300mlの飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液を加え、酢酸エチルで単離した水相を1回あたり200mlで3回抽出し、洗浄
して得られた有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で1回洗浄してから、洗浄して得
られた有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減
圧留去して30.3gの油状物粗製品GAL5-C4-1を得、そのまま次の反応を行っ
た。
40mlのN,N-ジメチルホルムアミドに上記(1-1)に記載された方法により得
られたGAL-5(13.43g、30.0mmol)、4-アミノ酸tert-ブチル
エステル塩酸塩(5.87g、30.0mmol)、O-ベンゾトリアゾール-テトラメ
チルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(13.65g、36.0mmol)及びジ
イソプロピルエチルアミン(11.63g、90.0mmol)を加え、均一に溶解させ
た後室温で5時間攪拌反応させた。得られた反応液に300mlの飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液を加え、酢酸エチルで単離した水相を1回あたり200mlで3回抽出し、洗浄
して得られた有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で1回洗浄してから、洗浄して得
られた有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減
圧留去して30.3gの油状物粗製品GAL5-C4-1を得、そのまま次の反応を行っ
た。
(2-2)GAL5-C4-2の合成
工程(2-1)で得られたGAL5-C4-1粗製品(30.3g、30mmol)を
180mlギ酸に溶解させ、室温で16時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発
し、粗製品をカラムクロマトグラフィーにより精製し(200~300メッシュの順相シ
リカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=100:18~100:20で勾配溶
出した)、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計14.84gの目的生成物GAL5-
C4-2を得た。
工程(2-1)で得られたGAL5-C4-1粗製品(30.3g、30mmol)を
180mlギ酸に溶解させ、室温で16時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発
し、粗製品をカラムクロマトグラフィーにより精製し(200~300メッシュの順相シ
リカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=100:18~100:20で勾配溶
出した)、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計14.84gの目的生成物GAL5-
C4-2を得た。
(2-3)P-6の合成:
工程(1-4)に記載された方法により得られたM-18-Tr(2.02g、4.6
9mmol)と工程(2-2)で得られたGAL5-C4-2(8.24g、15.48
mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN-メチルモルホリ
ン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4-(4,6-ジメトキシトリア
ジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48
mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。200mlのジクロロメタンで得られた
反応液を希釈し、それぞれ100mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び100mlの飽
和食塩水で有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾
過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200~300メッシュの順相シリカゲ
ルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲ
ルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5~100:7で勾配溶出し
、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計8.27gの純粋品P-6を得た。
工程(1-4)に記載された方法により得られたM-18-Tr(2.02g、4.6
9mmol)と工程(2-2)で得られたGAL5-C4-2(8.24g、15.48
mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN-メチルモルホリ
ン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4-(4,6-ジメトキシトリア
ジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48
mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。200mlのジクロロメタンで得られた
反応液を希釈し、それぞれ100mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び100mlの飽
和食塩水で有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾
過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200~300メッシュの順相シリカゲ
ルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲ
ルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5~100:7で勾配溶出し
、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計8.27gの純粋品P-6を得た。
(2-4)P-7の合成:
上記(2-3)で得られたP-6(6.82g、3.456mmol)を69mlのジ
クロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加
え、室温で2h反応させた。得られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈
し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7~8となるように調節し
、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、全ての有機相をあ
わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得
た。200~300メッシュの順相シリカゲルで精製し、10wt%トリエチルアミンで
シリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメ
タン:メタノール=100:30~100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、
溶剤を減圧蒸発乾固して計4.82gのP-7を得た。MS m/z:C78H127N
10O33、[M+H]+、理論値:1732.91、実測値:1735.73。
上記(2-3)で得られたP-6(6.82g、3.456mmol)を69mlのジ
クロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加
え、室温で2h反応させた。得られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈
し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7~8となるように調節し
、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、全ての有機相をあ
わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得
た。200~300メッシュの順相シリカゲルで精製し、10wt%トリエチルアミンで
シリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメ
タン:メタノール=100:30~100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、
溶剤を減圧蒸発乾固して計4.82gのP-7を得た。MS m/z:C78H127N
10O33、[M+H]+、理論値:1732.91、実測値:1735.73。
(2-5)P-8の合成:
mol)を混合して16mlのジクロロメタンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリル-
1,2,3-ベンゾトリアゾール4(3H)-オン(DEPBT)(1.375g、4.
596mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.19
1mmol)を加え、25℃で2h攪拌反応させた。10mlの飽和炭酸水素ナトリウム
で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、全ての有
機相をあわせ、10mlの飽和食塩水で洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あ
たり10mlで2回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、
濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品
を得た。粗製品をカラムで精製し、120gの200~300メッシュの順相シリカゲル
を用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチル
アミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメ
タン:N,N-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5~1:1:1:0.6で勾配
溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計2.793gの純粋品P-8を得た
。
(2-6)P-9の合成:
P-8(490mg、0.231mmol)、コハク酸無水物(69mg、0.693
mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、68mg、0.554mmol
)を混合して2.3mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミ
ン(DIPEA、149mg、1.155mmol)を加え、25℃で21h攪拌反応さ
せた。得られた反応液を50mlのジクロロメタンで希釈し、さらに100mlの0.5
Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あ
たり10mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗
製品をカラムで精製し、80gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1w
t%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し
、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18~100
:20で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計200mgの純粋品P
-9複合分子(複合分子2)を得た。MS m/z:C106H153N10O41、[
M-DMTr]+、理論値:1921.05、実測値:1920.97。得られたP-9
複合分子の構造が式(504)に示される。
P-8(490mg、0.231mmol)、コハク酸無水物(69mg、0.693
mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、68mg、0.554mmol
)を混合して2.3mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミ
ン(DIPEA、149mg、1.155mmol)を加え、25℃で21h攪拌反応さ
せた。得られた反応液を50mlのジクロロメタンで希釈し、さらに100mlの0.5
Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あ
たり10mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗
製品をカラムで精製し、80gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1w
t%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し
、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18~100
:20で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計200mgの純粋品P
-9複合分子(複合分子2)を得た。MS m/z:C106H153N10O41、[
M-DMTr]+、理論値:1921.05、実測値:1920.97。得られたP-9
複合分子の構造が式(504)に示される。
(調製例3)R-4複合分子(複合分子3)の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子3(以下、R-4複合分子ともいう)を合
成した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子3(以下、R-4複合分子ともいう)を合
成した。
(3-1)GAL-C7-1の合成
工程(1-1b)に記載された方法により得られたGAL-3(26.4g、80.2
mmol)を134mlの無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、60gの4Å分子篩
粉を加え、さらに7-オクテン-1-オール(11.3g、88.2mmol)を加え、
室温で10分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリ
メチルシリル(Trimethylsilyl trifluoromethanesu
lphonate、TMSOTf、8.9g、40.1mmol)を加え、室温で24時
間攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に500mlの飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、残りの水相を100mlのジクロロメタン
で1回抽出した。全ての有機相をあわせ、250mlの飽和食塩水で1回洗浄してから、
洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤
を減圧留去して33.3gの黄色水飴状製品GAL-C7-1を得、精製することなく、
そのまま次の酸化反応を行った。
工程(1-1b)に記載された方法により得られたGAL-3(26.4g、80.2
mmol)を134mlの無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、60gの4Å分子篩
粉を加え、さらに7-オクテン-1-オール(11.3g、88.2mmol)を加え、
室温で10分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリ
メチルシリル(Trimethylsilyl trifluoromethanesu
lphonate、TMSOTf、8.9g、40.1mmol)を加え、室温で24時
間攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に500mlの飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、残りの水相を100mlのジクロロメタン
で1回抽出した。全ての有機相をあわせ、250mlの飽和食塩水で1回洗浄してから、
洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤
を減圧留去して33.3gの黄色水飴状製品GAL-C7-1を得、精製することなく、
そのまま次の酸化反応を行った。
(3-2)GAL-C7-2の合成
工程(3-1)で得られたGAL-C7-1(33.3g、72.8mmol)を16
0mlのジクロロメタンと160mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ
216mlの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム(62.3g、291.2mmol)を加
え、氷水浴下で10分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム(III)(498mg、2
.4mmol)を加えて自然に室温まで昇温し23時間攪拌反応させた。得られた反応液
に200mlの水を加えて希釈し、攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを7.
5に調節し、有機相を分離し、残りの水相をジクロロメタンで3回抽出し、抽出して得ら
れた有機相を捨て、抽出して得られた水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロ
ロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナト
リウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(200~300
メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=100:18~10
0:20で勾配溶出した)により精製して22.4gの白色泡状固形製品GAL-C7-
2を得た。MS m/z:C21H32NO11、[M+H]+、理論値:476.50
、実測値:475.94。
工程(3-1)で得られたGAL-C7-1(33.3g、72.8mmol)を16
0mlのジクロロメタンと160mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ
216mlの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム(62.3g、291.2mmol)を加
え、氷水浴下で10分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム(III)(498mg、2
.4mmol)を加えて自然に室温まで昇温し23時間攪拌反応させた。得られた反応液
に200mlの水を加えて希釈し、攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを7.
5に調節し、有機相を分離し、残りの水相をジクロロメタンで3回抽出し、抽出して得ら
れた有機相を捨て、抽出して得られた水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロ
ロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナト
リウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(200~300
メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=100:18~10
0:20で勾配溶出した)により精製して22.4gの白色泡状固形製品GAL-C7-
2を得た。MS m/z:C21H32NO11、[M+H]+、理論値:476.50
、実測値:475.94。
(3-3)R-1の合成:
工程(1-4)に記載された方法により得られたM-18-Tr(2.02g、4.6
9mmol)とGAL-C7-2(7.36g、15.48mmol)を混合して47m
lのアセトニトリルに溶解させ、さらにN-メチルモルホリン(3.13g、30.96
mmol)を加え、最後に4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチ
ルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2
h攪拌反応させた。得られた反応液を200mlのジクロロメタンで希釈し、それぞれ1
00mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び100mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、
全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾
固して粗製品を得、200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エー
テルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロ
メタン:メタノール=100:5~100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減
圧蒸発乾固して7.82gの純粋品R-1を得た。
工程(1-4)に記載された方法により得られたM-18-Tr(2.02g、4.6
9mmol)とGAL-C7-2(7.36g、15.48mmol)を混合して47m
lのアセトニトリルに溶解させ、さらにN-メチルモルホリン(3.13g、30.96
mmol)を加え、最後に4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチ
ルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2
h攪拌反応させた。得られた反応液を200mlのジクロロメタンで希釈し、それぞれ1
00mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び100mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、
全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾
固して粗製品を得、200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エー
テルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロ
メタン:メタノール=100:5~100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減
圧蒸発乾固して7.82gの純粋品R-1を得た。
(3-4)R-2の合成:
R-1(6.23g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、
ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた
。得られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液を加えて洗浄しpH=7~8となるように調節し、単離した水相をジクロロメタン
で1回あたり30mlで6回抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾
燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品200~300メッ
シュの順相シリカゲルで精製し、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和
し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=10
0:30~100:40で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.49gの純粋品R-
2を得た。
R-1(6.23g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、
ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた
。得られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液を加えて洗浄しpH=7~8となるように調節し、単離した水相をジクロロメタン
で1回あたり30mlで6回抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾
燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品200~300メッ
シュの順相シリカゲルで精製し、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和
し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=10
0:30~100:40で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.49gの純粋品R-
2を得た。
(3-5)R-3の合成:
R-2(2.391g、1.532mmol)とA-1(2.342g、4.596m
mol)を混合して16mlのジクロロメタンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリルオ
キシ-1,2,3-ベンゾトリアジン4(3H)-オン(DEPBT、1.375g、4
.596mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.1
91mmol)を加え、25℃で2h攪拌反応させた。10mlの飽和炭酸水素ナトリウ
ムで有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し
た。全ての有機相をあわせ、10mlの飽和食塩水で洗浄し、単離した水相をジクロロメ
タンで1回あたり10mlで2回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウム
で乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩減圧乾燥
させ粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、120gの200~300メッシュの順相
シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%
トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:
ジクロロメタン:N,N-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5~1:1:1:0
.6で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.642gの純粋品R-3を得た。
R-2(2.391g、1.532mmol)とA-1(2.342g、4.596m
mol)を混合して16mlのジクロロメタンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリルオ
キシ-1,2,3-ベンゾトリアジン4(3H)-オン(DEPBT、1.375g、4
.596mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.1
91mmol)を加え、25℃で2h攪拌反応させた。10mlの飽和炭酸水素ナトリウ
ムで有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し
た。全ての有機相をあわせ、10mlの飽和食塩水で洗浄し、単離した水相をジクロロメ
タンで1回あたり10mlで2回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウム
で乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩減圧乾燥
させ粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、120gの200~300メッシュの順相
シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%
トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:
ジクロロメタン:N,N-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5~1:1:1:0
.6で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.642gの純粋品R-3を得た。
(3-6)R-4の合成:
R-3(795mg、0.4074mmol)、コハク酸無水物(82mg、0.81
48mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、100mg、0.8148
mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチル
アミン(DIPEA、100mg、0.8148mmol)を加え、25℃で18h攪拌
反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で得られた反応液を洗浄し、水
相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、溶剤を減
圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、30gの200~300メッシ
ュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジ
クロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メ
タノール=100:18~100:20で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発
乾固して505mgの純粋品R-4複合分子(複合分子3)を得た。得られたR-4複合
分子の構造が式(507)に示される。
R-3(795mg、0.4074mmol)、コハク酸無水物(82mg、0.81
48mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、100mg、0.8148
mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチル
アミン(DIPEA、100mg、0.8148mmol)を加え、25℃で18h攪拌
反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で得られた反応液を洗浄し、水
相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、溶剤を減
圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、30gの200~300メッシ
ュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジ
クロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メ
タノール=100:18~100:20で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発
乾固して505mgの純粋品R-4複合分子(複合分子3)を得た。得られたR-4複合
分子の構造が式(507)に示される。
(調製例4)LA-4複合分子(複合分子4)の調製
以下のプロセス経路により、複合分子4(以下、LA-4複合分子ともいう)を合成で
きると予期した。得られるLA-4複合分子の構造が式(512)に示される。
以下のプロセス経路により、複合分子4(以下、LA-4複合分子ともいう)を合成で
きると予期した。得られるLA-4複合分子の構造が式(512)に示される。
(調製例5)LB-4複合分子(複合分子5)の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子5(以下、LB-4複合分子ともいう)を
合成した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子5(以下、LB-4複合分子ともいう)を
合成した。
(5-1)LB-1の合成:
工程(1-6)に記載された方法により得られたL-8(5.0g、3.386mmo
l)、アジピン酸無水物(870mg、6.772mmol)及び4-ジメチルアミノピ
リジン(DMAP、827mg、6.772mmol)を混合して130mlのジクロロ
メタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、2.2g、16.
931mmol)を加え、25℃で4h攪拌反応させた。得られた反応液に70mlのジ
クロロメタンを加えて希釈し、0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、単
離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで4回抽出し、全ての有機相をあわせ
、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、120gの200~
300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性
を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメ
タン:メタノール=1:1:1:0.2~1:1:1:1で勾配溶出した。溶剤を減圧蒸
発乾固して4.267gの純粋品LB-1を得た。
工程(1-6)に記載された方法により得られたL-8(5.0g、3.386mmo
l)、アジピン酸無水物(870mg、6.772mmol)及び4-ジメチルアミノピ
リジン(DMAP、827mg、6.772mmol)を混合して130mlのジクロロ
メタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、2.2g、16.
931mmol)を加え、25℃で4h攪拌反応させた。得られた反応液に70mlのジ
クロロメタンを加えて希釈し、0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、単
離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで4回抽出し、全ての有機相をあわせ
、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、120gの200~
300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性
を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメ
タン:メタノール=1:1:1:0.2~1:1:1:1で勾配溶出した。溶剤を減圧蒸
発乾固して4.267gの純粋品LB-1を得た。
(5-2)LB-2の合成:
工程(5-1)に記載された方法により得られたLB-1(4.697g、2.753
mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)、3-アミノ-1,2-プロパンジオール
(313mg、3.442mmol)、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル
)-4-メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、953mg、3.442mmol)及び
N-メチルモルホリン(700mg、6.884mmol)を30mlのアセトニトリル
と3mlのメタノールの混合物に順に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させるまで
溶剤を蒸発し、残存物をカラムクロマトグラフィー(200~300メッシュの順相シリ
カゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=1:0.07~1:0.5で勾配溶出し
た)により精製し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、3.27gの目的生成物LB-
2を得た。
工程(5-1)に記載された方法により得られたLB-1(4.697g、2.753
mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)、3-アミノ-1,2-プロパンジオール
(313mg、3.442mmol)、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル
)-4-メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、953mg、3.442mmol)及び
N-メチルモルホリン(700mg、6.884mmol)を30mlのアセトニトリル
と3mlのメタノールの混合物に順に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させるまで
溶剤を蒸発し、残存物をカラムクロマトグラフィー(200~300メッシュの順相シリ
カゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=1:0.07~1:0.5で勾配溶出し
た)により精製し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、3.27gの目的生成物LB-
2を得た。
(5-3)LB-3の合成:
LB-2(2.27g、1.353mmol)を14mlの無水ピリジンで溶解させた
。さらに4,4’-ビスメトキシトリチルクロリド(688mg、2.03mmol)を
加えて室温で一晩攪拌反応させた。150mlのメタノールを加えてクエンチングし反応
、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。残存物をカラムクロマトグラフィー(200~300
メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=1:0.05~1:
0.2で勾配溶出した)により精製し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、1.647
gの目的生成物LB-3を得た。
LB-2(2.27g、1.353mmol)を14mlの無水ピリジンで溶解させた
。さらに4,4’-ビスメトキシトリチルクロリド(688mg、2.03mmol)を
加えて室温で一晩攪拌反応させた。150mlのメタノールを加えてクエンチングし反応
、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。残存物をカラムクロマトグラフィー(200~300
メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=1:0.05~1:
0.2で勾配溶出した)により精製し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、1.647
gの目的生成物LB-3を得た。
(5-4)LB-4の合成:
LB-3(822mg、0.415mmol)、コハク酸無水物(83g、0.83m
mol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、102mg、0.83mmol)
を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIPEA(270mg、2.0
75mmol)を加え、25℃で一晩攪拌反応させた。得られた反応液を0.5Mトリエ
チルアミンリン酸塩で3回洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり2mlで
3回抽出した。全ての有機相をあわせ、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品を
カラムで精製し、200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、5wt%トリエチル
アミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、1wt‰トリエ
チルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:5~100:20で勾配溶出し
、溶剤を減圧蒸発乾固して787mgの構造が式(513)に示される純粋品LB-4複
合分子(複合分子5)を得た。
LB-3(822mg、0.415mmol)、コハク酸無水物(83g、0.83m
mol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、102mg、0.83mmol)
を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIPEA(270mg、2.0
75mmol)を加え、25℃で一晩攪拌反応させた。得られた反応液を0.5Mトリエ
チルアミンリン酸塩で3回洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり2mlで
3回抽出した。全ての有機相をあわせ、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品を
カラムで精製し、200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、5wt%トリエチル
アミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、1wt‰トリエ
チルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:5~100:20で勾配溶出し
、溶剤を減圧蒸発乾固して787mgの構造が式(513)に示される純粋品LB-4複
合分子(複合分子5)を得た。
(調製例6)V-7複合分子(複合分子6)の合成
以下のプロセス経路により、構造が式(514)に示される複合分子6(以下、V-7
複合分子ともいう)を合成できると予期した。
以下のプロセス経路により、構造が式(514)に示される複合分子6(以下、V-7
複合分子ともいう)を合成できると予期した。
(調製例7)W-7複合分子(複合分子7)の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子7(以下、W-7複合分子ともいう)を合
成した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子7(以下、W-7複合分子ともいう)を合
成した。
(7-1)W-1の合成:
W-0(2.024g、10mmol)を25mlのアセトニトリルに溶解させ、さら
にトリエチルアミン(4.048g、40mmol)を加え、氷浴で0℃程度まで冷却し
、トリフルオロ酢酸エチル(5.683g、40mmol)を加え、室温で22h反応さ
せた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を18h発泡乾燥させ、5.835
gの固形粗製品W-1を得た。
W-0(2.024g、10mmol)を25mlのアセトニトリルに溶解させ、さら
にトリエチルアミン(4.048g、40mmol)を加え、氷浴で0℃程度まで冷却し
、トリフルオロ酢酸エチル(5.683g、40mmol)を加え、室温で22h反応さ
せた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を18h発泡乾燥させ、5.835
gの固形粗製品W-1を得た。
(7-2)W-2の合成:
W-1粗製品(5.835g、10mmol)を50mlのジクロロメタンに溶解させ
、反応液にTrCl(3.345g、12mmol)及びトリエチルアミン(1.518
g、15mmol)を加え、室温で20h攪拌反応させた。得られた反応液を20mlの
飽和炭酸水素ナトリウムで2回洗浄し、さらに20mlの飽和食塩水で1回洗浄した。全
ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に有機溶剤を減圧蒸発
乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、8.012gの固形粗製品W-2を
得た。固形粗製品W-2は、処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
W-1粗製品(5.835g、10mmol)を50mlのジクロロメタンに溶解させ
、反応液にTrCl(3.345g、12mmol)及びトリエチルアミン(1.518
g、15mmol)を加え、室温で20h攪拌反応させた。得られた反応液を20mlの
飽和炭酸水素ナトリウムで2回洗浄し、さらに20mlの飽和食塩水で1回洗浄した。全
ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に有機溶剤を減圧蒸発
乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、8.012gの固形粗製品W-2を
得た。固形粗製品W-2は、処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
(7-3)W-3の合成:
W-2粗製品(8.012g、10mmol)を100mlのメタノールに溶解させ、
さらに100mlのメチルアミン水溶液(40wt%)を加え、50℃で23h攪拌反応
させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物に200mlの体積比
1:1のDCM-メタノール混合溶剤を加え、得られた有機相を50mlの飽和炭酸水素
ナトリウムで洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで3回抽出し
た。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸
発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、200~300メッシュの順相シ
リカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシ
リカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニア水(25wt%)=
1:1:0.05~1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧
蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて3.062gの純粋品W-3を得た
。
W-2粗製品(8.012g、10mmol)を100mlのメタノールに溶解させ、
さらに100mlのメチルアミン水溶液(40wt%)を加え、50℃で23h攪拌反応
させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物に200mlの体積比
1:1のDCM-メタノール混合溶剤を加え、得られた有機相を50mlの飽和炭酸水素
ナトリウムで洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで3回抽出し
た。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸
発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、200~300メッシュの順相シ
リカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシ
リカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニア水(25wt%)=
1:1:0.05~1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧
蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて3.062gの純粋品W-3を得た
。
(7-4)W-4の合成:
W-3(675mg、1.517mmol)とGAL-C7-2(2.60g、5.4
6mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエ
チルアミン(1.57g、12.14mmol)を加え、最後に3-ジエトキシホスホリ
ルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン(DEPBT、1.816
g、6.04mmol)を加え、室温で2.5h攪拌反応させた。得られた反応液を10
0mlのジクロロメタンで希釈した。それぞれ80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及
び80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品を200~3
00メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%
トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:
5~100:7で勾配溶出し、溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して1.610gの純粋品
W-4を得た。
W-3(675mg、1.517mmol)とGAL-C7-2(2.60g、5.4
6mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエ
チルアミン(1.57g、12.14mmol)を加え、最後に3-ジエトキシホスホリ
ルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン(DEPBT、1.816
g、6.04mmol)を加え、室温で2.5h攪拌反応させた。得られた反応液を10
0mlのジクロロメタンで希釈した。それぞれ80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及
び80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品を200~3
00メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%
トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:
5~100:7で勾配溶出し、溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して1.610gの純粋品
W-4を得た。
(7-5)W-5の合成:
W-4(1.61g、0.886mmol)を125mlのジクロロメタンに溶解させ
、さらにジクロロ酢酸(3.5ml、42.43mmol)を加え、室温で1h反応させ
た。得られた反応液に150mlピリジンを加えて中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製
品を得た。粗製品をカラムで精製し、200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、
10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンで
カラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30~100:40で勾配溶
出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.26gの純粋品W-5を得た
。
W-4(1.61g、0.886mmol)を125mlのジクロロメタンに溶解させ
、さらにジクロロ酢酸(3.5ml、42.43mmol)を加え、室温で1h反応させ
た。得られた反応液に150mlピリジンを加えて中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製
品を得た。粗製品をカラムで精製し、200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、
10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンで
カラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30~100:40で勾配溶
出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.26gの純粋品W-5を得た
。
(7-6)W-6の合成:
W-5(1.25g、0.793mmol)と工程(1-7a)に記載された方法によ
り得られたA-1(1.21g、2.38mmol)を混合して12mlのジクロロメタ
ンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(
3H)-オン(DEPBT、0.712g、2.38mmol)を加え、さらにジイソプ
ロピルエチルアミン(0.615g、4.76mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応
させた。80mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロ
メタンで1回あたり10mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、10mlの飽和食
塩水で洗浄し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に
溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製
品をカラムで精製し、185gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、20
mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む
石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N
-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.1~1:1:0.7で勾配溶出し、溶出液を
回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.57gの純粋品W-6を得た。
W-5(1.25g、0.793mmol)と工程(1-7a)に記載された方法によ
り得られたA-1(1.21g、2.38mmol)を混合して12mlのジクロロメタ
ンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(
3H)-オン(DEPBT、0.712g、2.38mmol)を加え、さらにジイソプ
ロピルエチルアミン(0.615g、4.76mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応
させた。80mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロ
メタンで1回あたり10mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、10mlの飽和食
塩水で洗浄し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に
溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製
品をカラムで精製し、185gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、20
mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む
石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N
-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.1~1:1:0.7で勾配溶出し、溶出液を
回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.57gの純粋品W-6を得た。
(7-7)W-7の合成:
W-6(1.238g、0.63mmol)、コハク酸無水物(0.189g、1.8
9mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.231g、1.89mm
ol)を混合して7mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIEA(0.407g、
3.15mmol)を加え、25℃で24h攪拌反応させた。得られた反応液を5mlの
0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あた
り5mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製
品をカラムで精製し、30gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt
%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、
1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18~100:
20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.033gの純粋
品W-7複合分子(複合分子7)を得た。MS m/z:C101H146N7O38、
[M-DMTr]+、理論値:1763.92、実測値:1763.21。得られたW-
7複合分子の構造が式(515)に示される。
W-6(1.238g、0.63mmol)、コハク酸無水物(0.189g、1.8
9mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.231g、1.89mm
ol)を混合して7mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIEA(0.407g、
3.15mmol)を加え、25℃で24h攪拌反応させた。得られた反応液を5mlの
0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あた
り5mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製
品をカラムで精製し、30gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt
%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、
1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18~100:
20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.033gの純粋
品W-7複合分子(複合分子7)を得た。MS m/z:C101H146N7O38、
[M-DMTr]+、理論値:1763.92、実測値:1763.21。得られたW-
7複合分子の構造が式(515)に示される。
(調製例8)X-7複合分子(複合分子8)の調製
以下のプロセス経路により、構造が式(521)に示される複合分子8(以下、X-7
複合分子ともいう)を合成できると予期した。
以下のプロセス経路により、構造が式(521)に示される複合分子8(以下、X-7
複合分子ともいう)を合成できると予期した。
(調製例9)K-3複合分子(比較複合分子1)の調製
本調製例では、以下の方法に従い、K-3複合分子(以下、比較複合分子1ともいう)
を合成した。
本調製例では、以下の方法に従い、K-3複合分子(以下、比較複合分子1ともいう)
を合成した。
(9-1)K-1の合成:
60mlのジクロロメタンに工程(1-7a)に記載された方法により得られたA-1
(3.0g、6.0mmol)、PyBOP(6.2g、12.0mmol)、HOBt
(1.6g、2.0mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、3.9g
、30.0mmol)を加え、室温で10分間攪拌反応させた後、上記溶液をK-0(5
.6g、30.0mmol)に加え、室温で1時間50分間反応させた。反応液を30m
lの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり
30mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。粗製品をカラムで精製し、200~3
00メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニ
ア水(25wt%)=10:2:0.1~4:4:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収
し、溶剤を濃縮除去し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させ、2.2gの白色固形製品
K-1を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.02 (
s,1H),7.43 (d,J =7.8 Hz,2H),7.34-7.17 (m
,7H),6.87 (d,J =8.6 Hz,4H),4.05 (d,J =5.
2 Hz,1H),3.74(s,6H),3.20-3.01 (m,5H),2.6
0-2.38 (m,12H),1.60-1.39 (m,8H),1.24 (s,
1H). MS m/z:C33H47N4O5、[M+H]+、理論値:579.35
、実測値:579.26。
60mlのジクロロメタンに工程(1-7a)に記載された方法により得られたA-1
(3.0g、6.0mmol)、PyBOP(6.2g、12.0mmol)、HOBt
(1.6g、2.0mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、3.9g
、30.0mmol)を加え、室温で10分間攪拌反応させた後、上記溶液をK-0(5
.6g、30.0mmol)に加え、室温で1時間50分間反応させた。反応液を30m
lの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり
30mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。粗製品をカラムで精製し、200~3
00メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニ
ア水(25wt%)=10:2:0.1~4:4:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収
し、溶剤を濃縮除去し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させ、2.2gの白色固形製品
K-1を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.02 (
s,1H),7.43 (d,J =7.8 Hz,2H),7.34-7.17 (m
,7H),6.87 (d,J =8.6 Hz,4H),4.05 (d,J =5.
2 Hz,1H),3.74(s,6H),3.20-3.01 (m,5H),2.6
0-2.38 (m,12H),1.60-1.39 (m,8H),1.24 (s,
1H). MS m/z:C33H47N4O5、[M+H]+、理論値:579.35
、実測値:579.26。
(9-2)K-2の合成:
3mlのジクロロメタンに(1-1)に記載された方法により得られたGAL-5(4
83mg、1.08mmol)、3-ジエトキシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾ
トリアジン-4(3H)-オン(359mg、1.2mmol)、ジイソプロピルエチル
アミン(DIPEA、310mg、2.4mmol)を加え、室温で30分間攪拌した後
、K-1(174mg、0.3mmol)を加え、室温で16時間反応させた。反応液を
10mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、単離した水相をジクロロメタンで1回
あたり10mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、10mlの飽和塩化ナトリウム溶
液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。200~300メッシ
ュの順相シリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン:メタノール=20:1で溶出し、
溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、205mgの黄色固
形製品K-2を得た。
3mlのジクロロメタンに(1-1)に記載された方法により得られたGAL-5(4
83mg、1.08mmol)、3-ジエトキシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾ
トリアジン-4(3H)-オン(359mg、1.2mmol)、ジイソプロピルエチル
アミン(DIPEA、310mg、2.4mmol)を加え、室温で30分間攪拌した後
、K-1(174mg、0.3mmol)を加え、室温で16時間反応させた。反応液を
10mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、単離した水相をジクロロメタンで1回
あたり10mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、10mlの飽和塩化ナトリウム溶
液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。200~300メッシ
ュの順相シリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン:メタノール=20:1で溶出し、
溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、205mgの黄色固
形製品K-2を得た。
(9-3)K-3の合成:
1.1mlのジクロロメタンにK-2(205mg、0.11mmol)、コハク酸無
水物(22mg、0.22mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、27m
g、0.22mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、71mg、0.
55mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた。反応液を0.5Mトリエチルアミン
リン酸塩溶液で1回あたり0.5mlで3回洗浄し、1回あたり洗浄して得られた水相を
0.5mlのジクロロメタンで1回逆抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥させ、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、218mgの淡黄色
固形製品K-3複合分子(比較複合分子1)を得た。
1.1mlのジクロロメタンにK-2(205mg、0.11mmol)、コハク酸無
水物(22mg、0.22mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、27m
g、0.22mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、71mg、0.
55mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた。反応液を0.5Mトリエチルアミン
リン酸塩溶液で1回あたり0.5mlで3回洗浄し、1回あたり洗浄して得られた水相を
0.5mlのジクロロメタンで1回逆抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥させ、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、218mgの淡黄色
固形製品K-3複合分子(比較複合分子1)を得た。
(調製例10)本調製例は、(GalNAc)3複合分子(比較複合分子2)の合成を
説明するためのものである
本調製例では、WO2014025805A1における実施例1~4に記載された調製
方法により、構造が下式に示される化合物47(本明細書では、(GalNAc)3複合
分子(比較複合分子2)という)を合成した。
説明するためのものである
本調製例では、WO2014025805A1における実施例1~4に記載された調製
方法により、構造が下式に示される化合物47(本明細書では、(GalNAc)3複合
分子(比較複合分子2)という)を合成した。
(調製例11)本調製例は、FIN-2複合分子(比較複合分子3)の調製を説明する
ためのものである
本調製例では、Rajeevら、ChemBioChem 2015,16,903-
908に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、FIN-2複合分子
(比較複合分子3)を合成した。
ためのものである
本調製例では、Rajeevら、ChemBioChem 2015,16,903-
908に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、FIN-2複合分子
(比較複合分子3)を合成した。
(11-1)PRO-10化合物の合成
(11-1-1)PRO-7の合成
2.93gのPRO-6(L-ヒドロキシプロリン、CAS番号:51-35-4、E
nergy社から購入、22.4mmol)を22.5mlの1,4-ジオキサン(1,
4-dioxane)に溶解させ、34mlの10%(w/w)Na2CO3の水溶液を
加え、6.954gのFmoc-Cl(クロロギ酸-9-フルオレニルメチル、CAS番
号:28920-43-6、Energy社から購入、26.8mmol)を56.5m
lの1,4-ジオキサンに溶解させ、氷浴下で反応混合物に加え、自然に室温まで昇温し
一晩反応させた。反応液を150mlの氷水に注入し、メチルtert-ブチルエーテル
で1回あたり100mlで3回抽出し、得られた有機相を捨て、残りの水相を濃HClで
pH≦5となるように調節し、100mlの酢酸エチルで2回抽出し、得られた有機相を
あわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して7.83gの白色泡状
固形製品PRO-7を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ
7.91 (t,J =7.2 Hz,2H),7.67 (d,J =7.5 Hz,
2H),7.48-7.39 (m,2H),7.38-7.27 (m,2H),5.
17 (s,1H),4.27 (s,2H),4.23-4.11 (m,2H),3
.55-3.41 (m,3H),2.31-2.10 (m,1H),2.08-1.
88 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値(calcd for)
C20H19NO5 [M-H]-352.1190、実測値352.1033.
2.93gのPRO-6(L-ヒドロキシプロリン、CAS番号:51-35-4、E
nergy社から購入、22.4mmol)を22.5mlの1,4-ジオキサン(1,
4-dioxane)に溶解させ、34mlの10%(w/w)Na2CO3の水溶液を
加え、6.954gのFmoc-Cl(クロロギ酸-9-フルオレニルメチル、CAS番
号:28920-43-6、Energy社から購入、26.8mmol)を56.5m
lの1,4-ジオキサンに溶解させ、氷浴下で反応混合物に加え、自然に室温まで昇温し
一晩反応させた。反応液を150mlの氷水に注入し、メチルtert-ブチルエーテル
で1回あたり100mlで3回抽出し、得られた有機相を捨て、残りの水相を濃HClで
pH≦5となるように調節し、100mlの酢酸エチルで2回抽出し、得られた有機相を
あわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して7.83gの白色泡状
固形製品PRO-7を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ
7.91 (t,J =7.2 Hz,2H),7.67 (d,J =7.5 Hz,
2H),7.48-7.39 (m,2H),7.38-7.27 (m,2H),5.
17 (s,1H),4.27 (s,2H),4.23-4.11 (m,2H),3
.55-3.41 (m,3H),2.31-2.10 (m,1H),2.08-1.
88 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値(calcd for)
C20H19NO5 [M-H]-352.1190、実測値352.1033.
(11-1-2)PRO-8の合成
7.83gのPRO-7(22.2mmol)を80mlのTHFに溶解させ、油浴で
65℃に加熱し、還流状態で36.6mlの2mol/LのBH3-Me2SのTHF溶
液(CAS番号13292-87-0、百霊威(J&K Scientific)社から
購入、73.2mmol)を加え、3時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノ
ールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えて
から30分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後、残存物を石油エーテルで3回精製して
7.1gの白色固形生成物PRO-8を得た。1H NMR (400 MHz,DMS
O-d6) δ 7.91 (t,J =6.7 Hz,2H),7.67 (d,J
=7.2 Hz,2H),7.49-7.39 (m,2H),7.38-7.26 (
m,2H),5.18 (dd,J =6.1,3.8 Hz,1H),4.28 (s
,2H),4.23-4.13 (m,2H),3.55-3.38 (m,2H),2
.32-2.11 (m,1H),2.08-1.89 (m,1H). HRMS (
ESI) m/z 理論値(calcd for) C20H21NO4 [M+Na]
+362.1368、実測値362.1012.
7.83gのPRO-7(22.2mmol)を80mlのTHFに溶解させ、油浴で
65℃に加熱し、還流状態で36.6mlの2mol/LのBH3-Me2SのTHF溶
液(CAS番号13292-87-0、百霊威(J&K Scientific)社から
購入、73.2mmol)を加え、3時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノ
ールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えて
から30分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後、残存物を石油エーテルで3回精製して
7.1gの白色固形生成物PRO-8を得た。1H NMR (400 MHz,DMS
O-d6) δ 7.91 (t,J =6.7 Hz,2H),7.67 (d,J
=7.2 Hz,2H),7.49-7.39 (m,2H),7.38-7.26 (
m,2H),5.18 (dd,J =6.1,3.8 Hz,1H),4.28 (s
,2H),4.23-4.13 (m,2H),3.55-3.38 (m,2H),2
.32-2.11 (m,1H),2.08-1.89 (m,1H). HRMS (
ESI) m/z 理論値(calcd for) C20H21NO4 [M+Na]
+362.1368、実測値362.1012.
(11-1-3)PRO-9の合成
7.1gのPRO-8(21mmol)を100mlピリジンに溶解させ、14.2g
のDMTr-Cl(4,4’-ビスメトキシトリチルクロリド、42mmol)を加え、
室温で5時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩
類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後、シリカゲルカラムで残存物を精製した。
精製のために、DCMに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理され
たシリカゲルカラムに負荷した。1%(v/v)ピリジンを含むDCMでDMTr-Cl
を溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸
発乾固し、8.2gの白色固形生成物PRO-9を得た。HRMS (ESI) m/z
理論値(calcd for) C41H39NO6 [M+Na]+664.267
5、実測値664.2348,C18 RP-HPLC(ロット番号JJS160324
-1)純度94.20%。
7.1gのPRO-8(21mmol)を100mlピリジンに溶解させ、14.2g
のDMTr-Cl(4,4’-ビスメトキシトリチルクロリド、42mmol)を加え、
室温で5時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩
類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後、シリカゲルカラムで残存物を精製した。
精製のために、DCMに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理され
たシリカゲルカラムに負荷した。1%(v/v)ピリジンを含むDCMでDMTr-Cl
を溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸
発乾固し、8.2gの白色固形生成物PRO-9を得た。HRMS (ESI) m/z
理論値(calcd for) C41H39NO6 [M+Na]+664.267
5、実測値664.2348,C18 RP-HPLC(ロット番号JJS160324
-1)純度94.20%。
(11-1-4)PRO-10の合成
8.2gのPRO-9(12.8mmol)を64mlのDMFに溶解させ、40ml
のピペリジン(384mmol)を加え、室温で30分間攪拌反応させた。反応液を30
0mlの氷水に注入し、酢酸エチルで1回あたり150mlで3回抽出し、得られた有機
相をあわせ、200mlの飽和食塩水で洗浄した後、洗浄して得られた有機相を無水硫酸
ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後、残存物をシリカゲルカラムで精製し、精
製のために、DCMに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理された
シリカゲルカラムに負荷した。1%(v/v)ピリジンを含むDCMでFmocを溶出さ
せた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し
、4.65gの白色固形生成物PRO-10を得た。1H NMR (400 MHz,
DMSO-d6) δ 7.40 (d,J =7.2 Hz,2H),7.35-7.
18 (m,7H),6.93-6.84 (m,4H),4.56 (d,J =3.
9 Hz,1H),4.12 (s,1H),3.74 (s,6H),3.46-3.
37 (m,1H),2.88 (ddd,J =18.5,10.0,5.5 Hz,
2H),2.75 (dd,J =8.7,5.8 Hz,1H),2.62 (dd,
J =11.0,2.7 Hz,1H),1.74-1.65 (m,1H),1.40
(ddd,J =12.9,8.5,5.9 Hz,1H),HRMS (ESI)
m/z 理論値(calcd for) C26H29NO4 [M+Na]+442.
1994、実測値442.1999,C18 RP-HPLC(ロット番号JJS160
329-1)純度97.07%。
8.2gのPRO-9(12.8mmol)を64mlのDMFに溶解させ、40ml
のピペリジン(384mmol)を加え、室温で30分間攪拌反応させた。反応液を30
0mlの氷水に注入し、酢酸エチルで1回あたり150mlで3回抽出し、得られた有機
相をあわせ、200mlの飽和食塩水で洗浄した後、洗浄して得られた有機相を無水硫酸
ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後、残存物をシリカゲルカラムで精製し、精
製のために、DCMに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理された
シリカゲルカラムに負荷した。1%(v/v)ピリジンを含むDCMでFmocを溶出さ
せた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し
、4.65gの白色固形生成物PRO-10を得た。1H NMR (400 MHz,
DMSO-d6) δ 7.40 (d,J =7.2 Hz,2H),7.35-7.
18 (m,7H),6.93-6.84 (m,4H),4.56 (d,J =3.
9 Hz,1H),4.12 (s,1H),3.74 (s,6H),3.46-3.
37 (m,1H),2.88 (ddd,J =18.5,10.0,5.5 Hz,
2H),2.75 (dd,J =8.7,5.8 Hz,1H),2.62 (dd,
J =11.0,2.7 Hz,1H),1.74-1.65 (m,1H),1.40
(ddd,J =12.9,8.5,5.9 Hz,1H),HRMS (ESI)
m/z 理論値(calcd for) C26H29NO4 [M+Na]+442.
1994、実測値442.1999,C18 RP-HPLC(ロット番号JJS160
329-1)純度97.07%。
(11-2)FIN-1の合成
40mlのDMFに溶解させ、3.9gのDIPEA(N,N-ジイソプロピルエチルア
ミン、CAS番号:7087-68-5、Aladdin社から購入、30mmol)及
び3.8gのHBTU(ベンゾトリアゾール-N,N、N’,N’-テトラメチルウロニ
ウムヘキサフルオロホスフェート、CAS番号:94790-37-2、Aladdin
社から購入、11mmol)を順に加え、室温で10分間攪拌して反応液を得た。工程(
12-4)で得られたPRO-10(4.2g、10mmol)を40mlDMFに溶解
させた後、上記反応液に加え、反応液に無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、室温で2
時間攪拌した。反応液を120mlの氷水に注入し、酢酸エチルで1回あたり60mlで
3回抽出し、得られた有機相をあわせ、それぞれ20mlの水、20mlの飽和食塩水で
洗浄し、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧
留去し、残存物をシリカゲルカラムで精製した。精製のために、サンプルを、アルカリ化
のためにピリジンで前処理されたシリカゲルカラムに負荷した。1%(v/v)トリエチ
ルアミン及び1%(v/v)メタノールを含むジクロロメタン(DCM)溶液で溶出し、
溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、6.5gの淡黄色泡状固形製品FIN-1を得
た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.83 (d,J =
9.2 Hz,1H),7.32 (t,J =6.6 Hz,4H),7.20 (t
d,J =8.9,3.5 Hz,5H),6.93-6.84 (m,4H),5.2
1 (d,J =3.2 Hz,1H),5.04-4.90 (m,2H),4.49
(s,1H),4.40 (d,J =4.4 Hz,0.8H),4.31 (d,
J =5.0 Hz,0.2H),4.15 (s,1H),4.03 (s,3H),
3.93 (s,1H),3.74 (s、7H)、3.59 (dt,J =12.0
,6.0 Hz,1H),3.50-3.40 (m,1H),3.39-3.25 (
m,3H),3.13 (dd,J =8.9,5.2 Hz,1H),3.00 (d
q,J =9.3,5.3,4.3 Hz,1H),2.22 (s,2H),2.07
(s,3H),1.99 (s,3H),1.90 (s,4H),1.74 (s,
3H),1.50 (s,3H),1.36 (s,1H)。C18 RP-HPLC(
ロット番号LJ160422)純度95.45%。
(11-3)FIN-2の合成
DMFに溶解させ、窒素保護下で2.13gのPA(ビス(ジイソプロピルアミノ)(2
-シアノエトキシ)ホスフィン、Adamas社、商品番号11356B、7.06mm
ol)、346mgのテトラゾール(CAS番号:288-94-8、Aladdin社
から購入、4.94mmol)を加え、室温で攪拌反応させ、10mlのDMFを追加し
、1時間攪拌反応させ続けた。溶剤を減圧留去した後、残存物をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーにより精製した。精製のために、DCMに溶解させた粗製品を、アルカリ化
のためにピリジンで前処理されたシリカゲルカラムに負荷し、酢酸エチルで溶出させ、溶
出液を回収し、溶剤を減圧留去し、4.5gの無色シロップ状粗製品を得た。完全に溶解
させるまで粗製品を50%(v/v)アセトニトリル水溶液で溶解させ、(C-18、3
30g、300Å)中圧精製カラムでサンプルを精製し、カラムを予め1%(v/v)ピ
リジンを含むアセトニトリル溶液でアルカリ化し、勾配溶出して製品を回収し、溶剤を減
圧留去して2.2gの白色粉末製品FIN-2複合分子(比較複合分子3)を得た。31
P NMR (162 MHz,CDCl3) δ 148.04,147.94,14
7.62,147.19、リンスペクトル純度92%、C18 RP-HPLC純度90
.54%。
(調製例12)本調製例は、Z-4複合分子(複合分子153)の調製を説明するため
のものである
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子153(以下、Z-4複合分子ともいう)
を合成した。
のものである
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子153(以下、Z-4複合分子ともいう)
を合成した。
(12-1)Z-1の合成:
工程(7-3)に記載された方法により得られたW-3(1.50g、3.37mmo
l)と工程(2-2)に記載された方法により得られたGAL5-C4-2(7.18g
、13.48mmol)を混合して34mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソ
プロピルエチルアミン(3.48g、26.96mmol)を加え、その後、3-ジエト
キシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン(DEPBT
、4.04g、13.48mmol)を加え、室温で4.5時間攪拌反応させた。得られ
た反応液を100mlのジクロロメタンで希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶
液及び80mlの飽和食塩水でそれぞれ有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫
酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、粗製品を2
00~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、
1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=
30:1~15:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して3.97gの純粋
品Z-1を得た。MS m/z:C98H143N10O33、[M+H]+、理論値:
1987.98、実測値:1987.90。
工程(7-3)に記載された方法により得られたW-3(1.50g、3.37mmo
l)と工程(2-2)に記載された方法により得られたGAL5-C4-2(7.18g
、13.48mmol)を混合して34mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソ
プロピルエチルアミン(3.48g、26.96mmol)を加え、その後、3-ジエト
キシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン(DEPBT
、4.04g、13.48mmol)を加え、室温で4.5時間攪拌反応させた。得られ
た反応液を100mlのジクロロメタンで希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶
液及び80mlの飽和食塩水でそれぞれ有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫
酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、粗製品を2
00~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、
1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=
30:1~15:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して3.97gの純粋
品Z-1を得た。MS m/z:C98H143N10O33、[M+H]+、理論値:
1987.98、実測値:1987.90。
(12-2)Z-2の合成:
Z-1(3.97g、2.00mmol)を250mlのジクロロメタンに溶解させ、
さらにジクロロ酢酸(10.941g、84.85mmol)を加え、室温で1時間反応
させた。得られた反応液を中性になるまでピリジンを加えて中和し、溶剤を減圧蒸発乾固
して粗製品を得た。200gの200~300メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ
、10%ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、1‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジク
ロロメタン:メタノール=10:1~2:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧
蒸発乾固して3.49gの純粋品Z-2を得た。MS m/z:C79H129N10O
33、[M+H]+、理論値:1746.94、実測値:1746.90。
Z-1(3.97g、2.00mmol)を250mlのジクロロメタンに溶解させ、
さらにジクロロ酢酸(10.941g、84.85mmol)を加え、室温で1時間反応
させた。得られた反応液を中性になるまでピリジンを加えて中和し、溶剤を減圧蒸発乾固
して粗製品を得た。200gの200~300メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ
、10%ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、1‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジク
ロロメタン:メタノール=10:1~2:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧
蒸発乾固して3.49gの純粋品Z-2を得た。MS m/z:C79H129N10O
33、[M+H]+、理論値:1746.94、実測値:1746.90。
(12-3)Z-3の合成:
工程(1-7a)に記載の方法により得られたZ-2(3.49g、2.0mmol)
及びA-1(3.06g、6.0mmol)を混合して30mlのジクロロメタンに溶解
させ、3-(ジエトキシホスホリルオキシ)-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H
)-オン(DEPBT、1.80g、6.0mmol)を加えた後、ジイソプロピルエチ
ルアミン(1.55g、12.0mmol)を加え、25℃で3時間攪拌反応させた。得
られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで
有機相を1回あたり30mlで2回洗浄し、水相を10mlのジクロロメタンで抽出した
。全ての有機相をあわせ、50mlの飽和食塩水で洗浄し、得られた有機相をあわせ、無
水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポン
プで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、200gの200~3
00メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性
を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロ
メタン:メタノール=25:1~15:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸
発乾固して2.2gの純粋品Z-3を得た。MS m/z:C103H151N10O3
8、[M+H]+、理論値:2136.02、実測値:2136.20。
工程(1-7a)に記載の方法により得られたZ-2(3.49g、2.0mmol)
及びA-1(3.06g、6.0mmol)を混合して30mlのジクロロメタンに溶解
させ、3-(ジエトキシホスホリルオキシ)-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H
)-オン(DEPBT、1.80g、6.0mmol)を加えた後、ジイソプロピルエチ
ルアミン(1.55g、12.0mmol)を加え、25℃で3時間攪拌反応させた。得
られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで
有機相を1回あたり30mlで2回洗浄し、水相を10mlのジクロロメタンで抽出した
。全ての有機相をあわせ、50mlの飽和食塩水で洗浄し、得られた有機相をあわせ、無
水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポン
プで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、200gの200~3
00メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性
を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロ
メタン:メタノール=25:1~15:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸
発乾固して2.2gの純粋品Z-3を得た。MS m/z:C103H151N10O3
8、[M+H]+、理論値:2136.02、実測値:2136.20。
(12-4)Z-4の合成:
Z-3(2.10g、0.983mmol)を、DIEA(635mg、4.915m
mol)を含む14.8mlのジクロロメタンに溶解させ、4-ジメチルアミノピリジン
(DMAP、240mg、1.966mmol)を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸
無水物(197mg、1.966mmol)を加え、25℃で18時間攪拌反応させた。
50mlのジクロロメタンを加えて得られた反応液を希釈し、80mlの0.5Mトリエ
チルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで2
回抽出した。全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで
精製し、188gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチ
ルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰ト
リエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=10:1~3:1で勾配溶出し、溶
出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.95gの構造が式(422)に示される純粋
品Z-4複合分子(複合分子12)を得た。MS m/z:C107H155N10O4
1、[M+H]+、理論値:1935.07、実測値:1935.29。
Z-3(2.10g、0.983mmol)を、DIEA(635mg、4.915m
mol)を含む14.8mlのジクロロメタンに溶解させ、4-ジメチルアミノピリジン
(DMAP、240mg、1.966mmol)を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸
無水物(197mg、1.966mmol)を加え、25℃で18時間攪拌反応させた。
50mlのジクロロメタンを加えて得られた反応液を希釈し、80mlの0.5Mトリエ
チルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで2
回抽出した。全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで
精製し、188gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチ
ルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰ト
リエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=10:1~3:1で勾配溶出し、溶
出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.95gの構造が式(422)に示される純粋
品Z-4複合分子(複合分子12)を得た。MS m/z:C107H155N10O4
1、[M+H]+、理論値:1935.07、実測値:1935.29。
(調製例13)L10-siHBa1複合体(複合体9)の調製
本調製例では、L-9複合分子(複合分子1)を出発とし、以下の方法に従い、L10
-siHBa1複合体(以下、複合体9ともいう)を調製した。
本調製例では、L-9複合分子(複合分子1)を出発とし、以下の方法に従い、L10
-siHBa1複合体(以下、複合体9ともいう)を調製した。
(13-1)L-10化合物の合成:
この工程において、L-9複合分子を固相担体に結合することにより、L-10化合物
を調製した。
を調製した。
工程(1-8)で得られたL-9複合分子(0.233g、0.1126mmol)、
O-ベンゾトリアゾール-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBT
U、0.064g、0.1689mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPE
A、0.029g、0.2252mmol)を混合し、19mlのアセトニトリルに溶解
させ、室温で5分間攪拌した。アミノメチル樹脂(0.901g、100~200メッシ
ュ、アミノ基担持量400μmol/g、南開和成社から購入)を反応液に加え、25℃
でシェーカーで反応を行い、回転数220回転/分間、15h反応させた後濾過した。残
存物をDCMで1回あたり30mlで2回リンスし、アセトニトリルで1回あたり30m
lで3回リンスし、30mlのエチルエーテルで1回リンスし、真空油ポンプで2h乾燥
させた。表2に示す配合割合に従いキャッピング反応を行った。
O-ベンゾトリアゾール-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBT
U、0.064g、0.1689mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPE
A、0.029g、0.2252mmol)を混合し、19mlのアセトニトリルに溶解
させ、室温で5分間攪拌した。アミノメチル樹脂(0.901g、100~200メッシ
ュ、アミノ基担持量400μmol/g、南開和成社から購入)を反応液に加え、25℃
でシェーカーで反応を行い、回転数220回転/分間、15h反応させた後濾過した。残
存物をDCMで1回あたり30mlで2回リンスし、アセトニトリルで1回あたり30m
lで3回リンスし、30mlのエチルエーテルで1回リンスし、真空油ポンプで2h乾燥
させた。表2に示す配合割合に従いキャッピング反応を行った。
(v/v)N-メチルイミダゾールのピリジン/アセトニトリル混合物における溶液であ
り、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が3:5であり、Cap2は、20%(v/v
)酢酸無水物のアセトニトリル溶液であった。
Cap1、Cap2、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)及びアセトニトリルを
上記反応混合物に加え、25℃でシェーカーで反応を行い、回転数200回転/分間、5
時間反応させた。反応液を濾過し、残存物をアセトニトリルで1回あたり30mlで3回
リンスし、溶剤を乾燥させるまで蒸発し、真空油ポンプで混合物を減圧下で一晩乾燥させ
、1.100g、担持量90.8μmol/gの、構造が式(523)に示されるL-1
0化合物(即ち、固相担体に結合されたL-9複合分子)を得た。
上記反応混合物に加え、25℃でシェーカーで反応を行い、回転数200回転/分間、5
時間反応させた。反応液を濾過し、残存物をアセトニトリルで1回あたり30mlで3回
リンスし、溶剤を乾燥させるまで蒸発し、真空油ポンプで混合物を減圧下で一晩乾燥させ
、1.100g、担持量90.8μmol/gの、構造が式(523)に示されるL-1
0化合物(即ち、固相担体に結合されたL-9複合分子)を得た。
(13-2)L10-siHBa1複合体のセンス鎖の合成
本工程において、siRNA複合体のsiRNAは、番号siHBa1の配列であった
。
siHBa1
センス鎖:5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(配列番号1)、
アンチセンス鎖:5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(配列番
号2)
本工程において、siRNA複合体のsiRNAは、番号siHBa1の配列であった
。
siHBa1
センス鎖:5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(配列番号1)、
アンチセンス鎖:5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(配列番
号2)
ホスホルアミダイト固相合成方法により、上記工程で調製されたL-10化合物を出発
とし、上記配列順序3’-5’の方向に従い一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。
ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング及び酸化
の4つの反応を含む。合成条件は、以下のように規定された。
とし、上記配列順序3’-5’の方向に従い一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。
ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング及び酸化
の4つの反応を含む。合成条件は、以下のように規定された。
ヌクレオシドモノマーを0.1M濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各工程の脱保護
反応の条件が同じであり、即ち、温度が25℃であり、反応時間が70秒であり、脱保護
試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(3%v/v)であり、ジクロロ酢酸と固相
担体における4,4’-ジメトキシトリチル保護基とのモル比が5:1であった。
反応の条件が同じであり、即ち、温度が25℃であり、反応時間が70秒であり、脱保護
試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液(3%v/v)であり、ジクロロ酢酸と固相
担体における4,4’-ジメトキシトリチル保護基とのモル比が5:1であった。
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が25℃であり、固相担体に結
合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が1:10であり、固相担体に結合
される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が1:65であり、反応時間が600秒で
あり、カップリング試薬は、5-エチルチオ-1H-テトラゾールの0.5Mアセトニト
リル溶液であった。
合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が1:10であり、固相担体に結合
される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が1:65であり、反応時間が600秒で
あり、カップリング試薬は、5-エチルチオ-1H-テトラゾールの0.5Mアセトニト
リル溶液であった。
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が25℃であり、反応時間が15秒
であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が1:1であるCap1とCap2の混合溶
液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物
:N-メチルイミダゾール:固相担体に結合される核酸配列=1:1:1であった。
であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が1:1であるCap1とCap2の混合溶
液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物
:N-メチルイミダゾール:固相担体に結合される核酸配列=1:1:1であった。
各酸化反応条件は同じであり、温度が25℃であり、反応時間が15秒であり、酸化試
薬が0.05Mのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結
合される核酸配列とのモル比が30:1であった。反応をテトラヒドロフラン:水:ピリ
ジン=3:1:1の混合溶剤で行った。
薬が0.05Mのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結
合される核酸配列とのモル比が30:1であった。反応をテトラヒドロフラン:水:ピリ
ジン=3:1:1の混合溶剤で行った。
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配
列を25wt%のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が0.5ml/μmolであ
り、55℃で16h反応させ、液体を除去し、残存物を乾燥させるまで真空濃縮した。ア
ンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、0.4ml/μmolのN-メ
チルピロリドンで製品を溶解させた後、0.3ml/μmolのトリエチルアミン及び0
.6ml/μmolのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける2’
-TBDMS保護を除去した。精製と脱塩:分取用イオンクロマトグラフィーカラム(S
ource 15Q)により、NaClによる勾配溶出で、核酸の精製を実現した。具体
的には、溶出剤A:20mMリン酸ナトリウム(pH 8.1)、溶剤が水/アセトニト
リル=9:1(体積比)であり、溶出剤B:1.5M塩化ナトリウム、20mMリン酸ナ
トリウム(pH 8.1)、溶剤が水/アセトニトリル=9:1(体積比)であり、溶出
勾配:溶出剤A:溶出剤B=100:0~50:50で勾配溶出した。製品溶出液を回収
してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件として
は、Sephadexカラムにより脱塩し、充填剤がSephadex-G25であり、
脱イオン水で溶出した。
列を25wt%のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が0.5ml/μmolであ
り、55℃で16h反応させ、液体を除去し、残存物を乾燥させるまで真空濃縮した。ア
ンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、0.4ml/μmolのN-メ
チルピロリドンで製品を溶解させた後、0.3ml/μmolのトリエチルアミン及び0
.6ml/μmolのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける2’
-TBDMS保護を除去した。精製と脱塩:分取用イオンクロマトグラフィーカラム(S
ource 15Q)により、NaClによる勾配溶出で、核酸の精製を実現した。具体
的には、溶出剤A:20mMリン酸ナトリウム(pH 8.1)、溶剤が水/アセトニト
リル=9:1(体積比)であり、溶出剤B:1.5M塩化ナトリウム、20mMリン酸ナ
トリウム(pH 8.1)、溶剤が水/アセトニトリル=9:1(体積比)であり、溶出
勾配:溶出剤A:溶出剤B=100:0~50:50で勾配溶出した。製品溶出液を回収
してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件として
は、Sephadexカラムにより脱塩し、充填剤がSephadex-G25であり、
脱イオン水で溶出した。
検出:イオン交換クロマトグラフィー(IEX-HPLC)を用いて検出したところ、
純度が92.4%であり、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により分子量
を分析したところ、理論値7253.96、実測値7253.12であった。
純度が92.4%であり、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により分子量
を分析したところ、理論値7253.96、実測値7253.12であった。
これにより、当該工程においてL-9複合分子を得られたセンス鎖の3’末端に結合し
、L-9複合分子がsiRNAの3’末端に複合されるsiRNAのセンス鎖Sを得た。
、L-9複合分子がsiRNAの3’末端に複合されるsiRNAのセンス鎖Sを得た。
(13-3)アンチセンス鎖の合成
本工程において、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded Nitt
oPhase(登録商標)HL Solid Supports、Kinovate L
ife SciencesInc.)により、L10-siHB1複合体のアンチセンス
鎖ASを合成した。センス鎖合成と同じ条件によりsiRNAのアンチセンス鎖ASを得
、固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応条件、脱保護と
切断、単離条件を含む。
本工程において、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded Nitt
oPhase(登録商標)HL Solid Supports、Kinovate L
ife SciencesInc.)により、L10-siHB1複合体のアンチセンス
鎖ASを合成した。センス鎖合成と同じ条件によりsiRNAのアンチセンス鎖ASを得
、固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応条件、脱保護と
切断、単離条件を含む。
検出:イオン交換クロマトグラフィー(IEX-HPLC)により検出したところ、純
度が93.2%であり、分子量を液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により
分析した。理論値6675.04、実測値6674.50であった。
度が93.2%であり、分子量を液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により
分析した。理論値6675.04、実測値6674.50であった。
(13-4)L10-siHBa1複合体の合成
S鎖及びAS鎖をそれぞれ注射用水溶液に溶解させ、40mg/mlの溶液を得た。これ
らを等モル比で混合し、50℃で15分間加熱し、室温まで冷却した後、これらを水素結
合により二本鎖構造を形成させた。
S鎖及びAS鎖をそれぞれ注射用水溶液に溶解させ、40mg/mlの溶液を得た。これ
らを等モル比で混合し、50℃で15分間加熱し、室温まで冷却した後、これらを水素結
合により二本鎖構造を形成させた。
上記合成が完了した後、超純水(Milli-Q超純水装置で自作、抵抗率18.2M
Ω*cm(25℃))を用いて複合体を0.2mg/mLの濃度に希釈した。液体クロマ
トグラフィー質量分析計(LC-MS、Liquid Chromatography-
Mass Spectrometry、Waters社から購入、型番:LCT Pre
mier)により分子量を検出した。その結果、分子量の理論値S:7253.96、A
S:6675.04、分子量の実測値S:7253.24、AS:6674.61であり
、実測値が理論値と一致しており、合成された複合体が、L-9複合分子を含む目的設計
の二本鎖核酸配列であることが確定された。L10-siHBa1複合体(複合体9)の
構造が式(3)に示される。
Ω*cm(25℃))を用いて複合体を0.2mg/mLの濃度に希釈した。液体クロマ
トグラフィー質量分析計(LC-MS、Liquid Chromatography-
Mass Spectrometry、Waters社から購入、型番:LCT Pre
mier)により分子量を検出した。その結果、分子量の理論値S:7253.96、A
S:6675.04、分子量の実測値S:7253.24、AS:6674.61であり
、実測値が理論値と一致しており、合成された複合体が、L-9複合分子を含む目的設計
の二本鎖核酸配列であることが確定された。L10-siHBa1複合体(複合体9)の
構造が式(3)に示される。
(調製例14)複合体16~18、24~26、42~43、62、78、105、1
09、111、115、144及び154~171の調製
1)複合siRNAが、表3A~3Gに示される複合体16~18、24~26、42
~43、62、78、105、109、111、115、144、157~163及び1
67~171に対応する配列を有し、2)目的配列における2つのヌクレオチド間がチオ
リン酸エステルにより結合される場合、当該2つのヌクレオチドのうち後のヌクレオチド
の結合における酸化反応工程の代わりに以下の硫化反応工程を用い、各工程の硫化反応条
件は同じであり、温度が25℃であり、反応時間が300秒であり、硫化試薬がキサンタ
ンヒドリドであり、硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配
列とのモル比が120:1であり、アセトニトリル:ピリジン=1:1の混合溶剤で反応
を行い、3)目的配列における全てのヌクレオチドの2’-位がいずれも修飾ヒドロキシ
基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける2’-TBDMS保護を除去す
る工程を含まないこと以外は、調製例13と同じ方法によって表題複合体を調製し、本開
示の複合体16~18、24~26、42~43、62、78、105、109、111
、115、144、157~163及び167~171を調製した。
09、111、115、144及び154~171の調製
1)複合siRNAが、表3A~3Gに示される複合体16~18、24~26、42
~43、62、78、105、109、111、115、144、157~163及び1
67~171に対応する配列を有し、2)目的配列における2つのヌクレオチド間がチオ
リン酸エステルにより結合される場合、当該2つのヌクレオチドのうち後のヌクレオチド
の結合における酸化反応工程の代わりに以下の硫化反応工程を用い、各工程の硫化反応条
件は同じであり、温度が25℃であり、反応時間が300秒であり、硫化試薬がキサンタ
ンヒドリドであり、硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配
列とのモル比が120:1であり、アセトニトリル:ピリジン=1:1の混合溶剤で反応
を行い、3)目的配列における全てのヌクレオチドの2’-位がいずれも修飾ヒドロキシ
基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける2’-TBDMS保護を除去す
る工程を含まないこと以外は、調製例13と同じ方法によって表題複合体を調製し、本開
示の複合体16~18、24~26、42~43、62、78、105、109、111
、115、144、157~163及び167~171を調製した。
また、L-9複合分子の代わりにそれぞれ以下の複合分子を用い、上記調製例2で得ら
れたP-9複合分子(複合分子2)を用いて複合体164を調製し、上記調製例7で得ら
れたW-7複合分子(複合分子7)を用いて複合体155、156及び165を調製し、
上記調製例12で得られたZ-4複合分子(複合分子12)を用いて複合体154及び1
66を調製し、複合siRNAが、それぞれ表3A~3Gに示される複合体154~15
6及び164~166に対応する配列であり、表3A~3Gにより上記複合体にそれぞれ
番号を付け、これらの構造がそれぞれ式(3)、式(4)、式(15)及び式(22)に
示されること以外は、調製例13と同じ方法によって、複合体154~156及び164
~166を調製した。液体クロマトグラフィー質量分析計により複合体の分子量を検出し
たところ、複合体142の理論値S:7649.55、AS:6991.46、実測値S
:7649.1、AS:6991、複合体170の理論値S:7649.55、AS:6
995.47、実測値S:7648.8、AS:6994.8、複合体171の理論値S
:7649.55、AS:7011.53、実測値S:7648.8、AS:7010.
9、複合体115の理論値S:7584.5、AS:7007.46、実測値S:758
4、AS:7006.2、複合体109の理論値S:7584.5、AS:6931.4
7、実測値S:7584、AS:6930.9、複合体106の理論値S:7572.4
7、AS:6907.41、実測値S:7571.8、AS:6906.9、複合体11
3の理論値S:7584.5、AS:7011.47、実測値S:7584、AS:70
11.3、複合体17の理論値S:7504.34、AS:6961.52、実測値S:
7503.4、AS:6960.9、複合体25の理論値S:7504.34、AS:7
037.51、実測値S:7503.6、AS:7036.9、複合体18の理論値S:
8218.83、AS:7703.05、実測値S:8218、AS:7702.5、複
合体16の理論値S:7516.37、AS:6985.58、実測値S:7516.5
、AS:6984.9、複合体159の理論値S:7504.34、AS:7057.5
8、実測値S:7503.6、AS:7057、複合体160の理論値S:7504.3
4、AS:7041.52、実測値S:7503.6、AS:7040.8、複合体16
1の理論値S:7516.37、AS:7065.58、実測値S:7516.6、AS
:7064.5、複合体162の理論値S:7504.34、AS:7139.68、実
測値S:7515.6、AS:7138.9、複合体163の理論値S:7516.37
、AS:7081.64、実測値S:7515.6、AS:7080.9、複合体62の
理論値S:7485.3、AS:7161.7、実測値S:7484.4、AS:716
0.9、複合体78の理論値S:7423.22、AS:7207.78、実測値S:7
422.6、AS:7207.2、複合体42の理論値S:7407.22、AS:72
08.77、実測値S:7406.4、AS:7208.1、複合体43の理論値S:7
407.22、AS:7170.72、実測値S:7406.5、AS:7170.1と
いう結果であり、測定値が理論値と一致していた。
れたP-9複合分子(複合分子2)を用いて複合体164を調製し、上記調製例7で得ら
れたW-7複合分子(複合分子7)を用いて複合体155、156及び165を調製し、
上記調製例12で得られたZ-4複合分子(複合分子12)を用いて複合体154及び1
66を調製し、複合siRNAが、それぞれ表3A~3Gに示される複合体154~15
6及び164~166に対応する配列であり、表3A~3Gにより上記複合体にそれぞれ
番号を付け、これらの構造がそれぞれ式(3)、式(4)、式(15)及び式(22)に
示されること以外は、調製例13と同じ方法によって、複合体154~156及び164
~166を調製した。液体クロマトグラフィー質量分析計により複合体の分子量を検出し
たところ、複合体142の理論値S:7649.55、AS:6991.46、実測値S
:7649.1、AS:6991、複合体170の理論値S:7649.55、AS:6
995.47、実測値S:7648.8、AS:6994.8、複合体171の理論値S
:7649.55、AS:7011.53、実測値S:7648.8、AS:7010.
9、複合体115の理論値S:7584.5、AS:7007.46、実測値S:758
4、AS:7006.2、複合体109の理論値S:7584.5、AS:6931.4
7、実測値S:7584、AS:6930.9、複合体106の理論値S:7572.4
7、AS:6907.41、実測値S:7571.8、AS:6906.9、複合体11
3の理論値S:7584.5、AS:7011.47、実測値S:7584、AS:70
11.3、複合体17の理論値S:7504.34、AS:6961.52、実測値S:
7503.4、AS:6960.9、複合体25の理論値S:7504.34、AS:7
037.51、実測値S:7503.6、AS:7036.9、複合体18の理論値S:
8218.83、AS:7703.05、実測値S:8218、AS:7702.5、複
合体16の理論値S:7516.37、AS:6985.58、実測値S:7516.5
、AS:6984.9、複合体159の理論値S:7504.34、AS:7057.5
8、実測値S:7503.6、AS:7057、複合体160の理論値S:7504.3
4、AS:7041.52、実測値S:7503.6、AS:7040.8、複合体16
1の理論値S:7516.37、AS:7065.58、実測値S:7516.6、AS
:7064.5、複合体162の理論値S:7504.34、AS:7139.68、実
測値S:7515.6、AS:7138.9、複合体163の理論値S:7516.37
、AS:7081.64、実測値S:7515.6、AS:7080.9、複合体62の
理論値S:7485.3、AS:7161.7、実測値S:7484.4、AS:716
0.9、複合体78の理論値S:7423.22、AS:7207.78、実測値S:7
422.6、AS:7207.2、複合体42の理論値S:7407.22、AS:72
08.77、実測値S:7406.4、AS:7208.1、複合体43の理論値S:7
407.22、AS:7170.72、実測値S:7406.5、AS:7170.1と
いう結果であり、測定値が理論値と一致していた。
[表3]
siRNA複合体
siRNA複合体
注釈:大文字C、G、U、Aは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、dTは、デオキシチ
ミンヌクレオチドを表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチド
が2’-メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に
隣接する1つのヌクレオチドが2’-フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文
字sは、当該文字sの左右に隣接する2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基によ
り結合されていることを表し、VPは、当該文字VPの右側の1つのヌクレオチドがビニ
ルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Pは、当該文字Pの右側の1つの
ヌクレオチドがリン酸エステルヌクレオチドであることを表し、Psは、当該文字Psの
右側の1つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、T
moeは、2’-メトキシエトキシ修飾チミンヌクレオチドを表す。
ビニルリン酸エステル及び2’-メトキシ修飾ウリジンモノマー(VP-Um)は、以
下の方法に従い合成された。
下の方法に従い合成された。
(14-1)VP-U-2の合成
以下の方法に従い、VP-U-2分子を合成した。
以下の方法に従い、VP-U-2分子を合成した。
6mmol)、tert-ブチルジフェニルクロロシラン(TBDPSCl、50.35
g、183.2mmol)、イミダゾール(12.47g、183.2mmol)を混合
して450mlのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させ、室温で20時間
攪拌反応させた。DMFを留去し、残存物を600mlのジクロロメタンで溶解した後、
300mlの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて洗浄し、単離した水相をジクロロメタン(
DCM)で1回あたり300mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、5%シュウ酸
で水相をpH<5になるまで洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発した後でVP-U-1粗
製品を得、そのまま後のVP-U-2の合成に使用した。
VP-U-1粗製品を100mlのジクロロメタンで溶解した後、氷浴を施して10分
間攪拌し、さらに、予め4℃の冷蔵庫で冷却された450mlの2%p-トルエンスルホ
ン酸溶液(溶剤が、体積比3:7のメタノール-ジクロロメタン混合溶剤である)を加え
、10分間反応させた。さらに200mlの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエ
ンチングし、得られた有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてpH=8になるま
で洗浄した。水相をあわせ、ジクロロメタンで1回あたり200mlで2回抽出し、全て
の有機相をあわせ、さらに200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させるまで溶剤を
蒸発した。残存物を200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エー
テルをカラムに入れ、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール=1:1
:1:0.05~1:1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減
圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて計40.00gの純粋品VP-U
-2を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.96 (d
,J =7.8 Hz,1H),7.64 (dtd,J =5.1,4.0,2.2
Hz,4H),7.41-7.30 (m,6H),6.79 (d,J =4.7 H
z,1H),5.73 (d,J =7.6 Hz,1H),4.94 (t,J =7
.0 Hz,1H),4.12 (td,J =4.6,3.9 Hz,1H),4.0
5 (dd,J =4.8、4.0 Hz,1H),3.96 (t,J =4.7 H
z,1H),3.68 (ddd,J =11.8,7.0,4.6 Hz,1H),3
.57-3.46 (m,1H),3.39 (s,3H),1.05 (s,8H).
MS m/z:C26H33N2O6Si、[M+H]+、理論値:497.21、実
測値:497.45。
間攪拌し、さらに、予め4℃の冷蔵庫で冷却された450mlの2%p-トルエンスルホ
ン酸溶液(溶剤が、体積比3:7のメタノール-ジクロロメタン混合溶剤である)を加え
、10分間反応させた。さらに200mlの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエ
ンチングし、得られた有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてpH=8になるま
で洗浄した。水相をあわせ、ジクロロメタンで1回あたり200mlで2回抽出し、全て
の有機相をあわせ、さらに200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、乾燥させるまで溶剤を
蒸発した。残存物を200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エー
テルをカラムに入れ、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール=1:1
:1:0.05~1:1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減
圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて計40.00gの純粋品VP-U
-2を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.96 (d
,J =7.8 Hz,1H),7.64 (dtd,J =5.1,4.0,2.2
Hz,4H),7.41-7.30 (m,6H),6.79 (d,J =4.7 H
z,1H),5.73 (d,J =7.6 Hz,1H),4.94 (t,J =7
.0 Hz,1H),4.12 (td,J =4.6,3.9 Hz,1H),4.0
5 (dd,J =4.8、4.0 Hz,1H),3.96 (t,J =4.7 H
z,1H),3.68 (ddd,J =11.8,7.0,4.6 Hz,1H),3
.57-3.46 (m,1H),3.39 (s,3H),1.05 (s,8H).
MS m/z:C26H33N2O6Si、[M+H]+、理論値:497.21、実
測値:497.45。
(14-2)VP-U-4の合成:
(DCC、16.48g、80.0mmol)、ピリジン(4.20g、53.2mmo
l)、トリフルオロ酢酸(6.61g、53.2mmol)を混合して200mlのジメ
チルスルホキシド(DMSO)に溶解させ、室温で20時間攪拌反応させて反応液を得た
。別に、メチレンジホスホン酸テトラエチル(21.44g、74.4mmol)を12
0mlのTHFに溶解させ、氷浴で降温し、氷浴温度でt-BuOK(11.36g、1
01.2mmol)を加え、氷浴温度で10分間反応させた後、室温まで昇温して0.5
時間反応させた後、約1時間かけて前述した反応液に加え、氷浴温度で1h反応させた後
、室温まで昇温して18時間反応させた。水を加えて反応をクエンチングし、単離した水
相をジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、2
00mlの飽和食塩水で1回洗浄した後に乾燥させるまで溶剤を蒸発した。200~30
0メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテ
ル:酢酸エチル=1:1~1:4で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発
乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて計14.00gの純粋品VP-U-4を
得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.96 (d,J
=7.8 Hz,1H),7.64 (dtd,J =5.1,4.0,2.2 Hz,
4H),7.41-7.30 (m,6H),6.82-6.71 (m,2H),5.
90 (ddd,J =25.9、15.0,1.0 Hz,1H),5.73 (d,
J =7.6 Hz,1H),4.36-4.21 (m,3H),4.18 (t,J
=4.9 Hz,1H),4.05 (ddq,J =9.7,8.5,6.9 Hz
,2H),3.87 (t,J =4.8 Hz,1H),3.39 (s,3H),1
.32 (td,J =6.9,0.7 Hz,6H),1.05 (s,8H). M
S m/z:C31H42N2O8PSi、[M+H]+、理論値:629.24、実測
値:629.51。
(14-3)VP-U-5の合成:
ンに溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(17.96g、111.45mmo
l)を加え、室温で完全に反応させるまで20時間攪拌した。そのまま溶剤を乾燥させる
まで蒸発し、1回あたり50mlのジクロロメタンで溶解してから蒸発乾固する操作を2
回繰り返し、粗製品を得た。粗製品を200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで
精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:メ
タノール=1:1:1:0.05~1:1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を
回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて計6.70gの
純粋品VP-U-5を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ
7.96 (d,J =7.8 Hz,1H),6.77 (dd,J =15.0,6
.2 Hz,1H),5.99-5.82 (m,2H),5.73 (d,J =7.
6 Hz,1H),5.27 (d,J =5.1 Hz,1H),5.10 (dd,
J =5.3,4.7 Hz,1H),4.29 (ddq,J =9.8,8.6,7
.0 Hz,2H),4.17 (ddd,J =6.2,5.2,1.0 Hz,1H
),4.12-3.98 (m,3H),3.39 (s,2H),1.32 (td,
J =6.9,0.6 Hz,6H). MS m/z:C15H24N2O8P、[M
+H]+、理論値:391.13、実測値:391.38。
(14-4)VP-U-6の合成:
0mmol)、ピリジントリフルオロアセテート(0.232g、1.2mmol)、N
-メチルイミダゾール(0.099g、1.2mmol)、ビス(ジイソプロピルアミノ
)(2-シアノエトキシ)ホスフィン(0.452g、1.5mmol)を加え、室温で
5時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を留去し、残存物をカラムクロマトグラフィ
ーにより精製し(200~300メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:
アセトニトリル(0.5wt%トリエチルアミンを含む)=3:1~1:3で勾配溶出し
た)、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計508mgの目的生成物VP-U-
6を得た。31P NMR (161 MHz,DMSO-d6) δ 150.34,
150.29,17.07,15.50. MS m/z:C24H41N4O9P2、
[M+H]+、理論値:591.23、実測値:591.55。VP-U-6が目的生成
物VP-Umであり、ヌクレオシドモノマーとしてRNA鎖の合成に関与することを示し
た。
以下の方法を用いて5’-リン酸エステル修飾をアンチセンス鎖の5’端に結合した。
原料は、以下の式CPR-Iの構造を有するリン酸化構造モノマーであり、蘇州吉瑪に
より提供され、番号はCat#13~2601-XXであった。
より提供され、番号はCat#13~2601-XXであった。
アンチセンス鎖の全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、ホスホルアミダイト核酸
固相合成方法により、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の4つの反応を行って
式CPR-Iのモノマーをアンチセンス鎖の5’末端に結合した。その後、以下の条件で
切断と脱保護を行い、アンチセンス鎖を得た。
固相合成方法により、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の4つの反応を行って
式CPR-Iのモノマーをアンチセンス鎖の5’末端に結合した。その後、以下の条件で
切断と脱保護を行い、アンチセンス鎖を得た。
合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を濃度25wt%のアンモニア水に加え
、ヌクレオチド配列について、アンモニア水の用量が0.5ml/μmolであり、55
℃で16時間反応させ、液体を除去し、残存物を真空で乾燥させるまで濃縮した。アンモ
ニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、0.4ml/μmolのN-メチル
ピロリドンで製品を溶解させた後、0.3ml/μmolのトリエチルアミン及び0.6
ml/μmolのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける2’-T
BDMS保護を除去した。精製と脱塩:分取用イオンクロマトグラフィーカラム(Sou
rce 15Q)により、NaClによる勾配溶出で、核酸を精製した。具体的には、溶
出剤A:20mMリン酸ナトリウム(pH 8.1)、溶剤が水/アセトニトリル=9:
1(体積比)であり、溶出剤B:1.5M塩化ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム(
pH 8.1)、溶剤が水/アセトニトリル=9:1(体積比)であり、溶出勾配:溶出
剤A:溶出剤B=100:0~50:50で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあ
わせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、Sep
hadexカラムにより脱塩し、充填剤がSephadex-G25であり、脱イオン水
で溶出した。
、ヌクレオチド配列について、アンモニア水の用量が0.5ml/μmolであり、55
℃で16時間反応させ、液体を除去し、残存物を真空で乾燥させるまで濃縮した。アンモ
ニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、0.4ml/μmolのN-メチル
ピロリドンで製品を溶解させた後、0.3ml/μmolのトリエチルアミン及び0.6
ml/μmolのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける2’-T
BDMS保護を除去した。精製と脱塩:分取用イオンクロマトグラフィーカラム(Sou
rce 15Q)により、NaClによる勾配溶出で、核酸を精製した。具体的には、溶
出剤A:20mMリン酸ナトリウム(pH 8.1)、溶剤が水/アセトニトリル=9:
1(体積比)であり、溶出剤B:1.5M塩化ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム(
pH 8.1)、溶剤が水/アセトニトリル=9:1(体積比)であり、溶出勾配:溶出
剤A:溶出剤B=100:0~50:50で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあ
わせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、Sep
hadexカラムにより脱塩し、充填剤がSephadex-G25であり、脱イオン水
で溶出した。
目的生成物が5’-チオリン酸エステル修飾を有する場合に、結合する際に、上記酸化
反応条件の代わりに硫化反応条件を用いたこと以外は、上記と同じ工程により硫化反応を
行った。
反応条件の代わりに硫化反応条件を用いたこと以外は、上記と同じ工程により硫化反応を
行った。
上記合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して、イオン交換クロマトグラフィー
(IEX-HPLC)を用いて純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析
(LC-MS)により分子量を分析し、合成された核酸配列が表5における各実施例及び
比較例に対応するsiRNAであることを確認した。
(IEX-HPLC)を用いて純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析
(LC-MS)により分子量を分析し、合成された核酸配列が表5における各実施例及び
比較例に対応するsiRNAであることを確認した。
(調製例15)表3A~3Gにおける他の複合体の調製
また、1)複合体31~37、52~58、68~74、84~90、121~127
、146~152及び比較複合体4~5、7~8、10~13について、L-9複合分子
の代わりに上記調製例2~10又は12で得られた複合分子2~8又は12及び比較複合
分子1~2を用い(例えば、L-9複合分子の代わりにP-9複合分子(複合分子2)を
用いた場合、複合体31、52、68、84、121及び146という番号にP10が付
された複合体を得ると予期し、L-9複合分子の代わりにR-4複合分子(複合分子3)
を用いた場合、複合体32、53、69、85、122及び147という番号にR5が付
された複合体を得ると予期し、以下類推してもよい)、2)複合siRNAが、表3A~
3Gに示される複合体10~15、19~23、27~41、44~61、63~77、
79~104、106~108、110、112~114、116~141、143~1
52及び比較複合体4~5、7~8、10~17に対応する配列を有し、3)目的配列に
おける2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、当該2つのヌ
クレオチドのうち後のヌクレオチドの結合における酸化反応工程の代わりに調製例13に
記載された硫化反応工程を用い、4)目的配列における全てのヌクレオチドの2’-位が
いずれも修飾ヒドロキシ基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける2’-
TBDMS保護を除去する工程を含まないこと以外は、調製例13と同じ方法により、表
3A~3Gにおける他のsiRNA複合体を調製できると予期した。これにより、複合体
10~15、19~23、27~41、44~61、63~77、79~104、106
~108、110、112~114、116~141、143~152及び比較複合体4
~5、7~8、10~17を調製できると予期し、表3A~3Gによりそれらにそれぞれ
番号を付けた。これらの本開示の複合体の構造は、それぞれ式(3)、(4)、(7)、
(12)、(13)、(14)、(15)、(21)又は(22)に示され、各比較複合
体の構造は、それぞれ式(901)、式(902)に示される。
また、1)複合体31~37、52~58、68~74、84~90、121~127
、146~152及び比較複合体4~5、7~8、10~13について、L-9複合分子
の代わりに上記調製例2~10又は12で得られた複合分子2~8又は12及び比較複合
分子1~2を用い(例えば、L-9複合分子の代わりにP-9複合分子(複合分子2)を
用いた場合、複合体31、52、68、84、121及び146という番号にP10が付
された複合体を得ると予期し、L-9複合分子の代わりにR-4複合分子(複合分子3)
を用いた場合、複合体32、53、69、85、122及び147という番号にR5が付
された複合体を得ると予期し、以下類推してもよい)、2)複合siRNAが、表3A~
3Gに示される複合体10~15、19~23、27~41、44~61、63~77、
79~104、106~108、110、112~114、116~141、143~1
52及び比較複合体4~5、7~8、10~17に対応する配列を有し、3)目的配列に
おける2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、当該2つのヌ
クレオチドのうち後のヌクレオチドの結合における酸化反応工程の代わりに調製例13に
記載された硫化反応工程を用い、4)目的配列における全てのヌクレオチドの2’-位が
いずれも修飾ヒドロキシ基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける2’-
TBDMS保護を除去する工程を含まないこと以外は、調製例13と同じ方法により、表
3A~3Gにおける他のsiRNA複合体を調製できると予期した。これにより、複合体
10~15、19~23、27~41、44~61、63~77、79~104、106
~108、110、112~114、116~141、143~152及び比較複合体4
~5、7~8、10~17を調製できると予期し、表3A~3Gによりそれらにそれぞれ
番号を付けた。これらの本開示の複合体の構造は、それぞれ式(3)、(4)、(7)、
(12)、(13)、(14)、(15)、(21)又は(22)に示され、各比較複合
体の構造は、それぞれ式(901)、式(902)に示される。
(調製例16)比較複合体6及び9の合成
上記工程(11-3)で得られたFIN-2を用いて比較複合体6及び9を合成した。
汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録
商標)HL Solid Supports)を用い、FIN-2の3回の反応循環によ
りFIN_FIN_FINをRNAセンス鎖の3’末端に複合した後、固相合成を行った
ことのみ以外、RNA固相合成条件、脱保護条件は、前述した工程(11-2)に記載さ
れた核酸固相合成と一致した。
上記工程(11-3)で得られたFIN-2を用いて比較複合体6及び9を合成した。
汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録
商標)HL Solid Supports)を用い、FIN-2の3回の反応循環によ
りFIN_FIN_FINをRNAセンス鎖の3’末端に複合した後、固相合成を行った
ことのみ以外、RNA固相合成条件、脱保護条件は、前述した工程(11-2)に記載さ
れた核酸固相合成と一致した。
Rajeevら、ChemBioChem 2015,16,903-908に記載さ
れた方法を参照してFIN_FIN_FIN複合基の結合を行い、具体的には、まず、上
記汎用の固相担体におけるヒドロキシ保護基を除去し、カップリング反応条件下及びカッ
プリング試薬の存在下でFIN-2複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピン
グ反応及び酸化反応を行った後、固相担体に結合されたFIN複合分子を得た。また、当
該固相担体に結合されたFIN複合分子におけるヒドロキシ保護基DMTrを除去し、別
のFIN-2複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を
行い、再び上記脱保護-カップリング-キャッピング-酸化工程を1回繰り返し、3番目
のFIN-2複合分子を結合させ、これにより固相担体に結合された複合基(FIN_F
IN_FIN)を得た。その後、固相担体に結合される複合基から、ヌクレオチドモノマ
ーを結合し、最終的に3’末端に複合される複合基(FIN_FIN_FIN)を有する
RNAセンス鎖を得た。
れた方法を参照してFIN_FIN_FIN複合基の結合を行い、具体的には、まず、上
記汎用の固相担体におけるヒドロキシ保護基を除去し、カップリング反応条件下及びカッ
プリング試薬の存在下でFIN-2複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピン
グ反応及び酸化反応を行った後、固相担体に結合されたFIN複合分子を得た。また、当
該固相担体に結合されたFIN複合分子におけるヒドロキシ保護基DMTrを除去し、別
のFIN-2複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を
行い、再び上記脱保護-カップリング-キャッピング-酸化工程を1回繰り返し、3番目
のFIN-2複合分子を結合させ、これにより固相担体に結合された複合基(FIN_F
IN_FIN)を得た。その後、固相担体に結合される複合基から、ヌクレオチドモノマ
ーを結合し、最終的に3’末端に複合される複合基(FIN_FIN_FIN)を有する
RNAセンス鎖を得た。
上記反応において、前記の脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応の条件、溶
剤及び試薬は、工程(11-2)に記載された核酸固相合成方法と同じであった。
剤及び試薬は、工程(11-2)に記載された核酸固相合成方法と同じであった。
その後、調製例12と同じ方法により切断と脱保護、精製と脱塩、検出、アニールを行
い、最終的に比較複合体6及び9(以下単にFIN複合体ともいうことがある)を得た。
液体クロマトグラフィー質量分析計(LC-MS、Liquid Chromatogr
aphy-Mass Spectrometry、WatersCorp.から購入、型
番:LCT Premier)により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値と一
致しており、合成されたFIN-siHBa1M1SP複合体が、以下の式(903)に
示される目的設計の化合物であることが確定された。
い、最終的に比較複合体6及び9(以下単にFIN複合体ともいうことがある)を得た。
液体クロマトグラフィー質量分析計(LC-MS、Liquid Chromatogr
aphy-Mass Spectrometry、WatersCorp.から購入、型
番:LCT Premier)により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値と一
致しており、合成されたFIN-siHBa1M1SP複合体が、以下の式(903)に
示される目的設計の化合物であることが確定された。
上記複合体を調製した後、標準的な手段により固体粉末として凍結乾燥させて保存し、
使用に備えた。必要な場合、例えば注射用水又は生理食塩水を用いて溶解させ所望の濃度
の溶液として用いてもよい。
使用に備えた。必要な場合、例えば注射用水又は生理食塩水を用いて溶解させ所望の濃度
の溶液として用いてもよい。
(実験例1)本実験では、本開示の複合体の毒性について証明している。
C57BL/6Jマウスにおいて、マウス1匹あたり100mg/kg又は200mg
/kg(siRNAとして計算、0.9%塩化ナトリウム水溶液の形で、それぞれ10m
g/mL又は20mg/mLの濃度で10mL/kg使用)の複合体24をそれぞれ単回
皮下投与し、持続的に観察した期間中、動物の死亡はなく、薬物の副作用に関連する臨床
症状も認められず、投与した24h後、臨床病理学的検査及び肉眼解剖のいずれにおいて
も異常が認められなかった。上記結果から明らかなように、本開示の複合体は、動物レベ
ルの毒性が低い。
C57BL/6Jマウスにおいて、マウス1匹あたり100mg/kg又は200mg
/kg(siRNAとして計算、0.9%塩化ナトリウム水溶液の形で、それぞれ10m
g/mL又は20mg/mLの濃度で10mL/kg使用)の複合体24をそれぞれ単回
皮下投与し、持続的に観察した期間中、動物の死亡はなく、薬物の副作用に関連する臨床
症状も認められず、投与した24h後、臨床病理学的検査及び肉眼解剖のいずれにおいて
も異常が認められなかった。上記結果から明らかなように、本開示の複合体は、動物レベ
ルの毒性が低い。
(実験例2)本実験では、本開示の複合体の安定性を証明している
(実験例2-1)体外リソソーム溶解液における安定性
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列1(それぞれsiRNA濃度
が20μMである0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)をそ
れぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオ
ン水及び2.72μLのマウストリトソーム(XenotechInc.から購入、番号
R0610LT、No.1610069、最終濃度0.2mU/μL)と均一に混合し、
37℃で恒温培養した。それぞれ0h、5min、15min、30min、1h、2h
、4h、8hの各時点で5μlの試料(サンプル)を取り出し、それぞれ15μLの9M
尿素水溶液に加えて変性させた後、4μlの試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号
20160830)を加え、直ちに-80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時
間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表
す。リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製:各1.5μlの等モル量
の上記複合体(20μM)を、それぞれ7.5μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5
.0)、1μLの脱イオン水と均一に混合し、それぞれ15μLの9M尿素水溶液に加え
て変性させた後、4μLの試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830
)を加えて均一に混合し、直ちに-80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各複合
体の参照サンプルは、電気泳動図においてConと記している。
(実験例2-1)体外リソソーム溶解液における安定性
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列1(それぞれsiRNA濃度
が20μMである0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)をそ
れぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオ
ン水及び2.72μLのマウストリトソーム(XenotechInc.から購入、番号
R0610LT、No.1610069、最終濃度0.2mU/μL)と均一に混合し、
37℃で恒温培養した。それぞれ0h、5min、15min、30min、1h、2h
、4h、8hの各時点で5μlの試料(サンプル)を取り出し、それぞれ15μLの9M
尿素水溶液に加えて変性させた後、4μlの試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号
20160830)を加え、直ちに-80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時
間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表
す。リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製:各1.5μlの等モル量
の上記複合体(20μM)を、それぞれ7.5μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5
.0)、1μLの脱イオン水と均一に混合し、それぞれ15μLの9M尿素水溶液に加え
て変性させた後、4μLの試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830
)を加えて均一に混合し、直ちに-80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各複合
体の参照サンプルは、電気泳動図においてConと記している。
16重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、冷凍保存サンプルにおける各群
の全てのサンプルをそれぞれ4μlの試料負荷緩衝液(Solarbio社から購入、2
0mMのEDTA、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水
溶液)と混合した後、20μlの混合液を前述したゲルに負荷し、20mAで10分間電
気泳動した後、40mAで30分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルをGelred
染料(BioTium、Cat.13G1203)で10分間染色した後にイメージング
を行い、結果を図1Aに示した。
の全てのサンプルをそれぞれ4μlの試料負荷緩衝液(Solarbio社から購入、2
0mMのEDTA、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水
溶液)と混合した後、20μlの混合液を前述したゲルに負荷し、20mAで10分間電
気泳動した後、40mAで30分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルをGelred
染料(BioTium、Cat.13G1203)で10分間染色した後にイメージング
を行い、結果を図1Aに示した。
前記比較配列1は以下のとおりである。
センス鎖:5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(配列番号250)
、
アンチセンス鎖:5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(配列番
号251)。
センス鎖:5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(配列番号250)
、
アンチセンス鎖:5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(配列番
号251)。
同じ方法により、複合体105、109、111及び115に対して6h以内での安定
性を測定し、結果を図1Bに示した。
性を測定し、結果を図1Bに示した。
図1A~1Bは、siRNA複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出
結果を示す。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間維持して分解さ
れず、非常に良好な安定性を示すことができることが示された。
結果を示す。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間維持して分解さ
れず、非常に良好な安定性を示すことができることが示された。
(実験例2-2)ヒト血漿における体外安定性
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列1(それぞれsiRNA濃度
が20μMである0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)
をそれぞれ108μLの90%ヒト血漿(Human plasma、PBSで希釈)と
均一に混合して37℃で恒温培養した。それぞれ0、2、4、6、8、24、48、72
時間の各時点で10μLの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、-80℃
の冷蔵庫に冷凍して保存し、使用に備えた。同時に、等モル量の各複合体(2μM、2μ
l)を8μlの1×PBSと均一に混合して、10μLのヒト血漿処理されていないサン
プルを得た(Conと記した)。20重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、
冷凍保存サンプルにおける各群の全てのサンプルをそれぞれ4μLの試料負荷緩衝液(2
0mMのEDTA、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水
溶液)と混合した後、前述したゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動
した。電気泳動終了後、ゲルを1×Sybr Gold染料(Invitrogen、C
at.11494)で15分間染色した後にイメージングを行い、結果を図2Aに示した
。前記比較配列1は以下のとおりである。
センス鎖:5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(配列番号250)
、
アンチセンス鎖:5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(配列番
号251)。
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列1(それぞれsiRNA濃度
が20μMである0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)
をそれぞれ108μLの90%ヒト血漿(Human plasma、PBSで希釈)と
均一に混合して37℃で恒温培養した。それぞれ0、2、4、6、8、24、48、72
時間の各時点で10μLの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、-80℃
の冷蔵庫に冷凍して保存し、使用に備えた。同時に、等モル量の各複合体(2μM、2μ
l)を8μlの1×PBSと均一に混合して、10μLのヒト血漿処理されていないサン
プルを得た(Conと記した)。20重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、
冷凍保存サンプルにおける各群の全てのサンプルをそれぞれ4μLの試料負荷緩衝液(2
0mMのEDTA、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水
溶液)と混合した後、前述したゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動
した。電気泳動終了後、ゲルを1×Sybr Gold染料(Invitrogen、C
at.11494)で15分間染色した後にイメージングを行い、結果を図2Aに示した
。前記比較配列1は以下のとおりである。
センス鎖:5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(配列番号250)
、
アンチセンス鎖:5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(配列番
号251)。
同じ方法により、複合体105、109、111及び115に対して72h以内での安
定性を測定し、結果を図2Bに示した。
定性を測定し、結果を図2Bに示した。
図2Aと2Bは、被験siRNA複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的
検出結果を示す。結果から分かるとおり、本開示の複合体は、ヒト血漿中で最長72hで
も分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
検出結果を示す。結果から分かるとおり、本開示の複合体は、ヒト血漿中で最長72hで
も分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
(実験例2-3)サル血漿における体外安定性
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列2(それぞれsiRNA濃度
が20μMの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl、前記
比較配列2は、センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ配列番号80及び配列番号81に
示される配列を有するが、いずれの複合分子とも複合していないsiRNAであった)を
それぞれ108μLの90%カニクイザル血漿(Monkey plasma、鴻泉生物
から購入、HQ70082、PBSで希釈)と均一に混合して37℃で恒温培養した。0
、2、4、6、8、24、48、72時間の各時点でそれぞれ10μLの試料を取り出し
、直ちに液体窒素により急速冷凍し、-80℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサ
ンプリングした後、各サンプルを1×PBS(pH7.4)で5倍希釈した後、10μL
をとって使用に備えた。同時に、等モル量の以上の各複合体(2μM、2μl)を8μl
の1×PBSと均一に混合して、10μLのサル血漿処理されていないサンプルを得た(
Conと記した)。20重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記希釈され
たサンプルにおける各群の全てのサンプルを4μLの試料負荷緩衝液(20mMのEDT
A、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水溶液)と混合し
た後、前述したゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動
終了後、ゲルを1×Sybr Gold染料(Invitrogen、Cat.1149
4)で15分間染色した後にイメージングを行い、結果を図3Aに示した。
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列2(それぞれsiRNA濃度
が20μMの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl、前記
比較配列2は、センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ配列番号80及び配列番号81に
示される配列を有するが、いずれの複合分子とも複合していないsiRNAであった)を
それぞれ108μLの90%カニクイザル血漿(Monkey plasma、鴻泉生物
から購入、HQ70082、PBSで希釈)と均一に混合して37℃で恒温培養した。0
、2、4、6、8、24、48、72時間の各時点でそれぞれ10μLの試料を取り出し
、直ちに液体窒素により急速冷凍し、-80℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサ
ンプリングした後、各サンプルを1×PBS(pH7.4)で5倍希釈した後、10μL
をとって使用に備えた。同時に、等モル量の以上の各複合体(2μM、2μl)を8μl
の1×PBSと均一に混合して、10μLのサル血漿処理されていないサンプルを得た(
Conと記した)。20重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記希釈され
たサンプルにおける各群の全てのサンプルを4μLの試料負荷緩衝液(20mMのEDT
A、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水溶液)と混合し
た後、前述したゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動
終了後、ゲルを1×Sybr Gold染料(Invitrogen、Cat.1149
4)で15分間染色した後にイメージングを行い、結果を図3Aに示した。
同じ方法により、複合体105、109、111及び115及び比較配列2に対して7
2h以内での安定性を測定し、結果を図3Bに示した。
2h以内での安定性を測定し、結果を図3Bに示した。
図3Aと3Bは、被験siRNAの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結
果を示している。本開示のsiRNA複合体は、カニクイザル血漿中で最長72hでも分
解されていないことが分かり、サル血漿における優れた安定性を示した。
果を示している。本開示のsiRNA複合体は、カニクイザル血漿中で最長72hでも分
解されていないことが分かり、サル血漿における優れた安定性を示した。
(実験例3)本実験では、複合体24及び25のラット体内での薬物動力学について説
明している
本実験例では、それぞれ各実験群のラット(1群あたりラット10匹、雌雄はそれぞれ
半分ずつ)に複合体24及び複合体25を皮下注射投与し、単回用量を10mg/kg及
び50mg/kgとして実施した。その後、各時点でのラット血漿の薬物濃度及び肝臓、
腎臓組織の薬物濃度を検出した。
明している
本実験例では、それぞれ各実験群のラット(1群あたりラット10匹、雌雄はそれぞれ
半分ずつ)に複合体24及び複合体25を皮下注射投与し、単回用量を10mg/kg及
び50mg/kgとして実施した。その後、各時点でのラット血漿の薬物濃度及び肝臓、
腎臓組織の薬物濃度を検出した。
まず、PRISTIMA 7.2.0版データシステムにより、SDラットをラットの
体重に応じて性別でランダムに分け、その後、設計された用量でそれぞれ複合体に投与し
た。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は10及
び50mg/kgであり、1mg/ml及び5mg/mlの0.9%塩化ナトリウム水溶
液の形とし、体積は10ml/kgであった。薬剤投与前及び薬剤投与後の5分間(±3
0秒)、30分間(±1分間)、1時間(±2分間)、2時間(±2分間)、6時間(±
5分間)、24時間(±10分間)、48時間(±20分間)、72時間(±20分間)
、120時間(±30分間)、168時間(±30分間)に、それぞれ頸静脈からラット
全血を採取した。その後全血サンプルを2~8℃で遠心力1800×gで10分間遠心し
て血漿を単離し、血漿サンプルをチューブに約70μL放置し、残りの同一サンプルを別
のチューブに放置し、いずれも検出するまで-70~-86℃で冷凍保存した。薬剤投与
後それぞれ約24、48、72、120、168時間でラットの肝臓、腎臓組織を採取し
、採取方法は、ラットの体重に応じてペントバルビタールナトリウムで麻酔し(60mg
/kg腹腔注射)、腹大動脈から採血してラットを安楽死させ、肉眼解剖を行ったことを
含む。各ラットの肝臓、腎臓をサンプリングし、1mLの冷凍保存チューブに保存し、検
出・分析するまで、-68℃以下で保存した。
体重に応じて性別でランダムに分け、その後、設計された用量でそれぞれ複合体に投与し
た。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は10及
び50mg/kgであり、1mg/ml及び5mg/mlの0.9%塩化ナトリウム水溶
液の形とし、体積は10ml/kgであった。薬剤投与前及び薬剤投与後の5分間(±3
0秒)、30分間(±1分間)、1時間(±2分間)、2時間(±2分間)、6時間(±
5分間)、24時間(±10分間)、48時間(±20分間)、72時間(±20分間)
、120時間(±30分間)、168時間(±30分間)に、それぞれ頸静脈からラット
全血を採取した。その後全血サンプルを2~8℃で遠心力1800×gで10分間遠心し
て血漿を単離し、血漿サンプルをチューブに約70μL放置し、残りの同一サンプルを別
のチューブに放置し、いずれも検出するまで-70~-86℃で冷凍保存した。薬剤投与
後それぞれ約24、48、72、120、168時間でラットの肝臓、腎臓組織を採取し
、採取方法は、ラットの体重に応じてペントバルビタールナトリウムで麻酔し(60mg
/kg腹腔注射)、腹大動脈から採血してラットを安楽死させ、肉眼解剖を行ったことを
含む。各ラットの肝臓、腎臓をサンプリングし、1mLの冷凍保存チューブに保存し、検
出・分析するまで、-68℃以下で保存した。
HPLC-FLD(蛍光検出高速液体クロマトグラフィー)によりラット血漿及び肝臓
、腎臓組織における複合体24及び25の濃度を定量的に検出し、具体的には、以下の工
程による。
(1)組織塊が80mg以下となるまで組織を粉砕し、その後、組織と細胞溶解液(T
issue and Cell Lysis Solution、供給者:Epicen
tre、番号:MTC096H)を加えて66.7mg/mLの組織ホモジネートとして
調製した。
(2)組織ホモジネートを超音波(150W、30s)処理して細胞を破砕した。
(3)各群の組織サンプルに対して、組織サンプルを75μLを96ウェルのPCRプ
レートに加え、5μLのプロテアーゼK(供給者:Invitrogen、番号:255
30-015)、10μLの10wt%アセトニトリルと0.01wt%ツウィーン20
の混合水溶液を加えた。
血漿サンプルに対して、20μLの血漿を96ウェルのPCRプレートに加え、45μ
Lの組織と細胞溶解液、5μLのプロテアーゼK及び20μLの10wt%アセトニトリ
ルと0.01wt%ツウィーン20の混合液を加えた。
(4)プレートをシールし、PCR器(供給者:Applied Biosystem
s、型番:GeneAmp(登録商標) PCR system 9700)に放置し、
65℃で45分間培養した。
(5)培養終了後、10μLの3M KClの水溶液(供給者:Sigma-aldr
ich、番号:60135-250ML)を加え、振とうして均一にし、4℃で、320
0rcfで15分間遠心した。
(6)各群の組織サンプルに対して、80μLの上清液を120μLのハイブリッド混
合物(配合方法:0.5mLの6μM PNAプローブ(供給者:杭州泰禾生物科技有限
公司)、1mLの200mM Trizma/pH=8、5mLの8M尿素水溶液、3.
5mLのH2O、2mLのアセトニトリル)に加えた。
各群の血漿サンプルに対して、40μLの上清液を160μLのハイブリッド混合物(
配合方法:0.5mLの6μM PNAプローブ、1mLの200mM Trizma/
pH=8、5mLの8M尿素水溶液、7.5mLのH2O、2mLのアセトニトリル)に
加えた。
(7)プレートをシールし、PCR器に放置し、95℃で15分間培養し、直ちに氷の
上に5分間放置した。
(8)サンプルを別の円錐底96ウェルプレートに移し、振とうして均一にし、320
0rcfで1分間遠心した。
(9)サンプルを負荷して検出し、HPLC-FLDを用いて定量的に分析した(液相
系供給者:Thermo Fisher、クロマトグラフ型番:ultimate 30
00)。
、腎臓組織における複合体24及び25の濃度を定量的に検出し、具体的には、以下の工
程による。
(1)組織塊が80mg以下となるまで組織を粉砕し、その後、組織と細胞溶解液(T
issue and Cell Lysis Solution、供給者:Epicen
tre、番号:MTC096H)を加えて66.7mg/mLの組織ホモジネートとして
調製した。
(2)組織ホモジネートを超音波(150W、30s)処理して細胞を破砕した。
(3)各群の組織サンプルに対して、組織サンプルを75μLを96ウェルのPCRプ
レートに加え、5μLのプロテアーゼK(供給者:Invitrogen、番号:255
30-015)、10μLの10wt%アセトニトリルと0.01wt%ツウィーン20
の混合水溶液を加えた。
血漿サンプルに対して、20μLの血漿を96ウェルのPCRプレートに加え、45μ
Lの組織と細胞溶解液、5μLのプロテアーゼK及び20μLの10wt%アセトニトリ
ルと0.01wt%ツウィーン20の混合液を加えた。
(4)プレートをシールし、PCR器(供給者:Applied Biosystem
s、型番:GeneAmp(登録商標) PCR system 9700)に放置し、
65℃で45分間培養した。
(5)培養終了後、10μLの3M KClの水溶液(供給者:Sigma-aldr
ich、番号:60135-250ML)を加え、振とうして均一にし、4℃で、320
0rcfで15分間遠心した。
(6)各群の組織サンプルに対して、80μLの上清液を120μLのハイブリッド混
合物(配合方法:0.5mLの6μM PNAプローブ(供給者:杭州泰禾生物科技有限
公司)、1mLの200mM Trizma/pH=8、5mLの8M尿素水溶液、3.
5mLのH2O、2mLのアセトニトリル)に加えた。
各群の血漿サンプルに対して、40μLの上清液を160μLのハイブリッド混合物(
配合方法:0.5mLの6μM PNAプローブ、1mLの200mM Trizma/
pH=8、5mLの8M尿素水溶液、7.5mLのH2O、2mLのアセトニトリル)に
加えた。
(7)プレートをシールし、PCR器に放置し、95℃で15分間培養し、直ちに氷の
上に5分間放置した。
(8)サンプルを別の円錐底96ウェルプレートに移し、振とうして均一にし、320
0rcfで1分間遠心した。
(9)サンプルを負荷して検出し、HPLC-FLDを用いて定量的に分析した(液相
系供給者:Thermo Fisher、クロマトグラフ型番:ultimate 30
00)。
分析結果を図4~図11に示した。図4~図7は、それぞれ複合体24のラット血漿に
おけるPK/TK血漿濃度の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるPK/TK
組織濃度の経時的代謝曲線を示し、図8~図11は、複合体25のラット血漿におけるP
K/TK血漿濃度の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるPK/TK組織濃度
の経時的代謝曲線を示した。具体的には、
図4は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体24のラット血漿におけるPK/
TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図5は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体24のラット肝臓及び腎臓におけ
るPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図6は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体24のラット血漿におけるPK/
TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図7は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体24のラット肝臓及び腎臓におけ
るPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図8は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体25のラット血漿におけるPK/
TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図9は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体25のラット肝臓及び腎臓におけ
るPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図10は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体25のラット血漿におけるPK
/TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図11は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体25のラット肝臓及び腎臓にお
けるPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
おけるPK/TK血漿濃度の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるPK/TK
組織濃度の経時的代謝曲線を示し、図8~図11は、複合体25のラット血漿におけるP
K/TK血漿濃度の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるPK/TK組織濃度
の経時的代謝曲線を示した。具体的には、
図4は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体24のラット血漿におけるPK/
TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図5は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体24のラット肝臓及び腎臓におけ
るPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図6は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体24のラット血漿におけるPK/
TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図7は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体24のラット肝臓及び腎臓におけ
るPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図8は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体25のラット血漿におけるPK/
TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図9は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体25のラット肝臓及び腎臓におけ
るPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図10は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体25のラット血漿におけるPK
/TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図11は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体25のラット肝臓及び腎臓にお
けるPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図4~図11の結果から分かるように、低用量(10mg/kg)でも比較的高用量(
50mg/kg)でも、複合体24及び25のラット血漿における濃度は、いずれも数時
間で検出限界以下まで急速に低下しているが、肝臓組織においてはいずれも少なくとも1
68h高い安定したレベルの濃度を維持した。このことから、L-9複合分子を複合させ
ることにより、得られたsiRNA複合体は、特異的に肝臓において顕著に富化して安定
化することができ、高度な標的性が示された。
50mg/kg)でも、複合体24及び25のラット血漿における濃度は、いずれも数時
間で検出限界以下まで急速に低下しているが、肝臓組織においてはいずれも少なくとも1
68h高い安定したレベルの濃度を維持した。このことから、L-9複合分子を複合させ
ることにより、得られたsiRNA複合体は、特異的に肝臓において顕著に富化して安定
化することができ、高度な標的性が示された。
(実験例4)本実験では、異なる複合分子により形成された複合体による、C57BL
/6Jマウスにおける標的mRNAに対する抑制効果を証明している。
まず、C57BL/6Jマウスをランダムに分けた(いずれも雌性)。実験群をそれぞ
れ複合体158(5匹のマウス)及び比較複合体14で番号を付け(5匹のマウス)、P
BS対照群(8匹のマウス)に番号を付けた。全ての動物について、体重に応じて投与量
を算出し、それぞれ1mg/kg又は0.1mg/kgの異なる単回用量で皮下投与した
。投与体積は5ml/kgであった。異なる用量を得るために、複合体を0.2mg/m
l及び0.02mg/mlで0.9%塩化ナトリウム水溶液に溶解させた。薬剤投与後の
72hで動物を死亡させ、肝臓を回収し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし
、さらにでRNAVzol (VIGOROUS、lot:161G)で全RNA抽出の
標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
/6Jマウスにおける標的mRNAに対する抑制効果を証明している。
まず、C57BL/6Jマウスをランダムに分けた(いずれも雌性)。実験群をそれぞ
れ複合体158(5匹のマウス)及び比較複合体14で番号を付け(5匹のマウス)、P
BS対照群(8匹のマウス)に番号を付けた。全ての動物について、体重に応じて投与量
を算出し、それぞれ1mg/kg又は0.1mg/kgの異なる単回用量で皮下投与した
。投与体積は5ml/kgであった。異なる用量を得るために、複合体を0.2mg/m
l及び0.02mg/mlで0.9%塩化ナトリウム水溶液に溶解させた。薬剤投与後の
72hで動物を死亡させ、肝臓を回収し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし
、さらにでRNAVzol (VIGOROUS、lot:161G)で全RNA抽出の
標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
蛍光定量的リアルタイムPCRにより肝組織におけるTTR mRNAの発現レベルを
検出した。具体的には、Reverse Transcription System(
Promega、Lot#0000223677、REF:A3500)を用いてその説
明書により抽出された全RNAをcDNAに逆転写した。次に、蛍光定量的PCR器(A
BI Step One)によりsiRNAによる肝組織におけるmTTR mRNA発
現に対する抑制効率を検出した。当該検出方法では、GAPDH遺伝子を内因性参照遺伝
子とし、TTRに対するプライマー及びGAPDHに対するプライマーを用いてそれぞれ
mTTR及びGAPDHを検出した。
検出した。具体的には、Reverse Transcription System(
Promega、Lot#0000223677、REF:A3500)を用いてその説
明書により抽出された全RNAをcDNAに逆転写した。次に、蛍光定量的PCR器(A
BI Step One)によりsiRNAによる肝組織におけるmTTR mRNA発
現に対する抑制効率を検出した。当該検出方法では、GAPDH遺伝子を内因性参照遺伝
子とし、TTRに対するプライマー及びGAPDHに対するプライマーを用いてそれぞれ
mTTR及びGAPDHを検出した。
検出プライマーの配列については、表4を参照のこと。
当該リアルタイムPCR法では、mTTR mRNAの発現量は、TTR遺伝子発現残
量パーセントで表し、以下の等式により算出した。
TTR遺伝子発現残量=(試験群TTR遺伝子のコピー数/試験群GAPDHのコピー
数)/(対照群TTR遺伝子のコピー数/対照群GAPDHのコピー数)×100%
量パーセントで表し、以下の等式により算出した。
TTR遺伝子発現残量=(試験群TTR遺伝子のコピー数/試験群GAPDHのコピー
数)/(対照群TTR遺伝子のコピー数/対照群GAPDHのコピー数)×100%
その後、下式により複合体によるmRNAに対する抑制率を算出した。
mRNA抑制率=(1-TTR遺伝子発現残量)×100%
mRNA抑制率=(1-TTR遺伝子発現残量)×100%
対照群は、本実験においてPBSが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞ
れ異なるsiRNA複合体が施された投与群マウスであった。結果を表5に示した。
れ異なるsiRNA複合体が施された投与群マウスであった。結果を表5に示した。
結果から分かるように、用いられるsiRNA配列及び修飾はいずれも同じであるが、
複合体158による標的mRNAに対する抑制率は、比較複合体14よりも顕著に高かっ
た。
複合体158による標的mRNAに対する抑制率は、比較複合体14よりも顕著に高かっ
た。
以下の実験例5~実験例11において、siRNA標的位置及び配列関連性実験により
、表3Aから3FにおけるsiRNA複合体の性質と効果を検証した。
、表3Aから3FにおけるsiRNA複合体の性質と効果を検証した。
(実験例5)表3AのsiRNA複合体の効果を検証した実験
(実験例5-1)複合体26のオフターゲット効果を検証した実験
Kumico Ui-Tei et.al.,Functional dissect
ion of siRNA sequence by systematic DNA
substitution:modified siRNA with a DNA s
eed arm is a powerful tool for mammalian
gene silencing with significantly reduc
ed off-target effect. Nucleic Acids Rese
arch,2008.36(7),2136-2151に記載された方法により、検出プ
ラスミドを構築し、被検siRNA複合体とともにHEK293A細胞にコトランスフェ
クションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キットを用い、デュアルル
シフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。具体的な工程は以下のとおりで
ある。
(実験例5-1)複合体26のオフターゲット効果を検証した実験
Kumico Ui-Tei et.al.,Functional dissect
ion of siRNA sequence by systematic DNA
substitution:modified siRNA with a DNA s
eed arm is a powerful tool for mammalian
gene silencing with significantly reduc
ed off-target effect. Nucleic Acids Rese
arch,2008.36(7),2136-2151に記載された方法により、検出プ
ラスミドを構築し、被検siRNA複合体とともにHEK293A細胞にコトランスフェ
クションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キットを用い、デュアルル
シフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。具体的な工程は以下のとおりで
ある。
1、検出プラスミドの構築
psiCHECKTM-2(PromegaTM)プラスミドにより4つの組換えプラ
スミドを構築した。GSCMは、オンターゲットプラスミドを表し、PSCM、GSSM
、PSSMは、オフターゲットプラスミドを表す。
(1)GSCMは、被検複合体のアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと
完全に相補的な目的配列を含む。
(2)PSCMは、被検複合体のセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に
相補的な目的配列を含む。
(3)GSSMは、被検複合体のアンチセンス鎖の5’端から1~8位のヌクレオチド
配列と完全に相補的な目的配列を含む。被検複合体におけるアンチセンス鎖の5’端から
9~21位のヌクレオチド配列とその対応する目的配列とは、相補的にミスマッチした。
ミスマッチルールは、被検複合体のアンチセンス鎖の5’端から第9~21位の任意の位
置でのG、C、A又はUヌクレオチドが、それぞれ目的配列の対応する位置でヌクレオチ
ドT、A、C又はGとミスマッチしたことである。
(4)PSSMは、被検複合体のセンス鎖の5’端から1~8位のヌクレオチド配列と
完全に相補的な目的配列を含む。被検複合体におけるセンス鎖の5’端から9~21位の
ヌクレオチド配列とその対応する目的配列とは、相補的にミスマッチした。ミスマッチル
ールは、被検複合体のセンス鎖の5’端から第9~21位の任意の位置でのG、C、A又
はUヌクレオチドが、それぞれ目的配列の対応する位置でヌクレオチドT、A、C又はG
とミスマッチしたことである。
psiCHECKTM-2(PromegaTM)プラスミドにより4つの組換えプラ
スミドを構築した。GSCMは、オンターゲットプラスミドを表し、PSCM、GSSM
、PSSMは、オフターゲットプラスミドを表す。
(1)GSCMは、被検複合体のアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと
完全に相補的な目的配列を含む。
(2)PSCMは、被検複合体のセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に
相補的な目的配列を含む。
(3)GSSMは、被検複合体のアンチセンス鎖の5’端から1~8位のヌクレオチド
配列と完全に相補的な目的配列を含む。被検複合体におけるアンチセンス鎖の5’端から
9~21位のヌクレオチド配列とその対応する目的配列とは、相補的にミスマッチした。
ミスマッチルールは、被検複合体のアンチセンス鎖の5’端から第9~21位の任意の位
置でのG、C、A又はUヌクレオチドが、それぞれ目的配列の対応する位置でヌクレオチ
ドT、A、C又はGとミスマッチしたことである。
(4)PSSMは、被検複合体のセンス鎖の5’端から1~8位のヌクレオチド配列と
完全に相補的な目的配列を含む。被検複合体におけるセンス鎖の5’端から9~21位の
ヌクレオチド配列とその対応する目的配列とは、相補的にミスマッチした。ミスマッチル
ールは、被検複合体のセンス鎖の5’端から第9~21位の任意の位置でのG、C、A又
はUヌクレオチドが、それぞれ目的配列の対応する位置でヌクレオチドT、A、C又はG
とミスマッチしたことである。
目的配列をpsiCHECKTM-2プラスミドのXho I/Not I部位に嵌め
込んだ。
込んだ。
2、トランスフェクション
96ウェルプレートに、LipofectamineTM 2000(Invitro
gen)の使用説明書により、siRNAと、プラスミドごとにそれぞれ11群の一定の
濃度のsiRNAが対応している上記各プラスミドをコトランスフェクションした。具体
的には、プラスミドをウェルあたり10ngずつトランスフェクションし、ウェルずつ0
.2μLのLipofectamineTM 2000を用い、ウェルずつコトランスフ
ェクションされたsiRNAの最終濃度は、100nM~0.0001nM(4倍シリー
ズの希釈物)であり、1群あたり3個の複製ウェルがあった。
96ウェルプレートに、LipofectamineTM 2000(Invitro
gen)の使用説明書により、siRNAと、プラスミドごとにそれぞれ11群の一定の
濃度のsiRNAが対応している上記各プラスミドをコトランスフェクションした。具体
的には、プラスミドをウェルあたり10ngずつトランスフェクションし、ウェルずつ0
.2μLのLipofectamineTM 2000を用い、ウェルずつコトランスフ
ェクションされたsiRNAの最終濃度は、100nM~0.0001nM(4倍シリー
ズの希釈物)であり、1群あたり3個の複製ウェルがあった。
3、検出
24時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検
出キット(Dual luciferase reporter gene assay
kit、Promega社、cat.E2940)を用い、使用説明書によりHEK2
93A細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出し
た。各特定の濃度の試験群では、複合体処理なしを対照(con)とした。ホタルルシフ
ェラーゼタンパク質レベル(Fir)に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レ
ベル(Ren)で標準化(normalization)した。siRNAの異なる濃度
で測定された活性結果により、用量-効果曲線をプロットし、Graphad5.0ソフ
トウェアの関数log(Inhibitor)及び応答-変化傾きを用い、以下の式によ
り曲線モデリングを行った。
24時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検
出キット(Dual luciferase reporter gene assay
kit、Promega社、cat.E2940)を用い、使用説明書によりHEK2
93A細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出し
た。各特定の濃度の試験群では、複合体処理なしを対照(con)とした。ホタルルシフ
ェラーゼタンパク質レベル(Fir)に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レ
ベル(Ren)で標準化(normalization)した。siRNAの異なる濃度
で測定された活性結果により、用量-効果曲線をプロットし、Graphad5.0ソフ
トウェアの関数log(Inhibitor)及び応答-変化傾きを用い、以下の式によ
り曲線モデリングを行った。
Yは、残存mRNAの発現レベルであり、
Xは、トランスフェクションされたsiRNAの濃度の対数値であり、
Botは、定常期の最低のY値であり、
Topは、定常期の最高のY値であり、
LogIC50は、Yが定常期の最低と最高との間の半分である場合のX値であり、H
illSlopeは、曲線の傾きである。
用量効果曲線に基づいて算出することにより、GSCMに対応する被験複合体のIC5
0値を確定し、PSCM、GSSM又はPSSMと比較した。
0値を確定し、PSCM、GSSM又はPSSMと比較した。
複合体24については、結果を図12A~12Dに示し、GSCMに対応し、複合体2
4のIC50値を算出したところ、0.0019nMであり、PSCM、GSSM又はP
SSMに比べて、複合体24は、siRNAの各濃度でいずれも明らかな抑制作用がなく
、本開示のsiRNA複合体が体外で高い活性及び低いオフターゲット効果を有すること
が示された。
4のIC50値を算出したところ、0.0019nMであり、PSCM、GSSM又はP
SSMに比べて、複合体24は、siRNAの各濃度でいずれも明らかな抑制作用がなく
、本開示のsiRNA複合体が体外で高い活性及び低いオフターゲット効果を有すること
が示された。
(実験例5-2)本実験では、表3AにおけるsiRNA複合体の体内でのHBV m
RNA発現量に対する抑制効率を証明している
本実験例では、複合体16及び24によるHBVトランスジェニックマウスC57BL
/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/JにおけるHBV mRNA発現量に対す
る抑制効率を調べた。
RNA発現量に対する抑制効率を証明している
本実験例では、複合体16及び24によるHBVトランスジェニックマウスC57BL
/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/JにおけるHBV mRNA発現量に対す
る抑制効率を調べた。
まず、C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/Jマウスを血清HBs
Agの含有量別にランダムに分け(いずれも雌性、1群あたりマウス4匹)、それぞれ複
合体16及び複合体24で番号を付け、生理食塩水(NS)対照群を追加した。全ての動
物について、体重に応じて投与量を算出し、1mg/kgの単回用量を皮下に使用し、複
合体の濃度はそれぞれ0.9%塩化ナトリウム水溶液における0.2mg/ml及び0.
02mg/mlであり、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与後の14日目に動物
を死亡させ、肝臓を回収し、RNA Later(Sigma Aldrich)で保存
し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズした。さらにTrizolで全RNA抽
出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
Agの含有量別にランダムに分け(いずれも雌性、1群あたりマウス4匹)、それぞれ複
合体16及び複合体24で番号を付け、生理食塩水(NS)対照群を追加した。全ての動
物について、体重に応じて投与量を算出し、1mg/kgの単回用量を皮下に使用し、複
合体の濃度はそれぞれ0.9%塩化ナトリウム水溶液における0.2mg/ml及び0.
02mg/mlであり、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与後の14日目に動物
を死亡させ、肝臓を回収し、RNA Later(Sigma Aldrich)で保存
し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズした。さらにTrizolで全RNA抽
出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
蛍光定量的リアルタイムPCRにより肝組織におけるHBV mRNAの発現レベルを
検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega)を用い
てその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定量的PC
Rキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織におけるH
BV mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PCR法では、β-ア
クチン(β-actin)遺伝子を内因性参照遺伝子とし、HBVに対するプライマー及
びβ-アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれHBV及びβ-アクチンを検出した
。
検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega)を用い
てその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定量的PC
Rキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織におけるH
BV mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PCR法では、β-ア
クチン(β-actin)遺伝子を内因性参照遺伝子とし、HBVに対するプライマー及
びβ-アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれHBV及びβ-アクチンを検出した
。
検出プライマーの配列を表5Aに示した。
当該蛍光定量的PCR法では、HBV mRNAの発現量は、HBV遺伝子発現残量で
表され、以下の等式により算出した。
HBV遺伝子発現残量=(試験群HBV遺伝子のコピー数/試験群β-アクチンのコピ
ー数)/(対照群HBV遺伝子のコピー数/対照群β-アクチンのコピー数)×100%
。図において、HBV X/β-アクチンmRNA発現量と記している。
表され、以下の等式により算出した。
HBV遺伝子発現残量=(試験群HBV遺伝子のコピー数/試験群β-アクチンのコピ
ー数)/(対照群HBV遺伝子のコピー数/対照群β-アクチンのコピー数)×100%
。図において、HBV X/β-アクチンmRNA発現量と記している。
その後、下式により複合体によるmRNAに対する抑制率を算出した。
mRNAに対する抑制率=(1-HBV遺伝子発現残量)×100%
mRNAに対する抑制率=(1-HBV遺伝子発現残量)×100%
対照群は、本実験においてNSが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ
異なるsiRNA複合体が施された投与群マウスであった。結果を図13に示した。
異なるsiRNA複合体が施された投与群マウスであった。結果を図13に示した。
他の実験では、以下の条件で実験をさらに2回行った。
投与されるsiRNA複合体を複合体17、25、159及び160に変更して実験を
行い、7日目にデータを回収したこと以外は、上記と同じ方法を採用した。
行い、7日目にデータを回収したこと以外は、上記と同じ方法を採用した。
投与されるsiRNA複合体を複合体24、161、162及び163に変更して実験
を行い、28日目にデータを回収し、各複合体について、1mg/kg及び0.3mg/
kgの2つの用量で投与した(投与体積を変化させず、複合体溶液の濃度を相応に調整し
た)こと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果をそれぞれ図14~15に示した。
を行い、28日目にデータを回収し、各複合体について、1mg/kg及び0.3mg/
kgの2つの用量で投与した(投与体積を変化させず、複合体溶液の濃度を相応に調整し
た)こと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果をそれぞれ図14~15に示した。
上記結果から分かるように、試験時点の異なる複数回の実験では、全ての上記本開示の
複合体は、いずれも高いマウス体内HBV mRNA発現抑制活性を示した。
複合体は、いずれも高いマウス体内HBV mRNA発現抑制活性を示した。
(実験例5-3)本実験では、HBVトランスジェニックマウスにおいて、表3Aにお
ける、異なる複合分子を有するsiRNA複合体によるmRNAに対する抑制効果を証明
している
実験例4の方法により、44BriのHBVマウスにおいて、表5Aの検出配列をプラ
イマーとして複合体25、164、165及び166による標的mRNA抑制効率を検出
した。結果をそれぞれ表6Aに示した。
ける、異なる複合分子を有するsiRNA複合体によるmRNAに対する抑制効果を証明
している
実験例4の方法により、44BriのHBVマウスにおいて、表5Aの検出配列をプラ
イマーとして複合体25、164、165及び166による標的mRNA抑制効率を検出
した。結果をそれぞれ表6Aに示した。
表6Aから分かるように、本開示の各種の複合分子により形成されたsiRNA複合体
は、マウスの体内での優れた標的mRNA抑制効率を有する。
は、マウスの体内での優れた標的mRNA抑制効率を有する。
(実験例5-4)本実験では、HBVトランスジェニックマウスの血清において、表3
AにおけるsiRNA複合体によるHBsAg及びHBV DNAに対する抑制効率の時
間関連性試験を示している
AAV-HBVマウスモデルを用い、動物を成功にモデリングした後、血清中のHBs
Agの含有量別にランダムに分け(1群あたり5匹)、1群あたりそれぞれ複合体24、
25及び比較複合体15を投与し、NSをブランク対照として用いた。全ての動物につい
て、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量が3mg/kgであり、薬物を
0.6mg/mlの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積が5ml
/kgであった。薬剤投与前(D0と記した)及び薬剤投与後の7、14、21、28、
56、84、112、140、154、168、182日目にマウスに対して眼窩静脈叢
採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。その間、検出結果から、血清中
のHBsAgの含有量が初期値に近くなった、又はそれを超えた場合、当該対象の検出を
停止させた。
AにおけるsiRNA複合体によるHBsAg及びHBV DNAに対する抑制効率の時
間関連性試験を示している
AAV-HBVマウスモデルを用い、動物を成功にモデリングした後、血清中のHBs
Agの含有量別にランダムに分け(1群あたり5匹)、1群あたりそれぞれ複合体24、
25及び比較複合体15を投与し、NSをブランク対照として用いた。全ての動物につい
て、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量が3mg/kgであり、薬物を
0.6mg/mlの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積が5ml
/kgであった。薬剤投与前(D0と記した)及び薬剤投与後の7、14、21、28、
56、84、112、140、154、168、182日目にマウスに対して眼窩静脈叢
採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。その間、検出結果から、血清中
のHBsAgの含有量が初期値に近くなった、又はそれを超えた場合、当該対象の検出を
停止させた。
1回あたり約100μl眼窩採血し、遠心後の血清が20μl以上であった。HBsA
g CLIAキット(安図生物、CL0310)により血清中のHBsAgの発現レベル
を検出した。QIAamp 96 DNA Blood Kit説明書を参照して血清中
のDNAを抽出し、定量PCRを行い、HBV DNAの発現レベルを検出した。
g CLIAキット(安図生物、CL0310)により血清中のHBsAgの発現レベル
を検出した。QIAamp 96 DNA Blood Kit説明書を参照して血清中
のDNAを抽出し、定量PCRを行い、HBV DNAの発現レベルを検出した。
標準化されたHBsAgの発現レベル=(薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与
前のHBsAgの含有量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAg
の含有量)×100%。
ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBsAg当量
(UI)で表される。
前のHBsAgの含有量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAg
の含有量)×100%。
ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBsAg当量
(UI)で表される。
標準化されたHBV DNAの発現=(薬剤投与後のHBV DNAの含有量/薬剤投
与前のHBV DNAの含有量)×100%。
HBV DNA抑制率=(1-薬剤投与後のHBV DNAの含有量/薬剤投与前のH
BV DNAの含有量)×100%。
ここで、HBV DNA含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBV DN
Aのコピー数で表される。
与前のHBV DNAの含有量)×100%。
HBV DNA抑制率=(1-薬剤投与後のHBV DNAの含有量/薬剤投与前のH
BV DNAの含有量)×100%。
ここで、HBV DNA含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBV DN
Aのコピー数で表される。
結果を図16及び図17に示した。図16の結果から分かるように、NS陰性対照群は
、薬剤投与後の異なる時点でいかなる抑制作用も示さなかったのに対して、複合体24及
び25は、薬剤投与後の異なる時点でいずれも優れたHBsAg抑制効果を示した。特に
3mg/kgの用量で、複合体24は、最長140日間の期間にわたって常に高い血清中
のHBsAgの抑制率を示しており、HBV遺伝子の発現を長期間安定的で効果的に抑制
することができることを示した。
、薬剤投与後の異なる時点でいかなる抑制作用も示さなかったのに対して、複合体24及
び25は、薬剤投与後の異なる時点でいずれも優れたHBsAg抑制効果を示した。特に
3mg/kgの用量で、複合体24は、最長140日間の期間にわたって常に高い血清中
のHBsAgの抑制率を示しており、HBV遺伝子の発現を長期間安定的で効果的に抑制
することができることを示した。
図17の結果から分かるように、各実施例のsiRNA複合体は、同様に効率的なHB
V DNA発現抑制を示し、最長84日間の期間にわたって、いずれも高い抑制率を維持
した。
V DNA発現抑制を示し、最長84日間の期間にわたって、いずれも高い抑制率を維持
した。
それに対して、比較複合体15は、最初の28日間で各実施例において類似のmRNA
抑制効果を実現したが、その以降、抑制効果が明らかに低下し、図16及び図17に示さ
れる抑制効果の持続時間は、同じ用量レベルでの複合体24及び25に比べて明らかに短
かった。
抑制効果を実現したが、その以降、抑制効果が明らかに低下し、図16及び図17に示さ
れる抑制効果の持続時間は、同じ用量レベルでの複合体24及び25に比べて明らかに短
かった。
以下の点以外は上記と同じ方法によりさらに実験を4回行い、血清HBsAgを検出し
た。
た。
AAV-HBV低濃度マウスモデルを採用し、複合体25を用いて、用量はそれぞれ3
mg/kg及び1mg/kgであり、対照群には生理食塩水NSを投与し、140日目ま
で試験を行った。結果を図18に示した。
mg/kg及び1mg/kgであり、対照群には生理食塩水NSを投与し、140日目ま
で試験を行った。結果を図18に示した。
M-Tgモデルを採用し、複合体17及び25を用いて、用量はそれぞれ3mg/kg
及び1mg/kgであり、対照群にはPBSを投与し、70日目まで試験を行った。結果
を図19に示した。
及び1mg/kgであり、対照群にはPBSを投与し、70日目まで試験を行った。結果
を図19に示した。
M-Tgモデルを採用し、複合体26の用量はそれぞれ5mg/kg、1mg/kg、
0.2mg/kgであり、比較複合体15の用量は5mg/kgであり、対照群にはPB
Sを投与し、78日目まで試験を行った。結果を図20に示した。
0.2mg/kgであり、比較複合体15の用量は5mg/kgであり、対照群にはPB
Sを投与し、78日目まで試験を行った。結果を図20に示した。
1.28copyモデルを採用し、複合体24を用いて、用量は3mg/kg及び1m
g/kgであり、210日目まで試験を行った。結果を図21に示した。
g/kgであり、210日目まで試験を行った。結果を図21に示した。
上記各種の用量については、各複合体を同じ用量体積で用いるとともに、相応に投与す
るために、複合体溶液の濃度を個別に調節した。
るために、複合体溶液の濃度を個別に調節した。
図18~21から分かるように、本開示のsiRNA複合体は、複数種の動物モデルに
おいて、いずれも持続的で効率的な血清HBsAg抑制効率を示し、規律的な用量依存性
を示した。
おいて、いずれも持続的で効率的な血清HBsAg抑制効率を示し、規律的な用量依存性
を示した。
(実験例6)表3B~3DにおけるsiRNA複合体の効果を検証した実験
(実験例6-1)複合体43、62及び78のオフターゲット効果試験
各複合体について、対応する複合体におけるsiRNAのアンチセンス鎖配列と完全に
相補的に対合する目的配列により、オンターゲットプラスミドGSCMを構築した。また
、それぞれ対応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列と完全に同じであって、対
応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列の1~8位と相補的に対合する、又は対
応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列の1~8位と同じ目的配列を用いて、オ
フターゲットプラスミドGSSM、PSCM及びPSSMを構築した。それ以外は、実験
例5-1に記載された方法に従い、複合体43、62及び78のオフターゲット効果をそ
れぞれ検証した。結果をそれぞれ図22~24に示した。図22~24の結果から分かる
ように、以上の全ての複合体は、標的mRNAに対して良好な抑制作用を有するだけでな
く、オフターゲット効果も低かった。
(実験例6-1)複合体43、62及び78のオフターゲット効果試験
各複合体について、対応する複合体におけるsiRNAのアンチセンス鎖配列と完全に
相補的に対合する目的配列により、オンターゲットプラスミドGSCMを構築した。また
、それぞれ対応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列と完全に同じであって、対
応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列の1~8位と相補的に対合する、又は対
応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列の1~8位と同じ目的配列を用いて、オ
フターゲットプラスミドGSSM、PSCM及びPSSMを構築した。それ以外は、実験
例5-1に記載された方法に従い、複合体43、62及び78のオフターゲット効果をそ
れぞれ検証した。結果をそれぞれ図22~24に示した。図22~24の結果から分かる
ように、以上の全ての複合体は、標的mRNAに対して良好な抑制作用を有するだけでな
く、オフターゲット効果も低かった。
(実験例6-2)本実験では、マウス体内で本開示の複合体によるHBV mRNA発
現に対する抑制効果を証明している
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J-Tg(Alb1H
BV)44Bri/Jにおいて複合体25、42、43、62及び78によるHBV m
RNA発現に対する抑制効率を調べた。
現に対する抑制効果を証明している
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J-Tg(Alb1H
BV)44Bri/Jにおいて複合体25、42、43、62及び78によるHBV m
RNA発現に対する抑制効率を調べた。
まず、C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/Jマウスを血清HBs
Agの含有量別にランダムに分け(いずれも雌性、1群あたりマウス4匹)、それぞれ番
号を付け、NS群を対照群として追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を
算出した。それぞれ1mg/kg及び0.1ml/kgの用量で複合体25及び複合体4
2を皮下投与し、0.2mg/ml及び0.02mg/mlの複合体の0.9%塩化ナト
リウム水溶液として投与し、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与後の7日目に動
物を死亡させ、肝臓を回収し、RNA Later(Sigma Aldrich)で保
存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズした。その後、Trizolで全RN
A抽出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
Agの含有量別にランダムに分け(いずれも雌性、1群あたりマウス4匹)、それぞれ番
号を付け、NS群を対照群として追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を
算出した。それぞれ1mg/kg及び0.1ml/kgの用量で複合体25及び複合体4
2を皮下投与し、0.2mg/ml及び0.02mg/mlの複合体の0.9%塩化ナト
リウム水溶液として投与し、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与後の7日目に動
物を死亡させ、肝臓を回収し、RNA Later(Sigma Aldrich)で保
存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズした。その後、Trizolで全RN
A抽出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
蛍光定量的リアルタイムPCRにより肝組織におけるHBV mRNAの発現レベルを
検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega)を用い
てその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定量的PC
Rキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織におけるH
BV mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PCR法では、β-ア
クチン(β-actin)遺伝子を内因性参照遺伝子とし、HBVに対するプライマー及
びβ-アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれHBV及びβ-アクチンを検出した
。
検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega)を用い
てその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定量的PC
Rキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織におけるH
BV mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PCR法では、β-ア
クチン(β-actin)遺伝子を内因性参照遺伝子とし、HBVに対するプライマー及
びβ-アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれHBV及びβ-アクチンを検出した
。
検出プライマーの配列を表5Aに示した。
当該蛍光定量的PCR法では、HBV mRNAの発現量及び複合体によるmRNAに
対する抑制率の算出方法は、実験例5-2と同じである。
対する抑制率の算出方法は、実験例5-2と同じである。
対照群は、本実験においてNSが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ
異なるsiRNA複合体が施された投与群マウスであった。結果を図25に示した。
異なるsiRNA複合体が施された投与群マウスであった。結果を図25に示した。
他の実験において、以下の条件でさらに実験を2回行った。
投与されるsiRNA複合体を複合体43、62、78及び25に変更して実験を行い
、7日目に検出データを回収したこと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果を図26
に示した。
、7日目に検出データを回収したこと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果を図26
に示した。
投与されるsiRNA複合体を複合体42、43及び25に変更して実験を行い、複合
体42及び25について、それぞれ1mg/kg及び0.1mg/kg(ここで、用量体
積を変化させず、複合体溶液の濃度をそれぞれ調整した)の用量で投与し、検出に用いた
プライマー配列を表5Bに示される配列に変更したこと以外は、上記と同じ方法を採用し
た。結果を図27に示した。
体42及び25について、それぞれ1mg/kg及び0.1mg/kg(ここで、用量体
積を変化させず、複合体溶液の濃度をそれぞれ調整した)の用量で投与し、検出に用いた
プライマー配列を表5Bに示される配列に変更したこと以外は、上記と同じ方法を採用し
た。結果を図27に示した。
図26及び図27から分かるように、全ての上記本開示の複合体は、マウス体内でのH
BV mRNA発現に対していずれも高い抑制活性を有する。異なるHBV mRNAに
対する抑制効果はほぼ一致した。
BV mRNA発現に対していずれも高い抑制活性を有する。異なるHBV mRNAに
対する抑制効果はほぼ一致した。
(実験例6-3)本実験では、HBVトランスジェニックマウスの血清において、表3
BにおけるsiRNA複合体によるHBsAg発現及びHBV DNAに対する抑制効率
の時間関連性試験を示している
AAV-HBV低濃度モデルマウスを用いた。動物モデルの構築に成功した後、血清中
のHBsAgの含有量別にランダムに分けた(1群あたりマウス5匹)。1群あたりそれ
ぞれ複合体43を投与し、PBSをブランク対照として用いた。全ての動物について、体
重に応じて投与量を算出した。皮下に単回投与し、用量は3mg/kg又は1mg/kg
の2つのグループであり、使用濃度はそれぞれ0.6mg/ml又は0.2mg/mlの
複合体の0.9%塩化ナトリウム水溶液であり、投与体積は5ml/kgであった。薬剤
投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、56、84、112、126及び140日
目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。
BにおけるsiRNA複合体によるHBsAg発現及びHBV DNAに対する抑制効率
の時間関連性試験を示している
AAV-HBV低濃度モデルマウスを用いた。動物モデルの構築に成功した後、血清中
のHBsAgの含有量別にランダムに分けた(1群あたりマウス5匹)。1群あたりそれ
ぞれ複合体43を投与し、PBSをブランク対照として用いた。全ての動物について、体
重に応じて投与量を算出した。皮下に単回投与し、用量は3mg/kg又は1mg/kg
の2つのグループであり、使用濃度はそれぞれ0.6mg/ml又は0.2mg/mlの
複合体の0.9%塩化ナトリウム水溶液であり、投与体積は5ml/kgであった。薬剤
投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、56、84、112、126及び140日
目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。
1回あたり約100μl眼窩採血し、遠心後の血清は20μl以上であった。HBsA
g CLIAキット(安図生物、CL0310)により血清中のHBsAgの含有量を検
出した。
g CLIAキット(安図生物、CL0310)により血清中のHBsAgの含有量を検
出した。
標準化されたHBsAgの発現=(薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のH
BsAgの含有量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAg
の含有量)×100%。ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あ
たりのHBsAg当量(UI)で表される。
BsAgの含有量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAg
の含有量)×100%。ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あ
たりのHBsAg当量(UI)で表される。
結果を図28に示した。図28の結果から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、
NS陰性対照群が抑制作用を示していないのに対して、複合体43は、薬剤投与後の異な
る時点でいずれも優れたHBsAg抑制効果を示し、最長100日間の期間にわたって高
い血清HBsAg抑制率を示し続け、HBV遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制
することができることを示した。
NS陰性対照群が抑制作用を示していないのに対して、複合体43は、薬剤投与後の異な
る時点でいずれも優れたHBsAg抑制効果を示し、最長100日間の期間にわたって高
い血清HBsAg抑制率を示し続け、HBV遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制
することができることを示した。
さらなる実験では、上記方法により、M-Tgモデルマウスにおいて、複合体24、6
2及び78をそれぞれ3mg/kg及び1mg/kgの用量で投与し、使用濃度が0.6
mg/ml又は0.2mg/mlの複合体の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液であり、
投与体積は5ml/kgであった。試験を85日目まで行った。結果を図29及び30に
示した。
2及び78をそれぞれ3mg/kg及び1mg/kgの用量で投与し、使用濃度が0.6
mg/ml又は0.2mg/mlの複合体の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液であり、
投与体積は5ml/kgであった。試験を85日目まで行った。結果を図29及び30に
示した。
図29の結果から分かるように、複合体24、62及び78は、いずれも最長85日間
の長期間にわたる有効な血清HBsAg抑制効果を示した。図30から分かるように、薬
剤投与後の85日目に、3mg/kg用量群の複合体24及び78は、それぞれ68.6
%及び62%のHBV mRNA抑制率を示した。
の長期間にわたる有効な血清HBsAg抑制効果を示した。図30から分かるように、薬
剤投与後の85日目に、3mg/kg用量群の複合体24及び78は、それぞれ68.6
%及び62%のHBV mRNA抑制率を示した。
さらなる実験では、上記方法により、1.28copyモデルマウスにおいて、それぞ
れ3mg/kg及び1mg/kgの用量で複合体43を用い、使用濃度がそれぞれ0.6
mg/ml又は0.2mg/mlの複合体の0.9%塩化ナトリウム水溶液であり、投与
体積が5ml/kgであり、試験を85日目まで行った。実験例5-4の方法によりHB
sAg及びHBV DNAの抑制効果を検出した。結果を図31及び32に示した。
れ3mg/kg及び1mg/kgの用量で複合体43を用い、使用濃度がそれぞれ0.6
mg/ml又は0.2mg/mlの複合体の0.9%塩化ナトリウム水溶液であり、投与
体積が5ml/kgであり、試験を85日目まで行った。実験例5-4の方法によりHB
sAg及びHBV DNAの抑制効果を検出した。結果を図31及び32に示した。
図31及び32の結果から分かるように、1.28copyマウスにおいて、本開示の
複合体43は、最長85日間の期間にわたってHBV発現及びHBV DNAに対する効
率的な抑制を示し続けた。
複合体43は、最長85日間の期間にわたってHBV発現及びHBV DNAに対する効
率的な抑制を示し続けた。
(実験例7)複合体167及び168の効果を検証した実験
(実験例7-1)本実験では、本開示のsiRNA複合体は、体外で高い活性を有する
とともに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
本実験例では、複合体168の体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性(
on-target activity)及びオフターゲット効果を調べた。具体的には
、複合体168が、完全マッチングした目的配列(そのヌクレオチド配列が複合体168
のアンチセンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的であり、又は一致している)又
はシード領域がマッチングした目的配列(そのヌクレオチド配列が複合体168のアンチ
センス鎖の1~8位のヌクレオチド配列と相補的であり、又は一致している)を標的する
活性を測定した。
(実験例7-1)本実験では、本開示のsiRNA複合体は、体外で高い活性を有する
とともに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
本実験例では、複合体168の体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性(
on-target activity)及びオフターゲット効果を調べた。具体的には
、複合体168が、完全マッチングした目的配列(そのヌクレオチド配列が複合体168
のアンチセンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的であり、又は一致している)又
はシード領域がマッチングした目的配列(そのヌクレオチド配列が複合体168のアンチ
センス鎖の1~8位のヌクレオチド配列と相補的であり、又は一致している)を標的する
活性を測定した。
複合体168におけるsiRNAのアンチセンス鎖の配列と完全に相補的な目的配列を
用いてオンターゲットプラスミドGSCMを構築し、複合体168におけるsiRNAの
アンチセンス鎖配列と完全に同じ目的配列、複合体168におけるsiRNAのアンチセ
ンス鎖配列の1~8位と相補的に対合する目的配列、又は複合体168におけるsiRN
Aのアンチセンス鎖配列の1~8位と同じ目的配列を用い、それぞれオフターゲットプラ
スミドGSSM、PSCM及びPSSMを構築したこと以外は、実験例5-1の方法によ
り、複合体168を検証した。実験結果から分かるように、上記の全ての複合体は、標的
mRNAに対して高い抑制作用を有するだけでなく(IC50=0.0513nM)、低
いオフターゲット効果をさらに示した。
用いてオンターゲットプラスミドGSCMを構築し、複合体168におけるsiRNAの
アンチセンス鎖配列と完全に同じ目的配列、複合体168におけるsiRNAのアンチセ
ンス鎖配列の1~8位と相補的に対合する目的配列、又は複合体168におけるsiRN
Aのアンチセンス鎖配列の1~8位と同じ目的配列を用い、それぞれオフターゲットプラ
スミドGSSM、PSCM及びPSSMを構築したこと以外は、実験例5-1の方法によ
り、複合体168を検証した。実験結果から分かるように、上記の全ての複合体は、標的
mRNAに対して高い抑制作用を有するだけでなく(IC50=0.0513nM)、低
いオフターゲット効果をさらに示した。
(実験例7-2)本実験では、本開示のsiRNA複合体のリソソーム溶解液における
体外安定性を証明している
調製例1で得られた複合体167及び比較配列1(siRNA濃度として計算し、それ
ぞれ20μMの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液であり、1群あたり6μl、比較配列
1をNCと記した)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)
、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのマウス由来のリソソーム溶解液(Xen
otech Inc.から購入、番号R0610LT、最終濃度は0.2mU/μL)と
均一に混合して37℃で恒温培養した。0、1、2、4、6、24時間の各時点でそれぞ
れ5μlの試料を取り出し、それぞれ15μLの9M尿素水溶液に加えて変性させ、直ち
に-80℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、使用に備えた。0時間は、siRNA複合体をリ
ソソーム溶解液と均一に混合した後、直ちに取り出した試験の時点を表す。同時に、複合
体167及び比較配列1に対して、それぞれ等モル量のsiRNA(20μM、1.5μ
l)を7.5μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH 5.0)及び1μLの脱イオン水
と均一に混合し、さらに30μlの9M尿素水溶液に加えて変性させ、次に、8μLの6
×試料負荷緩衝液(20mMのEDTA水溶液、36重量%グリセリン、0.06重量%
ブロムフェノールブルー)と均一に混合し、直ちに-80℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、
反応をクエンチングした。これにより、リソソーム溶解液で処理されていない被験サンプ
ル(電気泳動図においてMと記している)を作製した。16重量%の非変性ポリアクリル
アミドゲルを配合した。20μLの各試験に用いたサンプルをゲルに負荷し、80mAの
定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを1×Sybr Gold染
料(Invitrogen、Cat.11494)で15分間染色した後にイメージング
を行った。結果を図33に示した。
体外安定性を証明している
調製例1で得られた複合体167及び比較配列1(siRNA濃度として計算し、それ
ぞれ20μMの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液であり、1群あたり6μl、比較配列
1をNCと記した)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)
、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのマウス由来のリソソーム溶解液(Xen
otech Inc.から購入、番号R0610LT、最終濃度は0.2mU/μL)と
均一に混合して37℃で恒温培養した。0、1、2、4、6、24時間の各時点でそれぞ
れ5μlの試料を取り出し、それぞれ15μLの9M尿素水溶液に加えて変性させ、直ち
に-80℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、使用に備えた。0時間は、siRNA複合体をリ
ソソーム溶解液と均一に混合した後、直ちに取り出した試験の時点を表す。同時に、複合
体167及び比較配列1に対して、それぞれ等モル量のsiRNA(20μM、1.5μ
l)を7.5μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH 5.0)及び1μLの脱イオン水
と均一に混合し、さらに30μlの9M尿素水溶液に加えて変性させ、次に、8μLの6
×試料負荷緩衝液(20mMのEDTA水溶液、36重量%グリセリン、0.06重量%
ブロムフェノールブルー)と均一に混合し、直ちに-80℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、
反応をクエンチングした。これにより、リソソーム溶解液で処理されていない被験サンプ
ル(電気泳動図においてMと記している)を作製した。16重量%の非変性ポリアクリル
アミドゲルを配合した。20μLの各試験に用いたサンプルをゲルに負荷し、80mAの
定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを1×Sybr Gold染
料(Invitrogen、Cat.11494)で15分間染色した後にイメージング
を行った。結果を図33に示した。
ヒト由来のリソソーム溶解液の代わりにマウス由来のリソソーム溶解液(Rat Li
ver Tritosomes、Xenotech Inc.から購入、番号R0610
.LT、最終濃度0.2mU/μL)を用いたこと以外は、同じ方法により複合体167
及び比較配列1(図34においてNCと記している)におけるマウス由来のリソソーム溶
解液の安定性を測定した。結果を図34に示した。
ver Tritosomes、Xenotech Inc.から購入、番号R0610
.LT、最終濃度0.2mU/μL)を用いたこと以外は、同じ方法により複合体167
及び比較配列1(図34においてNCと記している)におけるマウス由来のリソソーム溶
解液の安定性を測定した。結果を図34に示した。
図33及び34から、本開示の複合体は、ヒト由来のリソソーム溶解液及びマウス由来
のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定性を示し、少なくとも24時間
分解されずに維持できることを示した。
のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定性を示し、少なくとも24時間
分解されずに維持できることを示した。
(実験例7-3)本実験では、本開示の複合体のマウス体内でのHBV mRNA発現
に対する抑制効率を証明している
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J-Tg(Alb1H
BV)44Bri/Jにおいて、複合体167及び複合体168のsiRNA複合体によ
るHBV mRNA発現に対する抑制効率を調べた。
に対する抑制効率を証明している
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J-Tg(Alb1H
BV)44Bri/Jにおいて、複合体167及び複合体168のsiRNA複合体によ
るHBV mRNA発現に対する抑制効率を調べた。
まず、C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/Jマウスを血清中のH
BsAgの含有量別にランダムに分け(いずれも雌性、1群あたりマウス5匹)、それぞ
れPBS及び複合体167、複合体168を投与した。ここで、PBS群では、各動物の
皮下に5ml/kgの1×PBSを投与し、複合体167又は複合体168に対して、単
回皮下投与し、それぞれの用量は1mg/kgであり、複合体が0.2mg/ml濃度の
0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は5ml/kgであった。薬剤
投与後の28日目に全ての動物を死亡させた。肝臓を回収し、RNA Later(Si
gma Aldrich)で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さ
らにTrizolで全RNA抽出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
BsAgの含有量別にランダムに分け(いずれも雌性、1群あたりマウス5匹)、それぞ
れPBS及び複合体167、複合体168を投与した。ここで、PBS群では、各動物の
皮下に5ml/kgの1×PBSを投与し、複合体167又は複合体168に対して、単
回皮下投与し、それぞれの用量は1mg/kgであり、複合体が0.2mg/ml濃度の
0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は5ml/kgであった。薬剤
投与後の28日目に全ての動物を死亡させた。肝臓を回収し、RNA Later(Si
gma Aldrich)で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さ
らにTrizolで全RNA抽出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
蛍光定量的リアルタイムPCRにより肝組織におけるHBV mRNAの発現レベルを
検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega)を用い
てその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定量的PC
Rキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織におけるH
BV mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PCR法では、β-ア
クチン(β-actin)遺伝子を内因性参照遺伝子とし、HBVに対するプライマー及
びβ-アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれHBV及びβ-アクチンを検出した
。
検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega)を用い
てその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定量的PC
Rキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織におけるH
BV mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PCR法では、β-ア
クチン(β-actin)遺伝子を内因性参照遺伝子とし、HBVに対するプライマー及
びβ-アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれHBV及びβ-アクチンを検出した
。
検出プライマーの配列を表5Gに示した。
当該蛍光定量的PCR法では、HBV mRNAの発現量及び複合体によるmRNAに
対する抑制率の算出方法は、実験例5-2と同じであった。結果を以下の表6Gに示した
。
対する抑制率の算出方法は、実験例5-2と同じであった。結果を以下の表6Gに示した
。
他の実験では、複合体167及び168で検出するための投与されるsiRNA複合体
を置換し、用量を変化させたこと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果を以下の表6
Gに示した。
を置換し、用量を変化させたこと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果を以下の表6
Gに示した。
上記結果から分かるように、本開示の全ての複合体は、いずれも高いマウス体内でのH
BV mRNA発現抑制活性を示した。本開示のsiRNA複合体は、体内送達効率が良
好であることも示された。
BV mRNA発現抑制活性を示した。本開示のsiRNA複合体は、体内送達効率が良
好であることも示された。
(実験例7-4)本実験では、HBVトランスジェニックマウスの血清において、表3
BにおけるsiRNA複合体によるHBsAg及びHBV DNA発現量に対する抑制効
率の時間関連性試験を示している
1.28copyモデルにおいて、これらのマウスをランダムに分けた(1群あたりマ
ウス6匹、雌雄各半分)。各群にそれぞれ生理食塩水及び異なる用量の複合体168を投
与した。生理食塩水群に5ml/kgの生理食塩水を皮下注射した。複合体群に対して、
全ての動物について、体重に応じて投与量を算出した。皮下に単回投与し、用量はそれぞ
れ3mg/kg又は1mg/kgであり、複合体がそれぞれ0.6mg/ml又は0.2
mg/mlの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は5ml/k
gであった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、13、21、28、42、56、70、84
、98、112、126、140及び154日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い
、各時点で血清HBsAg、HBeAg及びHBV DNAレベルを検出した。
BにおけるsiRNA複合体によるHBsAg及びHBV DNA発現量に対する抑制効
率の時間関連性試験を示している
1.28copyモデルにおいて、これらのマウスをランダムに分けた(1群あたりマ
ウス6匹、雌雄各半分)。各群にそれぞれ生理食塩水及び異なる用量の複合体168を投
与した。生理食塩水群に5ml/kgの生理食塩水を皮下注射した。複合体群に対して、
全ての動物について、体重に応じて投与量を算出した。皮下に単回投与し、用量はそれぞ
れ3mg/kg又は1mg/kgであり、複合体がそれぞれ0.6mg/ml又は0.2
mg/mlの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は5ml/k
gであった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、13、21、28、42、56、70、84
、98、112、126、140及び154日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い
、各時点で血清HBsAg、HBeAg及びHBV DNAレベルを検出した。
1回あたり約100μl眼窩採血し、遠心後の血清は20μl以上であった。HBsA
g CLIAキット(安図生物、CL0310)により血清中のHBsAgの含有量を検
出し、HBeAg CLIAキット(安図生物、CL0310)により血清中のHBeA
gの含有量を検出し、QIAamp 96 DNA Blood Kitの説明書を参照
して血清中のDNAを抽出し、定量PCRを行い、HBV DNAの発現レベルを検出し
た。
g CLIAキット(安図生物、CL0310)により血清中のHBsAgの含有量を検
出し、HBeAg CLIAキット(安図生物、CL0310)により血清中のHBeA
gの含有量を検出し、QIAamp 96 DNA Blood Kitの説明書を参照
して血清中のDNAを抽出し、定量PCRを行い、HBV DNAの発現レベルを検出し
た。
標準化されたHBsAgの発現=(薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のH
BsAgの含有量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAg
の含有量)×100%。ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あ
たりのHBsAg当量(UI)で表される。
BsAgの含有量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAg
の含有量)×100%。ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あ
たりのHBsAg当量(UI)で表される。
標準化されたHBeAgの発現=(薬剤投与後のHBeAgの含有量/薬剤投与前のH
BeAgの含有量)×100%。
HBeAg抑制率=(1-薬剤投与後のHBeAgの含有量/薬剤投与前のHBeAg
の含有量)×100%。ここで、HBeAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あ
たりのHBeAg当量(UI)で表される。
BeAgの含有量)×100%。
HBeAg抑制率=(1-薬剤投与後のHBeAgの含有量/薬剤投与前のHBeAg
の含有量)×100%。ここで、HBeAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あ
たりのHBeAg当量(UI)で表される。
標準化されたHBV DNAの発現=(薬剤投与後のHBV DNAの含有量/薬剤投
与前のHBV DNAの含有量)×100%。
HBV DNA抑制率=(1-薬剤投与後のHBV DNAの含有量/薬剤投与前のH
BV DNAの含有量)×100%。
ここで、HBV DNAの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBV D
NAのコピー数で表される。
与前のHBV DNAの含有量)×100%。
HBV DNA抑制率=(1-薬剤投与後のHBV DNAの含有量/薬剤投与前のH
BV DNAの含有量)×100%。
ここで、HBV DNAの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBV D
NAのコピー数で表される。
結果を図35~37に示した。図35から分かるように、生理食塩水が施された陰性対
照群は、薬剤投与後の異なる時点で抑制作用を示しなかったのに対して、複合体168は
、薬剤投与後の異なる時点で、いずれもHBsAgに対して優れたHBsAg抑制効果を
示した。特に、3mg/kg群は、最長100日間の期間にわたって常に90%以上の血
清HBsAg抑制率を示し、HBV遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制すること
ができることを示した。
照群は、薬剤投与後の異なる時点で抑制作用を示しなかったのに対して、複合体168は
、薬剤投与後の異なる時点で、いずれもHBsAgに対して優れたHBsAg抑制効果を
示した。特に、3mg/kg群は、最長100日間の期間にわたって常に90%以上の血
清HBsAg抑制率を示し、HBV遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制すること
ができることを示した。
図36から分かるように、siRNA複合体は同様にHBeAgの発現を抑制でき、3
mg/kg用量群は、最長70日間にわたって、血清HBeAgの発現に対する抑制率が
常に50%以上であった。
mg/kg用量群は、最長70日間にわたって、血清HBeAgの発現に対する抑制率が
常に50%以上であった。
図37の結果から分かるように、siRNA複合体は、HBV DNAの発現を効率よ
く抑制し、最長154日間の期間にわたって常に高い抑制率を維持することもできた。
く抑制し、最長154日間の期間にわたって常に高い抑制率を維持することもできた。
(実験例8)表3EにおけるsiRNA複合体の効果を検証した実験
(実験例8-1)本実験では、表3EにおけるsiRNA複合体の体内でのANGPT
L3 mRNA発現量の抑制効率に対する影響について説明している
本実験例では、複合体105、109、111及び115による正常BALB/cマウ
スの肝臓組織におけるANGPTL3 mRNAに対する抑制率を調べた。
(実験例8-1)本実験では、表3EにおけるsiRNA複合体の体内でのANGPT
L3 mRNA発現量の抑制効率に対する影響について説明している
本実験例では、複合体105、109、111及び115による正常BALB/cマウ
スの肝臓組織におけるANGPTL3 mRNAに対する抑制率を調べた。
正常BALB/cマウス(6~8週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入)
をランダムに分け(1群あたり5匹)、それぞれ各群のマウスに複合体105、109、
111、115及びPBSを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出
し、皮下注射により単回投与し、siRNA複合体の用量は(siRNAの量として)3
mg/kg及び0.3mg/kgであり、複合体がそれぞれ0.3mg/ml及び0.0
3mg/ml濃度の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は10
mL/kgであった。薬剤投与後の14日目及び28日目にそれぞれ1つのバッチのマウ
スを死亡させ、肝臓を回収し、RNA Later(Sigma Aldrich)で保
存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにTrizol(Therm
o Fisher社)で全RNA抽出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
をランダムに分け(1群あたり5匹)、それぞれ各群のマウスに複合体105、109、
111、115及びPBSを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出
し、皮下注射により単回投与し、siRNA複合体の用量は(siRNAの量として)3
mg/kg及び0.3mg/kgであり、複合体がそれぞれ0.3mg/ml及び0.0
3mg/ml濃度の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は10
mL/kgであった。薬剤投与後の14日目及び28日目にそれぞれ1つのバッチのマウ
スを死亡させ、肝臓を回収し、RNA Later(Sigma Aldrich)で保
存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにTrizol(Therm
o Fisher社)で全RNA抽出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
蛍光定量的リアルタイムPCRにより肝組織におけるANGPTL3 mRNAの発現
レベルを検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega
)を用いてその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定
量的PCRキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織に
おけるANGPTL3 mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PC
R法では、GAPDH遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ANGPTL3に対するプライマ
ー及びGAPDHに対するプライマーを用いてそれぞれANGPTL3及びGAPDHを
検出した。
レベルを検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega
)を用いてその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定
量的PCRキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織に
おけるANGPTL3 mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PC
R法では、GAPDH遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ANGPTL3に対するプライマ
ー及びGAPDHに対するプライマーを用いてそれぞれANGPTL3及びGAPDHを
検出した。
検出プライマーの配列を表5Eに示した。
ANGPTL3 mRNAの発現量は、ANGPTL3 mRNA発現量=(試験群A
NGPTL3 mRNAの発現量/試験群GAPDH mRNAの発現量)/(対照群A
NGPTL3 mRNAの発現量/対照群GAPDH mRNAの発現量)×100%と
いう等式により算出した。
NGPTL3 mRNAの発現量/試験群GAPDH mRNAの発現量)/(対照群A
NGPTL3 mRNAの発現量/対照群GAPDH mRNAの発現量)×100%と
いう等式により算出した。
複合体のANGPTL3 mRNA発現量に対する抑制率は、ANGPTL3 mRN
A発現量抑制率=[1-(試験群ANGPTL3 mRNAの発現量/試験群GAPDH
mRNAの発現量)/(対照群ANGPTL3 mRNAの発現量/対照群GAPDH
mRNAの発現量)]×100%という等式により算出した。対照群は、本実験におい
てPBSが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるsiRNA複合体
が施された投与群マウスであった。結果を図38Aと38Bに示した。
A発現量抑制率=[1-(試験群ANGPTL3 mRNAの発現量/試験群GAPDH
mRNAの発現量)/(対照群ANGPTL3 mRNAの発現量/対照群GAPDH
mRNAの発現量)]×100%という等式により算出した。対照群は、本実験におい
てPBSが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるsiRNA複合体
が施された投与群マウスであった。結果を図38Aと38Bに示した。
図38Aと38Bの結果から明らかなように、上記siRNA複合体は、いずれも優れ
たANGPTL3 mRNA発現抑制活性を示した。
たANGPTL3 mRNA発現抑制活性を示した。
上記実験対象の眼窩から採取された血液(約100μl)を遠心して血清を得、さらに
PM1P000/3全自動血清生化学分析装置(SABA、イタリア)を用いて血清中の
総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)の含有量を検出し、脂質結果を
標準化処理し、脂質レベルの抑制率は、抑制率=(1-薬剤投与後の試験群における脂質
の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)×100%という等式により算出
した。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。検出結果を図39Aと39
Bに示した。
PM1P000/3全自動血清生化学分析装置(SABA、イタリア)を用いて血清中の
総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)の含有量を検出し、脂質結果を
標準化処理し、脂質レベルの抑制率は、抑制率=(1-薬剤投与後の試験群における脂質
の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)×100%という等式により算出
した。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。検出結果を図39Aと39
Bに示した。
図39Aと39Bの結果から分かるように、異なる用量の複合体105、109、11
1及び115で治療されたマウスの血清においてCHOとTGの含有量は明らかに低下し
ており、かつ、少なくとも薬剤投与後の28日間、脂質レベルの低下が認められた。
1及び115で治療されたマウスの血清においてCHOとTGの含有量は明らかに低下し
ており、かつ、少なくとも薬剤投与後の28日間、脂質レベルの低下が認められた。
(実験例8-2)本開示のsiRNA複合体による脂質に対する影響
Tg(APOC3)3707Bresモデルマウスに対して、TG含有量>2mmol
/Lとしてランダムに分け(1群あたりマウス5匹)、複合体115、及びPBSブラン
ク対照を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し
、用量は3mg/kg又は1mg/kgであり、複合体をそれぞれ0.6mg/ml及び
0.2mg/ml濃度の0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積は5ml
/kgであった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、35、56、70、
84、98、112、126、140、154及び168日目にマウスの眼窩から採血し
、血清CHO及びTGレベルを検出した。
Tg(APOC3)3707Bresモデルマウスに対して、TG含有量>2mmol
/Lとしてランダムに分け(1群あたりマウス5匹)、複合体115、及びPBSブラン
ク対照を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し
、用量は3mg/kg又は1mg/kgであり、複合体をそれぞれ0.6mg/ml及び
0.2mg/ml濃度の0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積は5ml
/kgであった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、35、56、70、
84、98、112、126、140、154及び168日目にマウスの眼窩から採血し
、血清CHO及びTGレベルを検出した。
眼窩から1回あたり約0.1ml採血し、遠心後の血清は20μl以上であった。PM
1P000/3全自動血清生化学分析装置(SABA、イタリア)を用いて血清中の総コ
レステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)の含有量を検出した。
1P000/3全自動血清生化学分析装置(SABA、イタリア)を用いて血清中の総コ
レステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)の含有量を検出した。
脂質結果を標準化処理した。
標準化された脂質レベル=(薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量)。
脂質レベルの抑制率=(1-薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量)×100%。
標準化された脂質レベル=(薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量)。
脂質レベルの抑制率=(1-薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量)×100%。
結果を図40Aと40Bに示した。
図40Aと40Bから分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、複合体115は、最
長168日間の期間にわたってTG及びCHOを明らかに低下させる効果を有し、マウス
体内でのANGPTL3遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制できることを示した
。
長168日間の期間にわたってTG及びCHOを明らかに低下させる効果を有し、マウス
体内でのANGPTL3遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制できることを示した
。
他の実験において、ob/obモデルマウスを採用し、複合体111、複合体115及
び比較複合体16を単独で投与し、各複合体を3mg/kg及び1mg/kgでそれぞれ
投与し、薬剤投与後の0、7、14、21、28、35及び41日目にデータを採取した
こと以外は、上記と同じ方法を採用した。その結果を図41A~41Bに示した。
び比較複合体16を単独で投与し、各複合体を3mg/kg及び1mg/kgでそれぞれ
投与し、薬剤投与後の0、7、14、21、28、35及び41日目にデータを採取した
こと以外は、上記と同じ方法を採用した。その結果を図41A~41Bに示した。
図41A~41Bの結果から分かるように、本開示の複合体111及び115は、41
日間の期間にわたってob/obマウス体内の脂質レベルを持続的に低下させ、優れた抑
制活性を示すことができる。
日間の期間にわたってob/obマウス体内の脂質レベルを持続的に低下させ、優れた抑
制活性を示すことができる。
他の実験においては、複合体111及び比較複合体16を単独で投与し、各複合体を3
mg/kg及び1mg/kgでそれぞれ投与し、複合体がそれぞれ0.6mg/ml及び
0.2mg/ml濃度の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は
5ml/kgであり、薬剤投与後の0、7、14、21、28、35、42、56及び7
0日目にCHO値及びTG値を検出したこと以外は、上記と同じ実験方法を採用した。そ
の結果を図42A~42Dに示した。
mg/kg及び1mg/kgでそれぞれ投与し、複合体がそれぞれ0.6mg/ml及び
0.2mg/ml濃度の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は
5ml/kgであり、薬剤投与後の0、7、14、21、28、35、42、56及び7
0日目にCHO値及びTG値を検出したこと以外は、上記と同じ実験方法を採用した。そ
の結果を図42A~42Dに示した。
図42A~42Dから分かるように、本開示の複合体111は、70日間に脂質を持続
的に低下させることができ、同じ用量での比較複合体16よりも優れていた。
的に低下させることができ、同じ用量での比較複合体16よりも優れていた。
(実験例8-3)本実験では、表3Aにおいて異なる複合分子を有するsiRNA複合
体によるANGPTL3 mRNA発現に対する抑制効率及び非ヒト霊長類動物の脂質に
対する影響について説明している
メタボリックシンドロームに罹患したサル(全て雄性)に対して、12匹中、8匹が複
合体169を投与した実験群、4匹が複合体25を投与した対照群となるように分け、サ
ルの基礎データを測定して観察し、3週間にわたり1週間ごとに1回採血し、脂質レベル
(TG、CHO、HDL)を検出した。その後、複合体169及び複合体25(そのsi
RNAが、完全に関連していないmRNAを標的するため、比較複合体として用いられた
)を投与し、全ての動物について体重に応じて薬物用量を算出した。単回皮下注射し、用
量は9mg/kg(siRNA数として)であり、100mg/mlの0.9wt%Na
Clの水溶液として投与され、各投与部位の用量体積は2ml以下であった。薬剤投与前
と薬剤投与後の7、14、21、28、35日目に採血し、各時点で血清TG及びCHO
レベルを検出した。
体によるANGPTL3 mRNA発現に対する抑制効率及び非ヒト霊長類動物の脂質に
対する影響について説明している
メタボリックシンドロームに罹患したサル(全て雄性)に対して、12匹中、8匹が複
合体169を投与した実験群、4匹が複合体25を投与した対照群となるように分け、サ
ルの基礎データを測定して観察し、3週間にわたり1週間ごとに1回採血し、脂質レベル
(TG、CHO、HDL)を検出した。その後、複合体169及び複合体25(そのsi
RNAが、完全に関連していないmRNAを標的するため、比較複合体として用いられた
)を投与し、全ての動物について体重に応じて薬物用量を算出した。単回皮下注射し、用
量は9mg/kg(siRNA数として)であり、100mg/mlの0.9wt%Na
Clの水溶液として投与され、各投与部位の用量体積は2ml以下であった。薬剤投与前
と薬剤投与後の7、14、21、28、35日目に採血し、各時点で血清TG及びCHO
レベルを検出した。
脂質結果を標準化処理し、標準化された脂質レベル=(薬剤投与後の試験群における脂
質の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)である。
質の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)である。
脂質レベルの抑制率=(1-薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量)×100%。
薬剤投与前の試験群における脂質の含有量:薬剤投与前3週間の脂質の含有量の平均値
。図43Aと図43BにおいてD0と記している。
試験群における脂質の含有量)×100%。
薬剤投与前の試験群における脂質の含有量:薬剤投与前3週間の脂質の含有量の平均値
。図43Aと図43BにおいてD0と記している。
0日目(投与当日)及び28日目に肝穿刺生検を行って肝臓組織におけるANGPTL
3 mRNAの発現レベルを検出した。肝臓を回収し、RNA Later(Sigma
Aldrich)で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにT
rizol(Thermo Fisher社)で全RNA抽出の標準操作手順により抽出
して全RNAを得た。
3 mRNAの発現レベルを検出した。肝臓を回収し、RNA Later(Sigma
Aldrich)で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにT
rizol(Thermo Fisher社)で全RNA抽出の標準操作手順により抽出
して全RNAを得た。
蛍光定量的リアルタイムPCRにより肝組織におけるANGPTL3 mRNAの発現
レベルを検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega
社)を用いてその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光
定量的PCRキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織
におけるANGPTL3 mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的P
CR法では、GAPDH遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ANGPTL3に対するプライ
マー及びGAPDHに対するプライマーを用いてそれぞれANGPTL3及びGAPDH
を検出した。
レベルを検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega
社)を用いてその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光
定量的PCRキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織
におけるANGPTL3 mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的P
CR法では、GAPDH遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ANGPTL3に対するプライ
マー及びGAPDHに対するプライマーを用いてそれぞれANGPTL3及びGAPDH
を検出した。
検出プライマーの配列を表6Eに示した。
ANGPTL3 mRNAの発現量及びANGPTL3 mRNAに対する抑制率の算
出は、実験例8-1と同じであった。対照群は、本実験においてPBSが施された対照群
サルであり、試験群は、それぞれ異なるsiRNA複合体が施された投与群サルであった
。結果を図43A~43Cに示した。
出は、実験例8-1と同じであった。対照群は、本実験においてPBSが施された対照群
サルであり、試験群は、それぞれ異なるsiRNA複合体が施された投与群サルであった
。結果を図43A~43Cに示した。
図43A~43Cから分かるように、複合体169は、明らかなTG低下効果及びAN
GPTL3遺伝子の発現抑制を示し、薬剤投与後の28日目に82.7%のANGPTL
3遺伝子mRNAを低下させた。
GPTL3遺伝子の発現抑制を示し、薬剤投与後の28日目に82.7%のANGPTL
3遺伝子mRNAを低下させた。
(実験例9)表3FにおけるsiRNA複合体の効果の実験
(実験例9-1)本実験では、表3FにおけるsiRNA複合体の体内でのAPOC3
mRNA発現に対する抑制効率を証明している
本実験例では、複合体144のヒトAPOC3トランスジェニックマウス(B6、CB
A-Tg(APOC3)3707Bres/J、Jackson Labから購入され)
体内での肝臓組織におけるAPOC3発現レベルに対する抑制率を調べた。
(実験例9-1)本実験では、表3FにおけるsiRNA複合体の体内でのAPOC3
mRNA発現に対する抑制効率を証明している
本実験例では、複合体144のヒトAPOC3トランスジェニックマウス(B6、CB
A-Tg(APOC3)3707Bres/J、Jackson Labから購入され)
体内での肝臓組織におけるAPOC3発現レベルに対する抑制率を調べた。
ヒトAPOC3トランスジェニックマウス(6~8週齢、トリグリセリド>2mmol
/L)を1群あたりマウス5匹でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体144
及び複合体25(そのsiRNAが、完全に関連していないmRNAを標的するため、比
較複合体として用いられた)を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算
出し、単回皮下投与し、siRNA複合体の用量は(siRNAの量として)それぞれ1
mg/kg及び0.1mg/kgであり、複合体がそれぞれ0.2mg/ml及び0.0
2mg/ml濃度の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は5m
L/kgであった。薬剤投与後の14日目にマウスを死亡させ、肝臓を回収し、RNA
Later(Sigma Aldrich)で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホ
モジナイズし、さらにTrizol(Thermo Fisher社)で全RNA抽出の
標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
/L)を1群あたりマウス5匹でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体144
及び複合体25(そのsiRNAが、完全に関連していないmRNAを標的するため、比
較複合体として用いられた)を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算
出し、単回皮下投与し、siRNA複合体の用量は(siRNAの量として)それぞれ1
mg/kg及び0.1mg/kgであり、複合体がそれぞれ0.2mg/ml及び0.0
2mg/ml濃度の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は5m
L/kgであった。薬剤投与後の14日目にマウスを死亡させ、肝臓を回収し、RNA
Later(Sigma Aldrich)で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホ
モジナイズし、さらにTrizol(Thermo Fisher社)で全RNA抽出の
標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
蛍光定量的リアルタイムPCRにより肝組織におけるAPOC3 mRNAの発現レベ
ルを検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega)を
用いてその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定量的
PCRキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織におけ
るAPOC3 mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PCR法では
、β-アクチン(β-actin)遺伝子を内因性参照遺伝子とし、APOC3に対する
プライマー及びβ-アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれAPOC3及びβ-ア
クチンを検出した。
ルを検出した。具体的には、ImProm-IITM逆転写キット(Promega)を
用いてその説明書により抽出した全RNAをcDNAに逆転写した。続いて、蛍光定量的
PCRキット(北京康為世紀生物科技有限公司)を用い、siRNAによる肝組織におけ
るAPOC3 mRNA発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的PCR法では
、β-アクチン(β-actin)遺伝子を内因性参照遺伝子とし、APOC3に対する
プライマー及びβ-アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれAPOC3及びβ-ア
クチンを検出した。
検出プライマーの配列を表7Fに示した。
APOC3 mRNA発現量は、APOC3 mRNA発現量=(試験群におけるAP
OC3 mRNAの発現量/試験群におけるβ-アクチンmRNAの発現量)/(対照群
におけるAPOC3 mRNAの発現量/対照群におけるβ-アクチンmRNAの発現量
)×100%という等式により算出した。
OC3 mRNAの発現量/試験群におけるβ-アクチンmRNAの発現量)/(対照群
におけるAPOC3 mRNAの発現量/対照群におけるβ-アクチンmRNAの発現量
)×100%という等式により算出した。
複合体によるAPOC3 mRNA発現量に対する抑制率は、抑制率=[1-(試験群
におけるAPOC3 mRNAの発現量/試験群におけるβ-アクチンmRNAの発現量
)/(対照群におけるAPOC3 mRNAの発現量/対照群におけるβ-アクチンmR
NAの発現量)]×100%という式により算出される。対照群は、本実験においてPB
Sが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるsiRNA複合体が施さ
れた投与群マウスであった。結果を図44Aに示した。
におけるAPOC3 mRNAの発現量/試験群におけるβ-アクチンmRNAの発現量
)/(対照群におけるAPOC3 mRNAの発現量/対照群におけるβ-アクチンmR
NAの発現量)]×100%という式により算出される。対照群は、本実験においてPB
Sが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるsiRNA複合体が施さ
れた投与群マウスであった。結果を図44Aに示した。
図44Aの結果から、複合体144は、トランスジェニックマウスにおけるヒトAPO
C3遺伝子に対して顕著な体内抑制活性を示すことが示された。
C3遺伝子に対して顕著な体内抑制活性を示すことが示された。
(実験例9-2)本実験では、実施例144のsiRNA複合体の体内での脂質含有量
に対する影響について説明している
本実験例では、実施例144のsiRNA複合体のヒトAPOC3トランスジェニック
マウス(B6、CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J、Jackson L
abから購入)体内での血清中総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)
含有量に対する影響を調べた。
に対する影響について説明している
本実験例では、実施例144のsiRNA複合体のヒトAPOC3トランスジェニック
マウス(B6、CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J、Jackson L
abから購入)体内での血清中総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)
含有量に対する影響を調べた。
ヒトAPOC3トランスジェニックマウス(6~8週齢、TG含有量>2mmol/L
)を、(1)NSコントロール群、(2)複合体144 3mg/kg群、(3)複合体
144 1mg/kg群にランダムに分けた(1群あたりマウス7匹)。全ての動物につ
いて、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、siRNA複合体がそれぞれ0.
6mg/ml及び0.2mg/ml濃度の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供
され、投与体積は5mL/kgであった。
)を、(1)NSコントロール群、(2)複合体144 3mg/kg群、(3)複合体
144 1mg/kg群にランダムに分けた(1群あたりマウス7匹)。全ての動物につ
いて、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、siRNA複合体がそれぞれ0.
6mg/ml及び0.2mg/ml濃度の0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供
され、投与体積は5mL/kgであった。
薬剤投与前(0日目と記す)、及び薬剤投与後の7、14、21、28、35、42、
49、63、77、91、112、133、147、154、161、175及び189
日目にそれぞれ眼窩採血(約100μL)を行い、遠心して血清を得た。さらにPM1P
000/3全自動血清生化学分析装置(SABA、イタリア)を用いて血清中の総コレス
テロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)の含有量を検出し、脂質結果を標準化処
理し、標準化された脂質レベル及び脂質レベルの抑制率の算出方法は、実験例8-3と同
じであった。検出結果を図44Bと44Cに示した。
49、63、77、91、112、133、147、154、161、175及び189
日目にそれぞれ眼窩採血(約100μL)を行い、遠心して血清を得た。さらにPM1P
000/3全自動血清生化学分析装置(SABA、イタリア)を用いて血清中の総コレス
テロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)の含有量を検出し、脂質結果を標準化処
理し、標準化された脂質レベル及び脂質レベルの抑制率の算出方法は、実験例8-3と同
じであった。検出結果を図44Bと44Cに示した。
図44Bと44Cから分かるように、実施例のsiRNA複合体は、最長189日間に
わたってTG及びCHOを明らかに低下させる効果を有し、ヒトAPOC3遺伝子の発現
を長期間安定的で効率的に抑制することができることを示した。
わたってTG及びCHOを明らかに低下させる効果を有し、ヒトAPOC3遺伝子の発現
を長期間安定的で効率的に抑制することができることを示した。
他の実験においては、投与複合体170を0.1mg/kg、0.3mg/kg、1m
g/kg、3mg/kg、9mg/kgでそれぞれ投与し(投与体積を変化させず、複合
体溶液の濃度を相応に調整した)、薬剤投与後の112日目にデータを採取したこと以外
は、上記と同じ方法を用いた。結果を図45Aと45Bに示した。
g/kg、3mg/kg、9mg/kgでそれぞれ投与し(投与体積を変化させず、複合
体溶液の濃度を相応に調整した)、薬剤投与後の112日目にデータを採取したこと以外
は、上記と同じ方法を用いた。結果を図45Aと45Bに示した。
図45Aと45Bの結果から分かるように、複合体170は、最長112日間の期間に
わたって、トランスジェニックマウス体内の脂質及びANGPTL3 mRNAレベルを
持続的に低下させることができ、当該低下効果は、明らかな用量依存効果を示している。
わたって、トランスジェニックマウス体内の脂質及びANGPTL3 mRNAレベルを
持続的に低下させることができ、当該低下効果は、明らかな用量依存効果を示している。
他の実験においては、複合体144、170、171及び比較複合体4を投与し、各複
合体を1mg/kg及び3mg/kgで投与し(投与体積を変化させず、複合体溶液の濃
度を相応に調整した)、薬剤投与後の112日目にデータを採取したこと以外は、上記と
同じ方法により、マウスの血清総コレステロール(CHO)及び総脂質(TG)を測定し
た。結果を図46A~図46Dに示した。
合体を1mg/kg及び3mg/kgで投与し(投与体積を変化させず、複合体溶液の濃
度を相応に調整した)、薬剤投与後の112日目にデータを採取したこと以外は、上記と
同じ方法により、マウスの血清総コレステロール(CHO)及び総脂質(TG)を測定し
た。結果を図46A~図46Dに示した。
図46A~図46Dの結果から分かるように、複合体144、170及び171は、最
長112日間の期間にわたって、いずれもトランスジェニックマウスにおける脂質に対す
る持続的な低下作用を示し、持続的な低下効果は、全体として比較複合体4よりも優れて
いた。
長112日間の期間にわたって、いずれもトランスジェニックマウスにおける脂質に対す
る持続的な低下作用を示し、持続的な低下効果は、全体として比較複合体4よりも優れて
いた。
以上に本開示の発明を実施するための形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形
態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段
に対して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本開示
の保護範囲に属する。
態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段
に対して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本開示
の保護範囲に属する。
説明すべきこととして、上記発明を実施するための形態に記載された各具体的な技術的
特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重
複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重
複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意の組合せで実施されることもでき、本開示
の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなす
べきである。
の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなす
べきである。
Claims (28)
- 式(1)に示される構造を有する化合物:
n1は1~3の整数であり、n3は0~4の整数であり、
各m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2~10の整数であり、
各R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1-C10アルキル基、C1-C10ハロゲン化アルキル基及びC1-C10アルコキシ基から選択され、
R3は機能的ヌクレオチドであり;
R2は、長さ1~20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニレン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロシクリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ又は複数で任意に置換され、R2は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基)、-NH(C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニル基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C10アルキル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-NHSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各L1は、独立して長さ1~70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニレン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロシクリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ又は複数で任意に置換され、L1は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキルフェニル基)、-NH(C1-C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニル基、-C(O)C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC(O)C1-C10アルキル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-NHSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各M1は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体(asialoglycoprotein receptor、ASGPR)と結合できるリガンドから選択される1つである。 - 各L1がA1~A26の基及びその任意の組合せからなる群から独立して選択される、請求項1に記載の複合体:
各j2は独立して1~20の整数であり、
各R’は独立してC1-C10アルキル基であり、
各Raは、A27~A45及びその任意の組合せからなる群から独立して選択され、
- L1が、A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13の基及びその結合の組合せからなる群から選択される、又は
L1が、A1、A4、A8、A10及びA11の基のうち少なくとも2つの結合の組合せである、請求項2に記載の複合体。 - L1の長さが3~25個の原子、又は4~15個の原子である、請求項1~3のいずれかに記載の複合体。
- m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2~5の整数である、又は、m1=m2=m3である、請求項1に記載の複合体。
- 各M1が独立して単糖、二糖、三糖又は多糖である、又は
各M1が、D-マンノピラノース、L-マンノピラノース、D-アラビノース、D-キシロフラノース、L-キシロフラノース、D-グルコース、L-グルコース、D-ガラクトース、L-ガラクトース、α-D-マンノフラノース、β-D-マンノフラノース、α-D-マンノピラノース、β-D-マンノピラノース、α-D-グルコピラノース、β-D-グルコピラノース、α-D-グルコフラノース、β-D-グルコフラノース、α-D-フルクトフラノース、α-D-フルクトピラノース、α-D-ガラクトピラノース、β-D-ガラクトピラノース、α-D-ガラクトフラノース、β-D-ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-トリフルオロアセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブチリルガラクトサミン、N-イソブチリルガラクトサミン、2-アミノ-3-O-[(R)-1-カルボキシエチル]-2-デオキシ-β-D-グルコピラノース、2-デオキシ-2-メチルアミノ-L-グルコピラノース、4,6-ジデオキシ-4-ホルムアミド-2,3-ジ-O-メチル-D-マンノピラノース、2-デオキシ-2-スルホアミノ-D-グルコピラノース、N-グリコリル-α-ノイラミン酸、5-チオ-β-D-グルコピラノース、メチル2,3,4-トリス-O-アセチル-1-チオ-6-O-トリチル-α-D-グルコピラノシド、4-チオ-β-D-ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7-テトラ-O-アセチル-2-デオキシ-1,5-ジチオ-α-D-グルコヘプトピラノシド、2,5-アンヒドロ-D-アロノニトリル、リボース、D-リボース、D-4-チオリボース、L-リボース及びL-4-チオリボースからなる群から独立して選択される、請求項1に記載の複合体。 - R3が、機能性オリゴヌクレオチドを含む、又は、R3が、式A59に示される構造を有する基である、請求項1に記載の複合体:
- R2が、R3におけるP原子とリン酸エステル結合を形成する、請求項7に記載の複合体。
- 式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)又は(22)に示される構造を有する、請求項1に記載の複合体:
- 前記機能性オリゴヌクレオチドが、低分子干渉RNA、マイクロRNA、抗マイクロRNA、マイクロRNA拮抗剤、マイクロRNA模倣物、デコイオリゴヌクレオチド、免疫刺激物、G-四重鎖、選択的スプライスバリアント、一本鎖RNA、アンチセンス核酸、核酸アプタマー、ステムループRNA、mRNA断片、活性化RNA又はDNAからなる群から選択される、請求項7に記載の複合体。
- 前記機能性オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドであり、式A59におけるP原子が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端に結合される、又は、
前記機能性オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、式A59におけるP原子が、前記センス鎖の3’末端に結合される、請求項10に記載の複合体。 - 前記siRNAにおける各ヌクレオチドが、独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記siRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖がヌクレオチド配列1を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列2を含み、前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2は、長さがいずれも19ヌクレオチドであり、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖相補領域を形成し、前記ヌクレオチド配列2が、標的mRNAにおけるヌクレオチド断片である第1のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で相補的であり、前記標的mRNAとは、肝細胞において異常に発現する遺伝子のmRNAを指す、請求項10に記載の複合体。
- 前記標的mRNAが、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV又はHCVに対応するmRNAである、請求項12に記載の複合体。
- 前記ヌクレオチド配列1と前記第1のヌクレオチド配列断片とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が3個以下であり、前記ヌクレオチド配列2とヌクレオチド配列Bとは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が3個以下であり、前記ヌクレオチド配列Bは、前記第1のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的なヌクレオチド配列である、請求項12に記載の複合体。
- 前記ヌクレオチド配列2と前記ヌクレオチド配列Bとの間のヌクレオチド差異が、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列2における1番目のヌクレオチドZ’の位置での差異を含む、請求項14に記載の複合体。
- 前記センス鎖がヌクレオチド配列3をさらに含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列4をさらに含み、前記ヌクレオチド配列3と前記ヌクレオチド配列4は、長さが等しく、いずれも1~4ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列3が前記ヌクレオチド配列1の5’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列4が前記ヌクレオチド配列2の3’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列4が第2のヌクレオチド配列断片と相補的であり、前記第2のヌクレオチド配列断片とは、標的mRNAにおいて前記第1のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列4と同じヌクレオチド配列を指し、前記ヌクレオチド配列3と前記ヌクレオチド配列4が、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項12に記載の複合体。
- 前記siRNAがヌクレオチド配列5をさらに含み、前記ヌクレオチド配列5は、長さが1~3ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の3’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の3’オーバーハング端を構成する、請求項12又は16に記載の複合体。
- 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、前記非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指し、ヌクレオチドアナログが、核酸におけるヌクレオチドを置換できる基であり、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドのいずれか1つとも異なる構造を有する、請求項12に記載の複合体。
- センス鎖及びアンチセンス鎖がいずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列1とヌクレオチド配列2に存在し、前記ヌクレオチド配列1におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが5個以下であり、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列1の第7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列2におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが7個以下であり、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列2の第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項18に記載の複合体。
- 各非フルオロ修飾ヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、前記ヌクレオチドにおいてリボース基の2’-ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項18に記載の複合体。
- 前記siRNAにおいて、少なくとも1つのリン酸エステル基は、チオリン酸エステルであり、前記チオリン酸エステルが、
前記センス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも1つに結合されて存在する、請求項12に記載の複合体。 - 前記アンチセンス鎖の5’末端のヌクレオチドが5’-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項12に記載の複合体。
- 必要のある被験体において、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患を治療するための治療薬であって、前記被験体に請求項1~22のいずれかに記載の複合体の有効量を投与する、治療薬。
- 前記特定の遺伝子が、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子及びアポリポタンパクC3遺伝子からなる群から選択される、請求項23に記載の治療薬。
- 前記疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維化、肝過形成性疾患及び脂質異常からなる群から選択される、請求項23に記載の治療薬。
- 前記脂質異常が高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項25に記載の治療薬。
- 肝細胞と接触させるための請求項1~22のいずれかに記載の複合体を含む、前記肝細胞における特定の遺伝子の発現抑制剤。
- 前記特定の遺伝子がApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV又はHCVである、請求項27に記載の発現抑制剤。
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