TW202340470A

TW202340470A - 一種ｄｓｒｎａ、其應用及製備方法

Info

Publication number: TW202340470A
Application number: TW112102801A
Authority: TW
Inventors: 李云飛; 林曉燕; 張瑱; 王艷輝; 董玉瓊; 茅松; 周雅琴; 黃龍飛; 黃燕芬; 黃敏印
Original assignee: 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司
Priority date: 2022-01-20
Filing date: 2023-01-19
Publication date: 2023-10-16
Also published as: TW202339773A; WO2023138650A1; WO2023138663A1

Abstract

本揭露關於一種dsRNA、其應用及製備方法。本揭露還關於包含該dsRNA的醫藥組成物、細胞或試劑盒。本揭露的dsRNA可以干擾AGT的表達，預防和/或治療相關疾病。

Description

一種DSRNA、其應用及製備方法

本揭露要求申請日為2022年01月20日的中國專利申請202210064314.2的優先權，本揭露引用上述中國專利申請的全文。

本揭露關於一種利用dsRNA降低目的RNA表達以及治療相關疾病的技術領域，具體地，本揭露關於dsRNA的製備和應用。

AGT也被稱為SERPINA8或ANHU。AGT由AGT基因編碼，主要由肝臟產生，是腎素-血管緊張素系統(RAS)的一種限速受質，也是血管緊張素肽的前體。在血漿中活性腎素的作用下，AGT分裂成血管緊張素I，其隨後藉由循環和局部表達的血管緊張素-轉化酶(ACE)的作用轉化成血管緊張素II。而血管緊張素II是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)中最主要的生物活性物質，它藉由與血管緊張素II 1型受體(AT1R)的結合，導致動脈血管收縮、腎上腺皮質醛固酮的分泌，因此在機體血壓調節中起著關鍵作用。當血管緊張素II過度產生或AT1R過度刺激，導致RAAS系統功能失調將會引起高血壓。眾多研究表明AGT基因上的多態現象與機體的血壓調控能力密切相關，而在中國漢族人群的關聯研究顯示AGT M235T位點多態性與原發性高血壓(ER)的發生有關。

高血壓(Hypertension)是一種世界性常見的心血管疾病，全球患病率高達10%至20%，並可導致腦血管、心臟以及腎臟的併發症，是各種疾病、失調和病症的主要風險因素(如腦中風、冠心病、慢性腎病、心肌梗塞、心衰竭、動脈瘤、外周動脈疾病、心臟損傷等其他心血管相關疾病)。目前，治療高血壓的藥物主要有五類，包括利尿藥、β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑以及血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑。儘管可用於治療高血壓的抗壓藥品種多，但超過三分之二的受試者用一種抗壓藥不能得到控制並且需要兩種或更多種不同類別的抗壓藥。由於依從性和副作用隨著用藥增加而增加，這進一步降低了具有受控血壓的受試者的數量。

RNA干擾(RNAi)是一種有效的沉默基因表達的方式。據統計，在人體內的疾病相關蛋白中，大約超過80%的蛋白質不能被目前常規的小分子藥物以及生物大分子製劑所靶向，屬於不可成藥蛋白。利用RNA干擾技術，可以根據編碼這些蛋白的mRNA，設計合適的dsRNA，特異性靶向目標mRNA並降解目標mRNA，從而達到抑制相關的蛋白生成。因此dsRNA具有非常重要的藥物開發前景。然而要實現體內的治療目的RNA干擾效應，需要向體內特定的細胞遞送dsRNA分子。

採用靶向配體綴合dsRNA，利用靶向配體與細胞膜表面的受體分子結構，從而內吞進入到細胞內，是一種有效的藥物遞送方式。例如，去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)是肝細胞特異性表達的受體，在肝細胞表面具有高豐度，胞內外轉換快速的特點。半乳糖、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺等單糖和多糖分子對ASGPR有高親和性。

第一方面，本揭露提供了一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含有義鏈和反義鏈，該有義鏈和反義鏈按照5'端到3'端的方向包含連續的核苷酸，其中該有義鏈第7、8和9位的核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸，第5位的核苷酸獨立地為2'-甲氧基修飾的核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸，其餘位置的核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸；該反義鏈第2和14位的核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸，第4、6、8、9、10、12、16和18位的核苷酸獨立地為2'-甲氧基或2'-氟修飾的核苷酸，其餘位置的核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸；該反義鏈中2'-氟修飾的核苷酸的個數為2-7個；

該反義鏈第2位至第8位中的至少一個核苷酸位置處包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽：

其中，Y選自O、NH和S；

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

Q₁為

，Q₂為R₂；或者Q₁為R₂，Q₂為

；

其中，

R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基；

該式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽修飾不是

。

在一些實施方案中(某些基團或特徵的定義如下，未定義的基團或特徵同其他任一方案所述，以下簡稱“在一些實施方案中”)，當X為NH-CO時，R₁不是H。

在一些實施方案中，以2’-甲氧基修飾替換式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，該反義鏈第2位至第8位中的至少一個核苷酸為2’-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、4、6、10、12、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、4、6、10、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、4、6、12、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、6、10、12、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、6、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、4、6、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、6、10、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、6、12、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第6、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、14和16位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，該反義鏈5’端起第2、6和14位為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自式(I-1)所示的化學修飾：

其中，Y選自O、NH和S；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

在一些實施方案中，B選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、異鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、C2修飾的嘌呤、N8修飾的嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鳥嘌呤、7-脫氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修飾的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，B與反義鏈該位置處核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自式(I-2)所示的化學修飾：

其中Y選自O、NH和S；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基；r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

在一些實施方案中，每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H、甲基、乙基、正丙基或異丙基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

R₃選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，p=1或2；

R₁選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，q=1或2；

R₂選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，r=1或2；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

在一些實施方案中，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、異鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、C2修飾的嘌呤、N8修飾的嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鳥嘌呤、7-脫氮嘌呤、胞嘧啶、5- 甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修飾的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

R₂選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、 NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，r=1或2；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

在一些實施方案中，Y為O或NH；每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I)中所定義。

在一些實施方案中，Y為O或NH；

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、NR₅和NH-CO，R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

R₃選自H、OH、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基和(CH₂)_pR₆；R₆選自OH、甲氧基和乙氧基，p=1、2或3；

Q₁為

，Q₂為R₂；或者Q₁為R₂，Q₂為

；

R₁選自H、OH、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基和(CH₂)_qR₇；R₇選自OH、甲氧基和乙氧基，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、OH、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基和(CH₂)_rR₈；R₈選自OH、甲氧基和乙氧基，r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成3-6員環；

B是鹼基；

在一些實施方案中，X獨立地選自CR₄(R₄’)和NH-CO。

在一些實施方案中，X獨立地選自CR₄(R₄’)。

在一些實施方案中，R₃選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_pR₆。

在一些實施方案中，R₃選自H和C₁-C₆烷基。

在一些實施方案中，R₁選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_qR₇。

在一些實施方案中，R₁選自H和C₁-C₆烷基。

在一些實施方案中，R₂選自H、OH、C₁-C₆烷基和(CH₂)_rR₈。

在一些實施方案中，R₂選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_rR₈。

在一些實施方案中，Y為O；

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)和NH-CO，R₄和R₄’分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

R₃選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_pR₆；R₆選自OH，p=1、2或3；

Q₁為

，Q₂為R₂；或者Q₁為R₂，Q₂為

；

R₁選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_qR₇；R₇選自OH，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、OH、C₁-C₆烷基和(CH₂)_rR₈；R₈選自OH，r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成5-6員環；

B是鹼基。

在一些實施方案中，Y為O；

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)，R₄和R₄’分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

J₂為H；

R₃選自H和C₁-C₆烷基；

Q₁為

，Q₂為R₂；或者Q₁為R₂，Q₂為

；

R₁選自H和C₁-C₆烷基；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_rR₈；R₈選自OH，r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成5-6員環；

B是鹼基。

在一些實施方案中，Y為O。

在一些實施方案中，X獨立地選自CR₄(R₄’)、NR₅和NH-CO，R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H、甲基、乙基、正丙基或異丙基。在一些實施方案中，X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH。在一些實施方案中，X獨立地選自NH-CO和CH₂。在一些實施方案中，X為CH₂。

在一些實施方案中，J₂為H或甲基。在一些實施方案中，J₂為H。

在一些實施方案中，R₃選自H、OH、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基和(CH₂)_pR₆，R₆選自OH、甲氧基和乙氧基，p=1或2。在一些實施方案中，R₃選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基和(CH₂)_pR₆，R₆選自OH，p=1或2。在一些實施方案中，R₃選自H和甲基。

在一些實施方案中，R₁選自H、OH、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基和(CH₂)_qR₇，R₇選自OH，q=1或2。在一些實施方案中，R₁選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基和(CH₂)_qR₇，R₇選自OH，q=1或2。在一些實施方案中，R₁選自H和甲基。

在一些實施方案中，R₂選自H、OH、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基和(CH₂)_rR₈，R₈選自OH，r=1或2。在一些實施方案中，R₂選自H、OH、甲基、乙基、正丙基、異丙基和(CH₂)_rR₈，R₈選自OH，r=1或2。在一些實施方案中，R₂選自H、甲基和CH₂OH。

在一些實施方案中，R₁和R₂直接相連成5-6員環。在一些實施方案中，R₁和R₂直接相連形成3-6員環烷基。在一些實施方案中，R₁和R₂直接相連形成環戊基或環己基。

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾選自以下任一結構：

其中，B選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，該包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸選自包含式(I’)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸，

其中，Y選自O、NH和S；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

Q_1’為

，Q_2’為R₂；或者Q_1’為R₂，Q_2’為

；

其中，

J₁為H或C₁-C₆烷基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基；

M為O或S；

該式(I’)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽不是

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

在一些實施方案中，以2’-甲氧基修飾替換式(I’)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，該式(I’)所示的化學修飾選自式(I’-1)所示的化學修飾：

其中，Y選自O、NH和S；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

M為O或S；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I’)中所定義。

在一些實施方案中，式(I’)所示的化學修飾選自式(I’-2)所示的化學修飾：

其中，Y選自O、NH和S；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

M為O或S；

B如式(I’)中所定義。

在一些實施方案中，每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

R₁選自H、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，q=1、2或3；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I’)中所定義。

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I’)中所定義。

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

視需要地，R₁和R₂直接相連成環；

B如式(I’)中所定義。

在一些實施方案中，Y為O或NH；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

Q_1’為

，Q_2’為R₂；或者Q_1’為R₂，Q_2’為

；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成3-6員環；

M為O或S；

B是鹼基；

。

在一些實施方案中，X獨立地選自CR₄(R₄’)和NH-CO。

在一些實施方案中，X獨立地選自CR₄(R₄’)。

在一些實施方案中，R₃選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_pR₆。

在一些實施方案中，R₃選自H和C₁-C₆烷基。

在一些實施方案中，R₁選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_qR₇。

在一些實施方案中，R₁選自H和C₁-C₆烷基。

在一些實施方案中，R₂選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_rR₈。

在一些實施方案中，Y為O；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

R₃選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_pR₆；R₆選自OH，p=1、2或3；

Q_1’為

，Q_2’為R₂；或者Q_1’為R₂，Q_2’為

；

R₁選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_qR₇；R₇選自OH，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

視需要地，R₁和R₂直接相連成5-6員環；

M為O或S；

B是鹼基。

在一些實施方案中，Y為O；

J₂為H；

R₃選自H和C₁-C₆烷基；

Q_1’為

，Q_2’為R₂；或者Q_1’為R₂，Q_2’為

；

R₁選自H和C₁-C₆烷基；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、C₁-C₆烷基和(CH₂)_rR₈；R₈選自OH，r=1、2或3；

視需要地，R₁和R₂直接相連成5-6員環；

M為O或S；

B是鹼基。

在一些實施方案中，Y為O。

在一些實施方案中，該式(I’)所示的化學修飾選自以下任一結構：

其中，M為O或S；

B選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲除和3-硝基吡咯。

其中，M為O或S；

B選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

其中，M為O或S；

以及它們結構中的腺嘌呤被置換為鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的那些。

在一些實施方案中，B與該反義鏈該位置處核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

再一方面，本揭露提供了一種dsRNA，其包含有義鏈和反義鏈：

在一些實施方案中，該反義鏈與靶序列至少部分地反向互補；在一些實施方案中，該反義鏈與靶序列之間存在不多於5個、不多於4個、不多於3個、不多於2個、不多於1個錯配；在一些實施方案中，該反義鏈與靶序列完全反向互補。

在一些實施方案中，該有義鏈與反義鏈至少部分地反向互補以形成雙鏈區；在一些實施方案中，該有義鏈與反義鏈之間存在不多於5個、不多於 4個、不多於3個、不多於2個、不多於1個錯配；在一些實施方案中，該有義鏈與反義鏈完全反向互補。

在一些實施方案中，該有義鏈和反義鏈各自獨立地具有16至35個、16至34個、17至34個、17至33個、18至33個、18至32個、18至31個、18至30個、18至29個、18至28個、18至27個、18至26個、18至25個、18至24個、18至23個、19至25個、19至24個、或19至23個核苷酸(例如19、20、21、22、23個核苷酸)。

在一些實施方案中，該有義鏈和反義鏈長度相同或不同，該有義鏈的長度為19-23個核苷酸，該反義鏈的長度為19-26個核苷酸。在一些實施方案中，該有義鏈和反義鏈的長度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/19、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些實施方案中，該有義鏈和反義鏈的長度比為19/21、21/23或23/25。在一些實施方案中，該有義鏈和反義鏈的長度比為19/21。

在一些實施方案中，該dsRNA包含一個或兩個平端。

在一些實施方案中，該dsRNA包含具有1至4個未配對核苷酸的突出端，例如1個、2個、3個、4個。

在一些實施方案中，該dsRNA包含位於該反義鏈3’端的突出端。

在一些實施方案中，包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸位於反義鏈5’區域的第5位、第6位或第7位。

在一些實施方案中，包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸位於反義鏈5’區域的位於第7位。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽修飾在其5’區域的第5位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽修飾在其5’區域的第6位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽修飾在其5’區域的第7位時，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，B與該反義鏈在其5’區域的第5位核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

在一些實施方案中，B與該反義鏈在其5’區域的第6位核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

在一些實施方案中，B與該反義鏈在其5’區域的第7位核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

在一些實施方案中，該有義鏈第5位的核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該反義鏈第7位的核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該有義鏈和反義鏈包含或為如下式所示的核苷酸序列：

有義鏈：5’-N_aN_aN_aN_aXN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

反義鏈：5’-N_a’N_b’N_a’X’N_a’X’W’X’X’X’N_a’X’N_a’N_b’N_a’X’N_a’X’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，每個X獨立地為N_a或N_b，每個X’獨立地為N_a’或N_b’；N_a和N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b和N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸或包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸。

在一些實施方案中，W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，W’表示包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸，在一些實施方案中，W’具有以下的結構：

有義鏈：5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，每個X’獨立地為N_a’或N_b’；N_a和N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b和N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

在一些實施方案中，W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，W’表示包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸，在一些實施方案中W’具有以下的結構：

在一些實施方案中，該有義鏈包含如或為如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aXN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，X為N_a或N_b；N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該有義鏈包含或為如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該反義鏈包含或為如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’X’N_a’X’W’X’X’X’N_a’X’N_a’N_b’N_a’X’N_a’X’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，每個X’獨立地為N_a’或N_b’；N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

在一些實施方案中，W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自：

、

和

；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；在一些具體的實施方案中，B與該反義鏈在其5’區域的第7位核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自：

、

和

；其中，M為O或S；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；在一些具體的實施方案中，B與該反義鏈在其5’區域的第7位核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

在一些具體的實施方案中，M為S。一些具體的實施方案中，M為O。

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’W’N_b’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；或，

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

在一些實施方案中，W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自：

、

和

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自：

、

和

在一些實施方案中，該有義鏈和/或反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基，該修飾基團使得該dsRNA在生物樣品或環境中具有增加的穩定性；在一些實施方案中，該具有修飾基團的磷酸酯基為硫代磷酸酯基。在一些實施方案中，該具有修飾基團的磷酸酯基為硫代磷酸二酯基。

在一些實施方案中，該硫代磷酸二酯基存在於以下位置中的至少一處：

該有義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及

該反義鏈的3'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，該有義鏈和/或反義鏈中包括多個硫代磷酸二酯基，該硫代磷酸二酯基存在於：

該有義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該有義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；和，

該反義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該反義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；和，

該反義鏈的3'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該反義鏈的3'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，該有義鏈包含如下式所示的核苷酸序列：

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，

其中，Nm表示2'-甲氧基修飾的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修飾的C、G、U、A；Nf表示2'-氟修飾的任意核苷酸，例如2'-氟修飾的C、G、U、A；

小寫字母s在中間時表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸二酯基連接；小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s左側相鄰的一個核苷酸末端為硫代磷酸二酯基。

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，

5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nm’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nm’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nm’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nm’Nm’Nm’W’Nf’Nf’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nm’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nm’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；

5’-Nm’sNf’sNm’Nm’Nm’Nm’W’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；或，

5’-Nm’sNf’sNm’Nm’Nm’Nm’W’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’sNm’sNm’-3’；

其中，Nm’表示2'-甲氧基修飾的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修飾的C、G、U、A；Nf’表示2'-氟修飾的任意核苷酸，例如2'-氟修飾的C、G、U、A；

小寫字母s在中間時表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸二酯基連接，小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s左側相鄰的一個核苷酸末端為硫代磷酸二酯基；

W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸或包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，W’表示包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸。

在一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自：

、

和

；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；在一些實施方案中，B與該反義鏈在其5’區域的第7位核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

一些實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自：

、

和

在一些實施方案中，M為S。在一些具體的實施方案中，M為O。

在一些實施方案中，該dsRNA抑制血管緊張素原(AGT)的表達。

在一些實施方案中，該有義鏈包含與SEQ ID NO：1的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，和/或，

該反義鏈包含與SEQ ID NO：2的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的至少19個連續核苷酸。

在一些實施方案中，該有義鏈包含或選自SEQ ID NO：1的核苷酸序列，和/或，該反義鏈包含或選自SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在一些實施方案中，該dsRNA的有義鏈包含或由SEQ ID NO：3組成，反義鏈包含或由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：15中任一的核苷酸序列組成；

在一些實施方案中，該dsRNA為以下任一方案：

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列；或

有義鏈包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列。

在一些實施方案中，該dsRNA為以下任一方案：

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：5組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：6組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：7組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：8組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：9組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：10組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：11組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：12組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：13組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：14組成；

有義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：3組成，反義鏈的核苷酸序列由SEQ ID NO：15組成。

在一些實施方案中，該dsRNA為以下任一方案：

包含SEQ ID NO：3所示的有義鏈和SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：15中任一項所示的反義鏈。

在一些實施方案中，該dsRNA為以下任一方案：

由SEQ ID NO：3組成的有義鏈和由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：15中任一項組成的反義鏈。

本揭露中，按照5’-3’方向，

SEQ ID NO：3是CmsGmsUmUmUmCmUfCfCfUmUmGmGmUmCmUmAmAmAm；

SEQ ID NO：5是UmsUfsUmAfGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAfGmGfAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：6是UmsUfsUmAfGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAfGmGmAmGfAmAfAmCfGmsGmsCm；

SEQ ID NO：7是UmsUfsUmAfGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGfAmGfAmAfAmCfGmsGmsCm；

SEQ ID NO：8是 UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAfGmGfAmGfAmAfAmCfGmsGmsCm；

SEQ ID NO：9是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：10是UmsUfsUmAfGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：11是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAfGmGmAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：12是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGfAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：13是UmsUfsUmAmGmAm(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAmAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：14是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAmAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：15是UmsUfsUmAmGmAm(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

其中，Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；Am=腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)；

s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸二酯基連接；

NAG0052’表示

，

(-)hmpNA(C)表示

。

在一些實施方案中，該dsRNA還包括綴合的配體，該配體選自靶向肝臟的靶向配體；在一些實施方案中，該配體結合脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)；在一些實施方案中，該配體包括半乳糖簇或半乳糖衍生物簇，該半乳糖衍生物選自N-乙醯基-半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺或N-異丁醯基半乳糖胺、或其組合。

在一些實施方案中，該dsRNA還包括與其綴合的配體，該配體為如式(II)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中，L₁為C₁-C₃₀烷基鏈、或包含被一個或多個氧、硫、氮原子或C=O間斷的C₁-C₃₀烷基鏈；

R₁₁和R₁₂獨立地為化學鍵、NR₁₆、C=O或-OC(=O)-；

Q₃為

或

；

為單鍵或雙鍵，且當

為單鍵時，R₁₃獨立地為CR₁₇R₁₈、NR₁₆、O或S，當

為雙鍵時，R₁₃獨立地為CR₁₉或N；

R₁₄獨立地為CR₁₉或N；

環A為存在或不存在的環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基，且當環A存在時，R₁₅獨立地為CR₁₉或N，當環A不存在時，R₁₅獨立地為CR₁₇R₁₈、NR₁₆或O；

R₁₆和R₁₉獨立地為氫、氘、烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、SR'、S(=O)R'、S(=O)₂R'、S(=O)₂NR'(R")、NR'(R")、C(=O)R'、C(=O)OR'或C(=O)NR'(R")，該烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_3-7環烷基、3-12員雜環烷基、6-12員芳基、5-12員雜芳基、SR'、S(=O)R'、S(=O)₂R'、S(=O)₂NR'(R")、NR'(R")、C(=O)R'、C(=O)OR'和C(=O)NR'(R")中的基團所取代；

R₁₇和R₁₈獨立地為氫、氘、烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、SR'、S(=O)R'、S(=O)₂R'、S(=O)₂NR'(R")、NR'(R")、C(=O)R'、C(=O)OR'或C(=O)NR'(R")，該烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_3-7環烷基、3-12員雜環烷基、6-12員芳基、5-12員雜芳基、SR'、S(=O)R'、S(=O)₂R'、S(=O)₂NR'(R")、NR'(R")、C(=O)R'、C(=O)OR'和C(=O)NR'(R")中的基團所取代；

R'和R"獨立地為氫、氘、羥基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基，該烷基、烷氧基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基視需要被一個或多個選自鹵素、羥基、側氧、硝基和氰基中的取代基所取代；

m1、n1、p1和q1獨立地為0、1、2、3或4；

B1為

或

；

R_b1、R_b2、R_b3、R_b4、R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-、-NHC(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-；

z1、z2、z3、z4、z5、z6、z7、z8和z9獨立地為0-10的整數；

L₂為C₁-C₃₀烷基鏈、或包含被一個或多個氧、硫、氮原子或C=O間斷的C₁-C₃₀烷基鏈；

r1為1-10的整數。

在一些實施方案中，L₁為C₁-C₃₀烷基鏈、或包含被一個或多個氧、硫、氮原子或C=O間斷的C₁-C₃₀烷基鏈；

R₁₁和R₁₂獨立地為化學鍵、NR₁₆或C=O；

R₁₆為氫或C_1-6烷基；

Q₃為

；

R₁₃為CR₁₇R₁₈、NR₁₆、O或S；

R₁₄為CR₁₉；

R₁₅獨立地為CR₁₇R₁₈、NR₁₆或O；

R₁₇至R₁₉獨立地為氫、氘或烷基；

m1、p1和q1獨立地為0、1、2、3或4；

B1為

；

R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-、-NHC(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-；

z5、z6、z7、z8和z9獨立地為0-10的整數；

r1為1-10的整數。

在一些實施方案中，L₁為-(CH₂)_j11-C(=O)-(CH₂)_j12-；

R₁₁和R₁₂獨立地為化學鍵、NR₁₆或C=O；

R₁₆為氫或C_1-6烷基；

Q₃為

；

R₁₃為CR₁₇R₁₈或O；

R₁₄為CR₁₉；

R₁₅獨立地為CR₁₇R₁₈或O；

R₁₇至R₁₉獨立地為氫或烷基；

m1、p1和q1獨立地為0或1；

B1表

；

R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-；

z8和z9獨立地為0-10的整數；

L₂為-(CH₂)_j15-(OCH₂CH₂)_1-4-(CH₂)_j16-或

；

j15和j16獨立地為0-4的整數；

r1為3、4、5或6。

在一些實施方案中，L₁可為L₃或L₃-R₁₁₀-R₁₁₁-L₃，其中，L₃獨立地為C₁-C₁₂烷基鏈、-(CH₂)_j11-C(=O)-(CH₂)_j12-或-(CH₂)_j13-(CH₂CH₂O)_1-4-(CH₂)_j14-，R₁₁₀和R₁₁₁獨立地為化學鍵、-NR₁₁₂-、-C(=O)-或-OC(=O)-，R₁₁₂為氫或C₁-C₁₂烷基，j11、j12、j13和j14獨立地為0-10的整數。在一些實施方案中，j11、j12、j13和j14獨立地為0-2或4-10的整數。在一些實施方案中，j11、j12、j13和j14獨立地為0、1、2、6、7、8、9或10。

在一些實施方案中，L₁可為-(CH₂)_j11-C(=O)-(CH₂)_j12-，j11和j12的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，L₁可為

，j12的定義同前任一方案所述，其中，a1端與B₁相連，b1端與R₁₁相連。

在一些實施方案中，L₁可為

、

、

、

或

，其中，a1端與B₁相連，b1端與R₁₁相連。

在一些實施方案中，R₁₁可為化學鍵且R₁₂可為C=O。

在一些實施方案中，R₁₁可為化學鍵且R₁₂可為NR₁₆，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁₁可為化學鍵且R₁₂可為-OC(=O)-。

在一些實施方案中，R₁₁可為NR₁₆且R₁₂可為C=O，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁可為NR₁₆且R₁₂可為-OC(=O)-，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁₂可為NR₁₆且R₁₁可為C=O，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁₂可為NR₁₆且R₁₁可為-OC(=O)-，R₁₆的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，R₁₁可為NH且R₁₂可為C=O。

在一些實施方案中，R₁₂可為NH且R₁₁可為C=O。

在一些實施方案中，R₁₆可為氫或C_1-6烷基。

在一些實施方案中，R₁₆可為氫、甲基、乙基、丙基或異丙基。

在一些實施方案中，R₁₆可為氫。

在一些實施方案中，R₁₇和R₁₈可為氫。

在一些實施方案中，R₁₉可為氫。

在一些實施方案中，環A存在時，環A可為C_6-12芳基。

在一些實施方案中，環A可為苯基。

在一些實施方案中，m1可為0或1。

在一些實施方案中，m1可為3。

在一些實施方案中，n1可為0或1。

在一些實施方案中，p1和q1獨立地為0或1。

在一些實施方案中，p1=1且q1=1。

在一些實施方案中，p1=1且q1=0。

在一些實施方案中，p1=0且q1=1。

在一些實施方案中，p1=0且q1=0。

在一些實施方案中，z1、z2、z3、z4、z5、z6、z7、z8和z9可獨立地為0-4的整數。在一些實施方案中，z1、z2、z3、z4、z5、z6、z7、z8和z9可獨立地為0、1或2。

在一些實施方案中，B₁可為

，R_b1、R_b2、R_b3和R_b4獨立地為-C(=O)-或-NHC(=O)-，N原子與L₁相連，z1、z2、z3和z4的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，B₁可為

，R_b1、R_b2、R_b3和R_b4獨立地為-C(=O)-或-NHC(=O)-，N原子與L₁相連，R_b1、R_b3和R_b4相同，z1、z2、z3和z4的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，B₁可為

。

在一些實施方案中，B₁可為

。

在一些實施方案中，B₁可為

，R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-，N原子與L₁相連，z5、z6、z7、z8和z9的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，B₁可為

，R_b5、R_b6和R_b7獨立地為-C(=O)-(CH₂)_z8-O-或-NHC(=O)-(CH₂)_z9-O-，N原子與L₁相連，R_b5、R_b6和R_b7相同，z5、z6、z7、z8和z9的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，B₁可為

。

在一些實施方案中，L₂可為L₄或L₄-R₁₃-R₁₄-L₄，其中，L₄獨立地為C₁-C₁₂烷基鏈或-(CH₂)_j15-(OCH₂CH₂)_1-4-(CH₂)_j16-，R₁₃和R₁₄獨立地為化學鍵、-NR₁₁₅-、-C(=O)-或-OC(=O)-，R₁₁₅獨立地為氫或C₁-C₁₂烷基，j15和j16獨立地為0-10的整數。在一些實施方案中，j15和j16獨立地為0-6的整數。在一些實施方案中，j15和j16獨立地為0、1、2、3或4。

在一些實施方案中，L₂可為-(CH₂)_j15-(OCH₂CH₂)_1-4-(CH₂)_j16-，j15和j16的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，L₂可為

或

。在一些實施方案中，L₂可為

，其中，左側與O原子相連，右側與B₁相連。

在一些實施方案中，L₂可為C₁-C₁₂烷基鏈。

在一些實施方案中，L₂可為

、

、

在一些實施方案中，L₂可為

。在一些實施方案中， L₂可為

。在一些實施方案中，L₂可為

。在一些實施方案中，L₂可為

。其中，a3端與O原子相連，b3端與B₁相連。

在一些實施方案中，L₂可為

，其中，a3端與O原子相連，b3端與B₁相連。

在一些實施方案中，r1可為3、4、5或6。在一些實施方案中，r1可為3。

在一些實施方案中，Q₃可為

或

。在一些實施方案中，Q₃可為

。其中，R₁₃、R₁₄、R₁₅和n1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

，其中，R₁₃、R₁₄、R₁₅、p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

、

、

或

在一些實施方案中，

可為

、

或

。在一些實施方案中，

可為

或

。在一些實施方案中，

可為

。p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

、

、

、

或

。在一些實施方案中，

可為

、

、

、

、

、

、

或

。在一些實施方案中，

可為

、

、

或

。p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

，其中，R₁₃、R₁₄、n1、p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

或

在一些實施方案中，

可為

或

在一些實施方案中，

可為

。n1、p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，

可為

或

，n1、p1和q1的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，該配體可為以下任一結構或其藥學上可接受的鹽，

在一些實施方案中，該配體可為以下結構或其藥學上可接受的鹽，

在一些實施方案中，可以N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺或N-異丁醯基半乳糖胺替換以上配體中的N-乙醯基-半乳糖胺部分。

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾為

、

或

，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；

該配體為如下任一結構或其藥學上可接受的鹽，

在一些實施方案中，該有義鏈和反義鏈的定義同前任一方案所述。

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾為

、

或

，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；

該配體為如下任一結構或其藥學上可接受的鹽，

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾為

、

或

，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；

該配體為如下結構或其藥學上可接受的鹽，

在一些實施方案中，該有義鏈和/或反義鏈和該配體共價或非共價連接。

在一些實施方案中，該有義鏈的3’端和/或5’端與該配體綴合。

在一些實施方案中，該有義鏈的3’端與該配體綴合。

在一些實施方案中，該配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該有義鏈和/或反義鏈末端連接。

在一些實施方案中，該配體藉由磷酸二酯基團或硫代磷酸二酯基團與該有義鏈和/或反義鏈末端連接。

在一些實施方案中，該配體藉由磷酸二酯基團與該有義鏈和/或反義鏈末端連接。

在一些實施方案中，該配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該有義鏈和/或反義鏈末端間接連接。

在一些實施方案中，該配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該有義鏈和/或反義鏈末端直接連接。

在一些實施方案中，該配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該有義鏈3’末端直接連接。

在一些實施方案中，該磷酸酯基團為磷酸一酯基團或磷酸二酯基團。在一些實施方案中，該磷酸酯基團為磷酸二酯基團。

在一些實施方案中，該硫代磷酸酯基團為硫代磷酸一酯基團或硫代磷酸二酯基團。在一些實施方案中，該硫代磷酸酯基團為硫代磷酸二酯基團。

在一些實施方案中，為了促進dsRNA進入細胞，可以在有義鏈的末端引入膽固醇等親脂性的基團，親脂性的基團包括以共價鍵與小干擾核酸結合，如末端引入膽固醇、脂蛋白、維生素E等，以利於藉由由脂質雙分子層構成的細胞膜與細胞內的mRNA發生作用。同時，dsRNA也可以進行非共價鍵修飾，如藉由疏水鍵或離子鍵結合磷脂分子、多肽、陽離子聚合物等增加穩定性和生物學活性。

在一些實施方案中，該配體的個數包括但不限於：1、2、3或4個。在一些實施方案中，該配體的個數為1個。

在一些實施方案中，該dsRNA的有義鏈的核苷酸序列包含或由SEQ ID NO：4組成，反義鏈的核苷酸序列包含或由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：15中任一的核苷酸序列組成；

在一些實施方案中，該dsRNA為以下任一方案：

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列。

在一些實施方案中，該dsRNA為以下任一方案：

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列組成；

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列組成；或

有義鏈由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列組成，反義鏈由SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列組成。

在一些實施方案中，該dsRNA為以下任一方案：

包含SEQ ID NO：4所示的有義鏈和SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：15中任一項所示的反義鏈。

在一些實施方案中，該dsRNA為以下任一方案：

由SEQ ID NO：4組成的有義鏈和由SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：15中任一項組成的反義鏈。

本揭露中，按照5’-3’方向，

SEQ ID NO：4是CmsGmsUmUmUmCmUfCfCfUmUmGmGmUmCmUmAmAmAm-NAG0052’；

SEQ ID NO：5是 UmsUfsUmAfGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAfGmGfAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：6是UmsUfsUmAfGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAfGmGmAmGfAmAfAmCfGmsGmsCm；

SEQ ID NO：7是UmsUfsUmAfGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGfAmGfAmAfAmCfGmsGmsCm；

SEQ ID NO：8是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAfGmGfAmGfAmAfAmCfGmsGmsCm；

SEQ ID NO：9是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：10是UmsUfsUmAfGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：11是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAfGmGmAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：12是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGfAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：13是UmsUfsUmAmGmAm(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAmAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：14是UmsUfsUmAmGmAf(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAmAmCmGmsGmsCm；

SEQ ID NO：15是UmsUfsUmAmGmAm(-)hmpNA(C)CmAmAmGmGmAmGfAmAfAmCmGmsGmsCm。

NAG0052’表示

，

(-)hmpNA(C)表示

。

在一些實施方案中，該dsRNA選自如下結構或其藥學上可接受的鹽：

其中，Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；Am=腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)。

表示硫代磷酸二酯基，

表示磷酸二酯基，

NAG0052’表示

，

(-)hmpNA(C)表示

。

在一些實施方案中，該藥學上可接受的鹽可為本領域常規的鹽，包括但不限於：鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、胺鹽等。

在一些實施方案中，該dsRNA選自TRD008110、TRD008112、TRD008103、TRD008104、TRD008105、TRD008106、TRD008107、TRD008108、TRD008109、TRD008111、TRD008113中的任一項。

在一些實施方案中，該dsRNA為TRD008110，其為如下結構：

在一些實施方案中，該dsRNA為TRD008112，其為如下結構：

表示硫代磷酸二酯基，

表示磷酸二酯基，

NAG0052’表示

，

(-)hmpNA(C)表示

。

另一方面，本揭露提供了一種醫藥組成物，其包含本揭露所述的dsRNA。

在一些實施方案中，該醫藥組成物還包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑。各種遞藥系統是已知的並且可以用於本揭露的dsRNA或醫藥組成物，例如封裝在脂質體中、微粒、微囊、能夠表達該化合物的重組細胞、受體介導的細胞內吞作用、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分。

在一些實施方案中，本揭露的dsRNA或醫藥組成物的給藥方式是常規的，可藉由局部給藥(例如，直接注射或植入)或全身給藥，也可藉由口服、直腸或胃腸外途徑進行給藥，該腸胃外途徑包括但不限於皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮給藥、吸入給藥(如氣溶膠)、黏膜給藥(如舌下、鼻內給藥)、顱內給藥等。

在一些實施方案中，本揭露提供的dsRNA或醫藥組成物可以藉由注射給予，例如，靜脈內、肌內、皮內、皮下、十二指腸內或腹膜內注射。

在一些實施方案中，本揭露提供的dsRNA或醫藥組成物可被包裝在試劑盒中。

本揭露中，該dsRNA或醫藥組成物的有效量或有效劑量為約0.001mg/kg體重至約200mg/kg體重、約0.01mg/kg體重至約100mg/kg體重或約0.5mg/kg體重至約50mg/kg體重。

另一方面，本揭露提供了一種本揭露所述的dsRNA或本揭露所述的醫藥組成物在製備藥物中的應用。

在一些實施方案中，該藥物可用於預防和/或治療高血壓、心血管疾病或肝源性疾病。在一些實施方案中，該藥物可用於預防和/或治療臨界性高血壓、原發性高血壓、繼發性高血壓、孤立性收縮期或舒張期高血壓、妊娠相關高血壓、糖尿病性高血壓、頑固性高血壓、難治性高血壓、陣發性高血壓、腎血管性高血壓、戈德布拉特氏高血壓、低血漿腎素活性或血漿腎素濃度相關的高血壓、眼高血壓、青光眼、肺動脈高血壓、門靜脈高血壓、系統性靜脈高血壓、收縮期高血壓、不穩定性高血壓、高血壓性心臟病、高血壓性腎病、動脈粥樣硬化、動脈硬化、血管病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、慢性心衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、腎小球硬化症、主動脈縮窄、主動脈瘤、心室纖維化、心衰竭、心肌梗塞、心絞痛、心臟瓣膜病、中風、腎疾病、腎衰竭、系統性硬化症、宮內發育遲緩(IUGR)、胎兒生長受限、肥胖、肝脂肪變性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)或代謝綜合症。

在一些實施方案中，該藥物可用於預防和/或治療與AGT基因表達相關的疾病。在一些實施方案中，該與AGT基因表達相關的疾病可為高血壓、心血管疾病或肝源性疾病。在一些實施方案中，該疾病可為臨界性高血壓、原發性高血壓、繼發性高血壓、孤立性收縮期或舒張期高血壓、妊娠相關高血壓、糖尿病性高血壓、頑固性高血壓、難治性高血壓、陣發性高血壓、腎血管性高血壓、戈德布拉特氏高血壓、低血漿腎素活性或血漿腎素濃度相關的高血壓、眼高血壓、青光眼、肺動脈高血壓、門靜脈高血壓、系統性靜脈高血壓、收縮期高血壓、不穩定性高血壓、高血壓性心臟病、高血壓性腎病、動脈粥樣硬化、動脈硬化、血管病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、慢性心衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、腎小球硬化症、主動脈縮窄、主動脈瘤、心室纖維化、心衰竭、心肌梗塞、心絞痛、心臟瓣膜病、中風、腎疾病、腎衰竭、系統性硬化症、宮內發育遲緩(IUGR)、胎兒生長受限、肥胖、肝脂肪變性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)或代謝綜合症。

在一些實施方案中，該dsRNA或醫藥組成物的有效量或有效劑量為約0.001mg/kg體重至約200mg/kg體重、約0.01mg/kg體重至約100mg/kg體重或約0.5mg/kg體重至約50mg/kg體重。

另一方面，本揭露提供了一種預防和/或治療疾病的方法，其包括向受試者給予有效量或有效劑量的本揭露所述的dsRNA或本揭露所述的醫藥組成物。

在一些實施方案中，該疾病可為高血壓、心血管疾病或肝源性疾病。在一些實施方案中，該疾病可為高血壓、原發性高血壓、繼發性高血壓、孤立性收縮期或舒張期高血壓、妊娠相關高血壓、糖尿病性高血壓、頑固性高血壓、難治性高血壓、陣發性高血壓、腎血管性高血壓、戈德布拉特氏高血壓、低血漿腎素活性或血漿腎素濃度相關的高血壓、眼高血壓、青光眼、肺動脈高血壓、門靜脈高血壓、系統性靜脈高血壓、收縮期高血壓、不穩定性高血壓、高血壓性心臟病、高血壓性腎病、動脈粥樣硬化、動脈硬化、血管病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、慢性心衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、腎小球硬化症、主動脈縮窄、主動脈瘤、心室纖維化、心衰竭、心肌梗塞、心絞痛、心臟瓣膜病、中風、腎疾病、腎衰竭、系統性硬化症、宮內發育遲緩(IUGR)、胎兒生長受限、肥胖、肝脂肪變性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)或代謝綜合症。

在一些實施方案中，該疾病可為與AGT基因表達相關的疾病。在一些實施方案中，該與AGT基因表達相關的疾病可為高血壓、心血管疾病或肝源性疾病。在一些實施方案中，該疾病可為臨界性高血壓、原發性高血壓、繼發性高血壓、孤立性收縮期或舒張期高血壓、妊娠相關高血壓、糖尿病性高血壓、頑固性高血壓、難治性高血壓、陣發性高血壓、腎血管性高血壓、戈德布拉特氏高血壓、低血漿腎素活性或血漿腎素濃度相關的高血壓、眼高血壓、青光眼、肺動脈高血壓、門靜脈高血壓、系統性靜脈高血壓、收縮期高血壓、不穩定性高血壓、高血壓性心臟病、高血壓性腎病、動脈粥樣硬化、動脈硬化、血管病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、慢性心衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、腎小球硬化症、主動脈縮窄、主動脈瘤、心室纖維化、心衰竭、心肌梗塞、心絞痛、心臟瓣膜病、中風、腎疾病、腎衰竭、系統性硬化症、宮內發育遲緩(IUGR)、胎兒生長受限、肥胖、肝脂肪變性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)或代謝綜合症。

另一方面，本揭露提供了一種用於在體內或在體外沉默細胞中靶基因或其mRNA的方法，其包括將本揭露所述的dsRNA或本揭露所述的醫藥組成物引入該細胞中的步驟。

在一些實施方案中，該靶基因為AGT。

另一方面，本揭露提供了一種抑制靶基因或其mRNA表達的方法，其包括向受試者給予有效量或有效劑量的本揭露所述的dsRNA或本揭露所述的醫藥組成物。

在一些實施方案中，該靶基因為AGT。

本揭露的dsRNA或醫藥組成物可以在細胞、細胞群、組織或受試者等對象中降低靶基因或其mRNA的表達水平，包括：向對象給予治療有效量的本文所述的dsRNA或醫藥組成物，從而抑制靶基因或其mRNA在對象中的表達。

在一些實施方案中，該對象已在先前被鑑定為在靶向的細胞、細胞群、組織或受試者中具有靶基因或其mRNA的病理性上調。

另一方面，本揭露提供了一種遞送寡核苷酸至肝臟的方法，其包括向受試者給予有效量或有效劑量的本揭露所述的dsRNA或本揭露所述的醫藥組成物。

另一方面，本揭露提供了一種RNA干擾(RNAi)試劑，其包含本揭露所述的dsRNA或本揭露所述的醫藥組成物。

另一方面，本揭露還提供了一種細胞，其包含本揭露所述的dsRNA或本揭露所述的醫藥組成物。

另一方面，本揭露還提供了一種試劑盒，其包含本揭露所述的dsRNA或本揭露所述的醫藥組成物。

一些實施方案中，本揭露的dsRNA選自siRNA。

本揭露中，本揭露所述dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot或流式細胞術測定的，本揭露所述dsRNA或醫藥組成物會抑制靶基因的表達至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%。

本揭露中，本揭露所述dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot或流式細胞術測定的，本揭露所述dsRNA或醫藥組成物引起的靶基因mRNA剩餘表達百分比為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。

本揭露中，本揭露所述dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，dsRNA在保持在靶活性的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

本揭露中，本揭露所述dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，dsRNA使在靶活性降低至多20%、至多19%、至多15%、至多10%、至多5%或超過1%的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

本揭露中，本揭露所述dsRNA或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，dsRNA使在靶活性提高至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

本揭露化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本揭露設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)-和(+)-對對映體、(R)-和(S)-對映體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬本揭露的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本揭露的範圍之內。本揭露的含有不對稱碳原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來。光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或藉由使用手性原料或手性試劑合成。

可以藉由的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(R)-和(S)-異構體以及D和L異構體。如果想得到本揭露某化合物的一種對映體，可以藉由不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有鹼性官能團(如胺基)或酸性官能團(如羧基)時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後藉由本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是藉由使用色譜法完成的，該色譜法採用手性固定相，並視需要地與化學衍生法相結合(例如由胺生成胺基甲酸鹽)。

本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”表示未指定構型，即如果化學結構中存在手性異構體，鍵“

”可以為“

”或“

”，或者同時包含“

”和“

”兩種構型。本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”並未指定構型，即鍵“

”的構型可以為E型或Z型，或者同時包含E和Z兩種構型。

在本揭露的化學結構式中，“

”、“

”、“

”可以根據本文所述發明範圍連接一個或多個任何基團；星號“*”表示手性中心。

在不指明構型的情況下，本揭露的化合物和中間體還可以以不同的互變異構體形式存在，並且所有這樣的形式包含於本揭露的範圍內。術語“互變異構體”或“互變異構體形式”是指可經由低能壘互變的不同能量的結構異構體。例如，質子互變異構體(也稱為質子轉移互變異構體)包括經由質子遷移的互變，如酮-烯醇及亞胺-烯胺、內醯胺-內醯亞胺異構化。內醯胺-內醯亞胺平衡實例是在如下所示的A和B之間。

本揭露中的所有化合物可以被畫成A型或B型。所有的互變異構形式在本揭露的範圍內。化合物的命名不排除任何互變異構體。

本揭露還包括一些與本文中記載的那些相同的，但一個或多個原子被原子量或質量數不同於自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本揭露化合物。可結合到本揭露化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，諸如分別為²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和³⁶Cl等。

除另有說明，當一個位置被特別地指定為氘(D)時，該位置應理解為具有大於氘的天然豐度(其為0.015%)至少1000倍的豐度的氘(即，至少10%的氘摻入)。示例中化合物的具有大於氘的天然豐度可以是至少1000倍的豐度的氘、至少2000倍的豐度的氘、至少3000倍的豐度的氘、至少4000倍的豐度的氘、至少5000倍的豐度的氘、至少6000倍的豐度的氘或更高豐度的氘。本揭露還包括各種氘化形式的式(I)、式(I’)、式(II)化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。所屬技術領域具有通常知識者能夠參考相關文獻合成氘化形式的式(I)、式(I’)、式(II)化合物。在製備氘代形式的式(I)、式(I’)、式(II)化合物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

本揭露還提供了一種製備dsRNA或醫藥組成物的方法，其包括：合成本揭露所述的dsRNA或醫藥組成物。

本揭露引入WO2022028462A1、PCT/CN2022/103275、PCT/CN2022/132883全文。

術語解釋

如本文所用，術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由該及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的情形。

除另有說明，“視需要地”、“視需要”、“可選的”或“可選”是指意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如“視需要地，R₁和R直接相連成環”是指R₁和R₂直接相連成環可以發生但不必須存在，該說明包括R₁和R₂直接相連成環的情形和R₁和R₂不成環的情形。

術語“約”、“大約”是指數值在由所屬技術領域具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍，例如1%至15%之間、在1%至10%之間、在1%至5%之間、在0.5%至5%之間、在0.5%至1%之間變化，本揭露中，數字或數值範圍之前有術語“約”的每種情況也包括給定數的實施方案。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

如無特殊說明，本揭露的“化合物”、“化學修飾”、“配體”、“dsRNA”、“核酸”和“RNAi”均可獨立地以鹽、混合鹽或非鹽(例如游離酸或游離鹼)的形式存在。當以鹽或混合鹽的形式存在時，其可為藥學上可接受的鹽。

“藥學上可接受的鹽”可選自無機鹽或有機鹽，也可包括藥學上可接受的酸加成鹽和藥學上可接受的鹼加成鹽。

“藥學上可接受的酸加成鹽”是指能夠保留游離鹼的生物有效性而無其它副作用的，與無機酸或有機酸所形成的鹽。無機酸鹽包括但不限於鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等；有機酸鹽包括但不限於甲酸鹽、乙酸鹽、2,2-二氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、十一碳烯酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、癸二酸鹽、己二酸鹽、戊二酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、油酸鹽、肉桂酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、谷胺酸鹽、焦谷胺酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、4-胺基水楊酸鹽、萘二磺酸鹽等。這些鹽可藉由本領域已知的方法製備。

“藥學上可接受的鹼加成鹽”是指能夠保持游離酸的生物有效性而無其它副作用的、與無機鹼或有機鹼所形成的鹽。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。一些實施方案中無機鹽為銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽，一些實施方案中為鈉鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於以下的鹽：一級胺類、二級胺類及三級胺類，被取代的胺類，包括天然的被取代胺類、環狀胺類及鹼性離子交換樹脂，例如胺、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己胺、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、普魯卡因、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。一些實施方案中有機鹼包括異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己基胺、膽鹼及咖啡因。這些鹽可藉由本領域已知的方法製備。

“烷基”指飽和的脂族烴基團，例如包括1至30個碳原子的直鏈和支鏈基團(C₁-C₃₀烷基)，又例如含有1至6個碳原子的烷基(C₁-C₆烷基)，又例如1至3個碳原子的烷基(C₁-C₃烷基)。非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、二級丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基及其各種支鏈異構體等。

術語“烯基”是指含有至少一個雙鍵的烴基。烯基的非限制性實例包括但不限於：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基或2-丁烯基及其各種支鏈異構體。

術語“炔基”指含有至少一個三鍵的烴基。炔基的非限制性實例包括但不限於：乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基或2-丁炔基及其各種支鏈異構體。

術語“烷氧基”指-O-(烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基。

“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至6個碳原子，更佳包含5-6個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基等；多環環烷基包括螺環、並環和橋環的環烷基。

“雜環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳包含3至7個環原子。“雜環烷基”非限制性實例包括：

，

和

，等等。

該雜環烷基環可以稠合於芳基或雜芳基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環烷基，其非限制性實例包括：

和

等。

“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共享毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至12員，例如苯基和萘基。該芳基環可以稠合於雜芳基、雜環烷基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性實例包括：

“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為6至12員，更佳為5員或6員。例如。其非限制性實例包括：咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基(oxazolyl)、異噁唑基(isoxazolyl)、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基、三唑基、吲唑基、苯并咪唑基、

，

、

等。

該雜芳基環可以稠合於芳基、雜環烷基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性實例包括：

術語“羥基”指-OH基團。

術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

術語“氰基”指-CN。

術語“胺基”指-NH₂。

術語“硝基”指-NO₂。

術語“側氧”指=O取代基。

本揭露中，“磷酸酯基團”可為磷酸一酯基團、磷酸二酯基團或磷酸三酯基團，較佳磷酸二酯基團；“硫代磷酸酯基團”中的“磷酸酯基團”也具有同樣的含義。

本揭露中，硫代磷酸二酯基是指一個非橋接氧原子被硫原子替代而修飾的磷酸二酯基，可用

、

(M為S原子)互換使用。

“取代”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1~3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。當取代基是酮或側氧(即，=O)時，則原子上有兩個(2個)氫被替代。

本揭露上下文中，基團

中的

部分可以替換為能夠與相鄰核苷酸實現連接的任意基團。

術語“連接”，當表示兩個分子之間的聯繫時，指兩個分子藉由共價鍵連接或者兩個分子經由非共價鍵(例如，氫鍵或離子鍵)關聯，包括直接連接、間接連接。

術語“直接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團在沒有任何間插原子或原子基團的情況下連接。

術語“間接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團藉由中間基團、化合物或分子(例如，連接基團)連接。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

“藥學上可接受的賦形劑”包括但不限於任何已經被美國食品和藥物管理局(FDA)批准對於人類或家畜動物使用可接受的任何助劑、載體、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增香劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、穩定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。

如本文所使用的，術語“抑制”，可以與“減少”、“沉默”、“下調”、“阻抑”和其他類似術語交替使用，並且包括任何水平的抑制。抑制可藉由這些變量中的一個或多個與對照水平相比的絕對或相對水平的減少來評估。該對照水平可以是本領域中使用的任何類型的對照水平，例如給藥前基線水平或從類似的未經處理或經對照(例如僅緩衝液對照或惰性劑對照)處理的受試者、細胞、或樣品確定的水平。例如，可以採用mRNA剩餘表達量來表徵dsRNA對靶基因表達的抑制程度，如mRNA剩餘表達量為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。靶基因表達的抑制率可以採用Dual-Glo® Luciferase Assay System檢測，分別讀取螢火蟲(Firefly)化學發光值和海腎(Renilla)化學發光值，計算相對值Ratio=Ren/Fir，抑制率(%)=1-(Ratio+dsRNA/Ratioreporter only)*100%；本揭露中，剩餘mRNA表達量比例(或剩餘活性%)=100%-抑制率(%)。

“有效量”或“有效劑量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

如本文所使用的，“對象”、“患者”、“受試者”或“個體”可互換使用，包括人類或者非人類動物，例如哺乳動物，例如人或猴。

如無特別說明，在本揭露上下文中，術語“血管緊張素原”與“AGT”在本文可互換地使用。AGT也被稱為SERPINA8和ANHU。AGT包括但不限於人類AGT、食蟹猴AGT、小鼠AGT、大鼠AGT，其胺基酸和完整編碼序列、 mRNA序列容易利用已公開的數據庫取得，例如，GenBank、UniProt、OMIM和獼猴(Macaca)基因組計劃網站。

術語“AGT”亦指AGT基因的天然存在的DNA序列變異，如AGT基因中的單核苷酸多態性(SNP)。示例性SNP可在dbSNP數據庫中發現。

術語“靶序列”指在AGT基因轉錄期間所形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包括作為主要轉錄產物的RNA加工產物的mRNA。該靶序列中被靶向的部分應當足夠長，才能作為iRNA指導的切割(iRNA-directed cleavage)的受質。在一個實施方案中，該靶序列在AGT的蛋白質編碼區內。

術語“dsRNA”是指能夠進行RNA干擾的雙鏈RNA分子，包含有義鏈和反義鏈。

如本文所使用的，有義鏈(又稱SS、SS鏈或正義鏈)是指包含與靶mRNA序列相同或基本上相同的序列的鏈；反義鏈(又稱AS或AS鏈)是指具有與靶mRNA序列互補的序列的鏈。

在描述本文所述的dsRNA有義鏈的上下文中，術語“SEQ ID NO：1的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸序列的至少15個連續核苷酸”旨在表示本文所述的dsRNA有義鏈包含如與SEQ ID NO：1的至少15個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：1的至少15個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列，視需要地，相差不超過2個核苷酸序列，視需要地，相差1個核苷酸序列。視需要地，本文所述的dsRNA有義鏈包含SEQ ID NO：1的至少16個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：1的至少16個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列，視需要地，相差不超過2個核苷酸序列，視需要地，相差1個核苷酸序列；

在描述本文所述的dsRNA反義鏈的上下文中，術語“與SEQ ID NO：2相差不超過3個核苷酸序列的至少15個連續核苷酸”旨在表示本文所述的SEQ ID NO：2的至少15個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：2的至少15個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列，視需要地，相差不超過2個核苷酸序列，視需要地，相差1個核苷酸序列。

如無特別說明，在本揭露上下文中，“G”、“C”、“A”、“T”與“U”分別代表核苷酸，其分別包含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷與尿嘧啶的鹼基。小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為氟修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸二酯基連接。

如本揭露所使用的，術語“2'-氟(2’-F)修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，“非氟修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。

如本揭露所使用的，術語“2'-甲氧基(2’-OMe)修飾的核苷酸”指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在本揭露的上下文中，一個核苷酸序列與另外一個核苷酸序列存在“核苷酸差異”，是指前者與後者相比，相同位置的核苷酸的鹼基種類發生了改變，例如，在後者中一個核苷酸鹼基為A時，在前者的相同位置處的對應核苷酸鹼基為U、C、G或者T的情況下，認定為兩個核苷酸序列之間在該位置處存在核苷酸差異。在一些實施方案中，以無鹼基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸時，也可認為在該位置處產生了核苷酸差異。

如本文所使用的，術語“互補”或“反向互補”一詞可互相替代使用，並具有所屬技術領域具有通常知識者周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。在DNA中，嘌呤鹼基腺嘌呤(A)始終與嘧啶鹼基胸腺嘧啶(或者在RNA中為尿嘧啶)相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤始終與嘧啶鹼基胞嘧啶相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出該鏈的序列。與此相應地，“錯配”在本領域中意指在雙鏈核酸中，對應位置上的鹼基並未以互補的形式配對存在。

術語“化學修飾”或“修飾”包括核苷酸經化學手段的所有改變，例如化學部分的添加或去除、或以一個化學部分取代另一個化學部分。

術語“鹼基”包含任何已知的DNA和RNA鹼基、鹼基類似物，例如嘌呤或嘧啶，其還包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、次黃苷和天然類似物。鹼基類似物還可以是通用鹼基。

術語“平端”或“平末端”可互換使用，是指在dsRNA的給定的末端沒有非配對的核苷酸或核苷酸類似物，即，沒有核苷酸突出。大多數情況下，兩個末端都是平末端的dsRNA將在其整個長度範圍內是雙鏈的。

本揭露提供的dsRNA可以藉由本領域常規的製備方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已經有商業化訂制服務。可以藉由使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本揭露該dsRNA中，製備具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入dsRNA的方法也是所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。

圖1為TRD002218、TRD007205在給藥後第7天TTR mRNA的表達量。

圖2為TRD002218、TRD007205在給藥後第28天TTR mRNA的表達量。

以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，則該試劑可自任意分子生物學試劑的供應商以用於分子生物學應用的質量/純度而獲得。

實施例1：化學修飾的製備

1.1 合成化合物1-1a和化合物1-1b

將化合物1(500mg,3.42mmol)和三乙胺(Et₃N，692mg,6.84mmol,0.95mL)溶於二氯甲烷(DCM，10mL)中，冰浴下滴加4-甲苯磺醯氯(TsCl,717mg,3.76mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，滴加完畢後反應在室溫下攪拌過夜，待反應完畢後，用水淬滅，水相用二氯甲烷(15mL)提取三次，合併的有機相先用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，隨後減壓蒸乾溶劑得到粗品2(820mg,80%)，直接用於下一步反應。MS m/z：C₁₄H₂₁O₅S，[M+H]⁺理論：301.10；實測：301.2。

將化合物3(239mg,1.22mmol)溶解於二甲基甲醯胺(DMF，10mL)中，冰浴下加入NaH(60%溶解在礦物油中，93mg,2.33mmol)溶液，該反應下攪拌30分鐘，然後滴加化合物2(350mg,1.16mmol)，滴加完畢後反應在60℃下攪拌5小時，反應完畢後，加水淬滅，水相用乙酸乙酯(15mL)提取三次，合併的有機相先用水(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(10mL)洗滌，隨後減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-50%(A：H₂O,B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到220mg化合物4。MS m/z：C₁₉H₂₁N₅O₃Na，[M+Na]⁺理論：390.16，實測：390.3。

室溫下將化合物4(1.50g,4.08mmol)溶解於20mL的醋酸和水(4：1)的混合溶液中，60℃下攪拌30分鐘，待反應完畢後減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-25%(A：H₂O,B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1.10g化合物5。MS m/z：C₁₆H₁₈N₅O₃，[M+H]⁺理論：328.13，實測：328.4。

將化合物5(1.00g,3.05mmol)溶於吡啶(Py，10mL)中，冰浴下滴4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl,1.50g,4.58mmol)的吡啶(5mL)溶液，滴加完畢後反應在室溫下攪拌過夜，待反應完畢後，用水淬滅，減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-80%(A：H₂O,B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1.00g化合物6。MS m/z：C₃₇H₃₆N₅O₅，[M-H]⁺理論：630.26，實測：630.5。消旋體化合物6經手性管柱(Daicel CHIRALPAK® IE 250*4.6mm,5μm,A：正己烷，B：乙醇)拆分得410mg 6A(-)和435mg 6B(+)。

將化合物6A(-)(200mg,0.32mmol)，四氮唑(11mg,0.16mmol)，N-甲基咪唑(5mg,0.06mmol)，3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(144mg,0.48mmol)，在室溫下攪拌過夜。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入二氯甲烷(30mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-100%(A：水，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到200mg化合物1-1a。MS m/z： C₄₀H₃₉N₆O₇P，[M-二異丙基+OH]⁺理論：747.26，實測：747.6。1H NMR(400MHz,Acetonitrile-d ₃)δ 7.56,7.54(2s,1H),7.36-7.27(m,2H),7.24-7.21(m,7H),6.83-6.80(m,4H),4.12-4.10(m,2H),3.75-3.68(m,10H),3.20-2.80(m,2H),2.68-2.54(m,4H),1.22-1.04(m,18H)。

將化合物6B(+)(200mg,0.32mmol)，四唑(11mg,0.16mmol)，N-甲基咪唑(5mg,0.06mmol)，3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(144mg,0.48mmol)，在室溫下攪拌過夜。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入二氯甲烷(30mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-100%(A：水，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到200mg化合物1-1b。MS m/z：C₄₀H₃₉N6O₇P，[M-二異丙基+OH]⁺理論：747.26，實測：747.5。

1.2 合成化合物1-6a

將化合物1(10g,68.404mmol)、化合物2(15g,62.186mmol)和三苯基膦(32.62g,124.371mmol)溶於無水THF(30mL)，於0℃下緩慢滴加 DIAD(24.656mL，124.371mmol)。該反應液在25℃下反應12h。LCMS顯示反應完成。將該反應液用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥將濾液濃縮，得到的殘留物用正相管柱純化(DCM/MeOH=10/1)得目標產物3(20g)。

將化合物3(20g,28.585mmol)溶於醋酸(24mL,426.016mmol)和H₂O(12mL)中，60℃攪拌1小時。之後將反應液旋乾加入THF(12mL)和H₂O(12mL)，80℃攪拌7小時。LCMS顯示反應完成。將反應液加入乙酸乙酯(200mL)和水(100mL)萃取，水相加入碳酸鈉固體直到水相有大量固體析出。將固體過濾，用水洗滌，將濾餅用油泵拉乾，得到目標化合物5(9g)。

在氮氣保護下，將化合物5(6.8g,18.581mmol)溶於吡啶(80mL)中，於0℃下緩慢加入TMSCl(14.250mL,111.489mmol)，攪拌2h。之後在0℃下加入Isobutyryl chloride(2.044mL,19.511mmol)，於25℃下攪拌1h。LCMS顯示反應完成。用二氯甲烷(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥旋乾後拌樣，用正相管柱純化(DCM：MeOH=10：1)過管柱，在4.8%處出峰)，得到黃色油狀化合物6(12g)。

在氮氣保護下，將化合物6(5.5g,12.392mmol)溶於吡啶(30mL)，加入MOLECULAR SIEVE 4A 1/16(7g,12.392mmol)，然後在0℃下分批加入DMTrCl(5.04g,14.870mmol)固體，25℃反應2h。TLC(PE：EtOAc=1：1,Rf=0.69)顯示反應已經完成。該反應液和TJN200879-040-P1合併一起處理。將反應液用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥旋乾後拌樣用正相管柱純化(PE：EtOAc過管柱，在84%處出峰)，得到黃色油狀化合物7(12g)。

將化合物7(12g,15.389mmol)溶於EtOAc(140mL)，加入濕鈀碳Pd/C(7g,15.389mmol)該反應液在25℃，氫氣(15Psi)下反應2小時。TLC(PE：EtOAc=0：1,Rf=0.09)顯示反應已經完成。將反應液過濾，濾餅用乙酸乙酯(30mL)沖洗三遍後，收集濾液。濾液旋乾後加入50mL二氯甲烷和2mL三乙胺拌樣用正相管柱純化(DCM：MeOH=10：1過管柱，在0.5%處出峰)，得到9g(黃色泡沫狀固體)。將所得消旋化合物SFC拆分，得到產品目標化合物7A(-)(3.9g)和目標化合物7B(+)(3.8g)。

將化合物7A(-)(3.30g,5.40mmol)，四唑(190mg,2.70mmol)，1-甲基咪唑(90mg,1.10mmol)，3A分子篩(500mg)溶於30mL的乙腈中，室溫下加入化合物8(2.50g,8.10mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(150mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(30mL*3)，再用飽和食鹽水(30mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18,Condition：5-100%(A：water,B：CH3CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-6a(2.9g,66%)。MS m/z：C43H55N7O7P[M+H]+，理論：812.38，實測：812.5。1H NMR(400MHz,Acetonitrile-d3)δ 7.56,7.54(2s,1H),7.36-7.27(m,2H),7.24-7.21(m,7H),6.83-6.80(m,4H),4.12-4.10(m,2H),3.75-3.68(m,10H),3.20-2.80(m,2H),2.68-2.54(m,4H),1.22-1.04(m,18H)。

1.3 合成化合物1-7a

在氮氣保護下，將化合物1(5g,23.1272mmol)、化合物2(6.76g,46.254mmol)和三苯基磷(7.28g,27.753mmol)溶於30mL二噁烷中，於0℃緩慢滴加入DEAD(5.502mL,27.753mmol)。滴加完成後，反應緩慢升溫至25℃繼續反應1h。在反應液裡加入100mL H₂O和100mL EtOAc萃取，有機相合併乾燥過濾濃縮後拌樣過管柱，用正相管柱純化(PE：EtOAc=1：1過管柱得目標產物(4g)。

將化合物3(3.3g)溶於HOAc(16mL)和H₂O(4mL)，油浴60℃加熱0.5h。將反應液旋乾得到的殘留物用正相管柱純化(PE：EtOAc=0：1過管柱)，得到目標產物4(3g)。

將化合物4(3g,8.873mmol)溶於5mL吡啶中，在氮氣保護下於0℃緩慢滴加DMTrCl(3.91g,11.535mmol)的10mL吡啶的溶液。滴加完畢後反應升溫至25℃並繼續反應1h。在反應液中加入50mL水和100mL乙酸乙酯萃取。水相再用100mL乙酸乙酯萃取三次，有機相合併乾燥過濾濃縮用正向管柱純化(用PE：EtOAc=2：1)。得到目標產物5(4g)。

將化合物5(4g,5.769mmol)溶於甲醇(10mL)，加入飽和的NH3甲醇溶液(40mL)，0℃反應6h。將反應液旋乾用正向管柱純化(用PE：EtOAc=0：1)得消旋化合物2.4g SFC拆分，得到目標產物6A(-)(750mg,100%純度)和目標產物6B(+)(400mg,99.16%純度)。

將化合物6A(-)(700mg,1.40mmol)，四唑(50mg,0.70mmol)，1-甲基咪唑(23mg,0.28mmol)，3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(630mg,2.10mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(50mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(10mL*3)，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18,Condition：5-100%(A：水B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-7a(700mg,72%)。MS m/z：C38H47N4O7PNa[M+Na]+，理論：725.32，實測：725.5。

1.4 合成化合物1-8a

將化合物1(8.5g,76.508mmol)、化合物2(30.64g,91.809mmol)溶於DMF(150mL)，加入CS2CO3(29.91g,91.809mmol)，反應於氮氣保護下，90℃反應12h。LCMS檢測反應完成。將反應液過濾，油泵旋乾，正相管柱分離純化(80g,DCM/MeOH=10/1~5/1)得到目標產物3(13.5g,80%純度)。

將化合物3(10.5g,35.105mmol)溶於吡啶(65mL)和CH₃CN(65mL)，向溶液中滴加BzCl(4.894mL,42.126mmol)，於25℃反應2h。LCMS檢測大部分原料反應完成，加H₂O(100mL)淬滅，EtOAc(100mL X 3)萃取，乾燥旋乾，管柱分離(合併TJN200872-101)純化(80g,PE/EtOAc=10/1~0/1,DCM/MeOH=10/1)得到目標產物4(14g,90%純度)。

將化合物4(14g,36.694mmol)溶於HOAc(56mL,314.796mmol)和H₂O(14mL)，於60℃反應2h，LCMS顯示反應完成。油泵濃縮，正相管柱分離(40g,DCM/MeOH=1/0~5/1)得到目標產物5(8.4g,90%純度& 2.4g,80%純度)。

將化合物5(7.4g,21.957mmol),DMAP(0.54g,4.391mmol),MOLECULAR SIEVE 4A(11.1g,2.967mmol)溶於吡啶(60mL)，冰浴下攪拌10min，然後加入DMTrCl(8.93g,26.348mmol)，反應攪拌1.8h。LCMS檢測約19%原料剩餘，約60%目標MS。合併(TJN200872-105&106)一起純化。向反應液中加入H₂O(50mL)，經DCM(50mL X 3)萃取，乾燥，旋乾，管柱分離(120g,PE/(EA：DCM：TEA=1：1：0.05)=1/0~0/1至DCM/MeOH=10/1)得到目標化合物6(11g,89%純度，TJN200872-105&106&107)，回收原料(3.0g,70%純度)。

化合物6(15g,22.041mmol)經SFC(DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*50mm,10um)；0.1% NH₃H₂O EtOH，B：45%-45%；200ml/min)分離得到目標產物6A(+)(5.33g,94.29%純度)，目標產物6B(-)(6.14g,97.91%純度)，化合物6回收1.0g。

將化合物6B(-)(5.4g,8.92mmol)，四唑(312mg,4.46mmol)，1-甲基咪唑(146mg,1.78mmol)，3A分子篩(500mg)溶於40mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(4g,13.4mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(200mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(30mL*3)，再用飽和食鹽水(50mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18,Condition：5-100%(A：water,B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-8a(5.8g,80%)。MS m/z：C45H51N5O7P，[M+H]+，理論：804.36，實測：804.4。

實施例2：不同化學修飾表徵

其中，我們將由2-羥甲基-1,3-丙二醇為起始原料合成的核苷酸定義hmpNA；

(+)hmpNA(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-1b藉由固相合成獲得，絕對構型為(S)-hmpNA(A)；

(-)hmpNA(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-1a藉由固相合成獲得，絕對構型為(R)-hmpNA(A)；

類似的，替換hmpNA的鹼基種類，藉由固相合成獲得以下結構並確認絕對構型：

(+)hmpNA(G)，絕對構型為(S)-hmpNA(G)；

(-)hmpNA(G)，絕對構型為(R)-hmpNA(G)；

(+)hmpNA(C)，絕對構型為(S)-hmpNA(C)；

(-)hmpNA(C)，絕對構型為(R)-hmpNA(C)；

(+)hmpNA(U)，絕對構型為(R)-hmpNA(U)；

(-)hmpNA(U)，絕對構型為(S)-hmpNA(U)。

(S)-hmpNA(G)，(R)-hmpNA(G)，(S)-hmpNA(C)，(R)-hmpNA(C)，(S)-hmpNA(U)和(R)-hmpNA(U)的絕對構型由其中間體或衍生物經X-Ray衍射而確認。

中間體或衍生物的結構為：

TJ-NA067：檢測晶體為無色塊狀(0.30×0.10×0.04mm3)，屬單斜晶系P21空間群。晶胞參數a=16.0496(5)Å，b=4.86260(10)Å，c=16.4686(5)Å，α=90°，β=118.015(4)°，γ=90°，V=1134.65(7)Å3，Z=4。計算密度Dc=1.389g/cm3，單胞中電子數F(000)=504.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.840mm-1，衍射實驗溫度T=150.00(11)K。

6A(+)：檢測晶體為無色塊狀(0.30×0.20×0.10mm3)，屬單斜晶系P21空間群。晶胞參數a=22.6688(7)Å，b=8.5595(2)Å，c=23.3578(5)Å，α=90°，β=113.876(3)°，γ=90，V=4144.3(2)Å3，Z=2。計算密度Dc=0.999g/cm3，單胞中電子數F(000)=1318.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.570mm-1，衍射實驗溫度T=100.01(18)K。

TJ-NA048：檢測晶體為無色針狀(0.30×0.04×0.04mm3)，屬單斜晶系P1空間群。晶胞參數a=7.6165(4)Å，b=11.3423(5)Å，c=17.3991(8)Å，α=85.007(4)°，β=88.052(4)°，γ=70.532(4)°，V=1411.75(12)Å3，Z=2。計算密度Dc=1.366g/cm3，單胞中電子數F(000)=620.0’單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.856mm-1，衍射實驗溫度T=150.00(13)K。

TJ-NA092：檢測晶體為無色棱柱狀(0.30×0.10×0.10mm3)，屬三斜晶系P1空間群。晶胞參數a=5.17960(10)Å，b=8.0667(2)Å，c=12.4077(2)Å，α=93.146(2)°，β=101.266(2)°，γ=96.134(2)°，V=503.993(18)Å3，Z=2。計算密度Dc=1.412g/cm3，單胞中電子數F(000)=228.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.945mm-1，衍射實驗溫度T=100.00(10)K。

實施例3：製備NAG0052、L96

化合物NAG0024、NAG0026購買自天津藥明康德新藥開發有限公司。除非特別說明，以下實施例中所用的試劑均為市售商品。

化合物NAG0052的合成

起始原料化合物1採購自江蘇倍達醫藥科技有限公司。化合物NAG0052的合成路線如下所示：

上述路線中涉及的具體中間產物以及終產物的合成以及鑑定如下所述：

化合物2

在0℃以及氮氣保護下，往化合物1(12.3mL,101mmol)的THF(300mL)溶液中分批加入NaH(12.2g,304mmol，純度60%)。該混合物在20℃下攪拌1小時之後再次冷卻到0℃，接著往體系中逐滴加入苄溴(36.3mL,304mmol)，並且在20℃攪拌12小時。將該反應液用H₂O(100mL)淬滅後，用EtOAc(200mL x 2)萃取。合併後的有機相用飽和食鹽水(100mL)洗滌，Na₂SO₄乾燥，過濾，濃縮得到的殘留物經過矽膠管柱層析分離後得到目標化合物2(20.0g,51.8mmol,產率51%)。

LCMS：t_R=2.615 and 2.820min in 30-90AB_7min_220&254_Shimadzu.lcm(Xtimate C18,3um,2.1*30mm),MS(ESI)m/z=351.2[M+Na]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.35-7.12(m,10H),5.06-4.95(m,1H),4.51-4.39(m,4H),4.24-3.87(m,2H),3.50-3.40(m,2H),3.38-3.20(m,3H),2.20-1.91(m,2H)。

化合物3和4

在20℃以及氮氣保護下，往化合物2(13.0g,33.6mmol)的DCM(300mL)溶液中一次性加入TMSCN(13.5mL,101mmol)，接著逐滴加入TMSOTf(9.14mL,50.5mmol)的DCM(30mL)溶液。該反應液在20℃下攪拌15小時。反應結束之後用飽和NaHCO₃水溶液(80mL)淬滅該體系，並且用DCM(150mL x 2)萃取，合併後的有機相用飽和食鹽水(80mL)洗滌，Na₂SO₄乾燥，過濾以及濃縮後藉由矽膠管柱層析分離後得到目標化合物3(3.30g,9.18mmol，產率27%)以及淡黃色油狀液體化合物4(8.50g,9.18mmol，產率70%)。

化合物3

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.42-7.29(m,10H),4.81(t,J=7.8Hz,1H),4.65-4.49(m,4H),4.30-4.21(m,2H),3.65-3.57(m,1H),3.57-3.49(m,1H),2.49-2.40(m,2H)。

化合物4

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.42-7.26(m,10H),4.93-4.87(m,1H),4.65-4.48(m,4H),4.43-4.38(m,1H),4.21-4.17(m,1H),3.79-3.70(m,1H),3.54(d,J=4.0Hz,1H),2.45-2.37(m,2H)。

化合物5

在0℃及氮氣保護下將化合物4(3.00g,9.28mmol)的THF(15mL)溶液，滴加到LiAlH₄(0.79g,20.9mmol)的THF(15mL)溶液中，滴加完後體系在0℃反應1小時。TLC(PE：EtOAc=3：1)監測到原料完全消失。向反應液中緩慢加入十水硫酸鈉，加至不冒泡為止。之後將反應液過濾，濾餅用二氯甲烷(60mL)洗滌三次後，收集濾液旋乾，得目標化合物5(3.00g，產率90%)。

¹ H NMR：(400MHz,DMSO-d ₆)δ ppm 7.40-7.14(m,10H),4.54-4.38(m,4H),4.06-3.99(m,2H),3.91(q,J=6.4Hz,1H),3.48-3.37(m,2H),2.67-2.52(m,2H),2.21-2.18(m,1H),1.77-1.73(m,1H)。

化合物6

在氮氣保護下，將化合物5(3.00g,8.25mmol)溶於DCM(30mL)，加入TEA(3.44mL,24.7mmol)和CbzCl(1.76mL,12.4mmol)，20℃反應2小時。LCMS顯示反應完成。將反應液加入二氯甲烷(30mL)和水(60mL)萃取。有機相用水(60mL x 3)洗滌三次，無水硫酸鈉乾燥，濃縮用正相管柱純化(PE：EtOAc=1：1)，得到目標化合物6(2.5g，產率90%)。

LCMS：t_R=0.810min in 5-95AB_1min,MS(ESI)m/z=462.2[M+H]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.39-7.29(m,15H),5.35(s,1H),5.15-5.01(m,2H),4.72(d,J=6.0Hz,1H),4.54-4.40(m,3H),4.26(s,1H),4.23-4.18(m,1H),4.11-4.04(m,1H),3.54-3.41(m,3H),3.37-3.25(m,1H),2.34-2.23(m,1H),1.85-1.79(m,1H)。

化合物7

在氮氣保護下，將化合物6(2.00g,3.90mmol)溶於DCM(5mL)，在-78℃下加入BCl₃的THF溶液(1M,27.3mL)，反應1小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)監測到原料完全消失。將反應液在-78℃下加入甲醇(20mL)淬滅，濃縮，用正相管柱純化(DCM：MeOH=10：1)，得到目標化合物7(2.00g，產率60%)。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.41-7.23(m,5H),5.08(s,2H),4.25-4.07(m,2H),3.85-3.75(m,1H),3.63-3.56(m,1H),3.54-3.48(m,1H),3.30-3.27(m,2H),2.34-2.21(m,1H),1.71-1.64(m,1H)。

化合物8

在氮氣保護下，將化合物7(0.50g,1.78mmol)溶於吡啶(5mL)中，在0℃下加入4A分子篩(500mg)和DMTrCl(0.66mL,2.13mmol)，之後升溫至20℃反應1.5小時。TLC(PE：EtOAc=2：1)監測到原料完全消失。將反應液加入乙酸乙酯(60mL)和水(60mL)萃取，有機相用水(60mL x 3)洗滌三次後用無水硫酸鈉乾燥，濃縮，用正相管柱純化(PE：EtOAc=1：1)，得到目標化合物8(800mg，產率90%)。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.44(d,J=7.6Hz,2H),7.37-7.23(m,11H),7.22-7.15(m,1H),6.84(d,J=8.8Hz,4H),5.09(s,2H),4.31-4.17(m,2H),4.02-3.91 (m,1H),3.84-3.73(m,6H),3.33(s,1H),3.28(s,1H),3.19-3.01(m,2H),2.34-2.25(m,1H),1.70-1.62(m,1H)。

化合物9

將化合物8(800mg,1.234mmol)溶於EtOAc(5mL)，加入Pd/C 10%(800mg,7.517mmol)，反應在H₂條件(15Psi)，20℃下反應1小時。LCMS顯示反應已經完成。反應液過濾，濾餅用二氯甲烷(100mL)和甲醇(100mL)洗滌三次，濃縮，經過反相管柱分離得到化合物9(300mg,54%)。

LCMS：t_R=2.586min in 10-80CD_3min MS(ESI)m/z=450.2[M+H]⁺。

化合物11

將化合物10(435mg,1.780mmol)溶於DCM(10mL)，加入DIEA(0.441mL,2.67mmol)和HATU(677mg,1.78mmol)後，再加入化合物9(400mg,0.890mmol)，20℃反應1小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)監測反應完成。將反應液加入二氯甲烷(60mL)和水(60mL)萃取，有機相用水(60mL x 3)洗滌三次，無水硫酸鈉乾燥，濃縮用正相管柱純化(PE：EtOAc=0：1過管柱，在100%處出產品峰)，得到目標化合物11(600mg，產率90%)。

LCMS：t_R=2.745min in 30-90CD_3min,MS(ESI)m/z=698.4[M+Na]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.46-7.38(m,2H),7.35-7.24(m,6H),7.22-7.16(m,1H),6.90-6.78(m,4H),4.29-4.21(m,2H),4.02-3.95(m,1H),3.77(s,6H),3.66-3.62(m,3H),3.41(s,1H),3.18-3.04(m,2H),2.36-2.17(m,5H),1.71-1.50(m,5H),1.39-1.25(m,14H)。

化合物12

將化合物11(600mg,0.799mmol)溶於THF(3mL)和H₂O(1mL)，加入LiOH.H₂O(134mg,3.20mmol)，20℃反應12小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)顯示反應完成。將反應液旋乾，用水(5mL)和甲醇(5mL)溶解，用反相管柱純化(H₂O：CH₃CN=1：1，在35%左右出峰)，得到目標化合物12(460mg，產率100%，鋰鹽)。

LCMS：t_R=1.346min in 10-80CD_3min,MS(ESI)m/z=684.3[M+Na]⁺。

HPLC：t_R=1.879min in 10-80CD_6min。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.47-7.39(m,2H),7.35-7.24(m,6H),7.22-7.15(m,1H),6.91-6.79(m,4H),4.31-4.18(m,2H),4.02-3.95(m,1H),3.78(s,6H),3.44-3.33(m,2H),3.18-3.04(m,2H),2.35-2.27(m,1H),2.24-2.10(m,4H),1.70-1.51(m,5H),1.31-1.23(m,12H)。

化合物13

室溫環境，氮氣保護下，將化合物NAG0024(271mg,0.151mmol)溶解於無水THF(2mL)和無水DMF(4mL)，加入3A分子篩，再依次加入化合物12(100mg,0.151mmol)、HOBt(25mg,0.181mmol)、DCC(38mg,0.181mmol)和DIEA(39mg,0.302mmol)。反應液45℃反應16h。LC-MS顯示反應完全後，加水淬滅，過濾。濾液濃縮後，經C18反相管柱純化(H₂O/MeCN)，得到化合物13(210mg，產率57%)。

化合物NAG0052

室溫環境下，化合物13(230mg，0.094mmol)溶於吡啶(5mL)，加入分子篩，加入DMAP(12mg，0.283mmol)，丁二酸酐(28mg，0.283mmol)。氮氣保護，50℃攪拌16小時。LCMS檢測反應完全，過濾旋乾。過C18反相管柱純化後，由製備HPLC二次純化，得到目標化合物NAG0052(123mg，0.048mmol，產率51%)。

MS(ESI)m/z=2535.3[M-1]^-.理論：2536.2。

¹H NMR(400MHz,Acetonitrile-d ₃)δ 7.48-7.43(m,2H),7.37-7.12(m,11H),7.00-6.85(m,10H),6.66(s,1H),5.31(dd,J=3.4,1.1Hz,3H),5.20-5.13(m,1H),5.05(dd,J=11.3,3.4Hz,3H),4.56(d,J=8.5Hz,3H),4.30(dd,J=7.7,5.3Hz,1H),4.18-3.93(m,14H),3.79(s,10H),3.65(q,J=4.7,3.6Hz,13H),3.56-3.07(m,24H),2.56(s,6H),2.37(t,J=5.8Hz,10H),2.17(t,J=7.5Hz,9H),2.02-1.96(m,20H),1.88(s,8H),1.82-1.73(m,2H),1.60(dt,J=15.0,7.3Hz,16H),1.27(s,13H)。

L96的合成

按照專利申請WO2014025805A1記載的方法製備獲得如上結構式所示的L96。

實施例4：dsRNA的合成

1.自製帶有載體的樹脂

將含有羧酸基團的化合物NAG0052(157mg,0.062mmol)溶於無水DMF(3mL)，待受質完全溶解後，依次加入無水乙腈(4mL)，DIEA(0.03mL,0.154mmol，2.5eq)和HBTU(35mg,0.093mmol，1.5eq)。反應液混合均勻後，再加入大孔胺甲基樹脂(476mg，空白載量為0.41mmol/g，目標載量為0.1mmol/g)。將反應液放入搖床上(溫度：25℃，轉速：200rpm)振搖過夜。反應液過濾，濾餅依次分別用DCM，無水乙腈洗滌，收集固體，真空乾燥過夜。

將上步固體分散於無水乙腈(5mL)，依次加入吡啶(0.18mL)，DMAP(3mg)，NMI(0.12mL)和CapB1(2.68mL)。將反應液放入搖床上(溫度：25℃，轉速：200rpm)振搖2h。反應液過濾，濾餅用無水乙腈洗滌，收集固體，真空乾燥過夜，得到帶有載體的樹脂。載量經過測定為0.1mmol/g。

2.對於已經連接在樹脂上的NAG0052，使用該樹脂作為起始，按照核苷酸排布順序自3’-5’方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應。操作為本領域常規。

化合物NAG0052經過固相合成連接到序列上，再經過胺解後，NAG0052結構脫去一部分官能團成為NAG0052’。

製得的dsRNA具有表1和表2中所示的有義鏈和反義鏈。

表1.dsRNA列表

表2.有義鏈和反義鏈的核酸序列

在上表中，大寫字母G、A、C、U分別表示包含鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，小寫字母m表示2'-甲氧基修飾，小寫字母f表示2'-氟修飾，小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸二酯基連接；以下同。

實施例5：dsRNA在體內對靶基因mRNA表達量的抑制

本實驗考察本揭露不同的dsRNA在體內對靶基因mRNA表達量的抑制效率

將雄性6-8週齡C57BL/6小鼠隨機分組，每組共6隻，每個時間點各3隻，分別向每組小鼠給予TRD007205、參比陽性TRD002218以及PBS。

所有動物依據體總計算給藥量，採用皮下注射方式單次給藥，dsRNA給藥劑量(以無配體核苷酸的量計)為1mg/kg，給藥體積為5mL/kg。給藥7天、28天後處死小鼠，收集肝臟，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；隨後用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用組織RNA提取試劑盒(凡知醫療科技，FG0412)根據操作說明書標註的操作步驟提取得到肝組織總RNA。將總RNA 反轉錄成cDNA並採用實時螢光定量PCR方法檢測肝組織中的TTR mRNA(轉甲狀腺蛋白mRNA)的表達量。在該螢光定量PCR法中，以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內參基因，使用針對TTR和GAPDH的Taqman探針引子分別檢測TTR和GAPDH的mRNA表達量。

表3.小鼠體內實驗分組信息：

表4.檢測引子的序列參見如下：

TTR mRNA表達量按照如下等式計算：

TTR mRNA表達量=【(測試組TTR mRNA表達量/測試組GAPDH mRNA表達量)/(對照組TTR mRNA表達量/對照組GAPDH mRNA表達量)】x 100%。

給藥7天、28天後，本揭露的綴合不同結構的dsRNA的在體內對靶基因mRNA表達量的抑制效率分別見圖1和圖2。由圖1的結果可知， TRD007205在給藥後7天對於TTR mRNA的表達抑制均具有良好的效果。由圖2可知，給藥28天後，TRD007205對靶基因mRNA表達量的抑制作用均優於TRD002218。

實施例6：合成dsRNA

1.自製帶有載體的樹脂

2.使用帶有NAG0052的樹脂作為起始，按照核苷酸排布順序自3’-5’方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應。具體參照實施例7的合成方法。

製得的dsRNA具有表5和表6中所示的有義鏈和反義鏈。

表5.dsRNA列表

表6.dsRNA的有義鏈和反義鏈

表7.有義鏈和反義鏈的核酸序列的裸序列

其中，(-)hmpNA(C)表示

；

NAG0052’的結構為：

表8.裸序列dsRNA(對照組)

實施例7：dsRNA對人原代肝細胞(PHH)中人AGT的抑制-7個濃度點抑制活性

在人原代肝細胞(PHH)中採用7個濃度梯度對dsRNA進行人原代肝細胞(PHH)活性篩選。各個dsRNA樣品轉染起始終濃度為20nM，5倍梯度稀釋和7個濃度點。

人原代肝細胞(PHH)凍存於液氮中，轉染前24h，將人原代肝細胞(PHH)復蘇後接種於96孔板，接種密度為每孔3×10⁴個細胞，每孔80μL培養基。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX)ThermoFisher，13778150)轉染dsRNA，dsRNA轉染的梯度終濃度為10nM，2nM，0.4nM，0.08nM，0.016nM，0.0032nM和0.00064nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒FG0417-L/FG0418-XL，磁珠法)進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗(Takara PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)和定量實時PCR(Takara PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)檢測，測定人AGT的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

該實驗涉及的儀器如表9所示。

表9.實驗儀器

其中，在實時定量PCR檢測時，採用的是探針Q-PCR检测实验，其引子信息如表10所示。

表10.Taqman引子信息表

結果分析方法

Q-PCR檢測實驗完畢後，按照系統自動設定的閾值獲取相應的Ct值，可以藉由Ct值比較，相對定量某個基因的表達：比較Ct指的是藉由與內參基因Ct值之間的差值來計算基因表達差異，也稱之是2^-△△Ct，△△Ct=[(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參)]。抑制率(%)=(1-目的基因表達剩餘量)*100%。

結果以相對於經過對照dsRNA處理的細胞的人AGT mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC₅₀結果見表11。

結果表明，所有化合物在PHH細胞中針對AGT基因具有高水平的在靶抑制活性。

表11.dsRNA在PHH細胞中多劑量抑制活性

實施例8：對人肝癌細胞系(Hep3B)中AGT的多濃度點抑制活性

在人肝癌細胞系(Hep3B)中採用7濃度梯度進行劑量響應實驗。

轉染前24h，將Hep3B細胞以約20,000細胞/孔接種在96孔板中，每孔100μL培養基。轉染時，參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的梯度終濃度為10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0.00064nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒FG0417-L/FG0418-XL，磁珠法)進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗(Takara PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)和定量實時PCR(Takara PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)檢測，測定人的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照樣品處理的細胞的人AGT mRNA表達剩餘百分比來表示，抑制率的IC₅₀結果見表12

結果表明，所有化合物在Hep3B細胞中針對AGT基因具有高水平的在靶抑制活性。

表12.對Hep3B細胞中人AGT的抑制活性

實施例9：對人肝癌細胞系(Hep3B)中AGT的抑制-多濃度點抑制活性

在人肝癌細胞系(Hep3B)中採用7濃度梯度進行劑量響應實驗。

轉染前24h，將Hep3B細胞以約20,000細胞/孔接種在96孔板中，每孔100μL培養基。轉染時，參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的梯度終濃度為10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0.00064nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定人的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對人AGT的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照樣品處理的細胞的人AGT mRNA表達剩餘百分比來表示，抑制率的IC₅₀結果見表13。實驗操作參考實施例8。

表13.對Hep3B細胞中人AGT的抑制活性

由表13數據可知：

TJR100283對AGT的抑制活性優於TJR100286、TJR100290、TJR100291、TJR100292和TJR100293。這些樣品的序列是針對TJR100283序列進行5’端首位鹼基突變，左右位移鹼基等方式變換而來。結果表明TJR100283展現出更好的對AGT的抑制活性，若鹼基變化均削弱對AGT的抑制活性。

實施例10：對猴原代肝細胞(PCH)中AGT的抑制-多濃度點抑制活性

在猴原代肝細胞(PCH)中採用7濃度梯度對樣品進行劑量響應實驗。

轉染時，參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，13778150)轉染樣品，樣品轉染的梯度終濃度為10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0.00064nM。將用Opti-MEM I稀釋後的RNAiMAX和樣品等體積混勻，室溫孵育15分鐘後，以每孔10μL的量加入96孔板中，然後每孔加入90μL復蘇的凍存PCH細胞懸液(6.7E5細胞/mL)。轉染24小時後收集細胞，使用RNeasy 96Kit(Qiagen-74182)提取細胞總RNA。參照反轉錄試劑盒(天根，KR106)說明書，加入隨機引子反轉錄成cDNA。採用qPCR的方法檢測樣品中的AGT mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對猴的AGT的mRNA水平進行校正，探針引子序列信息見表14。

每個樣品目的AGT mRNA的表達水平藉由ΔΔCt相對定量法進行計算。目的基因相對表達量使用2^-ΔΔCT表示，計算公式如下：

ΔCT=目的基因平均Ct值-內參基因平均Ct值；

ΔΔCT=ΔCT(加藥組)組-ΔCT(對照組)；

目的基因mRNA相對表達量=2^-ΔΔCT

應用GraphPad Prism軟體(four parameter logistic equations)計算IC₅₀。結果見表15。

表14.Taqman探針引子信息表

表15.對PCH細胞中猴AGT的7濃度抑制活性

結果表明，TJR100283活性明顯優於TJR100292、TJR100293和TJR100295。說明TJR100283序列本身對AGT的抑制活性都很強。

TW202340470A_112102801_SEQL.xml

Claims

一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含有義鏈和反義鏈，該有義鏈和反義鏈按照5'端到3'端的方向包含連續的核苷酸，其中

該有義鏈第7、8和9位的核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸，第5位的核苷酸獨立地為2'-甲氧基修飾的核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸，其餘位置的核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸；

該反義鏈第2和14位的核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸，第4、6、8、9、10、12、16和18位的核苷酸獨立地為2'-甲氧基或2'-氟修飾的核苷酸，其餘位置的核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸；

該反義鏈中2'-氟修飾的核苷酸的個數為2-7個；

該反義鏈第7位的核苷酸位置處包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽：

該式(I)所示的化學修飾選自以下任一結構：

、
、
，B是該反義鏈在其5’區域的第7位核苷酸未被修飾時的鹼基；

該dsRNA抑制血管緊張素原(AGT)的表達。
如請求項1所述的dsRNA，其中，

該有義鏈含有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aNbNbNbN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。
如請求項1或2所述的dsRNA，其中，

該反義鏈包含如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’X’N_a’X’W’X’X’X’N_a’X’N_a’N_b’N_a’X’N_a’X’N_a’N_a’N_a’-3’；

較佳地，該反義鏈包含如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’W’N_b’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’Nb’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’Nb’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；或，

5’-N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’W’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，每個X’獨立地為N_a’或N_b’；N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

W’表示包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸。
如請求項1至3中任一項所述的dsRNA，其中，該有義鏈和/或反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基，較佳為硫代磷酸酯基，更佳為硫代磷酸二酯基。
如請求項4所述的dsRNA，其中，該硫代磷酸二酯基存在於以下位置中的至少一處：

該有義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及

該反義鏈的3'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

較佳地，該有義鏈和/或反義鏈中包括多個硫代磷酸二酯基，該硫代磷酸二酯基存在於：

該有義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該有義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；和，

該反義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該反義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；和，

該反義鏈的3'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該反義鏈的3'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。
如請求項1至5中任一項所述的dsRNA，其中，

該有義鏈包含與SEQ ID NO：1的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸；並且

該反義鏈包含與SEQ ID NO：2的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸的至少19個連續核苷酸；

較佳地，

該有義鏈包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，並且反義鏈包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
如請求項1至6中任一項所述的dsRNA，其中，

該反義鏈包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15中任一項所示的核苷酸序列；

較佳地，該有義鏈包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
如請求項1至7中任一項所述的dsRNA，其中，該dsRNA還包括與其綴合的配體，該配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。
如請求項8所述的dsRNA，其中，該配體具有如下結構或其藥學上可接受的鹽，
如請求項8或9所述的dsRNA，其中，該dsRNA有義鏈的3’端與該配體綴合。
如請求項8至10中任一項所述的dsRNA，其中，該配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該dsRNA有義鏈的3’端連接；較佳藉由磷酸二酯基團或硫代磷酸二酯基團連接，更佳藉由磷酸二酯基團連接。
如請求項1至11中任一項所述的dsRNA，其中，

該反義鏈包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15中任一項所示的核苷酸序列；

較佳地，該有義鏈包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
如請求項1至12中任一項所述的dsRNA，其中，該dsRNA具有如下結構或其藥學上可接受的鹽：

其中，Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷；Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷；Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷；Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷；Am=腺嘌呤2'-OMe核糖核苷；Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷；Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷；Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷；

表示硫代磷酸二酯基，
表示磷酸二酯基；

NAG0052’表示
，(-)hmpNA(C)表示
。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至13中任一項所述的dsRNA；視需要地，該醫藥組成物還包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
一種載體，其包含如請求項1至13中任一項所述的dsRNA。
一種細胞，其包含如請求項1至13中任一項所述的dsRNA，或如請求項15所述的載體。
一種如請求項1至13中任一項所述的dsRNA、如請求項14所述的醫藥組成物、如請求項15所述的載體、或如請求項16所述的細胞在製備藥物中的應用；所述的藥物用於預防和/或治療高血壓。
一種抑制AGT基因或其mRNA表達的方法，其包括向受試者給予有效量或有效劑量的如請求項1至13中任一項所述的dsRNA、如請求項14所述的醫藥組成物、如請求項15所述的載體、或如請求項16所述的細胞。
一種遞送寡核苷酸至肝臟的方法，其包括向受試者給予有效量或有效劑量的如請求項8至13中任一項所述的dsRNA、如請求項14所述的醫藥組成物、如請求項15所述的載體、或如請求項16所述的細胞。
一種試劑盒，其包含如請求項1至13中任一項所述的dsRNA、如請求項14所述的醫藥組成物、如請求項15所述的載體、或如請求項16所述的細胞。
一種製備dsRNA或醫藥組成物的方法，其包括：合成如請求項1至13中任一項所述dsRNA。