JP2021509402A - 複合体及びその調製方法と使用 - Google Patents
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Abstract
Description
n1は1〜3の整数であり、n3は0〜4の整数であり、
各m1、m2及びm3は、それぞれ独立して2〜10の整数であり、R10、R11、R12、R13、R14及びR15は、それぞれ独立してH、C1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル基及びC1−C10アルコキシ基から選択され、
R4は、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各L1は、長さ1〜70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ又は複数で任意に置換され、L1は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各S1は独立してM1であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒドロキシ保護基で保護され、
各M1が、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。
各j2は独立して1〜20の整数であり、
各R’は独立してC1−C10アルキル基であり、
各Raは独立してA27〜A45及びその任意の組合せからなる群から選択される。
n1は1〜3の整数であり、n3は0〜4の整数であり、
m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2〜10の整数であり、
R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル又はC1−C10アルコキシ基から選択され、
R3は活性薬物であり、
R2は、長さ1〜20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ又は複数で任意に置換され、R2は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各L1は独立して、長さ1〜70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ又は複数で任意に置換され、L1は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各M1は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される1つである。
各j2は独立して1〜20の整数であり、
各R’は独立してC1−C10アルキル基であり、
各Raは、独立して式A27〜A45の基及びその任意の組合せから選択される。
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許又は特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、大文字C、G、U及びAは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字sの左右に隣接する2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、P1は、当該P1の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、特に、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてVPで表される)、5’−リン酸ヌクレオチド(以下の実施例においてPで表される)又は5’−チオリン酸エステル修飾ヌクレオチド(以下の実施例においてPsで表される)を指している。
1つの側面において、本明細書には、活性剤又は活性薬物を送達するための複合分子が開示されている。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、組織特異的標的に用いられる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、細胞表面の受容体と結合する。この目的のために、いかなる細胞表面の受容体又はバイオマーカー又はその一部も、適切であると考えられる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、特定の組織に特有の受容体に特異的に結合し、組織特異的標的を実現する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、肝細胞表面の受容体を特異的に標的し、肝組織を特異的に標的する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、肝細胞に特有の細胞表面の受容体を特異的に標的する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体(asialoglycoprotein receptor、ASGPR)を特異的に標的する。
n1は1〜3の整数であり、n3は0〜4の整数であり、
m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2〜10の整数であり、R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル基及びC1−C10アルコキシ基から選択され、
R4が、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各L1は、長さ1〜70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で任意に置換され、L1は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各S1は独立してM1であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒドロキシ保護基で保護され、
各M1は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。いくつかの実施形態において、q1は1又は2である。いくつかの実施形態において、q2は1〜5の整数である。いくつかの実施形態において、R4は、式(B9)又は(B10)に示される基を含む。いくつかの実施形態において、R4は、式(B11)又は(B12)に示される基を含む。
である。
当業者は、任意の合理的な合成経路により本開示の複合分子を調製してもよい。
他の側面において、本開示は、式(1)に示される構造を有する複合体を提供する。
n1は1〜3の整数であり、n3は0〜4の整数であり、
各m1、m2及びm3が独立して2〜10の整数であり、
各R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル又はC1−C10アルコキシ基から選択され、いくつかの実施形態において、R10、R11、R12、R13、R14及びR15がそれぞれ独立してH、メチル基又はエチル基から選択され、
R3は活性薬物であり、いくつかの実施形態において、R3が機能性オリゴヌクレオチドを含み、
R2は、長さ1〜20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基から選択される1又は複数で任意に置換され、R2は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)から選択されるいずれか1つ又は複数の基で任意に置換され、
各L1は、長さ1〜70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で任意に置換され、L1は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、いくつかの実施形態において、L1は、式A1〜A26の基又はその任意の組合せから選択されてもよく、A1〜A26の構造と定義は、前述したとおりである。
前記センス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間。
任意の合理的な合成経路により本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製してもよい。例えば、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれ前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの種類と順序により、3’から5’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の4つの反応を含むことを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式(321)に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式(321)に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。
(1)上記固相担体が結合された式(321)の化合物(以下、固相担体が結合されたL複合分子ともいう)における保護基Rkを除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、当該固相担体が結合されたL複合分子をヌクレオシドモノマーと接触させ、L複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
(2)当該L複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、3’−5’の方向に従いホスホルアミダイト固相合成方法によりsiRNAのセンス鎖を合成すること、
(3)ホスホルアミダイト固相合成方法により、siRNAのアンチセンス鎖を合成すること、
(4)siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のsiRNA複合体を得ることを含む。
本開示に示されるように、前記複合体は、ある活性剤を細胞に送達し、このような送達を必要とする可能性がある疾患又は状況を治療又は予防するために用いることができる。何ら理論に束縛されることを望まないが、複合分子の空間配列は、標的細胞表面の受容体面に特に有効であり、負荷された活性剤を細胞と接触させると考えられる。いくつかの実施形態において、このような複合体は、肝細胞を標的するオリゴヌクレオチド複合体である。
(発明の効果)
他の側面において、本明細書は、以上のような複合体を含むキットを提供する。
C57BL/6Jマウス:北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
SDラット:北京維通利華実験動物技術有限公司により提供される。
HBVトランスジェニックマウスC57B/6N−Tg(1.28HBV)/Vst(genotype A):北京維通達生物技術有限公司から購入する。実験前にCOI>104のマウス(以下、単に1.28copyマウスともいう)を選択した。
HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/J:北京大学医学部実験動物科学部から購入する。実験前にS/CoV>10のマウスを選択した。
HBVトランスジェニックマウス:M−TgHBVと命名され、上海市公衆衛生センター動物部から購入され、トランスジェニックマウスの作製方法は、Ren J.ら、J. Medical Virology. 2006,78:551〜560に記載された。
AAV−HBVトランスジェニックマウス:文献の方法(董小岩ら、Chin J Biotech 2010,May 25,26(5):679〜686)により調製された。rAAV8−1.3HBV、D型(ayw)ウイルス(北京五加和分子医学研究所有限公司から購入され、1×1012ウイルスゲノム(v.g.)/mL、ロット番号2016123011)について、無菌PBSでrAAV8−1.3HBVを5×1011v.g./mLに希釈し、マウス1匹あたり希釈されたrAAV8−1.3HBVを200μL注射した(即ち、マウス1匹あたり1×1011v.g.注射した)。ウイルスを注射した後の28日目に、全てのマウスに対して眼窩採血(約100μL)を行い、血清を回収してHBsAg及びHBV DNAを検出するために用いられた。
低濃度AAV−HBVトランスジェニックマウス:実験前に、ウイルスを無菌PBSで1×1011v.g./mLに希釈し、マウス1匹あたり100μLのウイルスを注射し、即ち、マウス1匹あたり1×1010v.g.注射したこと以外、上記とほぼ同じモデリング方法を採用した。
BALB/cマウス:6〜8週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
ob/obマウス:6〜8週齢、常州キャヴェンス実験動物有限公司から購入する。
ヒトAPOC3トランスジェニックマウス:B6、CBA−Tg(APOC3)3707Bres/J、Jackson Labから購入する。
メタボリックシンドロームサル:全て雄性、北京大学分子医学研究所非ヒト霊長類研究センターにより提供される。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子1(以下、L−9複合分子ともいう)を合成した。
100.0gのGAL−1(N−アセチル−D−ガラクトサミン塩酸塩、CAS番号:1772−03−8、寧波弘翔生化公司から購入、463.8mmol)を1000mlの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で540mlの酢酸無水物(Enox社から購入、5565.6mmol)を加え、室温で1.5時間攪拌反応した。反応液を10Lの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを2Lの氷水で洗浄した後、完全に溶解させるまでアセトニトリル/トルエン混合溶剤(アセトニトリル:トルエンの体積比=1:1)を加え、溶剤を蒸発乾固し、130.0gの白色固形製品GAL−2を得た。
工程(1−1a)で得られたGAL−2(35.1g、90.0mmol)213mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、24.0gのTMSOTf(CAS番号:27607−77−8、マックリン社から購入、108.0mmol)を加え、室温で一晩反応させた。
工程(1−1b)で得られたGAL−3(26.9g、81.7mmol)を136mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した4Å分子篩粉30gを加え、9.0gの5−ヘキセン−1−オール(CAS番号:821−41−0、Adamas−beta社から購入、89.9mmol)を加え、室温で30分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で9.08gのTMSOTf(40.9mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に300mlのジクロロエタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて10分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、残りの水相を300mlのジクロロエタンで1回抽出し、全ての有機相をあわせ、それぞれ300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び300mlの飽和食塩水で洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、41.3gの黄色水飴状製品GAL−4を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(1−1c)に記載された方法により得られたGAL−4(14.9g、34.7mmol)を77mlのジクロロメタンと77mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ103mlの脱イオン水及び29.7gの過ヨウ素酸ナトリウム(CAS番号:7790−28−5、Aladdin社から購入、138.8mmol)を加え、氷水浴下で10分間攪拌し、塩化ルテニウム(III)(CAS番号:14898−67−0、Energy社から購入、238mg、1.145mmol)を加え、室温で一晩反応させた。反応液に300mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを約7.5に調整し、有機相を分離し、残りの水相をジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、抽出して得られた有機相を捨てた。抽出して得られた水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、6.85gの白色泡状固形製品GAL−5を得た。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子2(以下、P−9複合分子ともいう)を合成した。
40mlのN,N−ジメチルホルムアミドに上記(1−1)に記載された方法により得られたGAL−5(13.43g、30.0mmol)、4−アミノ酸tert−ブチルエステル塩酸塩(5.87g、30.0mmol)、O−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(13.65g、36.0mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(11.63g、90.0mmol)を加え、均一に溶解させた後室温で5時間攪拌反応させた。得られた反応液に300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで単離した水相を1回あたり200mlで3回抽出し、洗浄して得られた有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で1回洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して30.3gの油状物粗製品GAL5−C4−1を得、そのまま次の反応を行った。
工程(2−1)で得られたGAL5−C4−1粗製品(30.3g、30mmol)を180mlギ酸に溶解させ、室温で16時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、粗製品をカラムクロマトグラフィーにより精製し(200〜300メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出した)、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計14.84gの目的生成物GAL5−C4−2を得た。
工程(1−4)に記載された方法により得られたM−18−Tr(2.02g、4.69mmol)と工程(2−2)で得られたGAL5−C4−2(8.24g、15.48mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN−メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。200mlのジクロロメタンで得られた反応液を希釈し、それぞれ100mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び100mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計8.27gの純粋品P−6を得た。
上記(2−3)で得られたP−6(6.82g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた。得られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7〜8となるように調節し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200〜300メッシュの順相シリカゲルで精製し、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計4.82gのP−7を得た。MS m/z:C78H127N10O33、[M+H]+、理論値:1732.91、実測値:1735.73。
P−8(490mg、0.231mmol)、コハク酸無水物(69mg、0.693mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、68mg、0.554mmol)を混合して2.3mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、149mg、1.155mmol)を加え、25℃で21h攪拌反応させた。得られた反応液を50mlのジクロロメタンで希釈し、さらに100mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、80gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計200mgの純粋品P−9複合分子(複合分子2)を得た。MS m/z:C106H153N10O41、[M−DMTr]+、理論値:1921.05、実測値:1920.97。得られたP−9複合分子の構造が式(504)に示される。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子3(以下、R−4複合分子ともいう)を合成した。
工程(1−1b)に記載された方法により得られたGAL−3(26.4g、80.2mmol)を134mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、60gの4Å分子篩粉を加え、さらに7−オクテン−1−オール(11.3g、88.2mmol)を加え、室温で10分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(Trimethylsilyl trifluoromethanesulphonate、TMSOTf、8.9g、40.1mmol)を加え、室温で24時間攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、残りの水相を100mlのジクロロメタンで1回抽出した。全ての有機相をあわせ、250mlの飽和食塩水で1回洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して33.3gの黄色水飴状製品GAL−C7−1を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(3−1)で得られたGAL−C7−1(33.3g、72.8mmol)を160mlのジクロロメタンと160mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ216mlの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム(62.3g、291.2mmol)を加え、氷水浴下で10分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム(III)(498mg、2.4mmol)を加えて自然に室温まで昇温し23時間攪拌反応させた。得られた反応液に200mlの水を加えて希釈し、攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを7.5に調節し、有機相を分離し、残りの水相をジクロロメタンで3回抽出し、抽出して得られた有機相を捨て、抽出して得られた水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出した)により精製して22.4gの白色泡状固形製品GAL−C7−2を得た。MS m/z:C21H32NO11、[M+H]+、理論値:476.50、実測値:475.94。
工程(1−4)に記載された方法により得られたM−18−Tr(2.02g、4.69mmol)とGAL−C7−2(7.36g、15.48mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN−メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。得られた反応液を200mlのジクロロメタンで希釈し、それぞれ100mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び100mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して7.82gの純粋品R−1を得た。
R−1(6.23g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた。得られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7〜8となるように調節し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品200〜300メッシュの順相シリカゲルで精製し、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.49gの純粋品R−2を得た。
R−2(2.391g、1.532mmol)とA−1(2.342g、4.596mmol)を混合して16mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリルオキシ−1,2,3−ベンゾトリアジン4(3H)−オン(DEPBT、1.375g、4.596mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.191mmol)を加え、25℃で2h攪拌反応させた。10mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、10mlの飽和食塩水で洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで2回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩減圧乾燥させ粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、120gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N−ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5〜1:1:1:0.6で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.642gの純粋品R−3を得た。
R−3(795mg、0.4074mmol)、コハク酸無水物(82mg、0.8148mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、100mg、0.8148mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、100mg、0.8148mmol)を加え、25℃で18h攪拌反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で得られた反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、30gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して505mgの純粋品R−4複合分子(複合分子3)を得た。得られたR−4複合分子の構造が式(507)に示される。
以下のプロセス経路により、複合分子4(以下、LA−4複合分子ともいう)を合成できると予期した。得られるLA−4複合分子の構造が式(512)に示される。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子5(以下、LB−4複合分子ともいう)を合成した。
工程(1−6)に記載された方法により得られたL−8(5.0g、3.386mmol)、アジピン酸無水物(870mg、6.772mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、827mg、6.772mmol)を混合して130mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、2.2g、16.931mmol)を加え、25℃で4h攪拌反応させた。得られた反応液に70mlのジクロロメタンを加えて希釈し、0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで4回抽出し、全ての有機相をあわせ、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、120gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール=1:1:1:0.2〜1:1:1:1で勾配溶出した。溶剤を減圧蒸発乾固して4.267gの純粋品LB−1を得た。
工程(5−1)に記載された方法により得られたLB−1(4.697g、2.753mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)、3−アミノ−1,2−プロパンジオール(313mg、3.442mmol)、4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、953mg、3.442mmol)及びN−メチルモルホリン(700mg、6.884mmol)を30mlのアセトニトリルと3mlのメタノールの混合物に順に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、残存物をカラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=1:0.07〜1:0.5で勾配溶出した)により精製し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、3.27gの目的生成物LB−2を得た。
LB−2(2.27g、1.353mmol)を14mlの無水ピリジンで溶解させた。さらに4,4’−ビスメトキシトリチルクロリド(688mg、2.03mmol)を加えて室温で一晩攪拌反応させた。150mlのメタノールを加えてクエンチングし反応、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。残存物をカラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン:メタノール=1:0.05〜1:0.2で勾配溶出した)により精製し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、1.647gの目的生成物LB−3を得た。
LB−3(822mg、0.415mmol)、コハク酸無水物(83g、0.83mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、102mg、0.83mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIPEA(270mg、2.075mmol)を加え、25℃で一晩攪拌反応させた。得られた反応液を0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で3回洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり2mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、5wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:20で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して787mgの構造が式(513)に示される純粋品LB−4複合分子(複合分子5)を得た。
以下のプロセス経路により、構造が式(514)に示される複合分子6(以下、V−7複合分子ともいう)を合成できると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子7(以下、W−7複合分子ともいう)を合成した。
W−0(2.024g、10mmol)を25mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにトリエチルアミン(4.048g、40mmol)を加え、氷浴で0℃程度まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル(5.683g、40mmol)を加え、室温で22h反応させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を18h発泡乾燥させ、5.835gの固形粗製品W−1を得た。
W−1粗製品(5.835g、10mmol)を50mlのジクロロメタンに溶解させ、反応液にTrCl(3.345g、12mmol)及びトリエチルアミン(1.518g、15mmol)を加え、室温で20h攪拌反応させた。得られた反応液を20mlの飽和炭酸水素ナトリウムで2回洗浄し、さらに20mlの飽和食塩水で1回洗浄した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、8.012gの固形粗製品W−2を得た。固形粗製品W−2は、処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
W−2粗製品(8.012g、10mmol)を100mlのメタノールに溶解させ、さらに100mlのメチルアミン水溶液(40wt%)を加え、50℃で23h攪拌反応させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物に200mlの体積比1:1のDCM−メタノール混合溶剤を加え、得られた有機相を50mlの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニア水(25wt%)=1:1:0.05〜1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて3.062gの純粋品W−3を得た。
W−3(675mg、1.517mmol)とGAL−C7−2(2.60g、5.46mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.57g、12.14mmol)を加え、最後に3−ジエトキシホスホリルオキシ−1,2,3−ベンゾトリアジン−4(3H)−オン(DEPBT、1.816g、6.04mmol)を加え、室温で2.5h攪拌反応させた。得られた反応液を100mlのジクロロメタンで希釈した。それぞれ80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品を200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して1.610gの純粋品W−4を得た。
W−4(1.61g、0.886mmol)を125mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸(3.5ml、42.43mmol)を加え、室温で1h反応させた。得られた反応液に150mlピリジンを加えて中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.26gの純粋品W−5を得た。
W−5(1.25g、0.793mmol)と工程(1−7a)に記載された方法により得られたA−1(1.21g、2.38mmol)を混合して12mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリルオキシ−1,2,3−ベンゾトリアジン−4(3H)−オン(DEPBT、0.712g、2.38mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(0.615g、4.76mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応させた。80mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、10mlの飽和食塩水で洗浄し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、185gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N−ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.1〜1:1:0.7で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.57gの純粋品W−6を得た。
W−6(1.238g、0.63mmol)、コハク酸無水物(0.189g、1.89mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.231g、1.89mmol)を混合して7mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIEA(0.407g、3.15mmol)を加え、25℃で24h攪拌反応させた。得られた反応液を5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、30gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.033gの純粋品W−7複合分子(複合分子7)を得た。MS m/z:C101H146N7O38、[M−DMTr]+、理論値:1763.92、実測値:1763.21。得られたW−7複合分子の構造が式(515)に示される。
以下のプロセス経路により、構造が式(521)に示される複合分子8(以下、X−7複合分子ともいう)を合成できると予期した。
本調製例では、以下の方法に従い、K−3複合分子(以下、比較複合分子1ともいう)を合成した。
60mlのジクロロメタンに工程(1−7a)に記載された方法により得られたA−1(3.0g、6.0mmol)、PyBOP(6.2g、12.0mmol)、HOBt(1.6g、2.0mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、3.9g、30.0mmol)を加え、室温で10分間攪拌反応させた後、上記溶液をK−0(5.6g、30.0mmol)に加え、室温で1時間50分間反応させた。反応液を30mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで3回抽出した。全ての有機相をあわせ、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。粗製品をカラムで精製し、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニア水(25wt%)=10:2:0.1〜4:4:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させ、2.2gの白色固形製品K−1を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 8.02 (s,1H),7.43 (d,J =7.8 Hz,2H),7.34−7.17 (m,7H),6.87 (d,J =8.6 Hz,4H),4.05 (d,J =5.2 Hz,1H),3.74(s,6H),3.20−3.01 (m,5H),2.60−2.38 (m,12H),1.60−1.39 (m,8H),1.24 (s,1H). MS m/z:C33H47N4O5、[M+H]+、理論値:579.35、実測値:579.26。
3mlのジクロロメタンに(1−1)に記載された方法により得られたGAL−5(483mg、1.08mmol)、3−ジエトキシホスホリルオキシ−1,2,3−ベンゾトリアジン−4(3H)−オン(359mg、1.2mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、310mg、2.4mmol)を加え、室温で30分間攪拌した後、K−1(174mg、0.3mmol)を加え、室温で16時間反応させた。反応液を10mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、単離した水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、全ての有機相をあわせ、10mlの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン:メタノール=20:1で溶出し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、205mgの黄色固形製品K−2を得た。
1.1mlのジクロロメタンにK−2(205mg、0.11mmol)、コハク酸無水物(22mg、0.22mmol)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、27mg、0.22mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、71mg、0.55mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた。反応液を0.5Mトリエチルアミンリン酸塩溶液で1回あたり0.5mlで3回洗浄し、1回あたり洗浄して得られた水相を0.5mlのジクロロメタンで1回逆抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、218mgの淡黄色固形製品K−3複合分子(比較複合分子1)を得た。
本調製例では、WO2014025805A1における実施例1〜4に記載された調製方法により、構造が下式に示される化合物47(本明細書では、(GalNAc)3複合分子(比較複合分子2)という)を合成した。
本調製例では、Rajeevら、ChemBioChem 2015,16,903−908に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、FIN−2複合分子(比較複合分子3)を合成した。
2.93gのPRO−6(L−ヒドロキシプロリン、CAS番号:51−35−4、Energy社から購入、22.4mmol)を22.5mlの1,4−ジオキサン(1,4−dioxane)に溶解させ、34mlの10%(w/w)Na2CO3の水溶液を加え、6.954gのFmoc−Cl(クロロギ酸−9−フルオレニルメチル、CAS番号:28920−43−6、Energy社から購入、26.8mmol)を56.5mlの1,4−ジオキサンに溶解させ、氷浴下で反応混合物に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を150mlの氷水に注入し、メチルtert−ブチルエーテルで1回あたり100mlで3回抽出し、得られた有機相を捨て、残りの水相を濃HClでpH≦5となるように調節し、100mlの酢酸エチルで2回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して7.83gの白色泡状固形製品PRO−7を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.91 (t,J =7.2 Hz,2H),7.67 (d,J =7.5 Hz,2H),7.48−7.39 (m,2H),7.38−7.27 (m,2H),5.17 (s,1H),4.27 (s,2H),4.23−4.11 (m,2H),3.55−3.41 (m,3H),2.31−2.10 (m,1H),2.08−1.88 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値(calcd for) C20H19NO5 [M−H]−352.1190、実測値352.1033.
7.83gのPRO−7(22.2mmol)を80mlのTHFに溶解させ、油浴で65℃に加熱し、還流状態で36.6mlの2mol/LのBH3−Me2SのTHF溶液(CAS番号13292−87−0、百霊威(J&K Scientific)社から購入、73.2mmol)を加え、3時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えてから30分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後、残存物を石油エーテルで3回精製して7.1gの白色固形生成物PRO−8を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.91 (t,J =6.7 Hz,2H),7.67 (d,J =7.2 Hz,2H),7.49−7.39 (m,2H),7.38−7.26 (m,2H),5.18 (dd,J =6.1,3.8 Hz,1H),4.28 (s,2H),4.23−4.13 (m,2H),3.55−3.38 (m,2H),2.32−2.11 (m,1H),2.08−1.89 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値(calcd for) C20H21NO4 [M+Na]+362.1368、実測値362.1012.
7.1gのPRO−8(21mmol)を100mlピリジンに溶解させ、14.2gのDMTr−Cl(4,4’−ビスメトキシトリチルクロリド、42mmol)を加え、室温で5時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後、シリカゲルカラムで残存物を精製した。精製のために、DCMに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理されたシリカゲルカラムに負荷した。1%(v/v)ピリジンを含むDCMでDMTr−Clを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、8.2gの白色固形生成物PRO−9を得た。HRMS (ESI) m/z 理論値(calcd for) C41H39NO6 [M+Na]+664.2675、実測値664.2348,C18 RP−HPLC(ロット番号JJS160324−1)純度94.20%。
8.2gのPRO−9(12.8mmol)を64mlのDMFに溶解させ、40mlのピペリジン(384mmol)を加え、室温で30分間攪拌反応させた。反応液を300mlの氷水に注入し、酢酸エチルで1回あたり150mlで3回抽出し、得られた有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で洗浄した後、洗浄して得られた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後、残存物をシリカゲルカラムで精製し、精製のために、DCMに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理されたシリカゲルカラムに負荷した。1%(v/v)ピリジンを含むDCMでFmocを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、4.65gの白色固形生成物PRO−10を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.40 (d,J =7.2 Hz,2H),7.35−7.18 (m,7H),6.93−6.84 (m,4H),4.56 (d,J =3.9 Hz,1H),4.12 (s,1H),3.74 (s,6H),3.46−3.37 (m,1H),2.88 (ddd,J =18.5,10.0,5.5 Hz,2H),2.75 (dd,J =8.7,5.8 Hz,1H),2.62 (dd,J =11.0,2.7 Hz,1H),1.74−1.65 (m,1H),1.40 (ddd,J =12.9,8.5,5.9 Hz,1H),HRMS (ESI) m/z 理論値(calcd for) C26H29NO4 [M+Na]+442.1994、実測値442.1999,C18 RP−HPLC(ロット番号JJS160329−1)純度97.07%。
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子153(以下、Z−4複合分子ともいう)を合成した。
工程(7−3)に記載された方法により得られたW−3(1.50g、3.37mmol)と工程(2−2)に記載された方法により得られたGAL5−C4−2(7.18g、13.48mmol)を混合して34mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(3.48g、26.96mmol)を加え、その後、3−ジエトキシホスホリルオキシ−1,2,3−ベンゾトリアジン−4(3H)−オン(DEPBT、4.04g、13.48mmol)を加え、室温で4.5時間攪拌反応させた。得られた反応液を100mlのジクロロメタンで希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び80mlの飽和食塩水でそれぞれ有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、粗製品を200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=30:1〜15:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して3.97gの純粋品Z−1を得た。MS m/z:C98H143N10O33、[M+H]+、理論値:1987.98、実測値:1987.90。
Z−1(3.97g、2.00mmol)を250mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸(10.941g、84.85mmol)を加え、室温で1時間反応させた。得られた反応液を中性になるまでピリジンを加えて中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200gの200〜300メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、10%ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、1‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=10:1〜2:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して3.49gの純粋品Z−2を得た。MS m/z:C79H129N10O33、[M+H]+、理論値:1746.94、実測値:1746.90。
工程(1−7a)に記載の方法により得られたZ−2(3.49g、2.0mmol)及びA−1(3.06g、6.0mmol)を混合して30mlのジクロロメタンに溶解させ、3−(ジエトキシホスホリルオキシ)−1,2,3−ベンゾトリアジン−4(3H)−オン(DEPBT、1.80g、6.0mmol)を加えた後、ジイソプロピルエチルアミン(1.55g、12.0mmol)を加え、25℃で3時間攪拌反応させた。得られた反応液に100mlのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を1回あたり30mlで2回洗浄し、水相を10mlのジクロロメタンで抽出した。全ての有機相をあわせ、50mlの飽和食塩水で洗浄し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、200gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=25:1〜15:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.2gの純粋品Z−3を得た。MS m/z:C103H151N10O38、[M+H]+、理論値:2136.02、実測値:2136.20。
Z−3(2.10g、0.983mmol)を、DIEA(635mg、4.915mmol)を含む14.8mlのジクロロメタンに溶解させ、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、240mg、1.966mmol)を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸無水物(197mg、1.966mmol)を加え、25℃で18時間攪拌反応させた。50mlのジクロロメタンを加えて得られた反応液を希釈し、80mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで2回抽出した。全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、188gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=10:1〜3:1で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.95gの構造が式(422)に示される純粋品Z−4複合分子(複合分子12)を得た。MS m/z:C107H155N10O41、[M+H]+、理論値:1935.07、実測値:1935.29。
本調製例では、L−9複合分子(複合分子1)を出発とし、以下の方法に従い、L10−siHBa1複合体(以下、複合体9ともいう)を調製した。
本工程において、siRNA複合体のsiRNAは、番号siHBa1の配列であった。
siHBa1
センス鎖:5’−CCUUGAGGCAUACUUCAAA−3’(配列番号1)、
アンチセンス鎖:5’−UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU−3’(配列番号2)
本工程において、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports、Kinovate Life SciencesInc.)により、L10−siHB1複合体のアンチセンス鎖ASを合成した。センス鎖合成と同じ条件によりsiRNAのアンチセンス鎖ASを得、固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応条件、脱保護と切断、単離条件を含む。
S鎖及びAS鎖をそれぞれ注射用水溶液に溶解させ、40mg/mlの溶液を得た。これらを等モル比で混合し、50℃で15分間加熱し、室温まで冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。
1)複合siRNAが、表3A〜3Gに示される複合体16〜18、24〜26、42〜43、62、78、105、109、111、115、144、157〜163及び167〜171に対応する配列を有し、2)目的配列における2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、当該2つのヌクレオチドのうち後のヌクレオチドの結合における酸化反応工程の代わりに以下の硫化反応工程を用い、各工程の硫化反応条件は同じであり、温度が25℃であり、反応時間が300秒であり、硫化試薬がキサンタンヒドリドであり、硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が120:1であり、アセトニトリル:ピリジン=1:1の混合溶剤で反応を行い、3)目的配列における全てのヌクレオチドの2’−位がいずれも修飾ヒドロキシ基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける2’−TBDMS保護を除去する工程を含まないこと以外は、調製例13と同じ方法によって表題複合体を調製し、本開示の複合体16〜18、24〜26、42〜43、62、78、105、109、111、115、144、157〜163及び167〜171を調製した。
注釈:大文字C、G、U、Aは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、dTは、デオキシチミンヌクレオチドを表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドが2’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字sの左右に隣接する2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、VPは、当該文字VPの右側の1つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Pは、当該文字Pの右側の1つのヌクレオチドがリン酸エステルヌクレオチドであることを表し、Psは、当該文字Psの右側の1つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Tmoeは、2’−メトキシエトキシ修飾チミンヌクレオチドを表す。
以下の方法に従い、VP−U−2分子を合成した。
また、1)複合体31〜37、52〜58、68〜74、84〜90、121〜127、146〜152及び比較複合体4〜5、7〜8、10〜13について、L−9複合分子の代わりに上記調製例2〜10又は12で得られた複合分子2〜8又は12及び比較複合分子1〜2を用い(例えば、L−9複合分子の代わりにP−9複合分子(複合分子2)を用いた場合、複合体31、52、68、84、121及び146という番号にP10が付された複合体を得ると予期し、L−9複合分子の代わりにR−4複合分子(複合分子3)を用いた場合、複合体32、53、69、85、122及び147という番号にR5が付された複合体を得ると予期し、以下類推してもよい)、2)複合siRNAが、表3A〜3Gに示される複合体10〜15、19〜23、27〜41、44〜61、63〜77、79〜104、106〜108、110、112〜114、116〜141、143〜152及び比較複合体4〜5、7〜8、10〜17に対応する配列を有し、3)目的配列における2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、当該2つのヌクレオチドのうち後のヌクレオチドの結合における酸化反応工程の代わりに調製例13に記載された硫化反応工程を用い、4)目的配列における全てのヌクレオチドの2’−位がいずれも修飾ヒドロキシ基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける2’−TBDMS保護を除去する工程を含まないこと以外は、調製例13と同じ方法により、表3A〜3Gにおける他のsiRNA複合体を調製できると予期した。これにより、複合体10〜15、19〜23、27〜41、44〜61、63〜77、79〜104、106〜108、110、112〜114、116〜141、143〜152及び比較複合体4〜5、7〜8、10〜17を調製できると予期し、表3A〜3Gによりそれらにそれぞれ番号を付けた。これらの本開示の複合体の構造は、それぞれ式(3)、(4)、(7)、(12)、(13)、(14)、(15)、(21)又は(22)に示され、各比較複合体の構造は、それぞれ式(901)、式(902)に示される。
上記工程(11−3)で得られたFIN−2を用いて比較複合体6及び9を合成した。汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports)を用い、FIN−2の3回の反応循環によりFIN_FIN_FINをRNAセンス鎖の3’末端に複合した後、固相合成を行ったことのみ以外、RNA固相合成条件、脱保護条件は、前述した工程(11−2)に記載された核酸固相合成と一致した。
C57BL/6Jマウスにおいて、マウス1匹あたり100mg/kg又は200mg/kg(siRNAとして計算、0.9%塩化ナトリウム水溶液の形で、それぞれ10mg/mL又は20mg/mLの濃度で10mL/kg使用)の複合体24をそれぞれ単回皮下投与し、持続的に観察した期間中、動物の死亡はなく、薬物の副作用に関連する臨床症状も認められず、投与した24h後、臨床病理学的検査及び肉眼解剖のいずれにおいても異常が認められなかった。上記結果から明らかなように、本開示の複合体は、動物レベルの毒性が低い。
(実験例2−1)体外リソソーム溶解液における安定性
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列1(それぞれsiRNA濃度が20μMである0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのマウストリトソーム(XenotechInc.から購入、番号R0610LT、No.1610069、最終濃度0.2mU/μL)と均一に混合し、37℃で恒温培養した。それぞれ0h、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8hの各時点で5μlの試料(サンプル)を取り出し、それぞれ15μLの9M尿素水溶液に加えて変性させた後、4μlの試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830)を加え、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製:各1.5μlの等モル量の上記複合体(20μM)を、それぞれ7.5μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、1μLの脱イオン水と均一に混合し、それぞれ15μLの9M尿素水溶液に加えて変性させた後、4μLの試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830)を加えて均一に混合し、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各複合体の参照サンプルは、電気泳動図においてConと記している。
センス鎖:5’−CCUUGAGGCAUACUUCAAA−3’(配列番号250)、
アンチセンス鎖:5’−UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU−3’(配列番号251)。
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列1(それぞれsiRNA濃度が20μMである0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl)をそれぞれ108μLの90%ヒト血漿(Human plasma、PBSで希釈)と均一に混合して37℃で恒温培養した。それぞれ0、2、4、6、8、24、48、72時間の各時点で10μLの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、使用に備えた。同時に、等モル量の各複合体(2μM、2μl)を8μlの1×PBSと均一に混合して、10μLのヒト血漿処理されていないサンプルを得た(Conと記した)。20重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、冷凍保存サンプルにおける各群の全てのサンプルをそれぞれ4μLの試料負荷緩衝液(20mMのEDTA、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水溶液)と混合した後、前述したゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを1×Sybr Gold染料(Invitrogen、Cat.11494)で15分間染色した後にイメージングを行い、結果を図2Aに示した。前記比較配列1は以下のとおりである。
センス鎖:5’−CCUUGAGGCAUACUUCAAA−3’(配列番号250)、
アンチセンス鎖:5’−UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU−3’(配列番号251)。
複合体24、25、42、43、62、78及び比較配列2(それぞれsiRNA濃度が20μMの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供、1群あたり12μl、前記比較配列2は、センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ配列番号80及び配列番号81に示される配列を有するが、いずれの複合分子とも複合していないsiRNAであった)をそれぞれ108μLの90%カニクイザル血漿(Monkey plasma、鴻泉生物から購入、HQ70082、PBSで希釈)と均一に混合して37℃で恒温培養した。0、2、4、6、8、24、48、72時間の各時点でそれぞれ10μLの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、各サンプルを1×PBS(pH7.4)で5倍希釈した後、10μLをとって使用に備えた。同時に、等モル量の以上の各複合体(2μM、2μl)を8μlの1×PBSと均一に混合して、10μLのサル血漿処理されていないサンプルを得た(Conと記した)。20重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記希釈されたサンプルにおける各群の全てのサンプルを4μLの試料負荷緩衝液(20mMのEDTA、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルーの水溶液)と混合した後、前述したゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを1×Sybr Gold染料(Invitrogen、Cat.11494)で15分間染色した後にイメージングを行い、結果を図3Aに示した。
本実験例では、それぞれ各実験群のラット(1群あたりラット10匹、雌雄はそれぞれ半分ずつ)に複合体24及び複合体25を皮下注射投与し、単回用量を10mg/kg及び50mg/kgとして実施した。その後、各時点でのラット血漿の薬物濃度及び肝臓、腎臓組織の薬物濃度を検出した。
(1)組織塊が80mg以下となるまで組織を粉砕し、その後、組織と細胞溶解液(Tissue and Cell Lysis Solution、供給者:Epicentre、番号:MTC096H)を加えて66.7mg/mLの組織ホモジネートとして調製した。
(2)組織ホモジネートを超音波(150W、30s)処理して細胞を破砕した。
(3)各群の組織サンプルに対して、組織サンプルを75μLを96ウェルのPCRプレートに加え、5μLのプロテアーゼK(供給者:Invitrogen、番号:25530−015)、10μLの10wt%アセトニトリルと0.01wt%ツウィーン20の混合水溶液を加えた。
血漿サンプルに対して、20μLの血漿を96ウェルのPCRプレートに加え、45μLの組織と細胞溶解液、5μLのプロテアーゼK及び20μLの10wt%アセトニトリルと0.01wt%ツウィーン20の混合液を加えた。
(4)プレートをシールし、PCR器(供給者:Applied Biosystems、型番:GeneAmp(登録商標) PCR system 9700)に放置し、65℃で45分間培養した。
(5)培養終了後、10μLの3M KClの水溶液(供給者:Sigma−aldrich、番号:60135−250ML)を加え、振とうして均一にし、4℃で、3200rcfで15分間遠心した。
(6)各群の組織サンプルに対して、80μLの上清液を120μLのハイブリッド混合物(配合方法:0.5mLの6μM PNAプローブ(供給者:杭州泰禾生物科技有限公司)、1mLの200mM Trizma/pH=8、5mLの8M尿素水溶液、3.5mLのH2O、2mLのアセトニトリル)に加えた。
各群の血漿サンプルに対して、40μLの上清液を160μLのハイブリッド混合物(配合方法:0.5mLの6μM PNAプローブ、1mLの200mM Trizma/pH=8、5mLの8M尿素水溶液、7.5mLのH2O、2mLのアセトニトリル)に加えた。
(7)プレートをシールし、PCR器に放置し、95℃で15分間培養し、直ちに氷の上に5分間放置した。
(8)サンプルを別の円錐底96ウェルプレートに移し、振とうして均一にし、3200rcfで1分間遠心した。
(9)サンプルを負荷して検出し、HPLC−FLDを用いて定量的に分析した(液相系供給者:Thermo Fisher、クロマトグラフ型番:ultimate 3000)。
図4は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体24のラット血漿におけるPK/TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図5は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体24のラット肝臓及び腎臓におけるPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図6は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体24のラット血漿におけるPK/TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図7は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体24のラット肝臓及び腎臓におけるPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図8は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体25のラット血漿におけるPK/TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図9は、投与量が10mg/kgであるとき、複合体25のラット肝臓及び腎臓におけるPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
図10は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体25のラット血漿におけるPK/TK血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図11は、投与量が50mg/kgであるとき、複合体25のラット肝臓及び腎臓におけるPK/TK組織濃度の経時的代謝曲線である。
まず、C57BL/6Jマウスをランダムに分けた(いずれも雌性)。実験群をそれぞれ複合体158(5匹のマウス)及び比較複合体14で番号を付け(5匹のマウス)、PBS対照群(8匹のマウス)に番号を付けた。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、それぞれ1mg/kg又は0.1mg/kgの異なる単回用量で皮下投与した。投与体積は5ml/kgであった。異なる用量を得るために、複合体を0.2mg/ml及び0.02mg/mlで0.9%塩化ナトリウム水溶液に溶解させた。薬剤投与後の72hで動物を死亡させ、肝臓を回収し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにでRNAVzol (VIGOROUS、lot:161G)で全RNA抽出の標準操作手順により抽出して全RNAを得た。
TTR遺伝子発現残量=(試験群TTR遺伝子のコピー数/試験群GAPDHのコピー数)/(対照群TTR遺伝子のコピー数/対照群GAPDHのコピー数)×100%
mRNA抑制率=(1−TTR遺伝子発現残量)×100%
(実験例5−1)複合体26のオフターゲット効果を検証した実験
Kumico Ui−Tei et.al.,Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off−target effect. Nucleic Acids Research,2008.36(7),2136−2151に記載された方法により、検出プラスミドを構築し、被検siRNA複合体とともにHEK293A細胞にコトランスフェクションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キットを用い、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。具体的な工程は以下のとおりである。
psiCHECKTM−2(PromegaTM)プラスミドにより4つの組換えプラスミドを構築した。GSCMは、オンターゲットプラスミドを表し、PSCM、GSSM、PSSMは、オフターゲットプラスミドを表す。
(1)GSCMは、被検複合体のアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
(2)PSCMは、被検複合体のセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
(3)GSSMは、被検複合体のアンチセンス鎖の5’端から1〜8位のヌクレオチド配列と完全に相補的な目的配列を含む。被検複合体におけるアンチセンス鎖の5’端から9〜21位のヌクレオチド配列とその対応する目的配列とは、相補的にミスマッチした。ミスマッチルールは、被検複合体のアンチセンス鎖の5’端から第9〜21位の任意の位置でのG、C、A又はUヌクレオチドが、それぞれ目的配列の対応する位置でヌクレオチドT、A、C又はGとミスマッチしたことである。
(4)PSSMは、被検複合体のセンス鎖の5’端から1〜8位のヌクレオチド配列と完全に相補的な目的配列を含む。被検複合体におけるセンス鎖の5’端から9〜21位のヌクレオチド配列とその対応する目的配列とは、相補的にミスマッチした。ミスマッチルールは、被検複合体のセンス鎖の5’端から第9〜21位の任意の位置でのG、C、A又はUヌクレオチドが、それぞれ目的配列の対応する位置でヌクレオチドT、A、C又はGとミスマッチしたことである。
96ウェルプレートに、LipofectamineTM 2000(Invitrogen)の使用説明書により、siRNAと、プラスミドごとにそれぞれ11群の一定の濃度のsiRNAが対応している上記各プラスミドをコトランスフェクションした。具体的には、プラスミドをウェルあたり10ngずつトランスフェクションし、ウェルずつ0.2μLのLipofectamineTM 2000を用い、ウェルずつコトランスフェクションされたsiRNAの最終濃度は、100nM〜0.0001nM(4倍シリーズの希釈物)であり、1群あたり3個の複製ウェルがあった。
24時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット(Dual luciferase reporter gene assay kit、Promega社、cat.E2940)を用い、使用説明書によりHEK293A細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。各特定の濃度の試験群では、複合体処理なしを対照(con)とした。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベル(Fir)に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベル(Ren)で標準化(normalization)した。siRNAの異なる濃度で測定された活性結果により、用量−効果曲線をプロットし、Graphad5.0ソフトウェアの関数log(Inhibitor)及び応答−変化傾きを用い、以下の式により曲線モデリングを行った。
Yは、残存mRNAの発現レベルであり、
Xは、トランスフェクションされたsiRNAの濃度の対数値であり、
Botは、定常期の最低のY値であり、
Topは、定常期の最高のY値であり、
LogIC50は、Yが定常期の最低と最高との間の半分である場合のX値であり、HillSlopeは、曲線の傾きである。
本実験例では、複合体16及び24によるHBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/JにおけるHBV mRNA発現量に対する抑制効率を調べた。
HBV遺伝子発現残量=(試験群HBV遺伝子のコピー数/試験群β−アクチンのコピー数)/(対照群HBV遺伝子のコピー数/対照群β−アクチンのコピー数)×100%。図において、HBV X/β−アクチンmRNA発現量と記している。
mRNAに対する抑制率=(1−HBV遺伝子発現残量)×100%
実験例4の方法により、44BriのHBVマウスにおいて、表5Aの検出配列をプライマーとして複合体25、164、165及び166による標的mRNA抑制効率を検出した。結果をそれぞれ表6Aに示した。
AAV−HBVマウスモデルを用い、動物を成功にモデリングした後、血清中のHBsAgの含有量別にランダムに分け(1群あたり5匹)、1群あたりそれぞれ複合体24、25及び比較複合体15を投与し、NSをブランク対照として用いた。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量が3mg/kgであり、薬物を0.6mg/mlの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積が5ml/kgであった。薬剤投与前(D0と記した)及び薬剤投与後の7、14、21、28、56、84、112、140、154、168、182日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。その間、検出結果から、血清中のHBsAgの含有量が初期値に近くなった、又はそれを超えた場合、当該対象の検出を停止させた。
HBsAg抑制率=(1−薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAgの含有量)×100%。
ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBsAg当量(UI)で表される。
HBV DNA抑制率=(1−薬剤投与後のHBV DNAの含有量/薬剤投与前のHBV DNAの含有量)×100%。
ここで、HBV DNA含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBV DNAのコピー数で表される。
(実験例6−1)複合体43、62及び78のオフターゲット効果試験
各複合体について、対応する複合体におけるsiRNAのアンチセンス鎖配列と完全に相補的に対合する目的配列により、オンターゲットプラスミドGSCMを構築した。また、それぞれ対応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列と完全に同じであって、対応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列の1〜8位と相補的に対合する、又は対応する複合体のsiRNAのアンチセンス鎖配列の1〜8位と同じ目的配列を用いて、オフターゲットプラスミドGSSM、PSCM及びPSSMを構築した。それ以外は、実験例5−1に記載された方法に従い、複合体43、62及び78のオフターゲット効果をそれぞれ検証した。結果をそれぞれ図22〜24に示した。図22〜24の結果から分かるように、以上の全ての複合体は、標的mRNAに対して良好な抑制作用を有するだけでなく、オフターゲット効果も低かった。
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/Jにおいて複合体25、42、43、62及び78によるHBV mRNA発現に対する抑制効率を調べた。
AAV−HBV低濃度モデルマウスを用いた。動物モデルの構築に成功した後、血清中のHBsAgの含有量別にランダムに分けた(1群あたりマウス5匹)。1群あたりそれぞれ複合体43を投与し、PBSをブランク対照として用いた。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出した。皮下に単回投与し、用量は3mg/kg又は1mg/kgの2つのグループであり、使用濃度はそれぞれ0.6mg/ml又は0.2mg/mlの複合体の0.9%塩化ナトリウム水溶液であり、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、56、84、112、126及び140日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAgレベルを検出した。
HBsAg抑制率=(1−薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAgの含有量)×100%。ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBsAg当量(UI)で表される。
(実験例7−1)本実験では、本開示のsiRNA複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
本実験例では、複合体168の体外psiCHECK系におけるオンターゲット活性(on−target activity)及びオフターゲット効果を調べた。具体的には、複合体168が、完全マッチングした目的配列(そのヌクレオチド配列が複合体168のアンチセンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的であり、又は一致している)又はシード領域がマッチングした目的配列(そのヌクレオチド配列が複合体168のアンチセンス鎖の1〜8位のヌクレオチド配列と相補的であり、又は一致している)を標的する活性を測定した。
調製例1で得られた複合体167及び比較配列1(siRNA濃度として計算し、それぞれ20μMの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液であり、1群あたり6μl、比較配列1をNCと記した)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのマウス由来のリソソーム溶解液(Xenotech Inc.から購入、番号R0610LT、最終濃度は0.2mU/μL)と均一に混合して37℃で恒温培養した。0、1、2、4、6、24時間の各時点でそれぞれ5μlの試料を取り出し、それぞれ15μLの9M尿素水溶液に加えて変性させ、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、使用に備えた。0時間は、siRNA複合体をリソソーム溶解液と均一に混合した後、直ちに取り出した試験の時点を表す。同時に、複合体167及び比較配列1に対して、それぞれ等モル量のsiRNA(20μM、1.5μl)を7.5μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH 5.0)及び1μLの脱イオン水と均一に混合し、さらに30μlの9M尿素水溶液に加えて変性させ、次に、8μLの6×試料負荷緩衝液(20mMのEDTA水溶液、36重量%グリセリン、0.06重量%ブロムフェノールブルー)と均一に混合し、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、反応をクエンチングした。これにより、リソソーム溶解液で処理されていない被験サンプル(電気泳動図においてMと記している)を作製した。16重量%の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合した。20μLの各試験に用いたサンプルをゲルに負荷し、80mAの定電流条件で60分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを1×Sybr Gold染料(Invitrogen、Cat.11494)で15分間染色した後にイメージングを行った。結果を図33に示した。
本実験例では、HBVトランスジェニックマウスC57BL/6J−Tg(Alb1HBV)44Bri/Jにおいて、複合体167及び複合体168のsiRNA複合体によるHBV mRNA発現に対する抑制効率を調べた。
1.28copyモデルにおいて、これらのマウスをランダムに分けた(1群あたりマウス6匹、雌雄各半分)。各群にそれぞれ生理食塩水及び異なる用量の複合体168を投与した。生理食塩水群に5ml/kgの生理食塩水を皮下注射した。複合体群に対して、全ての動物について、体重に応じて投与量を算出した。皮下に単回投与し、用量はそれぞれ3mg/kg又は1mg/kgであり、複合体がそれぞれ0.6mg/ml又は0.2mg/mlの0.9wt%塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、13、21、28、42、56、70、84、98、112、126、140及び154日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清HBsAg、HBeAg及びHBV DNAレベルを検出した。
HBsAg抑制率=(1−薬剤投与後のHBsAgの含有量/薬剤投与前のHBsAgの含有量)×100%。ここで、HBsAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBsAg当量(UI)で表される。
HBeAg抑制率=(1−薬剤投与後のHBeAgの含有量/薬剤投与前のHBeAgの含有量)×100%。ここで、HBeAgの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBeAg当量(UI)で表される。
HBV DNA抑制率=(1−薬剤投与後のHBV DNAの含有量/薬剤投与前のHBV DNAの含有量)×100%。
ここで、HBV DNAの含有量は、血清1ミリリットル(ml)あたりのHBV DNAのコピー数で表される。
(実験例8−1)本実験では、表3EにおけるsiRNA複合体の体内でのANGPTL3 mRNA発現量の抑制効率に対する影響について説明している
本実験例では、複合体105、109、111及び115による正常BALB/cマウスの肝臓組織におけるANGPTL3 mRNAに対する抑制率を調べた。
Tg(APOC3)3707Bresモデルマウスに対して、TG含有量>2mmol/Lとしてランダムに分け(1群あたりマウス5匹)、複合体115、及びPBSブランク対照を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は3mg/kg又は1mg/kgであり、複合体をそれぞれ0.6mg/ml及び0.2mg/ml濃度の0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積は5ml/kgであった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、35、56、70、84、98、112、126、140、154及び168日目にマウスの眼窩から採血し、血清CHO及びTGレベルを検出した。
標準化された脂質レベル=(薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)。
脂質レベルの抑制率=(1−薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)×100%。
メタボリックシンドロームに罹患したサル(全て雄性)に対して、12匹中、8匹が複合体169を投与した実験群、4匹が複合体25を投与した対照群となるように分け、サルの基礎データを測定して観察し、3週間にわたり1週間ごとに1回採血し、脂質レベル(TG、CHO、HDL)を検出した。その後、複合体169及び複合体25(そのsiRNAが、完全に関連していないmRNAを標的するため、比較複合体として用いられた)を投与し、全ての動物について体重に応じて薬物用量を算出した。単回皮下注射し、用量は9mg/kg(siRNA数として)であり、100mg/mlの0.9wt%NaClの水溶液として投与され、各投与部位の用量体積は2ml以下であった。薬剤投与前と薬剤投与後の7、14、21、28、35日目に採血し、各時点で血清TG及びCHOレベルを検出した。
薬剤投与前の試験群における脂質の含有量:薬剤投与前3週間の脂質の含有量の平均値。図43Aと図43BにおいてD0と記している。
(実験例9−1)本実験では、表3FにおけるsiRNA複合体の体内でのAPOC3 mRNA発現に対する抑制効率を証明している
本実験例では、複合体144のヒトAPOC3トランスジェニックマウス(B6、CBA−Tg(APOC3)3707Bres/J、Jackson Labから購入され)体内での肝臓組織におけるAPOC3発現レベルに対する抑制率を調べた。
本実験例では、実施例144のsiRNA複合体のヒトAPOC3トランスジェニックマウス(B6、CBA−Tg(APOC3)3707Bres/J、Jackson Labから購入)体内での血清中総コレステロール(CHO)及びトリグリセリド(TG)含有量に対する影響を調べた。
Claims (114)
- 式(321)に示される構造を有する化合物:
n1は1〜3の整数であり、n3は0〜4の整数であり、
各m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2〜10の整数であり、
各R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル基及びC1−C10アルコキシ基から選択され、
R4は、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各L1は、長さ1〜70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ又は複数で任意に置換され、L1は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各S1は独立してM1であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒドロキシ保護基で保護され、
各M1は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。 - L1が、A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13の基及びその結合の組合せからなる群から選択される、請求項2に記載の化合物。
- L1が、A1、A4、A8、A10及びA11の基のうち少なくとも2つの結合の組合せである、請求項3に記載の化合物。
- L1が、A1、A8及びA10の基のうち少なくとも2つの結合の組合せである、請求項4に記載の化合物。
- L1の長さが3〜25個の原子であり、前記L1の長さとは、L1において窒素含有骨格中のN原子に結合される原子からS1に結合される原子まで形成される最も長い原子鎖上の連鎖原子の個数を指す、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
- L1の長さが4〜15個の原子である、請求項6に記載の化合物。
- j1は2〜10の整数であり、j2は2〜10の整数であり、R’はC1−C4アルキル基であり、Raは、A27、A28、A29、A30及びA31からなる群から選択され、RbはC1−C5アルキル基である、請求項1に記載の化合物。
- j1は3〜5の整数であり、j2は3〜5の整数であり、R’はメチル基、エチル基又はイソプロピル基であり、RaはA27又はA28であり、Rbはメチル基、エチル基、イソプロピル基又はブチル基である、請求項8に記載の化合物。
- n1は1〜2の整数であり、n3は0〜1の整数であり、かつ、n1+n3=2〜3である、請求項1に記載の化合物。
- 各m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2〜5の整数である、請求項1に記載の化合物。
- m1=m2=m3である、請求項11に記載の化合物。
- 保護されるヒドロキシ基がYCOO−構造を有し、各Yが独立して、C1−C10アルキル基及びC6−C10アリール基からなる群から選択され、ハロゲン置換基及びC1−C6アルキル基からなる群から選択される1又は複数の置換基を任意に有する、請求項1に記載の化合物。
- 各Yが独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モノクロロメチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びC1−C6アルキルフェニル基からなる群から選択される、請求項13に記載の化合物。
- 各M1が独立して糖である、請求項1に記載の化合物。
- 各M1が独立して単糖、二糖、三糖又は多糖である、請求項1に記載の化合物。
- 少なくとも1つのM1が修飾されている、請求項1に記載の化合物。
- 各M1が、D−マンノピラノース、L−マンノピラノース、D−アラビノース、D−キシロフラノース、L−キシロフラノース、D−グルコース、L−グルコース、D−ガラクトース、L−ガラクトース、α−D−マンノフラノース、β−D−マンノフラノース、α−D−マンノピラノース、β−D−マンノピラノース、α−D−グルコピラノース、β−D−グルコピラノース、α−D−グルコフラノース、β−D−グルコフラノース、α−D−フルクトフラノース、α−D−フルクトピラノース、α−D−ガラクトピラノース、β−D−ガラクトピラノース、α−D−ガラクトフラノース、β−D−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、N−アセチルガラクトサミン、N−トリフルオロアセチルガラクトサミン、N−プロピオニルガラクトサミン、N−n−ブチリルガラクトサミン、N−イソブチリルガラクトサミン、2−アミノ−3−O−[(R)−1−カルボキシエチル]−2−デオキシ−β−D−グルコピラノース、2−デオキシ−2−メチルアミノ−L−グルコピラノース、4,6−ジデオキシ−4−ホルムアミド−2,3−ジ−O−メチル−D−マンノピラノース、2−デオキシ−2−スルホアミノ−D−グルコピラノース、N−グリコリル−α−ノイラミン酸、5−チオ−β−D−グルコピラノース、メチル2,3,4−トリス−O−アセチル−1−チオ−6−O−トリチル−α−D−グルコピラノシド、4−チオ−β−D−ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7−テトラ−O−アセチル−2−デオキシ−1,5−ジチオ−α−D−グルコヘプトピラノシド、2,5−アンヒドロ−D−アロノニトリル、リボース、D−リボース、D−4−チオリボース、L−リボース及びL−4−チオリボースからなる群から独立して選択される、請求項1に記載の化合物。
- 少なくとも1つのM1がN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)である、請求項18に記載の化合物。
- 各M1が、いずれもN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)である、請求項18に記載の化合物。
- S1がA49又はA50である、請求項21に記載の化合物。
- Yがメチル基である、請求項21又は22に記載の化合物。
- R10、R11、R12、R13、R14及びR15がそれぞれ独立してH、メチル基又はエチル基である、請求項1に記載の化合物。
- R4は、リン酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに結合されることができる基である、請求項1に記載の化合物。
- R4は、オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド上の基と反応してリン酸エステル結合を形成することができる第1の官能基を含む、請求項1に記載の化合物。
- R4は第2の官能基をさらに含み、前記第2の官能基は、ヒドロキシ基もしくはアミノ基と共有結合を形成することができる、又は、ヒドロキシ基もしくはアミノ基と形成する共有結合により分子の残りの部分に結合される固相担体である、請求項26に記載の化合物。
- 前記第1の官能基が、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されるヒドロキシ基である、請求項26に記載の化合物。
- 前記第2の官能基が、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸塩である、請求項26に記載の化合物。
- 前記固相担体が、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合及び/又はアミド結合により分子の残りの部分に結合される、請求項27に記載の化合物。
- 前記固相担体が樹脂である、請求項30に記載の化合物。
- 前記カルボン酸塩が、金属カチオン、アンモニウム塩、第3級アミン又は第4級アンモニウムイオンを有するカルボン酸塩である、請求項28に記載の化合物。
- 前記カルボン酸塩が、トリエチルアミンカルボン酸塩又はN,N−ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である、請求項32に記載の化合物。
- q1は1〜5の整数であり、q2は1又は2である、請求項36に記載の化合物。
- M+が、アルカリ金属カチオン、アンモニウムカチオン、第3級アミンにより形成されたカチオン又は第4級アンモニウムカチオンであり、Rkが、トリチル基、4−メトキシトリチル、4,4’−ジメトキシトリチル又は4,4’,4’’−トリメトキシトリチルであり、SPSが樹脂を表す、請求項34〜38のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記受容体が肝細胞表面の受容体である、請求項1に記載の化合物。
- 前記受容体が哺乳動物の細胞表面の受容体である、請求項1に記載の化合物。
- 前記受容体がヒト肝細胞におけるアシアロ糖タンパク質受容体である、請求項1に記載の化合物。
- 式(1)に示される構造を有する複合体:
n1は1〜3の整数であり、n3は0〜4の整数であり、
各m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2〜10の整数であり、
各R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立してH、C1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル基及びC1−C10アルコキシ基から選択され、
R3は活性薬物であり、
R2は、長さ1〜20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ又は複数で任意に置換され、R2は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各L1は、独立して長さ1〜70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか1つ又は複数で任意に置換され、L1は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキルフェニル基)、−NH(C1−C10アルキルフェニル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有し、
各M1は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される1つである。 - L1が、A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13の基及びその結合の組合せからなる群から選択される、請求項43に記載の複合体。
- L1が、A1、A4、A8、A10及びA11の基のうち少なくとも2つの結合の組合せである、請求項45に記載の複合体。
- L1が、A1、A8及びA10の基のうち少なくとも2つの結合の組合せである、請求項46に記載の複合体。
- L1の長さが3〜25個の原子である、請求項43〜47のいずれか1項に記載の複合体。
- L1の長さが4〜15個の原子である、請求項48に記載の複合体。
- j1は2〜10の整数であり、j2は2〜10の整数であり、R’はC1−C4アルキル基であり、Raは、A27、A28、A29、A30及びA31から選択され、RbはC1−C5アルキル基である、請求項43に記載の複合体。
- j1は3〜5の整数であり、j2は3〜5の整数であり、R’はメチル基、エチル基又はイソプロピル基であり、RaはA27又はA28であり、Rbはメチル基、エチル基、イソプロピル基又はブチル基である、請求項50に記載の複合体。
- n1は1〜2の整数であり、n3は0〜1の整数であり、かつ、n1+n3=2〜3である、請求項43に記載の複合体。
- m1、m2及びm3はそれぞれ独立して2〜5の整数である、請求項43に記載の複合体。
- m1=m2=m3である、請求項53に記載の複合体。
- 保護されるヒドロキシ基がYCOO−構造を有し、各Yが、C1−C10アルキル基及びC6−C10アリール基からなる群から独立して選択され、ハロゲン置換基及びC1−C6アルキル基から選択される1又は複数の置換基を任意に有する、請求項43に記載の複合体。
- 各Yが、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モノクロロメチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びC1−C6アルキルフェニル基から独立して選択される、請求項55に記載の複合体。
- 各M1が独立して糖である、請求項43に記載の複合体。
- 各M1が独立して単糖、二糖、三糖又は多糖である、請求項43に記載の複合体。
- 少なくとも1つのM1が修飾されている、請求項43に記載の複合体。
- 各M1が、D−マンノピラノース、L−マンノピラノース、D−アラビノース、D−キシロフラノース、L−キシロフラノース、D−グルコース、L−グルコース、D−ガラクトース、L−ガラクトース、α−D−マンノフラノース、β−D−マンノフラノース、α−D−マンノピラノース、β−D−マンノピラノース、α−D−グルコピラノース、β−D−グルコピラノース、α−D−グルコフラノース、β−D−グルコフラノース、α−D−フルクトフラノース、α−D−フルクトピラノース、α−D−ガラクトピラノース、β−D−ガラクトピラノース、α−D−ガラクトフラノース、β−D−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、N−アセチルガラクトサミン、N−トリフルオロアセチルガラクトサミン、N−プロピオニルガラクトサミン、N−n−ブチリルガラクトサミン、N−イソブチリルガラクトサミン、2−アミノ−3−O−[(R)−1−カルボキシエチル]−2−デオキシ−β−D−グルコピラノース、2−デオキシ−2−メチルアミノ−L−グルコピラノース、4,6−ジデオキシ−4−ホルムアミド−2,3−ジ−O−メチル−D−マンノピラノース、2−デオキシ−2−スルホアミノ−D−グルコピラノース、N−グリコリル−α−ノイラミン酸、5−チオ−β−D−グルコピラノース、メチル2,3,4−トリス−O−アセチル−1−チオ−6−O−トリチル−α−D−グルコピラノシド、4−チオ−β−D−ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7−テトラ−O−アセチル−2−デオキシ−1,5−ジチオ−α−D−グルコヘプトピラノシド、2,5−アンヒドロ−D−アロノニトリル、リボース、D−リボース、D−4−チオリボース、L−リボース及びL−4−チオリボースからなる群から独立して選択される、請求項43に記載の複合体。
- 少なくとも1つのM1がN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)である、請求項60に記載の複合体。
- 各M1がいずれもN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)である、請求項60に記載の複合体。
- R10、R11、R12、R13、R14及びR15がそれぞれ独立してH、メチル基又はエチル基である、請求項43に記載の複合体。
- R3が、機能性オリゴヌクレオチドを含む、請求項43に記載の複合体。
- R2がR3上のP原子に結合される、請求項65に記載の複合体。
- R2が、R3におけるP原子とリン酸エステル結合を形成する、請求項65に記載の複合体。
- 前記機能性オリゴヌクレオチドが、低分子干渉RNA、マイクロRNA、抗マイクロRNA、マイクロRNA拮抗剤、マイクロRNA模倣物、デコイオリゴヌクレオチド、免疫刺激物、G−四重鎖、選択的スプライスバリアント、一本鎖RNA、アンチセンス核酸、核酸アプタマー、ステムループRNA、mRNA断片、活性化RNA又はDNAからなる群から選択される、請求項65に記載の複合体。
- 前記機能性オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項70に記載の複合体。
- 前記機能性オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドであり、式A59におけるP原子が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域に結合され、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域とは、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの一端に最も近い4個のヌクレオチドを指す、請求項71に記載の複合体。
- 式A59におけるP原子が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端に結合される、請求項72に記載の複合体。
- 式A59におけるP原子が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端に結合される、請求項73に記載の複合体。
- 前記機能性オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記式A59におけるP原子が、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域に結合され、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の一端に最も近い4個のヌクレオチドを指す、請求項71に記載の複合体。
- 式A59におけるP原子が、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の末端に結合される、請求項75に記載の複合体。
- 式A59におけるP原子が、前記センス鎖の3’末端に結合される、請求項76に記載の複合体。
- 式A59におけるP原子が、リン酸ジエステル結合により前記機能性オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの2’位、3’位又は5’位に結合される、請求項71〜77のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記二本鎖オリゴヌクレオチドがsiRNAである、請求項71及び75〜77のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記siRNAにおける各ヌクレオチドが、独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記siRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖がヌクレオチド配列1を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列2を含み、前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2は、長さがいずれも19ヌクレオチドであり、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖相補領域を形成し、前記ヌクレオチド配列2が、標的mRNAにおけるヌクレオチド断片である第1のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で相補的であり、前記標的mRNAとは、肝細胞において異常に発現する遺伝子のmRNAを指す、請求項79に記載の複合体。
- 前記標的mRNAが、ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP−1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV又はHCVに対応するmRNAである、請求項80に記載の複合体。
- 前記標的mRNAが、B型肝炎ウイルスのmRNA、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子から転写されたmRNA、又は、アポリポタンパクC3遺伝子から転写されたmRNAから選択される、請求項81に記載の複合体。
- 前記ヌクレオチド配列1と前記第1のヌクレオチド配列断片とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が3個以下であり、前記ヌクレオチド配列2とヌクレオチド配列Bとは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が3個以下であり、前記ヌクレオチド配列Bは、前記第1のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的なヌクレオチド配列である、請求項80に記載の複合体。
- 前記ヌクレオチド配列1と前記第1のヌクレオチド配列断片とは、ヌクレオチド差異が1つ以下であり、及び/又は前記ヌクレオチド配列2と前記ヌクレオチド配列Bとは、ヌクレオチド差異が1つ以下である、請求項83に記載の複合体。
- 前記ヌクレオチド配列2と前記ヌクレオチド配列Bとの間のヌクレオチド差異が、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列2における1番目のヌクレオチドZ’の位置での差異を含む、請求項83又は84に記載の複合体。
- 5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列1における最後のヌクレオチドZが、Z’と相補的なヌクレオチドである、請求項85に記載の複合体。
- 前記ヌクレオチド配列1と前記ヌクレオチド配列2が、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項80に記載の複合体。
- 前記センス鎖がヌクレオチド配列3をさらに含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列4をさらに含み、前記ヌクレオチド配列3と前記ヌクレオチド配列4は、長さが等しく、いずれも1〜4ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列3が前記ヌクレオチド配列1の5’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列4が前記ヌクレオチド配列2の3’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列4が第2のヌクレオチド配列断片と相補的であり、前記第2のヌクレオチド配列断片とは、標的mRNAにおいて前記第1のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列4と同じヌクレオチド配列を指し、前記ヌクレオチド配列3と前記ヌクレオチド配列4が、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項80に記載の複合体。
- 前記siRNAがヌクレオチド配列5をさらに含み、前記ヌクレオチド配列5は、長さが1〜3ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の3’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の3’オーバーハング端を構成する、請求項80又は88に記載の複合体。
- 前記ヌクレオチド配列5の長さが2ヌクレオチドであり、5’から3’に向かって、前記ヌクレオチド配列5が、連続した2個のデオキシシチジン一リン酸、連続した2個のウリジン一リン酸であり、又は、第3のヌクレオチド配列断片と相補的であり、前記第3のヌクレオチド配列断片とは、標的mRNAにおいて前記第1のヌクレオチド配列断片もしくは前記第2のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列5と等しいヌクレオチド配列を指す、請求項89に記載の複合体。
- 前記センス鎖又はアンチセンス鎖の少なくとも1つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び/又は少なくとも1つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項80〜84、86〜88及び90のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、前記非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指し、ヌクレオチドアナログが、核酸におけるヌクレオチドを置換できる基であり、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドのいずれか1つとも異なる構造を有する、請求項91に記載の複合体。
- センス鎖及びアンチセンス鎖がいずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列1とヌクレオチド配列2に存在し、前記ヌクレオチド配列1におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが5個以下であり、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列1の第7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列2におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが7個以下であり、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列2の第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項92に記載の複合体。
- 5’末端から3’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列1の第7、8及び9位又は第5、7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
5’末端から3’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列2の第2、6、14、16位又は第2、6、8、9、14、16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項93に記載の複合体。 - 前記ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドが、2’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、2’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、2’−アルキル修飾ヌクレオチド、2’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、2’−アミノ修飾ヌクレオチド、2’−置換アミノ修飾ヌクレオチド及び2’−デオキシヌクレオチド(DNA)からなる群から選択され、前記ヌクレオチドアナログが、イソヌクレオチド、LNA、ENA、cET、UNA及びGNAから選択される、請求項92又は94に記載の複合体。
- 各非フルオロ修飾ヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、前記ヌクレオチドにおいてリボース基の2’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項95に記載の複合体。
- 前記修飾基を有するリン酸エステル基が、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも1つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項91に記載の複合体。
- 前記siRNAにおいて、チオリン酸エステルが、
前記センス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端の1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端の2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも1つに結合されて存在する、請求項97に記載の複合体。 - 前記アンチセンス鎖の5’末端のヌクレオチドが5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項91、92又は97に記載の複合体。
- 前記5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、式(202)、式(203)又は式(205)に示されるヌクレオチドである、請求項101に記載の複合体。
- 請求項43〜102のいずれか1項に記載の複合体の、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び/又は予防のための薬物の調製への使用。
- 前記特定の遺伝子が、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子及びアポリポタンパクC3遺伝子からなる群から選択される、請求項103に記載の使用。
- 前記疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維化、肝過形成性疾患及び脂質異常からなる群から選択される、請求項103に記載の使用。
- 前記脂質異常が高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項105に記載の使用。
- 必要のある被験体において、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患を治療する方法であって、前記被験体に請求項43〜102のいずれか1項に記載の複合体の有効量を投与することを含む、方法。
- 前記特定の遺伝子が、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子及びアポリポタンパクC3遺伝子からなる群から選択される、請求項107に記載の方法。
- 前記疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維化、肝過形成性疾患及び脂質異常からなる群から選択される、請求項107に記載の方法。
- 前記脂質異常が高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項109に記載の方法。
- 請求項43〜102のいずれか1項に記載の複合体を肝細胞と接触させることを含む、前記肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法。
- 前記特定の遺伝子がApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP−1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV又はHCVである、請求項111に記載の方法。
- 前記特定の遺伝子が、B型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質3遺伝子及びアポリポタンパクC3遺伝子からなる群から選択される、請求項112に記載の方法。
- 請求項43〜102のいずれか1項に記載の複合体を含むキット。
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