KR20240028502A - 핵산 리간드 및 이의 접합체, 및 이를 위한 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본원은 핵산 리간드 및 이의 접합체, 및 이를 위한 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는 리간드가 제공된다. 제공된 리간드는 핵산과의 결합을 통해 우수한 발현 억제 효과를 달성한다.
[화학식 I]
[화학식 I]
Description
본 개시내용은 리간드 및 이를 위한 제조 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 리간드와 핵산이 공유 결합으로 연결되어 형성된 핵산-리간드 접합체에 관한 것이다. 핵산-리간드 접합체의 전달은 간세포를 표적으로 하여 RNA 간섭 효과를 생성할 수 있다.
RNA 간섭은 유전자 발현을 침묵시키는 효과적인 방법이다. 통계적으로 인간의 질병 관련 단백질 중 약 80% 이상이 약물로 치료할 수 없는 단백질인데, 이는 이들이 기존의 소분자 약물 및 생체거대분자 제제로는 표적화될 수 없기 때문이다. RNA 간섭 기술을 이용하면 이들 단백질의 mRNA 코딩에 따라 적절한 siRNA를 고안하여 표적 mRNA를 특이적으로 표적화하고 분해하여 관련 단백질의 생성을 억제할 수 있다. 따라서 siRNA는 약물 개발에 매우 중요한 전망을 가지고 있다. 그러나 생체내에서 치료적 RNA 간섭 효과를 얻으려면 siRNA 분자를 생체내 특정 세포에 전달할 필요가 있다.
약물을 전달하는 효과적인 방법 중 하나는 siRNA를 표적 리간드와 접합시켜 표적 리간드가 세포막 표면의 수용체 분자에 결합하는 방식으로 세포내이입을 통해 세포에 들어갈 수 있도록 하는 것이다. 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(ASGPR: asialoglycoprotein receptor)는 간세포에 의해 특이적으로 발현되는 수용체이며, 간세포 표면에서는 풍부하고 빠른 세포내 및 세포외 변형을 특징으로 한다. 갈락토스, 갈락토사민 및 N-아세틸갈락토사민과 같은 단당류 및 다당류 분자는 ASGPR에 대해 높은 친화성을 갖는다. 문헌[위아뉴(Yuanyu H), 리앙 지카이(LIANG Zicai L), "아시알로당단백질 수용체 및 간 표적 약물 전달에서의 그의 적용(Asialoglycoprotein Receptor and Its Application in Liver-targeted Drug Delivery), Prog. Biochem. Biophys. 2015; 42(6)]에 따르면, 갈락토사민 클러스터(GalNAc)를 사용하여 RNA를 간세포에 효과적으로 전달할 수 있고; GalNAc 분자가 3가 또는 4가 클러스터로서 고안되면, 간세포를 표적으로 하는 1가 또는 2가 GalNAc 분자의 능력은 크게 향상될 수 있다.
다양한 클러스터 구조와 RNA와의 다양한 연결 방식은 siRNA의 생체내 활성에 큰 영향을 미친다. 활성이 더 높다는 것은 치료 효과가 더 우수하거나, 약제의 투여량이 더 적다는 것을 의미하며, 나아가 동등한 치료 효과를 달성하는 약제 투여량이 낮다는 것은 독성이 낮다는 것을 의미한다. 따라서, 표적화 리간드와 siRNA 사이의 합리적인 공유 결합을 고안하는 것은 매우 중요하다.
본 발명은 GalNAc 분자가 RNA에 연결된 신규한 분자 구조를 제공하며, 이는 합성 구조가 단순하고 전달 활성 및 RNA 간섭 활성이 더 우수하다.
첫 번째 양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 I'로 표시되는 구조를 갖는 리간드를 제공한다:
[화학식 I']
상기 식에서,
L1은 C1-C30 알킬 사슬, 또는 하나 이상의 산소, 황 또는 질소 원자 또는 C=O가 개재된 C1-C30 알킬 사슬이고;
R1 및 R2는 독립적으로 화학 결합, -NR6-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이며;
Q는 
이고;
R4는 독립적으로 CR9 또는 N이고;
고리 A는 존재하지 않거나, 또는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 고리 A가 존재하는 경우, R5는 독립적으로 CR9 또는 N이고; 고리 A가 존재하지 않는 경우, R5는 독립적으로 CR7R8, NR6 또는 O이고;
R6 및 R9는 독립적으로 수소, 중수소, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 또는 C(=O)NR'(R")이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C3-7 사이클로알킬, 3원 내지 12원 헤테로사이클릴, 5원 내지 12원 아릴, 5원 내지 12원 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 및 C(=O)NR'(R")로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 수소, 중수소, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 또는 C(=O)NR'(R")이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C3-7 사이클로알킬, 3원 내지 12원 헤테로사이클릴, 5원 내지 12원 아릴, 5원 내지 12원 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 및 C(=O)NR'(R")로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
R' 및 R"는 독립적으로 수소, 중수소, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되고:
m, n, p 및 q는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
B는 
이고;
Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-, -NHC(=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고;
z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
L2는 C1-C30 알킬 사슬, 또는 하나 이상의 산소, 황 또는 질소 원자 또는 C=O가 개재된 C1-C30 알킬 사슬이고;
G는 세포 수용체에 결합하는 표적화 작용부분이고;
r은 1 내지 10의 정수이다.
일부 실시양태에서, 특정 기는 다음과 같이 정의되고, 정의되지 않은 기는 이전 실시양태 중 어느 하나(이하 "일부 실시양태에서"라고 함)에 기재된 바와 같고; L1은 L3 또는 L3-R10-R11-L3일 수 있으며, 여기서 L3은 독립적으로 C1-C12 알킬 사슬, -(CH2)j1-C(=O)-(CH2)j2- 또는 -(CH2)j3-(CH2CH2O)1-4-(CH2)j4-이고; R10 및 R11은 독립적으로 화학 결합, -NR12-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이며; R12는 수소 또는 C1-C12 알킬이고; j1, j2, j3 및 j4는 독립적으로 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 2 또는 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 0, 1, 2, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수이다.
일부 실시양태에서, L1은 -(CH2)j1-C(=O)-(CH2)j2-일 수 있으며, 여기서 j1 및 j2는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, L1은 
일 수 있고, j1 및 j2는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같으며, 여기서 말단 a1은 B에 부착되고, 말단 b1은 R1에 부착된다.
일부 실시양태에서, L1은 
일 수 있으며, 여기서 말단 a1은 B에 부착되고, 말단 b1은 R1에 부착된다.
일부 실시양태에서, R1은 화학 결합일 수 있고 R2는 C=O일 수 있다.
일부 실시양태에서, R1은 화학 결합일 수 있고 R2는 NR6일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R1은 화학 결합일 수 있고 R2는 -OC(=O)-일 수 있다.
일부 실시양태에서, R1은 NR6일 수 있고 R2는 C=O일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R1은 NR6일 수 있고 R2는 -OC(=O)-일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R2는 NR6일 수 있고 R1은 C=O일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R2는 NR6일 수 있고 R1은 -OC(=O)-일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R6은 수소 또는 C1-6 알킬일 수 있다.
일부 실시양태에서, R6은 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필일 수 있다.
일부 실시양태에서, R6은 수소일 수 있다.
일부 실시양태에서, R7 및 R8은 수소일 수 있다.
일부 실시양태에서, R9는 수소일 수 있다.
일부 실시양태에서, 고리 A가 존재하는 경우, 고리 A는 C6-10 아릴, 바람직하게는 페닐일 수 있다.
일부 실시양태에서, m은 0 또는 1일 수 있다.
일부 실시양태에서, m은 3일 수 있다.
일부 실시양태에서, n은 0 또는 1일 수 있다.
일부 실시양태에서, p 및 q는 독립적으로 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, p = 1이고 q = 1이다.
일부 실시양태에서, p = 1이고 q = 0이다.
일부 실시양태에서, p = 0이고 q = 1이다.
일부 실시양태에서, p = 0이고 q = 0이다.
일부 실시양태에서, z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0 내지 4의 정수, 바람직하게는 0, 1 또는 2일 수 있다.
일부 실시양태에서, B는 
일 수 있으며, 여기서 Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4는 독립적으로 -C(=O)- 또는 -NHC(=O)-이고; N 원자는 L1에 부착되고; z1, z2, z3 및 z4는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, B는 
일 수 있으며, 여기서 Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4는 독립적으로 -C(=O)- 또는 -NHC(=O)-이고; N 원자는 L1에 부착되고; Rb1, Rb3 및 Rb4는 동일하고; z1, z2, z3 및 z4는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서 B는 
일 수 있다.
일부 실시양태에서 B는 
일 수 있다.
일부 실시양태에서, B는 
일 수 있으며, 여기서 Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고; N 원자는 L1에 부착되고; z5, z6, z7, z8 및 z9는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, B는 
일 수 있으며, 여기서 Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고; N 원자는 L1에 부착되고; Rb5, Rb6 및 Rb7은 동일하고; z5, z6, z7, z8 및 z9는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서 B는 
일 수 있다.
일부 실시양태에서, L2는 L4 또는 L4-R13-R14-L4일 수 있으며, 여기서 L4는 독립적으로 C1-C12 알킬 사슬 또는 -(CH2)j5-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j6-이고; R13 및 R14는 독립적으로 화학 결합, -NR15-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이며; R15는 독립적으로 수소 또는 C1-C12 알킬이고; j5 및 j6은 독립적으로 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 6, 더욱 바람직하게는 0, 1, 2, 3 또는 4의 정수이다.
일부 실시양태에서, L2는 -(CH2)j5-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j6-일 수 있으며, 여기서 j5 및 j6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, L2는 
일 수 있으며, 여기서 O 원자는 G에 부착되고 C 원자는 B에 부착되고; 바람직하게는 L2는 또는 이다.
일부 실시양태에서, L2는 일 수 있으며, 여기서 j6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같고; O 원자는 G에 부착되고 C 원자는 B에 부착된다.
일부 실시양태에서, L2는 
일 수 있으며, 여기서 O 원자는 G에 부착되고, C 원자는 B에 부착된다.
일부 실시양태에서, G는 아시알로당단백질 수용체 표적화 작용부분일 수 있다.
일부 실시양태에서, G는 갈락토스, 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민 또는 N-이소부티릴갈락토사민일 수 있다.
일부 실시양태에서, G는 
일 수 있다.
일부 실시양태에서, r은 3, 4, 5 또는 6이고, 예를 들어 3일 수 있다.
일부 실시양태에서, Q는 
, 바람직하게는 
일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5 및 n은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 , 바람직하게는 , 보다 바람직하게는 일 수 있으며, 여기서 p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서는 는 , 바람직하게는 , 보다 바람직하게는 이며, 여기서 p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
본 개시내용은 하기 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는 리간드를 제공한다:
[화학식 I]
상기 식에서,
L1은 C1-C30 알킬 사슬, 또는 하나 이상의 산소, 황 또는 질소 원자 또는 C=O가 개재된 C1-C30 알킬 사슬이고;
R1 및 R2는 독립적으로 화학 결합, -NR6-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이고;
Q는 이고;
는 단일 또는 이중 결합이고; 가 단일 결합인 경우, R3은 독립적으로 CR7R8, NR6, O 또는 S이고; 가 이중 결합인 경우, R3은 독립적으로 CR9 또는 N이고;
R4는 독립적으로 CR9 또는 N이고;
고리 A는 존재하지 않거나, 또는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 고리 A가 존재하는 경우, R5는 독립적으로 CR9 또는 N이고; 고리 A가 존재하지 않는 경우, R5는 독립적으로 CR7R8, NR6 또는 O이고;
R6 및 R9는 독립적으로 수소, 중수소, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 또는 C(=O)NR'(R")이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C3-7 사이클로알킬, 3원 내지 12원 헤테로사이클릴, 5원 내지 12원 아릴, 5원 내지 12원 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 및 C(=O)NR'(R")로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 수소, 중수소, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 또는 C(=O)NR'(R")이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C3-7 사이클로알킬, 3원 내지 12원 헤테로사이클릴, 5원 내지 12원 아릴, 5원 내지 12원 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 및 C(=O)NR'(R")로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
R' 및 R"는 독립적으로 수소, 중수소, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되고;
m, n, p 및 q는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
B는 이고;
Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-, -NHC(=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고;
z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
L2는 C1-C30 알킬 사슬, 또는 하나 이상의 산소, 황 또는 질소 원자 또는 C=O가 개재된 C1-C30 알킬 사슬이고;
r은 1 내지 10의 정수이다.
일부 실시양태에서, L1은 L3 또는 L3-R10-R11-L3일 수 있고, 여기서 L3은 독립적으로 C1-C12 알킬 사슬, -(CH2)j1-C(=O)-(CH2)j2- 또는 -(CH2)j3-(CH2CH2O)1-4-(CH2)j4-이고; R10 및 R11은 독립적으로 화학 결합, -NR12-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이며; R12는 수소 또는 C1-C12 알킬이고; j1, j2, j3 및 j4는 독립적으로 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 2 또는 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 0, 1, 2, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수이다.
일부 실시양태에서, L1은 -(CH2)j1-C(=O)-(CH2)j2-일 수 있으며, 여기서 j1 및 j2는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, L1은 일 수 있고, j1 및 j2는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같으며, 여기서 말단 a1은 B에 부착되고, 말단 b1은 R1에 부착된다.
일부 실시양태에서, L1은 일 수 있으며, 여기서 말단 a1은 B에 부착되고, 말단 b1은 R1에 부착된다.
일부 실시양태에서, R1은 화학 결합일 수 있고 R2는 C=O일 수 있다.
일부 실시양태에서, R1은 화학 결합일 수 있고 R2는 NR6일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R1은 화학 결합일 수 있고 R2는 -OC(=O)-일 수 있다.
일부 실시양태에서, R1은 NR6일 수 있고 R2는 C=O일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R1은 NR6일 수 있고 R2는 -OC(=O)-일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R2는 NR6일 수 있고 R1은 C=O일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R2는 NR6일 수 있고 R1은 -OC(=O)-일 수 있으며, 여기서 R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, R6은 수소 또는 C1-6 알킬일 수 있다.
일부 실시양태에서, R6은 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필일 수 있다.
일부 실시양태에서, R6은 수소일 수 있다.
일부 실시양태에서, R7 및 R8은 수소일 수 있다.
일부 실시양태에서, R9는 수소일 수 있다.
일부 실시양태에서, 고리 A가 존재하는 경우, 고리 A는 C6-10 아릴, 바람직하게는 페닐일 수 있다.
일부 실시양태에서, m은 0 또는 1일 수 있다.
일부 실시양태에서, m은 3일 수 있다.
일부 실시양태에서, n은 0 또는 1일 수 있다.
일부 실시양태에서, p 및 q는 독립적으로 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, p = 1이고 q = 1이다.
일부 실시양태에서, p = 1이고 q = 0이다.
일부 실시양태에서, p = 0이고 q = 1이다.
일부 실시양태에서, p = 0이고 q = 0이다.
일부 실시양태에서, z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0 내지 4의 정수, 바람직하게는 0, 1 또는 2일 수 있다.
일부 실시양태에서, B는 일 수 있으며, 여기서 Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4는 독립적으로 -C(=O)- 또는 -NHC(=O)-이고; N 원자는 L1에 부착되고; z1, z2, z3 및 z4는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다(예를 들어, , 여기서 말단 a2의 N 원자는 L1에 부착됨).
일부 실시양태에서, B는 일 수 있으며, 여기서 Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4는 독립적으로 -C(=O)- 또는 -NHC(=O)-이고; N 원자는 L1에 부착되고; Rb1, Rb3 및 Rb4는 동일하고; z1, z2, z3 및 z4는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다(예를 들어, , 여기서 말단 a2의 N 원자는 L1에 부착됨).
일부 실시양태에서, B는 (예를 들어 ), 여기서 말단 a2의 N 원자는 L1에 부착됨)일 수 있다.
일부 실시양태에서, B는 (예를 들어 , 여기서 말단 a2의 N 원자는 L1에 부착됨)일 수 있다.
일부 실시양태에서, B는 일 수 있으며, 여기서 Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고; N 원자는 L1에 부착되고; z5, z6, z7, z8 및 z9는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, B는 일 수 있으며, 여기서 Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고; N 원자는 L1에 부착되고; Rb5, Rb6 및 Rb7은 동일하고; z5, z6, z7, z8 및 z9는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, B는 일 수 있으며, 여기서 Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고; 말단 a2의 N 원자는 L1에 부착되고; z5, z6, z7, z8 및 z9는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, B는 일 수 있으며, 여기서 Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고; 말단 a2의 N 원자는 L1에 부착되고; Rb5, Rb6 및 Rb7은 동일하고; z5, z6, z7, z8 및 z9는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, B는 (예를 들어, )이고, 여기서 말단 a2의 N 원자는 L1에 부착됨)일 수 있다.
일부 실시양태에서, L2는 L4 또는 L4-R13-R14-L4일 수 있으며, 여기서 L4는 독립적으로 C1-C12 알킬 사슬 또는 -(CH2)j5-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j6-이고; R13 및 R14는 독립적으로 화학 결합, -NR15-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이며; R15는 독립적으로 수소 또는 C1-C12 알킬이고; j5 및 j6은 독립적으로 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 6, 더욱 바람직하게는 0, 1, 2, 3 또는 4의 정수이다.
일부 실시양태에서, L2는 -(CH2)j5-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j6-일 수 있으며, 여기서 j5 및 j6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, L2는 , 바람직하게는 일 수 있으며, 여기서 O 원자는 G에 부착되고 C 원자는 B에 부착된다.
일부 실시양태에서, L2는 C1-C12 알킬 사슬일 수 있다.
일부 실시양태에서, L2는 일 수 있다.
일부 실시양태에서, L2는 , 바람직하게는 , 보다 바람직하게는 일 수 있으며, 여기서 말단 a3은 O에 부착되고, 말단 b3은 B에 부착된다.
일부 실시양태에서, L2는 일 수 있으며, 여기서 말단 a3은 O에 부착되고, 말단 b3은 B에 부착된다.
일부 실시양태에서, L2는 일 수 있다.
일부 실시양태에서, r은 3, 4, 5 또는 6, 바람직하게는 3일 수 있다.
일부 실시양태에서, Q는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4 및 R5는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 
일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서 
는 
, 바람직하게는 
, 보다 바람직하게는 
일 수 있으며, 여기서 p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 
은 
일 수 있으며, 바람직하게는 
, 보다 바람직하게는 
일 수 있으며, 여기서 p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, -R1-R2-는 -C(=O)-NR6-일 수 있으며, 여기서 C 원자는 바람직하게는 L1에 부착되고, R6은 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, m은 1일 수 있다.
일부 실시양태에서, m은 1일 수 있고; 
는 
, 바람직하게는 
일 수 있고; p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 
는 
, 바람직하게는 
일 수 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는 다음 구조의 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
일부 실시양태에서, 리간드는 다음 구조의 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
일부 실시양태에서, 상기 리간드의 N-아세틸-갈락토사민 작용부분은 N-트리플루오로아세틸갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민 또는 N-이소부티릴갈락토사민으로 대체될 수 있다.
두 번째 양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 II'로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 II']
상기 식에서,
X는 하이드록시 보호기이고; Y는 수소, 중수소, 또는 이고;
j7은 1, 2, 3 또는 4이고;
W는 거대분자 화합물이고;
G는 세포 수용체에 결합하는 표적화 작용부분이고;
L1, R1, R2, Q, B, L2, m, p, q 및 r은 화학식 I'로 표시되는 구조를 갖는 리간드의 실시양태 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 하이드록시 보호기는 에스테르 기 보호기, 알콕시메틸 보호기, 알킬 보호기, 실릴 보호기 또는 아릴 보호기, 바람직하게는 아릴 보호기, 보다 바람직하게는 MMTr 및 DMTr일 수 있고, 더욱 바람직하게는 DMTr일 수 있다.
일부 실시양태에서, j7은 2일 수 있다.
일부 실시양태에서, G는 아시알로당단백질 수용체 표적화 작용부분일 수 있다.
일부 실시양태에서, G는 N-아세틸-갈락토사민 트리아세테이트, N-트리플루오로아세틸갈락토사민 트리아세테이트, N-프로피오닐갈락토사민 트리아세테이트, N-n-부티릴갈락토사민 트리아세테이트 또는 N-이소부티릴갈락토사민 트리아세테이트, 바람직하게는 N-아세틸-갈락토사민 트리아세테이트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 거대분자 화합물은 수지, 바람직하게는 거대다공성 수지, 보다 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지일 수 있다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, X, Y, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, X, Y, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 , 바람직하게는 , 더욱 바람직하게는 일 수 있으며, 여기서 X, Y, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 , 바람직하게는 , 보다 바람직하게는 일 수 있으며, 여기서 X, Y, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 수 있으며, 여기서 R3, R4, X, Y, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, X, Y, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 X, Y, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 X, Y, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식 II'-1, II'-2 또는 II'-3으로 표시되는 화합물일 수 있고;
[화학식 II'-1]
[화학식 II'-2]
[화학식 II'-3]
상기 식에서,
는 수지, 바람직하게는 거대다공성 수지, 더욱 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지이고; L1, R1, R2, Q, B, L2, G, m, p, q 및 r은 화학식 II'로 표시되는 화합물의 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
본 개시내용은 하기 화학식 II로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 II]
상기 식에서,
X는 하이드록시 보호기이고; Y는 수소, 중수소, 이고;
j7은 1, 2, 3 또는 4이고;
W는 거대분자 화합물이고;
L1, R1, R2, Q, B, L2, m, p, q 및 r은 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는 리간드의 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 하이드록시 보호기는 에스테르 기 보호기, 알콕시메틸 보호기, 알킬 보호기, 실릴 보호기 또는 아릴 보호기, 바람직하게는 아릴 보호기, 보다 바람직하게는 MMTr 및 DMTr, 더욱 바람직하게는 DMTr일 수 있다.
일부 실시양태에서, j7은 2일 수 있다.
일부 실시양태에서, 거대분자 화합물은 수지, 바람직하게는 거대다공성 수지, 보다 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지일 수 있다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, X, Y, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, R5, X, Y, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 바람직하게는 또는 , 보다 바람직하게는 일 수 있으며, 여기서 X, Y, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 바람직하게는 , 보다 바람직하게는 일 수 있으며, 여기서 X, Y, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, X, Y, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 R3, R4, X, Y, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 일 수 있으며, 여기서 X, Y, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 는 
일 수 있으며, 여기서 X, Y, n, p 및 q는 이전 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식 II-1, II-2 또는 II-3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 II-1]
[화학식 II-2]
[화학식 II-3]
상기 식에서,
는 수지, 바람직하게는 거대다공성 수지, 더욱 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지이고; L1, R1, R2, Q, B, L2, m, p, q 및 r은 화학식 II로 표시되는 화합물의 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 화합물은 다음 구조의 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
상기 식에서,
Y는 수소 또는 
이거나; 또는
Y는 이고, 여기서 는 수지, 바람직하게는 거대다공성 수지, 더욱 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지이다.
일부 실시양태에서, 화합물은 다음 구조의 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
상기 식에서,
Y는 수소 또는 
이거나; 또는
Y는 이고, 여기서 는 수지, 바람직하게는 거대다공성 수지, 보다 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지이다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 화합물 중 N-아세틸-갈락토사민 트리아세테이트 작용부분은 N-트리플루오로아세틸갈락토사민 트리아세테이트, N-프로피오닐갈락토사민 트리아세테이트, N-n-부티릴갈락토사민 트리아세테이트 또는 N-이소부티릴갈락토사민 트리아세테이트로 대체될 수 있다.
본 개시내용은 핵산 및 상기 기재된 하나 이상의 리간드를 포함하는 핵산-리간드 접합체를 제공하며, 여기서 리간드는 핵산의 말단에 접합되고, 리간드는 동일하거나 상이하다.
일부 실시양태에서, 핵산 및 리간드는 포스포에스테르 기, 포스포로티오에이트 기 또는 포스폰산 기에 의해 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산에는 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA(siRNA: short interfering RNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA: double-stranded RNA), 마이크로RNA(miRNA: microRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA: short hairpin RNA), 리보자임, 간섭 RNA 분자 및 다이서(Dicer) 효소 기질이 포함될 수 있지만 이에 국한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 핵산의 3' 말단은 리간드에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 단일 가닥 핵산일 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 가닥 핵산은 siRNA의 센스 가닥일 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 가닥 핵산은 siRNA의 안티센스 가닥일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 이중 가닥 핵산일 수 있다. 이중 가닥 핵산은 제1 가닥 핵산이 제2 가닥 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 포함할 수 있으며, 여기서:
(1) 제1 가닥 핵산의 어느 쪽 말단도 리간드에 접합되지 않거나; 제2 가닥 핵산의 5' 말단은 리간드에 접합되고, 3' 말단은 리간드에 접합되지 않거나; 제2 가닥 핵산의 3' 말단은 리간드에 접합되고, 5' 말단은 리간드에 접합되지 않거나; 또는 제2 가닥 핵산의 3' 말단과 5' 말단 둘 다 리간드에 접합되거나;
(2) 제2 가닥 핵산의 어느 쪽 말단도 리간드에 접합되지 않거나; 제1 가닥 핵산의 5' 말단은 리간드에 접합되고, 3' 말단은 리간드에 접합되지 않거나; 제1 가닥 핵산의 3' 말단은 리간드에 접합되고, 5' 말단은 리간드에 접합되지 않거나; 또는 제1 가닥 핵산의 3' 말단과 5' 말단 둘 다 리간드에 접합되거나;
(3) 제1 가닥 핵산과 제2 가닥 핵산의 5' 말단은 모두 리간드에 접합되고, 3' 말단은 모두 리간드에 접합되지 않거나; 제1 가닥 핵산과 제2 가닥 핵산의 3' 말단 둘 다 리간드에 접합되고, 5' 말단 모두 리간드에 접합되지 않거나; 제1 가닥 핵산과 제2 가닥 핵산의 3' 말단과 5' 말단 모두 리간드에 접합되거나; 제1 가닥 핵산의 3' 말단과 제2 가닥 핵산의 5' 말단이 모두 리간드에 접합되고, 제1 가닥 핵산의 5' 말단이나 제2 가닥 핵산의 3' 말단 모두 접합되지 않거나; 또는 제1 가닥 핵산의 5' 말단과 제2 가닥 핵산의 3' 말단이 모두 리간드에 접합되고, 제1 가닥 핵산의 3' 말단이나 제2 가닥 핵산의 5' 말단 모두 접합되지 않거나;
(4) 제1 가닥 핵산의 3' 말단과 5' 말단 모두 리간드에 접합되고, 제2 가닥 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 중 하나가 리간드에 접합되거나; 또는 제2 가닥 핵산의 3' 말단과 5' 말단 둘 다 리간드에 접합되고, 제1 가닥 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 중 하나가 리간드에 접합된다.
일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산은 siRNA일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산-리간드 접합체는 다음 구조의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염일 수 있다:
상기 식에서,
T는 상기 기재된 리간드이고, 각각의 T는 동일하거나 상이하고;
L5는 독립적으로 C1-C30 알킬 사슬, 또는 하나 이상의 산소, 황 또는 질소 원자 또는 C=O가 개재된 C1-C30 알킬 사슬이고;
M은 독립적으로 O 또는 S이고;
g는 독립적으로 0 내지 4의 정수이고;
일부 실시양태에서, L5는 
,또는 일 수 있다.
일부 실시양태에서, g는 0 또는 1일 수 있다.
일부 실시양태에서, g는 0일 수 있다.
일부 실시양태에서, M은 S일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산-리간드 접합체는 다음 구조의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 어느 하나일 수 있다:
일부 실시양태에서, 핵산-리간드 접합체는 다음 구조의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 어느 하나일 수 있다:
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 염은 당업계의 통상적인 염일 수 있고, 나트륨 염, 칼륨 염, 암모늄 염, 아민 염 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 핵산-리간드 접합체를 포함하는 RNAi 제제를 제공한다.
일부 실시양태에서, RNAi 제제에는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 다이서 기질이 포함될 수 있지만 이에 국한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, RNAi 제제는 siRNA일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 핵산-리간드 접합체 또는 상기 기재된 RNAi 제제, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어 담체, 비히클, 희석제 및/또는 전달 중합체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산-리간드 접합체 또는 RNAi 제제는 치료 유효량으로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물의 단위 용량은 0.001mg-1000mg일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산-리간드 접합체 또는 RNAi 제제는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01-99.99%, 또는 0.1-99.9%, 또는 0.5%-99.5%, 추가로 1%-99%, 더욱 추가로 2%%-98%의 양으로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01-99.99%, 또는 0.1-99.9%, 또는 0.5%-99.5%, 추가로 1%-99%, 더욱 추가로 2%-98%의 양으로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물이 표적 유전자 발현 세포와 접촉하는 경우, 예를 들어 psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시퍼라제 리포터 유전자 분석, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA) 기반 방법과 같은 다른 방법, 또는 단백질 기반 방법, 예컨대 면역형광 분석, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 유세포 분석으로 측정했을 때, 상기 기재된 핵산-리간드 접합체 또는 RNAi 제제는 표적 유전자 발현을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 억제한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 접합체, RNAi 제제 또는 조성물이 표적 유전자 발현 세포와 접촉하는 경우, 예를 들어 psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시퍼라제 리포터 유전자 분석, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA) 기반 방법과 같은 기타 방법, 또는 단백질 기반 방법, 예컨대 면역형광 분석, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 유세포 분석으로 측정했을 때, 상기 기재된 siRNA는 99% 이하, 95% 이하%, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 또는 10% 이하의 표적 유전자 mRNA 발현의 잔존 백분율을 초래한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 환자의 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 기재된 핵산-리간드 접합체, 상기 기재된 RNAi 제제 또는 상기 기재된 조성물의 용도를 제공한다. 질병은 바람직하게는 간원성(hepatogenic) 질환이다.
본 개시내용은 환자의 질병을 치료하기 위한 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물을 제공하며, 여기서 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물은 상기 기재된 바와 같다. 질병은 바람직하게는 간원성 질환이다.
본 개시내용은 환자에서 mRNA 발현을 억제하기 위한 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물을 제공하며, 여기서 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물은 상기 기재된 바와 같다.
본 개시내용은 발현 억제 올리고머 화합물을 생체내에서 간에 전달하기 위한 리간드, 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물을 제공하며, 여기서 리간드, 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물은 상기 기재된 바와 같다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 환자에게 상기 기재된 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 질병은 바람직하게는 간원성 질환이다. 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물은 치료 유효량으로 존재할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 환자에게 상기 기재된 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 mRNA 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물은 치료 유효량으로 존재할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 환자에게 상기 기재된 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 발현-억제 올리고머 화합물을 생체내에서 간에 전달하는 방법을 제공한다. 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물은 치료 유효량으로 존재할 수 있다.
본원에 개시된 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물 및 방법은 세포, 세포 그룹, 조직 또는 피험체에서 표적 mRNA의 수준을 감소시킬 수 있으며, 이는 피험체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 발현 억제 올리고머를 투여함을 포함한다. 발현 억제 올리고머는 리간드에 연결되어 피험체에서 표적 mRNA 발현을 억제한다. 리간드는 상기 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 피험체는 표적 세포 또는 조직에서 표적 유전자의 병원성 상향 조절을 갖는 것으로 이전에 확인되었다.
본 개시내용에 기재된 환자는 표적 mRNA 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 병태를 갖는 피험체를 지칭한다.
전달은 국소 투여(예: 직접 주사 또는 이식) 또는 전신 투여, 또는 경구, 직장 또는 비경구 경로를 통해 이루어질 수 있다. 비경구 경로에는 피하 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 경피 투여, 흡입 투여(예: 에어로졸), 점막 투여(예: 설하 또는 비강 투여), 두개내 투여 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물은 주사, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 십이지장내 또는 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 핵산-리간드 접합체, RNAi 제제 또는 조성물은 키트에 포장될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 핵산-리간드 접합체 또는 RNAi 제제를 포함하는 세포를 추가로 제공한다.
본 개시내용은 상기 화학식 II-3 또는 화학식 II'-3으로 표시되는 화합물을 출발 물질로 사용하는 단계; 및 뉴클레오시드 단량체를 뉴클레오티드가 배열되는 순서대로 3'-5' 방향으로 하나씩 부착시키는 단계를 포함하는 핵산-리간드 접합체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 단량체가 부착될 때마다 4가지 반응(탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 또는 황화)이 수반되고; 마지막 단량체가 부착된 후, 고체상 지지체에 부착된 핵산 서열은 절단, 탈보호, 정제, 탈염된 후 동결건조되어 핵산-리간드 접합체를 수득한다.
본 발명은 상기 기재된 화학식 II-2로 표시되는 화합물과 거대분자 화합물을 접합시켜 하기 화학식 II-3으로 표시되는 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 기재된 화학식 II-3으로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
상기 식에서,
L1, R1, R2, Q, B, L2, m, p, q, r 및 은 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 접합을 위한 조건 및 절차는 당업계의 통상적인 조건 및 절차일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 II-2로 표시되는 화합물은 상기 기재된 화학식 II-1로 표시되는 화합물을 알칼리 작용 하에 용매 중에서 무수 숙신산과 반응시켜 화학식 II-2로 표시되는 화합물을 제공함으로써 제조될 수 있다;
상기 식에서,
L1, R1, R2, Q, B, L2, m, p, q 및 r은 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 반응을 위한 조건 및 절차는 이러한 반응을 위한 당업계의 통상적인 조건 및 절차일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 II-1로 표시되는 화합물은 화학식 III으로 표시되는 화합물을 화학식 IV로 표시되는 화합물과 다음과 같이 반응시켜 화학식 II-1로 표시되는 화합물을 수득함으로써 제조될 수 있다:
상기 식에서,
L1, R1, R2, Q, B, L2, m, p, q 및 r은 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 반응을 위한 조건 및 절차는 이러한 반응에 대한 당업계의 통상적인 조건 및 절차일 수 있다.
본 개시내용은 화학식 III으로 표시되는 화합물과 화학식 IV로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 화학식 II-1로 표시되는 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 화학식 II-1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
상기 식에서,
L1, R1, R2, Q, B, L2, m, p, q 및 r은 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 반응을 위한 조건 및 절차는 이러한 반응에 대한 당업계의 통상적인 조건 및 절차일 수 있다.
용어 정의
본 개시내용이 특정 입체배열을 정의하지 않는 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 화합물은 특히 기하학적 또는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 개시내용은 시스 및 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)-거울상이성질체, (R)- 및 (S)-거울상이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 및 라세미 혼합물 및 이들의 다른 혼합물, 예를 들어 거울상이성질체적으로 또는 부분입체이성질체적으로 농축된 혼합물을 비롯한 모든 이러한 화합물을 고려하고, 이들 모두는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 추가적인 비대칭 탄소 원자가 알킬 기와 같은 치환기에 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 및 이들의 혼합물은 본 개시내용의 범주 내에 포함된다.
본 개시내용의 화합물 및 중간체는 또한 다양한 호변이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 형태는 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. "호변이성질체" 또는 "호변이성질체 형태"라는 용어는 낮은 에너지 장벽을 통해 상호전환될 수 있는 다양한 에너지의 구조적 이성질체를 지칭한다. 예를 들어, 양성자 호변이성질체(양성자 이동 호변이성질체라고도 함)는 케토-에놀 및 이민-에나민, 락탐-락팀 이성질체화와 같은 양성자 이동을 통한 상호전환을 포함한다. 락탐-락팀 평형의 예는 하기 제시된 바와 같이 A와 B 사이에 존재한다.
본 개시내용의 모든 화합물은 형태 A 또는 형태 B로 도출될 수 있다. 모든 호변이성질체 형태는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 화합물의 명명법은 어떠한 호변 이성질체도 배제하지 않는다.
본 개시내용의 화합물은 비대칭일 수 있고; 예를 들어, 화합물은 하나 이상의 입체이성질체를 갖는다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 입체이성질체에는 예를 들어 거울상이성질체 및 부분입체이성질체가 포함된다. 비대칭 탄소 원자를 함유하는 본 개시내용의 화합물은 광학 활성 순수 형태 또는 라세미 형태로 단리될 수 있다. 광학 활성 순수 형태는 라세미 혼합물로부터 단리되거나 키랄 출발 물질 또는 키랄 시약을 사용하여 합성될 수 있다.
광학 활성 (R)- 및 (S)-거울상이성질체, 그리고 D- 및 L-이성질체는 키랄 합성, 키랄 시약 또는 기타 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 개시내용의 특정 화합물의 하나의 거울상이성질체가 요망되는 경우, 이는 비대칭 합성 또는 키랄 보조제를 사용한 유도체화에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 생성된 부분입체 이성질체의 혼합물은 분리되고 보조 기는 절단되어 순수한 원하는 거울상이성질체를 제공한다. 대안적으로, 분자가 염기성 작용기(예: 아미노) 또는 산성 작용기(예: 카르복실)를 함유하는 경우, 부분입체이성질체의 염은 적절한 광학 활성 산 또는 염기에 의해 형성되고, 이어서 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 부분입체이성질체가 분할되고, 순수한 거울상이성질체는 회수를 통해 수득된다. 또한, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체의 분리는 일반적으로 키랄 정지상을 사용하고 선택적으로 화학적 유도체화(예를 들어 아민으로부터의 카르바메이트 형성)와 함께 크로마토그래피에 의해 달성된다.
본 개시내용은 본원에 언급된 바와 동일하지만 자연에서 일반적으로 발견되는 원자 질량 또는 질량수와 다른 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 하나 이상의 원자를 갖는 동위원소 표지된 화합물을 추가로 포함한다. 본 개시내용의 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예에는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소, 요오드 및 염소의 동위원소, 예컨대 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 123I, 125I 및 36Cl이 포함된다.
달리 명시하지 않는 한, 하나의 위치에 중수소(D)가 특별히 지정된 경우 해당 위치는 중수소의 자연적인 존재비(0.015%)보다 적어도 1000배 더 많은 존재비를 갖는 중수소로 해석되어야 한다(즉, 적어도 10% 중수소 혼입). 실시예의 화합물은 자연 존재비의 적어도 1000배, 자연 존재비의 적어도 2000배, 자연 존재비의 적어도 3000배, 자연 존재비의 적어도 4000배, 자연 존재비의 적어도 5000배, 자연 존재비의 적어도 6000배 또는 그 이상의 존재비를 갖는 중수소를 포함한다. 본 개시내용은 화학식 I의 화합물의 다양한 중수소화 형태를 추가로 포함한다. 탄소 원자에 연결된 각각의 이용 가능한 수소 원자는 독립적으로 중수소 원자로 대체될 수 있다. 당업자는 관련 문헌에 따라 화학식 I의 화합물의 중수소화 형태를 합성할 수 있다. 시판되는 중수소화 출발 물질은 화학식 I의 화합물의 중수소화 형태를 제조하는 데 사용될 수 있거나, 제한되지는 않지만 중수소화 보란, 테트라하이드로푸란 중 삼중수소화 보란, 중수소화 리튬 알루미늄 수소화물, 중수소화 요오도에탄, 중수소화 요오도메탄 등의 중수소화 시약에 의해 통상적인 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
"선택적으로" 또는 "선택적"은 이후 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만 필수적이지는 않고, 기재내용에는 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우가 포함된다는 의미이다. 예를 들어, "할로겐 또는 시아노로 선택적으로 치환된 C1-6 알킬"은 할로겐 또는 시아노가 존재할 수 있지만 필수적이지는 않음을 의미하며, 알킬이 할로겐 또는 시아노로 치환되는 경우 및 알킬이 할로겐이나 시아노로 치환되지 않은 경우를 포함한다.
본 개시내용의 화합물의 화학 구조에서 결합 
는 불특정한 입체배열을 나타내고; 즉, 화학 구조에 키랄 이성질체가 존재하는 경우 결합 는 
또는 
이거나 
및 
의 입체배열을 둘 다 포함할 수 있다. 상기 구조식 모두가 단순화를 위해 특정 이성질체 형태로 도시되었으나, 본 개시내용은 호변이성질체, 회전 이성질체, 기하 이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체 및 거울상이성질체와 같은 모든 이성질체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 화합물의 화학 구조에서, 결합 
은 입체배열을 특정하지 않고 - 즉, 결합 
의 입체배열은 E 입체배열 또는 Z 입체배열일 수 있거나, E 입체배열과 Z 입체배열을 둘 다 포함할 수 있다.
용어 "조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로 약학적으로 허용되는 염 또는 전구체 및 기타 화학 성분뿐만 아니라 생리학적으로 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제와 같은 기타 성분을 함유하는 약물의 혼합물을 지칭한다. 본 조성물은 유기체에 대한 투여를 촉진하여 활성 성분의 흡수를 용이하게 함으로써 생물학적 활성을 발휘하도록 의도된다.
"약학적으로 허용되는 부형제"라는 용어에는 미국 식품의약국(FDA: Food and Drug Administration)이 사람이나 가축에 허용하도록 승인한 임의의 보조제, 담체, 부형제, 유동화제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장성 제제, 용매 또는 유화제가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
달리 명시하지 않는 한, 본 개시내용의 "화합물", "리간드", "핵산-리간드 접합체" 및 "핵산"은 각각 독립적으로 염, 혼합 염 또는 비-염(예를 들어, 유리산 또는 유리 염기)의 형태로 존재할 수 있다. 염 또는 혼합 염의 형태로 존재하는 경우에, 이는 약학적으로 허용되는 염일 수 있다.
"약학적으로 허용되는 염"이라는 용어에는 약학적으로 허용되는 산 부가염 및 약학적으로 허용되는 염기 부가염이 포함된다.
"약학적으로 허용되는 산부가염"은 원치않는 영향 없이 유리 염기의 생물학적 유효성을 유지할 수 있고 무기산 또는 유기산에 의해 형성되는 염을 지칭한다. 무기산염에는 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 유기산염에는 포름산염, 아세트산염, 2,2-디클로로아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 프로피온산염, 카프론산염, 카프릴산염, 카프르산염, 운데센산염, 글리콜산염, 글루콘산염, 락트산염, 세박산염, 아디프산염, 글루타르산염, 말론산염, 옥살산염, 말레산염, 숙신산염, 푸마르산염, 주석산염, 시트르산염, 팔미트산염, 스테아르산염, 올레산염, 신남산염, 라우르산염, 말산염, 글루탐산염, 피로글루탐산염, 아스파르트산염, 벤조산염, 메실산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 알긴산염, 아스코르브산염, 살리실산염, 4-아미노살리실산염, 나파디실산염 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 이들 염은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
"약학적으로 허용되는 염기 부가염"은 원치않는 영향 없이 유리산의 생물학적 유효성을 유지할 수 있고 무기 염기 또는 유기 염기와 함께 형성되는 염을 지칭한다. 무기 염기로부터 유래된 염에는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 암모늄염, 칼슘염, 마그네슘염, 철염, 아연염, 구리염, 망간염, 알루미늄염 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 바람직한 무기염은 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 및 마그네슘염이고; 나트륨염이 바람직하다. 유기 염기로부터 유래된 염에는 1차, 2차 및 3차 아민, 자연 발생 치환 아민을 포함한 치환 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 암모니아, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디메틸에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등의 염이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 바람직한 유기 염기에는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이 포함된다. 이들 염은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
용어 "알킬"은 1 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 기인 포화 지방족 탄화수소 기를 지칭하고, 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 기, 보다 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 기, 더욱 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 기, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 기가다. 비제한적인 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 2급-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, n-헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 2,3-디메틸펜틸, 2,4-디메틸펜틸, 2,2-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, n-옥틸, 2,3-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실, 2,2-디메틸헥실, 3,3-디메틸헥실, 4,4-디메틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, 4-에틸헥실, 2-메틸-2-에틸펜틸, 2-메틸-3-에틸펜틸, n-노닐, 2-메틸-2-에틸헥실, 2-메틸-3-에틸헥실, 2,2-디에틸펜틸, n-데실, 3,3-디에틸헥실, 2,2-디에틸헥실 및 이들의 다양한 분지형 이성질체 등이 포함된다. 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 기가 더욱 바람직하고; 비제한적인 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 2급-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸 등이 포함된다. 알킬은 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환되는 경우 치환기는 접근 가능한 임의의 부착 지점에서 치환될 수 있으며, 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 설프하이드릴, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오, 헤테로사이클로알킬티오, 옥소, 카복실 및 카복실레이트 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이다.
"알킬렌"이라는 용어는 2개의 수소 원자가 제거된 후의 알칸 분자의 나머지 부분을 지칭하고, 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 선형 및 분지형 -일렌 기를 포함한다. 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬렌의 비제한적인 예에는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(예: -CH2CH2- 또는 -CH(CH3)-), 프로필렌(예: -CH2CH2CH2- 또는 -CH(CH2CH3)-) 및 부틸렌(예: -CH2CH2CH2CH2-)이 포함된다. 달리 명시하지 않는 한, 알킬렌은 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환되는 경우 치환기는 접근 가능한 임의의 부착 지점에서 치환될 수 있으며, 바람직하게는 중수소, 아릴, 헤테로아릴 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이다.
"사이클로알킬" 또는 "탄소환"이라는 용어는 포화되거나 부분적으로 불포화된, 단환식 또는 다환식 탄화수소 치환기를 지칭한다. 사이클로알킬 고리는 3 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 7개의 탄소 원자를 함유한다. 단환식 사이클로알킬의 비제한적인 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헥사디에닐 등이 포함된다. 다환식 사이클로알킬에는 스피로사이클로알킬, 융합된 사이클로알킬 및 가교화된 사이클로알킬이 포함된다. 사이클로알킬은 치환되거나 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기는 접근 가능한 임의의 부착 지점에서 치환될 수 있으며, 바람직하게는 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시, 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이고, 여기서 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
사이클로알킬 고리는 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 융합될 수 있으며, 여기서 모 구조에 부착된 고리는 사이클로알킬이고; 비제한적인 예에는 인다닐, 테트라하이드로나프틸, 벤조사이클로헵틸 등이 포함된다. 사이클로알킬은 선택적으로 치환되거나 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기는 바람직하게는 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이고, 여기서 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
용어 "헤테로사이클로알킬" 또는 "헤테로환"은 포화되거나 부분적으로 불포화된 단환식 또는 다환식 탄화수소 치환기를 지칭하고, 이는 3 내지 20개의 고리 원자를 함유하고, 그 중 하나 이상이 질소, 산소 및 S(O)m(여기서 m은 0 내지 2의 정수임)이지만 -O-O-, -O-S- 또는 -S-S-의 고리 작용부분을 포함하지 않으며, 다른 고리 원자는 탄소이다. 이는 바람직하게는 3 내지 12개의 고리 원자를 함유하고, 그 중 1 내지 4개는 헤테로원자이고; 보다 바람직하게는 3 내지 7개의 고리 원자를 함유한다. 단환식 헤테로사이클로알킬의 비제한적인 예에는 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 디하이드로이미다졸릴, 디하이드로푸라닐, 디하이드로피라졸릴, 디하이드로피롤릴, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 호모피페라지닐 등이 포함된다. 다환식 헤테로사이클로알킬에는 스피로헤테로사이클릴, 융합된 헤테로사이클릴 및 가교화된 헤테로사이클릴이 포함된다. "헤테로사이클로알킬"의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
헤테로사이클로알킬 고리는 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 융합될 수 있으며, 여기서 모 구조에 부착된 고리는 헤테로사이클로알킬이고; 이의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
헤테로사이클로알킬은 선택적으로 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환되는 경우 치환기는 바람직하게는 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시, 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이고, 여기서 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8사이클로알케닐옥시 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
용어 "아릴"은 공액 π-전자 시스템을 갖는 6원 내지 14원, 바람직하게는 6원 내지 12원의 전체-탄소 단환식 또는 융합 다환식(즉, 한 쌍의 인접한 탄소 원자를 공유하는 고리) 기를 지칭하고, 예컨대 예컨대 페닐 및 나프틸이다. 아릴 고리는 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬 또는 사이클로알킬 고리에 융합될 수 있으며, 여기서 모 구조에 부착된 고리는 아릴 고리이고; 이의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
아릴은 치환되거나 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기는 바람직하게는 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시, 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이고, 여기서 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
용어 "헤테로아릴"은 1 내지 4개의 헤테로원자 및 5 내지 14개의 고리 원자를 함유하는 헤테로방향족 시스템을 지칭하고, 여기서 헤테로원자는 산소, 황 및 질소로 구성된 군으로부터 선택된다. 헤테로아릴은 바람직하게는 5원 내지 12원, 더욱 바람직하게는 5원 또는 6원이다. 예를 들어, 그의 비제한적인 예에는 이미다졸릴, 푸라닐, 티에닐, 티아졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 피롤릴, 테트라졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 티아디아졸, 피라지닐, 트리아졸릴, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 
등이 포함된다.
헤테로아릴 고리는 아릴, 헤테로사이클로알킬 또는 사이클로알킬 고리에 융합될 수 있으며, 여기서 모 구조에 부착된 고리는 헤테로아릴이고; 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
헤테로아릴은 선택적으로 치환되거나 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기는 바람직하게는 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시, 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이고, 여기서 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
"스피로"라는 용어는 두 개의 고리가 하나의 원자를 공유하는 화합물을 지칭한다.
"스피로사이클로알킬"이라는 용어는 단환식 고리가 하나의 탄소 원자(스피로 원자로 지칭됨)를 공유하는 5원 내지 20원의 다환식 기를 지칭한다. 이는 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있지만, 고리 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자 시스템을 갖지는 않는다. 바람직하게는 6원 내지 14원, 더욱 바람직하게는 7원 내지 10원이다. 고리 사이에 공유된 스피로 원자의 수에 따라 스피로사이클로알킬은 모노스피로사이클로알킬, 비스피로사이클로알킬 또는 폴리스피로사이클로알킬일 수 있다. 모노스피로사이클로알킬 및 비스피로사이클로알킬이 바람직하다. 4원/4원, 4원/5원, 4원/6원, 5원/5원 또는 5원/6원 모노스피로사이클로알킬이 더욱 바람직하다. "스피로탄소환"은 스피로사이클로알킬의 고리 시스템을 지칭한다. 스피로사이클로알킬의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
용어 "스피로헤테로사이클릴"은 단환식 고리가 하나의 원자(스피로 원자로 지칭됨)를 공유하는 5원 내지 20원의 다환식 헤테로사이클릴 기를 지칭하고, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소 및 S(O)m(여기서 m은 0 내지 2의 정수임)로 구성된 군으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소이다. 이는 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있지만, 고리 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자 시스템을 갖지는 않는다. 바람직하게는 6원 내지 14원, 더욱 바람직하게는 7원 내지 10원이다. 고리 사이에 공유된 스피로 원자의 수에 따라 스피로헤테로사이클릴은 모노스피로헤테로사이클릴, 비스피로헤테로사이클릴 또는 폴리스피로헤테로사이클릴일 수 있다. 모노스피로헤테로사이클릴 및 비스피로헤테로사이클릴이 바람직하다. 4원/4원, 4원/5원, 4원/6원, 5원/5원 또는 5원/6원 모노스피로헤테로사이클릴이 더욱 바람직하다. "스피로헤테로환"은 스피로헤테로사이클릴의 고리 시스템을 지칭한다. 스피로헤테로사이클릴의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
"융합된"이라는 용어는 두 개의 인접한 원자를 공유함으로써 두 개 이상의 고리를 융합하여 형성된 화합물을 지칭한다.
용어 "융합된 사이클로알킬"은 시스템의 각 고리가 시스템의 다른 고리와 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 5원 내지 20원의 전체-탄소 다환식 기를 지칭하고, 여기서 하나 이상의 고리는 하나 이상의 결합을 포함할 수 있지만, 그 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자 시스템을 갖지는 않는다. 이는 바람직하게는 6원 내지 14원, 더욱 바람직하게는 7원 내지 10원이다. 구성 고리의 수에 따라, 융합 사이클로알킬은 이환식, 삼환식, 사환식 또는 다환식 융합 사이클로알킬일 수 있으며, 바람직하게는 이환식 또는 삼환식 융합 사이클로알킬, 보다 바람직하게는 5원/5원 또는 5원/6원 바이사이클로알킬이다. 융합된 사이클로알킬의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
용어 "융합된 헤테로사이클릴"은 시스템의 각 고리가 시스템의 다른 고리와 한 쌍의 인접한 원자를 공유하는 5원 내지 20원의 다환식 헤테로환식 기를 지칭하고, 여기서 하나 이상의 고리는 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있지만 그 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자 시스템을 갖지는 않고; 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소 및 S(O)m(여기서 m은 0 내지 2의 정수임)으로 구성된 군으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소이다. 이는 바람직하게는 6원 내지 14원, 더욱 바람직하게는 7원 내지 10원이다. 구성 고리의 수에 따라, 융합 헤테로사이클릴은 이환식, 삼환식, 사환식 또는 다환식 융합 헤테로사이클릴일 수 있으며, 바람직하게는 이환식 또는 삼환식 융합 헤테로사이클릴, 보다 바람직하게는 5원/5원 또는 5원/6원 이환식 융합 헤테로사이클릴이다. "융합된 헤테로환"은 융합된 헤테로사이클릴의 고리 시스템을 지칭한다. 융합된 헤테로사이클릴의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
용어 "융합 헤테로아릴"은 인접한 2개의 원자를 공유하는 2개 이상의 환형 구조가 연결되어 형성된 5 내지 14개의 고리 원자(적어도 1개의 헤테로원자를 포함)를 함유하는 불포화 방향족 융합 환형 구조일 수 있으며, 탄소 원자, 질소 원자 및 황 원자가 옥소, 바람직하게는 "5원 내지 12원 융합 헤테로아릴", "7원 내지 12원 융합 헤테로아릴", "9원 내지 12원 융합 헤테로아릴" 등으로 치환될 수 있는 경우를 포함하고, 예를 들어 벤조푸라닐, 벤조이소티아푸라닐, 벤조티에닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤족사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴, 퀴놀릴, 2-퀴놀리노닐, 4-퀴놀리노닐, 1-이소퀴놀리노닐, 이소퀴놀리닐, 아크리디닐, 페난트리디닐, 벤조피리다지닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 페나지닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 나프티리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐 등이다. "융합된 헤테로방향족 고리"는 융합된 헤테로아릴의 고리 시스템을 지칭한다.
융합된 헤테로아릴은 선택적으로 치환되거나 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 설프하이드릴, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오, 헤테로사이클로알킬티오, 카르복실 및 카르복실레이트 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이다.
"가교화된"이라는 용어는 두 개의 인접하지 않은 고리 원자를 공유하는 두 개 이상의 환형 구조에 의해 형성되는된 구조를 지칭한다.
"가교화된 사이클로알킬"이라는 용어는 임의의 2개의 고리가 직접 연결되지 않은 2개의 탄소 원자를 공유하는 5원 내지 20원의 전체-탄소 다환식 기를 지칭한다. 이는 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있지만, 고리 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자 시스템을 갖지는 않는다. 이는 바람직하게는 6원 내지 14원, 더욱 바람직하게는 7원 내지 10원이다. 구성 고리의 수에 따라, 가교화된 사이클로알킬은 이환식, 삼환식, 사환식 또는 다환식 가교화된 사이클로알킬일 수 있으며, 바람직하게는 이환식, 삼환식 또는 사환식 가교화된 사이클로알킬, 더욱 바람직하게는 이환식 또는 삼환식 가교화된 사이클로알킬이다. 가교화된 사이클로알킬의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
"가교화된 헤테로사이클릴"이라는 용어는 임의의 2개의 고리가 직접 연결되지 않은 2개의 원자를 공유하는 5원 내지 14원의 다환식 헤테로환식 기를 지칭한다. 이는 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있지만, 고리 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자 시스템을 갖지 않으며, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소 및 S(O)m(여기서 m은 0 내지 2의 정수임)로 구성된 군으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소이다. 이는 바람직하게는 6원 내지 14원, 더욱 바람직하게는 7원 내지 10원이다. 구성 고리의 수에 따라, 가교화된 헤테로사이클릴은 이환식, 삼환식, 사환식 또는 다환식 가교화된 헤테로사이클릴일 수 있으며, 바람직하게는 이환식, 삼환식 또는 사환식 가교화된 헤테로사이클릴, 더욱 바람직하게는 이환식 또는 삼환식 가교화된 헤테로사이클릴이다. 가교화된 헤테로사이클릴의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
"알콕시"라는 용어는 -O-(알킬) 및 -O-(비치환된 사이클로알킬)을 지칭하고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다. 알콕시의 비제한적인 예에는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부톡시, 사이클로펜틸옥시 및 사이클로헥실옥시가 포함된다. 알콕시는 선택적으로 치환되거나 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기는 바람직하게는 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알케닐옥시, 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이고, 여기서 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐옥시, C2-6 알키닐옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3원 내지 6원 헤테로사이클로알콕시, C3-8사이클로알케닐옥시 및 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다. 마찬가지로, "알키닐옥시", "알케닐옥시", "사이클로알콕시", "헤테로사이클로알콕시" 및 "사이클로알케닐옥시"의 정의는 "알콕시"의 상기 정의와 유사하다.
"치환된"이라는 용어는 기 내의 1개 이상, 바람직하게는 5개 이하, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 수소 원자가 상응하는 수의 치환기로 독립적으로 치환되는 것을 의미한다. 치환기가 그의 가능한 화학적 위치에만 있다는 것은 말할 필요도 없으며, 당업자는 과도한 노력 없이 (실험적으로 또는 이론적으로) 가능하거나 불가능한 치환을 결정할 수 있을 것이다.
"1개 이상으로 치환된다"는 것은 단일 치환기 또는 다수의 치환기로 치환될 수 있음을 의미한다. 다수의 치환기로 치환되는 경우에는 동일한 치환기가 복수개 있을 수도 있고, 서로 다른 치환기의 1개의 조합 또는 복수개의 조합이 있을 수도 있다.
두 분자 사이의 관계를 언급할 때 용어 "결합하다", "연결하다" 또는 "부착하다"는 두 분자가 공유 결합에 의해 연결되거나 두 분자가 비공유 결합(예: 수소 결합 또는 이온 결합)을 통해 회합된다는 것을 의미하고, 직접 연결 및 간접 연결을 포함한다.
"직접 연결된"이라는 용어는 제1 화합물 또는 기가 사이에 삽입된 임의의 원자 또는 원자 기 없이 제2 화합물 또는 기에 연결된다는 것을 의미한다. "간접적으로 연결된"이라는 용어는 제1 화합물 또는 기가 중간체 기, 화합물 또는 분자(예를 들어 연결기)에 의해 제2 화합물 또는 기에 연결된다는 것을 의미한다.
"하이드록시"라는 용어는 -OH를 지칭한다.
"할로겐"이라는 용어는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 지칭한다.
"할로알킬"이란 용어는 할로겐으로 치환된 알킬 기를 지칭하고, 여기서 알킬 기는 상기 정의된 바와 같다.
"시아노"라는 용어는 -CN을 지칭한다.
"니트로"라는 용어는 -NO2를 지칭한다.
"옥소"라는 용어는 =O 기를 지칭한다. 예를 들어, 탄소 원자는 이중 결합을 통해 산소 원자에 연결되어 케톤 또는 알데히드 기를 형성한다.
"아미노"라는 용어는 -NH2를 지칭한다.
"시아노"라는 용어는 -CN을 지칭한다.
"카르복실"이라는 용어는 -C(O)OH를 지칭한다.
"알데히드"라는 용어는 -CHO를 지칭한다.
본 개시내용에서, "포함하다" 및 "함유하다"라는 용어는 "구성하다"로 대체될 수 있다.
본 개시내용에서, "포스포에스테르 기" 및 "포스페이트 연결"은 상호교환적으로 사용되며, 포스포모노에스테르, 포스포디에스테르 또는 포스포트리에스테르를 포함한다. "포스포로티오에이트 기" 중의 "포스포에스테르 기"도 동일한 의미를 갖는다. 달리 명시하지 않는 한, 천연 뉴클레오티드간 포스포에스테르 기는 포스포디에스테르 기이다.
본 개시내용에서 포스포로티오에이트 기는 비-가교화된 산소 원자 하나가 황 원자로 치환된 포스포디에스테르 기를 지칭하고, 및 (M은 S 원자임)와 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, RNA 매개 유전자 침묵과 관련하여, siRNA의 센스 가닥(SS 또는 SS 가닥으로도 지칭됨)은 표적 mRNA 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 가닥을 지칭하고; siRNA의 안티센스 가닥(AS 또는 AS 가닥이라고도 함)은 표적 mRNA 서열과 상보적인 서열을 갖는 가닥을 지칭한다.
본 개시내용에서, 센스 또는 안티센스 가닥의 "5' 영역", 즉 "5' 말단" 또는 "5' 단부"는 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 2 내지 8에 있는 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 5' 말단의 위치 2 내지 8에 있는 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 센스 또는 안티센스 가닥의 "3' 영역", "3' 단부" 및 "3' 말단"도 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적" 및 "역상보적"은 상호교환적으로 사용되며 당업자에게 잘 알려진 의미를 갖고 - 즉, 이중 가닥 핵산 분자에서 한 가닥의 염기는 다른 가닥의 염기와 상보적인 방식으로 쌍을 이룬다. DNA에서 퓨린 염기인 아데닌(A)은 항상 피리미딘 염기인 티민(T)(또는 RNA에서는 우라실(U))과 쌍을 이루고, 퓨린 염기인 구아닌(C)은 항상 피리미딘 염기인 시토신(G)과 쌍을 이룬다. 각 염기쌍은 퓨린과 피리미딘을 포함한다. 한 가닥의 아데닌이 항상 다른 가닥의 티민(또는 우라실)과 쌍을 이루고 구아닌이 항상 시토신과 쌍을 이루는 경우, 두 가닥은 서로 상보적인 것으로 간주되며, 그 가닥의 서열은 상보적인 가닥의 서열로부터 추론될 수 있다. 따라서, 당업계에서 "미스매치"란 이중나선 핵산에서 상응하는 위치의 염기가 상보적 방식으로 쌍을 이루지 않는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "화학적 변형" 또는 "변형"은 자연적으로 발생하는 대응물과 비교할 때 화학적 차이가 있는 구조를 의미하고, 화학적 작용부분의 부가 또는 제거, 또는 한 화학적 작용부분의 다른 화학적 작용부분으로의 치환 등과 같은 화학적 수단에 의해 이루어진 모든 변화를 포함한다.
본 개시내용과 관련하여, Bz는 벤조일을 나타내고; MMTr은 메톡시페닐 벤즈하이드릴을 나타내고; DMTr은 디메톡시트리틸을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염기"는 임의의 공지된 DNA 및 RNA 염기, 및 퓨린 또는 피리미딘과 같은 염기 유사체를 포괄하며, 이는 천연 화합물인 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신 및 천연 유사체도 포함한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 대문자 C, G, U, A 및 T는 뉴클레오티드의 염기 성분을 나타내고; 소문자 d는 문자 d에 인접한 오른쪽 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 m은 문자 m에 인접한 왼쪽 뉴클레오티드가 메톡시 변형된 뉴클레오티드임을 나타내며; 소문자 f는 문자 f에 인접한 왼쪽 뉴클레오티드가 플루오로 변형된 뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 s는 문자 s에 인접한 두 개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기에 의해 연결되어 있음을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "플루오로-변형 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록시 기가 불소로 치환된 뉴클레오티드를 지칭하고; 메톡시 변형 뉴클레오티드는 리보실 기의 2'-하이드록시 기가 메톡시 기로 치환된 뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "억제하다"는 "감소", "침묵", "하향 조절", "저해" 및 기타 유사한 용어와 상호교환적으로 사용되며, 임의의 수준의 억제를 포함한다. 억제는 대조 수준에 비해 이들 변수 중 하나 이상의 절대적 또는 상대적 수준의 감소로 평가될 수 있다. 대조 수준은 투약 전 기준선 수준, 또는 유사한 치료되지 않은 또는 대조(예를 들어, 완충제 단독 대조 또는 불활성 제제 대조) 치료된 피험체, 세포, 또는 샘플에서 측정된 수준과 같이 당업계에서 사용되는 임의의 유형의 대조 수준일 수 있다. 예를 들어, mRNA의 잔존 발현 수준은 siRNA에 의한 표적 유전자 발현의 억제 정도를 특성화하는 데 사용될 수 있으며; 예를 들어, mRNA의 잔존 발현 수준은 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 또는 10% 이하이다. 표적 유전자 발현의 억제는 듀얼-글로(Dual-Glo: 등록상표) 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여 측정할 수 있는데: 반딧불이(Firefly) 화학발광 값 및 레닐라(Renilla) 화학발광 값을 각각 판독하고, 상대값 비율 = Ren/Fir을 계산하고; 본 개시내용에서 잔존 mRNA 발현 수준의 비율(또는 잔여 활성%) = 비율(siRNA 처리군)/비율(siRNA 비처리 대조군), 억제율(%) = 100% - 잔존 mRNA 발현 수준(%).
"유효량", "유효 용량", "유효 치료량" 또는 "치료 유효량"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 원하는 치료 결과를 수득하는 데 필요한 약물, 화합물 또는 약학적 조성물의 양을 지칭한다. 예방적 사용의 경우 유익하거나 원하는 결과에는 장애의 생화학, 조직학 및/또는 행동 증상, 이의 합병증 및 장애가 진행되는 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함하여, 위험 제거 또는 감소, 중증도 감소 또는 장애 발병의 지연이 포함된다. 치료적 적용의 경우, 유익하거나 원하는 결과에는 본 개시내용의 표적 유전자, 표적 mRNA 또는 표적 단백질과 관련된 다양한 병태의 발생률 감소, 또는 병태의 하나 이상의 증상 완화, 병태의 치료에 필요한 다른 제제의 투여량 감소, 또 다른 제제의 치료 효과의 강화, 및/또는 본 개시내용의 표적 유전자, 표적 mRNA 또는 표적 단백질과 관련된 병태의 진행을 환자에서 지연시키는 것과 같은 임상 결과가 포함된다. 유효량은 또한 진단을 허용하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 지칭한다. 특정 환자 또는 수의학적 피험체에 대한 유효량은 치료할 장애, 환자의 일반적인 건강 상태, 투여 방법 및 경로와 투여량, 부작용의 심각도와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 심각한 부작용이나 독성 효과를 피하기 위한 최대 용량 또는 투여 계획일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상", "환자", "피험체" 및 "개체"는 상호교환적으로 사용되며 인간 또는 인간이 아닌 동물, 예를 들어 포유동물을 포함하고, 예를 들어 인간 또는 원숭이이다.
일부 실시양태에서, 유전자 발현 세포에 올리고머 화합물을 전달하는 경우, 올리고머 화합물은 기본 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 본원에서는 "발현-억제 올리고머 화합물"로 지칭된다. 이는 시험관내 또는 생체내에서 유전자 발현을 억제할 수 있다. "올리고머 화합물"에는 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 리보자임, 간섭 RNA 분자 및 다이서 효소 기질이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 기호 는 이것이 본원에 기재된 개시내용의 범주에 따라 임의의 기 또는 기들에 연결될 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 제1 가닥은 안티센스 가닥으로 지칭될 수 있고, 제2 가닥은 센스 가닥으로 지칭될 수 있다. 제1 가닥과 안티센스 가닥 또는 제2 가닥과 센스 가닥이라는 용어는 상호교환 가능한 것으로 간주되어야 한다.
본 개시내용에 사용된 "RNAi 제제"는 서열 특이적 방식으로 표적 메신저 RNA(mRNA)의 전사 및 번역을 분해하거나 억제할 수 있는 RNA 또는 RNA 유사(예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 제제를 지칭한다. 본 개시내용에서, RNAi 제제는 RNA 간섭 기작을 통해 작동할 수 있거나[즉, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구(RNA 유도 침묵 복합체 또는 RISC)와의 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도함] 임의의 다른 기작 또는 경로에 의해 작용할 수 있다. RNAi 제제에는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 다이서 기질이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
본원에 기재된 RNAi 제제는 표적화된 mRNA에 적어도 부분적으로 상보적인 가닥을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
도 1은 접합체 TRD002218, TRD007203, TRD007204 및 TRD007205를 투여한 후 7일째 TTR에서 mRNA의 발현 수준을 보여준다.
도 2는 접합체 TRD002218, TRD007203, TRD007204 및 TRD007205를 투여한 후 28일째 TTR에서 mRNA의 발현 수준을 보여준다.
도 3은 시험예 6에서 1차 뮤린 간세포에서 mTTR 유전자 발현에 대한 GalNAc 접합 siRNA의 억제 활성을 보여준다.
도 4는 시험예 7의 마우스 mTTR 유전자에 대한 GalNAc 접합 siRNA의 생체내 억제 활성을 보여준다.
도 2는 접합체 TRD002218, TRD007203, TRD007204 및 TRD007205를 투여한 후 28일째 TTR에서 mRNA의 발현 수준을 보여준다.
도 3은 시험예 6에서 1차 뮤린 간세포에서 mTTR 유전자 발현에 대한 GalNAc 접합 siRNA의 억제 활성을 보여준다.
도 4는 시험예 7의 마우스 mTTR 유전자에 대한 GalNAc 접합 siRNA의 생체내 억제 활성을 보여준다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이는 본 개시내용을 제한하려는 의도는 아니다. 본 개시내용의 실시예에 명시된 조건이 없는 실험 과정은 일반적으로 통상적인 조건에 따라 수행되거나, 출발 물질 또는 시판품의 제조사가 권장하는 조건에 따라 수행된다. 시약의 출처가 표시되지 않은 경우 해당 시약은 분자생물학 응용 분야에 적합한 품질/순도를 갖춘 임의의 분자생물학 시약 공급업체로부터 구입한 것이다.
화합물 NAG0024 및 NAG0026은 우시 앱텍(톈진) 컴퍼니 리미티드[WuXi AppTec (Tianjin) Co., Ltd.]에서 구입하였다. 달리 명시하지 않는 한, 다음 실시예에 사용된 모든 시약은 시판된다.
제조예 1: 화합물 NAG0039의 합성
화합물 2
질소 분위기 하에 실온에서 건조 THF(20 mL) 중 화합물 1(1.00 g, 1.82 밀리몰)의 용액에 DIEA(469 mg, 3.63 밀리몰), 3A 분자체, 모노메틸 수베레이트(342 mg, 1.82 밀리몰), DCC(487 mg, 2.36 밀리몰) 및 HOBt(319 mg, 2.36 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 밤새 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 여과하고 농축한 후 역상 컬럼 크로마토그래피[보스턴(Boston) C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O]로 정제하고 동결건조시켜 중간체(1.14 g, 1.58 밀리몰, 87% 수율)를 수득하였다.
중간체(1.14 g, 1.58 밀리몰)를 THF(3 mL) 및 MeOH(3 mL)에 용해시키고, 물(3 mL) 중 NaOH(126 mg, 3.16 밀리몰)의 용액을 적가하였다. 반응 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 대부분의 유기 용매를 감압 하에 제거한 후, 잔류물을 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 화합물 2(851 mg, 1.17 밀리몰, 나트륨 염, 74% 수율)를 수득하였다.
화합물 3
질소 분위기 하에 실온에서 건조 THF(15 mL) 중 화합물 NAG0026(863 mg, 0.566 밀리몰)의 용액에 DIEA(146 mg, 1.13 밀리몰), 3A 분자체, 화합물 2(400 mg, 0.566 밀리몰), DCC(140 mg, 0.679 밀리몰) 및 HOBt(92 mg, 0.679 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 45℃에서 밤새 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 여과하고 농축한 후 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하고 동결건조시켜 화합물 3(918 mg, 0.415 밀리몰, 73% 수율)을 수득하였다.
화합물 NAG0039
실온에서 피리딘 중 화합물 3(400 mg, 0.181 밀리몰)의 용액에 3A 분자체, 숙신산 무수물(36 mg, 0.361 밀리몰) 및 DMAP(22 mg, 0.181 밀리몰)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에 45℃에서 밤새 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 여과하고, 감압 하에 농축하고, 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 분리 및 정제하여 조질의 생성물(248 mg)을 수득하였다. 조질의 생성물의 2개 배치를 합치고 분취용 HPLC(컬럼: Xbridge 150 × 50 mm, 5 ㎛; 이동상: A: 물 중 0.1% NH3H2O + 0.005% FA; B: MeCN; 구배: 9분 내에 20% B-95% B)로 분리하여 화합물 NAG0039(240 mg, 0.104 밀리몰, 33% 수율)를 수득하였다.
MS(ESI) m/z = 2312.3[M-1]-, 계산값: 2313.0.
1H NMR(400 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δ 7.63-6.59 (m, 27H), 5.40-5.22 (m, 4H), 5.16-5.02 (m, 3H), 4.74-4.57 (m, 3H), 4.45-3.05 (m, 47H), 2.70-1.96 (m, 57H), 1.63-1.27 (m, 11H).
제조예 2: 화합물 NAG0046의 합성
화합물 3
질소 분위기 하에 용매 DCM(5 mL)에 화합물 2(203 mg, 0.830 밀리몰), DIEA(0.206 mL, 1.246 밀리몰) 및 HATU(237 mg, 0.623 밀리몰)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 교반한 후, 화합물 1(200 mg, 0.415 밀리몰)을 상기 기재된 시스템에 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 질소 분위기 하에 1시간 동안 20℃에서 반응하도록 방치하였다. 반응 용액에 H2O(10 mL)를 첨가하고 혼합물을 DCM(3 × 20 mL)으로 추출하였다. 유기상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(DCM:MeOH(100:0-90:10))로 정제하여 화합물 3(250 mg, 82% 수율)을 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80AB_2분, 체류 시간 1.534분; MS(ESI) m/z = 682.6 [M+Na]+.
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.42 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.34-7.29 (m, 6H), 7.21-7.17 (m, 2H), 6.86 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 4.44 (br d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.31-4.08 (m, 1H), 4.01-3.84 (m, 1H), 3.82 (d, J = 2.0 Hz, 6H), 3.69 (d, J = 2.3 Hz, 3H), 3.17-3.06 (m, 1H), 2.36-2.25 (m, 3H), 2.19-1.97 (m, 4H), 1.57-1.54 (m, 3H), 1.47 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 1.28 (br d, J = 6.8 Hz, 10H).
화합물 4
화합물 3(250 mg, 0.348 밀리몰)을 MeOH(1 mL) 및 H2O(0.5 mL)에 용해시킨 후, LiOH(146 mg, 3.48 밀리몰)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 4(166 mg, 71% 수율)를 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80CD_3분, 체류 시간 1.353분; MS(ESI) m/z = 668.6 [M+Na]+.
HPLC: 크로마토그래피 조건 10-80CD_6분, 체류 시간 1.897분.
H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.45 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.34-7.27 (m, 6H), 7.24-7.19 (m, 1H), 6.92-6.83 (m, 4H), 4.32 (q, J = 8.0 Hz, 1H), 4.13-4.02 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.21-3.14 (m, 1H), 3.13-3.06 (m, 1H), 2.37-2.28 (m, 1H), 2.14 (td, J = 7.5, 15.6 Hz, 5H), 1.99-1.89 (m, 1H), 1.72-1.70 (m, 1H), 1.59-1.50 (m, 4H), 1.36-1.23 (m, 13H).
화합물 5
화합물 NAG0026(120 mg, 0.079 밀리몰)을 무수 THF(2 mL) 및 무수 DMF(2 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(50 mg)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 4(54 mg, 0.084 밀리몰), HOBt(28 mg, 0.205 밀리몰), DCC(39 mg, 0.189 밀리몰) 및 DIEA(0.08 mL, 0.472 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 40℃에서 20시간 동안 반응하도록 방치하였다. LC-MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물로 급랭하고 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 화합물 5(90 mg, 53% 수율)를 수득하였다.
화합물 NAG0046
화합물 5(90 mg, 0.042 밀리몰)를 무수 피리딘(3 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(50 mg), DMAP(26 mg, 0.209 밀리몰) 및 숙신산 무수물(42 mg, 0.364 밀리몰)을 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. LC-MS는 출발 물질의 약 50%가 소비되었음을 보여주었다. 반응 용액을 여과하고, 농축하고, 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, H2O/MeCN, 5%에서 70%로 용출)로 정제하여 NAG0046(30 mg)을 수득하였다.
MS (ESI) m/z = 2251.4 [M-1]-, 계산값: 2252.0.
1H NMR(400MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 7.50-7.14 (m, 14H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 7H), 6.56 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.32 (d, J = 3.4 Hz, 3H), 5.09 (t, J = 12.5 Hz, 4H), 4.65 (dd, J = 8.6, 4.8 Hz, 3H), 4.32-3.11 (m, 52H), 2.54 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 2.32 (d, J = 7.6 Hz, 16H), 2.14-2.04 (m, 17H), 1.89 (d, J = 2.9 Hz, 10H), 1.75 (dt, J = 14.6, 7.9 Hz, 4H), 1.62-1.49 (m, 5H), 1.29 (s, 13H).
제조예 3: 화합물 NAG0047의 합성
화합물 3
MeOH(10 mL) 중 화합물 2(300 mg, 1.60 밀리몰)의 용액에 0℃에서 질소 분위기 하에 SOCl2(0.581 mL, 8.009 밀리몰)를 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 화합물 3(0.32 g, 1.510 밀리몰, 95% 수율)을 수득하였다.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 3.75-3.59 (m, 3H), 2.93 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.33 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.64 (td, J = 7.0, 14.4 Hz, 4H), 1.48-1.27 (m, 10H).
화합물 4
질소 분위기 하에 0℃에서 THF(25 mL) 중 화합물 1(250 mg, 0.538 밀리몰)의 용액에 DIEA(0.267 mL, 1.61 밀리몰), 4A 분자체(500 mg), 화합물 3(271 mg, 1.08 밀리몰), DCC(333 mg, 1.61 밀리몰) 및 HOBt(218 mg, 1.61 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 H2O(50 mL)로 급랭하고 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 염수(50 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(0-80% EtOAc/PE)로 정제하여 화합물 4(420 mg, 0.486 밀리몰, 90% 수율)을 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80CD_7분, 체류 시간 5.586분; MS(ESI) m/z = 670.3 [M+Na]+.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.36-7.29 (m, 6H), 7.28-7.22 (m, 1H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 4.53 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.35-4.27 (m, 1H), 4.02 (q, J = 4.0 Hz, 1H), 3.86-3.74 (m, 6H), 3.66 (s, 3H), 3.52-3.42 (m, 1H), 3.33-3.30 (m, 1H), 3.29-3.23 (m, 1H), 3.18 (td, J = 7.0, 13.5 Hz, 1H), 3.00 (td, J = 7.0, 13.5 Hz, 1H), 2.33-2.22 (m, 3H), 2.14 (ddd, J = 5.8, 7.8, 13.3 Hz, 1H), 1.92-1.82 (m, 2H), 1.73 (td, J = 3.6, 13.2 Hz, 2H), 1.66-1.53 (m, 3H), 1.43-1.26 (m, 7H).
화합물 5
20℃에서 THF(5 mL) 및 H2O(2 mL) 중 화합물 4(420 mg, 0.486 밀리몰)의 용액에 LiOH(82 mg, 1.95 밀리몰)를 첨가하였다. 반응 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 농축하고 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 화합물 5(236 mg, 0.155 밀리몰, 32% 수율, 리튬염)를 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 0-60CD_7분, 체류 시간 3.950분; MS(ESI) m/z = 656.4 [M+Na]+.
화합물 6
화합물 NAG0026(236 mg, 0.155 밀리몰)을 무수 THF(3 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 5(98 mg, 0.155 밀리몰), HOBt(25 mg, 0.186 밀리몰), DCC(41 mg, 0.201 밀리몰) 및 DIEA(0.08 mL, 0.464 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 40℃에서 16시간 동안 반응하도록 방치하였다. LC-MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물로 급랭하고 여과하였다. 여액을 농축한 다음 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 화합물 6(160 mg, 0.075 밀리몰, 48% 수율)을 수득하였다.
화합물 NAG0047
화합물 6(160 mg, 0.075 밀리몰)을 무수 피리딘(3 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg), DMAP(46 mg, 0.374 밀리몰) 및 숙신산 무수물(75 mg, 0.747 밀리몰)을 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하고, 농축하고, 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 NAG0047(80 mg)을 수득하였다.
MS(ESI) m/z = 2239.1 [M-1]-, 계산값: 2240.0.
1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 7.53-7.09 (m, 14H), 6.89 (dd, J = 7.2, 5.1 Hz, 8H), 5.31 (dt, J = 3.2, 1.5 Hz, 3H), 5.22-5.05 (m, 4H), 4.70-4.61 (m, 3H), 4.44 (dd, J = 9.7, 6.7 Hz, 1H), 4.29 (dq, J = 14.6, 7.6 Hz, 2H), 4.18-3.84 (m, 16H), 3.80 (s, 6H), 3.69 (dd, J = 11.2, 4.3 Hz, 3H), 3.64-3.03 (m, 24H), 2.57 (h, J = 2.3 Hz, 5H), 2.36-2.27 (m, 7H), 2.24-2.16 (m, 4H), 2.11 (s, 3H), 2.01-1.96 (m, 22H), 1.88 (q, J = 2.9, 2.2 Hz, 8H), 1.56 (s, 2H), 1.24 (d, J = 17.7 Hz, 13H).
제조예 4: 화합물 NAG0048의 합성
화합물 3
MeOH(10 mL) 중 화합물 2(500 mg, 2.67 밀리몰)의 용액에 0℃에서 질소 분위기 하에 SOCl2(0.968 mL, 13.3 밀리몰)를 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 화합물 3(550 mg, 2.46 밀리몰, 92%)을 수득하였다.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 3.69-3.62 (m, 3H), 2.94 (s, 2H), 2.33 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.73-1.57 (m, 4H), 1.46-1.31 (m, 10H).
화합물 4
질소 분위기 하에 0℃에서 THF(25 mL) 중 화합물 1(250 mg, 0.538 밀리몰)의 용액에 DIEA(0.267 mL, 1.614 밀리몰), 4A 분자체(500 mg), 화합물 3(271 mg, 1.08 밀리몰), DCC(333 mg, 1.61 밀리몰) 및 HOBt(218 mg, 1.61 밀리몰)에 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 H2O(50 mL)로 급랭하고 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축한 다음, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(0-80% EtOAc/PE)로 정제하여 화합물 4(350 mg, 0.486 밀리몰, 90% 수율)를 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80CD_7분, 체류 시간 5.670분; MS(ESI) m/z = 670.3 [M+Na]+.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.45 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.36-7.27 (m, 6H), 7.25-7.19 (m, 1H), 6.90-6.85 (m, 4H), 4.50 (dd, J = 4.6, 9.0 Hz, 1H), 4.27 (td, J = 3.0, 5.6 Hz, 1H), 4.20-4.14 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.68-3.62 (m, 3H), 3.53-3.43 (m, 1H), 3.27-3.18 (m, 3H), 3.16-3.09 (m, 1H), 2.54 (ddd, J = 5.8, 8.8, 13.2 Hz, 1H), 2.31 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08 (td, J = 4.0, 13.2 Hz, 1H), 1.91-1.82 (m, 2H), 1.73 (td, J = 3.6, 13.2 Hz, 2H), 1.67-1.50 (m, 5H), 1.39-1.32 (m, 2H), 1.27-1.12 (m, 3H).
화합물 5
20℃에서 THF(5 mL) 및 H2O(2 mL) 중 화합물 4(350 mg, 0.486 밀리몰)의 용액에 LiOH(82 mg, 1.95 밀리몰)를 첨가하였다. 반응 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 직접 농축하여 화합물 5(300 mg, 0.469 밀리몰, 96% 수율)를 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 0-60CD_7분, 체류 시간 4.081분; MS(ESI) m/z = 656.4 [M+Na]+.
화합물 6
화합물 NAG0026(300 mg, 0.197 밀리몰)을 무수 THF(5 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 5(125 mg, 0.197 밀리몰), HOBt(32 mg, 0.236 밀리몰), DCC(53 mg, 0.256 밀리몰) 및 DIEA(0.10 mL, 0.590 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 40℃에서 16시간 동안 반응하도록 방치하였다. LC-MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물로 급랭하고 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축한 다음 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 화합물 6(260 mg, 62% 수율)을 수득하였다.
화합물 NAG0048
화합물 6(260 mg, 0.121 밀리몰)을 무수 피리딘(4 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg), DMAP(30 mg, 0.242 밀리몰) 및 숙신산 무수물(73 mg, 0.726 밀리몰)을 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. LC-MS는 출발 물질의 약 70%가 소비되었음을 보여주었다. 반응 용액을 여과하고, 농축하고, 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 NAG0048(170 mg, 62% 수율)을 수득하였다.
MS(ESI) m/z = 2239.1 [M-1]-, 계산값: 2240.0.
1H NMR(400MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δ 7.68 (s, 3H), 7.51-7.17 (m, 12H), 7.11-6.85 (m, 7H), 5.31 (dt, J = 2.5, 1.3 Hz, 3H), 5.18-5.04 (m, 4H), 4.74-4.53 (m, 4H), 4.30 (d, J = 4.9 Hz, 3H), 4.21-3.93 (m, 12H), 3.79 (s, 9H), 3.69 (dt, J = 10.4, 4.7 Hz, 3H), 3.62-3.14 (m, 22H), 3.09 (dd, J = 10.1, 4.4 Hz, 2H), 2.91 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 2.46 (s, 6H), 2.28 (ddt, J = 28.8, 20.0, 7.2 Hz, 8H), 2.11 (s, 3H), 2.01-1.96 (m, 18H), 1.90-1.87 (m, 8H), 1.54 (d, J = 25.2 Hz, 4H), 1.37-1.18 (m, 16H).
제조예 5: 화합물 NAG0049의 합성
화합물 3
화합물 2(293 mg, 1.20 밀리몰)를 DCM(3 mL)에 용해시키고, DIEA(0.298 mL, 1.80 밀리몰) 및 HATU(457 mg, 1.20 밀리몰)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 1(300 mg, 0.601 밀리몰, 제조예 7로부터)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 디클로로메탄(60 mL) 및 물(60 mL)로 추출하였다. 유기상을 물(60 mL × 3)로 3회 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(PE:EtOAc = 0:1)로 정제하여 화합물 3(300 mg, 90% 수율)을 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 30-90CD_3분, 체류 시간 2.225분; MS(ESI) m/z = 698.4 [M+Na]+.
화합물 4
화합물 3(300 mg, 0.444 밀리몰)을 THF(3 mL) 및 H2O(1 mL)에 용해시키고, LiOH·H2O(75 mg, 1.78 밀리몰)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 감압 하에 농축하고 물(5 mL)과 메탄올(5 mL)에 용해시킨 후 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 화합물 4(212 mg, 100% 수율)를 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80CD_3분, 체류 시간 1.333분; MS(ESI) m/z = 684.3 [M+Na]+.
HPLC: 크로마토그래피 조건 10-80CD_6분, 체류 시간 1.853분.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.47-7.38 (m, 2H), 7.35-7.25 (m, 6H), 7.24-7.17 (m, 1H), 6.86 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 4.30-4.17 (m, 2H), 3.99-3.88 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.42-3.33 (m, 2H), 3.16-3.04 (m, 2H), 2.18-2.05 (m, 4H), 1.92-1.70 (m, 2H), 1.65-1.46 (m, 4H), 1.36-1.17 (m, 12H).
화합물 5
화합물 NAG0026(300 mg, 0.197 밀리몰)을 무수 DMF(3 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 4(143 mg, 0.216 밀리몰), HOBt(32 mg, 0.236 밀리몰), DCC(53 mg, 0.256 밀리몰) 및 DIEA(0.1 mL, 0.590 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 40℃에서 16시간 동안 반응하도록 방치하였다. LC-MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물로 급랭하고 여과하였다. 여액을 농축한 다음 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, H2O/MeCN, 5%에서 80%로 용출)로 정제하여 화합물 5(110 mg, 28% 수율)를 수득하였다.
화합물 NAG0049
화합물 5(110 mg, 0.051 밀리몰)를 무수 피리딘(3 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg), DMAP(31 mg, 0.255 밀리몰) 및 숙신산 무수물(51 mg, 0.510 밀리몰)을 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. LC-MS는 출발 물질의 약 50%가 소비되었음을 보여주었다. 반응 용액을 여과하고, 농축하고, 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, H2O/MeCN, 5%에서 70%로 용출)로 정제하여 NAG0049(45 mg, 39% 수율)를 수득하였다.
MS (ESI) m/z = 2267.0 [M-1]-, 계산값: 2268.0.
1H NMR (400 MHz, CH3CN-d 3) δ 7.62-6.40 (m, 22H), 5.31 (s, 3H), 5.21-5.02 (m, 4H), 4.64 (dd, J = 8.7, 6.2 Hz, 3H), 4.16 (s, 2H), 4.13-3.94 (m, 14H), 3.79 (s, 10H), 3.72-3.38 (m, 24H), 3.32-3.11 (m, 5H), 2.56 (t, J = 3.4 Hz, 4H), 2.34-2.20 (m, 16H), 1.99 (d, J = 11.3 Hz, 24H), 1.41 (d, J = 127.6 Hz, 21H).
제조예 6: 화합물 NAG0050의 합성
화합물 3
화합물 2(435 mg, 1.780 밀리몰)를 DCM(10 mL)에 용해시키고, DIEA(0.441 mL, 2.67 밀리몰) 및 HATU(677 mg, 1.78 밀리몰)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 1(400 mg, 0.890 밀리몰, 제조예 8로부터)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 디클로로메탄(60 mL) 및 물(60 mL)로 추출하였다. 유기상을 물(60 mL × 3)로 3회 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(PE:EtOAc = 0:1)로 정제하여 화합물 3(600 mg, 90% 수율)을 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 30-90CD_3분, 체류 시간 2.745분; MS(ESI) m/z = 698.4 [M+Na]+.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.46-7.38 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.22-7.16 (m, 1H), 6.90-6.78 (m, 4H), 4.29-4.21 (m, 2H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.66-3.62 (m, 3H), 3.41 (s, 1H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.36-2.17 (m, 5H), 1.71-1.50 (m, 5H), 1.39-1.25 (m, 14H).
화합물 4
화합물 3(600 mg, 0.799 밀리몰)을 THF(3 mL) 및 H2O(1 mL)에 용해시키고, LiOH·H2O(134 mg, 3.20 밀리몰)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 감압 하에 농축하고 물(5 mL)과 메탄올(5 mL)에 용해시킨 후 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 화합물 4(460 mg, 100% 수율, 리튬염)를 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80CD_3분, 체류 시간 1.346분; MS(ESI) m/z = 684.3 [M+Na]+.
HPLC: 크로마토그래피 조건 10-80CD_6분, 체류 시간 1.879분.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.47-7.39 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.22-7.15 (m, 1H), 6.91-6.79 (m, 4H), 4.31-4.18 (m, 2H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.44-3.33 (m, 2H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.35-2.27 (m, 1H), 2.24-2.10 (m, 4H), 1.70-1.51 (m, 5H), 1.31-1.23 (m, 12H).
화합물 5
화합물 NAG0026(300 mg, 0.197 밀리몰)을 무수 DMF(3 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 4(143 mg, 0.216 밀리몰), HOBt(32 mg, 0.236 밀리몰), DCC(53 mg, 0.256 밀리몰) 및 DIEA(0.1 mL, 0.590 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 40℃에서 16시간 동안 반응하도록 방치하였다. LC-MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물로 급랭하고 여과하였다. 여액을 농축한 다음 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, H2O/MeCN, 5%에서 80%로 용출)로 정제하여 화합물 5(300 mg, 73% 수율)를 수득하였다.
화합물 NAG0050
화합물 5(310 mg, 0.143 밀리몰)를 무수 피리딘(5 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg), DMAP(87 mg, 0.714 밀리몰) 및 숙신산 무수물(143 mg, 1.429 밀리몰)을 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. LC-MS는 출발 물질의 약 50%가 소비되었음을 보여주었다. 반응 용액을 여과하고, 농축하고, 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, H2O/MeCN, 5%에서 70%로 용출)로 정제하여 NAG0050(140 mg, 43% 수율)을 수득하였다.
MS(ESI) m/z = 2267.1 [M-1]-, 계산값: 2268.0.
1H NMR (400 MHz, CH3CN-d 3) δ 7.54-7.14 (m, 14H), 6.97-6.64 (m, 8H), 5.32 (d, J = 3.4 Hz, 3H), 5.21-5.04 (m, 4H), 4.71-4.60 (m, 3H), 4.30 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 4.17-3.95 (m, 14H), 3.93-3.84 (m, 3H), 3.79 (s, 7H), 3.74-3.65 (m, 3H), 3.63-3.08 (m, 26H), 2.57 (d, J = 2.0 Hz, 6H), 2.46-2.28 (m, 8H), 2.20 (dt, J = 15.1, 7.4 Hz, 5H), 2.11 (s, 2H), 2.01-1.97 (m, 16H), 1.90-1.88 (m, 9H), 1.65-1.55 (m, 4H), 1.39-1.20 (m, 14H).
제조예 7: 화합물 NAG0051
화합물 2
용매 디클로로메탄(100 mL)에 화합물 1(5.00 g, 21.4 밀리몰) 및 TEA(8.04 mL, 57.9 밀리몰)를 첨가하였다. DMTrCl(9.08 g, 26.8 밀리몰)을 0℃에서 교반하면서 상기 시스템에 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 25℃로 가열하고 12시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액에 포화 탄산수소나트륨 용액(100 mL)을 첨가하고 DCM(100 × 3)으로 추출하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(PE:EtOAc 100:0-70:30)로 정제하여 화합물 2(12 g, 94% 수율)를 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 5-95AB_1.5분, 체류 시간 1.166분; MS(ESI) m/z = 558.1 [M+Na]+.
1H NMR: (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.52-7.47 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 8H), 7.34-7.27 (m, 3H), 7.26-7.19 (m, 1H), 6.89-6.81 (m, 4H), 5.68 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.18-5.08 (m, 3H), 4.83 (br d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.55-4.42 (m, 2H), 3.82 (s, 6H), 2.43-2.29 (m, 1H), 1.39-1.32 (m, 2H).
화합물 3
화합물 2(6.00 g, 10.1 밀리몰)를 용매 THF(100 mL)에 첨가하고, BH3THF(1M, 20.2 mL, 20.2 밀리몰)를 상기 시스템에 0℃에서 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 반응하도록 방치하였다. 이어서, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, EtOH(6 mL) 및 NaOH(20 mL, 60.0 밀리몰)를 0℃에서 천천히 첨가하였다. 마지막으로 0℃에서 반응 용액에 H2O2(20 mL, 33.4 밀리몰)를 천천히 적가하였다. 이어서, 반응 용액을 20℃로 천천히 가열하고 12시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 여과하고 H2O(200 mL) 및 EtOAc(200 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc(3 × 200 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 Na2SO3 용액(100 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH)로 정제하여 조질의 생성물(3.5 g)을 수득하였고, 생성물을 기본 분취용 크로마토그래피(컬럼: Xbridge 150 × 50 mm, 5 ㎛; 이동상: A: 물 중 0.1% NH3H2O + 0.005% FA, B: MeCN, 구배: 9분 내 20% B-95% B)로 분리하여 화합물 3(850 mg, 15% 수율) 및 화합물 4(800 mg, 14% 수율)를 수득하였다.
화합물 3
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80AB_7분, 체류 시간 4.214분; MS(ESI) m/z = 576.3 [M+Na]+.
1H NMR: (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.31-7.23 (m, 6H), 7.23-7.19 (m, 5H), 7.12-7.08 (m, 3H), 6.79-6.73 (m, 4H), 5.12 (s, 1H), 5.01 (s, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.01-3.95 (m, 1H), 3.75-3.71 (m, 6H), 2.48-2.27 (m, 1H), 2.12-1.84 (m, 2H), 1.57 (br d, J = 14.6 Hz, 1H).
화합물 4
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80AB_7분, 체류 시간 4.305분; MS(ESI) m/z = 576.3 [M+Na]+.
1H NMR: (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.37-7.33 (m, 1H), 7.31-7.19 (m, 11H), 7.15-7.08 (m, 2H), 6.78-6.69 (m, 4H), 5.08-4.98 (m, 3H), 4.39-4.05 (m, 2H), 3.71 (m, 6H), 3.54-3.36 (m, 1H), 2.37-1.97 (m, 1H), 1.87-1.65 (m, 2H), 1.14-0.99 (m, 1H).
화합물 5
Pd/C 5%(300 mg, 0.141 밀리몰)를 EtOAc(10 mL) 중 화합물 3(600 mg, 1.030 밀리몰)의 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 수소 분위기(15psi) 하에 20℃에서 2시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 여과하고 농축하여 조질의 생성물을 수득하였고, 조질의 생성물을 기본 분취용 크로마토그래피(컬럼: Xbridge 150 × 50 mm, 5 ㎛; 이동상: A: 물 중 0.1% NH3H2O + 0.005% FA; B: MeCN, 구배: 9분 내 20% B-95% B)로 분리하여 화합물 5(301 mg, 70% 수율)를 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80CD_3분, 체류 시간 2.444분; MS(ESI) m/z = 839.5 [2M+H]+.
HPLC: 크로마토그래피 조건 10-80CD_7분, 체류 시간 4.100분.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.49-7.44 (m, 2H), 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.32-7.26 (m, 2H), 7.24-7.18 (m, 1H), 6.91-6.82 (m, 4H), 4.22-4.11 (m, 1H), 3.85-3.81 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 2.78-2.68 (m, 1H), 1.90-1.83 (m, 1H), 1.73-1.65 (m, 1H), 1.41-1.33 (m, 1H), 1.29-1.25 (m, 1H).
화합물 7
화합물 6(233 mg, 0.953 밀리몰), HATU(272 mg, 0.715 밀리몰) 및 DIEA(0.236 mL, 1.430 밀리몰)를 DCM(10 mL)에 용해시키고, 화합물 5(200 mg, 0.477 밀리몰)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 반응하도록 방치하였다. H2O(20 mL)를 첨가하고, 혼합물을 DCM(20 mL × 3)으로 추출하였다. 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(PE/EtOAc = 1/1-1/2)로 분리하여 화합물 7(290 mg)을 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 10-80CD_3분, 체류 시간 2.834분; MS(ESI) m/z = 668.4 [M+Na]+.
1H NMR: (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.49-7.44 (m, 2H), 7.41-7.30 (m, 6H), 7.25-7.18 (m, 1H), 6.89-6.79 (m, 4H), 4.30-4.07 (m, 2H), 3.87-3.79 (m, 7H), 3.73-3.64 (m, 4H), 2.8-2.80 (m, 7H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.24-2.13 (m, 2H), 2.01-1.89 (m, 1H), 1.80-1.75 (m, 1H), 1.65-1.60 (m, 5H), 1.58 (s, 4H), 1.20-1.10 (m, 1H).
화합물 8
화합물 7(290 mg, 0.404 밀리몰)을 THF(10 mL) 및 H2O(5 mL)에 용해시키고, LiOH(51 mg, 1.212 밀리몰)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 반응하도록 방치하였다. TLC(DCM/MeOH = 10/1)에 따르면 출발 물질의 약 20%가 소모되지 않았으므로 LiOH를 50 mg 더 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 반응하도록 방치하였고, TLC(DCM/MeOH = 10/1)는 출발 물질이 완전히 소비되었음을 보여주었다. 반응 용액을 농축하고, 잔류물을 역상 크로마토그래피(H2O/CH3CN = 5/1-3/1)로 분리하여 화합물 8(217 mg)을 수득하였다.
LCMS: 크로마토그래피 조건 5-95CDN_1.5분, 체류 시간 0.879분; MS(ESI) m/z = 630.3 [M-H]+.
HPLC: 크로마토그래피 조건 10-80CD_7분, 체류 시간 2.677분.
1H NMR: (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.50-7.44 (m, 2H), 7.38-7.32 (m, 4H), 7.32-7.27 (m, 2H), 7.24-7.19 (m, 1H), 6.91-6.85 (m, 4H), 4.25-4.14 (m, 1H), 4.02-3.96 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.73-3.65 (m, 1H), 2.20-2.10 (m, 4H), 1.97-1.86 (m, 1H), 1.75-1.70 (m, 1H), 1.66-1.53 (m, 4H), 1.51-1.41 (m, 1H), 1.37-1.26 (m, 13H).
화합물 9
화합물 NAG0026(300 mg, 0.197 밀리몰)을 무수 DMF(4 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 8(137 mg, 0.217 밀리몰), HOBt(32 mg, 0.236 밀리몰), DCC(53 mg, 0.256 밀리몰) 및 DIEA(0.10 mL, 0.591 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 40℃에서 16시간 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 용액을 물로 급랭하고 여과하였다. 여액을 농축한 후 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, H2O/MeCN, 5%에서 80%로 용출)로 정제하여 화합물 9(330 mg)를 수득하였다.
화합물 NAG0051
화합물 9(330 mg, 0.154 밀리몰)를 무수 피리딘(5 mL)에 용해시키고, 3A 분자체(100 mg), DMAP(94 mg, 0.771 밀리몰) 및 숙신산 무수물(154 mg, 1.543 밀리몰)을 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 50℃에서 48시간 동안 교반하였다. LC-MS는 출발 물질의 약 60%가 소비되었음을 보여주었다. 반응 용액을 여과하고, 농축하고, 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, H2O/MeCN, 5%에서 70%로 용출)로 정제하여 NAG0051(190 mg)을 수득하였다.
MS(ESI) m/z = 2237.3[M-1]-, 계산값: 2238.0.
1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 7.54-7.16 (m, 14H), 7.01-6.53 (m, 8H), 5.32 (d, J = 5.1 Hz, 3H), 5.20-4.89 (m, 4H), 4.65 (q, J = 7.2 Hz, 3H), 4.38-3.20 (m, 52H), 2.51-2.44 (m, 4H), 2.36-2.20 (m, 20H), 2.02-1.97 (m, 20H), 1.64-1.20 (m, 22H).
제조예 8: NAG0052의 합성
화합물 3
화합물 NAG0024(271 mg, 0.151 밀리몰)를 질소 분위기 하에 실온에서 무수 THF(2 mL) 및 무수 DMF(4 mL)에 용해시키고, 3A 분자체를 첨가하였다. 이어서, 화합물 2(100 mg, 0.151 밀리몰), HOBt(25 mg, 0.181 밀리몰), DCC(38 mg, 0.181 밀리몰) 및 DIEA(39 mg, 0.302 밀리몰)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 45℃에서 16시간 동안 반응하도록 방치하였다. LC-MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물로 급랭하고 여과하였다. 여액을 농축한 후 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제하여 화합물 3(210 mg, 57% 수율)을 수득하였다.
화합물 NAG0052
화합물 3(230 mg, 0.094 밀리몰)을 실온에서 피리딘(5 mL)에 용해시키고 분자체를 첨가하였다. DMAP(12 mg, 0.283 밀리몰) 및 숙신산 무수물(28 mg, 0.283 밀리몰)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS 분석에 따르면 반응이 완료된 것으로 나타났다. 반응 용액을 여과하고 농축하였다. 잔류물을 역상 컬럼 크로마토그래피(보스턴 C18 컬럼, 0-100% MeCN/H2O)로 정제한 후 분취용 HPLC(컬럼: Xbridge 150 × 50 mm, 5 ㎛; 이동상: A: 0.1% NH3H2O + 물 중 0.005% FA, B: MeCN, 구배: 9분 내 20% B-95% B)로 정제하여 화합물 NAG0052(123 mg, 0.048 밀리몰, 51% 수율)를 수득하였다.
MS(ESI) m/z = 2535.3 [M-1]-, 계산값: 2536.2.
1H NMR (400 MHz, CH3CN-d 3) δ 7.48-7.43 (m, 2H), 7.37-7.12 (m, 11H), 7.00-6.85 (m, 10H), 6.66 (s, 1H), 5.31 (dd, J = 3.4, 1.1 Hz, 3H), 5.20-5.13 (m, 1H), 5.05 (dd, J = 11.3, 3.4 Hz, 3H), 4.56 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.30 (dd, J = 7.7, 5.3 Hz, 1H), 4.18-3.93 (m, 14H), 3.79 (s, 10H), 3.65 (q, J = 4.7, 3.6 Hz, 13H), 3.56-3.07 (m, 24H), 2.56 (s, 6H), 2.37 (t, J = 5.8 Hz, 10H), 2.17 (t, J = 7.5 Hz, 9H), 2.02-1.96 (m, 20H), 1.88 (s, 8H), 1.82-1.73 (m, 2H), 1.60 (dt, J = 15.0, 7.3 Hz, 16H), 1.27 (s, 13H).
제조예 9: L96 및 NAG1의 합성
L96은 국제 특허출원 공개공보 제WO2014025805A1호에 기재된 방법에 따라 제조하였고, NAG1은 국제 특허출원 공개공보 제WO2021254360A1호에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 이들 특허 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
제조예 10: 핵산 리간드 접합체의 합성
1. 지지체를 갖는 수지의 제조
카르복실산 기 함유 화합물 NAG0050(140 mg, 0.062 밀리몰)을 무수 DMF(3 mL)에 용해시켰다. 기질이 완전히 용해된 후 무수 아세토니트릴(4 mL), DIEA(0.03 mL, 0.154 밀리몰, 2.5 당량) 및 HBTU(35 mg, 0.093 밀리몰, 1.5 당량)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 잘 혼합한 후, 거대다공성 아미노메틸 수지(476 mg, 블랭크 적재 0.41 밀리몰/g, 표적 적재 0.1 밀리몰/g)를 첨가하였다. 반응 용액을 진탕기(온도: 25℃, 회전 속도: 200rpm)에서 밤새 진탕시켰다. 반응 용액을 여과하였다. 여과 케이크를 DCM으로 세척한 다음 무수 아세토니트릴로 세척하였다. 고체를 수집하고 진공하에 밤새 건조시켰다.
이어서, 고체를 무수 아세토니트릴(5 mL)에 분산시키고, 피리딘(0.18 mL), DMAP(3 mg), NMI(0.12 mL) 및 CapB1(2.68 mL)을 순차적으로 첨가하였다. 반응 용액을 진탕기(온도: 25℃, 회전 속도: 200 rpm)에서 2시간 동안 진탕시켰다. 반응 용액을 여과하였다. 여과 케이크를 무수 아세토니트릴로 세척하였다. 고체를 수집하고 진공하에 밤새 건조시켜 지지체를 갖는 수지를 수득하였다. 적재는 0.1 밀리몰/g으로 측정되었다.
화합물 NAG0051 및 NAG0052를 동일한 반응 조건에 적용하여 지지체를 갖는 수지를 수득하였다.
2. 수지에 부착되어 있던 NAG0050-NAG0052는 수지를 출발 물질로 사용하였고, 뉴클레오시드 단량체를 뉴클레오티드가 배열되는 순서대로 3'-5' 방향으로 하나씩 부착하였다. 뉴클레오시드 단량체가 부착될 때마다 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화 등 4가지 반응이 수반되었다.
기기 모델: 바이오라이틱 닥터 올리고(Biolytic Dr. Oligo) 48 고체상 합성기, 바이오콤마 임베드(Biocomma Embed: 상표명) CPG 프리츠(Frits) 범용 합성 컬럼 DS0200 및 바이오콤마 96-웰 플레이트 탈염 컬럼 DC189650(80 mg).
표 1
siRNA 접합체의 합성에 사용되는 시약
합성 조건:
뉴클레오시드 단량체는 아세토니트릴 중 0.05M 용액 형태로 제공되었다. 각 탈보호 반응의 조건은 동일하였다: 온도는 25℃였고; 반응 시간은 3분이었으며; 탈보호 시약은 DCA였고; 주입 부피는 180 ㎕였다.
각 커플링 반응의 조건은 동일하였다: 온도는 25℃였고; 반응 시간은 3분이었으며; 뉴클레오시드 단량체의 주입 부피는 90 ㎕였고; 촉매 ACT의 주입 부피는 110 ㎕였다.
각 캡핑 반응의 조건은 동일하였다: 온도는 25℃였고; 반응 시간은 2분이었으며; 캡핑 시약은 CapA와 CapB의 1:1(몰비) 혼합 용액(CapB1:CapB2 = 1:1)이었고; 캡핑 시약의 주입 부피는 180 ㎕였다.
각 산화 반응의 조건은 동일하였다: 온도는 25℃였고; 반응 시간은 3분이었으며; 산화제 OXD의 주입 부피는 180 ㎕였다.
각 황화 반응의 조건은 동일하였다: 온도는 25℃였고; 반응 시간은 4분이었으며; 황화제는 피리딜아세토니트릴 중 PADS의 0.05M 용액이었고; 황화제의 주입 부피는 180 ㎕였다.
3. 마지막 뉴클레오시드 단량체가 부착된 후, 고체상 지지체에 부착된 핵산 서열을 절단, 탈보호, 정제, 탈염한 후 동결건조시켜 센스 가닥과 안티센스 가닥을 수득하였으며, 여기서:
3-1. 절단 및 탈보호 조건: 지지체에 부착된 합성된 뉴클레오티드 서열을 암모니아수와 에탄올의 혼합 용액(3:1)에 부피가 0.8 mL가 될 때까지 첨가하였다. 50℃에서 15시간 동안 반응을 실행하였다. 남은 지지체를 여과로 제거하고, 상청액을 진공 하에 농축 건조시켰다.
3-2. 정제 및 탈염 조건: 바이오콤마 96웰 플레이트 탈염 컬럼 DC189650(80 mg)을 사용하여 탈염을 수행하였다. 구체적인 조건은 다음과 같다:
3-2-1. 샘플 준비
0.1 M TEAA(트리에틸아민 아세테이트)를 부피가 0.8 mL가 될 때까지 올리고뉴클레오티드 샘플에 첨가하였다.
3-2-2. 96웰 플레이트 활성화
활성화: 활성화를 위해 96웰 플레이트의 각 웰에 아세토니트릴 0.8 mL를 첨가하였다.
평형화: 96웰 플레이트를 0.8 mL의 TEAA(pH 7.0) 용액으로 평형화하였다.
3-2-3. 정화 과정:
올리고뉴클레오티드를 함유한 용액 0.8 mL를 탈염 컬럼을 통과시켰고; 96웰 플레이트를 0.8 mL의 6.5% 암모니아수로 2회 세척하여 실패한 서열을 제거하였고; 96웰 플레이트를 0.8 mL의 탈이온수로 2회 세척하여 염을 제거하였고; 96웰 플레이트를 0.8 mL의 3% 트리플루오로아세트산으로 3회 세척하여 DMT를 제거한 결과, 흡착 층이 주황색-빨간색으로 변하는 것이 관찰되었고; 96웰 플레이트를 0.8 mL의 0.1M TEAA로 헹구고; 96웰 플레이트를 0.8 mL의 탈이온수로 2회 세척하여 트리플루오로아세트산과 잔류 염을 제거하였고; 0.6 mL의 20% 아세토니트릴로 용출시키고, 용출액을 수집하여 동결건조시켰다.
검출 방법: 워터스 애쿼티(Waters Acquity) UPLC-SQD2 LCMS(컬럼: ACQUITY UPLC BEH C18)를 사용하여 상기 기재된 센스 및 안티센스 가닥의 순도를 결정하고 분자량을 분석하였다. 발견된 값은 계산된 값과 일치하며, 이는 합성된 물질이 3' 말단이 접합 분자에 접합된 센스 및 안티센스 가닥임을 시사한다.
4. 어닐링 과정:
3단계에서 합성된 센스 및 안티센스 가닥을 주사용수에 용해시켜 1000 ng/㎕ 용액을 형성하고, 용액을 QPCR 기기[어플라이드 바이오시스템스 퀀트스튜디오(Applied Biosystems QuantStudio) 6&7 프로(Pro)]에서 등몰 비로 혼합하고 90℃에서 10분 동안 가열하고 5℃씩 감소할 때마다 3분 동안 유지시키고 마지막으로 25℃에서 10분 동안 유지시켜 수소 결합을 통해 이중 가닥 구조를 형성하였다. 발견된 값은 계산된 값과 일치하며, 이는 합성된 siRNA 접합체가 접합 분자를 갖는 고안된 이중 가닥 핵산 서열임을 시사한다. siRNA는 표 2와 표 3에 표시된 센스 및 안티센스 가닥을 갖는다.
표 2
표 3
센스 및 안티센스 가닥의 핵산 서열
상기 접합체의 구조는 다음과 같다:
접합체 TRD002218을 기준 양성 화합물로 사용하였다.
시험예 1
본 실험에서는 다양한 구조물과 접합된 본 개시내용의 siRNA 접합체를 생체내에서 표적 유전자의 mRNA 발현 수준에 대한 억제 효율에 대하여 조사하였다.
6 내지 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 시점당 3마리씩 무작위로 6마리의 그룹으로 나누었다. 이들 마우스 그룹에 본 개시내용의 접합체(3가지 접합체: TRD007203, TRD007204 및 TRD007205), 기준 양성 핵산-리간드 접합체 TRD002218 및 PBS를 투여하였다.
모든 동물에게 체중에 따라 단일 피하 주사를 투여하였다. siRNA 접합체의 용량(siRNA 기준)은 1 mg/kg이고, 부피는 5 mL/kg이었다. 투여 후 7일 및 28일에 마우스를 희생시키고, 간을 채취하여 이후 RNA[시그마 알드리치(Sigma Aldrich)]와 함께 보관하였다. 이후, 조직 균질기를 이용하여 간 조직을 균질화한 후, 조직 RNA 추출 키트[파이어겐 바이오메디칼스(FireGen Biomedicals), FG0412]를 이용하여 설명서에 기재된 과정에 따라 간 조직에서 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA를 cDNA로 역전사시키고 실시간 형광 정량 PCR을 통해 간 조직 내 TTR mRNA 발현 수준을 측정하였다. 형광 정량 PCR 방법에서는 내부 기준 유전자로 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 사용하였고, 각각 TTR 및 GAPDH에 대한 Taqman 프로브 프라이머를 사용하여 TTR 및 GAPDH mRNA 발현 수준을 측정하였다.
표 4
마우스의 생체내 시험에 사용된 화합물의 그룹화
표 5
검출 프라이머의 서열
TTR mRNA 발현 수준은 아래 식에 따라 계산되었다:
TTR mRNA 발현 = [(시험군의 TTR mRNA 발현 / 시험군의 GAPDH mRNA 발현) / (대조군의 TTR mRNA 발현 / 대조군의 GAPDH mRNA 발현)] × 100%.
다양한 구조물과 접합된 본 개시내용의 siRNA 접합체의 투여 후 7일 및 28에 생체내 표적 유전자 mRNA 발현 수준에 대한 억제 효율을 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1의 결과에서 알 수 있듯이, NAG0050의 접합체 TRD007203과 NAG0052의 접합체 TRD007205는 투여 7일 후 TTR mRNA 발현을 잘 억제하였고, NAG0050의 접합체 TRD007203은 L96의 접합체 TRD002218보다 훨씬 더 우수한 효과를 나타내었고, 이는 보다 효율적인 siRNA 전달을 매개할 수 있음을 시사한다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 투여 28일 후 NAG0050의 접합체 TRD007203, NAG0051의 접합체 TRD007204 및 NAG0052의 접합체 TRD007205는 모두 L96의 접합체 TRD002218보다 표적 유전자 mRNA 발현 수준에 대하여 더 우수한 억제 효과를 나타냈으며, NAG0050의 접합체 TRD007203의 우수성은 가장 유의미하다.
제조예 11: 핵산 리간드 접합체의 합성
제조예 10의 과정을 참조하여 다음과 같은 siRNA 접합체를 합성하였다. siRNA는 표 6 및 표 7에 제시된 센스 및 안티센스 가닥을 갖는다.
표 6
핵산 화합물
접합체 TRD6233, TRD6238 및 TRD6253을 기준 양성 화합물로 사용하였다.
표 7
센스 및 안티센스 가닥의 핵산 서열
036은 국제 특허출원 공개공보 제WO2022028462A1호에 개시된 (-)hmpNA(A) 변형(서열에 의한 염기 변경)을 나타낸다.
시험예 2. siRNA 서열 psiCHECK 11 농도점 표적화 활성
표 6의 siRNA 서열에 대하여 11개 농도를 사용하여 HEK293A 세포[난징 코바이오어(Nanjing Cobioer)]에서 표적화 활성 스크리닝의 시험관내 분자 수준 시뮬레이션을 적용하였다.
상응하는 표적화 siRNA 서열을 인간 FXI, ANGPTL3 및 MARC1 유전자로부터 작성하고 psiCHECK-2 플라스미드[상온 바이오텍 컴퍼니 리미티드(Sangon Biotech Co., Ltd.)]에 삽입하였다. 플라스미드는 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase) 유전자와 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 함유하였다. 플라스미드는 이중 리포터 유전자 시스템이었다. siRNA의 표적 서열을 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3' UTR 영역에 삽입하였다. 반딧불이 루시퍼라제로 보정한 후 레닐라 루시퍼라제 발현을 측정하여 표적 서열에 대한 siRNA의 활성을 반영하였다. 측정에는 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템(Dual-Luciferase Reporter Assay System)[프로메가(Promega), E2940]을 사용하였다.
HEK293A 세포를 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM 고 글루코스 배지에서 5% CO2하에 37℃에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전에 HEK293A 세포를 96웰 플레이트 상에 접종하였고, 각 웰은 웰당 8 × 103 세포의 밀도로 100 ㎕의 배지를 함유하였다.
리포펙타민(Lipofectamine)2000[써모피셔(ThermoFisher), 11668019]을 사용하여 세포를 siRNA 및 해당 플라스미드로 공동 형질감염시켰고; 웰당 0.2 ㎕의 리포펙타민2000과 20 ng의 플라스미드를 사용하였다. 표적화 서열 플라스미드의 경우, 총 11개의 siRNA 농도점을 설정하였다. 최고 농도점 최종 농도는 20nM이었으며, 3배 연속 희석을 실시하였다. 형질감염 24시간 후, 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템(프로메가, E2940)을 사용하여 표적화 수준을 결정하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)5를 이용하여 데이터를 분석하였고, 그 결과를 표 8에 나타내었다.
표 8
siRNA 서열 psi-CHECK 표적화 활성 스크리닝 결과
결과는 본 개시내용의 리간드 NAG0052가 다양한 구조적 서열의 siRNA와 접합될 때 세포에서 표적 유전자 mRNA 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
시험예 3. 인간 1차 간세포(PHH: primary human hepatocyte)에서 siRNA에 의한 인간 FXI, ANGPTL3, 및 MACR1의 억제
표 6의 siRNA에 대하여 5 또는 7가지 농도를 사용하여 1차 인간 간세포[PHH, 노바비오시스(Novabiosis)]에서 1차 인간 간세포(PHH) 활성 스크리닝을 실시하였다.
1차 인간 간세포(PHH)를 액체 질소에 냉동보존하고, 형질감염 24시간 전에 1차 인간 간세포(PHH)를 해동한 후 96웰 플레이트 상에 접종하였고, 각 웰은 80 ㎕의 배지를 웰당 3×104 세포의 밀도로 함유하였다. siRNA 형질감염에는 리포펙타민 RNAi MAX(써모피셔, 13778150)를 사용하였다. 7-농도점 실험을 위한 siRNA 형질감염 구배 최종 농도는 10nM, 2nM, 0.4nM, 0.08nM, 0.016nM, 0.0032nM 및 0.00064nM이었다. 5-농도점 실험을 위한 siRNA 형질감염 구배 최종 농도는 5nM, 0.625nM, 0.0781nM, 0.00977nM 및 0.00122nM이었다. 24시간 처리 후, 고처리량 세포 RNA 추출 키트(파이어겐, FG0417)를 사용하여 세포 전체 RNA 추출을 수행하였고, RNA 역전사 키트[타카라(Takara), 6210A]를 사용하여 역전사를 수행하였으며, Taqman 프로브 Q-PCR 키트(써모피셔, 4444964)를 사용하여 인간 FXI, ANGPTL3 및 MACR1의 mRNA 수준을 결정하였다. 인간 FXI, ANGPTL3 및 MACR1의 mRNA 수준을 GAPDH 내부 기준 유전자 수준에 따라 보정하였다. Taqman 프로브 프라이머는 표 9에 제시되어 있다. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터 처리를 수행하였고, 결과는 대조 siRNA 처리를 받은 세포에 대하여 인간 FXI, ANGPTL3 및 MACR1 mRNA 발현의 잔존 백분율로 표시된다. 억제율 IC50 결과를 표 10 및 표 11에 나타내었다.
ΔΔCt = [(Ct 실험군 표적 유전자 - Ct 실험군 내부 기준) - (Ct 대조군 표적 유전자 - Ct 대조군 내부 기준)].
억제율(%) = (1 - 표적 유전자 발현의 잔존량) × 100%.
표 9
Taqman 프라이머
표 10
PHH 세포에서 siRNA의 다중 용량 억제 활성
표 11
PHH 세포에서 siRNA의 다중 용량 억제 활성
결과는 본 개시내용의 리간드 NAG0052가 다양한 구조적 서열의 siRNA와 접합될 때 1차 인간 간세포에서 표적 유전자 mRNA 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다. NAG0052의 접합체 TRD008024, TRD008025 및 TRD008026은 NAG1의 접합체 TRD6233, TRD6238 및 TRD6253보다 PHH 세포에 대해 더 우수한 억제 활성을 나타내었다.
시험예 4. 1차 사이노몰구스 원숭이 간세포(PCH: Primary Cynomolgus Monkey Hepatocyte)에서 siRNA에 의한 FXI의 억제 - 7-농도점 억제 활성
표 6의 FXI의 2개의 siRNA에 대하여 7가지 농도를 사용하여 1차 원숭이 간세포[PCH, 마일스톤(Milestone)]에서 역형질감염 활성 스크리닝을 실시하였다. 각 siRNA 샘플의 형질감염을 위한 초기 최종 농도는 10nM이었으며, 5배 연속 희석을 수행하여 7개의 농도점을 수득하였다.
일차 원숭이 간세포(PCH)를 액체 질소에 냉동보존하고, 형질감염 전에 1차 원숭이 간세포(PCH)를 해동한 후 96웰 플레이트 상에 접종하였고, 각 웰은 90 ㎕의 배지를 웰당 3 × 104 세포의 밀도로 함유하였다. siRNA 형질감염에는 리포펙타민 RNAi MAX(써모피셔, 13778150)를 사용하였고, siRNA 형질감염을 위한 최종 농도 구배는 10nM, 2nM, 0.4nM, 0.08nM, 0.016nM, 0.0032nM 및 0.00064nM이었다. 24시간 처리 후 고처리량 세포 RNA 추출 키트(파이어겐, FG0417)를 사용하여 세포 전체 RNA 추출을 수행하였고, RNA 역전사 키트(타카라, 6210A)를 사용하여 역전사를 수행하였으며, Taqman 프로브 Q-PCR 키트(써모피셔, 4444964)를 사용하여 원숭이 FXI의 mRNA 수준을 결정하였다. 원숭이 FXI의 mRNA 수준을 GAPDH 내부 기준 유전자 수준에 따라 보정하였다. Taqman 프로브 프라이머는 표 12에 제시되어 있다. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터 처리를 수행하였으며, 결과는 대조 siRNA 처리를 받은 세포에 대하여 원숭이 FXI mRNA 발현의 잔존 백분율로 표시된다. 억제율 IC50 결과를 표 13에 나타내었다.
ΔΔCt = [(Ct 실험군 표적 유전자 - Ct 실험군 내부 기준) - (Ct 대조군 표적 유전자 - Ct 대조군 내부 기준)].
억제율(%) = (1 - 표적 유전자 발현의 잔존량) × 100%.
표 12
원숭이 Taqman 프로브 프라이머
표 13
PCH에서 siRNA의 다중 용량 억제 활성
결과는 NAG0052의 접합체 TRD008002 및 TRD008003이 PCH 세포에서 FXI에 대해 매우 우수한 억제 활성을 가짐을 보여준다.
시험예 5. Huh7 세포에서 siRNA에 의한 인간 ANGPTL3의 억제 - 7 농도점 억제 활성
표 6의 siRNA에 대하여 Huh7 세포(난징 코바이오어)에서 7가지 농도를 이용하여 Huh7 세포 활성 스크리닝을 실시하였다. 각 siRNA 샘플의 형질감염을 위한 초기 최종 농도는 10nM이었으며, 5배 연속 희석을 수행하여 7개의 농도점을 수득하였다.
Huh7 세포를 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM 고 글루코스 배지에서 5% CO2하에 37℃에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전에 Huh7 세포를 96-웰 플레이트 상에 접종하였고, 각 웰은 웰당 10,000개 세포의 밀도로 100 ㎕의 배지를 함유하였다. siRNA 형질감염에는 리포펙타민 RNAi MAX(써모피셔, 13778150)를 사용하였으며, siRNA 형질감염을 위한 최종 농도는 10nM, 2nM, 0.4nM, 0.08nM, 0.016nM, 0.0032nM, 및 0.00064nM 이었다. 24시간 처리 후 고처리량 세포 RNA 추출 키트(파이어겐, FG0417)를 사용하여 세포 전체 RNA 추출을 수행하였고, RNA 역전사 키트(타카라, 6210A)를 사용하여 역전사를 수행하였으며, Taqman 프로브 Q-PCR 키트(써모피셔, 4444964)를 사용하여 인간 ANGPTL3의 mRNA 수준을 결정하였다. 인간 ANGPTL3의 mRNA 수준을 GAPDH 내부 기준 유전자 수준에 따라 보정하였다. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터 처리를 수행하였으며, 결과는 대조 siRNA 처리를 받은 세포에 대하여 인간 ANGPTL3 mRNA 발현의 잔존 백분율로 표시된다. 억제율 IC50 결과를 표 14에 나타내었다.
ΔΔCt = [(Ct 실험군 표적 유전자 - Ct 실험군 내부 기준) - (Ct 대조군 표적 유전자 - Ct 대조군 내부 기준)].
억제율(%) = (1 - 표적 유전자 발현의 잔존량) × 100%.
표 14
Huh7에서 인간 ANGPTL3에 대한 siRNA의 다중 용량 억제 활성
결과는 NAG0052의 접합체 TRD008004, TR008005 및 TRD008006이 Huh7 세포에서 ANGPTL3에 대해 효과적인 억제 활성을 나타내었음을 보여준다.
제조예 12: 핵산 리간드 접합체의 합성
제조예 10의 과정을 참조하여 시험예 6 및 7을 위해 다음과 같은 siRNA 접합체를 합성하였다. 상기 siRNA는 표 15에 나타낸 센스 및 안티센스 가닥을 갖는다.
표 15
시험예 6. 1차 간세포에서 갈락토사민 분자 클러스터 접합된 siRNA에 의한 mRNA 발현 억제
세베르기니(Severgini) 등에 의해 보고된 방법을 사용하여 마우스로부터 신선한 1차 간세포를 단리하였다[Cytotechnology. 2012;64(2):187-195].
단리 후, 1차 간세포를 웰당 100,000개 세포로 24웰 플레이트 상에 접종하였다. 테스트 siRNA 화합물을 50nM, 10nM, 2nM, 0.4nM, 0.08nM, 0.016nM, 0.0032nM 및 0.00064nM의 최종 농도로 첨가하였다. 후속적으로, 1차 간세포를 37℃에서 5% CO2 하에 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, qPCR 방법을 사용하여 mTTR의 mRNA 발현 수준을 결정하였다.
도 3은 siRNA 접합체 S-1(NAG1-접합) 및 S-L96(L96-접합)의 mRNA에 대한 농도별 억제율을 나타낸다. 도 3에 도시된 바와 같이, S-1은 mTTR 유전자 발현에 대해 탁월한 억제 효율을 나타내었다. 대조군 S-L96의 IC50 값은 0.280nM인 반면, S-1의 IC50 값은 0.131nM이었다. 이는 NAG1 접합된 siRNA가 대조군보다 더 우수한 효율로 시험관내에서 1차 간세포에 의해 자유롭게 흡수되었음을 시사한다. NAG1 접합은 siRNA가 1차 간세포로 진입하는 것을 더 효율적으로 중재할 수 있다. 시험예 3에서는 NAG0052 접합된 siRNA가 NAG1 접합된 siRNA보다 표적 유전자 발현에 대해 더 강한 억제 활성을 나타내었다. 전체적으로, 데이터는 NAG0052 접합체가 L96 접합체보다 더 우수한 억제 활성을 가짐을 시사한다.
시험예 7. 갈락토사민 분자 클러스터 접합된 siRNA에 의한 생체내 mRNA 발현 억제
8주령의 C57BL/6 마우스[조인바이오(Joinnbio), SPF, 암컷]에 상기 기재된 갈락토사민 분자 클러스터 접합된 siRNA를 피하 주사하였다. 1일차에 PBS 함유 용액(모의군, 즉 블랭크 대조군이라고 함) 또는 PBS에 제형화된 상응하는 갈락토사민 분자 클러스터 접합된 siRNA(S-L96 또는 S-1)의 용량(1 mg/kg(mpk) 또는 0.2 mpk)이 함유된 용액 100 ㎕을 마우스의 목과 어깨의 느슨한 피부에 피하 주사하였다. 각 그룹마다 6마리의 마우스에게 주사하였다.
투여 3일 후, 마우스를 경추 탈구로 희생시키고, 마우스의 간 조직에서 mTTR의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 측정하였다.
도 4는 다양한 용량의 S-1 및 S-L96을 각각 투여한 후 마우스 간 조직에서 mRNA의 발현 수준을 보여준다. 도 4에 도시된 바와 같이, S-1은 mTTR 유전자 발현에 대해 탁월한 억제 효율을 나타내었다. S-1은 1 mpk 및 0.2 mpk로 투여했을 때 대조군 S-L96보다 더 우수한 활성을 나타내었다. 시험예 3에서는 NAG0052 접합된 siRNA가 NAG1 접합된 siRNA보다 표적 유전자 발현에 대해 더 강한 억제 활성을 나타내었다. 전체적으로, 데이터는 NAG0052 접합체가 L96 접합체보다 더 우수한 억제 활성을 가짐을 시사한다.
Claims (30)
- 하기 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는 리간드:
[화학식 I]
상기 식에서,
L1은 C1-C30 알킬 사슬, 또는 하나 이상의 산소, 황 또는 질소 원자 또는 C=O가 개재된 C1-C30 알킬 사슬이고;
R1 및 R2는 독립적으로 화학 결합, -NR6-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이고;
Q는 또는 이고;
는 단일 또는 이중 결합이고; 가 단일 결합인 경우, R3은 독립적으로 CR7R8, NR6, O 또는 S이고; 가 이중 결합인 경우, R3은 독립적으로 CR9 또는 N이고;
R4는 독립적으로 CR9 또는 N이고;
고리 A는 존재하지 않거나, 또는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고; 고리 A가 존재하는 경우, R5는 독립적으로 CR9 또는 N이고; 고리 A가 존재하지 않는 경우, R5는 독립적으로 CR7R8, NR6 또는 O이고;
R6 및 R9는 독립적으로 수소, 중수소, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 또는 C(=O)NR'(R")이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C3-7 사이클로알킬, 3원 내지 12원 헤테로사이클릴, 5원 내지 12원 아릴, 5원 내지 12원 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 및 C(=O)NR'(R")로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 수소, 중수소, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 또는 C(=O)NR'(R")이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C3-7 사이클로알킬, 3원 내지 12원 헤테로사이클릴, 5원 내지 12원 아릴, 5원 내지 12원 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R"), NR'(R"), C(=O)R', C(=O)OR' 및 C(=O)NR'(R")로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되고;
R' 및 R"는 독립적으로 수소, 중수소, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 여기서 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되고;
m, n, p 및 q는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
B는 또는 이고;
Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-, -NHC(=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고;
z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
L2는 C1-C30 알킬 사슬, 또는 하나 이상의 산소, 황 또는 질소 원자 또는 C=O가 개재된 C1-C30 알킬 사슬이고;
r은 1 내지 10의 정수이다. - 제1항에 있어서,
L1이 L3 또는 L3-R10-R11-L3이고, 여기서 L3이 독립적으로 C1-C12 알킬 사슬, -(CH2)j1-C(=O)-(CH2)j2- 또는 -(CH2)j3-(CH2CH2O)1-4-(CH2)j4-이고; R10 및 R11이 독립적으로 화학 결합, -NR12-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이고; R12가 수소 또는 C1-C12 알킬이고; j1, j2, j3 및 j4가 독립적으로 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 2 또는 4 내지 10, 보다 바람직하게는 0, 1, 2, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수인, 리간드. - 제2항에 있어서,
L1이 -(CH2)j1-C(=O)-(CH2)j2-이고, 바람직하게는 L1이이고; 보다 바람직하게는 L1이 또는
이고; 여기서 말단 a1이 B에 부착되고, 말단 b1이 R1에 부착되는, 리간드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
R1 및 R2가 다음 조합 중 어느 하나인, 리간드:
조합 1: R1은 화학 결합이고 R2는 C=O임;.
조합 2: R1은 화학 결합이고 R2는 NR6임;
조합 3: R1은 화학 결합이고 R2는 -OC(=O)-임;
조합 4: R1은 NR6이고 R2는 C=O임;
조합 5: R1은 NR6이고 R2는 -OC(=O)-임;
조합 6: R2는 NR6이고 R1은 C=O임; 및
조합 7: R2는 NR6이고 R1은 -OC(=O)-임. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
R6이 수소 또는 C1-6 알킬이고, 바람직하게는 수소, 중수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필이고, 보다 바람직하게는 수소이고/이거나; R7 및 R8이 수소이고/이거나; R9가 수소인, 리간드. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
m이 0 또는 1인, 리간드. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
p 및 q가 다음 조합 중 어느 하나일 수 있는, 리간드:
조합 1: p = 1 및 q = 1;
조합 2: p = 1 및 q = 0;
조합 3: p = 0 및 q = 1; 및
조합 4: p = 0 및 q = 0. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
B가이고; Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5, Rb6 및 Rb7이 독립적으로 -C(=O)- 또는 -NHC(=O)-이고; 말단 a2의 N 원자가 L1에 부착되고; 바람직하게는 B가
인, 리간드.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
L2가 L4 또는 L4-R13-R14-L4이고, 여기서 L4가 독립적으로 C1-C12 알킬 사슬 또는 -(CH2)j5-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j6-이고; R13 및 R14가 독립적으로 화학 결합, -NR15-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이고; R15가 독립적으로 수소 또는 C1-C12 알킬이고; j5 및 j6이 독립적으로 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 6, 보다 바람직하게는 0, 1, 2, 3 또는 4의 정수인, 리간드. - 제9항에 있어서,
L2가 -(CH2)j5-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j6-이고, 바람직하게는인, 리간드.
- 제9항에 있어서,
L2가이고, 바람직하게는
이고, 보다 바람직하게는
이고, 더욱 바람직하게는
이고, 여기서 말단 a3이 O에 부착되고, 말단 b3이 B에 부착되는, 리간드.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
r이 3인, 리간드. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
는
이고, 바람직하게는
이고, 보다 바람직하게는
이고, 더욱 바람직하게는
인 리간드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
는
이고,
바람직하게는,
이고, 보다 바람직하게는
이고, 더욱 바람직하게는
인 리간드.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
리간드가 다음 구조의 화합물 중 어느 하나인, 리간드:
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
리간드가 다음 구조의 화합물 중 어느 하나인, 리간드:
- 하기 화학식 II로 표시되는 화합물:
[화학식 II]
상기 식에서,
X는 하이드록시 보호기이고, 하이드록시 보호기는 바람직하게는 에스테르 기 보호기, 알콕시메틸 보호기, 알킬 보호기, 실릴 보호기 또는 아릴 보호기이고, 보다 바람직하게는 MMTr(메톡시페닐 벤즈하이드릴) 및 DMTr(디메톡시트리틸)이고, 더욱 바람직하게는 DMTr이고;
Y는 수소, 중수소, 또는 이고;
j7은 1, 2, 3 또는 4이고, 바람직하게는 2이고;
W는 거대분자 화합물이고, 바람직하게는 수지이고, 보다 바람직하게는 거대다공성 수지이고, 더욱 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지이고;
L1, R1, R2, Q, B, L2, m, p, q 및 r은 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다. - 제17항에 있어서,
하기 화학식 II-1, II-2 또는 II-3으로 표시되는 화합물:
[화학식 II-1]
[화학식 II-2]
[화학식 II-3]
상기 식에서,
는 수지이고, 바람직하게는 거대다공성 수지이고, 보다 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지이고;
L1, R1, R2, B, L2, m, p, q 및 r은 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다. - 제17항 또는 제18항에 있어서,
다음 구조의 화합물 중 어느 하나인 화합물:
상기 식에서,
Y는 수소 또는이거나; 또는
Y는 이고, 여기서 는 수지이고, 바람직하게는 거대다공성 수지이고, 보다 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지이다. - 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
다음 구조의 화합물 중 어느 하나인 화합물:
상기 식에서,
Y는 수소 또는이거나; 또는
Y는 이고, 여기서 는 수지이고, 바람직하게는 거대다공성 수지이고, 보다 바람직하게는 거대다공성 아미노메틸 수지이다. - 핵산 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 리간드를 포함하고, 여기서 리간드가 핵산의 말단에 접합되고, 리간드가 동일하거나 상이한
핵산-리간드 접합체. - 제21항에 있어서,
핵산 및 리간드가 포스포에스테르 기, 포스포로티오에이트 기 또는 포스폰산 기로 연결되고/되거나; 핵산의 3' 말단이 리간드에 접합되고/되거나; 핵산이 단일 가닥 핵산이고, 바람직하게는 siRNA의 센스 가닥인 핵산-리간드 접합체. - 제21항 또는 제22항에 있어서,
핵산-리간드 접합체가 다음 구조의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 어느 하나인 핵산-리간드 접합체:
상기 식에서,
T는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 리간드이고, 각각의 T는 동일하거나 상이하고;
L5는 독립적으로 C1-C30 알킬 사슬, 또는 하나 이상의 산소, 황 또는 질소 원자 또는 C=O가 개재된 C1-C30 알킬 사슬이고, 바람직하게는
이고;
M은 독립적으로 O 또는 S이고;
g는 독립적으로 0 내지 4의 정수이고, 바람직하게는 0 또는 1이고, 보다 바람직하게는 0이고;
는 핵산을 나타낸다.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산-리간드 접합체가 다음 구조의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 어느 하나인 핵산-리간드 접합체:
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산-리간드 접합체가 다음 구조의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 어느 하나인 핵산-리간드 접합체:
.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 핵산-리간드 접합체를 포함하고, 바람직하게는 siRNA인 RNAi 제제.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 핵산-리간드 접합체 또는 제26항에 따른 RNAi 제제, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
- 환자의 질환, 바람직하게는 간원성(hepatogenic) 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 핵산-리간드 접합체, 제26항에 따른 RNAi 제제 또는 제27항에 따른 조성물의 용도.
- 환자에게 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 핵산-리간드 접합체, 제26항에 따른 RNAi 제제 또는 제27항에 따른 조성물을 투여함을 포함하는, 환자에서 mRNA 발현을 억제하거나 발현 억제 올리고머 화합물을 생체내에서 간에 전달하는 방법.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 출발 물질로 사용하는 단계, 및 뉴클레오시드 단량체를 뉴클레오티드가 배열되는 순서로 3'-5' 방향으로 하나씩 부착하는 단계를 포함하는, 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 핵산-리간드 접합체를 제조하는 방법.
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