KR20210110839A - 핵산, 핵산을 함유하는 조성물 및 접합체, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

아포지질단백질 C3 유전자의 발현을 억제하기 위한 siRNA, 및 siRNA를 함유하는 약제학적 조성물 및 접합체가 제공된다. siRNA내 각각의 뉴클레오타이드는 각각 및 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; siRNA는 센스 가닥 및 안티-센스 가닥을 함유하고; 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이를 가지고, 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이하고; 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이를 가지고 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이하다. 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 및 이의 약제학적 조성물 및 접합체는 이상지질혈증을 효과적으로 치료 및/또는 예방할 수 있다.

Description

핵산, 핵산을 함유하는 조성물 및 접합체, 이의 제조 방법 및 용도
본 개시내용은 아포지질단백질(Apolipoprotein) C3(APOC3) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 핵산, 이를 포함하는 조성물 및 접합체에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 이러한 핵산, 조성물 및 접합체의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
지방의 비정상적인 대사 및 수송이 정상치보다 더 높은 혈장 지질 함량을 유발하는 전신계 질환을 지칭하는, 이상지질혈증(Dyslipidemia)(또한 고지혈증으로 알려짐)은 전세계적으로 환자의 건강을 심각하게 위협하고 있다. 이상지질혈증을 치료하기 위해 현재 이용가능한 의약은 주로 스타틴, 콜레스테롤 흡수 억제제, 수지, 프로부콜, 피브레이트, 니아신, 및 이의 유도체를 포함한다.
아포지질단백질 C3(APOC3)은 지질 대사에 중요한 역활을 한다. APOC3 돌연변이체 유전자를 지닌 사람들에서, 혈류 속의 APOC3의 발현 수준은 46%까지 감소하며, 혈장 속의 트리글리세라이드 수준은 정상의 집단과 비교하여 39%까지 감소한다. 한편, 비교적 낮은 혈액 지질 수준은 APOC3 돌연변이체 유전자를 수반하는 사람들에서 심장 질환의 발달 위험을 상기 유전자를 수반하지 않는 사람들과 비교하여 35.1%까지 감소시킬 수 있다. 따라서, 유전적 수순에서 APOC3 유전자의 유전자 발현을 사일런싱(silencing)시켜 APOC3 생산을 차단하는 것은 의심의 여지없이 가장 이상적인 치료 수단이다. RNA 간섭(RNAi)의 메카니즘을 기반으로, 작은 간섭(small interfering) RNA(siRNA)는 서열-특이적인 방식으로 목적한 임의의 표적 유전자의 발현을 억제하거나 차단할 수 있으므로, 질환을 치료할 목적을 달성할 수 있다.
siRNA의 적합한 서열 및 변형 및 이의 전달 시스템은 siRNA 의약의 개발에 있어 2개의 중요한 기술이다.
발명의 요약
일부 구현예에서, 본 개시내용은 화학식 (308)로 나타낸 구조를 갖는 siRNA 접합체를 제공한다:
Figure pct00001
화학식(308),
상기 화학식 (308)에서,
n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이고;
m1, m2, 및 m3은 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 서로 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
R3은 화학식 (A59)로 나타낸 구조를 갖는 그룹이고:
Figure pct00002
화학식 (A59)
상기 화학식 (A59)에서,
E1은 OH, SH 또는 BH2이고;
Nu는 siRNA이고;
siRNA는 센스 가닥(sense strand) 및 안티센스 가닥(antisense strand)을 포함하고; siRNA내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 다음의 그룹 i) 내지 v) 중 하나로부터 선택된 서열이고:
i) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00003
여기서, Za1는 A이고 Za2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Za1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Za2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za4를 포함하고, 여기서 Za4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다; 또는
ii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 13으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00004
여기서, Zb1는 A이고 Zb2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zb1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb3를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zb2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb4를 포함하고, 여기서 Zb4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다; 또는
iii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 25는 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00005
여기서, Zc1는 A이고 Zc2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zc1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zc3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zc2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zc4를 포함하고, 여기서 Zc4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다; 또는
iv) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 37로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00006
여기서, Zd1는 A이고 Zd2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zd1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zd2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd4를 포함하고, 여기서 Zd4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다; 또는
v) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 49로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00007
여기서, Ze1은 A이고 Ze2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Ze1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Ze2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze4를 포함하고, 여기서 Ze4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다;
R2는 길이가 1 내지 20개 탄소 원자인 선형의 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 임의 치환되고; 여기서 R2는 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬페닐), -NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
각각의 L1은 길이가 1 내지 70개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 임의 치환되고; 여기서 L1은 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), -NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
Figure pct00008
는 그룹이 분자의 나머지에 연결된 부위를 나타내고;
M1은 표적화 그룹(targeting group)을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 APOC3 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 제공하고, 여기서 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 및 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 다음의 그룹 i) 내지 v) 중 하나로부터 선택된 서열이다:
i) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00009
여기서, Za1는 A이고 Za2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Za1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Za2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za4를 포함하고, 여기서 Za4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다; 또는
ii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 13으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00010
여기서, Zb1는 A이고 Zb2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zb1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zb2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb4를 포함하고, 여기서 Zb4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다; 또는
iii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00011
여기서, Zc1는 A이고 Zc2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zc1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zc3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zc2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zc4를 포함하고, 여기서 Zc4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다; 또는
iv) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 37로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00012
여기서, Zd1는 A이고 Zd2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zd1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zd2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd4를 포함하고, 여기서 Zd4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다; 또는
v) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 49로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00013
여기서, Ze1은 A이고 Ze2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Ze1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Ze2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze4를 포함하고, 여기서 Ze4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 이의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드, 및 뉴클레오타이드 유사체 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 리보스 그룹의 2'-하이드록시 그룹을 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드는 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 상기 siRNA, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 APOC3 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 이상지질혈증을 치료하고/하거나 예방하기 위한 의약의 제조시 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 발명의 유효량의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체를 이상지질혈증을 앓고 있는 대상체에게 투여함을 포함하여, 이상지질혈증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체를 간세포와 접촉시킴을 포함하여, 간세포에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체를 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
유리한 효과
본 개시내용의 siRNA, siRNA를 포함하는 조성물, 및 siRNA 접합체는 양호한 안정성, 보다 높은 유전자 억제 활성을 나타내고/내거나 혈액 지질 수준을 유의적으로 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 APOC3 mRNA를 억제하고: 1 mg/kg의 용량에서 고-지방 모델 마우스의 간 내에서 APOC3 mRNA의 발현을 적어도 82.0% 억제하는 탁월한 특성을 나타낸다.
실험은 선행 기술에서 제공된 바와 같은 접합체 분자로부터 형성된 접합체와 비교하여, 본 개시내용의 siRNA 접합체가 혈액 지질을 감소시키는 탁월한 능력을 나타낸다. 더욱이, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 낮은 투여 용량 및 낮는 투여 빈도 하에 189일 이하의 기간에 걸쳐 혈액 지질 수준의 탁월한 효과를 지속적으로 나타낼 수 있다.
예를 들면, 3 mg/kg의 단일 투여 후, 접합체 2, 4 및 5는 77일 이하의 기간에 걸쳐 TG에 대해 70% 내지 90%의 억제율을 유지하고, 77일 이하의 기간에 걸쳐 총 콜레스테롤(CHO)에 대해 50%의 억제율을 실질적으로 유지하고, 147일 이하의 기간에 걸쳐 TG에 대해 약 50% 이상의 억제율을 유지하고; 3 mg/kg의 단일 투여 후, 3개의 접합체는 7일째에 TG에 대해 약 80% 이하의 억제율을 나타내고, 49일 이하의 기간에 걸쳐 50% 이상까지 TG 함량을 감소시키는 효과를 지속적으로 나타내고; 단일 투여 후 35일째에, 1 mg/kg 용량 그룹에서 3개의 접합체는 CHO 함량을 적어도 약 50%까지 감소시키는 효과를 여전히 나타낸다. 접합체 1의 경우, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 용량 그룹 둘 다에서, 접합체 1은 112일 이하의 기간에 걸쳐 유전자이식 마우스에서 TG 및 CHO 수준을 유의적으로 감소시킬 수 있고; 이러한 감소 효과는 비교 접합체 2보다 유의적으로 더 우수하다. 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 용량 그룹 둘 다에서, 접합체 1은 단일 투여 후 56일의 기간에 걸쳐 TG 및 CHO에 대해 50% 이상의 억제율을 나타내고; TG에 대한 억제 효과는 보다 유의적이고; 접합체 1의 2회 용량은 112일 이하의 기간에 걸쳐 약 50%의 TG 수준을 지속적으로 유지시킨다.
다른 예에서, 접합체 3은 유전자이식 마우스에서 TG 및 CHO 수준을 98일 이하의 기간에 걸쳐 유의적으로 감소시킬 수 있다. 3 mg/kg의 단일 투여 후 14일째에, 접합체 3은 TG에 대해 93.6% 이하의 억제율을 나타내고 단일 투여 후 7일째에 CHO에 대해 63.0%의 억제율을 나타낸다. 2개의 용량에서 접합체 4, 6 및 7은 사람 APOC3 유전자이식 마우스에서 혈액 지질 수준을 유의적으로 억제시키고, 3 mg/kg 용량 그룹에서, 투여 후 84일의 기간에 걸쳐 TG에 대해 50% 이상의 억제율 및 CHO에 대해 30% 이상의 억제율을 지속적으로 유지할 수 있다. 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 용량에서, 접합체 4, 6 및 7은 비교 접합체 2보다 TG에 대해 더 높은 억제 효과를 지속적으로 나타내고; 동일한 경향성이 또한 CHO에서 억제 효과에 대해 관찰됨이 주목할만하다.
접합체 8 및 9의 경우, 상이한 시점에서 TG를 억제하기 위한 ED50 값을 측정한다. 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 경우, 투여 후 심지어 1/2개월째에, 0.16 mg/kg의 접합체 8 또는 0.11 mg/kg의 접합체 9의 단일 피하 투여는 혈청 TG 함량을 1/2로 감소시키는 효능을 여전히 실현시킬 수 있고; 심지어 투여 1개월 재에, 1 mg/kg 미만의 본 개시내용의 접합체의 단일 피하 투여는 혈청 TG 함량의 1/2을 감소시키는 효과를 여전히 실현시킬 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체는 APOC3 유전자의 발현을 억제시킬 수 있고, APOC3 유전자의 과발현에 의해 유발된 이상지질혈증을 효과적으로 치료 및/또는 예방할 수 있으므로, 촉망된 적용 가능성을 나타낸다.
본 개시내용의 추가의 특징 및 장점은 다음 부분 "본 발명의 상세한 설명"에서 상세히 나타낼 것이다.
본 발명의 실시예 및 선행 기술의 기술적 해결을 보다 명확하게 나타내기 위하여, 다음의 부분은 실시예 및 선행 기술에서 사용된 도면을 간단히 기술한다. 명백하게, 다음의 설명에서 도면은 본 발명의 단지 일부 예를 나타낸다.
도 1은 상이한 최종 농도에서 상이한 접합체로 형질감염된 Huh7 세포 및 형질감염되지 않은 Huh7 세포내에서 APOC3 mRNA의 발현 수준을 나타내는 히스토그램이다.
도 2a 내지 도 7d는 정상의 염수 및 다양한 접합체가 상이한 용량으로 투여된 사람 APOC4 유전자전이 마우스의 혈청 속에서 시간에 걸친 총 콜레스테롤(CHO) 수준 및 트리글리세라이드(TG) 수준의 변화를 나타내는 다이아그램이다.
도 8은 정상의 염수 및 접합체 4가 상이한 용량으로 투여된 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 생체내(in vivo) 간 조직내에서 APOC3 mRNA의 발현 수준을 나타내는 산포도이다.
발명의 상세한 설명
다음은 본 개시내용의 구체적인 구현예의 상세한 설명이다. 본원에 기술된 구체적인 구현예는 본 개시내용을 나타내고 설명하는데 단지 사용되며 본 개시내용을 한정하려는 의도는 아니다.
본 개시내용에서, APOC3 mRNA의 서열은 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 제NM_000040.1호에 나타낸 서열이다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 본 개시내용에 사용된 "표적 유전자"는 상기 APOC3 mRNA를 발현하는 유전자를 지칭하고; 용어 "표적 mRNA"는 상기 APOC3 mRNA를 지칭한다.
정의
본 개시내용의 맥락에서, 달리 명시하지 않는 한, C, G, U, 및 A는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; s는 문자 s의 측면 둘 다에 인접한 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 연결에 의해 연결되어 있음을 나타내고; P1은 P1의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; 일부 구현예에서, P1은 구체적인 변형된 뉴클레오타이드 VP, Ps 또는 P를 나타내고, 여기서 VP는 VP의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 비닐 포스페이트 (5'-(E)-비닐포스포네이트, E-VP) 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; Ps는 Ps의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; P는 문자 P의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 불소 원자로 치환함으로써 형성된 뉴클레오타이드를 지칭한다. "비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹, 또는 뉴클레오타이드 유사체로 치환함으로써 형성된 뉴클레오타이드를 지칭한다. "뉴클레오타이드 유사체"는 핵산내 뉴클레오타이드를 대체할 수 있는 그룹을 지칭하는 반면, 아데노신 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 사이토신 리보뉴클레오타이드, 우라실 리보뉴클레오타이드, 또는 티민 데옥시리보뉴클레오타이드, 예를 들면, 이소뉴클레오타이드, 브릿지된(bridged) 뉴클레오타이드(브릿지된 핵산, BNA) 또는 아사이클릭(acyclic) 뉴클레오타이드와는 상이하다. "메톡시 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환함으로써 형성시킨 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, 표현 "상보성" 및 "역 상보성"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 당해 분야에 잘 공지된 의미를 갖는데, 즉, 하나의 가닥내 염기는 이중 가닥 핵산 분자내에서 다른 가닥내 염기와 상보적으로 쌍을 이룬다. DNA에서, 퓨린 염기 아데닌(A)은 피리미딘 염기 티민(T)(또는 RNA내 우라실(U))과 항상 쌍을 이루고; 퓨린 염기 구아닌(G)은 피리미딘 염기 사이토신(C)과 항상 쌍을 이룬다. 각각의 염기 쌍은 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 하나의 가닥내 아데닌은 다른 가닥내 티민(또는 우라실)과 항상 쌍을 이루고, 구아닌은 사이토신과 항상 쌍을 이루고, 2개의 가닥은 서로 상보성인 것으로 고려되고; 가닥의 서열은 이의 상보성 가닥의 서열로부터 유추될 수 있다. 상응하게, "쌍오류(mispairing)"는 상응하는 위치에서의 염기가 이중 가닥 핵산내 상보성 쌍화의 방식으로 존재하지 않음을 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 달리 규정하지 않는 한, "염기적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기쌍오류(base mispairing)가 존재함을 의미한다. "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미한다. "상보적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 뉴클레오타이드 서열이 다른 뉴클레오타이드 서열과 "뉴클레오타이드 차이"를 갖는 경우, 이들 사이의 동일한 위치에서 뉴클레오타이드의 염기는 변화된다. 예를 들면, 후자의 서열내 뉴클레오타이드 염기가 A이고 전자의 서열내 동일한 위치에서 뉴클레오타이드 염기가 U, C, G, 또는 T인 경우, 2개의 뉴클레오타이드 서열은 당해 위치에서 뉴클레오타이드 차이를 가진 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 위치에서 뉴클레오타이드가 무염기성(abasic) 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체로 대체되는 경우, 이는 또한 위치에서 뉴클레오타이드 차이가 존재하는 것으로 고려된다.
본 개시내용의 맥락에서, 특히 siRNA의 설명에서, siRNA를 포함하는 조성물, 또는 본 개시내용의 siRNA 접합체를 제조하는 방법에서, 달리 명시하지 않는 한, "뉴클레오시드 단량체"는 제조될 siRNA 또는 siRNA 접합체내 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라서, 포스포르아미디트 고체 상 합성에 사용된 변형되지 않은 또는 변형된 뉴클레오시드 포스포르아미디트 단량체(변형되지 않은 또는 변형된 RNA 포스포르아미디트; 때때로 RNA 포스포르아미디트는 뉴클레오시드 포스포르아미디트로서 지칭된다)를 지칭한다. 포스포르아미디트 고체 상 합성은 당해 분야의 숙련가에 의해 RNA 합성용으로 잘 공지된 방법이다. 본 개시내용에 사용된 뉴클레오시드 단량체는 모두 상업적으로 이용가능하다.
본 개시내용의 맥락에서, 달리 명시하지 않는 한, "접합"은 각각 특이적인 기능을 가진“2개 이상의 화학적 모이어티(moiety)가 공유결합성 연결을 통해 서로 연결됨을 의미한다. 상응하게, "접합체"는 개개 화학적 모이어티의 공유결합성 연결에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 또한, "siRNA 접합체"는 각각 특이적인 기능을 지닌 하나 이상의 화학적 모이어티를 siRNA에 공유결합적으로 부착시켜 형성시킨 화합물을 지칭한다. 다음의 내용에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 때때로 "접합체"로 축약된다. 본 개시내용의 맥락에 따라서, siRNA 접합체는 siRNA 접합체의 일반적인 용어, 많은 구체적인 화학 분자의 siRNA 접합체의 일반적인 용어, 또는 많은 구체적인 화학 분자의 siRNA 접합체 중에서 각각의 siRNA 접합체로 이해되어야 한다. 본 개시내용의 맥락에서, "접합 분자"는 반응을 통해 siRNA에 접합됨으로써 본 개시내용의 siRNA 접합체를 최종적으로 형성시킬 수 있는 화합물의 부류 또는 구체적인 화합물로서 해석되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은, 2개의 문자 또는 기호 사이에 존재하지 않는 점선("-")은 치환체에 대한 부착점이 있는 위치를 나타내는데 사용된다. 예를 들면, 구조식 "-C1-C10알킬-NH2"내 먼 좌측 상의 점선은 C1-C10알킬을 통해 부착됨을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "임의의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기술된 현상 또는 환경이 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있고 설명이 현상 또는 환경이 발생하는 예 및 이것이 일어나지 않는 예를 포함함을 의미한다. 예를 들면, "임의로 치환된 알킬"은 "알킬" 및 하기 정의된 바와 같이 "치환된 알킬" 둘 다를 포함한다. 당해 분야의 기술자는 하나 이상의 치환체를 함유하는 임의의 그룹과 관련하여, 이러한 그룹이 입체적으로 실시불가능한, 합성적으로 실행불가능한 및/또는 고유하게 불안정한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 도입하기 위해 의도되지 않음을 이해할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "알킬"은 나타낸 수의 탄소 원자, 일반적으로 1 내지 20개의 탄소 원자, 예를 들면 1 내지 10개의 탄소 원자, 예를 들면, 1 내지 8개 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬을 지칭한다. 예를 들면, C1-C6 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 및 측쇄 알킬 둘 다를 포함한다. 특정 수의 탄소 원자를 갖는 알킬 잔기가 명명되는 경우, 이러한 수의 탄소 원자를 갖는 모든 측쇄 및 직쇄 형태가 포함되는 것으로 의도되며; 따라서, 예를 들면, "부틸"은 n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸, 및 t-부틸을 포함함을 의미하고; "프로필"은 n-프로필 및 이소프로필을 포함한다. 알킬렌은 알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 점을 갖는 알킬의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알케닐"은 모 알킬의 2개의 인접한 탄소 원자로부터 1개의 수소 분자를 각각 제거함으로써 수득된 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화된 측쇄 또는 직쇄 알킬 그룹을 지칭한다. 그룹은 이중 결합(들)의 시스 또는 트랜스 구조일 수 있다. 대표적인 알케닐 그룹은 에테닐; 프로페닐, 예를 들면, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일(알릴), 프로프-2-엔-2-일; 부테닐, 예를 들면, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 구현예에서, 알케닐 그룹은 2 내지 20개의 탄소 원자, 및 다른 구현예에서 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 알케닐렌은 알케닐과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착점을 갖는 알케닐의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알키닐"은 모 알킬의 2개의 인접한 탄소 원자로부터 2개의 수소 분자를 각각 제거함으로써 수득된 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화된 측쇄 또는 직쇄 알킬 그룹을 지칭한다. 대표적인 알키닐 그룹은 에티닐; 프로피닐, 예를 들면, 프로프-1-인-1-일, 프로프-2-인-1-일; 부티닐, 예를 들면, 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 구현예에서, 알키닐 그룹은 2 내지 20개의 탄소 원자를 가지고, 다른 구현예에서, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 알키닐렌은 알키닐과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 부착점을 갖는 알키닐의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알콕시"는 산소 브릿지를 통해 부착된 나타낸 수의 탄소 원자의 알킬 그룹, 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 2급-부톡시, 3급-부톡시, 펜틸옥시, 2-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시, 헥실옥시, 2-헥실옥시, 3-헥실옥시, 3-메틸펜틸옥시 등을 지칭한다. 알콕시 그룹은 일반적으로 산소 브릿지를 통해 부착된 1 내지 10개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "아릴"은 환 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 환 시스템은 유일한 수소 및 탄소, 예를 들면, 6 내지 18개의 탄소 원자를 함유하고, 여기서 환 시스템내 적어도 하나의 환은 완전히 불포화되는데, 즉, 이는 획켈 이론(Hueckel theory)에 따라서 사이클릭, 탈국재화된 (4n+2)π 전자 시스템을 함유한다. 아릴 그룹은 페닐, 플루오레닐 및 나프틸과 같은 그룹을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아릴렌는 아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 부착 점을 갖는 아릴의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "사이클로알킬"은 3 내지 7개의 환 탄소 원자를 일반적으로 갖는 비-방향족 탄소 환을 지칭한다. 환은 포화되거나 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가질 수 있다. 사이클로알킬 그룹의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 및 사이클로헥세닐 뿐만 아니라, 브릿지되고 케이지된(caged) 환 그룹, 예를 들면, 노르보르난을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "할로 치환체" 또는 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도를 지칭하고, 용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 및 요오드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "할로알킬"은 상기 정의된 바와 같은 알킬을 지칭하며 여기서 구체적인 수의 탄소 원자는 하나 이상(최대 허용가능한 수 이하)의 할로겐 원자로 치환된다. 할로알킬의 예는 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 2-플루오로에틸, 및 펜타-플루오로에틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"헤테로사이클릴"은 2 내지 12 탄소 원자 및 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 포함하는 안정한 3 내지 18원의 비-방향족 환 라디칼을 지칭한다. 명세서에서 달리 기술하지 않는 한, 헤테로사이클릴은 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭, 또는 테트라사이클릭 환 시스템이고, 이는 융합되거나 브릿지된 환 시스템(들)을 포함할 수 있다. 헤테로사이클릴내 헤테로원자(들)은 임의로 산화될 수 있다. 하나 이상의 질소 원자는, 존재하는 경우, 임의로 사급화된다. 헤테로사이클릴은 부분적으로 또는 완전히 포화된다. 헤테로사이클릴은 임의의 환 원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 이러한 ㅎ테로사이클릴의 예는 디옥솔라닐, 티에닐[1,3]디티아닐, 데카하이드로이소퀴놀릴, 이미다졸릴, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로이소인돌릴, 2-옥사피페라지닐, 2-옥사피페리디닐, 2-옥사피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로푸릴, 트리티아닐, 테트라하이드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 1-옥소-티오모르폴리닐, 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"헤테로아릴"은 2 내지 17개의 탄소 원자 및, 질소, 산소 또는 환으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 18원의 방향족 환 라디칼로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 헤테로아릴은 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 환 시스템일 수 있고, 여기서 환 시스템 내 적어도 하나의 환은 완전히 불포화되는데, 즉, 이는 획켈 이론에 따라서 사이클릭의, 탈국재화된 (4n+2)π 전자 시스템을 함유한다. 헤테로아릴은 융합된 또는 브릿지된 환 시스템(들)을 포함한다. 헤테로아릴내 헤테로원자(들)은 임의 산화된다. 하나 이상의 질소 원자는, 존재하는 경우, 임의로 사급화된다. 헤테로아릴은 임의의 환 원자를 통해 분자의 나머지에 부착된다. 헤테로아릴의 예는 아제피닐, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈인돌릴, 1,3-벤조디옥사졸릴, 벤조푸라닐, 벤조[d]티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조[b][1,4]디옥세피닐, 벤조[b][1,4]옥사지닐, 1,4-벤조디옥사닐, 벤조나프토푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥시닐, 벤조피라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐, 벤조티에노[3,2-d]피리미디닐, 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐, 카바졸릴, 신놀리닐, 사이클로펜타[d]피리미디닐, 6,7-디하이드로-5H-사이클로펜타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6-디하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 5,6-디하이드로벤조[h]신놀리닐, 6,7-디하이드로-5H-벤조[6,7]사이클로헵타[1,2-c]피리디지닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티에닐, 푸라닐, 푸라노닐, 푸로[3,2-c]피리디닐, 5,6,7,8,9,10 헥사하이드로사이클로옥타[d]피리미디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로헵타[d]피리다지닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리디닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 5,8-메타노-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 나프티리디노닐, 1,6-나프티리디노닐, 옥사디아졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥시라닐, 5,6,6a,7,8,9,10,10a-옥타하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 푸리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피라졸로[3,4-d]피리미디닐, 피리디닐, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로벤조[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-사이클로헵타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[4,5-c]피리다지닐, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 트리아지닐, 티에노[2,3-d]피리미디닐, 티에노[3,2-d]피리미디닐, 티에노[2,3-c]피리디닐 및 티오페닐/티에닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 하이드록실 보호 그룹이 본 개시내용에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 보호 그룹은 화학적 작용 그룹이 특이적인 반응 조건에 대해 불활성이 되도록 하며, 분자의 나머지에 실질적으로 손상을 입히지 않고 분자내 이러한 작용 그룹에 부착되거나 이로부터 제거될 수 있다. 대표적인 하이드록실 보호 그룹은 문헌: Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311, 및 또한 문헌: Greene and Wuts, Protective Groups in Organic 합성, Chapter 2, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991에 개시되어 있으며, 이러한 문헌은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 보호 그룹은 염기성 조건 하에서 안정하지만 산성 조건 하에서 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용될 수 있는 하이드록실 보호 그룹의 비-배타적인 예는 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸, 9-페닐크산텐-9-일(Pixyl) 및 9-(p-메톡시페닐)크산텐-9-일(Mox)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용될 수 있는 하이드록실 보호 그룹의 비-독점적인 예는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr(4,4'-디메톡시트리틸), 및 TMTr(4,4',4''-트리메톡시트리틸)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 임의의 동물, 예컨대, 포유동물 또는 유대목동물(marsupial)을 지칭한다. 본 개시내용의 대상체는 사람, 비-사람 영장류(예컨대, 레서스(rhesus) 또는 다른 유형의 마카크(macaque), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 랫트, 및 임의의 종류의 가금류를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료" 또는 "치료하는", 또는 "완화시키는" 또는 "개선시키는"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 유리한 또는 바람직할 수 있는 결과, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 치료학적 이익을 수득하기 위한 시도를 지칭한다. "치료학적 이익"은 치료되는 직면한 장애의 근절 또는 개선을 의미한다. 치료학적 이익은 직면한 장애와 관련된 하나 이상의 생리학적 증상을 근절시키거나 개선시킴으로써 대상체가 여전히 직면한 장애"로 괴로울 수 있다고 해도, 대상체내에서 개선을 관찰함으로써 달성된다.
본원에 사용된 바와 같은, "예방" 및 "예방하는"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 유리하거나 바람직한 결과, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 예방학적 이익을 수득하기 위한 접근법을 지칭한다. "예방학적 이익"을 수득하기 위하여, 접합체 또는 조성물은 특수한 질환으로 진행될 위험이 있는 대상체, 또는 질환의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게, 이러한 질환의 진단이 이루어지지 않았다고 해도, 투여될 수 있다.
본 개시내용의 siRNA는 기본 구조 단위로서 뉴클레오타이드 그룹을 포함한다. 뉴클레오타이드 그룹이 포스페이트 그룹, 리보스 그룹, 및 염기를 포함함은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 그룹의 상세한 설명은 본원에서 제외된다.
제1의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제1의 siRNA일 수 있다.
제1의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 제1의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 제1의 siRNA의 경우, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00014

여기서, Za1은 A이고 Za2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Za1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Za2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za4를 포함하고, 여기서 Za4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 맥락에서, "상응하는 위치"는 뉴클레오타이드 서열의 동일한 말단으로부터 계수하는 경우 뉴클레오타이드 서열내 동일한 위치를 지칭한다. 예를 들면, 제1의 siRNA의 경우, 뉴클레오타이드 서열 I의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드는 서열 번호: 1의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드에 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Za4에서의 차이를 포함하고 여기서 Za4 는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 위치 Za4에서의 차이이고, 여기서 Za4는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Za3은 Za4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이는 표적 유전자를 억제하는 siRNA 접합체의 능력을 유의적으로 감소시킬 것이며, 따라서 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA 접합체는 본 개시내용의 보호 영역 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전한 역 상보성이고; "기본적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 염기쌍 오류가 존재함을 의미하고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "완전한 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 3으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고, 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 4로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이다:
Figure pct00015

여기서, Za4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고, Za3은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Za4는 Za3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Za3는 U이고, Za4는 A이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥은 20 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되어 있고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되어 있고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 GC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 GC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 UGC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 GCA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 UUGC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 GCAA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 GC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 GC이고; 이러한 경우에 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖고 완전하게 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)가 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 측정된다.
제2의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제2의 siRNA일 수 있다.
제2의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 제2의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 13으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00016

여기서, Zb1은 A이고 Zb2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zb1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zb2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb4를 포함하고, 여기서 Zb4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 13으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Zb4에서의 차이를 포함하고 여기서 Zb4 는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 위치 Zb4에서의 차이이고, 여기서 Zb4는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Zb3은 Zb4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이는 표적 유전자를 억제하는 siRNA 접합체의 능력을 유의적으로 감소시킬 것이며, 따라서 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA 접합체는 본 개시내용의 보호 영역 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전한 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 15로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고, 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 16으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이다:
Figure pct00017

여기서, Zb4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고, Zb3은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Zb4는 Za3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Zb3는 U이고, Zb4는 A이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥은 20 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되어 있고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되어 있고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 GG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 GGG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CCC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AGGG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CCCU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 GG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CC이고; 이러한 경우에 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖고 완전하게 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)가 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 측정된다.
제3의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제3의 siRNA일 수 있다.
제3의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 제3의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00018

여기서, Zc1은 A이고 Zc2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zc1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zc3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zc2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zc4를 포함하고, 여기서 Zc4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Zc4에서의 차이를 포함하고 여기서 Zc4 는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 위치 Zc4에서의 차이이고, 여기서 Zc4는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Zc3은 Zc4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이는 표적 유전자를 억제하는 siRNA 접합체의 능력을 유의적으로 감소시킬 것이며, 따라서 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA 접합체는 본 개시내용의 보호 영역 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전한 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 27로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고, 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 28로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이다:
Figure pct00019

여기서, Zc4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고, Zc3은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Zc4는 Zc3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Zc3는 U이고, Zc4는 A이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥은 20 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되어 있고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되어 있고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 CAG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CUG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 ACAG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CUGU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CU이고; 이러한 경우에 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖고 완전하게 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)가 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 측정된다.
제4의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제4의 siRNA일 수 있다.
제4의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 제4의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 37로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00020

여기서, Zd1은 A이고 Zd2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Zd1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zd2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd4를 포함하고, 여기서 Zd4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 37로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Zd4에서의 차이를 포함하고 여기서 Zd4 는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 위치 Zd4에서의 차이이고, 여기서 Zd4는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Zd3은 Zd4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이는 표적 유전자를 억제하는 siRNA 접합체의 능력을 유의적으로 감소시킬 것이며, 따라서 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA 접합체는 본 개시내용의 보호 영역 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전한 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 39로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고, 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 40으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이다:
Figure pct00021

여기서, Zd4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고, Zd3은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Zd4는 Zd3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Zd3는 U이고, Zd4는 A이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥은 20 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되어 있고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되어 있고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 GU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 GAC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 GUC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 GGAC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 GUCC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 GU이고; 이러한 경우에 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖고 완전하게 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)가 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 측정된다.
제5의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제5의 siRNA일 수 있다.
제5의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 제5의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 49로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
Figure pct00022

여기서, Ze1은 A이고 Ze2는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Ze1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Ze2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze4를 포함하고, 여기서 Ze4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 49로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Ze4에서의 차이를 포함하고 여기서 Ze4 는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 위치 Ze4에서의 차이이고, 여기서 Ze4는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Ze3은 Ze4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이는 표적 유전자를 억제하는 siRNA 접합체의 능력을 유의적으로 감소시킬 것이며, 따라서 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA 접합체는 본 개시내용의 보호 영역 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전한 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 51로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고, 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 52로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이다:
Figure pct00023

여기서, Ze4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고, Ze3은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Ze4는 Ze3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Ze3는 U이고, Ze4는 A이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥은 20 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되어 있고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되어 있고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AAG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CUU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AAAG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CUUU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 AG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 CU이고; 이러한 경우에 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖고 완전하게 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)가 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 측정된다.
siRNA의 오버행 말단(Overhang terminal) 및 변형
뉴클레오타이드 서열 V, 핵산 서열, 또는 뉴클레오타이드 변형 및 siRNA의 변형된 서열에 관한 다음의 설명은 제1의 siRNA 내지 제5의 siRNA 중 어느 하나에 적용가능하다. 즉, 달리 기술하지 않는 한, siRNA의 다음의 설명은 제1, 제2, 제3 및 제4의 siRNA 각각의 설명으로서 고려될 수 있다. 예를 들면, 특수한 siRNA를 구체적으로 나타내지 않는 경우, "siRNA는 뉴클레오타이드 서열 V를 포함한다"는 "제1의 siRNA, 제2의 siRNA, 제3의 siRNA, 제4의 siRNA 또는 제5의 siRNA가 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함한다"를 의미한다.
일부 구현예에서, siRNA는 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함한다. 뉴클레오타이드 서열 V는 1 내지 3개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결(즉, 뉴클레오타이드 서열 II 또는 뉴클레오타이드 서열 IV의 말단에 연결)됨으로써, 안티센스 가닥의 3' 오버행 말단을 형성한다. 이러한 경우에, siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이 비는 19/20, 19/21, 19/22, 20/21, 20/22, 20/23, 21/22, 21/23, 21/24, 22/23, 22/24, 22/25, 23/24, 23/25, 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 V는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 따라서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21, 21/23 또는 23/25일 수 있다.
뉴클레오타이드 서열 V내 각각의 뉴클레오타이드는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 합성을 촉진시키고 합성 비용을 절약하기 위하여, 뉴클레오타이드 서열 V는 2개의 연속된 티민 데옥시리보뉴클레오타이드(dTdT) 또는 2개의 연속된 우라실 리보뉴클레오타이드(UU)이고; siRNA의 안티센스 가닥과 표적 mRNA 사이의 친화성을 향상시키기 위해서, 뉴클레오타이드 서열 V는 표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드에 대해 상보성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21 또는 21/23이다. 이러한 경우에, 본 개시내용의 siRNA는 보다 우수한 mRNA 사일런싱 활성을 나타낸다.
표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드는 표적 mRNA의 뉴클레오타이드 서열의 분절(segment)의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 표적 mRNA의 뉴클레오타이드 서열의 이러한 분절은 뉴클레오타이드 서열 II와 실질적으로 역 상보성 또는 완전한 역 상보성이거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 뉴클레오타이드 서열 IV로 이루어진 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성인 뉴클레오타이드 서열의 분절을 지칭한다.
일부 구현예에서, 제1의 siRNA의 경우 siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 5로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 6으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00024

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 7로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 7을 포함하고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 8로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00025

여기서, Za4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고; Za3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Za4는 Za3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제2의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 17로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 18로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00026

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 19로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 20으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00027

여기서, Zb4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고; Zb3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Zb4는 Zb3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제4의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 29로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 30으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00028

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 31로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 32로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00029

여기서, Zc4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고; Zc3 는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Zc4는 Zc3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제5의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 41로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 42로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00030

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 43으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 44로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00031

여기서, Zd4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고; Zd3는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Zd4는 Zd3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제5의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 53으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 54로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00032

대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 55로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 56으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00033

여기서, Ze4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고; Ze3는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Ze4는 Ze3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 siAPa1, siAPa2, siAPb1, siAPb2, siAPc1, siAPc2, siAPd1, siAPd2, siAPe1, 또는 siAPe2이다:
Figure pct00034

Figure pct00035

일부 구현예에서, siRNA는 siAPa1, siAPa2, siAPb1, siAPb2, siAPc1, siAPc2, siAPd1, siAPd2, siAPe1, 또는 siAPe2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열(즉, 핵산 또는 염기 서열)을 갖는다.
상술한 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA에서, 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA에서 뉴클레오타이드는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA에서, 뉴클레오타이드 중 일부 또는 모두는 변형된 뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드 그룹 상의 이러한 변형은 본 개시내용의 siRNA의 APOC3 유전자의 발현을 억제하기 위한 기능의 유의적인 감소 또는 손실을 초래하지 않을 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, 사용된 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 다른 그룹, 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 이의 염기가 변형된 염기인 뉴클레오타이드로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오타이드는 siRNA 접합체의 유전자 발현을 억제하기 위한 기능의 유의적인 손상 또는 손실을 초래하지 않을 수 있다. 예를 들면, 문헌: Watts, J.K., G. F. Deleavey and M. J. Damha, Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008.13(19-20): p.842-55에 개시된 변형된 뉴클레오타이드가 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 변형된 뉴클레오타이드이고/이거나, 적어도 하나의 포스페이트 그룹은 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이다. 다시 말해서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 적어도 하나의 단일 가닥의 포스페이트-리보스 골격내 포스페이트 및/또는 리보스 그룹의 적어도 일부는 변형된 그룹을 지닌 포스페이트 그룹 및/또는 변형된 그룹을 지닌 리보스 그룹이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥내 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 또는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도 본 개시내용의 siRNA가 동물 실험에서 혈장 안전성 및 유전자 사일런싱 효능 사이에 높은 균형을 달성함을 발견하였다.
일부 구현예에서, 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 뉴클레오타이드 서열 I은 5개 이상의 플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 II는 7개 이하의 플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 또는 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치 또는 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 불소 원자로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드를 지칭하고, 이는 다음 화학식 (7)로 나타낸 구조를 갖는다. "비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체로부터 독립적으로 선택된다.
리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드, 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (8)로 나타낸 2'-메톡시(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드는 예를 들면, 화학식 (9)로 나타낸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE) 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 2'-아미노 (2'-NH2) 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (10)으로 나타낸다. 일부 구현예에서, 2'-데옥시 뉴클레오타이드(DNA)는 화학식 (11)로 나타낸다.
Figure pct00036

뉴클레오타이드 유사체는 핵산내 뉴클레오타이드를 대체할 수 있지만 아데닌 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 사이토신 리보뉴클레오타이드, 우라실 리보뉴클레오타이드, 또는 티민 데옥시리보뉴클레오타이드와는 구조적으로 상이한 그룹을 지칭한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, 브릿지된 뉴클레오타이드 또는 아사이클릭 뉴클레오타이드일 수 있다.
BNA 뉴클레오타이드(브릿지된 핵산, BNA)는 구속되거나 접근불가능한 뉴클레오타이드이다. BNA는 "고정된" C3'-엔도 당 퍼커링(puckering)을 지닌 5-, 6- 원 또는 7-원의 환 브릿지된 구조를 함유할 수 있다. 브릿지는 전형적으로 리보스의 2'- 및 4'-위치에 포함되어 2',4'-BNA 뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 구현예에서, BNA는 LNA, ENA, cET BNA 등일 수 있고, 이는 각각 화학식 (12), (13) 및 (14)로 나타낸다.
Figure pct00037

아사이클릭 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 부류를 지칭하고 여기서 당 환(sugar ring)은 개환되어 있다. 일부 구현예에서, 아크릴성 뉴클레오타이드는 드러난(unlocked) 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)이고, 이는 각각 화학식 (15) 및 (16)로 나타낸다.
Figure pct00038

상기 화학식 (15) 및 (16)에서, R은 H, OH 또는 알콕시(O-알킬)로부터 선택된다.
이소뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 내 리보스 환 상의 염기의 위치를 변경시켜 형성된 화합물이다. 일부 구현예에서, 이소뉴클레오타이드는 각각 화학식 (17) 또는 (18)로 나타낸 바와 같이, 리보스 환 상의 1'-위치로부터 2'-위치 또는 3'-위치로 염기를 수송함으로써 형성된 화합물이다.
Figure pct00039

상기 화학식 (17) 및 (18)의 화합물에서, "염기"는 핵산의 염기, 예를 들면, A, U, G, C, 또는 T를 나타내고; R은 H, OH, F, 또는 상기 비-플루오로 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다. 일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다. 본 개시내용의 맥락에서, 메톡시 변형된 뉴클레오타이드는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드", "2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드", "리보스 그룹의 2'-하이드록시가 불소 원자로 치환된 뉴클레오타이드", 및 "2'-플루오로리보실을 지닌 뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 2'-하이드록시가 불소 원자로 치환된 화합물을 지칭하는, 동일한 의미를 가지며, 이는 화학식 (7)로 나타낸 구조를 갖는다. "메톡시 변형된 뉴클레오타이드", "2'-메톡시 변형된 뉴클레오타이드", "리보스 그룹의 2'-하이드록시 그룹이 메톡시로 치환된 뉴클레오타이드" 및 "2'-메톡시리보실을 지닌 뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드내 리보스 그룹의 2'-하이드록시가 메톡시로 치환된 화합물을 지칭하는, 동일한 의미를 가지고, 이는 화학식 (8)로 나타낸 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 다음의 변형을 지닌 siRNA이다: 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치 또는 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치 또는 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 다음의 변형을 지닌 siRNA이고 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA 센스 가닥의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8, 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 및 siRNA의 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고;
대안적으로, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8, 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥이 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
대안적으로, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 siAPa1-M1, siAPa2-M1, siAPa1-M2, siAPa2-M2, siAPa1-M3, siAPa2-M3, siAPb1-M1, siAPb2-M1, siAPb1-M2, siAPb2-M2, siAPb1-M3, siAPb2-M3, siAPc1-M1, siAPc2-M1, siAPc1-M2, siAPc2-M2, siAPc1-M3, siAPc2-M3, siAPd1-M1, siAPd2-M1, siAPd1-M2, siAPd2-M2, siAPd1-M3, siAPd2-M3, siAPe1-M1, siAPe2-M1, siAPe1-M2, siAPe2-M2, siAPe1-M3, 또는 siAPe2-M3 중 임의의 하나이다:
Figure pct00040

Figure pct00041

Figure pct00042

Figure pct00043

Figure pct00044
.
상기 변형을 지닌 siRNA는 보다 낮은 비용을 가질 뿐만 아니라 혈액 속의 리보뉴클레아제가 핵산을 용이하게 절단할 수 없도록 함으로써 핵산의 안전성을 증가시켜 핵산이 뉴클레아제 가수분해에 대해 보다 강력한 내성을 가지도록 한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 적어도 하나의 단일 가닥의 포스페이트-리보스 골격내 포스페이트 그룹의 적어도 일부는 변형된 그룹을 지닌 포스페이트 그룹이다. 일부 구현예에서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹은 포스페이트 그룹내 포스포디에스테르 결합내 적어도 하나의 산소 원자를 황 원자로 치환시킴으로써 형성된 포스포로티오에이트 그룹이다. 일부 구현예에서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹은 화학식 (1)로 나타낸 구조를 갖는 포스포로티오에이트 그룹이다:
Figure pct00045

화학식 (1).
이러한 변형은 siRNA의 이중-가닥 구조를 안정화시킴으로써, 염기 쌍화(base pairing)의 고 특이성 및 고 친화성을 유지한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA에서, 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치로 이루어진 그룹 중 적어도 하나에 위치한다: 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치, 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제4의 뉴클레오타이드 사이의 위치, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 5' 말단을 제외하고는 모든 상기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 말단을 제외하고는 모든 상기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치 중 적어도 하나에 위치한다:
센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 5' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 3' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치; 및
안티센스 가닥의 3' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 siAPa1-M1S, siAPa2-M1S, siAPa1-M2S, siAPa2-M2S, siAPa1-M3S, siAPa2-M3S, siAPb1-M1S, siAPb2-M1S, siAPb1-M2S, siAPb2-M2S, siAPb1-M3S, siAPb2-M3S, siAPc1-M1S, siAPc2-M1S, siAPc1-M2S, siAPc2-M2S, siAPc1-M3S, siAPc2-M3S, siAPd1-M1S, siAPd2-M1S, siAPd1-M2S, siAPd2-M2S, siAPd1-M3S, siAPd2-M3S, siAPe1-M1S, siAPe2-M1S, siAPe1-M2S, siAPe2-M2S, siAPe1-M3S, 및 siAPe2-M3S이다.
Figure pct00046

Figure pct00047

Figure pct00048

Figure pct00049

Figure pct00050
.
일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥내 5'-말단에서 뉴클레오타이드는 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드이다.
대표적인 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드는 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00051

화학식 (2)
다른 예로서, 문헌: Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48은 다음의 4개의 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드를 개시하고 있다:
Figure pct00052

여기서 R은 H, OH, 메톡시, 및 F로부터 선택되고;
"염기"는 A, U, C, G, 또는 T로부터 선택된 염기를 나타낸다.
일부 구현예에서, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드는 화학식 (2)로 나타낸 바와 같은 5'-포스페이트 변형을 지닌 뉴클레오타이드이고; 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (3)으로 나타낸 바와 같은 비닐포스포네이트 변형을 지닌 뉴클레오타이드, 또는 화학식 (5)로 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 siAPa1-M1P1, siAPa2-M1P1, siAPa1-M2P1, siAPa2-M2P1, siAPa1-M3P1, siAPa2-M3P1, siAPa1-M1SP1, siAPa2-M1SP1, siAPa1-M2SP1, siAPa2-M2SP1, siAPa1-M3SP1, siAPa2-M3SP1, siAPa1U-M1P1, siAPa2U-M1P1, siAPa1U-M2P1, siAPa2U-M2P1, siAPa1U-M3P1, siAPa2U-M3P1, siAPa1U-M1SP1, siAPa2U-M1SP1, siAPa1U-M2SP1, siAPa2U-M2SP1, siAPa1U-M3SP1, siAPa2U-M3SP1, siAPb1-M1P1, siAPb2-M1P1, siAPb1-M2P1, siAPb2-M2P1, siAPb1-M3P1, siAPb2-M3P1, siAPb1-M1SP1, siAPb2-M1SP1, siAPb1-M2SP1, siAPb2-M2SP1, siAPb1-M3SP1, siAPb2-M3SP1, siAPb1U-M1P1, siAPb2U-M1P1, siAPb1U-M2P1, siAPb2U-M2P1, siAPb1U-M3P1, siAPb2U-M3P1, siAPb1U-M1SP1, siAPb2U-M1SP1, siAPb1U-M2SP1, siAPb2U-M2SP1, siAPb1U-M3SP1, siAPb2U-M3SP1, siAPc1-M1P1, siAPc2-M1P1, siAPc1-M2P1, siAPc2-M2P1, siAPc1-M3P1, siAPc2-M3P1, siAPc1-M1SP1, siAPc2-M1SP1, siAPc1-M2SP1, siAPc2-M2SP1, siAPc1-M3SP1, siAPc2-M3SP1, siAPd1-M1P1, siAPd2-M1P1, siAPd1-M2P1, siAPd2-M2P1, siAPd1-M3P1, siAPd2-M3P1, siAPd1-M1SP1, siAPd2-M1SP1, siAPd1-M2SP1, siAPd2-M2SP1, siAPd1-M3SP1, siAPd2-M3SP1, siAPd1U-M1P1, siAPd2U-M1P1, siAPd1U-M2P1, siAPd2U-M2P1, siAPd1U-M3P1, siAPd2U-M3P1, siAPd1U-M1SP1, siAPd2U-M1SP1, siAPd1U-M2SP1, siAPd2U-M2SP1, siAPd1U-M3SP1, siAPd2U-M3SP1, siAPe1-M1P1, siAPe2-M1P1, siAPe1-M2P1, siAPe2-M2P1, siAPe1-M3P1, siAPe2-M3P1, siAPe1-M1SP1, siAPe2-M1SP1, siAPe1-M2SP1, siAPe2-M2SP1, siAPe1-M3SP1, siAPe2-M3SP1, siAPe1U-M1P1, siAPe2U-M1P1, siAPe1U-M2P1, siAPe2U-M2P1, siAPe1U-M3P1, siAPe2U-M3P1, siAPe1U-M1SP1, siAPe2U-M1SP1, siAPe1U-M2SP1, siAPe2U-M2SP1, siAPe1U-M3SP1, 및 siAPe2U-M3SP1 중 어느 하나이다.
Figure pct00053

Figure pct00054

Figure pct00055

Figure pct00056

Figure pct00057

Figure pct00058

Figure pct00059

Figure pct00060

Figure pct00061

Figure pct00062

Figure pct00063

Figure pct00064

Figure pct00065

Figure pct00066

Figure pct00067
.
일부 구현예에서, siRNA는 표 7에 나타낸 바와 같은, siAPa1UM3SVP, siAPe1UM3SVP, siAPb1UM3SVP, siAPd1UM3SVP, siAPc1M3SVP, siAPd1UM3SP, siAPd1UM3SPs, siAPa1M3SP, siAPe1M3SP, siAPb1M3SP, 및 siAPc1M3SP 중 어느 하나일 수 있다.
본 개시내용의 상기 siRNA에서, C, G, U, 및 A는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 M의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; s는 문자 S의 측면 둘 다에 인접한 2개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결됨을 나타내고; P1은 P1의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드임을 나타낸다. 일부 구현예에서, P1은 구체적으로 변형된 뉴클레오타이드 VP, Ps 또는 P를 나타내고, 여기서 VP는 VP의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 비닐 포스페이트(5'-(E)-비닐포스페이트, E-VP) 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; Ps는 Ps의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; P는 문자 P의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도 본 개시내용의 siRNA가 유의적으로 향상된 혈장 및 라이소좀 안전성을 가지지만, 유전자-억제 활성을 유지함을 밝혀내었다.
본 개시내용의 siRNA는 당해 분야에서 siRNA를 제조하는 통상의 방법, 예컨대, 고체상 합성 방법 및 액체상 합성 방법에 의해 수득될 수 있다. 통상의 일반화된 서비스가 고체상 합성의 경우 이미 이용가능하다. 변형된 뉴클레오타이드 그룹은 상응하는 변형을 가진 뉴클레오타이드 단량체를 사용함으로써 본 개시내용의 siRNA내로 도입시킬 수 있다. 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오타이드 단량체를 제조하는 방법 및 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 siRNA 내로 도입하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 또한 잘 공지되어 있다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 활성 성분으로서 상기 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 siRNA 투여 분야에서 통상의 담체일 수 있고, 예를 들면, 하나 이상의 자기 나노입자(예를 들면, Fe3O4 및 Fe2O3-계 나노입자), 탄소 나노튜브, 메소다공성(mesoporous) 규소, 인산칼슘 나노입자, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머(dendrimer), 폴리(L-라이신)(PLL), 키토산, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 폴리(D&L-락트/글리콜산) 공중합체(PLGA), 폴리(2-아미노에틸 에틸렌 포스페이트)(PPEEA), 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트)(PDMAEMA), 및 이의 유도체이나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 속에, siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체의 함량에 대한 특별한 요건은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, siRNA 대 약제학적으로 허용되는 담체의 중량비는 1:(1 내지 500)이고, 일부 구현예에서, 중량비는 1:(1 내지 50)이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 또한 다른 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 이는 당해 분야에서 다양한 통상의 제형 또는 화합물 중 하나일 수 있다. 예를 들면, 상기 다른 약제학적으로 허용되는 부형제는 pH 완충제, 보호제 및 삼투압 조절제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
pH 완충제는 7.5 내지 8.5의 pH를 지닌 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드 완충제 용액, 및/또는 5.5 내지 8.5의 pH를 지닌 포스페이트 완충제 용액, 예를 들면, 5.5 내지 8.5의 pH를 지닌 포스페이트 완충제 용액이다.
보호제는 이노시톨, 소르비톨, 슈크로즈, 트레할로즈, 만노즈, 말토즈, 락토드, 및 글루코즈 중 적어도 하나일 수 있다. 보호제의 함량은 약제학적 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 30 중량%일 수 있다.
삼투압 조절제는 염화나트륨 및/또는 염화칼륨일 수 있다. 삼투압 조절제의 함량은 약제학적 조성물의 삼투압이 200 내지 700 milliosmol/kg이 되도록 한다. 목적한 삼투압에 따라서, 당해 분야의 기술자는 삼투압 조절제의 함량을 용이하게 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체 제형, 예를 들면, 주사 용액; 또는 액체 부형제와 혼합되어 투여시 액체 제형을 형성할 주사용 동결건조된 분말일 수 있다. 액체 제형은 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 또한 분부에 의해 폐로 또는 분무에 의해 폐를 통해 다른 기관(예를 들면, 간)으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 리포좀 제형의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포좀 제형에 사용된 약제학적으로 허용되는 담체는 아민-함유 형질감염 화합물(이후, 또한 유기 아민으로 지칭됨), 헬퍼 지질 및/또는 페길화된(PEGylated) 지질을 포함한다. 여기서, 유기 아민, 헬퍼 지질 및 페길화된 지질은 각각 아민-함유 형질감염 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 유도체, 헬퍼 지질 및 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제CN103380113A호에 기술된 페길화된 지질 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 제CN103380113A호에 기술된 바와 같은 화학식 (201)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다:
Figure pct00068

여기서,
X101 및 X102는 서로 독립적으로 O, S, N-A 및 C-A로부터 선택되고, 여기서 A는 수소 또는 C1-C20 탄화수소 쇄이고;
Y101 및 Z101은 서로 독립적으로 C=O, C=S, S=O, CH-OH 및 SO2로부터 선택되고;
R101, R102, R103, R104, R105, R106 및 R107은 서로 독립적으로 수소; 사이클릭 또는 아사이클릭의, 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄 지방족 그룹; 사이클릭 또는 아사이클릭의, 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄 헤테로지방족 그룹; 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄 아실 그룹; 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄 아릴 그룹; 및 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄 헤테로아릴 그룹으로부터 선택되고;
x는 1 내지 10의 정수이고;
n은 1 내지 3의 정수이고, m은 0 내지 20의 정수이고, p는 0 또는 1이고, 여기서 m=p=0이면, R102는 수소이고;
n 및 m 중 적어도 하나가 2이면, 화학식 (201)내 R103 및 질소는 화학식 (202) 또는 (203)로 나타낸 바와 같은 구조를 형성하고:
Figure pct00069

여기서 g, e 및 f는 서로 독립적으로 1 내지 6의 정수이고; "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각각의 *N은 화학식 (201)에 나타낸 질소 원자를 나타낸다.
일부 구현예에서, R103은 폴리아민이다. 다른 구현예에서, R103은 케탈이다. 일부 구현예에서, 화학식(201)에서 R101 및 R102는 서로 독립적으로 임의의 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄 알킬 또는 알케닐이고, 여기서 알킬 또는 알케닐은 3 내지 20개의 탄소 원자(예를 들면, 8 내지 18개의 탄소 원자) 및 0 내지 4개의 이중 결합(예를 들면, 0 내지 2개의 이중 결합)을 갖는다.
일부 구현예에서, n 및 m이 서로 독립적으로 1 또는 3인 경우, R103은 하기 화학식 (204) 내지 (213) 중의 어느 것이다:
Figure pct00070

여기서, (204) 내지 (213)에서, g, e 및 f는 서로 독립적으로 1 내지 6의 정수이고, 각각의 "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각각의 *는 화학식 (201)내 질소에 대한 R103의 잠재적인 부착 점을 나타내고, 여기서 임의의 * 위치에서 각각의 H는 대체되어 화학식 (201)내 질소 원자에 대한 부착을 달성할 수 있다.
화학식 (201)로 나타낸 화합물은 제CN103380113A호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 화학식 (214)에 나타낸 바와 같은 유기 아민 및/또는 화학식 (215)에 나타낸 바와 같은 유기 아민이다:
Figure pct00071

헬퍼 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및/또는 콜레스테롤 유도체이다.
페길화된 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)]-2000이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 중 유기 아민, 헬퍼 지질, 및 페길화된 지질 중 몰 비는 (19.7-80): (19.7-80): (0.3-50)이고, 예를 들면, 몰 비는 (50-70): (20-40): (3-20)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA에 의해 형성된 약제학적 조성물 입자 및 상기 아민-함유 형질감염 시약은 평균 직경이 약 30 nm 내지 약 200 nm, 전형적으로 약 40 nm 내지 약 135 nm이고, 보다 전형적으로, 리포좀 입자의 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 120 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm이고; 예를 들면, 리포좀 입자의 평균 직경은 약 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 160 nm이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 상기 아민-함유 형질감염 시약에 의해 형성된 약제학적 조성물에서, siRNA 대 총 지질, 예컨대, 유기 아민, 헬퍼 지질 및/또는 페길화된 지질의 중량비(중량/중량비)는 약 1:1 내지 약 1:50, 약 1:1 내지 약 1:30, 약 1:3 내지 약 1:20, 약 1:4 내지 약 1:18, 약 1:5 내지 약 1:17, 약 1:5 내지 약 1:15, 약 1:5 내지 약 1:12, 약 1:6 내지 약 1:12, 또는 약 1:6 내지 약 1:10의 범위이다. 예를 들면, 본 개시내용의 siRNA 대 총 지질의 중량 비는 약 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 또는 1:18이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 시판될 수 있고 각각의 구성성분은 별도이며, 액체 제형의 형태로 사용된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 상기 약제학적으로 허용되는 담체에 의해 형성된 약제학적 조성물은 기존의 sIRNA를 본 개시내용의 siRNA로 대체하는 것을 제외하고는, 다양한 공지된 공정으로 제조할 수 있다. 일부 구체적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음의 과정에 따라 제조할 수 있다:
유기 아민, 헬퍼 지질 및 페길화된 지질을 알코올 속에 상술한 몰 비로 현탁시키고 균질하게 혼합하여 액체 용액을 수득하고; 알코올은 수득되는 액체 용액이 2 내지 25 mg/mL(예컨대, 8 내지 18 mg/mL)의 총 질량 논도에서 존재하도록 하는 양으로 사용된다. 알코올은 약제학적으로 허용되는 알코올, 예를 들면, 약 실온에서 액체인 알코올, 예를 들면, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 벤질 알코올, 글리세롤, PEG 200, PEG 300, 및 PEG 400 중 하나 이상, 예를 들면, 에탄올이다.
본 개시내용의 siRNA를 완충된 염 용액 속에 용해시켜 siRNA를 생산한다. 완충된 염 용액은 0.05 내지 0.5 M, 예를 들면, 0.1 내지 0.2 M의 농도를 갖는다. 완충된 염 용액의 pH는 4.0 내지 5.5, 예를 들면, 5.0 내지 5.2로 조절한다. 완충된 염 용액은 siRNA가 0.6 mg/ml 미만, 예를 들면, 0.2 내지 0.4 mg/mL의 농도로 존재하는 양으로 사용된다. 완충된 염은 가용성 아세테이트 및 가용성 시트레이트, 예를 들면, 아세트산나트륨 및/또는 아세트산칼륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
siRNA의 지질 용액 및 수용액을 혼합시킨다. 혼합에 의해 수득된 생성물을 40 내지 60℃의 온도에서 적어도 2분(예컨대, 5 내지 30분) 동안 항온처리하여 항온처리된 지질 제형을 생산한다. 지질 용액 대 siRNA의 수용액의 용적 비는 1:(2-5)이다.
항온처리된 지질 제형을 농축시키거나 희석시키고, 정제하여 불순물을 제거한 다음 멸균시켜 본 개시내용의 약제학적 조성물을 수득하며, 이는 다음의 물리화학적 매개변수를 갖는다: 6.5 내지 8의 pH, 80% 이상의 캡슐화 퍼센트, 40 내지 200 nm의 입자 크기, 0.30 미만의 다분산도 지수(polydispersity index), 및 250 내지 400 mOsm/kg의 삼투압. 예를 들면, 물리화학적 매개변수는 다음과 같을 수 있다: 7.2 내지 7.6의 pH, 90% 이상의 캡슐화 퍼센트, 60 내지 100 nm의 입자 크기, 0.20 미만의 다분산도 지수, 및 300 내지 400 mOsm/kg의 삼투압.
여기서, 농축 및 희석 단계를 불순물의 제거 전, 후 또는 이와 동시에 수행할 수 있다. 불순물을 제거하는 방법은 다양한 기존의 방법, 예를 들면, 100 kDa 중공 섬유 컬럼(hollow fiber column) 및 접선 유동 시스템을 사용한 한외여과 교환 용액으로서 pH 7.4의 PBS를 사용한 한외여과일 수 있다. 멸균 방법은 다양한 기존의 방법 중 어느 것, 예를 들면, 0.22 μm 필터 상에서의 여과 멸균화일 수 있다.
siRNA 접합체
본 개시내용은 상기 siRNA 및, siRNA에 접합적으로 연결된 접합 그룹을 포함하는 siRNA 접합체를 제공한다.
일반적으로 말해서, 접합 그룹은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹 및 임의의 링커를 제공한다. 더욱이, siRNA, 링커 및 표적화 그룹은 순차적으로 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 표적화의 수는 1 내지 6이다. 일부 구현예에서, 표적 그룹의 수는 2 내지 4이다. siRNA 분자는 접합 그룹에 비-공유결합으로 또는 공유결합으로 접합될 수 있으며, 예를 들면, siRNA 분자는 접합 그룹에 공유결합으로 접합될 수 있다. siRNA와 접합 그룹 사이의 접합은 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단, 또는 siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단일 수 있으며, siRNA의 내부 서열 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA와 접합 그룹 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 센스 가닥의 3' 말단이다.
일부 구현예에서, 접합 그룹은 뉴클레오타이드의 포스페이트 그룹, 2'-하이드록시 또는 염기에 연결될 수 있다. 접합 그룹은 또한 2'-5'-포스포디에스테르 결합을 통해 연결될 수 있다. 접합 그룹이 siRNA의 말단에 연결되면, 접합 그룹은 전형적으로 뉴클레오타이드의 포스페이트 그룹에 연결되고; 접합 그룹이 siRNA의 내부 서열에 연결되면, 접합 그룹은 전형적으로 리보스 환 또는 염기에 연결된다. 다양한 연결 방식을 위해, 다음을 참고할 수 있다: Muthiah Manoharan et.al. siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes. ACS Chemical biology, 2015, 10(5): 1181-7.
일부 구현예에서, siRNA 및 접합 그룹은 산-분해가능하거나 환원성 화학 결합에 의해 연결될 수 있고, 이러한 화학 결합은 세포 엔도솜의 산성 환경 하에 분해됨으로써 siRNA를 유리 상태로 되도록 할 수 있다. 비-분해가능한 접합 방식의 경우, 접합 그룹은 siRNA의 센스 가닥에 연결됨으로써, siRNA의 활성에서 접합의 효과를 최소화시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 siRNA 투여 분야에서 통상의 리간드, 예를 들면, 본원에 이의 전문이 참고로 포함된 제WO2009082607A2호에 기술된 바와 같은 다양한 리간드일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 다음의 표적화 분자 또는 이의 유도체에 의해 형성된 리간드로부터 선택된 하나 이상일 수 있다: 친지성 분자, 예를 들면, 콜레스테롤, 담즙산, 비타민(예를 들면, 비타민 E), 상이한 쇄 길이를 지닌 지질 분자; 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜; 폴리펩타이드, 예를 들면, 세포-침투 펩타이드; 아프타머(aptamer); 항체; 퀀텀 도트(quantum dot); 사카라이드, 예를 들면, 락토즈, 폴리락토즈, 만노즈, 갈락토즈, N-아세틸갈락토즈(GalNAc); 폴레이트; 또는 간 실질조직 세포내에서 발현된 수용체 리간드, 예를 들면, 아시알로당단백질, 아시알로-당 잔기, 지단백질(예를 들면, 고 밀도 지단백질, 저 밀도 지단백질 등), 글루카곤, 신경전달물질(예를 들면, 아드레날린), 성장 인자, 트랜스페린 등.
일부 구현예에서, 각각의 리간드는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 포유동물 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 사람 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합할 수 있는 리간드이다. 이러한 리간드의 유형은 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있고 이들은 전형적으로 표적 세포의 표면에서 특이적인 수용체에 결합하는 기능을 제공함으로써 리간드에 연결된 siRNA의 표적 세포로의 전달을 매개한다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체에 결합하는 임의의 리간드일 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 독립적으로 아시알로당단백질, 예를 들면, 아시알로오로소무코이드(ASOR) 또는 아시알로페투인(ASF)이다. 일부 구현예에서, 리간드는 사카린 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 모노사카라이드, 폴리사카라이드, 변형된 모노사카라이드, 변형된 폴리사카라이드, 또는 사카라이드 유도체이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 트리사카라이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 변형된 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 변형된 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 폴리사카라이드, 변형된 폴리사카라이드, 모노사카라이드, 변형된 모노사카라이드, 폴리사카라이드 유도체, 및 모노사카라이드 유도체로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드 또는 적어도 하나의 리간드는 글루코즈 및 이의 유도체, 만노즈 및 이의 유도체, 갈락토즈 및 이의 유도체, 크실로즈 및 이의 유도체, 리보스 및 이의 유도체, 푸코즈 및 이의 유도체, 락토즈 및 이의 유도체, 말토즈 및 이의 유도체, 아라비노즈 및 이의 유도체, 프럭토즈 및 이의 유도체, 및 시알산으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 리간드는 D-만노피라노즈, L-만노피라노즈, D-아라비노즈, D-크실로푸라노즈, L-크실로푸라노즈, D-글루코즈, L-글루코즈, D-갈락토즈, L-갈락토즈, α-D-만노푸라노즈, β-D-만노푸라노즈, α-D-만노피라노즈, β-D-만노피라노즈, α-D-글루코피라노즈, β-D-글루코피라노즈, α-D-글루코푸라노즈, β-D-글루코푸라노즈, α-D-프럭토푸라노즈, α-D-프럭토피라노즈, α-D-갈락토피라노즈, β-D-갈락토피라노즈, α-D-갈락토푸라노즈, β-D-갈락토푸라노즈, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오로아세틸갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노즈, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노즈, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노즈, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노즈, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노즈, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노즈, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스, L-4-티오리보스로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 리간드의 다른 선택사항은 예를 들면, 제CN105378082A호의 개시내용으로부터 찾을 수 있으며, 이는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체 내 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 갈락토즈 또는 N-아세토갈락토사민일 수 있고, 여기서 갈락토즈 또는 N-아세틸갈락토사민은 1가-, 2가-, 3가-, 또는 4가일 수 있다. 본원에 기술된 용어 1가-, 2가-, 3가-, 또는 4가-는 각각 siRNA 접합체내 siRNA 분자 대 갈락토즈 또는 N-아세틸갈락토사민 분자의 몰 비가 1:1, 1:2, 1:3 또는 1:4임을 의미하고, 여기서 siRNA 접합체는 표적화 그룹으로서 갈락토즈 또는 N-아세틸갈락토사민 분자를 함유하는 접합 그룹 및 siRNA 분자로부터 형성된다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 N-아세틸갈락토사민이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드는 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 접합 그룹에 접합되고, N-아세틸갈락토사민 분자는 3가 또는 4가이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA가 N-아세틸갈락토사민을 함유하는 접합 그룹에 접합된 경우, N-아세틸갈락토사민 분자는 3가이다.
표적화 그룹은 적절한 링커를 통해 siRNA 분자에 연결될 수 있고, 적절한 링커는 표적화 그룹의 구체적인 유형에 따라 당해 분야의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 링커 및 표적화 그룹의 유형 및 siRNA와의 연결 방식은 제WO2015006740A2호의 개시내용에서 찾을 수 있으며, 이는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹이 N-아세틸갈락토사민인 경우, 적합한 링커는 다음의 화학식 (301)로 나타낸 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00072

여기서,
k는 1 내지 3의 정수이고;
LA는 화학식 (302)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 아미드 결합-포함 쇄 모이어티이고, 각각의 LA의 2개의 말단은 표적화 그룹 및 LC 모이어티에 에테를 결합을 통해 각각 연결된다.
Figure pct00073

LB는 화학식 (303)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 N-아실피롤리딘-포함 쇄 모이어티이고, 여기서 쇄 모이어티는 하나의 말단에 카보닐 그룹을 가지고 아미드 결합을 통해 LC 모이어티에 연결되며, 다른 말단에서 옥시 그룹을 가지고 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결된다:
Figure pct00074

LC는 하이드록시메틸 아미노메탄, 디하이드록시메틸 아미노메탄 또는 트리하이드록시메틸 아미노메탄을 기반으로 한 2가 내지 4가 연결 그룹이고, LC는 산소 원자를 경유하여 에테르 결합을 통해 LA 모이어티에 연결되고, 질소 원자를 경유하여 아미드 결합을 통해 LB 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에서, n이 3이고 LC가 트리하이드록시메틸 아미노메탄을 기반으로 한 3가 연결 그룹인 경우, N-아세틸갈락토사민 분자와 siRNA 분자를 링커로서 -(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB0를 통해 연결시켜 형성시킨 siRNA는 화학식 (304)로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00075

여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
유사하게, siRNA와 접합 그룹 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단 또는 5'-말단, 또는 안티센스 가닥의 5'-말단, 또는 siRNA의 내부 서열 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단은 링커 -(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB-를 통해 3개의 N-아세틸갈락토사민 분자에 공유결합으로 접합되어 siRNA 접합체를 제공할 수 있으며 여기서 siRNA 분자 대 GaINAc 분자의 몰 비는 1:3(이후에 또한 (GaINAc)3-siRNA로서 지칭됨)이고, 이러한 접합체는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00076

여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹이 N-아세틸갈락토사민인 경우, 적합한 링커는 화학식 (306)으로 나타낸 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00077

여기서,
l은 0 내지 3의 정수이고;
*는 에테르 결합을 통해 표적화 그룹에 연결된 링커 상의 부위를 나타내고;
#는 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결된 링커 상의 부위를 나타낸다.
일부 구체적인 구현예에서, l이 2인 경우, siRNA 접합체는 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00078

여기서, 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다.
상기 접합체는 선행 기술에 상세히 기술된 방법에 따라 합성할 수 있다. 예를 들면, 제WO2015006740 A2호는 다양한 접합체의 제조 방법을 상세히 기술하고 있다. 본 개시내용의 siRNA 접합체는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 제WO2014025805A1호는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 접합체의 제조 방법을 기술하고 있다. 문헌: Rajeev et al., ChemBioChem 2015, 16, 903-908은 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 접합체의 제조 방법을 기술하고 있다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체는 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00079

여기서,
n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이고;
m1, m2, 및 m3은 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 서로 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
R3은 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹이다:
Figure pct00080

여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고; Nu는 본 개시내용의 siRNA이고;
R2는 길이가 1 내지 20개의 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10-알케닐렌, C2-C10-알키닐렌, C6-C10-아릴렌, C3-C18-헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10-헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 그룹으로 임의 대체되고, 여기서 R2는 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬페닐), -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
각각의 L1은 길이가 1 내지 70개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 그룹으로 임의 대체되고, 여기서 L1은 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬페닐), -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 갖는다.
일부 구현예에서, L1은 화학식 (A1) 내지 (A26)의 그룹 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서 A1 내지 A26의 구조 및 정의는 다음과 같다:
Figure pct00081

여기서 j1은 1 내지 20의 정수이고;
j2는 1 내지 20의 정수이고;
R'는 C1-C10 알킬이고;
Ra는 화학식 (A27) 내지 (A45)의 그룹 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
Figure pct00082

Figure pct00083

Rb는 C1-C10 알킬이고;
Figure pct00084
는 그룹이 분자의 나머지에 연결된 부위를 나타낸다.
당해 분야의 기술자는 L1이 편의상 직쇄 알킬로 정의되어 있지만, 이것이 직쇄 그룹이 아닐 수 있거나 상이하게, 예를 들면, 상기 대체 및/또는 치환에 의해 생산된 아민 또는 알케닐로 명명될 수 있음을 이해할 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, L1의 길이는 2개의 부착점을 연결하는 쇄내 원자의 수이다. 이러한 목적을 위해, 직쇄 알킬렌, 예를 들면, 헤테로사이클릴렌 또는 헤테로아릴렌내 탄소 원자를 대체함으로써 수득된 환은 하나의 원자로 계수된다.
M1은 표적화 그룹을 나타내고, 이의 정의 및 선택사항은 상기 표적화 그룹의 것과 동일하다. 일부 구현예에서, 각각의 M1은 독립적으로 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는 리간드로부터 선택된 것이다.
M1이 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는 리간드인 경우, 일부 구현예에서, n1은 1 내지 3의 정수일 수 있고, n3은 0 내지 4의 정수이어서 접합체내 M1 표적화 그룹의 수가 적어도 2일 수 있도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, n1+n3 ≥ 2이면 M1 표적화 그룹의 수는 적어도 3이므로, M1 표적화 그룹이 간세포의 표면 상의 아시알로당단백질 수용체에 보다 용이하게 결합하도록 하며, 이는 세포내로 접합체의 세포내이입을 촉진할 수 있다. 실험은 M1 리간드의 수가 3 초과인 경우, M1 리간드와 간세포의 표면 상의 아시알로당단백질 수용체 사이의 결합 용이성이 유의적으로 증가하지 않음을 나타내었다. 따라서, 다양한 양태, 예를 들면, 합성 편이성, 구조/공정 비용 및 전달 효능의 측면에서, 일부 구현예에서, n1은 1-2의 정수이고, n3은 0-1의 정수이고, n1+n3은 2-3이다.
일부 구현예에서, m1, m2, 및 m3이 서로 독립적으로 2 내지 10으로부터 선택된 정수인 경우, 많은 M1 리간드 사이에서 입체적 위치는 M1 리간드와 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체 사이의 결합에 적합할 수 있다. 본 개시내용의 접합체가 보다 단순한 구조, 보다 용이한 합성 및/또는 감소된 비용을 가지도록 하기 위하여, 일부 구현예에서, m1, m2 및 m3은 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고; 일부 구현예에서, m1 = m2 = m3이다.
당해 분야의 기술자는 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 서로 독립적으로 H, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로부터 선택된 것인 경우, 이는 본 개시내용의 접합체의 특성을 변화시키지 않을 수 있고 본 개시내용의 목적을 모두 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 서로 독립적으로 H, 메틸 및 에틸로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 H이다.
R3은 화학식 A59로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹이고, 여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고 출발 물질의 용이한 이용가능성을 고려할 때, 일부 구현예에서, E1은 OH 또는 SH이다.
R2는 화학식 A59로 나타낸 바와 같은 그룹과 질소성 골격(nitrogenous backbone) 상의 N 원자 사이의 연결을 달성하기 위해 선택된다. 본 개시내용의 맥락에서, "질소성 골격"은 N 원자가, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 부착된 탄소 원자에 공동으로 인접하게(coadjacently) 연결된 쇄 구조를 지칭한다. 따라서, R2는 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같이 그룹을 질소성 골격 상의 N 원자에 적합한 수단으로 연결시킬 수 있는 임의의 연결 그룹일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체가 고체 상 합성 공정으로 제조되는 경우에, R2 그룹은 질소 골격 상의 N 원자에 연결시키는 부위 및 R3내 P 원자에 연결시키는 부위 둘 다를 가질 필요가 있다. 일부 구현예에서, R2에서, 질소성 골격 상의 N 원자에 연결시키는 부위는 N 원자와 아미드 결합을 형성하고, R3내 P 원자에 연결시키는 부위는 P 원자와 함께 포스포에스테르 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, R2는 B5, B6, B5', 또는 B6'일 수 있다:
Figure pct00085

여기서
Figure pct00086
는 그룹이 공유 결합을 통해 연결된 부위를 나타내고;
q2는 1 내지 10의 정수이고; 일부 구현예에서, q2는 1 내지 5의 정수이다.
L1은 화학식 (308)로 나타낸 바와 같이 M1 표적화 그룹을 질소 골격 상의 N 원자에 연결시키는데 사용됨으로써 siRNA 접합체에 대한 간 표적화 기능을 제공한다. 일부 구현예에서, L1은 (A1) 내지 (A26) 중 하나 이상의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 (A1), (A4), (A5), (A6), (A8), (A10), (A11), 및 (A13) 중 하나 이상의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 (A1), (A4), (A8), (A10), 및 (A11) 중 2개 이상의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 (A1), (A8) 및 (A10) 중 2개 이상의 연결 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, L1은 3 내지 25, 3 내지 20, 4 내지 15 또는 5 내지 12개의 원자의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, L1은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60개 원자의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, j1은 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서, j1은 3 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서, j2는 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서, j2는 3 내지 5의 정수이다. R'는 C1-C4 알킬이고, 일부 구현예에서, R'는 메틸, 에틸 및 이소프로필 중 하나이다. Ra는 화학식 (A27), (A28), (A29), (A30), 및 (A31) 중 하나이고, 일부 구현예에서, Ra는 화학식 (A27) 또는 (A28)이다. Rb는 C1-C5 알킬이고, 일부 구현예에서, 메틸, 에틸, 이소프로필, 및 부틸 중 하나이다. 일부 구현예에서, 화학식 (A1) 내지 (A26) 내 j1, j2, R’, Ra, 및 Rb는 각각 M1 표적화 그룹과 질소성 골격 상의 N 원자 사이의 연결을 달성하고, M1 표적화 그룹 사이의 입체적 위치를 M1 표적화 그룹과 간세포의 표면 상의 아시알로당단백질 수용체 사이의 결합에 보다 적합하도록 하기 위해 선택된다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체는 화학식 (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) 또는 (422)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00087

Figure pct00088

Figure pct00089

Figure pct00090

Figure pct00091

Figure pct00092

Figure pct00093

일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA 서열내 임의의 가능한 위치에 연결될 수 있다. 예를 들면, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥내 임의의 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥내 임의의 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 영역에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 말단 영역에 연결된다. 상기 말단 영역은 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단으로부터 계수된 처음 4개의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다. 화학식 A59내 P 원자가 siRNA의 센스 가닥의 상기 위치에 연겨로디는 경우, 세포내로 도입된 후, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 풀리는(unwinding) 동안 siRNA의 별도의 안티센스 가닥을 방출함으로써, APOC3 mRNA의 단백질로의 해독을 차단하고 아포지질단백질 C3 유전자의 발현을 억제한다.
일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA내 뉴클레오타이드의 임의의 가능한 위치, 예를 들면, 뉴클레오타이드의 5' 위치, 2' 위치, 3' 위치, 또는 염기에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA내 뉴클레오타이드의 2', 3', 또는 5' 위치에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA내 센스 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오타이드의 3'-하이드록시의 탈수소화에 의해 형성된 산소 원자에 연결되거나(이러한 경우에, 화학식 A59내 P 원자는 또한 siRNA의 포스페이트 그룹내 P원자로서 고려될 수 있다), 또는 화학식 A59내 P 원자는 siRNA내 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 2'-하이드록시내 수소 원자를 치환함으로써 뉴클레오타이드에 연결되거나, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA내 센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드의 5'-하이드록시내 수소 원자를 치환함으로써 뉴클레오타이드에 연결된다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도 본 개시내용의 siRNA 접합체가 APOC3 mRNA에 대해 유의적으로 감소된 사일런싱 활성없이 혈장내에서 유의적으로 개선된 안정성 및 낮은 오프-표적 효과를 나타내고, 또한 혈액 지질에서 보다 높은 억제 효과를 나타냄을 발견하였다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체내 siRNA는 표 1, 2, 3, 4, 및 5에 나타낸다:
[표 1]
Figure pct00094

Figure pct00095

Figure pct00096

Figure pct00097

[표 2]
Figure pct00098

Figure pct00099

Figure pct00100

Figure pct00101

[표 3]
Figure pct00102

Figure pct00103

Figure pct00104

[표 4]
Figure pct00105

Figure pct00106

Figure pct00107

Figure pct00108

[표 5]
Figure pct00109

Figure pct00110

Figure pct00111

Figure pct00112

본 개시내용의 siRNA 또는 siRNA 접합체에서, 인접한 뉴클레오타이드의 각각의 쌍은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 통해 연결된다. 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합내 비-브릿징 산소 또는 황 원자는 음으로 하전되고, 하이드록시 또는 설프하이드릴의 형태로 존재할 수 있다. 더욱이, 하이드록시 또는 설프하이드릴내 수소 이온은 양이온으로 부분적으로 또는 완전히 치환될 수 있다. 양이온은 임의의 양이온, 예를 들면, 임의의 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4 + 또는 유기 암모늄 양이온일 수 있다. 용해도를 증가시키기 위하여, 일 구현예에서, 양이온은 알칼리 금속 양이온, 3급 아민 및 4급 암모늄 양이온에 의해 형성된 암모늄 양이온으로부터 선택된 하나 이상이다. 알칼리 금속 이온은 K+ 및/또는 Na+일 수 있고 3급 아민에 의해 형성된 양이온은 트리에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온일 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 siRNA 및 siRNA 접합체는 적어도 부분적으로 염의 형태로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합 속의 비-브릿징 산소 원자 또는 황 원자는 적어도 부분적으로 나트륨 이온에 결합하므로, 본 개시내용의 siRNA 및 siRNA 접합체는 나트륨 염의 형태로 존재하거나 부분적으로 존재한다.
당해 분야의 기술자는 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 본 개시내용의 siRNA 내로 상응하는 변형을 지닌 뉴클레오시드 단량체에 의해 도입할 수 있음을 명확하고 알고 있다. 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오시드 단량체를 제조하는 방법 및 변형된 뉴클레오타이드를 siRNA 내로 도입하는 방법은 또한 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 모든 변형된 뉴클레오시드 단량체는 상업적으로 이용가능하거나 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체의 제조
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 임의의 적절한 합성 경로로 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 siRA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라서, 포스포르아미디트 고체상 합성을 위한 조건 하에서 순차적으로 연결시키는 단계(여기서 각각의 뉴클레오시드 단량체를 연결시키는 단계는 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4개 단계 반응을 포함한다); siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계; 및 어닐링(annealing)하는 단계를 포함하는, 다음의 방법으로 제조할 수 있고, 여기서 siRNA는 상기 본 개시내용의 siRNA이다.
더욱이, 방법은 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 고체상 지지체에 부착된 뉴클레오시드 단량체 또는 뉴클레오타이드 서열과 커플링 반응 조건 하에 및 커플링제의 존재하에서 접촉시킴으로써, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 커플링 반응을 통해 뉴클레오타이드 서열에 연결시키는 단계를 추가로 포함한다. 이후에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 또한 접합 분자로 지칭된다.
Figure pct00113

여기서,
R4는 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 화합물내 Nu로 나타낸 siRNA에 결합할 수 있는 그룹이다. 일부 구현예에서, R4는 Nu로 나타낸 siRNA에 이중 결합을 통해 결합할 수 있는 그룹이다. 일부 구현예에서, R4는 반응에 의한 포스포디에스테를 결합을 통해 Nu로 나타낸 siRNA에 접합될 수 있는 임의의 작용 그룹을 포함하는 그룹이다.
각각의 S1은 독립적으로 M1내 모든 활성 하이드록실을 그룹 YCOO-로 치환시켜 형성시킨 그룹이고, 여기서 각각의 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 알킬페닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고; 일부 구현예에서, Y는 메틸이다.
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, 및 M1의 정의 및 선택사항은 각각 상술한 바와 같다.
R4는 질소성 골격 상의 N 원자에 대한 연결을 달성하고 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 합성하기 위한 적합한 반응 부위를 제공하기 위해 선택된다. 일부 구현예에서, R4는 R2 연결 그룹 또는 보호된 R2 연결 그룹, 및 siRNA와 반응하여 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 형성할 수 있는 작용 그룹을 포함한다.
일부 구현예에서, R4는 Nu로 나타낸 siRNA 또는 뉴클레오시드 단량체 상의 그룹과 반응하여 포스파이트 에스테르를 형성할 수 있는 제1의 작용 그룹, 및 하이드록시 그룹 또는 아미노 그룹과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 제2의 작용 그룹을 포함하거나, 공유 결합에 의해 연결된 고체 상 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 포스포르아미디트, 하이드록시 또는 보호된 하이드록시이다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 포스포르아미디트, 카복실 또는 카복실레이트 염이다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 하이드록시 그룹 또는 아미노 그룹에 의해 형성된 공유 결합을 통해 분자의 나머지에 연결된 고체 상 지지체이다. 일부 구현예에서, 고체상 지지체는 포스포에스테르 결합, 카복실 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 고체 상 지지체는 수지이다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 하이드록시, -ORk 또는 화학식 (C3)으로 나타낸 바와 같은 그룹을 포함하고; 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1), (C2), (C3), (C1'), 또는 (C3')로 나타낸 바와 같은 그룹을 포함한다:
Figure pct00114

여기서 q1은 1 내지 4의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호 그룹이고, SPS는 고체상 지지체를 나타내고,
Figure pct00115
는 그룹이 분자의 나머지에 부착된 부위를 나타낸다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 포스포르아미디트 그룹, 예를 들면, 화학식 (C3)로 나타낸 바와 같은 그룹을 포함한다. 포스포르아미디트 그룹은 뉴클레오타이드 상의 임의의 위치에서의 하이드록시(예를 들면, 2'-하이드록시 또는 3'-하이드록시)와 커플링 반응에 의해 포스파이트 에스테르를 형성할 수 있고, 포스파이트 에스테르는 산화 또는 황화를 통해 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 에스테르를 형성함으로써 접합 분자를 siRNA에 접합시킬 수 있다. 여기서, 제2의 작용 그룹이 존재하지 않는 경우에도, 화학식 (321)로 나타낸 화합물은 여전히 뉴클레오타이드에 접합될 수 있는 반면, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득하는데 영향을 미치지 않는다. 이러한 조건 하에서, 포스포르아미디티 고체 상 합성과 같은 방법에 의해 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 수득한 후, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 뉴클레오타이드 서열의 말단에서 뉴클레오타이드 상의 하이드록시와 반응시키고, 포스포디에스테르 결합 연결 또는 포스포로티오에이트 결합 연결을 후속된 산화 또는 황화 공정에서 형성시킴으로써 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 siRNA에 접합시킨다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 보호된 하이드록시를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 고체 상 지지체와 반응하여 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 제공할 수 있는 그룹을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 카복실, 카복실레이트 염 또는 포스포르아미디트, 예를 들면, 화학식 (C1), (C2) 또는 (C3)로 나타낸 바와 같은 작용 그룹을 포함한다. 제2의 작용 그룹이 카복실 또는 카복실레이트 염을 포함하는 경우, 화학식 (321)의 화합물을 에스테르화 또는 아미드화 반응을 통해 고체 상 지지체(예를 들면, 수지) 상의 하이드록시 또는 아미노 그룹과 반응시켜 카복실레이트 에스테르 결합을 통해 연결된 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성할 수 있다. 제2의 작용 그룹이 포스포르아미디트 작용 그룹을 포함하는 경우, 화학식 (321)의 화합물을 공통의 고체상 지지체(예를 들면, 수지) 상의 하이드록시 그룹과 커플링시켜, 산화에 의한 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성시킬 수 있다. 다음에, 고체 상 지지체에 연결된 상기 생성물로부터 출발하여, 뉴클레오시드 단량체를 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법을 통해 연결시킴으로써, 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 수득할 수 있다. 포스포르아미디트 고체 상 합성의 공정에서, 제1의 작용 그룹을 탈보호된 후, 커플링 반응 조건 하에서 뉴클레오시드 단량체 상의 포스포르아미디트 그룹과 커플링된다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 하이드록시 또는 보호된 하이드록시 그룹을 포함하고; 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같이, 카복실레이트 에스테르 결합, 아미드 결합, 또는 포스포에스테르 결합을 통해 연결된 고체 상 지지체를 포함한다. 이러한 경우에, 고체 상 지지체 대신에 화학식 (321)로부터 출발하여, 뉴클레오시드 단량체를 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법을 통해 후속적으로 연결하여 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 수득할 수 있다.
일부 구현예에서, 카복실레이트는 -COO-M+로 나타낼 수 있으며, 여기서 M+는 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4+ 및 유기 암모늄 양이온으로부터 선택된 것과 같은 양이온이다. 일 구현예에서, 금속 양이온은 알칼리 금속 양이온, 예를 들면, K+ 또는 Na+일 수 있다. 용해도를 증가시키고 반응을 촉진시키기 위해, 일부 구현예에서, 유기 암모늄 양이온은 3급 아민 또는 4급 암모늄 양이온, 예를 들면, 트리에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온 또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온이다. 일부 구현예에서, 카복실레이트는 트리에틸아민 카복실레이트 또는 N,N-디이소프로필에틸아민 카복실레이트이다.
일부 구현예에서, R4는 화학식 (B9), (B10), (B9’), (B10’), (B11), (B12), (B11'), 또는 B(12')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다:
Figure pct00116

여기서 q1은 1 내지 4의 정수이고, q2는 1 내지 10의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호 그룹이고, SPS는 고체 상 지지체를 나타내고,
Figure pct00117
는 그룹이 분자의 나머지에 연결된 부위를 나타낸다. 일부 구현예에서, q1은 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, q2는 1 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서, R4는 화학식 (B9) 또는 (B10)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, R4는 화학식 (B11) 또는 (B12)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, Rk는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr (4,4'-디메톡시트리틸), 및 TMTr(4,4',4'-트리메톡시트리틸)이다. 일부 구현예에서, Rk는 DMTr, 즉, 4,4'-디메톡시트리틸일 수 있다.
L1의 정의는 상술한 바와 같다.
일부 구현예에서, L1은 질소성 골격 상의 N 원자에 M1 표적화 그룹을 연결시킴으로써 화학식 (308)로 나타낸 바와 같이 siRNA 접합체에 대한 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 (A1) 내지 (A26) 중 어느 하나, 및 이의 임의의 조합을 포함한다.
상기 설명에 따라서, 당해 분야의 기술자는 당해 분야에서 잘 공지된 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법과 비교하여, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은, 접합 분자가 뉴클레오타이드 서열의 임의의 가능한 위치에 연결된 siRNA 접합체를 상기 제1의 작용 그룹 및 임의의 제2의 작용 그룹을 사용하여 수득할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들면, 접합 분자를 뉴클레오타이드 서열의 말단 영역, 또는 뉴클레오타이드 서열의 말단에 연결시킨다. 상응하게, 달리 규정하지 않는 한, 접합체 및/또는 접합 분자의 제조에 관한 다음의 설명에서, 반응, 예를 들면, "탈보호", "커플링", "캡핑', "산화", "황화"를 지칭하는 경우, 당해 분야에서 잘 공지된 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 포함된 반응 조건 및 제제는 이러한 반응에 또한 적용될 수 있다. 예시적인 반응 조건 및 제제는 이후 상세히 기술될 것이다.
일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1이다. 일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1내 적어도 하나의 활성 하이드록실 그룹을 하이드록실 보호 그룹으로 보호함으로써 형성된 그룹이다. 일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1내 모든 존재하는 활성 하이드록실 그룹을 하이드록실 보호 그룹으로 보호함으로써 형성된 그룹이다. 일부 구현예에서, 기술자에게 공지된 임의의 하이드록실 보호 그룹을 사용하여 M1 내 활성 하이드록실 그룹을 호호할 수 있다. 일부 구현예에서, 보호된 하이드록실은 화학식 YCOO-로 나타내며, 여기서 각각의 Y는 C1-C10 알킬 및 C6-C10 아릴로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 이는 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의 치환된다. 일부 구현예에서, 각각의 Y는 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 C1-C6 알킬페닐로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 S1은 화학식 (A46) 내지 (A54)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00118

일부 구현예에서, S1은 A49 또는 A50이다.
일부 구현예에서, 각각의 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 알킬페닐로부터 선택된 것이다. 일부 구현예에서, Y는 메틸이다.
상술한 바와 같이, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체의 제조 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다: siRNA의 다른 쇄를 합성하는 단계(예를 들면, 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥이 상기 단계에서 합성되는 경우, 방법은 고체 상 합성 방법에 따라 siRNA의 안티센스 가닥을 합성하는 단계를 포함하거나, 이의 역을 포함한다), 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계, 및 어닐링 단계. 특히 단리 단계에서, 뉴클레오타이드 서열 및/또는 접합 분자에 연결된 고체 상 지지체가 절단되며, 필수적인 보호 그룹이 제거되어(이러한 경우에, 화학식 (321)의 화합물에서 각각의 S1 그룹은 상응하는 M1 표적화 그룹으로 전환된다), 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥(또는 안티센스 가닥) 및 상응하는 안티센스 가닥(또는 센스 가닥)이 제공된다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 어닐링하여 이중-가닥 RNA 구조를 형성함으로써, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제공한다.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오시드 단량체와 커플링제의 존재하에서 커플링 조건 하에 접촉시킴으로써, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 서열내 제1의 뉴클레오타이드에 연결시키는 단계; 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결시켜 포스포르아미디트 고체 상 합성에 대한 조건 하에서 목적한 센스 또는 안티센스 가닥으로 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 합성하여(여기서 화학식 (321)의 화합물은 R4가 제1의 작용 그룹 및 제2의 작용 그룹을 포함하는 화합물이고, 여기서 제1의 작용 그룹은 보호된 하이드록실을 포함하고 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같은 구조를 가지고, (321)의 화합물은 제1의 뉴클레오시드 단량체에 연결되기 전에 탈보호되고; 각각의 뉴클레오시드 단량체를 연결하는 것은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계 반응을 포함한다) 고체 상 지지체에 연결된 센스 가닥 및 고체 상 지지체에 연결된 안티센스 가닥을 수득하는 단계; 이에 의해 접합 그룹에 연결된 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥을 수득하는 단계; 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결하여 포스포르아미디티 고체 상 합성을 위한 조건 하에서 센스 또는 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라 핵산의 안티센스 또는 센스 가닥을 합성하는 단계(여기서 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계 반응을 포함한다); 보호 그룹을 제거하고 고체 상 지지체를 분해하는 단계; 핵산의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리 및 정제하는 단계; 및 어닐링하는 단계.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: 이중 가닥 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라서, 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결하여 안티센스 및 센스 가닥을 합성하여(여기서 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계 반응을 포함한다) 고체 상 지지체에 연결된 센스 가닥을 수득하는 단계; 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 고체 상 지지체에 연결된 센스 가닥 또는 고체 상 지지체에 연결된 안티센스 가닥과 커플링제의 존재하에서 커플링 반응 조건 하에 접촉시킴으로써, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 연결시키는 단계(여기서 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 R4가 포스포르아미디트 그룹인 제1의 작용 그룹을 포함하는 화합물이다); 보호 그룹을 제거하고 고체 상 지지체를 분해하는 단계; siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 각각 단리 및 정제하는 단계; 및 어닐링 단계(여기서 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥은 접합 그룹에 연결된다).
일부 구현예에서, 화학식 A59내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결되고, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음을 포함한다:
(1) 화학식 (321)의 화합물내 하이드록실 보호 그룹 Pk를 제거하는 단계(여기서 화학식 (321)의 화합물은 R4가 보호된 하이드록실 ORk를 포함하는 제1의 작용 그룹, 및 화학식 (C1') 또는 (C3')로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 제2의 작용 그룹을 포함한다); 보호된 생성물을 뉴클레오시드 단량체와 접촉시켜 커플링제의 존재하에서 커플링 반응 조건 하에 접합 분자를 통해 고체 상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체를 수득하는 단계;
(2) 접합 분자를 통해 고체 상 지지에체 연결된 뉴클레오시드 단량체로부터 출발하여, siRNA내 센스 가닥을 3' 내지 5' 방향으로 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 siRNA의 센스 가닥을 합성하는 단계;
(3) siRNA의 안티센스 가닥을 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 합성하는 단계; 및
(4) siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하고 이를 어닐링하여 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득하는 단계.
여기서, 단계 (1)에서, 화학식 (321)의 화합물 내 보호 그룹 Rk를 제거하는 방법은 화학식 (321)의 화합물을 탈보호제와 탈보호 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 탈보호 조건은 0 내지 50℃의, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 온도, 및 30 내지 300초, 및 일부 구현예에서, 50 내지 150초의 반응 온도를 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 일부 구현예에서, 디클로로아세트산이다. 탈보호제 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 10:1 내지 1000:1, 및 일부 구현예에서, 50:1 내지 500:1이다.
커플링 반응 조건 및 커플링제는 상기 커플링 반응에 적합한 임의의 조건 및 제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 상 합성 방법에서 커플링 반응의 것과 동일한 조건 및 제제를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 커플링 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 온도를 포함한다. 화학식 (321)의 화합물 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비는 1:1 내지 1:50, 및 일부 구현예에서, 1:2 내지 1:5이다. 화학식 (321)의 화합물 대 커플링제의 몰 비는 1:1 내지 1:50, 및 일부 구현예에서, 1:3 내지 1:10일 수 있다. 반응 시간은 200 내지 3,000초, 및 일부 구현예에서, 500 내지 1,500초이다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸로부터 선택된 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 커플링 반응은 유기 용매 속에서 수행할 수 있다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄으로부터 선택된 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 무수 아세토니트릴이다. 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol이고, 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol이다.
단계 (2)에서, 상기 단계에서 제조된 접합 분자를 통해 고체 상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체로부터 출발하여, 제2의 siRNA 접합체의 센스 가닥은 3' 내지 5' 방향으로 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 합성된다. 이러한 경우에, 접합 분자는 수득되는 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다.
단계 (2) 및 (3)에서 고체 상 합성을 위한 다른 조건, 예를 들어, 뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건, 탈커플링제의 유형 및 양, 커플링 반응 조건, 커플링제의 유형 및 양, 캡핑 반응 조건, 캡핑제의 유형 및 양, 산화 반응 조건, 산화제의 유형 및 양, 황화 반응 조건, 및 황화제의 유형 및 양은 당해 분야에서 다양한 통상의 제제, 양, 및 조건을 채택한다.
일부 구현예에서, 예를 들면, 단계 (2) 및 (3)에서 고체 상 합성은 다음의 조건을 사용할 수 있다:
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 30 내지 300초, 및 일부 구현예에서, 50 내지 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 하나 이상, 및 일부 구현예에서, 디클로로아세트산이다. 탈보호제 대 고체 상 지지체 상의 보호 그룹 4,4'-디메톡시트리틸의 몰 비는 2:1 내지 100:1, 및 일부 구현예에서, 3:1 내지 50:1이다.
커플링 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도를 포함한다. 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비는 1:1 내지 1:50이고, 일부 구현예에서, 1:5 내지 1:15이다. 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 커플링제의 몰 비는 1:1 내지 1:100, 및 일부 구현예에서, 1:50 내지 1:80이다. 반응 시간 및 커플링제의 선택은 상기와 동일하다.
캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 5 내지 500초, 및 일부 구현예에서, 10 내지 100초의 반응 시간을 포함한다. 캡핑제의 선택은 상기와 동일하다. 캡핑제의 총 양 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:100 내지 100:1이고, 일부 구현예에서, 1:10 내지 10:1이다. 캡핑제가 등몰의 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸을 사용하는 경우에, 아세트산 무수물, N-메틸이미다졸, 및 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1:10 내지 10:10:1일 수 있고, 일부 구현예에서, 1:1:2 내지 2:2:1이다.
산화 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 1 내지 100초, 및 일부 구현예에서, 5 내지 50초의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 산화제는 요오드(일부 구현예에서 요오드 물로 제공됨)이다. 산화제 대 커플링 단계에서 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1 내지 100:1일 수 있고, 일부 구현예에서, 5:1 내지 50:1이다. 일부 구현예에서, 산화 반응은 혼합 용매 속에서 수행되며 여기서 테트라하이드로푸란:물:피리딘의 비는 3:1:1 내지 1:1:3이다. 황화 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 50 내지 2,000초, 및 일부 구현예에서, 100 내지 1,000초의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 황화제는 크산탄 하이드라이드이다. 황화제 대 커플링 단계에서 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 10:1 내지 1,000:1이고, 일부 구현예에서, 10:1 내지 500:1이다. 일부 구현예에서, 황화 반응은 혼합된 용매 속에서 수행되며 여기서 아세토니트릴:피리딘의 비는 1:3 내지 3:1이다.
방법은 또한 모든 뉴클레오시드 단량체를 연결한 후 어닐링 전에 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 단리 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며 일반적으로 합성된 뉴클레오타이드 서열을 고체 상 지지체로부터 절단하는 단계, 염기, 포스페이트 그룹 및 리간드 상의 보호 그룹을 제거하는 단계, 정제하는 단계, 및 탈염 단계를 포함한다.
siRNA의 합성에서 통상의 절단 및 탈보호 방법을 사용하여 고체 상 지지체로부터 합성된 뉴클레오타이드 서열을 절단하고, 염기, 포스페이트 그룹 및 리간드 상의 보호 그룹을 제거할 수 있다. 예를 들면, 고체 상 지지체에 연결된 수득되는 뉴클레오타이드 서열을 농축된 수성 암모니아와 접촉시키고; 탈보호 동안 그룹 A46 내지 A54내 보호 그룹 YCOO-는 하이드록실 그룹으로 전환시킴으로써, S1 그룹을 상응하는 M1 그룹으로 전환시켜, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 접합체를 제공하며; 여기서 농축된 수성 암모니아는 25 내지 30 wt%의 농도의 수성 암모니아일 수 있다. 표적 siRNA 서열과 관련하여, 농축된 암모니아의 양은 0.2 ml/μmol 내지 0.8 ml/μmol일 수 있다.
합성된 뉴클레오타이드 서열 상에 적어도 하나의 2'-TBDMS 보호가 존재하는 경우, 방법은 고체 상 지지체로부터 제거된 뉴클레오타이드 서열을 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드와 접촉시켜 2'-TBDMS 보호를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 여기서, 수득되는 표적 siRNA 서열은 2'-하이드록시를 갖는 상응하는 뉴클레오시드를 포함한다. 표적 siRNA 서열과 관련하여, 순수한 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드의 양은 0.4 ml/μmol 내지 1.0 ml/μmol이다. 따라서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체가 수득될 수 있다.
정제 및 탈염 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 핵산 정제는 생성물의 수집 및 조합 후, NaBr 또는 NaCl의 구배 용출을 사용한 제조 이온 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 수행하고 있고, 탈염은 역상 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 수행할 수 있다.
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 수득되는 siRNA 접합체에서, 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르내 비-브릿징 산소 또는 황 원자는 실질적으로 나트륨 이온에 결합하며, siRNA 접합체는 실질적으로 나트륨 염의 형태로 존재한다. 잘 공지된 이온-교환 방법을 사용할 수 있으며, 여기서 나트륨 이온은 수소 이온 및/또는 다른 양이온으로 대체됨으로써, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체의 다른 형태를 제공한다. 양이온은 상술한 바와 같다.
합성 동안, 핵산 서열의 순도 및 분자량은 임의의 시간에 측정하여, 합성 품질을 보다 우수하게 제어할 수 있다. 이러한 측정 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 핵산의 순도는 이온 교환 크로마토그래피로 측정할 수 있고, 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)으로 측정할 수 있다.
어닐링 방법은 또한 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 합성된 센스 가닥(S 가닥) 및 안티센스 가닥(AS 가닥)을 주사용 수 속에서 등몰비로 단순히 혼합하고, 70 내지 95℃로 가열한 다음, 실온으로 냉각시켜 수소 결합을 통해 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다. 따라서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득할 수 있다.
접합체를 수득한 후, 일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 합성된 siRNA 접합체를 또한 액체 크로마토그래피-질량 분광법과 같은 방법을 사용하여 분자량 검출과 같은 수단으로 특성화함으로써, 합성된 siRNA 접합체가 목적한 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 설계된 siRNA 접합체이고, 합성된 siRNA의 서열이 목적한 siRNA의 서열, 예를 들면, 표 1 내지 5에 나타낸 서열 중 하나인지를 확인할 수 있다.
화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은: 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 사이클릭 무수물과 유기 용매 속에서 에스테르화 반응 조건 하에 염기 및 에스테르화 촉매의 존재하에서 접촉시키는 단계; 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 이온 교환에 의해 단리하는 단계를 포함하는, 다음의 제조 방법에 의해 수득할 수 있다.
Figure pct00119

여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, 및 S1의 정의 및 선택사항은 각각 상술한 바와 같고;
R6은 화학식 (321)의 R4를 제공하는 그룹이고; 일부 구현예에서, R6은 화학식 (A61)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00120

여기서 Ri는 질소성 골격 상의 N 원자에 연결하고, RkO에 연결하고 유리 하이드록시 그룹에 연결할 수 있는 임의의 그룹이고; Rk은 하이드록시 보호 그룹이다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되며, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C1) 또는 (C2)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
에스테르화 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 8 내지 48시간의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 에스테르화 반응 조건은 10 내지 40℃의 반응 온도 및 20 내지 30 시간의 반응 시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란을 포함하고, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급부틸 에테르를 포함하고, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol이고, 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 사이클릭 무수물은 석신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물 또는 피멜산 무수물 중 하나이고, 일부 구현예에서, 사이클릭 무수물은 석신산 무수물이다. 사이클릭 무수물 대 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1이다.
에스테르화 촉매는 에스테르화 반응을 촉매할 수 있는 임의의 촉매, 예를 들면, 4-디메틸아미노피리딘이다. 촉매 대 화학식 (313)으로 나타낸 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 염기는 임의의 무기 염기, 유기 염기 또는 이의 조합일 수 있다. 용해도 및 생성물 안정성을 고려하여, 염기는, 예를 들면, 3급 아민의 유기 염기일 수 있다. 일부 구현예에서, 3급 아민의 유기 염기는 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민의 유기 염기 대 화학식 (313)으로 나타낸 화합물의 몰비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서, 3:1 내지 10:1이다.
이온 교환은 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 목적한 형태의 카복실산 또는 카복실산 염으로 전환시키는 기능을 제공하며 이온 교환 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 양이온이 M+인 상기 접합 분자는 적합한 이온 교환 용액 및 이온 교환 조건을 사용하여 수득할 수 있으며, 이는 본원에서 삭제되어 있다. 일부 구현예에서, 이온 교환 반응은 트리에틸아민 포스페이트 용액을 사용하여 수행되며, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 농도는 0.2 내지 0.8 M이다. 일부 구현예에서, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 농도는 0.4 내지 0.6 M이고, 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 관련하여, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 양은 3 내지 6 L/mol이고, 추가의 구현예에서, 4 내지 5 L/mol이다.
화학식 (321)의 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 단리 방법을 사용하여 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피에 의해 단리할 수 있다. 예를 들면, 다음의 2개의 크로마토그래피 조건을 단리에 사용할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상 정제: 200 내지 300 메쉬 실리카 겔 여과기, 디클로로메탄 중 1 wt‰ 트리에틸아민:메탄올 = 100:18 내지 100:20의 구배 용출; 또는 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 충전제, 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용출. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (321)의 화합물의 조 생성물을 수득할 수 있으며, 이는 후속적인 반응에서 직접 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물을 제조하는 방법은 상기 이온 교환 반응에 의해 수득된 생성물을 유기 용매 속에서 축합 반응 조건 하에 축합제 및 3급 아민의 유기 염기의 존재하에서 아미노 또는 하이드록시 그룹을 지닌 고체 상 지지체와 추가로 접촉시킴을 추가로 포함한다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되며, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C1')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
고체 상 지지체는 siRNA의 고체 상 합성에 사용된 지지체 중 하나이며, 이들 중 일부는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 고체 상 지지체는 활성 하이드록시 또는 아미노 작용 그룹(들)을 함유하는 고체 상 지지체로부터 선택될 수 있고, 일부 구현예에서, 아미노 또는 하이드록시 수지이다. 일부 구현예에서, 아미노 또는 하이드록시 수지는 다음의 매개변수를 갖는다. 100 내지 400 메쉬(mesh)의 입자 크기, 및 0.2 내지 0.5 mmol/g의 표면 아미노 또는 하이드록시 로딩. 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물 대 고체 상 지지체의 비는 10 내지 400 μmol의 화합물/g의 고체 상 지지체이다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물 대 고체 상 지지체의 비는 50 μmol/g 내지 200 μmol/g이다.
유기 용매는 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 용매 또는 혼합된 용매일 수 있다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이고; 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급 부틸 에테르이고; 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 화학식 (321)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 20 내지 200 L/mol이고, 일부 구현예에서, 50 내지 100 L/mol이다.
일부 구현예에서, 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리필로이디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBop), 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온 및/또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 일부 구현예에서, 축합제는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 축합제 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서, 1:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 3급 아민의 유기 염기는 트리에틸아민 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 일부 구현예에서, N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민의 유기 염기 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서, 1:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물을 제조하는 방법은 수득되는 축합 생성물을 캡핑제 및 아실화 촉매와 유기 용매 속에서 캡핑 반응 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 화학식 (321)의 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 캡핑 반응을 사용하여 완전히 반응하지 않은 임의의 작용 그룹을 제거함으로써, 후속적인 반응에서 필요하지 않은 부반응물의 생산을 피한다. 캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 1 내지 10시간, 및 일부 구현예에서, 3 내지 6시간의 반응 시간을 포함한다. 캡핑제는 siRNA의 고체 상 합성에 사용된 캡핑제일 수 있으며, 이는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 캡핑제는 캡핑제 1(cap1) 및 캡핑제 2(cap2)로 구성된다. cap1은 N-메틸이미다졸이고, 일부 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합 용액으로서 제공되며, 여기서 피리딘 대 아세토니트릴의 용적 비는 1:10 내지 1:1이고, 일부 구현예에서, 1:3 내지 1:1이다. 일부 구현예에서, 피리딘 미 아세토니트릴의 총 용적 대 N-메틸이미다졸의 용적의 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 3:1 내지 7:1이다. cap2는 아세트산 무수물이고, 일부 구현예에서, 아세토니트릴 중 아세트산 무수물의 용액으로서 제공되며, 여기서 아세트산 무수물 대 아세토니트릴의 용적 비는 1:1 내지 1:10이고, 추가의 구현예에서 1:2 내지 1:6이다.
일부 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합된 용액의 용적 대 화합물 (321)의 화합물의 중량의 비는 5 ml/g 내지 50 ml/g이고, 일부 구현예에서, 15 ml/g 내지 30 ml/g이다. 아세토니트릴 중 아세트산 무수물의 용액의 용적 대 화학식 (321)의 화합물의 중량의 비는 0.5 ml/g 내지 10 ml/g이고, 일부 구현예에서, 1 ml/g 내지 5 ml/g이다.
일부 구현예에서, 캡핑제는 등몰량의 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸을 포함한다. 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 화학식 (321)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 10 내지 50 L/mol이고, 일부 구현예에서, 5 내지 30 L/mol이다.
일부 구현예에서, 아실화 촉매는 에스테르화 축합 또는 아미드화 축합에 사용될 수 있는 임의의 촉매, 예를 들면, 알칼린 헤테로사이클릭 화합물로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 아실화 촉매는 4-디메틸아미노피리딘이다. 촉매 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 중량비는 0.001:1 내지 1:1, 및 일부 구현예에서, 0.01:1 내지 0.1:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 임의의 적합한 분리 방법에 의해 반응 혼합물로부터 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 유기 용매를 사용하여 완전히 세척하고 여과하여 반응하지 않은 시약, 과도한 캡핑제 및 다른 분순물을 제거함으로써 수득할 수 있고, 여기서 유기 용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 메탄올로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 접합 분자의 제조 방법은 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 포스포로디아미디트와 유기 용매 속에서 커플링 반응 조건 하에 커플링제의 존재하에서 접촉시키는 단계, 및 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 단리하는 단계를 포함한다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되며, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C3)으로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
일부 구현예에서, 커플링 반응 조건은: 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 반응 온도; 1:1 내지 1:50, 예를 들면, 1:5 내지 1:15의 화학식 (313)의 화합물 대 포스포로디아미디트의 몰비; 1:1 내지 1:100, 예를 들면, 1:50 내지 1:80의 화학식 (313)의 화합물 대 커플링제의 몰 비; 및 200 내지 3,000초, 예를 들면, 500 내지 1,500초의 반응 시간을 포함한다. 포스포로디아미디트는 예를 들면, 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀이며, 이는 상업적으로 이용가능하거나 당해 분야에 잘 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸, 예를 들면, 5-에틸티오-1H-테트라졸 중 하나 이상이다. 커플링 반응은 유기 용매 속에서 수행될 수 있다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄, 예를 들면, 무수 아세토니트릴로부터 선택된 하나 이상이다. 화학식 (313)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 예를 들면, 5 내지 20 L/mol이다. 커플링 반응에 의해, 화학식 (313)의 화합물 내 하이드록시 그룹은 포스포로디아미디트와 반응하여 포스포르아미디트 그룹을 형성한다. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (321)의 화합물의 조 생성물을 제공할 수 있으며, 이는 후속적인 반응에 직접 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물의 제조 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다: 단리된 생성물을 하이드록시 그룹을 지닌 고체 상 지지체와 유기 용매 속에서 커플링 반응 조건 하에 커플링제의 존재하에서 추가로 접촉시키고, 캡핑, 산화, 및 단리하여, 화학식 (321)의 화합물을 수득하는 단계, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C3')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
일부 구현예에서, 고체 상 지지체는 핵산의 고체 상 합성에 대해 당해 분야에 잘 공지된 고체 지지체, 예를 들면, 탈보호된 시판되는 공통의 고체 상 지지체(NittoPhase®HL UnyLinker™ 300 올리고뉴클레오타이드 합성 지지체, Kinovate Life Sciences, 화학식 B80로 나타낸 바와 같음)이다:
Figure pct00121

탈보호 반응은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 30 내지 300초, 예를 들면, 50 내지 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈보호제는 디클로로아세트산이다. 고체 상 지지체 상의 탈보호제 대 보호 그룹 -DMTr(4,4'-디메톡시트리틸)의 몰 비는 2:1 내지 100:1, 예를 들면, 3:1 내지 50:1이다. 이러한 탈보호를 통해, 반응성 유리 하이드록시 그룹이 후속적인 커플링 반응을 촉진시키기 위해, 고체 상 지지체의 표면 상에서 수득된다.
커플링 반응 조건 및 커플링제는 상기와 같이 선택될 수 있다. 커플링 반응을 통해, 탈보호시 형성된 유리 하이드록시 그룹은 포스포르아미디트 그룹과 반응함으로써, 포스파이트 에스테르 연결을 형성한다.
일부 구현예에서, 캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 5 내지 500초, 예를 들면 10 내지 100초의 반응 시간을 포함한다. 캡핑 반응은 캡핑제의 존재하에서 수행된다. 캡핑제의 선택 및 양은 상술한 바와 같다.
산화 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 1 내지 100초, 예를 들면 5 내지 50초의 반응 시간을 포함한다. 산화제는, 예를 들면, 요오드(일부 구현예에서, 요오드 물로서 제공됨)이다. 산화제 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1 내지 100:1이고, 예를 들면, 5:1 내지 50:1일 수 있다. 일부 구현예에서, 산화 반응은 혼합된 용매 속에서 수행되며 여기서 테트라하이드로푸란:물:피리딘은 3:1:1 내지 1:1:3이다.
일부 구현예에서, R6은 화학식 B7 또는 B8의 그룹 중 하나이다:
Figure pct00122

여기서 q2의 정의는 상술한 바와 같다.
이러한 경우에, 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물은 다음의 제조 방법으로 수득될 수 있다: 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물을 화학식 (A-1) 또는 (A-2)로 나타낸 바와 같은 화합물과 유기 용매 속에서 아미드화 반응 조건 하에 아미드화 반응을 위한 축합제 및 3급 아민의 유기 염기의 존재하에서 접촉시키는 단계에 이은 단리 단계:
Figure pct00123

여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1, q2, 및 Rk의 정의 및 선택사항은 각각 상술한 바와 같다.
아미드화 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 1 내지 48시간의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미드화 반응 조건은 10 내지 40℃의 반응 온도 및 2 내지 16 시간의 반응 시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올 용매, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 알코올 용매는 메탄올, 에탄올 및 프로판올 중 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 에탄올이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (314)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol이고, 일부 구현예에서, 3 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 아미드화 반응을 위한 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드, 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ), 또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이고, 추가의 구현예에서, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온이다. 아미드화 반응용 축합제 대 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물의 물 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2.5:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 3급 아민의 유기 염기는 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 일부 구현예에서, N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민의 유기 염기 대 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 3:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서, 5:1 내지 10:1이다.
화학식 (A-1) 및 (A-2)의 화합물은 임의의 적합한 수단으로 제조할 수 있다. 예를 들면, Rk가 DMTr 그룹인 경우, 화학식 (A-1)의 화합물은 칼슘 글리세레이트를 DMTrCl과 반응시켜 제조할 수 있다. 유사하게, 화학식 (A-2)는 3-아미노-1,2-프로판디올을 사이클릭 무수물과 우선 접촉시킨 다음 DMTrCl과 접촉시켜 제조할 수 있고, 여기서 사이클릭 무수물은 4 내지 13개의 탄소 원자, 및 일부 구현예에서, 4 내지 8개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 당해 분야의 기술자는 상이한 사이클릭 무수물의 선택이 화학식 (A-2)의 화합물내 q2에 대한 상이한 값에 상응함을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들면, 사이클릭 무수물이 석신산 무수물인 경우, q2는 1이고; 사이클릭 무수물이 글루타르산 무수물인 경우, q2는 2이고 등이다.
일부 변형에서, 화학식 (313)의 화합물은 또한 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물을 사이클릭 무수물, 3-아미노-1,2-프로판디올 및 DMTrCl과 순차적으로 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 이러한 변형이 화학식 (313)의 화합물의 구조 및/또는 기능에 영향을 미치지 않을 수 있음을 용이하게 이해할 수 있고, 이러한 변형은 상기 방법을 기반으로 당해 분야의 기술자에 의해 용이하게 인식된다.
유사하게, 화학식 (313)의 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 단리 방법에 의해 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (313)의 화합물은 용매를 증발을 통해 제거한 다음 크로마토그래피에 의해 단리할 수 있다. 예를 들면, 다음의 크로마토그래피 조건을 단리에 사용할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상 정제: 200 내지 300 메쉬 실리카 겔 여과기, 석유 에테르:에틸아세테이트:디클로로메탄:N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 구배 용출 사용 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 여과기, 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 용출 구배 사용. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (313)의 화합물의 조 생성물을 수득할 수 있으며, 이는 후속적인 반응에서 직접 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 다음을 포함하는 제조 방법에 의해 수득될 수 있다: 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 유기 용매 속에서 축합 반응 조건 하에 아미드화 반응을 위한 축합제 및 3급 아민의 유기 염기의 존재하에서 접합시키는 단계에 이은 단리 단계:
Figure pct00124

Figure pct00125

여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15의 정의 및 선택사항은 각각 상술한 바와 같다.
화학식 (316)의 화합물은 예를 들면, 문헌: J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961에 개시된 것일 수 있다. 대안적으로, 화학식 (316)의 화합물은 당해 분야의 기술자에 의해 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 화학식 (316)의 일부 화합물은 미국 특허 제US8106022B2호에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있으며, 이는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 축합 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 0.1 내지 24 시간의 반응 시간, 및 일부 구현예에서, 10 내지 40℃의 반응 온도 및 0.5 내지 16시간의 반응 시간을 포함한다.
화학식 (314)의 목적한 생성물 화합물의 구조를 고려하여, 화학식 (316)으로 나타낸 화합물 대 화학식 (320)으로 나타낸 화합물의 몰 비는 화학식 (320) 내 n1 및 n3의 합을 기반으로 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들면, n1+n3이 3인 경우, 어떠한 과도한 반응없이 완전한 반응을 보증하기 위하여, 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물 대 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 3:1 내지 3.5:1, 및 일부 구현예에서, 3.01:1 내지 3.15:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (320)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol이고, 및 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 아미드화 반응을 위한 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-디에톡시포스포릴옥시-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(DEPBT), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드, 또는 1-하이드록시벤조트리아졸이고, 추가의 구현예에서 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 및 1-하이드록시벤조트리아졸이고, 여기서 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 및 1-하이드록시벤조트리아졸은 등몰 비로 사용된다. 아미드화 반응을 위한 총 축합제 대 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 3:1, 및 일부 구현예에서, 1.05:1 내지 1.5:1일 수 있다.
3급 아민의 유기 염기는 N-메틸모르폴린, 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민일 수 있고, 일부 구현예에서, N-메틸로르폴린일 수 있다. 3급 아민의 유기 염기 대 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 2:1 내지 10:1, 및 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1일 수 있다.
유사하게, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 단리 방법으로 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 용매를 증발로 제거한 후 예를 들면, 단리를 위한 다음의 2개의 크로마토그래피 조건을 사용하는 크로마토그래피에 의해 단리할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상 정제: 200 내지 300 메쉬 실리카 겔 여과기, 디클로로메탄:메탄올 = 100:5 내지 100:7의 구배 용출 사용; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 여과기, 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용출 사용. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (314)의 화합물의 조 생성물을 수득할 수 있으며, 이는 후속적인 반응에서 직접 사용될 수 있다.
화학식 (320)의 화합물은 상업적으로 이용가능하거나, 공지된 방법을 통해 당해 분야의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, m1=m2=m3=3, n1=1, n3=2, 및 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 모두 H인 경우에, 화학식 (320)의 화합물은 Alfa Aesar Inc.로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 개시내용의 siRNA 접합체는 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 사용될 수 있으며, 이는 당해 분야에서 다양한 통상의 제형 또는 화합물 중 하나 이상일 수 있다. 세부사항에 대해서는, 본 개시내용의 약제학적 조성물의 상기 설명을 참고한다.
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및 siRNA를 포함하는 접합체의 용도
일부 구현예에서, 본 개시내용은 이상지질혈증을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조시 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 이상지질혈증을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
이상지질혈증을 예방하고/하거나 치료하는 목적은 본 개시내용의 siRNA 활성 성분을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 RNA 방해 메카니즘을 통해 달성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체는 이상지질혈증을 예방 및/또는 치료하기 위해서, 또는 이상지질혈증의 예방 및/또는 치료용 의약의 제조를 위해 사용될 수 있다.
이상지질혈증은 간세포내에서 APOC3 유전자의 과-발현에 의해 유발된 비정상적인 혈액 지질을 지칭하며, 일반적으로 혈액 속에서 임의의 하나 또는 모든 지질(예를 들면, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤) 및/또는 지단백질의 증가된 수준(들)에 의해 유발된 비정상적인 혈액 지질을 지칭한다. 고 수준의 혈액 지질은 고혈압, 심혈관 질환, 당뇨병, 및 다른 병리학적 상태와 크게 관련되어 있다. 고중성지질혈증(hypertriglyceridemia)은 죽상경화증과 관련되어 있으며, 췌장염을 초래할 수 있다. 본 개시내용의 이상지질혈증은 고콜레스테롤혈증, 고중성지질혈증 또는 죽상경화증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "투여/투여하다"는 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 대상체의 혈액내로 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 목적한 부위에 적어도 부분적으로 위치시키는 방법 또는 경로에 의해 전달하여 목적한 효과를 생성함을 지칭한다. 본 개시내용의 방법을 위해 적합한 투여 경로는 국소 투여 및 전신계 투여를 포함한다. 일반적으로, 국소 투여는 대상체의 전체 체중과 비교하여 특수한 부위에 추가의 siRNA 접합체의 전달을 야기하는 반면; 전신계 투여는 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 대상체의 실질적으로 전체 신체로의 전달을 야기한다. 본 개시내용이 이상지질혈증의 예방 및/또는 치료용 수단을 제공하기 위한 것임을 고려할 때, 일부 구현예에서, 투여 방식은 의약을 간으로 전달할 수 있다.
대상체에 대한 투여는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 경구 및 비경구 경로, 예를 들면, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여, 기관내 투여(에어로졸), 폐 투여, 비강 투여, 직장 투여, 및 국소 투여(예를 들면, 볼 투여 및 설하 투여)에 의해 달성될 수 있다. 투여 빈도는 매일, 매주, 격주, 3주마다, 매달, 격달, 4개월마다, 반년마다, 또는 매년 1회 이상일 수 있다.
본 개시내용의 siRNA 또는 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체의 투여량은 당해 분야에서 통상적인 용량일 수 있고, 이는 다양한 매개변수, 특히, 대상체의 연령, 체중 및 성별에 따라 결정될 수 있다. 독성 및 효능을 세포 배양물 속에서 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정에 의해, 예를 들면, LD50(50%의 집단 사망을 유발하는 치사 용량) 및 ED50(등급화된 반응에서 최대 반응 강도의 50%를 유발할 수 있고, 실험 대상체의 50%에서 질적 반응에서 양성 반응을 가지도록 하는 용량)에 의해 측정할 수 있다. 사람에 대한 용량 범위는 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이타로부터 유도할 수 있다.
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 예를 들면, 수컷 또는 암컷의, 6 내지 12주령의, 18 내지 25 g의 체중의 C57BL/6J 마우스 또는 30 내지 45g 체중의 ob/ob 마우스에게 투여하는 경우, (i) siRNA 접합체에 대해, 이의 siRNA의 양은 0.001 내지 100 mg/kg의 체중, 추가의 구현예에서 0.01 내지 50 mg/kg의 체중, 보다 추가의 구현예에서 0.05 내지 20 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.05 내지 15 mg/kg의 체중, 및 다른 구현예에서 0.1 내지 10 mg/kg의 체중일 수 있고; (ii) siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체로부터 형성된 약제학적 조성물에 대해, 이의 siRNA의 양은 siRNA의 양을 기준으로 하여, 0.001 내지 50 mg/kg의 체중, 추가의 구현예에서 0.01 내지 10 mg/kg의 체중, 보다 추가의 구현예에서 0.05 내지 5 mg/kg의 체중, 및 여전히 보다 추가의 구현예에서 0.1 내지 3 mg/kg의 체중일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 간세포와 접촉시키는 단계, 및 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 간세포내로 도입시켜, RNA 방해의 메카니즘을 통해 간세포내에서 APOC3 유전자의 발현의 억제 목적을 실현시키는 단계를 포함하는, 간세포내에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 간세포는 간암 세포주(예를 들면, Hep3B, HepG2 및 Huh7), 및 단리된 원발성 간세포로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 간세포는 Huh7 간암 세포이다.
세포내에서 APOC3 유전자의 발현이 본 개시내용의 방법에 의해 억제되는 경우에, 본 개시내용의 변형된 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체내 siRNA의 양은 일반적으로 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분하고 표적 세포의 표면에서 1 pM 내지 1 μM, 또는 0.01 nM 내지 100 nM, 또는 0.05 nM 내지 50 nM, 또는 0.05 nM 내지 약 5 nM의 세포외 농도를 생성하기에 충분한 양이다. 이러한 국소 농도를 달성하는데 요구되는 양은 다양한 인자, 예를 들면, 전달 방법, 전달 부위, 전달 부위와 표적 세포 또는 조직 사이의 세포 층의 수, 전달 경로(국소 또는 전신계) 등으로 변할 수 있다. 전달 부위에서 농도는 표적 세포 또는 조직의 표면에서의 것보다 유의적으로 더 높을 수 있다.
키트(kit)
본 개시내용은 본 개시내용의 변형된 siRNA, 약제학적 조성물, 및 siRNA 접합체 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 용기 속에서 변형된 siRNA를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 다른 성분, 예를 들면, 안정화제 또는 방부제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 본 개시내용의 변형된 siRNA를 제공하기 위한 용기와는 상이한 다른 용기 속에 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 변형된 siRNA와 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는부형제 또는 다른 성분(존재하는 경우)를 혼합하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 키트에서, 변형된 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제 뿐만 아니라, 변형된 siRNA, 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체 및/또는 접합체, 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제는 임의의 형태, 예를 들면, 액체형, 건조형 또는 동결건조형으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 및 약제학적 조성물 및/또는 접합체 및 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제(들)은 실질적으로 순수하고/하거나 멸균되어 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 멸균수를 제공할 수 있다.
이후에, 본 개시내용을 실시예의 방식으로 추가로 나타낼 것이지만, 임의의 국면에서 이에 한정되지 않을 것이다.
실시예
달리 규정하지 않는 한, 다음의 실시예에 사용된 시약 및 배양 배지는 모두 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어, 전기영동 및 실시간 PCR에 사용된 과정은 모두 문헌: Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기술된 방법에 따라 수행된다.
Huh7 세포는 Stem Cell Bank of Chinese Academy of Science로부터 구입하여 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone company) 및 1% 비-필수 아미노산(NEAA, Corning company)을 함유하는 DMEM 완전 배지(Hyclone company) 속에서 37℃에서 5% CO2/95% 공기를 함유하는 항온처리기 속에서 배양하였다.
본 개시내용에서 합성된 APOC3 유전자에 대한 siRNA 또는 siRNA 접합체 또는 음성 대조군으로서 siRNA 또는 siRNA 접합체를 사용하여 세포를 형질감염시키고, LipofectamineTM2000(Invitrogen)을 형질감염제로서 사용하였다. 구체적인 과정은 제조업자가 제공한 설명서를 지칭할 수 있다.
달리 규정하지 않는 한, 하기 제공한 시약의 비는 모두 용적 비(v/v)로 계산된다.
사용된 동물 모델은 다음과 같다:
사람 APOC3 유전자이식 마우스: B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J, 미국 Jackson Laboratory로부터 구입;
모든 실험 데이타는
Figure pct00126
로서 나타내며, 데이타는 Graphpad prism 5.0 통계 분석 소프트웨어로 분석한다.
제조 실시예 1: 접합체 1 내지 11의 제조
본 제조 실시예에서, 접합체 1 내지 11을 합성하였다. 접합체는 표 7에 나타낸 바와 같이 L-9 접합 분자를 siRNA에 접합시켜 형성된 것이었다.
(1-1) 화합물 L-10의 합성:
화합물 L-10을 다음의 방법에 따라 합성하였다:
Figure pct00127
(1-1-1) GAL-5(접합 분자의 말단 분절)의 합성
Figure pct00128
(1-1-1a) GAL-2의 합성
100.0 g의 GAL-1(N-아세틸-D-갈락토사민 하이드로클로라이드, CAS 번호: 1772-03-8, Ning Bo hongxiang bio-chem Co., Ltd.로부터 구입, 463.8 mmol)을 1000 ml의 무수 피리딘 속에 용해하고 여기서 540 ml의 아세트산 무수물(Enox Inc.로부터 구입, 5565.6 mmol)를 빙욕 속에서 가하여 실온에서 교반하에 1.5시간 동안 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 10 L의 빙수에 붓고 감압하에 흡입 여과에 적용시켰다. 잔사를 2 L의 빙수로 세척한 다음, 아세토니트릴/톨루엔(아세토니트릴:톨루엔의 v/v 비 = 1:1)의 혼합된 용매로 완전히 용해될 때까지 가하였다. 용매를 증발로 제거하여 130.0 g의 생성물 GAL-2를 백색 고체로서 수득하였다.
(1-1-1b) GAL-3의 합성
단계(1-1-1a)에서 수득한 GAL-2(35.1 g, 90.0 mmol)를 213 ml의 무수 1,2-디클로로에탄 속에 용해하고, 여기에 24.0 g의 TMSOTf(CAS 번호: 27607-77-8, Macklin Inc.로부터 구입, 108.0 mmol)를 빙욕 속에서 질소 대기하에 가하여 실온에서 밤새 반응시켰다.
반응 용액을 희석을 위해 400 ml의 디클로로메탄과 함께 가하고, 규조토로 여과한 다음, 1L의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액과 함께 가하고 균일하게 교반하였다. 유기 상을 단리하였다. 남은 수성 상을 각각 300 ml의 디클로로에탄으로 2회 세척하였다. 유기 상을 합하고 300 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액 및 300 ml의 포화된 염수로 각각 세척하였다. 유기 상을 단리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증발 건조시켜 감압하에 제거함으로써 26.9 g의 생성물 GAL-3을 담황색 점성 시럽으로서 수득하였다.
(1-1-1c) GAL-4의 합성
단계 (1-1-1b)에서 수득한 GAL-3(26.9 g, 81.7 mmol)을 136 ml의 무수 1,2-디클로로에탄 속에 용해하고, 30 g의 무수 4Å 분자 체 분말에 이어서 9.0 g의 5-헥센-1-올(CAS 번호: 821-41-0, Adamas-beta Inc.로부터 시판됨, 89.9 mmol)과 함께 가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 9.08 g의 TMSOTf(40.9 mmol)를 빙욕 속에서 질소 대기하에 가하여 교반하에 실온에서 밤새 반응시켰다. 4Å 분자 체 분말을 여과로 제거하였다. 여액을 300 ml의 희석용 디클로로에탄과 함께 가하고, 규조토로 여과한 다음, 500 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액으로 세척하고 10분 동안 세척을 위해 교반하였다. 유기 상을 분리하였다. 수성 상을 300 ml의 디클로로에탄으로 1회 추출하였다. 유기 상을 합하고 300 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액 및 300 ml의 포화된 염수로 각각 세척하였다. 유기상을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 41.3g의 생성물 GAL-4를 황색 시럽으로서 수득하고, 이를 다음 산화 반응에서 정제없이 직접 사용하였다.
(1-1-1d) GAL-5의 합성
단계 (1-1-1c)의 방법에 따라 수득된 GAL-4(14.9 g, 34.7 mmol)를 77 ml의 디클로로메탄 및 77 ml의 아세토니트릴의 혼합된 용매 속에 용해하고, 103 ml의 탈이온수 및 29.7 g의 퍼요오드화나트륨(CAS 번호: 7790-28-5, Aladdin Inc.로부터 시판됨, 138.8 mmol) 각각을 가하고, 빙욕 속에서 10분 동안 교반하였다. 삼염화루테늄(CAS 번호: 14898-67-0, Energy Chemical로부터 시판됨, 238 mg, 1.145 mmol)을 가하여 실온에서 밤새 반응되도록 하였다. 수득되는 반응 용액을 교반하에 300 ml의 물을 가하여 희석시키고, 포화된 중탄산나트륨을 가하여 pH를 약 7.5로 조절하였다. 유기상을 분리하고 경사제거하였다. 수성 상을 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하고, 유기상을 경사제거(discarding)하였다. 수성 상을 시트르산 고체로 pH를 약 3으로 조절하고 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하고, 수득되는 유기 상을 합하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거함으로써 6.85 g의 생성물 GAL-5를 백색 발포성 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.01 (br, 1H), 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.07 - 3.95 (m, 3H), 3.92 - 3.85 (m, 1H), 3.74 - 3.67 (m, 1H), 3.48 - 3.39 (m, 1H), 2.20 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.55 - 1.45 (m, 4H).
(1-1-2) L-8의 합성
Figure pct00129
J-0(9.886 g, 52.5 mmol, Alfa Aesar Inc.로부터 시판됨) 및 단계 (1-1-1)에서 수득한 GAL-5(72.819 g, 162.75 mmol, 생성물의 수개의 배치(batch)를 합하여 수득함)를 525 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 44.782 g, 346.50 mmol), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP, 90.158 g, 173.25 mmol) 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 23.410 g, 173.25mmol)과 함께 가하여 실온에서 4시간 동안 반응되도록 하였다. 수득되는 반응 용액을 20 ml의 포화된 중탄산나트륨 용액 및 200 ml의 포화된 염수를 가하여 세척하였다. 수성 상을 각각 100 ml의 디클로로메탄으로 2회 세척하였다. 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 희석시키고, 여과하였다. 이후에, 용매를 감압하에 증발 건조로 제거함으로써 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 정상의 실리카 겔 컬럼(200 내지 300 메쉬)를 사용하여 정제하였다. 컬럼을 실리카 겔의 산성을 중화시키기 위한 10 wt%의 트리에틸아민과 함께 가하고, 1wt‰의 트리에틸아민으로 평형화시키고, 디클로로메탄:메탄올 = 100:25 내지 100:40의 구배 용출로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하여 38.8 g의 순수한 생성물 L-8을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 7.27 - 7.23 (m, 1H), 7.13 - 7.18 (m, 1H), 5.22 (d, J = 3.1 Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.3, 3.1 Hz, 3H), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.09 - 3.98 (m, 9H), 3.88 (dd, J = 19.3, 9.3 Hz, 3H), 3.75 - 3.66 (m, 3H), 3.44 - 3.38 (m, 3H), 3.17 - 3.30 (m, 4H), 3.10 - 2.97 (m, 4H), 2.35 - 2.20 (m, 6H), 2.15 - 2.08 (m, 9H), 2.07 - 1.98 (m, 13H), 1.94 - 1.87 (m, 9H), 1.81 - 1.74 (m, 9H), 1.65 - 1.42 (m, 18H). MS m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, 계산치: 1477.59, 측정치: 1477.23.
(1-1-3)
(1-1-3a) A-1의 합성
Figure pct00130
DMTrCl(4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드, 101.65 g, 300 mmol)를 1000 ml의 무수 피리딘 속에 용해하고, 칼슘 DL-글리세레이트 하이드레이트(28.63 g, 100 mmol)와 함께 가하여 45℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 여과하였다. 잔사를 200 ml의 DCM으로 세척하고, 여액을 감압하에 농축 건조시켰다. 잔사를 500 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고 각각 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트(pH = 7 내지 8)로 2회 세척하였다. 수성 상을 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하엿다. 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하고, 잔사를 정상 상 실리카 겔 컬럼(200 내지 300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 컬럼을 석유 에테르:에틸 아세테이트:디클로로메탄:메탄올 = 1:1:1:0.35 내지 1:1:1:0.55의 용출 구배로 정제하였다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하였다. 잔사를 600 ml의 디클로로메탄 속에 재용해하고, 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 1회 세척하였다. 수성 상을 200 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하고, 잔사를 감압하에 진공 펌프 오일 속에서 밤새 건조시켜 50.7 g의 생성물 A-1을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (ddd, J = 6.5, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.40 - 7.28 (m, 7H), 6.89 - 6.81 (m, 4H), 4.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.36 - 4.24 (m, 1H), 4.29 (s, 6H), 3.92 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.67 (dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 2.52 (q, J = 6.3 Hz, 6H), 1.03 (t, J = 6.3 Hz, 9H). MS m/z: C24H23O6, [M-H]-, 계산치: 407.15, 측정치: 406.92.
(1-1-3b) L-7의 합성
Figure pct00131
단계 (1-1-2) 및 (1-1-3a)에서 수득한 L-8(40 g, 27.09 mmol, 생성물의 수개의 배치를 합하여 수득함)을 합하고 271 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(DEPBT)(24.318 g, 81.37 mmol)을 가하고, 디이소프로필에틸아민(21.007 g, 162.54 mmol)과 함께 추가로 가하여 교반하에 25℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 유기상을 800 ml의 포화된 중탄산나트륨으로 세척하였다. 수성 상을 각각 50 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 150 ml의 포화된 염수로 세척하고 수성 상을 50 ml의 디클로로메탄으로 1회 추출하고, 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 세척하고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하고, 잔사를 진공 오일 펌프 속에서 밤새 발포-건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 컬럼 정제에 적용하였다. 컬럼을 2 kg의 정상 상 실리카 겔(200 내지 300 메쉬)로 여과하고, 실리카 겔의 산도를 중화하기 위한 200 ml의 트리에틸아민과 함께 가하고 석유 에테르:에틸아세테이트:디클로로메탄:N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 구배 용출로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하여 40.4 g의 조 생성물 L-7을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.90 - 7.78 (m, 4H), 7.75 - 7.64 (m, 1H), 7.38 - 7.18 (m, 9H), 6.91 - 6.83 (m, 4H), 5.25 - 5.10 (m, 4H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 3H), 4.48 - 4.30 (m, 4H), 4.02 (s, 9H), 3.93 - 3.84 (m, 3H), 3.76 - 3.66 (m, 9H), 3.45 - 3.35 (m, 3H), 3.24 - 2.98 (m, 10H), 2.30 - 2.20 (m, 2H), 2.11 - 1.88 (m, 31H), 1.80 - 1.40 (m, 28H). MS m/z: C90H128N7O35, [M-DMTr]+, 계산치: 1564.65, 측정치: 1564.88.
(1-1-4) L-9의 합성
Figure pct00132
단계 (1-1-3b)에서 수득한 L-7(40g, 21.4247mmol), 석신산 무수물(4.288g, 42.8494mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 5.235g, 42.8494mmol)을 혼합하고 215 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 13.845g, 107.1235mmol)과 함께 추가로 가하고, 25℃에서 24시간 동안 용해하였다. 수득되는 반응 용액을 800 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 용해하였다. 수성 상을 각각 5 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 감압하에 증발 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 컬럼 정제에 적용시켰다. 컬럼을 1 kg의 정상 상 실리카 겔(200 내지 300 메쉬)로 여과하고, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위한 1 wt% 트리에틸아민과 함께 가하고, 디클로로메탄으로 평형화시키고, 디클로로메탄 중 1wt‰ 트리에틸아민:메탄올 = 100:18 내지 100:20의 구배 용출로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하여 31.0 g의 순수한 생성물 L-9를 접합 분자로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.58 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.94 - 7.82 (m, 3H), 7.41 - 7.29 (m, 5H), 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 5H), 6.89 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 5.49 - 5.37 (m, 1H), 5.21 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 4.97 (d, J = 11.1 Hz, 3H), 4.49 (d, J = 8.2 Hz, 3H), 4.02 (s, 9H), 3.88 (dd, J = 19.4, 9.4 Hz, 3H), 3.77 - 3.65 (m, 9H), 3.50 - 3.39 (m, 6H), 3.11 - 2.90 (m, 5H), 2.61 - 2.54 (m, 4H), 2.47 - 2.41 (m, 2H), 2.26 - 2.17 (m, 2H), 2.15 - 1.95 (m, 22H), 1.92 - 1.84 (m, 9H), 1.80 - 1.70 (m, 10H), 1.65 - 1.35 (m, 17H), 1.31 - 1.19 (m, 4H), 0.96 (t, J = 7.1 Hz, 9H). MS m/z: C94H132N7O38, [M-DMTr]+, 계산치: 1664.72, 측정치: 1665.03.
(1-1-5) 화합물 L-10의 합성
Figure pct00133
당해 단계에서, 화합물 L-10을 L-9 접합 분자를 고체 상 지지체에 연결시켜 제조하였다.
단계 (1-1-4)에서 수득한 L-9 접합 분자(22.751 g, 11 mmol), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU, 6.257 g, 16.5 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA, 2.843 g, 22 mmol)을 혼합하고 900 ml의 아세토니트릴 속에 용해하고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 수득되는 반응 용액을 아미노메틸 수지(H2NResin, 88 g, 100 내지 200 메쉬, 아미노 로딩: 400 μmol/g, Tianjin Nankai HECHENG S&T Co., Ltd.로부터 구입)와 함께 가하였다. 반응을 진탕기 상에서 25℃및 150 rpm/min의 회전 속도에서 18시간 동안 수행한 다음, 여과하였다. 잔사를 2회(각각 300 ml의 DCM 사용) 및 3회(각각 300 ml의 아세토니트릴 사용) 세척하고, 진공 오일 펌프 속에서 18시간 동안 건조시켰다. 이후에 출발 물질(CapA, CapB, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 및 아세토니트릴)을 캡핑 반응을 위해 표 6에 나타낸 바와 같은 충전 비에 따라 가하였다. 반응을 진탕기 상에서 25℃ 및 150 rpm/min의 회전 속도에서 5시간 동안 수행하였다. 반응 액체를 여과하였다. 잔사를 각각 300 ml의 아세토니트릴로 3회 세척하였다. 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하고, 잔사를 감압하에 진공 오일 펌프 속에서 밤새 건조시켜 102 g의 화합물 L-10(즉, 고체 상 지지체에 연결된 L-9 접합 분자)을 90.8 μmol/g의 로딩으로 수득하였다.
[표 6]
Figure pct00134
상기 표에서, Cap A 및 Cap B는 캡핑제의 용액이다. Cap A는 피리딘 중 20 용적%의 N-메틸이미다졸/아세토니트릴의 혼합된 용액이고, 여기서 피리딘 대 아세토니트릴의 용적 비는 3:5이다. Cap B는 아세토니트릴 중 20 용적%의 아세트산 무수물이다.
(1-2) 접합체 1-11의 센스 가닥의 합성
뉴클레오시드 단량체를 하나씩 3' 내지 5' 방향으로 접합체 1-11의 센스 가닥내 뉴클레오타이드의 정렬 서열에 따라 상기 단계에서 제조한 화합물 L-10으로부터의 사이클로 출발하여 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법으로 연결시켰다. 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계 반응을 포함하였다. 여기서, 2개의 뉴클레오타이드가 포스포에스테르 결합을 통해 연결된 경우, 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4-단계 반응을 후자의 뉴클레오시드 단량체의 연결 동안 포함시켰고; 2개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된 경우, 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 황화의 4-단계 반응을 후자의 뉴클레오시드 단량체의 연결 동안 포함시켰다. 합성 조건은 다음과 같다.
뉴클레오시드 단량체를 0.1 M 아세토니트릴 용액 속에 제공한다. 각각의 단게에서 탈보호 반응을 위한 조건은 동일한데, 즉, 25℃의 온도, 70초의 반응 시간, 탈보호 시약으로서 디클로로메탄(3% v/v) 중 디클로로아세트산의 용액, 및 5:1의 디클로로아세트 산 대 고체 상 지지체 상의 보호 그룹 4,4'-디메톡시트리틸의 몰 비이다.
각각의 단계에서 커플링 반응을 위한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 1:10의 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비, 1:65의 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 커플링 시약의 몰 비, 600초의 반응 시간, 및 커플링 시약으로서 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)의 0.5 M 아세토니트릴 용액을 포함한다.
각각의 단계에서 캡핑 반응을 위한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 15초의 반응 시간, 캡핑제의 용액으로서 1:1의 몰 비의 Cap A 및 Cap B의 혼합된 용액, 및 1:1:1의 캡핑제 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비, 및 (아세트산 무수물: N-메틸이미다졸: 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열)를 포함한다.
각각의 단계에서 산화 반응을 위한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 15초의 반응 시간, 산화제로서 0.05 M의 요오드 수(iodine water); 및 30:1의 요오드 대 커플링 단계에서 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비를 포함한다. 반응은 테트라하이드로푸란:물:피리딘(3:1:1)의 혼합된 용매 속에서 수행된다.
각각의 단계에서 황화 반응을 위한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 300초의 반응 시간, 황화 시약으로서 크산탄 수소화물; 및 120:1의 황화 시약 대 커플링 단계에서 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비를 포함한다. 반응은 아세토니트릴:피리딘(1:1)의 혼합된 용매 속에서 수행된다.
절단 및 탈보호를 위한 조건은 다음과 같다: 지지체에 연결된 합성된 뉴클레오타이드 서열을 25 wt% 수성 암모니아에 가하여 55℃에서 16시간 동안 반응시키며, 여기서, 수성 암모니아의 양은 0.5 ml/μmol이다. 액체를 제거하였고, 잔사를 진공 하에 농축 건조시킨다.
정제 및 탈염: 핵산의 정제는 제조 이온 크로마토그래피 정제 컬럼(Source 15Q)과 NaCl의 구배 용출을 사용하여 달성한다. 구체적으로, 용출제 A는 20 mM 인산나트륨(pH 8.1)이고, 용매는 9:1(v/v)의 물/아세토니트릴이고; 용출제 B는 1.5 M 염화나트륨, 20 mM 인산나트륨(pH 8.1)이고, 용매는 9:1(v/v)의 물/아세토니트릴이고; 용출 구배: 용출제 A: 용출제 B = 100:0 내지 50:50의 비이다. 용출제를 수집하고, 합하고 역 상 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용함으로써 탈염시킨다. 구체적인 조건은 탈염용 Sephadex 컬럼(여과기: Sephadex G25)을 사용하는 것 및 탈이온수를 사용한 용출을 포함한다.
검출: 순도는 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)로 측정하고; 생성물의 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)으로 분석하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치한다는 사실은 이의 3' 말단이 L-9 접합 분자에 접합된 접합체 1-11의 센스 가닥 S가 합성되었음을 나타낸다.
(1-3) 안티센스 가닥의 합성
(1-3A) 접합체 1-5의 안티센스 가닥의 제조
접합체 1 내지 5의 안티센스 가닥 AS를 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 접합체 1-5의 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드의 정렬 서열에 따라 공통의 고체 상 지지체(UnyLinker™ loaded NittoPhase®HL 고체 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)로부터의 사이클을 출발시켜, 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에서 연결시켜 합성하였다. 탈보호, 커플링, 캡핑, 산화 또는 환원, 절단 및 탈보호, 및 고체 상 합성 방법에서 정제 및 탈염의 반응 조건은 센스 가닥의 합성에 사용된 것과 동일하였다.
검출: 순도를 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)로 검출하고; 분자량을 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)으로 분석하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치한다는 사실은 표적 서열을 갖는 안티센스 가닥 AS가 합성되었음을 나타낸다.
여기서, 비닐 포스페이트 및 2'-메톡시 변형된 우라실 단량체(VP-Um)를 다음의 방법에 따라 합성하였다:
Figure pct00135
(1-3-1) VP-U-2의 합성
VP-U-2 분자를 다음의 방법에 따라 합성하였다:
Figure pct00136
2'-메톡시 변형된 우라실 뉴클레오시드(2'-OMe-U, 51.30 g, 91.6 mmol), 3급-부틸 디페닐클로로실란(TBDPSCl, 50.35 g, 183.2 mmol), 및 이미다졸(12.47 g, 183.2 mmol)을 혼합하고 450 ml의 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 속에 용해시켜 실온에서 20시간 동안 교반하에 반응시켰다. DMF를 증발로 제거하고, 잔사를 600 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고 300 ml의 포화된 중탄산나트륨으로 세척하였다. 수성 상을 각각 300 ml의 디클로로메탄(DCM)으로 3회 세척하였다. 유기상을 합하고, 5%의 옥살산으로 수성상의 pH가 <5이 될 때까지 세척하였다. 용매를 증발 건조시켜 조 생성물 VP-U-1을 수득하고, 이를 VP-U-2의 후속적인 합성에서 직접 사용하였다.
조 생성물 VP-U-1을 100 ml의 디클로로메탄 속에 용해한 다음 빙욕 속에서 10분 동안 교반하였다. 냉장고 속에서 4℃로 예비 냉각시킨 450 ml의 2% p-톨루엔설폰산 용액(용매는 용적 비가 3:7인 메탄올과 디클로로메탄의 혼합된 용매이다)을 가하여 10분 동안 반응시켰다. 반응물을 200 ml의 포화된 중탄산나트륨을 가하여 퀀칭시켰다. 유기상을 포화된 중탄산나트륨 용액을 가하여 pH=8까지 세척하였다. 수성 상을 합하고 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 유기상을 합하고 200 ml의 포화된 염수로 1회 세척하였다. 용매를 증발 건조시켜 제거하고, 잔사를 정상 상 실리카 겔 컬럼(200 내지 300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 컬럼을 석유 에테르로 팩킹하고 석유 에테르:에틸 아세테이트:디클로로메탄:메탄올 = 1:1:1:0.05 내지 1:1:1:0.25의 구배 용출로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하고, 잔사를 진공 오일 펌프 속에서 발포-건조시켜 총 40.00 g의 순수한 생성물 VP-U-2를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (dtd, J = 5.1, 4.0, 2.2 Hz, 4H), 7.41-7.30 (m, 6H), 6.79 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.94 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.12 (td, J = 4.6, 3.9 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 4.8, 4.0 Hz, 1H), 3.96 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 3.68 (ddd, J = 11.8, 7.0, 4.6 Hz, 1H), 3.57 - 3.46 (m, 1H), 3.39 (s, 3H), 1.05 (s, 8H). MS m/z: C26H33N2O6Si, [M+H]+, 계산치: 497.21, 측정치: 497.45.
(1-3-2) VP-U-4의 합성
Figure pct00137
VP-U-2(19.84 g, 40.0 mmol), 디사이클로헥실카보디이미드(DCC, 16.48 g, 80.0 mmol), 피리딘(4.20 g, 53.2 mmol), 및 트리플루오로아세트산(6.61 g, 53.2 mmol)을 혼합하고 200 ml의 디메틸 설폭사이드(DMSO) 속에 용해하여 교반하에 실온에서 20시간 동안 반응시켰다. 별도로, 테트라에틸 메틸렌디포스페이트(21.44 g, 74.4 mmol)를 120 ml의 THF 속에 용해하고, 빙욕 속에서 냉각시키고, t-BuOK(11.36 g, 101.2 mmol)과 함께 빙욕의 온도에서 가하여 10분 동안 반응시키고, 실온으로 가온시켜 0.5 시간 동안 반응시키고 상기 반응 용액을 약 1시간에 걸쳐 가하였다. 반응을 빙욕의 온도에서 1시간 동안 수핸한 다음 실온으로 가온시켜 18시간 동안 반응시켰다. 반응물을 물을 가하여 퀀칭시켰다. 수성 상을 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고, 200 ml의 포화된 염수로 1회 세척하였다. 용매를 증발 건조시키고, 잔사를 정상 상 실리카 겔 컬럼(200 내지 300 메쉬)를 사용하여 정제하였다. 컬럼을 석유 에테르로 팩킹하고 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:1 내지 1:4의 구배 용출로 용출시켰다. 용출물을 수집하였다. 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하고, 잔사를 진공 오일 펌프 속에서 발포-건조시켜 총 14.00 g의 순수한 생성물 VP-U-4를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (dtd, J = 5.1, 4.0, 2.2 Hz, 4H), 7.41 - 7.30 (m, 6H), 6.82 - 6.71 (m, 2H), 5.90 (ddd, J = 25.9, 15.0, 1.0 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.36 - 4.21 (m, 3H), 4.18 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 4.05 (ddq, J = 9.7, 8.5, 6.9 Hz, 2H), 3.87 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.39 (s, 3H), 1.32 (td, J = 6.9, 0.7 Hz, 6H), 1.05 (s, 8H). MS m/z: C31H42N2O8PSi, [M+H]+, 계산치: 629.24, 측정치: 629.51.
(1-3-3) VP-U-5의 합성
Figure pct00138
VP-U-4(14.00 g, 22.29 mmol)을 100 ml의 테트라하이드로푸란 속에 용해하고, 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(17.96 g, 111.45 mmol)를 가하고, 실온에서 20시간 동안 교반하여 완전히 반응시켰다. 용매를 직접 증발 건조시키고, 잔사를 디클로로메탄 속에 용해한 다음, 용매를 다시 증발 건조시켰다. 상기 용해 및 증발 단계를 각각 50 ml의 디클로로메탄을 사용하여 2회 수행함으로써, 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 정상 상 실리카 겔 컬럼(200 내지 300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 컬럼을 석유 에테르로 팩킹하고 석유 에테르:에틸 아세테이트:디클로로메탄:메탄올 = 1:1:1:0.05 내지 1:1:1:0.25의 구배 용출로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조로 제거하고, 잔사를 진공 오일 펌프 속에서 발포-건조시켜 총 6.70 g의 순수한 생성물 VP-U-5를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 15.0, 6.2 Hz, 1H), 5.99 - 5.82 (m, 2H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.10 (dd, J = 5.3, 4.7 Hz, 1H), 4.29 (ddq, J = 9.8, 8.6, 7.0 Hz, 2H), 4.17 (ddd, J = 6.2, 5.2, 1.0 Hz, 1H), 4.12 - 3.98 (m, 3H), 3.39 (s, 2H), 1.32 (td, J = 6.9, 0.6 Hz, 6H). MS m/z: C15H24N2O8P, [M+H]+, 계산치: 391.13, 측정치: 391.38.
(1-3-4) VP-U-6의 합성
Figure pct00139
VP-U-5(391 mg, 1.0 mmol), 피리딘 트리플루오로아세테이트(0.232 g, 1.2 mmol), N-메틸이미다졸(0.099 g, 1.2 mmol), 및 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀(0.452 g, 1.5 mmol)을 10 ml의 무수 디클로로메탄에 아르곤 대기 하에 가하여 실온에서 교반하에 5시간 동안 반응시켰다. 용매를 증발 건조시킨 다음 잔사를 컬럼 크로마토그래피(200 내지 300 메쉬 정상 상 실리카 겔, 디클로로메탄:아세토니트릴(0.5 wt% 트리에틸아민 함유) = 3:1 내지 1:3의 구배 용출)으로 정제하였다. 용출물을 수집하고 농축시켜 용매를 제거함으로써 총 508 mg의 표적 생성물 VP-U-6을 수득하였다. 31P NMR(161 MHz, DMSO-d6) δ 150.34, 150.29, 17.07, 15.50. MS m/z: C24H41N4O9P2, [M+H]+, 계산치: 591.23, 측정치: 591.55. 상기 데이타는 VP-U-6이 표적 생성물 VP-Um이었고, 이는 RNA 가다의 합성시 뉴클레오시드 단량체로서 포함되었음을 나타내었다.
(1-3B) 접합체 6 및 8 내지 11의 안티센스 가닥의 제조
상응하는 뉴클레오시드 단량체를 차례로 각각 표 7에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 따라 연결시키는 것 외에, 접합체 6 및 8 내지 11의 안티센스 가닥을 합성하는 방법은 접합체 4의 안티센스 가닥의 합성 방법과 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드의 변형에 있어서만 상이하다. 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 따른 안티센스 가닥의 합성 동안, 2'-메톡시 변형된 구아닌 뉴클레오시드 단량체(Gm)를 마지막 뉴클레오시드 단량체로서 연결시킨 후, 화학식 (CPR-I)의 단량체(Suzhou GenePharma Inc.로부터 Cat# 13-2601-XX로 구입함)를 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4 단계 반응에 의해 안티센스 가닥의 5' 말단에 연결시켜 5'-포스페이트 변형을 형성시켰다.
Figure pct00140
합성 동안, 사용된 공통의 고체 상 지지체, 탈보호, 커플링, 캡핑, 산화 또는 황화 반응, 절단 및 탈보호, 정제 및 탈염의 조건은 센스 가닥의 합성시 사용된 것과 동일하였다.
순도는 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)로 검출하였고; 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)으로 분석하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치한다는 사실은 표적 서열을 가진 안티센스 가닥 AS가 합성되었음을 나타낸다.
(1-3C) 접합체 7의 안티센스 가닥의 제조
5'-포스포로티오에이트 변형을 지닌 접합체 7의 안티센스 가닥을, 산화 반응 조건을 CPR-I 단량체의 연결시 황화 반응 조건으로 대체하는 것 외에는, 단계 (1-3B)에서의 것과 동일한 합성 방법을 사용하여 제조하였다.
(1-4) 접합체 1-11의 합성
접합체 1을 위해, S 가닥 및 AS 가닥을 각각 주사용 수에 용해하여 40 mg/mL의 용액을 수득하였다. 이를 등몰 비로 혼합하고, 50℃에서 15분 동안 가열하고, 실온으로 냉각시켜 어닐링된 생성물을 생산한 다음 동결건조시켜 동결건조된 분말을 수득하였다. 접합체를 초-순수한 물(Milli-Q 초 순수한 물 장치를 사용하여 가정에서 제조, 18.2MΩ*cm의 저항(25℃))을 사용하여 0.2 mg/mL의 농도로 희석시키고, 분자량을 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS) 장치(Waters Corp.로부터 구입함, 모델: LCT Premier)으로 분석하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치한다는 사실은 합성된 접합체 1이 L-9 접합 분자를 지닌 설계된 이중 가닥 핵산 서열이었음을 나타낸다.
접합체 1의 센스 가닥을 상기 제조한 바와 같은 접합체 2-11의 센스 가닥으로 대체하고, 접합체 1의 안티센스 가닥을 상기 제조한 바와 같이 접합체 2-11의 안티센스 가닥으로 대체하는 것을 제외하고는, 접합체 2-11을 동일한 방법으로 합성하였다. 수득되는 접합체 2-11의 분자량을 각각 측정하여 측정된 값이 계산된 값과 일치하는지를 확인하였으며, 이는 합성된 접합체가 L-9 접합 분자를 지닌 설계된 표적 이중 가닥 핵산 서열이었음을 나타낸다.
접합체 1-11은 화학식 (403)으로 나타낸 구조를 갖는다.
[표 7]
Figure pct00141
Figure pct00142
제조 실시예 2 비교 접합체 1 및 2의 제조
본 제조 실시예에서, 비교 접합체 1 및 2를 합성하였다. 이러한 접합체내 접합된 siRNA는 표 7에 나타낸 바와 같은 서열을 가졌다. 접합될 접합 분자는 하기 단계 (2-1)에서 합성된 바와 같은 (GalNAc)3 접합 분자를 지칭한다. 접합체 각각은 제WO2016081444A1호에서의 화합물 AD-65704 및 AD-69535와 동일한 구조를 가졌다.
(2-1) (GalNAc)3 접합 분자의 합성
화합물 30, 즉, 상술한 링커 -(LA)3-트리하이드록시메틸아미노메탄-LB- 및 N-아세틸갈락토사민 분자를 표적화 그룹(여기서 각각의 LA는 하나의 N-아세틸갈락토사민 분자에 연결됨으로써 하나의 링커가 3개의 N-아세틸갈락토사민 분자에 연결될 수 있다)를 함유하는 접합 분자((GalNAc)3 접합 분자로 지칭함)를 제WO2014025805A1호의 실시예 17에 기술된 방법에 따라 합성하였다. 합성에 포함된 화학 반응 화학식 및 (GalNAc)3 접합 분자의 구조는 하기에 나타내었다:
Figure pct00143
(2-2) 고체 상 지지체에 연결된 (GalNAc)3 접합 분자의 제조
고체 상 지지체에 연결된 (GalNAc)3 접합 분자를, L-9 접합 분자를 (GalNAc)3 접합 분자로 대체함으로써 고체 상 지지체에 연결된 (GalNAc)3 접합 분자를 수득하는 것을 제외하고는, 제조 실시예 1의 단계 (1-1-5)와 동일한 방법을 사용함으로써 제조하였다.
(2-3) 비교 접합체 1 및 2의 합성
비교 접합체 1 및 2를, 1) 단계 (2-2)에서 수득된 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 개시하고; 2) 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 따른 안티센스 가닥의 제조 동안, 2'-메톡시 변형된 우라실 뉴클레오시드 단량체(Um)를 마지막 뉴클레오시드 단량체로서 연결시키고; 3) 접합된 siRNA 각각이 표 7에서 번호 (GalNAc)3-65704 및 (GalNAc)3-69535으로 나타낸 바와 같은 서열을 가진 것을 제외하고는, 제조 실시예 1의 것과 동일한 방법으로 제조하였다.
분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS) 장치(Waters Corp.로부터 구입함, 모델: LCT Premier)로 측정하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치한다는 사실은 합성된 접합체가 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 설계된 표적 화합물이었음을 입증한다.
실험 실시예 1: 시험관내 세포 시스템에서 siRNA 접합체의 억제 활성의 검출
실험 실시예 1-1 Huh 7에서 APOC3 mRNA의 발현 수준에 대한 siRNA 접합체의 억제 효과
본 실험 실시예에서, 시험관내 Huh 7 세포주에서 APOC3 mRNA의 발현 수준에 대한 접합체 1 내지 5의 억제 효능을 연구하였다.
접합체 1 내지 5를 사람 간 세포주 Huh7에 LipofectamineTM 2000을 사용하여 형질감염시켰다. siRNA 접합체의 최종 농도(siRNA의 양을 기준으로 함)는 각각 0.5 nM, 0.125 nM 및 0.03125 nM이었다. siRNA 접합체는 용액의 형태로 제공하였다. 특히, 실험 전에, siRNA 접합체를 DEPC 수에 용해시켜 목적한 농도를 지닌 용액을 수득하였다. siRNA 접합체로 형질감염되지 않은 세포를 농도 당 2개의 중복 웰을 사용하여, 블랭크 대조군으로서 사용하였다.
접합체 1 내지 5로 형질감염된 Huh 7 세포내에서 APOC3 mRNA의 발현 수준을 다양한 농도에서 정량적 실시간 PCR(Quantitative Real-Time PCR)을 사용하여 각각 측정하였다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: 형질감염된 세포의 배양 24시간 후, 총 RNA를 추출하고 트리졸(Thermo Fisher)을 사용하여 총 RNA 추출을 위한 표준 과정에 따라 추출하였다; 1 μg의 총 RNA를 취하고 역 전사 키트(Promega, Cat 번호 A3500)를 사용하여 이의 설명서의 과정에 따라 cDNA로 역 전사시켰다. APOC3 mRNA의 발현 수준을 2×Ultra SYBR 혼합물(ROX 함유) 키트(Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd, Cat 번호 CW0956)를 사용하여 주형으로서 cDNA로 설명서의 과정에 따라 측정하였다. 여기서, 내부 대조군 유전자로서 APOC3 및 GAPDH를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머는 표 8에 나타낸다.
[표 8]
Figure pct00144
APOC3 mRNA의 발현 수준을 다음의 수학식으로 계산하였다:
APOC3 mRNA의 발현 수준 = (시험 그룹내 APOC3 mRNA의 발현 수준/시험 그룹내 GAPDH mRNA의 발현 수준)/(대조군 그룹내 APOC3 mRNA의 발현 수준/대조군 그룹내 GAPDH mRNA의 발현 수준) × 100%.
APOC3 mRNA의 발현 수준에 대한 접합체의 억제율은 다음 수학식으로 계산하였다:
억제율 = (1 - APOC3 mRNA의 발현 수준) × 100%. 여기서, 시험 그룹은 각각 다양한 농도에서 접합체 1 내지 5로 처리한 Huh7 세포이고, 대조군 그룹은 접합체로 처리하지 않은 Huh 7 세포이다.
도 1은 형질감염되지 않은 Huh7 세포 및 상이한 접합체로 형질감염된 Huh7 세포내에서 상이한 최종 농도에서 APOC3 mRNA의 발현 수준을 나타내는 막대그래프이다(발현 수준은 사람 GAPDH의 것을 참고로 사용하였고, 블랭크 대조군에 대해 표준화하였다).
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 Huh7 세포주에서 보다 높은 억제 활성을 나타내었고; 0.5 nM에서 접합체는 APOC3 mRNA의 발현 수준에 대해 60% 이상의 억제율을 나타내었다. 본 개시내용의 siRNA 접합체 모두는 모든 농도에서 비교 접합체 1의 것보다 더 높은 억제 활성을 나타내었다.
실험 실시예 1-2: Huh7 세포주내에서 APOC3 mRNA에 대한 siRNA 접합체의 IC 50 의 측정
당해 실험 실시예는 Huh7 세포주내에서 APOC3 mRNA에 대한 접합체 6 및 8 내지 11에 대한 IC50 값을 측정하였다.
접합체 6 및 8 내지 11을 실험 실시예 1-1과 동일한 방법으로 형질감염시키고, 접합체의 최종 농도(siRNA의 농도를 기반으로 계산함)가 3 nM 내지 0.004 nM(7개 농도의 3배 일련 희석)임을 제외하고는, 각각의 그룹에서 APOC3 mRNA의 발현 수준을 측정하였다. 용량-반응 곡선을 접합체의 상이한 농도에서 측정된 APOC3 mRNA의 발현 수준으로 플롯팅하고, 곡선을 함수 로그(억제제) 대 반응-Graphpad 5.0 소프트웨어의 다양한 기울기를 사용하여 조정하였다. 각각의 접합체의 IC50을 용량-반응 곡선을 기반으로 계산하였다.
Figure pct00145
여기서:
Y는 남아있는 mRNA의 발현 수준이고,
X는 형질감염된 접합체의 농도의 대수이고,
Bot는 정지상(steady phase)의 하단에서의 Y 값이고,
Top은 정지 상의 상단에서의 Y 값이고,
LogIC50은 Y가 하단과 상단 사이의 중간 값인 곳에서의 X 값이고, 사면(HillSlope)은 곡선의 기울기이다.
시험관내 Huh7 세포에서 접합체 6 및 8 내지 11의 IC50 값은 각각 0.01002 nM, 0.008159 nM, 0.05375 nM, 0.01933 nM, 및 0.01949 nM인 것으로 측정되었으며, 이는 본 개시내용의 siRNA 접합체가 시험관내 표적 mRNA의 발현 수준에 대해 보다 높은 억제 활성을 나타내었음을 나타낸다.
실험 실시예 2 당해 실험은 본 개시내용의 siRNA 접합체의 혈액 지질 함량을 감소시키는 생체내 효과를 연구하였다.
실험 실시예 2-1 본 실험은 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세라이드(TG)의 함량을 감소시키기 위한 접합체 2, 4 및 5의 생체내 효과를 연구하였다.
혈청 TG 함량이 > 2mmol/L인 사람 APOC3 유전자이식 마우스(B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J)를 다음과 같이 그룹(그룹 당 7마리 마우스)으로 무작위로 나누었다: (1) 정상의 염수 대조군 그룹; (2) 접합체 2: 3 mg/kg 그룹; (3) 접합체 2: 1 mg/kg 그룹; (4) 접합체 4: 3mg/kg 그룹; (5) 접합체 4: 1 mg/kg 그룹; (6) 접합체 5: 3mg/kg 그룹; 및 (7) 접합체 5: 1mg/kg 그룹. 모든 동물에 대한 투여 투여량을 체중에 따라 게산하고 단일 투여로서 피하 주사하였고, 여기서 siRNA 접합체는 농도가 0.6 mg/ml 및 0.2 mg/ml인 0.9 wt% NaCl 수성 용액으로 제공하였다. 특히, 실험 전에, siRNA 접합체를 0.9 wt% NaCl 수성 용액 속에 용해하여 목적한 농도를 지닌 용액을 수득하였다. 정상의 염수 및 siRNA 접합체에 대한 투여 용적은 5 mL/kg이었다.
혈액을 마우스 궤도 정맥 플렉서스(mouse orbital venous plexus)로부터 투여 전(0일로 표시함) 및 투여 후 각각 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63, 77, 91, 112, 133, 147, 161, 175, 및 189일째에 취하였다. 혈청 중 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세라이드(TG)의 함량을 각각의 시점에서 측정하였다.
약 100 μl의 혈액을 매회 궤도로부터 취하고, 혈청은 원심분리 후 20 μl 이상이었다. 혈청 중 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세라이드(TG)의 함량을 PM1P000/3 완전 자동 혈청 생화학적 분석기(full-automatic serum biochemical analyzer)(SABA)를 사용하여 추가로 측정하였다.
표준화된 혈액 지질 수준 = (투여 후 시험 그룹내 혈액 지질 함량/투여 전 시험 그룹내 혈액 지질 함량) × 100%.
혈액 지질 수준에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 시험 그룹내 혈액 지질 함량/투여 전 시험 그룹내 혈액 지질 함량) × 100%. 혈액 지질은 총 콜레스테롤(CHO) 또는 트리글리세라이드(TG)를 지칭한다.
도 2a 내지 2d는 정상의 염수 및 접합체 2, 4 및 5를 상이한 용량으로 투여받은 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 시간에 걸쳐 총 콜레스테롤(CHO) 수준 및 트리글리세라이드(TG) 수준의 변화를 나타내는 다이아그램이다. 이러한 도에서, 투여 전 시험 그룹은 D0일로 표시하고; 혈청 중 각각의 CHO 수준 및 TG 수준을 D0일에서 값에 대해 표준화하였다.
도 2a로부터 알 수 있는 바와 같이, 단일 투여 후 3 mg/kg 용량 그룹에서 3개의 접합체는 77일까지의 기간에 걸쳐 TG에 대해 70% 내지 90%의 억제율, 및 147일까지의 기간에 걸쳐 TG에 대해 약 50% 이하의 억제율을 나타낸다.
도 2b로부터 알 수 있는 바와 같이, 1 mg/kg 용량 그룹에서 3개의 접합체는 단일 투여 후 7일 째에 TG에 대해 약 80% 억제율을 나타내고, 49일까지의 기간에 걸쳐 50% 이상까지 TG 함량을 감소시키는 효과를 지속적으로 나타낸다.
도 2c로부터 알 수 있는 바와 같이, 단일 투여 후, 3 mg/kg 용량 그룹에서 3개의 접합체는 77일까지의 기간에 걸쳐 CHO에 대해 약 50%의 억제율을 실질적으로 유지한다.
도 2d로부터 알 수 있는 바와 같이, 1 mg/kg 용량 그룹에서 3개의 그룹은 단일 투여 후 35일 째에 적어도 약 50%까지 CHO 함량을 감소시키는 효과를 여전히 나타낸다.
도 2a 내지 2d의 결과는 투여 후 상이한 시점에서 마우스 혈청내 TG 및 CHO의 함량을 실질적으로 감소시키는 효과를 나타내며, 이는 본 개시내용의 siRNA 접합체가 보다 긴 기간에 걸쳐 혈액 지질 수준을 안정하게 및 효과적으로 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
실험 실시예 2-2: 본 실시예는 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세라이드(TG)의 함량을 감소시키는 접합체 1의 생체내 효과를 연구하였다.
각각의 시험 그룹이 6마리의 마우스를 포함하고, 투여될 접합체가 접합체 1 및 비교 접합체 2이고; 시험을 투여 후 112일까지 지속하는 것을 제외하고는, 측정을 실험 실시예 2-1에서의 것과 동일한 방법으로 수행하였다.
도 3a 내지 3b는 정상의 염수 및 접합체 1 및 비교 접합체 2를 상이한 용량에서 투여받은 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청에서 시간에 걸쳐 총 콜레스테롤(CHO) 수준 및 트리글리세라이드(TG) 수준의 변화를 나타내는 다이아그램이다. 이러한 도에서, 투여 전 시험 그룹은 D0일로 표시하였고; 혈청 속의 각각의 CHO 수준 및 TG 수준을 D0일째의 값에 대해 표준화하였다.
도 3a 내지 3b로부터 알 수 있는 바와 같이, 3 mg/kg의 용량 그룹 및 1 mg/kg의 용량 그룹에서, 접합체 1은 112일까지의 기간에 걸쳐 유전자이식 마우스에서 TG 및 CHO 수준을 유의적으로 감소시킬 수 있으며, 이러한 감소 효과는 비교 접합체 2의 것보다 유의적으로 더 우수하다. 3 mg/kg 용량 그룹 및 1 mg/kg 용량 그룹 둘 다에서, 접합체 1은 단일 투여 후 56일에 걸쳐서 TG 및 CHO에 대해 50% 이상의 억제율을 나타내고, TG에서 억제 효과가 보다 유의적이며; 2개 용량의 접합체 1은 112일까지의 기간에 걸쳐 약 50%의 TG 수준을 지속적으로 유지한다.
실험 실시예 2-3: 본 실시예는 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세라이드(TG)의 함량을 감소시키기 위한 접합체 3의 생체내 효과를 연구하였다.
측정은, 각각의 시험 그룹이 6마리의 마우스를 포함하였고; 투여될 접합체가 접합체 3이고; 접합체 3을 정상의 염수(NS)대신에 1 X PBS 완충제 용액 속에 용해하여 목적한 농도를 지닌 용액을 수득하였고, 1×PBS 완충제 용액을 실험에서 블랭크 대조군으로 사용하였고; 시험을 투여 후 112일까지 지속한 것을 제외하고는, 실험 실시예 2-1에서의 것과 동일한 방법으로 수행하였다.
도 4a 내지 4b는 PBS 및 접합체 3을 상이한 용량으로 투여한 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 시간에 걸쳐 총 콜레스테롤(CHO) 수준 및 트리글리세라이드(TG) 수준의 변화를 나타내는 다이아그램이다. 이러한 도에서, 투여 전 시험 그룹은 D0일로 표시하였고; 혈청 속의 각각의 CHO 수준 및 TG 수준은 D0일에서 값에 대해 표준화하였다.
도 4a로부터 알 수 있는 바와 같이, 3 mg/kg의 용량 그룹에서, 접합체 3은 단일 투여 후 14일째에 TG에 대해 93.6%까지의 억제율을 나타내고, 투여 후 98일째에 TG에 대해 66.4%의 억제율을 나타낸다. 1 mg/kg의 용량 그룹에서, 접합체 3은 단일 투여 후 14일째에 TG에 대해 93.3%까지의 억제율을 나타내고, 투여 후 98일째에 TG에 대해 37.7%의 억제율을 여전히 나타낸다.
도 4b로부터 알 수 있는 바와 같이, 3 mg/kg의 용량 그룹에서, 접합체 3은 단일 투여 후 7일째에 CHO에 대해 63.0%까지의 억제율을 나타내고, 투여 후 98일째에 CHO에 대해 49.2%의 억제율을 나타낸다. 1 mg/kg의 용량 그룹에서, 접합체 3은 단일 투여 후 7일째에 CHO에 대해 52.2%까지의 억제율을 나타낸다.
도 4a 및 4b의 결과는 접합체 3이 유전자이식 마우스에서 TG 및 CHO 수준을 98일 까지의 기간에 걸쳐 유의적으로 감소시키며, 이러한 감소 효과가 명백한 용량-의존성 효과를 가짐을 나타낸다.
실험 실시예 2-4: 본 실험은 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세라이드(TG)의 함량을 감소시키기 위한 접합체 4의 생체내 효과를 연구하였다.
측정은 각각의 시험 그룹이 8마리의 마우스를 포함하였고; 투여될 접합체가 접합체 4이었고; 접합체 4를 각각 3회 용량의 0.3 mg/kg, 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 용량에서 투여한 반면, 투여 용적을 변화시키지 않았고; 시험을 화합물의 투여 후 133일까지 지속하는 것을 제외하고는, 실험 실시예 2-1에서와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 5a 내지 5b는 정상의 염수 및 접합체 4를 상이한 용량으로 투여한 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 시간에 걸쳐 총 콜레스테롤(CHO) 수준 및 트리글리세라이드(TG) 수준의 변화를 나타내는 다이아그램이다. 이러한 도에서, 투여 전 시험 그룹은 D0일로 표시하였고; 혈청 속의 각각의 CHO 수준 및 TG 수준은 D0일에서 값에 대해 표준화하였다. 도 5a 내지 5b의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 3개 용량에서, 접합체 4는 사람 APOC3 유전자이식 마우스에서 지질을 유의적으로 감소시키는 효과를 나타내며, 감소 효과는 용량-의존적이다. 3 mg/kg의 용량 그룹에서, 접합체 4는 133일째에 TG에 대해 50% 까지의 억제율을 여전히 나타낸다.
도 5a 내지 5b는 정상의 염수 및 접합체 4를 상이한 용량에서 투여받은 사람 POC3 유전자이식 마우스의 혈청에 걸쳐 총 콜레스테롤(CHO) 수준 및 트리글리세라이드(TG) 수준의 변화를 나타내는 다이아그램이다. 이러한 도에서, 투여 전 시험 그룹을 D0일로 표시하고; 혈청 속의 각각의 CHO 수준 및 TG 수준을 D0일째에 값에 대해 표준화시켰다. 도 5a 내지 5b의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 3개의 용량에서 접합체 4는 사람 APOC3 유전자이식 마우스에서 지질을 유의적으로 감소시키는 효과를 나타내고, 감소 효과는 용량-의존성이다. 3 mg/kg 용량 그룹에서 접합체 4는 133일째에 TG에 대해 50%까지의 억제율을 여전히 나타낸다.
실험 실시예 2-5: 본 실험은 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세라이드(TG)의 함량을 감소시키기 위한 접합체 4, 6 및 7의 생체내 효과를 연구하였다.
측정은 각각의 시험 그룹이 6마리의 마우스를 포함하였고; 투여될 접합체가 접합체 4, 6 및 7 및 비교 접합체 2이고; 시험을 투여 후 122일까지 지속하는 것을 제외하고는, 실험 실시예 2-1에서와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 6a 내지 6d는 정상의 염수 및 접합체 4, 6 및 7 및 비교 접합체 2를 상이한 용량에서 투여받은 사람 POC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 총 콜레스테롤(CHO) 수준 및 트리글리세라이드(TG) 수준의 변화를 나타내는 다이아그램이다. 이러한 도에서, 투여 전 시험 그룹을 D0일로 표시하고; 혈청 속의 각각의 CHO 수준 및 TG 수준을 D0일째에 값에 대해 표준화시켰다.
도 6a 내지 6d의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 접합체 4, 6 및 7은 2개의 용량에서 사람 APOC3 유전자이식 마우스에서 혈액 지질을 유의적으로 감소시키는 효과를 나타낸다. 3 mg/kg 용량 그룹에서 접합체 4, 6 및 7은 투여 후 84일째에 TG에 대해 50% 이상의 억제율 또는 CHO에 대해 30% 이상의 억제율을 지속적으로 유지한다. 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 용량에서 접합체 4, 6 및 7은 비교 접합체 2의 것보다 TG에 있어서 더 높은 억제 효과를 지속적으로 나타내며, 동일한 경향성이 또한 CHO에서의 억제 효과에 대해 관찰된다는 것은 주목할 만 하다.
실험 실시예 2-6: 본 실험은 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세라이드(TG)의 함량을 감소시키기 위한 상이한 농도에서 접합체 8 및 9의 생체내 효과를 시험하였다.
측정은 각각의 시험 그룹이 8마리의 마우스를 포함하였고; 투여될 접합체가 접합체 8 및 9이었고; 접합체가 각각 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 및 9 mg/kg의 5개 용량으로 투여되었으며; 투여 용적은 변하지 않고 남았지만 접합체 용액의 농도는 상응하게 조절되었고; 시험은 투여 후 147일까지 지속되었음을 제외하고는, 실험 실시예 2-1에서와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 7a 내지 7d는 정상의 염수 및 접합체 8 및 9를 상이한 용량에서 투여받은 사람 POC3 유전자이식 마우스의 혈청 속에서 시간에 걸쳐 총 콜레스테롤(CHO) 수준 및 트리글리세라이드(TG) 수준의 변화를 나타내는 다이아그램이다. 이러한 도에서, 투여 전 시험 그룹을 D0일로 표시하고; 혈청 속의 각각의 CHO 수준 및 TG 수준을 D0일째에 값에 대해 표준화시켰다.
도 7a 내지 7d의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 접합체 8 및 9는 5개의 용량에서 사람 APOC3 유전자이식 마우스에서 지질을 유의적으로 감소시키는 효과를 나타내며, 감소 효과는 용량 의존적이다.
또한, 사람 APOC3 유전자이식 마우스에서 상이한 시점에서 TG 수준을 억제하기 위한 접합체 8 및 9의 EC50 값을 상이한 시점에서 TG에 대해 상이한 용량에서 접합체의 억제율을 기반으로 측정하였다.
용량-반응 곡선을 접합체 8 및 9를 상이한 용량에서 사용하는 경우 상이한 시점에서 측정된 혈청 TG 수준에 따라 플롯팅하고, 곡선을 함수 로그(억제제) 대 반응-Graphpad 5.0 소프트웨어의 다양한 기울기를 사용하여 조정하였다. 각각의 접합체의 IC50 값을 용량-반응 곡선을 기반으로 계산하였다.
Figure pct00146
여기서:
Y는 측정된 혈청 TG 수준이고(D0일에 TG 수준에 대해 표준화시킴),
X는 동일한 시점에 형질감염된 접합체의 용량의 대수이고,
Bot는 정지상의 하단에서의 Y 값이고,
Top은 정체 상의 상단에서의 Y 값이고,
LogIC50은 Y가 하단과 상단 사이의 중간 값인 곳에서 X 값이고,
사면(HillSlope)은 곡선의 기울기이다.
단일 투여 후 상이한 시점에서 TG를 억제하기 위한 접합체 8 및 9의 계산된 EC50 값을 표 9에 나타내었다.
[표 9]
Figure pct00147
표 9에 나타낸 결과에 따라, 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 경우, 투여후 심지어 1/2개월째에, 0.16 mg/kg의 접합체 8 또는 0.11 mg/kg의 접합체 9의 단일 피하 주사는 TG 함량의 1/2을 감소시키는 효능을 여전히 실현시킬 수 있었으며; 투여 후 심지어 1개월째에도, 1 mg/kg 미만의 본 개시내용의 접합체의 단일 피하 투여는 TG 함량의 1/2을 감소시키는 효과를 여전히 실현시킬 수 있었다.
실험 실시예 3: 본 실험 실시예는 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 생체내 간 조직에서 APOC3 mRNA의 발현 수준에 대한 접합체 4의 억제율을 시험하였다.
실험 전에, 사람 APOC3 유전자이식 마우스(B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J)내 혈청 트리글리세라이드(TG) 함량을 측정하였다. 혈청 TG 함량이 > 2 mmol/L인 유전자이식 마우스를 선택하고 그룹으로 무작위로 나누었다. 시험 그룹 각각은 5마리의 마우스를 포함하였고; 블랭크 대조군 그룹(NS를 투여함)은 4마리의 마우스를 포함하였다. 접합체 4 및 정상의 염수(NS)를 각각 그룹내 마우스에 투여하였다. 모든 동물에 대한 투여 투여량은 체중에 따라 계산하였고 단일 투여로서 피하 주사하였다. siRNA 접합체는 1 mg/kg 및 0.1 mg/kg(siRNA의 양을 기반으로 함)의 2회 용량으로 투여하였으며, 여기서 siRNA 접합체는 0.2 mg/ml 및 0.02 mg/ml의 농도를 지닌 0.9 wt% NaCl 수성 용액으로 제공하였고, 투여 용적은 5 mL/kg이다. 마우스를 투여 14일째에 희생시키고 간 조직을 수집하고 이후에 RNA로 저장하였다(Sigma Aldrich). 후속적으로, 간 조직을 조직 균질화기로 균질화한 다음, 간 조직내 총 RNA를 추출하고 트리졸(Thermo Fisher)을 사용하여 총 RNA 추출을 위한 표준 과정에 따라 수득하였다.
간 조직에서 APOC3 mRNA의 발현 수준은 당해 형광성 qPCR 방법에서, β-액틴 유전자를 내부 대조군 유전자로서 사용하고, APOC3 및 β-액틴의 발현 수준을 APOC3 및 β-액틴에 대한 프라이머를 각각 사용하여 측정한 것을 제외하고는 실험 실시예 1-1에서 사용된 것과 동일한 정량적 실시간 PCR 방법으로 측정하였다.
검출용 프라이머의 서열은 표 10에 나타내었다.
[표 10]
Figure pct00148
간에서 APOC3 mRNA의 발현 수준 및 APOC3 mRNA에 대한 접합체의 억제율은 실험 실시예 1-1에서 사용된 것과 동일한 방법으로 계산하였다. 당해 실험에서, 대조군 그룹내 마우스에게 정상 염수(NS)를 투여하고; 시험 그룹내 마우스에게 상이한 농도의 siRNA 접합체를 각각 투여하였다.
도 8은 정상의 염수(NS) 및 접합체 4를 상이한 용량으로 투여받은 사람 APOC3 유전자이식 마우스의 생체내 간 조직에서 APOC3 mRNA의 발현 수준을 나타내는 산포도이다(발현 수준은 마우스 β-액틴 유전자의 것을 참고로 사용하였고, 블랭크 대조군 NS에 대해 표준화하였다).
결과는 1 mg/kg 및 0.1 mg/kg의 접합체 4의 단일 투여가 유전자이식 마우스에서 사람 APOC3 유전자에서 유의적인 억제 효과를 가질 수 있음을 나타낸다. 특히, 1 mg/kg의 접합체 4는 APOC3 mRNA에 대해 82.0%의 억제율을 나타내고, 0.1 mg/kg의 접합체 4는 APOC3 mRNA에 대해 40.4%의 억제율을 나타낸다.
본 개시내용의 일부 구현예를 상기에 상세히 기술하나, 본 개시내용은 상기 구현예의 구체적인 세부사항에 한정되지 않는다. 본 개시내용의 기술적 해결에 대한 다양한 단순한 변화가 본 개시내용의 기술적 개념 영역내에서 이루어질 수 있으며, 이러한 단순한 변형은 또한 본 개시내용의 영역내에 있다.
상기 구현예에 기술된 구체적인 기술적 특징 각각은 모순이 유발되지 않는 한 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있음이 주목되어야 한다. 불필요한 반복을 피하기 위하여, 다양한 가능한 조합 방식은 본 개시내용에 더 이상 기술되어 있지 않다.
또한, 본 개시내용의 다양한 상이한 구현예는 이것이 본 개시내용의 사상으로부터 벗어나지 않는 한 조합될 수 있으며, 이는 또한 본 개시내용의 개시내용으로 고려되어야 한다.
참고에 의한 혼입
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허원은 각각의 공보, 특허 및 특허원이 구체적으로 및 별도로 참고에 의해 본원에 포함되는 경우와 같은 정도로 본원에 참고로 포함된다.
<110> SUZHOU RIBO LIFE SCIENCE CO., LTD. <120> NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID, PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF <130> PI21-0104 <150> CN 201811622633.0 <151> 2018-12-28 <160> 430 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Za1, Za1 is A <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 1 uuaaaaggga caguauucn 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Za2, Za2 is U <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 2 ngaauacugu cccuuuuaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Za3, Za3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 3 uuaaaaggga caguauucn 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Za4, Za4 is a nucleotide complementary to Za3, Za3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 4 ngaauacugu cccuuuuaa 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Za3, Za3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 5 uuaaaaggga caguauucn 19 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Za4, Za4 is a nucleotide complementary to Za3, Za3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 6 ngaauacugu cccuuuuaag c 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Za3, Za3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (21) <400> 7 gcuuaaaagg gacaguauuc n 21 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Za4, Za4 is a nucleotide complementary to Za3, Za3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 8 ngaauacugu cccuuuuaag caa 23 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 uuaaaaggga caguauucu 19 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 10 agaauacugu cccuuuuaag c 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 gcuuaaaagg gacaguauuc u 21 <210> 12 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 agaauacugu cccuuuuaag caa 23 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zb1, Zb1 is A <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 13 acaguauucu cagugcucn 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zb2, Zb2 is U <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 14 ngagcacuga gaauacugu 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zb3, Zb3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 15 acaguauucu cagugcucn 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zb4, Zb4 is a nucleotide complementary to Zb3, Zb3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 16 ngagcacuga gaauacugu 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zb3, Zb3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 17 acaguauucu cagugcucn 19 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zb4, Zb4 is a nucleotide complementary to Zb3, Zb3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 18 ngagcacuga gaauacuguc c 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zb3, Zb3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (21) <400> 19 ggacaguauu cucagugcuc n 21 <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zb4, Zb4 is a nucleotide complementary to Zb3, Zb3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 20 ngagcacuga gaauacuguc ccu 23 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 21 acaguauucu cagugcucu 19 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 22 agagcacuga gaauacuguc c 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 23 ggacaguauu cucagugcuc u 21 <210> 24 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 24 agagcacuga gaauacuguc ccu 23 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zc1, Zc1 is A <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 25 uauucucagu gcucuccun 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zc2, Zc2 is U <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 26 naggagagca cugagaaua 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zc3, Zc3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 27 uauucucagu gcucuccun 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zc4, Zc4 is a nucleotide complementary to Zc3, Zc3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 28 naggagagca cugagaaua 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zc3, Zc3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 29 uauucucagu gcucuccun 19 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zc4, Zc4 is a nucleotide complementary to Zc3, Zc3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 30 naggagagca cugagaauac u 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zc3, Zc3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (21) <400> 31 aguauucuca gugcucuccu n 21 <210> 32 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zc4, Zc4 is a nucleotide complementary to Zc3, Zc3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 32 naggagagca cugagaauac ugu 23 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 33 uauucucagu gcucuccua 19 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 34 uaggagagca cugagaauac u 21 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 35 aguauucuca gugcucuccu a 21 <210> 36 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 36 uaggagagca cugagaauac ugu 23 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zd1, Zd1 is A <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 37 aguauucuca gugcucucn 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zd2, Zd2 is U <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 38 ngagagcacu gagaauacu 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zd3, Zd3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 39 aguauucuca gugcucucn 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zd4, Zd4 is a nucleotide complementary to Zd3, Zd3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 40 ngagagcacu gagaauacu 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zd3, Zd3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 41 aguauucuca gugcucucn 19 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zd4, Zd4 is a nucleotide complementary to Zd3, Zd3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 42 ngagagcacu gagaauacug u 21 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zd3, Zd3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (21) <400> 43 acaguauucu cagugcucuc n 21 <210> 44 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Zd4, Zd4 is a nucleotide complementary to Zd3, Zd3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 44 ngagagcacu gagaauacug ucc 23 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 45 aguauucuca gugcucucc 19 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 46 ggagagcacu gagaauacug u 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 47 acaguauucu cagugcucuc c 21 <210> 48 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 48 ggagagcacu gagaauacug ucc 23 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Ze1, Ze1 is A <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 49 ggacaguauu cucagugcn 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Ze2, Ze2 is U <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 50 ngcacugaga auacugucc 19 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Ze3, Ze3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 51 ggacaguauu cucagugcn 19 <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Ze4, Ze4 is a nucleotide complementary to Ze3, Ze3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 52 ngcacugaga auacugucc 19 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Ze3, Ze3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 53 ggacaguauu cucagugcn 19 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Ze4, Ze4 is a nucleotide complementary to Ze3, Ze3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 54 ngcacugaga auacuguccc u 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Ze3, Ze3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (21) <400> 55 agggacagua uucucagugc n 21 <210> 56 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Ze4, Ze4 is a nucleotide complementary to Ze3, Ze3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 56 ngcacugaga auacuguccc uuu 23 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 57 ggacaguauu cucagugcu 19 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 58 agcacugaga auacuguccc u 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 59 agggacagua uucucagugc u 21 <210> 60 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 60 agcacugaga auacuguccc uuu 23 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 61 uuaaaaggga caguauucu 19 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 62 agaauacugu cccuuuuaag c 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 63 gcuuaaaagg gacaguauuc u 21 <210> 64 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 64 agaauacugu cccuuuuaag caa 23 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 65 uuaaaaggga caguauucu 19 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 66 agaauacugu cccuuuuaag c 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 67 gcuuaaaagg gacaguauuc u 21 <210> 68 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 68 agaauacugu cccuuuuaag caa 23 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 69 uuaaaaggga caguauucu 19 <210> 70 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 70 agaauacugu cccuuuuaag c 21 <210> 71 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 71 gcuuaaaagg gacaguauuc u 21 <210> 72 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 72 agaauacugu cccuuuuaag caa 23 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 73 acaguauucu cagugcucu 19 <210> 74 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 74 agagcacuga gaauacuguc c 21 <210> 75 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 75 ggacaguauu cucagugcuc u 21 <210> 76 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 76 agagcacuga gaauacuguc ccu 23 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 77 acaguauucu cagugcucu 19 <210> 78 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 78 agagcacuga gaauacuguc c 21 <210> 79 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 79 ggacaguauu cucagugcuc u 21 <210> 80 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 80 agagcacuga gaauacuguc ccu 23 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 81 acaguauucu cagugcucu 19 <210> 82 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 82 agagcacuga gaauacuguc c 21 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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gagaauacug ucc 23 <210> 399 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 399 ggacaguauu cucagugca 19 <210> 400 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 400 ugcacugaga auacuguccc u 21 <210> 401 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 401 agggacagua uucucagugc a 21 <210> 402 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 402 ugcacugaga auacuguccc uuu 23 <210> 403 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 403 ggacaguauu cucagugca 19 <210> 404 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 404 ugcacugaga auacuguccc u 21 <210> 405 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 405 agggacagua uucucagugc a 21 <210> 406 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 406 ugcacugaga auacuguccc uuu 23 <210> 407 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 407 ggacaguauu cucagugca 19 <210> 408 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 408 ugcacugaga auacuguccc u 21 <210> 409 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 409 agggacagua uucucagugc a 21 <210> 410 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 410 ugcacugaga auacuguccc uuu 23 <210> 411 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 411 ggacaguauu cucagugca 19 <210> 412 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 412 ugcacugaga auacuguccc u 21 <210> 413 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 413 agggacagua uucucagugc a 21 <210> 414 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 414 ugcacugaga auacuguccc uuu 23 <210> 415 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 415 ggacaguauu cucagugca 19 <210> 416 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 416 ugcacugaga auacuguccc u 21 <210> 417 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 417 agggacagua uucucagugc a 21 <210> 418 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 418 ugcacugaga auacuguccc uuu 23 <210> 419 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 419 ggacaguauu cucagugca 19 <210> 420 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 420 ugcacugaga auacuguccc u 21 <210> 421 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 421 agggacagua uucucagugc a 21 <210> 422 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 422 ugcacugaga auacuguccc uuu 23 <210> 423 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 423 uuaaaaggga caguauucu 19 <210> 424 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 424 agaauacugu cccuuuuaag c 21 <210> 425 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 425 ggacaguauu cucagugcu 19 <210> 426 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 426 agcacugaga auacuguccc u 21 <210> 427 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 427 acaguauucu cagugcucu 19 <210> 428 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 428 agagcacuga gaauacuguc c 21 <210> 429 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 429 uauucucagu gcucuccua 19 <210> 430 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 430 uaggagagca cugagaauac u 21

Claims (58)

  1. 화학식 (308)로 나타낸 구조를 갖는 siRNA 접합체:
    Figure pct00149

    화학식(308),

    상기 화학식 (308)에서,
    n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이고;
    m1, m2, 및 m3은 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
    R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 서로 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    R3은 화학식 (A59)로 나타낸 구조를 갖는 그룹이고:
    Figure pct00150

    화학식 (A59)

    상기 화학식 (A59)에서,
    E1은 OH, SH 또는 BH2이고;
    Nu는 siRNA이고;
    siRNA는 센스 가닥(sense strand) 및 안티센스 가닥(antisense strand)을 포함하고; siRNA내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 다음의 그룹 i) 내지 v) 중 하나로부터 선택된 서열이고:
    i) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1(SEQ ID NO: 1)로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Za1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Za2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za4를 포함하고, 여기서 Za4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 13으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Zb1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb3를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zb2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb4를 포함하고, 여기서 Zb4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 25는 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Zc1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zc3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zc2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zc4를 포함하고, 여기서 Zc4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 37로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Zd1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Zd2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd4를 포함하고, 여기서 Zd4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이거나; 또는
    v) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 49로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I은 Ze1 에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Ze2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze4를 포함하고, 여기서 Ze4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이고;
    R2는 길이가 1 내지 20개 탄소 원자인 선형의 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 임의 치환되고; 여기서 R2는 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬페닐), -NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
    각각의 L1은 길이가 1 내지 70개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 임의 치환되고; 여기서 L1은 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), -NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
    Figure pct00151
    는 그룹이 분자의 나머지에 연결된 부위를 나타내고;
    M1은 표적화 그룹(targeting group)을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 L1이 화학식 (A1) 내지 (A26)의 그룹 중 하나 이상의 연결 조합으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 siRNA 접합체:
    Figure pct00152

    여기서 j1은 1 내지 20의 정수이고;
    j2는 1 내지 20의 정수이고;
    R'는 C1-C10 알킬이고;
    Ra는 화학식 (A27) 내지 (A45)의 그룹 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
    Figure pct00153

    Figure pct00154

    Rb는 C1-C10 알킬이이거나;
    L1은 화학식 (A1), (A4), (A5), (A6), (A8), (A10), (A11), 및 (A13) 중 하나 이상의 연결 조합으로부터 선택되거나;
    L1은 화학식 (A1), (A4), (A8), (A10) 및 (A11) 중 적어도 2개의 연결 조합으로부터 선택되거나;
    L1은 화학식 (A1), (A8), 및 (A10) 중 적어도 2개의 연결 조합으로부터 선택되거나;
    L1은 3 내지 25개 원자의 길이를 가지거나;
    L1은 4 내지 15개 원자의 길이를 갖는다.
  3. 제2항에 있어서, j1이 2 내지 10의 정수이고; j2가 2 내지 10의 정수이고; R'가 C1-C4 알킬이거나; Ra가 A27, A28, A29, A30, 및 A31 중 하나이고; Rb가 C1-C5 알킬이거나;
    j1이 3 내지 5의 정수이고; j2가 3 내지 5의 정수이고; R'가 메틸, 에틸, 및 이소프로필 중 하나이고; Ra가 화학식 A27 또는 A28로 나타낸 그룹이고; Rb가 메틸, 에틸, 이소프로필, 및 부틸 중 하나인 siRNA 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n1이 1 또는 2의 정수이고; n3이 0 또는 1의 정수이고; n1+n3이 2 내지 3인 siRNA 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, m1, m2 및 m3이 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수, 및/또는 m1 = m2 = m3인 siRNA 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 그룹 각각이 독립적으로 포유동물 간 세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는 리간드이거나;
    표적화 그룹 각각이 독립적으로 아시알로당단백질 또는 사카라이드이거나;
    표적화 그룹 각각이 D-만노피라노즈, L-만노피라노즈, D-아라비노즈, D-크실로푸라노즈, L-크실로푸라노즈, D-글루코즈, L-글루코즈, D-갈락토즈, L-갈락토즈, α-D-만노푸라노즈, β-D-만노푸라노즈, α-D-만노피라노즈, β-D-만노피라노즈, α-D-글루코피라노즈, β-D-글루코피라노즈, α-D-글루코푸라노즈, β-D-글루코푸라노즈, α-D-프럭토푸라노즈, α-D-프럭토피라노즈, α-D-갈락토피라노즈, β-D-갈락토피라노즈, α-D-갈락토푸라노즈, β-D-갈락토푸라노즈, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오로아세틸갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노즈, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노즈, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노즈, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노즈, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노즈, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노즈, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스, L-4-티오리보스로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되거나; 표적화 그룹 중 적어도 하나 또는 각각이 갈락토즈 또는 N-아세틸갈락토사민인 siRNA 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 서로 독립적으로 H, 메틸 또는 에틸이거나;
    R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 H인 siRNA 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 질소성 골격 상의 N 원자에 연결시키는 부위 및 R3내 P 원자에 연결시키는 부위 둘 다를 포함하거나; R2에서, 질소성 골격 상의 N 원자에 연결시키는 부위가 N 원자와 함께 아미드 결합을 형성하고, R3 내 P 원자에 연결시키는 부위가 P 원자와 함께 포스포에스테르 결합을 형성하거나; R2가 화학식 (B5), (B6), (B5') 또는 (B6) 중 어느 하나로 나타낸 구조를 갖는 작용 그룹인 siRNA 접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 화학식 (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421), 또는 (422)로 나타낸 구조를 갖는 siRNA 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 A59내 P 원자가 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 영역에 연결되고, 말단 영역은 센스 또는 안티센스 가닥 중 하나의 말단으로부터 계수하여 첫번째 4개의 뉴클레오타이드를 지칭하거나;
    화학식 A59내 P 원자가 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단에 연결되거나;
    화학식 A59내 P 원자가 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결되거나;
    화학식 A59내 P 원자가 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA내 뉴클레오타이드의 2', 3', 또는 5' 위치에 연결된 siRNA 접합체.
  11. 제1항에 있어서, i) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 1(SEQ ID NO: 1)로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 13으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 37로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 49로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지는 siRNA 접합체.
  12. 제1항 또는 제11항에 있어서, i) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택된 siRNA 접합체.
  13. 제12항에 있어서, Za3이 Za4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Zb3이 Zb4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Zc3이 Zc4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Zd3이 Zd4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Ze3dl Ze4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드인 siRNA 접합체.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II가 서로에 대해 기본적으로 역 상보성이거나, 실질적으로 역 상보성이거나, 완전히 역 상보성이고; "기본적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기쌍오류(base mispairings)가 존재함을 의미하고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류가 존재함을 의미하고 "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하는 siRNA 접합체.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 서로 독립적으로 1 내지 4 뉴클레오타이드의 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III이 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되어 있고, 뉴클레오타이드 서열 IV가 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되어 있고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하고; "완전한 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하는 siRNA 접합체.
  16. 제15항에 있어서, i) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 3으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 4로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 C이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 GC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 UGC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 UUGC이거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 15로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 16으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 GG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AGG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AGGG이거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 CAG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 ACAG이거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 39로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II이 서열 번호: 40으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 C이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 GAC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 GGAC이거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 51로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 52로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AAG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AAAG인 siRNA 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 서로에 대해 완전히 역 상보성인 siRNA 접합체.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함하고, 이는 1 내지 3 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결됨으로써 안티센스 가닥의 3' 오버행(overhang) 말단을 형성하거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 연속된 티민 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 2개의 연속된 우라실 리보뉴클레오타이드를 가지거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 표적 mRNA의 상응하는 부위에서 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 siRNA 접합체.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 5로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 6으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 7로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 8로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 17로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 18로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 19로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 20으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 29로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 30으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 31로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 32로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 41로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 42로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 43으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 44로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 53으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 54로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 55로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 56으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA 접합체.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1, siAPa2, siAPb1, siAPb2, siAPc1, siAPc2, siAPd1, siAPd2, siAPe1, 또는 siAPe2인 siRNA 접합체.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드이고/이거나 적어도 하나의 포스페이트 그룹이 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹인 siRNA 접합체.
  22. 제21항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 각각의 뉴클레오타이드가 독립적으로 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 또는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 또는 5, 7, 8 및 9번 위치에서 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 II의 2, 6, 14 및 16번 위치 또는 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드인 siRNA 접합체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 독립적으로 뉴클레오타이드의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체이거나;
    리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드가 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드, 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 뉴클레오타이드 유사체가 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나;
    각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고, 여기서 메톡시 변형된 뉴클레오타이드가 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드를 지칭하는 siRNA 접합체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 8, 9, 14 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 내 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥의 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥의 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드인 siRNA 접합체.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1-M1, siAPa2-M1, siAPa1-M2, siAPa2-M2, siAPa1-M3, siAPa2-M3, siAPb1-M1, siAPb2-M1, siAPb1-M2, siAPb2-M2, siAPb1-M3, siAPb2-M3, siAPc1-M1, siAPc2-M1, siAPc1-M2, siAPc2-M2, siAPc1-M3, siAPc2-M3, siAPd1-M1, siAPd2-M1, siAPd1-M2, siAPd2-M2, siAPd1-M3, siAPd2-M3, siAPe1-M1, siAPe2-M1, siAPe1-M2, siAPe2-M2, siAPe1-M3, 및 siAPe2-M3 중 어느 하나인 siRNA 접합체.
  26. 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 포스페이트 그룹내의 포스포디에스테르 결합내 적어도 하나의 산소 원자를 황 원자로 치환시켜 형성된 포스포로티오에이트 그룹이거나; 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 그룹인 siRNA 접합체:
    Figure pct00155
  27. 제26항에 있어서, siRNA내, 포스포로티오에이트 연결이 다음의 위치로 이루어진 그룹 중 적어도 하나에 위치하는 siRNA 접합체:
    센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 5' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치; 및
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치.
  28. 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1-M1S, siAPa2-M1S, siAPa1-M2S, siAPa2-M2S, siAPa1-M3S, siAPa2-M3S, siAPb1-M1S, siAPb2-M1S, siAPb1-M2S, siAPb2-M2S, siAPb1-M3S, siAPb2-M3S, siAPc1-M1S, siAPc2-M1S, siAPc1-M2S, siAPc2-M2S, siAPc1-M3S, siAPc2-M3S, siAPd1-M1S, siAPd2-M1S, siAPd1-M2S, siAPd2-M2S, siAPd1-M3S, siAPd2-M3S, siAPe1-M1S, siAPe2-M1S, siAPe1-M2S, siAPe2-M2S, siAPe1-M3S, 및 siAPe2-M3S 중 어느 하나인 siRNA 접합체.
  29. 제11항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' -포스페이트 뉴클레오타이드가 화학식 (2)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 뉴클레오타이드이고; 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드가 화학식 (3) 내지 (6) 중 어느 하나로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 뉴클레오타이드인 siRNA 접합체:
    Figure pct00156

    여기서 R은 H, OH, 메톡시, 또는 F로부터 선택되고;
    "염기"는 A, U, C, G, 또는 T로부터 선택된 염기를 나타낸다.
  30. 제11항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1-M1P1, siAPa2-M1P1, siAPa1-M2P1, siAPa2-M2P1, siAPa1-M3P1, siAPa2-M3P1, siAPa1-M1SP1, siAPa2-M1SP1, siAPa1-M2SP1, siAPa2-M2SP1, siAPa1-M3SP1, siAPa2-M3SP1, siAPa1U-M1P1, siAPa2U-M1P1, siAPa1U-M2P1, siAPa2U-M2P1, siAPa1U-M3P1, siAPa2U-M3P1, siAPa1U-M1SP1, siAPa2U-M1SP1, siAPa1U-M2SP1, siAPa2U-M2SP1, siAPa1U-M3SP1, siAPa2U-M3SP1, siAPb1-M1P1, siAPb2-M1P1, siAPb1-M2P1, siAPb2-M2P1, siAPb1-M3P1, siAPb2-M3P1, siAPb1-M1SP1, siAPb2-M1SP1, siAPb1-M2SP1, siAPb2-M2SP1, siAPb1-M3SP1, siAPb2-M3SP1, siAPb1U-M1P1, siAPb2U-M1P1, siAPb1U-M2P1, siAPb2U-M2P1, siAPb1U-M3P1, siAPb2U-M3P1, siAPb1U-M1SP1, siAPb2U-M1SP1, siAPb1U-M2SP1, siAPb2U-M2SP1, siAPb1U-M3SP1, siAPb2U-M3SP1, siAPc1-M1P1, siAPc2-M1P1, siAPc1-M2P1, siAPc2-M2P1, siAPc1-M3P1, siAPc2-M3P1, siAPc1-M1SP1, siAPc2-M1SP1, siAPc1-M2SP1, siAPc2-M2SP1, siAPc1-M3SP1, siAPc2-M3SP1, siAPd1-M1P1, siAPd2-M1P1, siAPd1-M2P1, siAPd2-M2P1, siAPd1-M3P1, siAPd2-M3P1, siAPd1-M1SP1, siAPd2-M1SP1, siAPd1-M2SP1, siAPd2-M2SP1, siAPd1-M3SP1, siAPd2-M3SP1, siAPd1U-M1P1, siAPd2U-M1P1, siAPd1U-M2P1, siAPd2U-M2P1, siAPd1U-M3P1, siAPd2U-M3P1, siAPd1U-M1SP1, siAPd2U-M1SP1, siAPd1U-M2SP1, siAPd2U-M2SP1, siAPd1U-M3SP1, siAPd2U-M3SP1, siAPe1-M1P1, siAPe2-M1P1, siAPe1-M2P1, siAPe2-M2P1, siAPe1-M3P1, siAPe2-M3P1, siAPe1-M1SP1, siAPe2-M1SP1, siAPe1-M2SP1, siAPe2-M2SP1, siAPe1-M3SP1, siAPe2-M3SP1, siAPe1U-M1P1, siAPe2U-M1P1, siAPe1U-M2P1, siAPe2U-M2P1, siAPe1U-M3P1, siAPe2U-M3P1, siAPe1U-M1SP1, siAPe2U-M1SP1, siAPe1U-M2SP1, siAPe2U-M2SP1, siAPe1U-M3SP1, 및 siAPe2U-M3SP1 중 어느 하나인 siRNA 접합체.
  31. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA로서; 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 각각의 뉴클레오타이드가 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II가 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥의 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고;
    i) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I이 뉴클레오타이드 Za1 에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II가 뉴클레오타이드 Za2 에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Za4를 포함하고, 여기서 Za4가 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 13으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I이 뉴클레오타이드 Zb1 에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II가 뉴클레오타이드 Zb2 에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zb4를 포함하고, 여기서 Zb4가 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I이 뉴클레오타이드 Zc1 에 상응하는 위치에서 Zc3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II가 뉴클레오타이드 Zc2에 상응하는 위치에서 Zc4를 포함하고, 여기서 Zc4가 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 37로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I이 Zd1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd3를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II가 Zd2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Zd4를 포함하고, 여기서 Zd4가 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드이거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 49로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 I이 Ze1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II가 Ze2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Ze4를 포함하고, 여기서 Ze4가 안티센스 가닥의 5' 말단에서 첫번째 뉴클레오타이드인 siRNA.
  32. 제31항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 독립적으로 이의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체인 siRNA.
  33. 제32항에 있어서, 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드가 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드, 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 뉴클레오타이드 유사체가 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 siRNA.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고, 여기서 메톡시 변형된 뉴클레오타이드가 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드를 지칭하는 siRNA.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, i) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 13으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고/갖거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고/갖거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 37로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고/갖거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 49로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고/갖거나 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는 siRNA.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서의 차이를 포함하고, Za4가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 14로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 38로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 50으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이가 Za4 위치에서 차이를 포함하고 Za4가 A, C 또는 G로부터 선택된 siRNA.
  37. 제36항에 있어서, Za3이 Za4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Zb3이 Zb4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Zc3이 Zc4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Zd3이 Zd4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나;
    Ze3이l Ze4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드인 siRNA 접합체.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II가 서로에 대해 기본적으로 역 상보성이거나, 실질적으로 역 상보성이거나, 완전히 역 상보성이고; "기본적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하는 siRNA 접합체.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 서로 독립적으로 1 내지 4 뉴클레오타이드의 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III이 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되어 있고, 뉴클레오타이드 서열 IV가 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되어 있고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하고; "완전이 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미하는 siRNA 접합체.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, i) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 3으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 4로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 C이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 GC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 UGC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 UUGC이거나;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 15로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 16으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 GG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AGG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AGGG이거나;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 25로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 26으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 CAG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 ACAG이거나;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 39로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 40으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 C이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 GAC이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 GGAC이거나;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 51로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 52로 나타낸 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 G이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AAG이거나;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다가 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 AAAG인 siRNA.
  41. 제40항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 서로에 대해 완전히 역 상보성인 siRNA.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함하고, 이는 1 내지 3 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결됨으로써 안티센스 가닥의 3' 오버행 말단을 형성하거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 연속된 티민 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 2개의 연속된 우라실 리보뉴클레오타이드이거나;
    뉴클레오타이드 서열 V가 표적 mRNA의 상응하는 부위에서 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 siRNA.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 5로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 6으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 7로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 8로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 17로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 18로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 19로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 20으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 29로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 30으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 31로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 32로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 41로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 42로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 43으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 44로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 53으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 54로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 55로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 56으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1, siAPa2, siAPb1, siAPb2, siAPc1, siAPc2, siAPd1, siAPd2, siAPe1, 또는 siAPe2인 siRNA.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1-M3, siAPa2-M3, siAPb1-M3, siAPb2-M3, siAPc1-M3, siAPc2-M3, siAPd1-M3, siAPd2-M3, siAPe1-M3, 및 siAPe2-M3 중 어느 하나인 siRNA.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 적어도 하나의 포스페이트 그룹이 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹인 siRNA.
  47. 제46항에 있어서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 포스페이트 그룹내의 포스포디에스테르 결합내 적어도 하나의 산소 원자를 황 원자로 치환시켜 형성된 포스포로티오에이트 그룹이거나; 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 그룹인 siRNA:
    Figure pct00157
  48. 제47항에 있어서, siRNA내에서, 포스포로티오에이트 연결이 다음의 위치로 이루어진 그룹 중 적어도 하나에 위치하는 siRNA:
    센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 5' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드와 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치; 및
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제2의 뉴클레오타이드와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치.
  49. 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1-M3S, siAPa2-M3S, siAPb1-M3S, siAPb2-M3S, siAPc1-M3S, siAPc2-M3S、siAPd1-M3S, siAPd2-M3S, siAPe1-M3S 및 siAPe2-M3S 중 어느 하나인 siRNA.
  50. 제31항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5'-포스페이트 뉴클레오타이드가 화학식 (2)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 뉴클레오타이드이고; 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드가 화학식 (3) 내지 (6) 중 어느 하나로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 뉴클레오타이드인 siRNA:
    Figure pct00158

    여기서 R은 H, OH, 메톡시, 및 F로부터 선택되고;
    "염기"는 A, U, C, G, 또는 T로부터 선택된 염기를 나타낸다.
  51. 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1-M3P1, siAPa2-M3P1, siAPa1-M3SP1, siAPa2-M3SP1, siAPa1U-M3P1, siAPa2U-M3P1, siAPa1U-M3SP1, siAPa2U-M3SP1, siAPb1-M3P1, siAPb2-M3P1, siAPb1-M3SP1, siAPb2-M3SP1, siAPb1U-M3P1, siAPb2U-M3P1, siAPb1U-M3SP1, siAPb2U-M3SP1, siAPc1-M3P1, siAPc2-M3P1, siAPc1-M3SP1, siAPc2-M3SP1, siAPd1-M3P1, siAPd2-M3P1, siAPd1-M3SP1, siAPd2-M3SP1, siAPd1U-M3P1, siAPd2U-M3P1, siAPd1U-M3SP1, siAPd2U-M3SP1, siAPe1-M3P1, siAPe2-M3P1, siAPe1-M3SP1, siAPe2-M3SP1, siAPe1U-M3P1, siAPe2U-M3P1, siAPe1U-M3SP1, 및 siAPe2U-M3SP1 중 어느 하나인 siRNA.
  52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siAPa1UM3SVP, siAPe1UM3SVP, siAPb1UM3SVP, siAPd1UM3SVP, siAPc1M3SVP, siAPd1UM3SP, siAPd1UM3SPs, siAPa1M3SP, siAPe1M3SP, siAPb1M3SP 및 siAPc1M3SP 중 어느 하나인 siRNA.
  53. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  54. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 및 siRNA에 접합적으로 연결된 접합 그룹을 포함하는 siRNA 접합체.
  55. 이상지질혈증의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조시, 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  56. 이상지질혈증을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 이상지질혈증을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  57. 유효량의 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약제학적 조성물을 간세포와 접촉시킴을 포함하여, 간세포내에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  58. 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는 키트(kit).
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