CN106574268B - 血管紧张素原（AGT）iRNA组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向血管紧张素原(AGT)基因的RNAi剂，例如，双链RNAi剂，以及使用这样的RNAi剂抑制AGT表达的方法和治疗患有AGT相关失调(例如，高血压)的受试者的方法。

Description

血管紧张素原（AGT）iRNA组合物及其使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年5月22日提交的美国临时申请No.62/001,731 和2014年9月9日提交的美国临时申请No.62/047978的优先权权益。将上述每篇申请的完整内容按引用并入本文中。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表并且将其全部按引用并入本文中。2015年5月18日形成的该ASCII拷贝命名为121301-01320_SL.txt并且为318,688字节大小。
背景技术
肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在血压调节中起着关键作用。RAAS级联始于肾脏的近肾小球细胞将肾素分泌至循环中。肾素分泌受到几个因素的刺激，包括远端小管中的Na+负荷、β-交感神经刺激和/或降低的肾灌注。血浆中的活性肾素将血管紧张素原(由肝脏产生)分裂成血管紧张素I，其随后通过循环和局部表达的血管紧张素-转化酶(ACE)转化成血管紧张素II。血管紧张素II对RAAS 的大部分作用是通过其与血管紧张素II 1型受体(AT1R)的结合来发挥的，导致动脉血管收缩、管和肾小球效应，如增强的Na+重吸收或肾小球滤过率的调节。此外，与其他刺激物(如促肾上腺皮质激素、抗-利尿激素、儿茶酚胺、内皮素、血清素)以及Mg2+和K+水平一起，AT1R刺激导致醛固酮释放，其随后促进肾远端曲小管中的Na+ 和K+排泄。
导致例如过度血管紧张素II产生和/或AT1R刺激的RAAS失调引起高血压，其可以导致例如提高的氧化应激，心脏、肾脏和动脉中炎症、肥大和纤维化的促进，并且导致例如左心室纤维化、动脉重建和肾血管球硬化症。
高血压是发达国家中最普遍的、可控的疾病，影响20-50％的成年人群。其是各种疾病、失调和病症的主要风险因素，如，缩短的预期寿命、慢性肾病、中风、心肌梗塞、心力衰竭、动脉瘤(例如，主动脉瘤)、外周动脉疾病、心脏损伤(例如，心脏扩张或肥大)和其他心血管相关疾病、失调和/或病症。此外，已经表明高血压是心血管发病率和死亡率的重要风险因素，占据或构成全部中风的62％和所有心脏病病例的49％。
尽管可用于治疗高血压的抗压药数量大，但超过三分之二的受试者用一种抗压药不能得到控制并且需要两种或更多种选自不同药物类别的抗压药。由于依从性和副作用随着用药增加而增加，这进一步降低了具有受控血压的受试者的数量。
因此，本领域需要用于患有血管紧张素原相关疾病的受试者的替代疗法和组合疗法。
发明内容
本发明提供了iRNA组合物，其实现RNA诱导沉默复合体(RISC) -介导的血管紧张素原(AGT)基因的RNA转录物的切割。AGT基因可以在细胞内，例如，受试者(如人)体内的细胞。
本发明还提供了用于治疗患有将得益于使用iRNA组合物抑制或降低AGT基因表达的失调的受试者的方法和疗法，所述失调例如为血管紧张素原相关疾病，如高血压，所述组合物实现RNA诱导沉默复合体(RISC)-介导的AGT基因的RNA转录物的切割而用于抑制 AGT基因的表达。
因此，在一个方面中，本发明提供了用于抑制血管紧张素原 (AGT)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含形成双链区的正义链和反义链，其中正义链包含至少15个与SEQID NO：1的核苷酸序列的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸和反义链包含至少15个与SEQID NO：2的核苷酸序列的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸，其中正义链的基本上全部的核苷酸和反义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸，并且其中正义链与在3’-末端连接的配体偶联。在一个实施方案中，正义链的全部核苷酸和反义链的全部核苷酸是修饰的核苷酸。
在另一个方面中，本发明提供了用于抑制血管紧张素原(AGT) 表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含形成双链区的正义链和反义链，其中正义链包含至少15个与SEQ IDNO：1的核苷酸序列的核苷酸2801-2101；803-843；834-859；803-859；803-875；834-875；847-875；1247-1271；1566-1624；1570-1624；1584-1624；1584-1624； 1584-1621；2035-2144；2070-2144；2070-2103；2201-2223；2227-2360； 2227-2304；2290-2318；2304-2350；2304-2326；2320-2342；2333-2360； 2333-2358；485-503；517-535；560-578；635-653；803-821；814-832； 822-840；825-843；834-852；837-855；841-859；855-873；967-985； 1247-1265；1248-1266；1249-1267；1251-1269；1253-1271；1566-1584； 1570-1588；1572-1590；1574-1592；1584-1602；1587-1605；1591-1609； 1592-1610；1595-1613；1601-1619；1602-1620；1605-1623；1729-1747； 1738-1756；1739-1757；1741-1769；1767-1785；1810-1828；1827-1845； 1880-1989；1892-1914；1894-1914；1894-2012；2035-2053；2046-2064； 2057-2075；2070-2088；2072-2090；2078-2096；2078-2107；2078-2011； 2080-2098；2081-2099；2081-2104；2081-2011；2082-2100；2084-2102； 2084-2011；2090-2108；2100-2118；2111-2129；2124-2142；2125-2143； 2167-2185；2179-2197；2201-2219；2202-2220；2203-2221；2204-2222； 2227-2245；2230-2248；2234-2252；2244-2264；2255-2273；2266-2284； 2268-2286；2270-2288；2279-2297；2281-2299；2283-2301；2284-2302； 2285-2303；2286-2304；2288-2306；2290-2308；2291-2309；2291-2311； 2291-2318；2291-2315；2292-2310；2294-2312；2296-2314；2299-2317； 2304-2322；2304-2329；2306-2324；2307-2325；2309-2327；2309-2329； 2309-2342；2309-2350；2309-2358；2314-2332；2316-2334；2317-2335； 2320-2338；2321-2339；2323-2341；2325-2343；2326-2344；2328-2346； 2329-2347；2331-2349；2333-2351；2334-2352；2335-2353；2339-2357； 2340-2358或2341-2359的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸和反义链包含至少15个与SEQ ID NO：2的核苷酸序列对应位置处的核苷酸的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸，使得反义链与正义链中的该至少15个连续核苷酸基本上互补。在特定实施方案中，正义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。在其他实施方案中，反义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。再在其他实施方案中，两条链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。在一个实施方案中，正义链的全部核苷酸和反义链的全部核苷酸是修饰的核苷酸。在一个实施方案中，正义链与在3’-末端连接的配体偶联。在一个实施方案中，正义链包含至少15个与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸2801-2101 的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸和反义链包含至少15个与 SEQ ID NO：2的核苷酸序列的相应位置的核苷酸差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸，使得反义链与正义链中的该至少15个连续核苷酸基本上互补。
在一个方面中，本发明提供了用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含形成双链区的正义链和反义链，其中正义链包含至少15个来自SEQ IDNO：1的核苷酸序列的核苷酸803-843；834-859；803-859；1247-1271；1566-1624；1570-1624； 1584-1624；1584-1624；1584-1621；2035-2144；2070-2144；2070-2103； 2201-2223；2227-2360；2227-2304；2290-2318；2304-2350；2304-2326； 2320-2342；2333-2360；2333-2358；485-503；517-535；560-578； 635-653；803-821；814-832；822-840；825-843；834-852；837-855； 841-859；855-873；967-985；1247-1265；1248-1266；1249-1267； 1251-1269；1253-1271；1566-1584；1570-1588；1572-1590；1574-1592； 1584-1602；1587-1605；1591-1609；1592-1610；1595-1613；1601-1619； 1602-1620；1605-1623；1729-1747；1738-1756；1739-1757；1741-1769； 1767-1785；1810-1828；1827-1845；1880-1989；1894-2012；2035-2053； 2046-2064；2057-2075；2070-2088；2072-2090；2078-2096；2080-2098； 2081-2099；2082-2100；2084-2102；2090-2108；2100-2118；2111-2129； 2124-2142；2125-2143；2167-2185；2179-2197；2201-2219；2202-2220； 2203-2221；2204-2222；2227-2245；2230-2248；2234-2252；2244-2264； 2255-2273；2266-2284；2268-2286；2270-2288；2279-2297；2281-2299； 2283-2301；2284-2302；2285-2303；2286-2304；2288-2306；2290-2308； 2291-2309；2292-2310；2294-2312；2296-2314；2299-2317；2304-2322； 2306-2324；2307-2325；2309-2327；2314-2332；2316-2334；2317-2335； 2320-2338；2321-2339；2323-2341；2325-2343；2326-2344；2328-2346； 2329-2347；2331-2349；2333-2351；2334-2352；2335-2353；2339-2357； 2340-2358或2341-2359的连续核苷酸和反义链包含至少15个与SEQ ID NO：2的核苷酸序列的相应位置的核苷酸差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸，使得反义链与正义链中的该至少15个连续核苷酸基本上互补。在特定实施方案中，正义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。在其他实施方案中，反义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。再在其他实施方案中，两条链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。在一个实施方案中，正义链与在3’-末端连接的配体偶联。
在一个实施方案中，正义链和反义链包含互补区，该互补区包含至少15个与表3、4、7、8、11、13和15任一个中所列的任一个反义序列的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸。例如，在特定实施方案中，正义链和反义链包含互补区，该互补区包含至少15个与双链体AD-52433.1，AD-52438.1，AD-52439.1，AD-52445.1，AD-52449.1， AD-52451.1，AD-52456.1，AD-52457.1，AD-52462.1，AD-52463.1， AD-52469.1，AD-52474.1，AD-55976.1，AD-55978.1，AD-55979.1， AD-55980.1，AD-55981.1，AD-55982.1，AD-55983.1，AD-55984.1， AD-55987.1，AD-55988.1，AD-55989.1，AD-55990.1，AD-55991.1， AD-55994.1，AD-55995.1，AD-55996.1，AD-55999.1，AD-56000.1， AD-56001.1，AD-56002.1，AD-56003.1，AD-56006.1，AD-56007.1， AD-56008.1，AD-56009.1，AD-56011.1，AD-56012.1，AD-56013.1， AD-56016.1，AD-56017.1，AD-56019.1，AD-56020.1，AD-56021.1， AD-56022.1，AD-56024.1，AD-56026.1，AD-56027.1，AD-56029.1， AD-56030.1，AD-56031.1，AD-56032.1，AD-56035.1，AD-56039.1， AD-56041.1，AD-56043.1，AD-56044.1，AD-56047.1，AD-56048.1， AD-56051.1，AD-56053.1，AD-56054.1，AD-56059.1，AD-56062.1，AD-56065.1，AD-56066.1，AD-60770.1，AD-60771.1，AD-60776.1， AD-60777.1，AD-60778.1，AD-60779.1，AD-60780.1，AD-60781.1， AD-60783.1，AD-60784.1，AD-60785.1，AD-60788.1，AD-60789.1， AD-60791.1，AD-60793.1，AD-60795.1，AD-60798.1，AD-60801.1， AD-67903.1，AD-67906.1，AD-67923.1，AD-67924.1，AD-67925.1， AD-67926.1，AD-67935.1，AD-67965.1，AD-67994.1，AD-67995.1， AD-67996.1，AD-68017.1，AD-68022.1，AD-68035.1，AD-68036.1，AD-68037.1，AD-68084.2，AD-68085.2，AD-68086.2，AD-68087.2， AD-68090.2，AD-68091.2，AD-68092.2，AD-68093.2，AD-68116.1， AD-68117.1，AD-68118.1，AD-68124.1，AD-68125.1或AD-68126.1的任一个反义序列的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸。在特定实施方案中，正义链和反义链包含互补区，该互补区包含双链体AD-52433.1，AD-52438.1，AD-52439.1，AD-52445.1，AD-52449.1， AD-52451.1，AD-52456.1，AD-52457.1，AD-52462.1，AD-52463.1， AD-52469.1，AD-52474.1，AD-55976.1，AD-55978.1，AD-55979.1， AD-55980.1，AD-55981.1，AD-55982.1，AD-55983.1，AD-55984.1， AD-55987.1，AD-55988.1，AD-55989.1，AD-55990.1，AD-55991.1， AD-55994.1，AD-55995.1，AD-55996.1，AD-55999.1，AD-56000.1， AD-56001.1，AD-56002.1，AD-56003.1，AD-56006.1，AD-56007.1， AD-56008.1，AD-56009.1，AD-56011.1，AD-56012.1，AD-56013.1， AD-56016.1，AD-56017.1，AD-56019.1，AD-56020.1，AD-56021.1， AD-56022.1，AD-56024.1，AD-56026.1，AD-56027.1，AD-56029.1， AD-56030.1，AD-56031.1，AD-56032.1，AD-56035.1，AD-56039.1， AD-56041.1，AD-56043.1，AD-56044.1，AD-56047.1，AD-56048.1， AD-56051.1，AD-56053.1，AD-56054.1，AD-56059.1，AD-56062.1，AD-56065.1，AD-56066.1，AD-60770.1，AD-60771.1，AD-60776.1， AD-60777.1，AD-60778.1，AD-60779.1，AD-60780.1，AD-60781.1， AD-60783.1，AD-60784.1，AD-60785.1，AD-60788.1，AD-60789.1， AD-60791.1，AD-60793.1，AD-60795.1，AD-60798.1，AD-60801.1， AD-67903.1，AD-67906.1，AD-67923.1，AD-67924.1，AD-67925.1， AD-67926.1，AD-67935.1，AD-67965.1，AD-67994.1，AD-67995.1， AD-67996.1，AD-68017.1，AD-68022.1，AD-68035.1，AD-68036.1， AD-68037.1，AD-68084.2，AD-68085.2，AD-68086.2，AD-68087.2， AD-68090.2，AD-68091.2，AD-68092.2，AD-68093.2，AD-68116.1， AD-68117.1，AD-68118.1，AD-68124.1，AD-68125.1或AD-68126.1中任一个的互补区的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包含互补区，该互补区包含至少15 个与AD-67327的反义核苷酸序列(5’- AUUAGAAGAAAAGGUGGGAGACU-3’；SEQ ID NO：537)的差异不超过3个核苷酸的连续未修饰核苷酸。在另一个实施方案中，互补区由AD-67327的反义未修饰核苷酸序列 (5’-AUUAGAAGAAAAGGUGGGAGACU-3’；SEQ ID NO：537)组成。在一个实施方案中，dsRNA包含由 5’-UCUCCCACCUUUUCUUCUAAU-3’(SEQ ID NO：499)的核苷酸序列组成的正义链和由5’-AUUAGAAGAAAAGGUGGGAGACU-3’ (SEQ ID NO：537)的核苷酸序列组成的反义链。在一个实施方案中，双链RNAi剂包含AD-67327的修饰核苷酸序列 (5’-uscsucccAfcCfUfUfuucuucuaau-3’；SEQ ID NO：1037和 5’-asUfsuagAfagaaaagGfuGfggagascsu-3’；SEQ ID NO：1038)。
在一些实施方案中，修饰的核苷酸独立地选自2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、包含5’-硫逐磷酸酯基团的核苷酸和连接于胆固醇基衍生物或月桂酸二癸酰胺基团的末端核苷酸。在进一步的实施方案中，修饰的核苷酸选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’- 脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸(unlocked nucleotide)、构象限制核苷酸、约束乙基核苷酸(constrained ethyl nucleotide)、无碱基核苷酸、2’-氨基-修饰的核苷酸、2’-烷基-修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烯丙基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
在双链RNAi剂的另一个实施方案中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3’悬端。在另一个实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的3’悬端。
在另一个方面中，本发明提供了RNAi剂，例如，能够抑制细胞中的血管紧张素原(AGT)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中反义链包含与编码 AGT的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸长，其中双链RNAi剂由式(III)来表示：
正义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′
(III)
其中：
i、j、k和1各自独立地为0或1；
p、p’、q和q’各自独立地为0-6；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np′、nq和nq′，其各自可以存在或不存在，独立地表示悬端核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰且Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰；和
其中正义链与至少一个配体偶联。
在一个实施方案中，i是0；j是0；i是1；j是1；i和j都是0；或i和j都是1。在另一个实施方案中，k是0；1是0；k是1；1是1； k和1都是0；或k和1是1。
在一个实施方案中，XXX与X′X′X′互补，YYY与Y′Y′Y′互补，和ZZZ与Z′Z′Z′互补。
在一个实施方案中，YYY基序出现在正义链的切割位点处或附近。
在另一个实施方案中，Y′Y′Y′基序出现在反义链从5′端的11、12 和13位置处。
在一个实施方案中，Y′是2′-O-甲基。
在一个实施方案中，式(III)由式(IIIa)来表示：
正义：5′np-Na-Y Y Y-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′ (IIIa)。
在一个实施方案中，式(III)由式(IIIb)来表示：
正义：5′np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5′ (IIIb)
其中每个Nb或Nb′独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在再另一个实施方案中，式(III)由式(IIIc)来表示：
正义：5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′ (IIIc)
其中每个Nb或Nb′独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，式(III)由式(IIId)来表示：
正义：5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5′
(IIId)
其中每个Nb或Nb′独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列和每个Na或Na′独立地表示包含2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施方案中，双链区为15-30个核苷酸对长。在另一个实施方案中，双链区为17-23个核苷酸对长。在再另一个实施方案中，双链区为17-25个核苷酸对长。在进一步的实施方案中，双链区为 23-27个核苷酸对长。在另一个实施方案中，双链区为19-21个核苷酸对长。在另一个实施方案中，双链区为19-23个核苷酸对长。在另一个实施方案中，双链区为21-23个核苷酸对长。在再另一个实施方案中，每条链具有15-30个核苷酸。在再另一个实施方案中，每条链具有19-30个核苷酸。
在一个实施方案中，核苷酸上的修饰选自LNA、UNA、CRN、 cEt、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C- 烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2’-羟基及其组合。在另一个实施方案中，核苷酸上的修饰为2′-O-甲基或2′-氟修饰。
在一个实施方案中，配体是通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。在另一个实施方案中，配体为
Figure BDA0001214965370000101
在一个实施方案中，配体连接于正义链的3’端。
在另一个实施方案中，RNAi剂如以下示意图中所示与配体偶联
Figure BDA0001214965370000111
其中X是O或S。在特定的实施方案中，X是O。
在一个实施方案中，所述药剂进一步包含至少一个硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团。
在进一步的实施方案中，硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团在一条链的3’-末端。在另一个实施方案中，所述链为反义链。在另一个实施方案中，所述链为正义链。
在一个实施方案中，硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团在一条链的5’-末端。在另一个实施方案中，所述链为反义链。在进一步的实施方案中，所述链为正义链。
在一个实施方案中，硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团在一条链的5’-和3’-端两端。在另一个实施方案中，所述链为反义链。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂包含6-8个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团。在进一步的实施方案中，反义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团和3’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，以及正义链包含正义链的5’-末端或3’-末端的至少两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团。
在一个实施方案中，双链体的反义链5’-端的1位的碱基对是AU 碱基对。在另一个实施方案中，Y核苷酸含有2’-氟修饰。在进一步的实施方案中，Y’核苷酸含有2’-O-甲基修饰。
在一个实施方案中，p’＞0。在另一个实施方案中，p’＝2。在进一步的实施方案中，q’＝0、p＝0、q＝0，和p’个悬端核苷酸与靶mRNA 互补。在再进一步的实施方案中，q’＝0、p＝0、q＝0，和p’个悬端核苷酸与靶mRNA不互补。
在一个实施方案中，正义链具有总共21个核苷酸和反义链具有总共23个核苷酸。
在另一个实施方案中，至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻的核苷酸。在进一步的实施方案中，所有np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻的核苷酸。
在另一个实施方案中，RNAi剂选自表3、4、7、8、11、13和 15任一个中所列的RNAi剂。
在一个方面中，本发明提供了用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂。该双链RNAi剂包含形成双链区的正义链和反义链，其中正义链包含至少15个与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸和反义链包含至少15个与SEQ ID NO：2的核苷酸序列的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸，其中正义链的基本上全部的核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’- 氟修饰的修饰，其中正义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，其中反义链的基本上全部的核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰，其中反义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团和3’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，和其中正义链在3’-末端与通过分支的二价或三价接头连接的一个或多个GalNAc衍生物偶联。
在一个实施方案中，正义链的全部核苷酸和反义链的全部核苷酸包含修饰。
在另一个方面中，本发明提供了能够抑制细胞中的AGT(血管紧张素原)表达的RNAi剂，例如，双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中反义链包含与编码AGT 的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸长，其中双链RNAi剂由式(III)来表示：
正义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′ (III)
其中：
i、j、k和l各自独立地为0或1；
p、p’、q和q’各自独立地为0-6；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np′、nq和nq′，其各自可以存在或不存在，独立地表示悬端核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序，和其中修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰；和
其中正义链与至少一个配体偶联。
在再另一个方面中，本发明提供了能够抑制细胞中的血管紧张素原(AGT)表达的RNAi剂，例如，双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中反义链包含与编码 AGT的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸长，其中双链RNAi剂由式(III)来表示：
正义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′ (III)
其中：
i、j、k和1各自独立地为0或1；
每个np、nq和nq′，其各自可以存在或不存在，独立地表示悬端核苷酸；
p、q和q’各自独立地为0-6；
np’＞0和至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻的核苷酸；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序，和其中修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰；和
其中正义链与至少一个配体偶联。
在进一步的方面中，本发明提供了能够抑制细胞中的血管紧张素原(AGT)表达的RNAi剂，例如，双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中反义链包含与编码 AGT的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸长，其中双链RNAi剂由式(III)来表示：
正义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′
(III)
其中：
i、j、k和1各自独立地为0或1；
每个np、nq和nq′，其各自可以存在或不存在，独立地表示悬端核苷酸；
p、q和q’各自独立地为0-6；
np’＞0和至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻的核苷酸；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序，和其中修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰；和
其中正义链与至少一个配体偶联，其中配体是通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
在另一个方面中，本发明提供了能够抑制细胞中的血管紧张素原 (AGT)表达的RNAi剂，例如，双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中反义链包含与编码AGT 的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸长，其中双链RNAi剂由式(III)来表示：
正义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′
(III)
其中：
i、j、k和1各自独立地为0或1；
每个np、nq和nq′，其各自可以存在或不存在，独立地表示悬端核苷酸；
p、q和q’各自独立地为0-6；
np’＞0和至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻的核苷酸；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序，和其中修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰；
其中正义链包含至少一个硫逐磷酸酯连接基团；和
其中正义链与至少一个配体偶联，其中配体是通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
在再另一个方面中，本发明提供了能够抑制细胞中的血管紧张素原(AGT)表达的RNAi剂，例如，双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中反义链包含与编码 AGT的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸长，其中双链RNAi剂由式(III)来表示：
正义5′np-Na-Y Y Y-Na-nq 3′
反义3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′ (IIIa)
其中：
每个np、nq和nq′，其各自可以存在或不存在，独立地表示悬端核苷酸；
p、q和q’各自独立地为0-6；
np’＞0和至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻的核苷酸；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序，和其中修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰；
其中正义链包含至少一个硫逐磷酸酯连接基团；和
其中正义链与至少一个配体偶联，其中配体是通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
在另一个方面中，本发明提供了包含表3、4、7、8、11、13和 15任一个中所列的RNAi剂的双链RNAi剂。
在另一个方面中，本发明提供了包含修饰的反义多核苷酸剂的组合物，其中所述反义多核苷酸剂能够抑制细胞中的血管紧张素原 (AGT)的表达，并且包含与选自表3、4、7、8、11、13和15中所列序列的正义序列互补的序列，其中该多核苷酸为约14至约30个核苷酸长。
本发明还提供了包含本发明的双链RNAi剂的细胞、载体、宿主细胞和药物组合物。
在一个实施方案中，细胞含有双链RNAi剂。
在一些实施方案中，使用药物组合物来施用双链RNAi剂或包含修饰的反义多核苷酸剂的组合物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含脂质制剂，如XTC 或MC3。
在优选实施方案中，在溶液中施用双链RNAi剂。在一些实施方案中，在未缓冲的溶液中施用双链RNAi剂。在另一个实施方案中，未缓冲的溶液为盐水或水。在另一个实施方案中，将双链RNAi剂与缓冲液一起施用。在再另一个实施方案中，缓冲液包含醋酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任意组合。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在另一个方面中，本发明提供了抑制细胞中血管紧张素原(AGT) 表达的方法。该方法包括将细胞接触双链RNAi剂、药物组合物、包含修饰的反义多核苷酸剂的组合物，或包含RNAi剂的载体并将产生的细胞维持足以获得ATG基因的mRNA转录物降解的时间，由此抑制细胞中ATG基因的表达。
在一个实施方案中，细胞在受试者内。在进一步的实施方案中，受试者是人。在进一步的实施方案中，受试者患有血管紧张素原相关疾病。
在一个实施方案中，AGT表达被抑制至少约30％，约40％，约 50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％，约98％或约100％。
在一个实施方案中，正义链包含至少15个与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸2801-2101；803-843；834-859；803-859；803-875； 834-875；847-875；1247-1271；1566-1624；1570-1624；1584-1624； 1584-1624；1584-1621；2035-2144；2070-2144；2070-2103；2201-2223； 2227-2360；2227-2304；2290-2318；2304-2350；2304-2326；2320-2342； 2333-2360；2333-2358；485-503；517-535；560-578；635-653；803-821； 814-832；822-840；825-843；834-852；837-855；841-859；855-873； 967-985；1247-1265；1248-1266；1249-1267；1251-1269；1253-1271； 1566-1584；1570-1588；1572-1590；1574-1592；1584-1602；1587-1605； 1591-1609；1592-1610；1595-1613；1601-1619；1602-1620；1605-1623； 1729-1747；1738-1756；1739-1757；1741-1769；1767-1785；1810-1828； 1827-1845；1880-1989；1892-1914；1894-1914；1894-2012；2035-2053； 2046-2064；2057-2075；2070-2088；2072-2090；2078-2096；2078-2107； 2078-2011；2080-2098；2081-2099；2081-2104；2081-2011；2082-2100； 2084-2102；2084-2011；2090-2108；2100-2118；2111-2129；2124-2142； 2125-2143；2167-2185；2179-2197；2201-2219；2202-2220；2203-2221； 2204-2222；2227-2245；2230-2248；2234-2252；2244-2264；2255-2273； 2266-2284；2268-2286；2270-2288；2279-2297；2281-2299；2283-2301； 2284-2302；2285-2303；2286-2304；2288-2306；2290-2308；2291-2309； 2291-2311；2291-2318；2291-2315；2292-2310；2294-2312；2296-2314； 2299-2317；2304-2322；2304-2329；2306-2324；2307-2325；2309-2327； 2309-2329；2309-2342；2309-2350；2309-2358；2314-2332；2316-2334； 2317-2335；2320-2338；2321-2339；2323-2341；2325-2343；2326-2344； 2328-2346；2329-2347；2331-2349；2333-2351；2334-2352；2335-2353； 2339-2357；2340-2358或2341-2359的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸。
在另一个方面中，本发明提供了治疗患有血管紧张素原(AGT) 相关失调的受试者的方法，包括将治疗有效量的双链RNAi剂、包含修饰的反义多核苷酸剂的组合物或包含双链RNAi剂的药物组合物施用于受试者，由此治疗受试者。
在另一个方面中，本发明提供了治疗患有血管紧张素原(AGT) 相关失调的受试者的方法，其包括将治疗有效量的双链核糖核酸(RNAi剂)皮下施用于受试者，其中双链RNAi剂包含形成双链区的正义链和反义链，其中正义链包含至少15个与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸和反义链包含至少 15个与SEQ ID NO：2的核苷酸序列的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸，其中反义链的基本上全部的核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰，其中反义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团和3’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，其中正义链的基本上全部的核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰，其中正义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，和其中正义链在3’末端与通过分支的二价或三价接头连接的一个或多个GalNAc衍生物偶联。
在一个实施方案中，正义链的全部核苷酸和反义链的全部核苷酸包含修饰。
在另一个方面中，本发明提供了治疗患有血管紧张素(AGT)相关失调的受试者的方法，其包括将治疗有效量的双链核糖核酸 (RNAi)剂施用于受试者，其中双链RNAi剂包含形成双链区的正义链和反义链，其中正义链包含至少15个与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸2801-2101；803-843；834-859；803-859；803-875；834-875； 847-875；1247-1271；1566-1624；1570-1624；1584-1624；1584-1624； 1584-1621；2035-2144；2070-2144；2070-2103；2201-2223；2227-2360； 2227-2304；2290-2318；2304-2350；2304-2326；2320-2342；2333-2360； 2333-2358；485-503；517-535；560-578；635-653；803-821；814-832； 822-840；825-843；834-852；837-855；841-859；855-873；967-985； 1247-1265；1248-1266；1249-1267；1251-1269；1253-1271；1566-1584； 1570-1588；1572-1590；1574-1592；1584-1602；1587-1605；1591-1609； 1592-1610；1595-1613；1601-1619；1602-1620；1605-1623；1729-1747； 1738-1756；1739-1757；1741-1769；1767-1785；1810-1828；1827-1845； 1880-1989；1892-1914；1894-1914；1894-2012；2035-2053；2046-2064； 2057-2075；2070-2088；2072-2090；2078-2096；2078-2107；2078-2011； 2080-2098；2081-2099；2081-2104；2081-2011；2082-2100；2084-2102； 2084-2011；2090-2108；2100-2118；2111-2129；2124-2142；2125-2143； 2167-2185；2179-2197；2201-2219；2202-2220；2203-2221；2204-2222； 2227-2245；2230-2248；2234-2252；2244-2264；2255-2273；2266-2284； 2268-2286；2270-2288；2279-2297；2281-2299；2283-2301；2284-2302； 2285-2303；2286-2304；2288-2306；2290-2308；2291-2309；2291-2311； 2291-2318；2291-2315；2292-2310；2294-2312；2296-2314；2299-2317； 2304-2322；2304-2329；2306-2324；2307-2325；2309-2327；2309-2329； 2309-2342；2309-2350；2309-2358；2314-2332；2316-2334；2317-2335； 2320-2338；2321-2339；2323-2341；2325-2343；2326-2344；2328-2346； 2329-2347；2331-2349；2333-2351；2334-2352；2335-2353；2339-2357； 2340-2358或2341-2359的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸和反义链包含至少15个与SEQ ID NO：2的核苷酸序列的相应位置的核苷酸的差异不超过3个核苷酸的连续核苷酸，使得反义链与正义链中的该至少15个连续核苷酸基本上互补。在特定实施方案中，正义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。在其他实施方案中，反义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。在再其他实施方案中，基本上全部的两条链的核苷酸是修饰的核苷酸。在一个实施方案中，全部的正义链的核苷酸和全部的反义链的核苷酸是修饰的核苷酸。在一个实施方案中，正义链在3’-末端与连接的配体偶联。
在另一个方面中，本发明提供了治疗患有血管紧张素原(AGT) 相关失调的受试者的方法，其包含将治疗有效量的双链核糖核酸 (RNAi剂)施用于受试者，其中双链RNAi剂包含形成双链区的正义链和反义链，其中正义链包含至少15个来自SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸803-843；834-859；803-859；1247-1271；1566-1624； 1570-1624；1584-1624；1584-1624；1584-1621；2035-2144；2070-2144； 2070-2103；2201-2223；2227-2360；2227-2304；2290-2318；2304-2350； 2304-2326；2320-2342；2333-2360；2333-2358；485-503；517-535； 560-578；635-653；803-821；814-832；822-840；825-843；834-852； 837-855；841-859；855-873；967-985；1247-1265；1248-1266； 1249-1267；1251-1269；1253-1271；1566-1584；1570-1588；1572-1590； 1574-1592；1584-1602；1587-1605；1591-1609；1592-1610；1595-1613； 1601-1619；1602-1620；1605-1623；1729-1747；1738-1756；1739-1757；1741-1769；1767-1785；1810-1828；1827-1845；1880-1989；1894-2012； 2035-2053；2046-2064；2057-2075；2070-2088；2072-2090；2078-2096； 2080-2098；2081-2099；2082-2100；2084-2102；2090-2108；2100-2118； 2111-2129；2124-2142；2125-2143；2167-2185；2179-2197；2201-2219； 2202-2220；2203-2221；2204-2222；2227-2245；2230-2248；2234-2252；2244-2264；2255-2273；2266-2284；2268-2286；2270-2288；2279-2297； 2281-2299；2283-2301；2284-2302；2285-2303；2286-2304；2288-2306； 2290-2308；2291-2309；2292-2310；2294-2312；2296-2314；2299-2317； 2304-2322；2306-2324；2307-2325；2309-2327；2314-2332；2316-2334； 2317-2335；2320-2338；2321-2339；2323-2341；2325-2343；2326-2344；2328-2346；2329-2347；2331-2349；2333-2351；2334-2352；2335-2353； 2339-2357；2340-2358或2341-2359的连续核苷酸和反义链包含至少 15个与SEQ ID NO：2的核苷酸序列的相应位置的核苷酸差异不超过3 个核苷酸的连续核苷酸，使得反义链与正义链中的至少15个连续核苷酸基本上互补。在特定实施方案中，正义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。在其他实施方案中，反义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。再在其他实施方案中，两条链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。在一个实施方案中，正义链与在3’-末端连接的配体偶联。
在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病选自高血压、临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病、肾病、肾衰竭、系统性硬化、宫内发育迟缓(IUGR) 和胎儿生长受限。
在另一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病选自高血压、高血压性心脏病、高血压性肾病、妊娠相关的高血压、动脉粥样硬化、动脉硬化、慢性肾病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、原发性醛固酮增多症和和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭、心肌梗死、中风、糖尿病、肾衰竭和系统性硬化。
在一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病是妊娠相关的高血压 (例如，妊娠诱发的高血压、先兆子痫和子痫)，并且将本发明的iRNA 施用于受试者导致母体血压下降；母体蛋白尿降低；子宫胎盘单元 (uteroplacental unit weight)重量增加；胎儿重量增加；胎儿脑∶肝比率正常化；母体肝中AGT mRNA表达降低和胎盘中hAGT mRNA表达没有显著降低；整体胎盘大小的增加；绒毛胎盘大小的增加；胎盘滋养管的大小没有显著变化；母体肾脏中sFLT1∶PLGF mRNA表达比例的降低；血清FLT1∶PLGF水平比例的降低；和/或AT1的激动性自身抗体的水平降低。
在一个实施方案中，以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg 至约50mg/kg的剂量施用双链RNAi剂。在优选的实施方案中，以约 10mg/kg，约30mg/kg，或约3.0mg/kg的剂量施用双链RNAi剂。在一个实施方案中，以约10mg/kg的剂量施用双链RNAi。在一个实施方案中，每周两次以约0.5mg/kg的剂量施用双链RNAi剂。在另一个实施方案中，每隔一周以约10mg/kg的剂量施用双链RNAi剂。在另一个实施方案中，每周一次以约0.5-1.0mg/kg的剂量施用双链 RNAi剂。在另一个实施方案中，约每周一次，每月一次，每隔两个月一次或一个季度一次(即，每三个月一次)以约0.1mg/kg至约5.0 mg/kg的剂量施用RNAi剂。
在一个实施方案中，皮下或静脉内施用双链RNAi剂。
在一个实施方案中，以两个或更多个剂量施用RNAi剂。
在一个实施方案中，以选自每约12小时一次，每约24小时一次，每约48小时一次，每约72小时一次和每约96小时一次的间隔施用 RNAi剂。
在一个实施方案中，每周两次施用RNAi剂。
在一个实施方案中，每隔一周施用RNAi剂。
在特定实施方案中，每月一次施用RNAi剂。
在特定实施方案中，每隔一月施用RNAi剂。
在特定实施方案中，每个季度(即，每三个月)一次施用RNAi。
在再另一个实施方案中，所述方法进一步包括将另外的治疗剂施用于受试者。在一些实施方案中，另外的治疗剂选自利尿剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β-阻滞剂、血管舒张剂、钙通道阻滞剂、醛固酮拮抗剂、α2-激动剂、肾素抑制剂、α-阻滞剂、外周作用肾上腺素能剂、选择性D1受体部分激动剂、非选择性α-肾上腺素能拮抗剂、合成的甾体抗盐皮质激素剂，或前述的任意组合，以及配制成药物组合的高血压治疗剂。
附图说明
图1是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的示意图，包括系统中已经是治疗干预靶标的各种点的指示(来自Zaman等，(2002) Nat Rev Drug Disc 1：621)。
图2A是描绘了施用AD-60771后妊娠转基因大鼠中平均动脉血压下降的图。
图2B是描绘了施用AD-60771后妊娠转基因大鼠中血清白蛋白降低的图。
图3A是描绘了母体施用AD-60771后增加的子宫胎盘单元重量的图，证明了母体施用AD-60771后胎儿结局的改善。
图3B是描绘了母体施用AD-60771后增加的胎儿重量的图，证明了母体施用AD-60771后胎儿结局的改善。
图3C是描绘了母体施用AD-60771后正常化的胎儿脑∶肝比率的图，证明了母体施用AD-60771后胎儿结局的改善。
图4A是描绘了施用AD-60771后母体肝脏中hATG mRNA降低的图，证明了iRNA不进入胎盘屏障。
图4B是描绘了胎盘中不存在hATG mRNA的显著降低的图，证明了iRNA不进入胎盘屏障。
图5是描绘了母体肝脏、胎盘和胎儿肝脏对于AD-60771的组织暴露的图。
图6A是来自针对细胞角蛋白进行免疫组织化学染色的妊娠野生型大鼠的胎盘切片。
图6B是来自针对细胞角蛋白进行免疫组织化学染色的未治疗妊娠PE大鼠的胎盘切片。
图6C是来自针对细胞角蛋白进行免疫组织化学染色的施用 AD-60771的妊娠PE大鼠的胎盘切片。
图6D是描绘了施用AD-60771的妊娠PE大鼠和未处理的妊娠PE大鼠的子宫肌层三角(mesometrial triangle)大小的图。
图6E是描绘了施用AD-60771的妊娠PE大鼠和未处理的妊娠 PE大鼠的滋养管(trophospongium)大小的图。
图6F是描绘了施用AD-60771的妊娠PE大鼠和未处理的妊娠PE 大鼠的胎盘大小的图。
图6G是描绘了施用AD-60771的妊娠PE大鼠和未处理的妊娠 PE大鼠的迷路(labyrinth)大小的图。
图7A是描绘了施用AD-60771后母体肾中抗血管生成因子sFLT1 的mRNA量降低的图。
图7B是描绘了施用AD-60771后母体肾中血管生成因子PLGF 的mRNA量降低的图。
图7C是母体施用AD-60771后胎盘中抗血管生成因子sFLT1的 mRNA量降低的图。
图7D是母体施用AD-60771后胎盘中血管生成因子PLGF的 mRNA量降低的图。
图8是描绘了施用AD-60771的PE大鼠中AT1-AA水平降低的图，如通过从对照PE大鼠和妊娠PE大鼠分离的AT1-AA对新生大鼠心肌细胞的自发搏动率的影响评价的。
图9A是描绘了施用AD-60771的妊娠PE大鼠与非妊娠PE大鼠相比以及与妊娠对照Sprague-Dawley大鼠相比的血清血管紧张素II (Ang 2-10)水平降低的图。
图9B是描绘了施用AD-60771的妊娠PE大鼠与非妊娠PE大鼠相比以及与妊娠对照Sprague-Dawley大鼠相比的血清人AGT(hAGT) 和大鼠AGT(rAGT)水平降低的图。
具体实施方式
本发明提供了iRNA组合物，其实现了RNA诱导沉默复合体 (RISC)介导的血管紧张素原(AGT)基因的RNA转录物的切割。所述基因可以在细胞内，例如，受试者(如，人)体内的细胞。
本发明还提供了用于治疗患有将受益于使用实现RNA诱导沉默复合体(RISC)介导的AGT基因的RNA转录物的切割的iRNA组合物抑制或降低AGT基因表达的失调的受试者的方法，例如，血管紧张素原相关疾病，如高血压或妊娠相关的高血压。
本发明的iRNA包括具有约为30个核苷酸或更小长度的区域的 RNA链(反义链)，例如，15-30，15-29，15-28，15-27，15-26，15-25，15-24， 15-23，15-22，15-21，15-20，15-19，15-18，15-17，18-30，18-29，18-28， 18-27，18-26，18-25，18-24，18-23，18-22，18-21，18-20，19-30，19-29， 19-28，19-27，19-26，19-25，19-24，19-23，19-22，19-21，19-20，20-30，20-29，20-28，20-27，20-26，20-25，20-24，20-23，20-22，20-21，21-30， 21-29，21-28，21-27，21-26，21-25，21-24，21-23或21-22个核苷酸长，所述区域与AGT基因的mRNA转录物的至少部分基本上互补。在特定实施方案中，本发明的iRNA包括可以包括更长长度的RNA链(反义链)，例如，多达66个核苷酸，例如，36-66，26-36，25-36，31-60， 22-43，27-53核苷酸长，具有与ATG基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补的至少19个连续核苷酸的区域。这些具有更长长度反义链的iRNA包括20-60个核苷酸长的第二RNA链(正义链)，其中正义链和反义链形成18-30个连续核苷酸的双链体。使用这些 iRNA能够实现哺乳动物中相应基因(AGT基因)的mRNA的靶向降解。特别地，非常低剂量的本发明的iRNA可以特异性地和有效地介导RNA干扰(RNAi)，导致相应基因(AGT基因)的表达的显著抑制。使用体外和体内测试，本发明的发明人已经证明了靶向血管紧张素原基因的iRNA可以介导RNAi，导致AGT表达的显著抑制，以及降低与血管紧张素原相关疾病相关的症状，如妊娠相关的高血压(例如，妊娠诱发的高血压、先兆子痫和子痫)。因此，包括这些iRNA 的方法和组合物可用于治疗患有血管紧张素原相关疾病(如高血压) 的受试者。
以下详述公开了怎样制备和使用含有iRNA的组合物来抑制血管紧张素原基因的表达，以及用于治疗患有将受益于AGT表达的抑制和/或降低的疾病和失调的受试者的组合物、用途和方法。
I.定义
为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。此外，应该注意的是，每当一个值或一个参数的取值范围是列举的，其目的是表明这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在此处使用的冠词“一”和“一个”(“a”和“an”)是指一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元素”是指一个元素或超过一个元素，例如多个元素。
术语“包括(including)”用在此处是指短语“包括但不限于”并且与之互换使用。
术语“或”用在此处是指术语“和/或”并且与之互换使用，除非语境清楚的另外指明。
术语“约”在本文中用于表示在本领域典型的容差范围内。如本文中使用的，可以与术语“AGT”互换使用的“血管紧张素原”是指公知的基因和多肽，在本领域中也称为丝氨酸蛋白酶肽酶抑制剂，进化枝A，成员8；α-1抗蛋白酶；抗胰蛋白酶；SERPINA8；血管紧张素I；丝氨酸蛋白酶A8；血管紧张素原II；α-1抗蛋白酶血管紧张素原；抗胰蛋白酶；前-血管紧张素原2；ANHU；丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
术语“AGT”包括人AGT，其氨基酸和完整的编码序列可以在例如 GenBank登录No.GI：188595658(NM_000029.3；SEQ ID NO：1)；食蟹猴(Macaca fascicularis)AGT，其氨基酸和完整的编码序列可以在例如 GenBank登录No.GI：90075391(AB170313.1：SEQ IDNO：3)中找到；小鼠(Mus musculus)AGT，其氨基酸和完整的编码序列可以在例如 GenBank登录No.GI：113461997(NM_007428.3；SEQ ID NO：5)中找到；和大鼠(Rattus norvegicus)AGT，其氨基酸和完整的编码序列可以在例如GenBank登录No.GI：51036672(NM_134432；SEQID NO：7) 中找到。
使用公众可利用的数据库，例如，GenBank、UniProt、OMIM和猕猴(Macaca)基因组项目网站，可以容易地获得AGT mRNA序列的其他实例。
如本文中使用的，术语“AGT”还指AGT基因的天然产生的DNA 序列变型，如AGT基因中的单核苷酸多态性(SNP)。示例性SNP 可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？geneId＝183可得的dbSNP数据库中找到。AGT基因内的序列变型的非限制性实例包括，例如，美国专利No.5,589,584中所述的那些，将其完整内容按引用并入本文中。例如，AGT基因内的序列变化可以包括如位置-532 (相对于转录起始位点)的C→T；位置-386的G→A；位置-218的 G→A；位置-18的C→T；位置-6和-10的G→A和A→C；位置+10 的C→T(未翻译的)；位置+521的C→T(T174M)；位置+597的 T→C(P199P)；位置+704的T→C(M235T)，还可以参见例如Reference SNP(refSNP)Cluster Report：rs699，可在www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP 获得；位置+743的A→G(Y248C)；位置+813的C→T(N271N)；位置+1017的G→A(L339L)；位置+1075的C→A(L359M)和/或位置+1162的G→A(V388M)。
如本文中使用的，“靶序列”是指在AGT基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。在一个实施例中，序列的靶部分将至少足够地长，以在AGT基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列部分处或其附近充当iRNA指导的切割的底物。
靶序列可以是从大约9-36个核苷酸长度，例如大约15-30个核苷酸长度。例如靶序列可以是从大约15-30个核苷酸，15-29、15-28、 15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、 15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、 18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、 19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、 20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、 21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸长度。以上引用的范围和长度的范围与长度中间值也意在成为本发明的部分。
如本文中使用的，术语“包含序列的链”是指含有由相当于使用标准核苷酸命名法描述的序列的核苷酸链的寡核苷酸。
“G”、“C”、“A”、“T”以及“U”每一者通常分别代表包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分(参见，如表2)。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如非限制性地，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包括腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明表征的dsRNA的核苷酸序列中由含有例如肌苷的核苷酸替换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别地替换为鸟嘌呤和尿嘧啶，以形成与靶mRNA的G-U摇摆碱基配对。含有这类替换部分的序列适用于本发明表征的组合物和方法。
术语“iRNA”，“RNAi剂”“iRNA剂”，“RNA干扰剂”在此可互换使用，是指在此所定义的术语包含RNA剂，并且介导通过 RNA诱导沉默复合体(RISC)途径的RNA转录物靶向切割。iRNA 通过已知为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节，例如抑制，AGT在细胞中的表达，如受试者的细胞，如哺乳动物受试者内。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂包括与靶RNA序列，例如AGT靶mRNA序列相互作用以指导靶RNA切割的单链RNA。不希望受理论约束，认为引入细胞中长的双链RNA由称作Dicer的III 型核酸内切酶分解成siRNA(夏普(Sharp)等人，基因与发育(Genes Dev.)2001，15：485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)将dsRNA加工成至具有特征性双碱基3′突出端的19-23碱基对短干扰性RNA(伯恩斯坦(Bernstein)等人，(2001)自然(Nature)409：363)。这些siRNA 随后掺入RNA诱导沉默复合体(RISC)中，在其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，这使得互补性反义链指导靶识别成为可能(尼坎宁(Nykanen)等人，(2001)细胞(Cell)107：309)。一旦与适宜的靶mRNA结合，RISC内部的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(巴希尔(Elbashir)等人，(2001)基因与发育(Genes Dev.) 15：188)。因此，在一个方面，本发明涉及促进实现靶基因(如AGT 基因)沉默的RISC复合物形成的、产生于一个细胞内的单链RNA。所以，术语“siRNA”还可以在此用作指代以上所述的RNAi。
在特定实施方案中，RNAi剂可以是引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA的单链siRNA(ssRNAi)。单链RNAi剂结合RISC核酸内切酶，Argonaute 2，其随后切割靶mRNA。单链siRNA通常为15-30 个核苷酸并且是化学修饰的。单链siRNA的设计和测试描述于美国专利No.8,101,348和Lima等(2012)Cell 150：883-894中，将其完整内容按引用并入本文中。本文中所述的任一个反义核苷酸序列可以用作单链siRNA，如本文中所述的或如通过Lima等(2012)Cell 150： 883-894中所述的方法化学修饰的。
在另一个实施方案中，本发明组合物、用途、和方法中使用的“iRNA”是双链RNA，并且在此是指“双链RNAi剂”、“双链RNA (dsRNA)分子”、“dsRNA剂”、或“dsRNA”。术语“dsRNA”，是指核糖核酸分子的复合体，其具有双链结构，包括两条反向平行的和基本上互补的核酸链，被称为相对于靶RNA，即AGT基因，具有“正义的”和“反义的”定向。在本发明的一些实施方案中，双链 RNA(dsRNA)通过转录后基因沉默机制(在此是指RNA干扰或 RNAi)引发靶RNA，如mRNA，的降解。
通常，dsRNA分子每条链的大部分核苷酸是核糖核苷酸，但如本文中详细描述的，每条或两条链还可以包含一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。此外，如本说明书中使用的，“RNAi剂”可以包含具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi 剂可以在多个核苷酸处包括实质的修饰。如本文中使用的，术语“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷酸间连接基团和/或修饰的核碱基的核苷酸。因此，术语修饰的核苷酸包括核苷酸间连接基团、糖部分或核碱基的(例如官能团或原子的)置换、添加或去除。适用于本发明的药剂的修饰包括本文中公开的或本领域已知的所有类型的修饰。任何这样的修饰，如siRNA型分子中使用的，出于本说明书和权利要求的目的包括在“RNAi剂”中。
dsRNA分子每条链的大部分核苷酸可以是核糖核苷酸，但如本文中详细描述的，每条链或两条链还可以包含一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。此外，如本说明书中使用的，“RNAi剂”可以包含具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi 剂可以在多个核苷酸处包括实质的修饰。如本文中使用的，术语“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷酸间连接基团和/或修饰的核碱基的核苷酸。因此，术语修饰的核苷酸包括核苷酸间连接基团、糖部分或核碱基的(例如官能团或原子的)置换、添加或去除。适用于本发明药剂的修饰包括本文中公开的或本领域已知的所有类型的修饰。任何这样的修饰，如siRNA型分子中使用的，用于本说明书和权利要求的目的包括在“RNAi剂”中。
双链体区域可以是允许在RISC途径中期望靶RNA特异降解的任何长度，并且长度可以是从大约9至36碱基对，例如约15-30个碱基对长度，例如约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35或36个碱基对长度，如约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、 15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、 18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、 18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、 19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、 20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、 21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对长度。以上引用的范围和长度的范围与长度中间值也意在成为本发明的部分。
形成双链体结构的两条链可以是一个更大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。在这两条链是一个更大分子的部分并且因此通过一条链的3’-末端与形成该双链体结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链而连接的情况下，该连接的 RNA链称作“发夹环”。发夹环可以包括至少一个非配对的核苷酸。在一些实施方案中，发夹环可以包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个非配对的核苷酸。
当dsRNA的两个基本上互补的链包含分离的RNA分子时，这些分子不是必须的，但是可以共价地连接。在这两条链是通过除了一条链的3’-末端与形成该双链体结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链以外的方式而共价连接的情况下，该连接结构称作“接头(linker)”。这些RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去存在于该双链体中的任何悬端。除了双链体结构，一个RNAi可以包括一个或多个核苷酸悬端。
在特定实施方案中，本发明的RNAi剂是与靶RNA序列(例如， AGT基因)相互作用的dsRNA，其每条链包含19-23个核苷酸，不希望受到理论的束缚，引入细胞中的长的双链RNA通过称为Dicer 的III型核苷酸内切酶分解成siRNA(Sharp等(2001)Genes Dev. 15：485)。Dicer，一种核糖核酸酶III-样酶，将dsRNA加工成19-23 个碱基对的短干扰RNA，具有特征性的两碱基3’悬端(Bernstein等， (2001)，Nature 409：363)。然后将siRNA结合至RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一个或多个解旋酶解开siRNA双链体，从而使得互补反义链能够指导靶识别(Nykanen等，(2001)，Cell 107：309)。在结合合适的靶mRNA时，RISC内的一个或多个核酸内切酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等，(2001)Genes Dev.15：188)。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂是与靶RNA序列(例如， AGT靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA切割的24-30个核苷酸的dsRNA。不希望受到理论的束缚，引入细胞中的长的双链RNA通过称为Dicer的III型核苷酸内切酶分解成siRNA(Sharp等(2001) GenesDev.15：485)。Dicer，一种核糖核酸酶III-样酶，将dsRNA加工成19-23个碱基对的短干扰RNA，具有特征性的两碱基3’悬端 (Bernstein等，(2001)，Nature 409：363)。然后将siRNA结合至 RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一个或多个解旋酶解开siRNA 双链体，从而使得互补反义链能够指导靶识别(Nykanen等，(2001)， Cell 107：309)。在结合合适的靶mRNA时，RISC内的一个或多个核酸内切酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等，(2001)Genes Dev.15：188)。
如本文中使用的，术语“核苷酸悬端”是指至少一个非配对的核苷酸，其从iRNA的双链体结构(例如，dsRNA)悬端。例如当dsRNA 的一条链的3′-端延伸超过另一条链的5′-端时或反之亦然，存在核苷酸悬端。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的悬端；可替代地，该悬端可以包括至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少 5个或更多个核苷酸。核苷酸悬端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个悬端可以处于正义链、反义链或其任意组合上。另外，悬端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的反义或正义链的5′末端、3′末端或两个末端上。
在一个实施方案中，dsRNA的反义链在3’-端和/或5’-端具有1-10 个核苷酸的悬端，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一个实施方案中，dsRNA的正义链在3’-端和/或5’-端具有1-10个核苷酸的悬端，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在特定实施方案中，正义链或反义链或两条链上的悬端可以包括长于 10个核苷酸的延长长度，例如，1-30个核苷酸、2-30个核苷酸、10-30 个核苷酸或10-15个核苷酸长。在特定实施方案中，延长的悬端在双链体的正义链上。在特定实施方案中，延长的悬端存在于双链体的正义链的3’端上。在特定实施方案中，延长的悬端存在于双链体的正义链的5’端上。在特定实施方案中，延长的悬端在双链体的反义链上。在特定实施方案中，延长的悬端存在于双链体的反义链的3’端上。在特定实施方案中，延长的悬端存在于双链体的反义链的5’端上。在特定实施方案中，悬端中的一个或多个核苷酸用核苷硫代磷酸酯来替代。
“钝”或“平端”表示在双链RNAi剂的末端不存在未配对的核苷酸，即，没有核苷酸悬端。“平端的”RNAi剂是在其整个长度上都是双链的dsRNA，即，在分子的任一端都没有核苷酸悬端。本发明的 RNAi剂包括在一端具有核苷酸悬端(即，具有一个悬端和一个平端的剂)或在两端具有核苷酸悬端的RNAi剂。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA(如dsRNA)的链，该链包括基本上与一个靶序列互补的区域，如AGT mRNA。如本文中使用的，术语“互补性区域”是指该反义链上基本上与一个序列互补的区域，例如在此定义的一个靶序列，如AGT核苷酸序列。在互补区域不与靶序列完全互补的情况下，错配可以存在于分子的内部或末端区域内。通常，最耐受的错配存在于末端区域内，例如在iRNA的 5′-和/或3′-末端的5、4、3或2个核苷酸内部。
如本文中使用的，术语“正义链”或“随从链”是指含有与在此所定义的术语的反义链区域基本上互补的区域的iRNA链。
如本文中使用的，术语“切割区”是指位置紧邻切割位点的区域。切割位点是靶标上发生切割的位点。在一些实施方案中，切割区在切割位点任一端上且紧邻切割位点包含三个碱基。在一些实施方案中，切割区在切割位点任一端上且紧邻切割位点包含两个碱基。在一些实施方案中，切割位点特别地出现在由反义链的核苷酸10和11限制的位点，并且切割区包含核苷酸11、12和13。
如本文中使用的，除非另有陈述，术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，是指含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如本领域技术人员所理解。这类条件可以例如是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mM PIPES，pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16 小时，随后洗涤(参见例如“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning： A Laboratory Manual)，萨拉布鲁克(Sambrook)等人(1989)冷泉港实验室出版社)。可以使用其他条件，如在如生物内部可能遭遇的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交的核苷酸的最终应用来确定两序列互补测试的最适条件集。
在iRNA内部(例如在如本文所述的dsRNA内部)的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整个长度范围内的碱基配对。此类序列在此可以称作相对于彼此“完全互补”。然而，在此在一个第一序列被称作相对于一个第二序列“基本上互补”的情况下，这两序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交成多达 30个碱基对的双链时形成一个或多个，但是总体上不多于5个、4个、 3个或2个错配碱基配对，同时保留了在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如通过RISC途径抑制基因表达。然而，在两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链悬端的情况下，此类悬端不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如出于在此描述的目的，以下这样一种dsRNA也可以称作“完全互补”：该dsRNA包括长度为21个核苷酸的一个寡核苷酸以及长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸，其中该更长的寡核苷酸包括一个与该更短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列。
如在此使用的，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/ 或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G：U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsRNA的正义链与反义链之间，或iRNA剂的反义链与靶序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。
如在此使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸指与感兴趣的mRNA(例如编码AGT的mRNA)的一个连续部分基本互补的多核苷酸。例如如果一种多核苷酸与编码AGT 的mRNA的非间断部分基本上互补，则该序列与AGT mRNA的至少一部分互补。
因此，在一些实施方案中，本文中公开的反义链多核苷酸与靶 AGT序列完全互补。在其他实施方案中，本文中公开的反义链多核苷酸与靶AGT序列基本上互补并且包含在其整个长度上与SEQ ID NO： 1的核苷酸序列的等同区域或SEQ ID NO：1的片段至少约80％互补的连续核苷酸序列，如约85％、约90％或约95％互补。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂包括与反义多核苷酸基本上互补的正义链，所述反义多核苷酸随之与靶AGT序列互补，并且其中正义链多核苷酸包含在其整个长度上与SEQ ID NO：2的核苷酸序列的等同区域或SEQ ID NO：2任一的片段至少约80％互补的连续核苷酸序列，如约85％、约90％或约95％互补。
总体上，每一链的大部分的核苷酸是核糖核苷酸，但是如在此详述的，两条链的每一者或两者还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如一种脱氧核糖核苷酸和/或一种经修饰的核苷酸。此外，“iRNA”可以包括化学修饰的核糖核苷酸。这些修饰可以包括在此披露的或在本领域中已知的所有类型的修饰。如在iRNA分子中所使用的任何此类修饰被“iRNA”所囊括用于本说明书以及权利要求书的目的。
在本发明的一个方面中，用于本发明的方法和组合物中的药剂是单链反义RNA分子，其通过反义抑制机制抑制靶mRNA。单链反义 RNA分子与靶mRNA内的序列互补。单链反义寡核苷酸可以以化学计量方式通过与mRNA的碱基配对和物理阻碍翻译机制来抑制翻译，参见Dias，N.等，(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。单链反义RNA 分子可以为约15至约30个核苷酸长并且具有与靶序列互补的序列。例如，单链反义RNA分子可以包含作为来自本文中所述的任一个反义序列的至少约15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的序列。
在此使用的术语“抑制”，可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语交替使用，并且包括任何水平的抑制。
在此处使用的短语“抑制AGT的表达”包括抑制任何AGT基因的表达(例如小鼠的AGT基因，大鼠的AGT基因，猴子的AGT 基因，或人的AGT基因)以及编码AGT蛋白的AGT基因的变体或突变体。
“抑制AGT基因的表达”包括任何水平的AGT基因的抑制，例如，AGT基因表达的至少部分遏制，如抑制至少约20％。在特定实施方案中，抑制为至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约 40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约 65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约 95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
可以基于与AGT基因表达相关的任何变量的水平来评价AGT基因的表达，例如，AGTmRNA水平或AGT蛋白水平。可以通过与对照水平相比，这些变量中一个或多个的绝对或相对水平的降低来评价抑制。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如，给药前的基线水平，或从未处理或用对照(如，例如，仅缓中剂的对照或无活性剂对照)处理的相似受试者、细胞或样品测定的水平。
在一个实施方案中，对AGT基因的表达的至少部分的压制是通过以下评估：可从AGT基因在其中转录的一个第一细胞或一组第一细胞(已经经过处理由此AGT基因的表达被抑制)中分离的或检测到的AGTmRNA的量减少，这是与一个第二细胞或一组第二细胞(对照细胞)相比，该一个第二细胞或一组第二细胞与该一个第一细胞或一组第一细胞基本上相同，除了未经受如此的处理。抑制程度可如以下表示
Figure BDA0001214965370000381
如此处使用的短语“使细胞接触RNAi剂”(如一种dsRNA)包括通过任何可能的手段接触细胞。使细胞接触RNAi剂包括在体外使细胞接触iRNA或在体内使细胞接触iRNA。该接触可以直接或间接地进行。因此，例如RNAi剂可通过执行该方法的个体与细胞的物理接触，或者可替代地，RNAi剂可进入许可或导致它后来接触到该细胞的一种情况。
在体外接触细胞可通过例如用该RNAi剂孵育该细胞来进行。体内接触细胞可以通过以下进行，例如通过将RNAi剂注入该细胞所在的组织或其附近，或通过将RNAi剂注入另一个区域例如血流或皮下空间，这样该药剂将随后到达待要接触的细胞所在的组织。例如该 RNAi剂可包含和/或被偶联到一个配体，例如GalNAc3，其用来将 RNAi剂引导到感兴趣的位点例如肝脏。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如也可以在体外用RNAi剂接触细胞，并随后移植入受试者。
在一个实施方案中，使细胞与一种iRNA接触包括通过促进或实现摄取或吸收入细胞来将该iRNA“引入”或“递送到该细胞”。吸收或摄取iRNA可以通过无协助扩散过程或主动细胞过程或借助助剂或装置发生。向细胞中引入iRNA可以在体外和/或体内进行。例如对于体内引入，可以将iRNA注射到组织位点中或全身施用。体内递送也可以由β-葡聚糖递送系统来进行，例如在美国专利号5,032,401和 5,607,677和美国公开号2005/0281781(特此将其全部内容通过引用结合在此)中所述的那些。体外引入细胞内包括本领域内已知的方法，例如电穿孔以及脂质转染法。其他方案在下文描述和/或是本领域已知的。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包括封装一种药物活性分子 (如核酸分子，例如iRNA或iRNA从其中转录的质粒)的脂质层的一种囊泡。LNP描述在例如美国专利号6,858,225、6,815,432、8,158,601 和8,058,069中，特此将其全部内容通过引用结合在此。
如此处使用的，“受试者”是动物，例如哺乳动物，包括灵长类动物(如人、非人灵长类动物(例如猴子和黑猩猩))、非灵长类(如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马、以及鲸)、或鸟(如鸭或鹅)。在一个实施方案中，该受试者是人，例如正针对一种疾病、障碍或病症进行治疗或评估的、将从减少AGT表达受益的人；处于对一种疾病、障碍或病症的风险中的、将从减少AGT表达受益的人；患有一种疾病、障碍或病症的、将从减少AGT表达受益的人；和/或如此处所述的正针对一种疾病、障碍或病症进行治疗的、将从减少AGT表达受益的人。
如本文中使用的，术语“治疗(treating)”或“处理(treatment)”是指有益或所需的结果，包括，但不限于，与不需要的AGT表达相关的一个或多个症状的缓解或改善，所述症状例如为，血管紧张素II 1型受体激活(AT1R)(例如，高血压、慢性肾病、中风、心肌梗死、心力衰竭、动脉瘤、外周动脉疾病、心脏病、提高的氧化应激(例如，提高的超氧化物形成)、炎症、血管收缩、钠和水潴留、钾和镁损失、肾素遏制、心肌细胞和平滑肌肥大、提高的胶原蛋白合成、血管的刺激、心肌和肾纤维化、提高的心脏收缩率和收缩力、改变的心率(例如，提高的心律失常)、血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂1(PAI1) 的刺激、交感神经系统的激活和提高的内皮素分泌)，妊娠相关高血压的症状(例如，先兆子痫和子痫)，包括，但不限于，宫内发育迟缓受限(IUGR)或胎儿生长受限，与恶性高血压相关的症状，与高醛甾酮症相关的症状；降低不需要的AT1R激活的程度；慢性AT1R 激活状态的稳定(即，没有恶化)；不需要的AT1R激活(例如，高血压、慢性肾病、中风、心肌梗死、心力衰竭、动脉瘤、外周动脉疾病、心脏病、提高的氧化应激(例如，提高的超氧化物形成)、炎症、血管收缩、钠和水潴留、钾和镁损失、肾素遏制、心肌细胞和平滑肌肥大、提高的胶原蛋白合成、血管的刺激、心肌和肾纤维化、提高的心脏收缩率和收缩力、改变的心率(例如，提高的心律失常)、血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)的刺激、交感神经系统的激活和提高的内皮素分泌)的改善或缓解，不管是可检测或不可检测的。“治疗”还可以表示与不存在治疗的情况下预期的存活相比延长存活。
受试者中的AGT或者疾病标志物或症状水平的情况中的术语“较低”是指此类水平的统计学显著的降低。降低可以为例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高并且优选下降至可接受的水平，如没有此类失调的个体的正常范围内。
如本文中使用的，“预防(prevention)”或“防止(preventing)”用于将受益于AGT基因表达降低的疾病、失调或其病症时是指受试者将产生与此类疾病、失调或病症相关症状的可能性降低，例如，不需要的AT1R激活的症状，例如，高血压、慢性肾病、中风、心肌梗死、心力衰竭、动脉瘤、外周动脉疾病、心脏病、提高的氧化应激(例如，提高的超氧化物形成)、炎症、血管收缩、钠和水潴留、钾和镁损失、肾素遏制、心肌细胞和平滑肌肥大、提高的胶原蛋白合成、血管的刺激、心肌和肾纤维化、提高的心脏收缩率和收缩力、改变的心率(例如，提高的心律失常)、血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂1(PAI1) 的刺激、交感神经系统的激活和提高的内皮素分泌。例如，当具有一个或多个高血压风险因子的个体未发生高血压或相对于具有相同风险因子但没有接受本文中所述治疗的群体发生不太严重的高血压时，发生例如高血压的可能性降低。未产生疾病、失调或病症，或与此类疾病、失调或病症相关症状的发展降低(例如，对于该疾病或失调的临床上可接受尺度上至少约10％降低)，或延迟症状的呈现(例如，延迟数天、数周、数月或数年)被认为是有效预防。
如本文中使用的，术语“血管紧张素原相关疾病”或“AGT相关疾病”是由肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活引起或与肾素- 血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)相关的疾病或失调，或是其症状或其进展对应于RAAS失活的疾病或失调。术语“血管紧张素原相关疾病”包括将受益于AGT表达降低的疾病、失调或病症。这样的疾病通常与高血压相关。血管紧张素原相关疾病的非限制性实例包括高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为essential hypertension(原发高血压)或特发性高血压)、继发性高血压(也称为inessential hypertension(非原发性高血压))、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。
基于在两次或多次诊所就诊过程中正确测量的坐位血压读数的平均值，具有正常血压的受试者是具有约90-119mmHg(约12-15.9 kPa(kN/m2))收缩压和约60-79mmHg(约8.0-10.5kPa(kN/m2)) 舒张压的受试者；具有高血压前期的受试者是具有约120-139mmHg(约16.1-18.5kPa(kN/m2))收缩压和约60-79mmHg(约8.0-10.5kPa (kN/m2))舒张压的受试者；具有高血压(例如，I期高血压)的受试者是具有约140-159mmHg(约18.7-21.2kPa(kN/m2))收缩压和约90-99mmHg(约12.0-13.2kPa(kN/m2))舒张压的受试者；具有高血压(例如，II期高血压)的受试者是具有约≥160mmHg(约≥21.3 kPa(kN/m2))收缩压和约≥100mmHg(约≥13.3kPa(kN/m2))舒张压的受试者。具有超过130/80mmHg血压连同1型或2型糖尿病或肾病的受试者认为是患有高血压的。
在一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病是原发性高血压。“原发性高血压”是环境或遗传因素的结果(例如，没有明显基础医学原因的结果)。
在一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病是继发性高血压。“继发性高血压”具有可鉴别的基础失调，其可以是多种病因的，包括肾、血管和内分泌原因，例如，肾实质疾病(例如，多囊肾、肾小球或间质病)、肾血管病(例如，肾动脉狭窄、纤维肌肉发育异常)、内分泌失调(例如，肾上腺皮质激素或盐皮质激素过多、嗜铬细胞瘤、甲亢或甲减、生长激素过多、甲状旁腺机能亢进)、主动脉缩窄或口服避孕药使用。
在一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病是高血压危症，例如，恶性高血压和急进性高血压。“急进性高血压”是严重升高的血压 (即，等于或高于180mmHg的收缩压或110mmHg的舒张压)，对一个或多个终末器官具有直接损伤。血压必须立即降低以防止进一步的器官损伤。“恶性高血压”是严重升高的血压(等于或高于180mmHg 的收缩压或110mmHg的舒张压)，对一个或多个终末器官和视乳头水肿具有直接损伤。血压必须立即降低以防止进一步的器官损伤。由于不受控制的血压引起的神经系统终末器官损伤可以包括高血压脑病、脑血管意外/脑梗死；蛛网膜下出血，和/或颅内出血。心血管终末器官损伤可以包括心肌缺血/梗塞、急性左心室机能障碍、急性肺水肿和/或主动脉夹层。其他器官系统也可能受到不受控的高血压的影响，其可能倒是急性肾衰竭/肾功能不全、视网膜病、子痫或微血管病性溶血性贫血。
在一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病是高血压急迫状态。“高血压急迫状态”是严重升高的血压(即，等于或高于180mmHg 的收缩压或110mmHg的舒张压)，对一个或多个器官没有直接损伤。血压可以在几小时内安全地降低。
在一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病是妊娠相关的高血压，例如，慢性妊娠高血压、妊娠高血压、先兆子痫、子痫、先兆子痫合并慢性高血压、HELLP综合征和妊娠高血压(也称为短暂性妊娠高血压、妊娠后半期发现的慢性高血压和妊娠诱发的高血压(PIH))。患有“慢性妊娠高血压”的受试者是在怀孕前或20周妊娠前具有超过140/90mmHg血压的受试者。“妊娠高血压”或“妊娠诱发的高血压”是指妊娠后期(＞20周妊娠)发作的，没有先兆子痫的任何其他特征，接着产后血压正常化的高血压。“轻度先兆子痫”定义为在20周妊娠前血压正常的女性中存在两次高血压(血压≥140/90mmHg)，间隔至少六小时，但没有终末器官损伤的证据。在具有预先存在的原发性高血压的受试者中，如果收缩压提高30mmHg 或如果舒张压提高15mmHg，则诊断为先兆子痫。“严重先兆子痫”定义为在先兆子痫存在情况下存在以下症状或体征之一：间隔至少六小时的两次160mmHg或更高的收缩压或110mmHg或更高的舒张压； 24小时收集中高于5g的蛋白尿或至少四小时间隔收集的两个随机尿样中高于3+，肺水肿或发绀，少尿(24小时中＜400mL)，持续性头疼，上腹疼和/或受损的肝功能，血小板减少，羊水过少，降低的胎儿生长或胎盘早剥。“子痫”定义为不能归因于患有先兆子痫的女性中的其他原因的病情发作。“HELLP综合征”(也称为B型水肿-蛋白尿-高血压妊娠中毒)是妊娠受试者中的溶血、升高的肝酶水平和低的血小板水平。
在一个实施方案中，血管紧张素原相关疾病是顽固性高血压。“顽固性高血压”是尽管同时使用三种不同类别的抗压药(其中之一是噻嗪类利尿剂)，仍保持高于目标(例如，140/90mmHg)的血压。用四种或更多种药物控制血压的受试者也认为是患有顽固性高血压。
如本文中使用的，“治疗有效量”意图包括在施用于患有血管紧张素原相关疾病的受试者时足以实现疾病治疗(例如，通过减轻、缓解或维持现有疾病或疾病的一个或多个症状)的RNAi剂的量。“治疗有效量”可以根据RNAi剂、怎样施用药剂、疾病及其严重性以及待治疗受试者的病史、年龄、体重、家族史、遗传构成、之前或伴随治疗的类型(如果有的话)和其他个体特征而改变。
如本文中使用的，“预防有效量”意图包括在施用于患有血管紧张素原相关疾病的受试者时足以预防或改善疾病易感受试者(即，由于一个或多个因素，例如，年龄、体重、妊娠，比一般群体中的个体更可能患有疾病)的疾病或疾病的一个或多个症状的iRNA的量。缓解疾病包括减缓疾病的进程或降低之后发生疾病的严重性。“预防有效量”可以根据iRNA、怎样施用药剂、疾病风险程度以及待治疗受试者的病史、年龄、体重、家族史、遗传构成、之前或伴随治疗的类型(如果有的话)和其他个体特征而改变。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括在合理的适用于任何治疗的效益/风险比下产生一些希望的局部或全身效果的RNAi剂的量。在本发明的方法中使用的iRNA能以足够于产生适用于这种治疗的合理的效益/风险比的量给予。
此处使用的短语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在正确医学判断范围内，适合于接触人类受试者和动物受试者的组织而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。
如此处使用的，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料(涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运送到身体的另一个器官或部分)。在与该配制品的其他成分相容并且对所治疗的受试者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3) 纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素； (4)粉末状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡； (9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓中剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16) 无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20) pH缓中溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酐；(22)膨胀剂，例如多肽和氨基酸(23)血清成分，如血清白蛋白、HDL和LDL；以及(22)在药物配制品中使用的其他非毒性相容物质。
如此处使用的，术语“样品”包括从受试者体内分离的类似的流体、细胞、或组织，以及受试者体内存在的流体、细胞、或组织的一个集合。生物流体的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、脑脊髓液、眼内液(ocular fluid)、淋巴液、尿液、唾液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如样品可以源自特定器官、器官部分、或这些器官内的流体或细胞。在某些实施方案中，样品可源自于肝脏(例如整个肝脏或肝脏的某些段，或肝脏中的某些类型的细胞，例如肝上皮实质细胞)。在一些实施方案中，“源自受试者的样品”是指取自于该受试者的血液或血浆。
II.本发明的iRNA
本发明提供了抑制AGT基因表达的iRNA。在一个实施方案中， iRNA剂包括用于抑制细胞中的AGT基因表达的双链核糖核酸 (dsRNA)分子，所述细胞如受试者体内的细胞，所述受试者如哺乳动物，如患有血管紧张素原相关疾病(例如，高血压)的人。dsRNA 包含反义链，该反义链具有与AGT基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补的互补区域。互补性区域是约30个核苷酸或更小的长度 (例如约30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、 22个、21个、20个、19个或18个核苷酸或更小的长度)。当与表达AGT基因的细胞接触时，该iRNA将该AGT基因(例如人类、灵长类、非灵长类、或鸟Sertpincl基因)的表达抑制至少约10％，如通过一种基于PCR或支链DNA(bDNA)的方法或通过一种基于蛋白质的方法，如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹法或流式细胞技术所评估的。
dsRNA包括互补并在其中将使用dsRNA的条件下杂交以形成双链体结构的两条RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包含一个互补性区域，该互补性区域基本上互补于并且通常完全互补于靶序列。靶序列可以源自AGT基因表达期间形成的mRNA的序列。另一条链(正义链)包括与反义链互补的区域，从而在适合的条件下组合时，这两条链杂交并形成双链体结构。如本文中他处描述并且如本领域已知，与处在分立的寡核苷酸上相反，dsRNA的互补序列也可以作为单一核酸分子的自我互补区域包括。
通常，双链体结构是15到30个碱基对之间的长度，例如在15-29、 15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、 15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、 18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、 20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、 21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对之间的长度。以上引用的范围和长度的范围与长度中间值也意在成为本发明的部分。
类似地，靶序列的互补区域是在15到30个核苷酸之间的长度，例如在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、 15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、 18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、 19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、 20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、 20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸之间的长度。以上引用的范围和长度的范围与长度中间值也意在成为本发明的部分。
在一些实施方案中，dsRNA为约15至约20个核苷酸长，约25 至约30个核苷酸长，或约15至约23个核苷酸长。通常，dsRNA足够长以用作Dicer酶的底物。例如在本领域所熟知的，长度大于约 21-23个核苷酸的dsRNA可以作为Dicer酶的底物。如普通技术人员也将认识，被靶向以便切割的RNA区域将最经常是较大RNA分子(往往是mRNA分子)的部分。在相关的情况下，mRNA靶的“一部分”是mRNA靶的连续序列，其长度足够以便允许其作为RNAi指导的切割的底物(即，经RISC途径的切割)。
本领域技术人员将也认识到，双链体区是dsRNA的主要功能性部分，例如大约9至36个碱基对，例如大约10-36、11-36、12-36、 13-36、14-36、15-36、9-35、10-35、11-35、12-35、13-35、14-35、 15-35、9-34、10-34、11-34、12-34、13-34、14-34、15-34、9-33、10-33、11-33、12-33、13-33、14-33、15-33、9-32、10-32、11-32、12-32、 13-32、14-32、15-32、9-31、10-31、11-31、12-31、13-32、14-31、 15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、 15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、 18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、 19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、 19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、 21-23、或21-22个碱基对的双链体区。因此，在一个实施方案例中，为了达到被加工成靶向所需RNA进行切割的功能性双链体(例如 15-30个碱基对)，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或 RNA分子复合物是dsRNA。因此，普通技术人员将认识到，在一个实施方案中，miRNA是dsRNA。在另一个实施方案中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施方案中，用于靶向AGT表达的iRNA剂不是在靶细胞中通过切割较大dsRNA产生的。
如本文所述的dsRNA可以进一步包括一个或多个单链核苷酸悬端，如1、2、3、或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸悬端的dsRNA 相对于它们的平端化对应物，可具备出乎意料优越的抑制性特性。核苷酸悬端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。该一个或多个悬端可以处于正义链、反义链或其任意组合上。另外，悬端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的反义或正义链的5′末端、3′末端或两个末端上。如本文中讨论的，多达30个核苷酸长的延长悬端也考虑在本发明的各个实施方案中。
dsRNA可以通过如进一步在以下所讨论的、本领域内已知的标准方法来进行合成，例如通过使用自动化的DNA合成仪，例如从例如 Biosearch，Applied Biosystems
Figure BDA0001214965370000481
Inc.可商购的合成仪。
本发明的iRNA化合物可以使用二步程序制备。首先，分别制备该双链RNA分子的各链。然后，将这些组分链退火。该siRNA化合物的各链可以通过使用溶液相或固相有机合成或二者来制备。有机合成提供了以下优点，可以容易地制备包含非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸链。本发明的单链寡核苷酸可以通过使用溶液相或固相有机合成或二者来制备。
在一个方面，本发明的dsRNA包含至少两个核苷酸序列，一个正义序列和一个反义序列。该正义链选自表3、4、7、8、11、13和 15中任一个提供的序列的组，并且相应的反义链选自表3、4、7、8、 11、13和15中的任一个的序列的组。在这个方面，两个序列的一者与两个序列的另一者互补，其中所述序列中的一者与AGT基因表达中产生的mRNA的序列基本上互补。照此，在这个方面，dsRNA将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述为表3、4、7、8、11、 13和15中的任一个中的正义链，并且第二个寡核苷酸被描述为表3、 4、7、8、11、13和15中的任一个中的正义链的相应反义链。在一个实施方案中，该dsRNA的基本上互补的序列包含在独立的寡核苷酸上。在另一个实施方案中，该dsRNA的基本上互补的序列包含在一个单独的寡核苷酸上。
应当理解的是，虽然表3、4、7、8、11、13和15中的一些序列被描述为修饰的和/或偶联的序列，本发明的iRNA的RNA(如本发明的dsRNA)可以包括表3、4、7、8、11、13和15中列出的任何一个序列，该序列是未修饰的、非偶联的，和/或不同于此处所述的修饰的和/或偶联的。
在另一个方面中，本发明的用于抑制血管紧张素原表达的双链核糖核酸(dsRNA)包含正义链和反义链，或基本上由正义链和反义链组成，或由正义链和反义链组成，其中正义链包含表3、4、7、8、11、 13和15中的正义链的核苷酸序列和反义链包含表3、4、7、8、11、13和15中的相应反义链的核苷酸序列。
熟练的技术人员将很好的意识到，具有约20与23个碱基对之间 (例如21个碱基对)的双链体结构的dsRNA被奉为是尤其有效地诱导RNA干扰(厄尔巴瑟(Elbashir)等人，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而，其他人已经发现较短或较长的RNA双链体结构物也可以是有效的(朱(Chu)和拉纳(Rana)(2007)RNA 14：1714-1719；金姆 (Kim)等人(2005)自然生物技术(Nat Biotech)23：222-226)。在上文描述的实施例中，由于表3、4、7、8、11、13和15中的任一个中提供的寡核苷酸序列的性质，此处所述的dsRNA可以包括长度最小21个核苷酸的至少一条链。可以合理地预期，具有表3、4、7、8、 11、13和15中的任一个的序列之一的、在一个末端或两个末端减去仅仅数个核苷酸的更短的双链体与以上描述的dsRNA相比可以类似地有效。因此，在本发明的范围内构思这样的dsRNA，它们具有源自于表3、4、7、8、11、13和15中的任一个的序列之一的至少15个、 16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的序列并且在它们抑制AGT基因表达不多于约5％、10％、15％、20％、25％、或 30％的能力方面与包括全序列的dsRNA不同。
此外，表3、4、7、8、11、13和15中任一个提供的RNA鉴定在AGT转录物中对RISC介导的切割敏感的一个或多个位点。照此，本发明进一步表征了靶向这些位点中的一个的内部的iRNA。如本文所用，如果一种iRNA促进在某个特定位点内部任何地方切割RNA 转录物，则称这种iRNA靶向该转录物内部的这个特定位点。这种iRNA通常将包括来自表3、4、7、8、11、13和15中任一个提供的一个序列的至少约15个连续核苷酸，该连续核苷酸与从AGT基因中的选择序列保持连续的区域所取得的额外核苷酸序列连接。
尽管靶序列总体上是约15-30个核苷酸长度，但是在这个范围内的特定序列指导任何给定靶RNA切割的适用性方面存在广泛变异。此处所列出的各种软件包和准则提供了用于鉴别对于任何给定的基因靶的最佳靶序列的准则，但还可以采取经验方法，其中一个给定尺寸(如一个非限制性实例，21个核苷酸)的“窗口”或“掩模”被照字面地或象征性(包括，例如计算机模拟)地放置在靶RNA序列上，以鉴别可以充当靶序列的在该尺寸范围内的序列。通过移动该序列“窗口”渐进初始靶序列位置的一个核苷酸上游或下游，可以鉴别下一个潜在的靶序列，直到针对所选择的任何给定的靶标尺寸鉴别可能的序列的全套。这个过程(加上为了鉴定最佳执行的那些序列的所鉴定的序列的系统合成和测试(使用此处所述的或如本领域中已知的测定))可以鉴定当用一种iRNA剂靶向时介导靶基因表达的最好抑制的那些RNA序列。因此，当所鉴定的序列(例如表3、4、7、8、 11、13和15中任一个中的)代表有效的靶序列时，设想了可以通过逐步“使窗户行走”所给定的序列上游或下游的一个核苷酸来鉴定具有相同或更好的抑制特征的序列来实现对抑制效率进一步优化。
另外，构思对于鉴定的任何序列，例如表3、4、7、8、11、13 和15中任一个中的序列，可以通过以下方式实现进一步优化：系统添加或移走核苷酸以产生较长或较短的序列，并且测试通过将较长或较短尺寸的窗从该点沿靶RNA向前或向后推进所产生的那些序列。再次地，使这种方案与产生新候选物靶联系，同时在如本领域已知和 /或如本文所述的抑制测定法中基于这些靶序列测试iRNA的有效性，可以导致效率抑制的进一步改善。再者，可以例如通过引入如本文所述或如本领域已知的修饰核苷酸、添加或改变悬端或如本领域已知和 /或本文中讨论的其他修饰，调节这类优化的序列以便进一步优化该分子(例如增加血清稳定性或循环半寿期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加核内体释放)作为表达抑制剂。
如本文所述的iRNA可以含有一个或多个相对于靶序列的错配。在一个实施例中，如本文所述的iRNA含有不多于3个错配。如果 iRNA的反义链含有相对于靶序列的错配，则优选错配区域不应当位于互补区域的中心内。如果iRNA的反义链含有相对于靶序列的错配，则优选错配应当局限于距互补区域5′-或3′-末端的最末5个核苷酸内部。例如对于与AGT基因的一个区域互补的23个核苷酸iRNA剂的 RNA链而言，通常在中央13个核苷酸内部不含任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可以用来确定含有相对于靶序列的错配的iRNA是否有效抑制AGT基因表达。考虑带错配的iRNA在抑制 AGT基因表达的功效方面是重要的，尤其在已知AGT基因中的特定互补区域在群体内部具有多态性序列变异时。
III.本发明的修饰iRNA
在一个实施方案中，本发明的iRNA(例如，dsRNA)的RNA是未修饰的，并且不包含例如本领域已知的和本文中所述的化学修饰和 /或偶联。在另一个实施方案中，本发明的iRNA(例如，dsRNA)的 RNA是化学修饰的以增强稳定性或其他有益特征。在本发明的特定实施方案中，本发明的iRNA的基本上全部的核苷酸是修饰的。在本发明的其他实施方案中，本发明的iRNA的全部核苷酸是本发明的修饰iRNA，其中“基本上全部的核苷酸是修饰的”是很大程度上但并不是全部修饰的并且可以包含不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
本发明所表征的核酸可以通过本领域内良好建立的方法来进行合成和/或修饰，例如描述于“当前核酸化学方案(Current protocols in nucleic acid chemistry)”，比尤克居(Beaucage)，S.L.(编)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)，纽约，纽约州，美国中的那些，特此通过引用将其结合于此。修饰包括例如末端修饰，例如 5′末端修饰(磷酸化、偶联、倒置键等)或3′末端修饰(偶联、DNA 核苷酸、倒置键等)；碱基修饰，例如替换为稳定性碱基、去稳定性碱基或与扩充的配偶物库发生碱基配对的碱基、移除碱基(非碱基核苷酸)、或偶联的碱基；糖修饰(例如在2′位置或4′位置)或糖的替换；和/或骨架修饰，包括修饰或替换磷酸二酯键。在本文所述的实施例中有用的iRNA化合物的具体实例包括但不限于含有修饰骨架或无天然核苷间键的RNA。具有修饰骨架的RNA包括在骨架中不具有磷原子的那些，连同其他。出于本说明书的目的和如有时本领域中谈及，也可以将在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰RNA视为寡核苷。在一些实施例中，修饰的iRNA将在其核苷间骨架中具有磷原子。
修饰的RNA骨架包括例如硫逐磷酸酯、手性硫逐磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、磷酰胺酯，包括3′- 氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些酯的2′-5′连接的类似物，和具有反转极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位为3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。还可以包括不同盐、混合盐以及游离酸形式。
教导制备以上含磷键的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897； 5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126； 5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361； 5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209； 6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590； 6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805； 7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利RE39464，特此将这些中的每个的全部内容通过引用结合在此。
其中不包含磷原子的修饰的RNA骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键的那些(部分地从一个核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl) 骨架；亚甲基甲乙酰基(methylene formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。
教导以上的寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141； 5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677； 5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240； 5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，特此将这些中的每个的全部内容通过引用结合在此。
在其他实施例中，构思了用于iRNA的适合的RNA模拟物，其中核苷酸单位的糖和核苷间键即骨架被替换为新基团。保持碱基单元以与适当的核酸靶标化合物杂交。一种这类寡聚化合物，已经显示具有优异杂交特性的RNA模拟物，称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架替换为含有酰胺的骨架，尤其氨基乙基甘氨酸骨架。这些核碱基得以保持并且直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教授制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，特此将这些中的每个的全部内容通过引用结合在此。适合于用在本发明的iRNA中的另外的PNA化合物描述在例如尼尔森(Nielsen)等人，科学 (Science)，1991，254，1497-1500中。
本发明中表征的一些实施例包括具有硫逐磷酸酯骨架的RNA和具有杂原子骨架的寡核苷，并且尤其上文所参考的美国专利号 5,489,677的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称作亚甲基 (甲基亚氨基)或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、 --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯骨架表述为--O--P--O--CH2--]，和上文所参考美国专利号 5,602,240的酰胺骨架。在一些实施例中，在此表征的RNA具有上文所参考美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构。
修饰的RNA也可以含有一个或多个取代的糖部分。在此表征的 iRNA(例如dsRNA)可以在2′位置包含以下之一：OH；F；O-、S- 或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至 C10烯基和炔基。示例性的适合的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、 O(CH2)·nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是从1至约10。在其他实施例中，dsRNA在2′位置包含以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、 Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、 RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善iRNA的药物代谢动力学特性的基团、或用于改善iRNA的药效特征的基团、和具有相似特性的其他取代基。在一些实施例中，该修饰包括2′-甲氧基乙氧基 (2′-O--CH2CH2OCH3，也称作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(马丁(Martin)等人，瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)，1995， 78：486-504)，即一个烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2’- 二甲基氨基氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，如下文的实例中所述的，也称作2′-DMAOE，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即 2′-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。更多示例性修饰包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-脱氧核苷酸，(这三个家族中都有R和S异构体)；2’-烷氧基烷基；和2’-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其他修饰包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基 (2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。也可以在iRNA的RNA上的其他位置处作出相似的修饰，尤其在3′末端核苷酸上或在2′-5′连接的dsRNA中糖的3′位置和5′末端核苷酸的5′位置。iRNA也可以具有糖模拟物，如替代呋喃戊糖的环丁基部分。教授制备这类修饰糖结构的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号4,981,957；5,118,800； 5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785； 5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，所述专利的某些由本申请共同所有。特此通过引用将前述的每个的全部内容结合在此。
iRNA还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰物或取代物。如本文中使用的，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰核碱基包括但不局限于其他合成以及天然核碱基例如脱氧-胸腺嘧啶(dT)，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)， 5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基， 8-氨基，8-氢硫基，8-硫烷基，8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其是5-溴，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他的核碱基包括在美国专利号3,687,808中披露的那些、在生物化学、生物技术和医药中的修饰的核苷酸(Modified Nucleosides in Biochemistry，Biotechnology and Medicine)，赫德维珍妮(Herdewijn)， P.编著，Wiley-VCH，2008中披露的那些；在聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering)，第858-859页，克洛舍维奇(Kroschwitz)，J.L编著，约翰威利父子(John Wiley&Sons)，1990中披露的那些、由恩利施 (Englisch)等人，应用化学(Angewandte Chemie)，国际版，1991， 30，613披露的那些和由赛格维(Sanghvi)，Y S.，第15章，dsRNA 研究与应用(dsRNA Research and Applications)，第289-302页，克鲁克(Crooke)，S.T.和拉布列(Lebleu)，B.编著，CRC出版社， 1993披露的那些。这些核碱基中的某些对提高本发明表征的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5- 丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经表明5-甲基胞嘧啶取代基提高核酸双链体的稳定性0.6℃-1.2℃(桑格威(Sanghvi)，Y.S.，克鲁克(Crooke)，S.T.以及拉布列(Lebleu)，B.编辑，dsRNA研究与应用(dsRNA Research and Applications)，CRC出版社，波卡拉顿 (Boca Raton)，1993，第276-278页)，并是示例性的碱基取代基，甚至更加特别地为当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰物组合时。
教导制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于上述的美国专利号3,687,808、4,845,205、 5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、 5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、 5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、5,750,692、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、 6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672、以及7,495,088，特此通过引用将这些中的每个的全部内容结合在此。
也可以修饰iRNA的RNA以包含一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰核糖部分的核苷酸，其中所述核糖部分包含连接2′碳和4′碳的额外桥。这个结构有效地将该核糖“锁”在3′-内切结构构象中。向siRNA添加锁核酸已经显示增加血清中的siRNA稳定性并且减少脱靶效应(埃尔曼(Elmen)，J.等人，(2005)核酸研究(Nucleic Acids Research)33(1)：439-447；穆克(Mook)，OR.等人，(2007) 分子癌症疗法(Mol Canc Ther)6(3)：833-843；格伦韦勒(Grunweller)， A.等人，(2003)核酸研究(Nucleic Acids Research)31(12)：3185-3193)。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个是UNA (未锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁的无环核酸，其中已经除去任何糖键，从而形成未锁的“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖C1’-C4’之间的键已经除去的单体(即，C1’和C4’碳之间的共价碳 -氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2’-C3’键(即，C2’和C3’碳之间的共价碳-碳键)已经除去(参见，Nuc.Acids Symp.Series，52， 133-134(2008)和Fluiter等，Mol.Biosyst.，2009，10，1039，将其按引用并入本文中)。
iRNA的RNA也可以被修饰来包括一个或多个双环糖部分。“双环糖”是通过两个原子的桥接修饰的呋喃基(furanosyl)环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，所述糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥，由此形成双环环系统。在特定实施方案中，桥连接糖环的4’-碳和2’-碳。因此，在一些实施方案中，本发明的药剂可以包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包含连接2’和4’碳的额外桥。换句话说，LNA 是包含双环糖部分的核苷酸，所述糖部分包含4’-CH2-O-2’桥。这个结构有效地将核糖“锁定”在3’-内结构构象中。将锁核酸添加至siRNA 已经显示出提高siRNA在血清中的稳定性，并且降低脱靶效应(Elmen， J.等，(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook，OR.等，(2007) Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller，A.等，(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用于本发明的多核苷酸中的双环核苷的实例包括但不限于在4’和2’核糖基环原子之间包含桥的核苷。在特定实施方案中，本发明的反义多核苷酸剂包含一个或多个双环核苷，其包含4’-2’桥。这样的4’-2’桥接的双环核苷的实例，包括但不限于 4′-(CH2)-O-2′(LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4′-(CH2)2-O-2′(ENA)； 4′-CH(CH3)-O-2′(也称为“约束乙基”或“cEt”)和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′ (及其类似物；参见，例如，美国专利No.7,399,845)； 4′-C(CH3)(CH3)-O-2′(及其类似物；参见，例如，美国专利No. 8,278,283)；4′-CH2-N(OCH3)-2′(及其类似物；参见，例如，美国专利No.8,278,425)；4′-CH2-O-N(CH3)-2′(参见，例如，美国专利公开No.2004/0171570)；4′-CH2-N(R)-O-2′，其中R是H、C1-C12烷基或保护基团(参见，例如，美国专利No.7,427,672)； 4′-CH2-C(H)(CH3)-2′(参见，例如，Chattopadhyaya等，J.Org.Chem.， 2009，74，118-134)；和4′-CH2-C(＝CH2)-2′(及其类似物；参见，例如，美国专利No.8,278,426)。将上述每篇的完整内容按引用并入本文中。
教导锁核酸核苷酸制备的其他代表性美国专利和美国专利公开包括，但不限于以下：美国专利No.6,268,490；6,525,191；6,670,461； 6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125； 7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467； 8,278,425；8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618和US 2009/0012281，将每篇的完整内容按引用并入本文中。
可以制备具有一个或多个立体化学糖构象上述任一双环核苷，包括，例如，α-L-核糖呋喃糖和β-D-核糖呋喃糖(参见WO 99/14226)。
iRNA的RNA也可以修饰来包括一个或多个约束乙基核苷酸。如本文中使用的，“约束乙基核苷酸”或“cEt”是包含双环糖部分的锁核酸，所述糖部分包含4′-CH(CH3)-O-2′桥。在一个实施方案中，约束乙基核苷酸是S构象，在本文中称为“S-cEt”。
本发明的iRNA还可以包括一个或多个“构象限制核苷酸” (“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2’和C4’碳或核糖的C3和-C5’碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定成稳定的构象并且提高与mRNA的杂交亲和性。接头足够长以将氧置于对于稳定性和亲和性的最佳位置而导致较少核糖环折叠。
教导上述特定CRN制备的代表性公开包括，但不限于，美国专利公开No.2013/0190383和PCT公开WO 2013/036868，将每篇的完整内容按引用并入本文中。
本发明的iRNA的一个或多个核苷酸还可以包括羟甲基取代的核苷酸。“羟甲基取代的核苷酸”是无环的2’-3’-断-核苷酸，也称为“未锁核酸”(“UNA”)修饰。
教导UNA制备的代表性美国公开包括，但不限于，美国专利No. 8,314,227；和美国专利公开No.2013/0096289；2013/0011922；和 2011/0313020，将每篇的完整内容按引用并入本文中。
RNA分子末端的潜在稳定修饰可以包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇) (Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇)(Hyp-NHAc)、胸苷-2’-O- 脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、 2-二十二碳酰基-尿苷-3”-磷酸、反向碱基dT(idT)和其他。这个修饰的公开可以在PCT公开No.WO 2011/005861中找到。
本发明的iRNA的核苷酸的其他修饰包括5’磷酸或5’磷酸模拟物，例如，RNAi剂的反义链上的5’-末端磷酸或磷酸模拟物。合适的磷酸模拟物公开于，例如，美国专利公开No.2012/0157511中，将其完整内容按引用并入本文中。
A.包含本发明基序的修饰iRNA
在本发明的特定方面中，本发明的双链RNAi剂包括具有例如 2011年11月18日提交的美国临时申请No.61/561,710或2012年11 月16日提交的PCT/US2012/065691中公开的化学修饰的药剂，将其每篇的完整内容按引用并入本文中。
如本文中和临时申请No.61/561,710或PCT申请No. PCT/US2012/065691中所示的，通过将三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个或多个基序引入RNAi剂的正义链和/或反义链中，特别是切割位点或附近，可以获得优异的结果。在一些实施方案中，RNAi剂的正义链和反义链可以另外是完全修饰的。这些基序的引入中断了正义链和/或反义链的修饰模式(如果存在)。RNAi剂可以任选与GalNAc 衍生物配体偶联，例如，在正义链上的。所得到的RNAi剂存在优异的基因沉默活性。
更特别地，已经令人惊讶地发现双链RNAi剂的正义链和反义链完全修饰以在RNAi剂的至少一条链的切割位点处或附近具有三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个或多个基序时，RNAi剂的基因沉默活性得到了很好的增强。
因此，本发明提供了能够在体内抑制靶基因(即，血管紧张素原 (AGT)基因)表达的双链RNAi剂。RNAi剂包含正义链和反义链。 RNAi剂的每条链可以为12-30个核苷酸长。例如，每条链可以为14-30 个核苷酸长，17-30个核苷酸长，25-30个核苷酸长，27-30个核苷酸长，17-23个核苷酸长，17-21个核苷酸长，17-19个核苷酸长，19-25 个核苷酸长，19-23个核苷酸长，19-21个核苷酸长，21-25个核苷酸长，或21-23个核苷酸长。
正义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)，在本文中也称为“RNAi剂”。RNAi剂的双链区可以为12-30个核苷酸对长。例如，双链体区域可以为14-30个核苷酸对长，17-30个核苷酸对长，27-30个核苷酸对长，17-23个核苷酸对长，17-21个核苷酸对长，17-19个核苷酸对长，19-25个核苷酸对长，19-23个核苷酸对长，19-21个核苷酸对长，21-25个核苷酸对长或21-23个核苷酸对长。在另一个实施例中，双链体区域选自15，16，17，18，19，20，21， 22，23，24，25，26和27个核苷酸长。
在一个实施方案中，RNAi剂可以在一条或两条链的3’-端、5’- 端或两端含有一个或多个悬端区和/或加帽基团。悬端可以是1-6个核苷酸长，例如，2-6个核苷酸长，1-5个核苷酸长，2-5个核苷酸长， 1-4个核苷酸长，2-4个核苷酸长，1-3个核苷酸长，2-3个核苷酸长或1-2个核苷酸长。悬端可以是一条链长于另一条的结果，或相同长度的两条链交错的结果。悬端可以与靶mRNA形成错配或者其可以与所靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。如本文中讨论的，在本发明的各个实施方案中还考虑了多达30个核苷酸长的延长悬端。第一条和第二条链也可以连接，例如，通过另外的碱基以形成发夹，或通过其他非碱基接头。
在一个实施方案中，RNAi剂的悬端区中的核苷酸可以各自独立地是修饰或未修饰的核苷酸，包括，但不限于，2’-糖修饰的，如，2-F、 2’-O甲基、胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O- 甲基氧乙基腺苷(Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任意组合。例如，TT可以是任一条链上任一端的悬端序列。悬端可以与靶mRNA形成错配或者其可以与靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。
RNAi剂的正义链、反义链或两条链的5’-或3’-悬端可以是磷酸化的。在一些实施方案中，悬端区含有两个核苷酸，在这两个核苷酸之间具有硫逐磷酸酯，其中该两个核苷酸可以相同或不同。在一个实施方案中，悬端存在于正义链、反义链或两条链的3’-端。在一个实施方案中，这个3’-端悬端存在于反义链中。在一个实施方案中，这个3’-悬端存在于正义链中。
RNAi剂可以只含有单一悬端，其可以增强RNAi的干扰活性，而不影响其整体稳定性。例如，单链悬端可以位于正义链的3’-末端，或可选地，在反义链的3’-末端。RNAi还可以具有平端，位于反义链的5’-端(或正义链的3’-端)，反之亦然。通常，RNAi的反义链在3’-端具有核苷酸悬端，而5’-端是平端。尽管不希望受到理论的束缚，反义链的5’-端的不对称平端和反义链的3’-端悬端有利于引导链载入 RISC过程中。
在一个实施方案中，RNAi剂是19个核苷酸长的双端bluntmer，其中正义链含有至少一个从5’端的位置7、8、9处三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个从5’端的位置11、12、 13处三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序。
在另一个实施方案中，RNAi剂是20个核苷酸长的双端bluntmer，其中正义链含有至少一个从5’端的位置8、9、10处三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个从5’端的位置11、12、 13处三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序。
在再另一个实施方案中，RNAi剂是21个核苷酸长的双端 bluntmer，其中正义链含有至少一个从5’端的位置9、10、11处三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个从5’端的位置11、12、13处三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施方案中，RNAi剂包含21个核苷酸的正义链和23个核苷酸的反义链，其中正义链含有至少一个从5’端的位置9、10、11 处三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序；反义链含有至少一个从5’端的位置11、12、13处三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序，其中RNAi剂的一端是平端，而另一端包含2个核苷酸的悬端。优选，这2个核苷酸的悬端在反义链的3’-端。
当2个核苷酸的悬端位于反义链的3’-端时，在末端三个核苷酸之间可以存在两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，其中三个核苷酸中的两个是悬端核苷酸，而第三个核苷酸是挨着悬端核苷酸的配对核苷酸。在一个实施方案中，RNAi剂另外在正义链的5’-端和反义链的5’端的末端三个核苷酸之间具有两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团。在一个实施方案中，RNAi剂的正义链和反义链中的每个核苷酸，包括是基序的部分的核苷酸，是修饰的核苷酸。在一个实施方案中，用 2’-O-甲基或3’-氟独立修饰各个残基，例如，在交替基序中。任选地， RNAi剂进一步包含配体(优选GalNAc3)。
在一个实施方案中，RNAi剂包含正义和反义链，其中正义链是 25-30个核苷酸残基长，其中从5’末端核苷酸(位置1)开始，第一条链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；反义链是36-66个核苷酸残基长，并且从3’末端核苷酸开始，在与正义链的位置1-23配对形成双链体的位置中包含至少8个核糖核苷酸；其中反义链的至少 3’末端核苷酸与正义链未配对，并且多达6个连续的3’末端核苷酸与正义链未配对，由此形成1-6个核苷酸的3’单链悬端；其中反义链的 5’末端包含10-30个连续核苷酸，其与正义链未配对，由此形成10-30个核苷酸的单链5’悬端；其中将正义链和反义链为了最大互补性比对时，至少正义链5’末端和3’末端核苷酸与反义链的核苷酸是碱基配对的，由此在正义链和反义链之间形成基本上双链的区域；并且在将双链核酸引入哺乳动物细胞中时，反义链沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补以降低靶基因表达；并且其中正义链含有至少一个在三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序，其中至少一个基序出现在切割位点处或附近。反义链在切割位点处或附近含有至少一个在三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施方案中，RNAi剂包含正义链和反义链，其中RNAi 剂包含具有至少25个和至多29个核苷酸长的第一条链和具有至多30 个核苷酸长的第二条链，其具有至少一个从5’端的位置11、12和13 处的三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序；其中第一条链的 3’端和第二条链的5’端形成平端，并且第二条链在其3’端比第一条链长1-4个核苷酸，其中双链体区域为至少25个核苷酸长，并且在将 RNAi剂引入哺乳动物细胞中时，第二条链沿着第二条链长度的至少 19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补以降低靶基因表达，并且其中 RNAi剂的dicer切割优先导致包含第二条链的3’端的siRNA，由此降低哺乳动物中靶基因的表达。任选地，RNAi剂进一步包含配体。
在一个实施方案中，RNAi剂的正义链含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序，其中基序之一出现在正义链中的切割位点处。
在一个实施方案中，RNAi剂的反义链也可以含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序，其中基序之一出现在反义链中的切割位点处或附近。
对于具有17-23个核苷酸长的双链区的RNAi剂，反义链的切割位点通常大约在从5’-端的10、11和12位置。因此，三个相同修饰的基序可以出现在反义链的9、10、11位置；10、11、12位置；11、 12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15位置，计数从反义链的5’-端的第1个核苷酸开始，或计数从反义链的5’端在双链体区域内的第1个配对核苷酸开始。反义链中的切割位点也可以根据从5’- 端的RNAi双链体区域的长度而改变。
RNAi剂的正义链可以在链的切割位点处含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序；和反义链可以在链的切割位点处或附近具有至少一个三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序。当正义链和反义链形成dsRNA双链体时，正义链和反义链可以如此对齐以使得正义链上的三个核苷酸的一个基序和反义链上的三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即，正义链中基序的三个核苷酸中的至少一个与反义链中基序的三个核苷酸中的至少一个形成碱基对。或者，至少两个核苷酸可以重叠，或全部三个核苷酸可以重叠。
在一个实施方案中，RNAi剂的正义链可以含有超过一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序。第一基序可以出现在链的切割位点处或附近和其他基序可以是翼修饰(wing modification)。本文中的术语“翼修饰”是指与相同链的切割位点处或附近的基序分开的链的另一个部分出现的基序。翼修饰可以邻接第一基序或隔开至少一个或多个核苷酸。在基序彼此直接邻接时，那么基序的化学性质彼此不同，并且在基序隔开一个或多个核苷酸时，那么化学性质可以相同或不同。可以存在两个或更多个翼修饰。例如，存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以出现在相对于第一基序的一端，其在切割位点处或附近或者在前导基序的任一侧。
与正义链相同，RNAi剂的反义链可以含有超过一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在链的切割位点处或附近。该反义链也可以含有与正义链上存在的翼修饰相似对齐的一个或多个翼修饰。
在一个实施方案中，RNAi剂的正义链或反义链上的翼修饰通常不包括链的3’-端、5’-端或两端的头一个或两个末端核苷酸。
在另一个实施方案中，RNAi剂的正义链或反义链上的翼修饰通常不包括链的3’-端、5’-端或两端处双链体区域内头一个或头两个配对的核苷酸。
当RNAi剂的正义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，翼修饰可以落在双链体区域的相同末端上，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
RNAi剂的正义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，正义链和反义链因此可以如何对齐以使得各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的一端上，从而具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的另一端上，从而具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；一条链上的两个修饰落在前导基序的每一侧，从而在双链体区域中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一个实施方案中，RNAi剂的正义链和反义链中的每个核苷酸，包括是基序部分的核苷酸，可以是修饰的。每个核苷酸可以用相同或不同修饰来进行修饰，其可以包括非连接磷酸氧的一个或两个和/或连接磷酸氧的一个或多个的一个或多个改变；核糖的组分的改变，例如，核糖上2’羟基的改变；磷酸部分被“去磷酸”接头整体替代；天然产生的碱基的修饰或替代；和核糖-磷酸主链的替代或修饰。
因为核酸是亚基的聚合物，许多修饰出现在核酸内重复的位置，例如，碱基的修饰，或磷酸部分，或磷酸部分的非连接O。在一些情况中，修饰将出现在核酸的全部所述位置，但在许多情况中，它不会。例如，修饰可以只出现在3’或5’末端位置，可以只出现在末端区域，例如，末端核苷酸上的位置或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可以出现在双链区、单链区或两者中。修饰可以只出现在 RNA的双链区中或可以只出现在RNA的单链区中。例如，非连接O 位置的硫逐磷酸酯修饰可以只出现在一个或两个末端，可以只出现在末端区域中，例如，末端核苷酸的位置或链的最后2、3、4、5或10 个核苷酸中，或可以出现在双链和单链区中，特别在末端。一个或多个5’端可以是磷酸化的。
有可能例如为增强稳定性，在悬端中包括特定碱基，或在单链悬端中，例如，在5’或3’悬端或两者中，包括修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可能希望在悬端中包括嘌呤核苷酸。在一些实施方案中， 3’或5’悬端中的全部或一些碱基可以是修饰的，例如，具有本文中所述的修饰。修饰可以包括，例如，在具有本领域已知的修饰的核糖的 2’位置的修饰，例如，使用脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)或 2’-O-甲基修饰的而非核碱基的核糖，以及磷酸基团中的修饰，例如，硫逐磷酸酯修饰。悬端不需要与靶序列是同源的。
在一个实施方案中，用LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、 2-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’- 羟基或2’-氟来独立地修饰正义链和反义链的每个残基。链可以含有超过一个修饰。在一个实施方案中，用2’-O-甲基或2’-氟独立地修饰正义链和反义链的每个残基。
通常至少两个不同的修饰存在于正义链和反义链上。那两个修饰可以是2’-O-甲基或2’-氟修饰，或其他。
在一个实施方案中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。如本文中使用的术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰出现在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个，或相似的模式。例如，如果A、B和C各自表示一种类型的核苷酸修饰，交替基序可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
交替基序中含有的修饰类型可以相同或不同。例如，如果A、B、 C、D各自表示核苷酸上的一种类型的修饰，交替模式，即，每隔一个核苷酸上的修饰，可以相同，但正义链或反义链各自可以选自交替基序内的几种修饰可能性，如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂包含正义链上的交替基序的修饰模式，相对于反义链上的交替基序的修饰模式是偏移的(shifted)。所述偏移可以使得正义链的核苷酸的修饰基团对应于反义链的核苷酸的不同修饰的基团，且反之亦然。例如，正义链在dsRNA 双链体中与反义链配对时，正义链中的交替基序可以在双链体区域内从链的5’-3’自“ABABAB”开始并且反义链中的交替基序可以从链的5’-3’自“BABABA”开始。作为另一个实例，正义链中的交替序列可以在双链体区域内从链的5’-3’自“AABBAABB”开始并且反义链中的交替基序可以从双链区的5’-3’自“BBAABBAA”开始，使得正义链和反义链之间存在修饰模式的完全或部分偏移。
在一个实施方案中，RNAi剂包含正义链上2’-O-甲基修饰和2’-F 修饰的交替基序的模式，最初具有相对于反义链上最初的2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序模式的偏移，即，正义链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与反义链上的2’-F修饰的核苷酸碱基配对，且反之亦然。正义链的1位可以从2’-F修饰开始，而反义链的1位可以从2’-O- 甲基修饰开始。
将三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个或多个基序引入正义链和/或反义链中断了正义链和/或反义链中存在的初始修饰模式。通过将三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个基序引入正义和/或反义链上的这种正义和/或反义链修饰模式的中断令人惊讶地增强了对靶基因的基因沉默活性。
在一个实施方案中，在将三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序引入任一条链时，紧接着基序的核苷酸的修饰是不同于基序修饰的修饰。例如，含有基序的序列部分是“…NaYYYNb…”，其中“Y”表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序的修饰，而“Na”和“Nb”表示紧接着基序“YYY”的核苷酸的修饰，其不同于Y的修饰，并且其中Na和Nb可以是相同或不同的修饰。或者，当存在翼修饰时， Na和/或Nb可以存在或不存在
RNAi剂可以进一步包含至少一个硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团。硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团修饰可以在任何链位置出现在正义链或反义链或两条链的任一核苷酸上。例如，核苷酸间连接基团修饰可以出现在正义链和/或反义链上的每一个核苷酸上；每个核苷酸间连接基团修饰可以以交替模式出现在正义链和/或反义链上；或正义链或反义链可以含有交替模式的两种核苷酸间连接基团修饰。正义链上的核苷酸间连接基团修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且正义链上的核苷酸间连接基团修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷酸间连接基团修饰的交替模式具有偏移。在一个实施方案中，双链RNAi剂包含6-8个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团。在一个实施方案中，反义链包含5’末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团和3’末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，而正义链包含5’-末端或3’-末端的至少两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团。
在一个实施方案中，RNAi在悬端区中包含硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团合修饰。例如，悬端区可以含有两个在两个核苷酸之间具有硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团的核苷酸。还可以形成核苷酸间连接基团合修饰来连接悬端核苷酸与双链区内末端配对的核苷酸。例如，至少2、3、4或全部悬端核苷酸可以通过硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团来连接，并且任选，存在连接悬端核苷酸与悬端核苷酸挨着的配对核苷酸的其他硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接基团。例如，在末端三个核苷酸之间存在至少两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，其中三个核苷酸中的两个是悬端核苷酸，并且第三个是挨着悬端核苷酸的配对核苷酸。这些末端三个核苷酸可以在反义链的3’-端、正义链的3’-端、反义链的5’-端和 /或反义链的5’端。
在一个实施方案中，2个核苷酸的悬端是在反义链的3’-端，并且在末端三个核苷酸之间存在两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团，其中三个核苷酸中的两个是悬端核苷酸，并且第三个核苷酸是挨着悬端核苷酸的配对核苷酸。任选地，RNAi剂可以在正义链的5’-端和反义链的5’-端的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫逐磷酸酯核苷酸间连接基团。
在一个实施方案中，RNAi剂包含与靶标的错配，在双链体内，或其组合。错配可以出现在悬端区或双链体区域中。可以基于其促进解离或熔化的倾向，将碱基对分级(例如，基于特定配对的缔合或解离的自由能，最简单的方法是基于单个对检查该对，尽管也可以使用次近邻或相似分析)。就促进解离而言，A∶U优于G∶C；G∶U优于 G∶C；和I∶C优于G∶C(I＝肌苷)。错配例如非标准的或标准配对以外的(如本文中别处所述的)优于规范的(A∶T、A∶U、G∶C)配对；并且包括通用碱基的配对优于标准的配对。
在一个实施方案中，RNAi剂包含独立地选自：A∶U、G∶U、I∶C 和错配的对(例如，非标准或标准以外的配对或包括通用碱基的配对) 的从反义链的5’-端的双链体区域内前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个，以促进反义链在双链体的5’-端解离。
在一个实施方案中，从反义链的5’-段的双链体区域内1位的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。或者，从反义链的5’-端的双链体区域内的头1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从反义链的5’-端的双链体区域内的头一个碱基对是AU碱基对。
在另一个实施方案中，正义链3’-端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶 (dT)。在另一个实施方案中，反义链的3’-端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在一个实施方案中，存在短的脱氧胸腺嘧啶核苷酸的序列，例如，在正义和/或反义链的3’-端的两个dT核苷酸。
在一个实施方案中，正义链序列可以由式(I)来表示：
5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′ (I)
其中：
i和j各自独立地为0或1；
p和q各自独立地为0-6；
每个Na独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸；
每个np和nq独立地表示悬端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同修饰；和
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。优选地，YYY全部是2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。
在一个实施方案中，YYY基序出现在正义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi剂具有17-23个核苷酸长的双链体区域时，YYY 基序可以出现在正义链的切割位点处或附近(例如，可以出现在正义链的位置6、7、8，7、8、9，8、9、10，9、10、11，10、11、12或 11、12、13处)，计数从5’端的第1个核苷酸开始；或任选地，计数从5’-端在双链体区域内的第1个配对核苷酸开始。
在一个实施方案中，i是1和j是0，或i是0和j是1，或i和j 都是1。正义链因此可以通过以下式来表示：
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Ib)；
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3′ (Ic)；或
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Id)。
在正义链由式(Ib)表示时，Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、 0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地可以表示包含 2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在正义链由式(Ic)表示时，Nb表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、 0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在正义链由式(Id)表示时，每个Nb独立地表示包含0-10、0-7、 0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、 1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10 个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。X、Y和Z中的每个可以彼此相同或不同。
在其他实施方案中，i是0和j是0，并且正义链可以由下式来表示：
5′np-Na-YYY-Na-nq 3′ (Ia)。
在正义链由式(Ia)表示时，每个Na可以独立地表示包含2-20、 2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施方案中，RNAi的反义链序列可以由式(II)来表示：
5′nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)1-N′a-np′3′ (II)
其中：
k和l各自独立地为0或1；
p’和q’各自独立地为0-6；
每个Na’独立地表示包含0-25个修饰核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb’独立地表示包含0-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np’和nq’独立地表示悬端核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同修饰；和
X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。
在一个实施方案中，Na’和/或Nb’包含交替模式的修饰。
Y’Y’Y’基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi 剂具有17-23个核苷酸长的双链体区域时，Y’Y’Y’基序可以出现在反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或 13、14、15，计数从5’端第1个核苷酸开始；或任选地，计数从5’- 端在双链体区域内的第1个配对核苷酸开始。优选地，Y’Y’Y’基序出现在位置11、12、13处。
在一个实施方案中，Y’Y’Y’基序全部是2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，k是1和l是0，或k是0和l是1，或k和 l都是1。
反义链因此可以由以下式来表示：
5′nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3′ (IIb)；
5′nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3′ (IIc)；或
5′nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’3′ (IId)。
在反义链由式(IIb)来表示时，Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、 0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IIc)来表示时，Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、 0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IId)来表示时，每个Nb’独立地表示包含0-10、 0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施方案中，k是0和l是0并且反义链可以由以下式来表示：
5′np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3′ (Ia)。
当反义链由式(IIa)来表示时，每个Na’独立地表示包含2-20、 2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。X’、Y’和Z’中的每个可以彼此相同或不同。
正义链和反义链的每个核苷酸可以独立地用LNA、CRN、UNA、 cEt、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C- 烯丙基、2’-羟基或2’-氟来修饰。例如，正义链和反义链的每个核苷酸独立地用2’-O-甲基或2’-氟来修饰。特别地，每个X、Y、Z、X’、 Y’和Z’可以表示2’-O-甲基修饰或2’-氟修饰。
在一个实施方案中，当双链体区域为21nt时，RNAi剂的正义链可以含有在链的9、10和11位置出现的YYY基序，计数从5’-端的第1个核苷酸开始，或任选地，计数从5’-端在双链体区域内的第1 个配对核苷酸开始；并且Y表示2’-F修饰。正义链可以另外含有XXX 基序或ZZZ基序作为双链体区域相对端的翼修饰；并且XXX和ZZZ 各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一个实施方案中，正义链可以含有在链的位置11、12、13出现的Y’Y’Y’基序，计数从5’-端的第1个核苷酸开始，或任选地，计数从5’-端在双链体区域内的第1个配对核苷酸开始；并且Y’表示 2’-O-甲基修饰。反义链可以另外含有X’X’X’基序或Z’Z’Z’基序作为在双链体区域相对端的翼修饰；并且X’X’X’和Z’Z’Z’各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
通过以上式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的正义链分别与通过式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中的任一个表示的反义链形成双链体。
因此，用于本发明方法中的RNAi剂可以包含正义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸，RNAi双链体由式(III)来表示：
正义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)1-Na’-nq’5′ (III)
其中：
i、j、k和l各自独立地为0或1；
p、p’、q和q’各自独立地为0-6；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中每个np′、np、nq′和nq，其各自可以存在或不存在，独立地表示悬端核苷酸；和
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。
在一个实施方案中，i是0和j是0；或i是1和j是0；或i是0 和j是1；或i和j都是0；或i和j都是1。在另一个实施方案中，k 是0和l是1；或k是1或l是0；k是0和l是1；或k和l都是0；或k和l都是1。
形成RNAi双链体的正义链和反义链的示例性组合包括以下式：
5′np-Na-Y Y Y-Na-nq 3′
3′np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5′
(IIIa)
5′np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
3′np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’5′
(IIIb)
5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3′
3′np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’5′
(IIIc)
5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
3′np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5′
(IIId)
在RNAi剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示包含2-20、 2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在RNAi剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示包含1-10、 1-7、1-5或1-4个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在RNAi剂由式(IIIc)表示时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、 0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在RNAi剂由式(IIId)表示时，每个Nb、Nb’独立地表示包含 0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’中的每个独立地包含交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中X、Y和Z 的每一个可以彼此相同或不同。
在RNAi剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId) 表示时，Y核苷酸中的至少一个可以与Y’核苷酸中的一个形成碱基对。或者，Y核苷酸中的至少两个与相应的Y’核苷酸形成碱基对；或全部三个Y核苷酸都与相应的Y’核苷酸形成碱基对。
在RNAi剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，Z核苷酸中的至少一个可以与Z’核苷酸中的一个形成碱基对。或者，Z核苷酸中的至少两个与相应的Z’核苷酸形成碱基对；或全部三个Z核苷酸都与相应的Z’核苷酸形成碱基对。
在RNAi剂由式(IIIc)或(IIId)表示时，X核苷酸中的至少一个可以与X’核苷酸中的一个形成碱基对。或者，X核苷酸中的至少两个与相应的X’核苷酸形成碱基对；或全部三个X核苷酸都与相应的 X’核苷酸形成碱基对。
在一个实施方案中，Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z’核苷酸上的修饰，和/或X核苷酸上的修饰不同于X’核苷酸上的修饰。
在一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰为 2’-O-甲基或2’-氟修饰。在另一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIId) 表示时，Na修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰，并且np’＞0和至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻接核苷酸。在再另一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’＞0和至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻核苷酸，并且正义链与通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物偶联(以下描述)。在另一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIId) 表示时，Na修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’＞0和至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻核苷酸，正义链包含至少一个硫逐磷酸酯连接基团，并且正义链与通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物偶联。
在一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰为2’-O- 甲基或2’-氟修饰，np’＞0和至少一个np’通过硫逐磷酸酯连接基团连接相邻核苷酸，正义链包含至少一个硫逐磷酸酯连接基团，并且正义链与通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物偶联。
在一个实施方案中，RNAi剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、 (IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中双链体通过接头连接。接头可以是可切割或不可切割的。任选地，多聚体进一步包含配体。每个双链体可以靶向相同基因或两个不同基因；或每个双链体可以在两个不同靶位点靶向相同基因。
在一个实施方案中，RNAi剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中双链体通过接头连接。接头可以是可切割或不可切割的。任选地，多聚体进一步包含配体。每个双链体可以靶向相同基因或两个不同基因；或每个双链体可以在两个不同靶位点靶向相同基因。
在一个实施方案中，两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc) 和(IIId)表示的RNAi剂在5’端以及在一个或两个3’端彼此连接并且任选地与配体偶联。每个制剂可以靶向相同基因或两个不同基因；或每个制剂可以在两个不同靶位点靶向相同基因。
各种公开描述了可以用于本发明的方法中的多聚RNAi剂。这样的公开包括WO2007/091269、美国专利No.7858769、 WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，将每篇的完整内容按引用并入本文中。
如以下更详细地描述的，含有一个或多个碳水化合物部分与 RNAi剂偶联的RNAi剂可以优化RNAi剂的一种或多种特性。在许多情况中，碳水化合物部分将连接于RNAi剂的修饰亚基。例如， dsRNA剂的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖可以被另一个部分替代，例如，碳水化合物配体与其连接的非碳水化合物(优选环状)载体。其中亚基的核糖因此被替代的核糖核苷酸亚基在本文中称为核糖替换修饰亚基(RRMS)。环状载体可以是碳环环系统，即，所有环原子是碳原子，或杂环环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如，氮、氧、硫。环状载体可以是单环环系统，或可以含有两个或多个环，例如，稠合环。环状载体可以是完全饱和的环系统，或其可以含有一个或多个双键。
配体可以通过载体连接于多核苷酸。载体包括(i)至少一个“主链连接点”，优选两个“主链连接点”，和(ii)至少一个“栓系连接点“。如本文中使用的“主链连接点”是指官能团，例如，羟基，或通常，可用于并且适用于将载体结合至核糖核酸主链中的键，例如，磷酸主链或修饰磷酸主链，例如含硫主链。“栓系连接点”(TAP) 在一些实施方案中是指连接选定部分的环状载体的组成环原子，例如，碳原子或杂原子(不同于提供主链连接点的原子)。所述部分可以是例如碳水化合物，例如，单糖、双糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地，选择的部分通过中间栓系连接于环状载体。因此，环状载体通常包括官能团，例如，氨基基团，或通常，提供键，其适用于结合或栓系另一化学实体，例如，将配体结合或栓系于组成环。
RNAi剂可以通过载体与配体偶联，其中载体可以是环状基团或无环基团；优选地，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1，3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢糠基和萘烷；优选地，无环基团选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在某些特定实施方案中，用于本发明方法中的RNAi剂是选自表 3、4、7、8、11、13和15任一个中所列的药剂。这些药剂可以进一步包含配体。
IV.与配体偶联的iRNA
本发明的iRNA的RNA的另一种修饰涉及使RNA化学连接至一种或多种增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取的配体、部分或偶联物。此类部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(乐欣格 (Letsinger)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acid.Sci.USA)， 1989，86：6553-6556)，胆酸(马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)，1994，4：1053-1060)，硫醚如beryl-S-三苯甲基硫醇((马诺汗(Manoharan)等人，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1992，660：306-309；(马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Biorg.Med.Chem. Let.)，1993，3：2765-2770)，硫代胆固醇(奥博汗瑟(Oberhauser) 等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1992，20：533-538)，脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(赛森-博和马拉(Saison-Behmoaras)等人，EMBO J，1991，10：1111-1118；卡波诺(Kabanov)等人，FEBS 通讯，1990，259：327-330；斯伍那区克(Svinarchuk)等人，生物化学 (Biochimie)，1993，75：49-54)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-磷酸酯((马诺汗(Manoharan)等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1995， 36：3651-3654；舍阿(Shea)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)， 1990，18：3777-3783)，聚胺或聚乙烯乙二醇链((马诺汗(Manoharan) 等人，核苷&核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14：969-973) 或金刚烷乙酸((马诺汗(Manoharan)等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1995，36：3651-3654)，棕榈基部分(米莎(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1995， 1264：229-237)，或十八胺或己胺-羰基羟胆固醇部分(克鲁克(Crooke) 等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1996， 277：923-937)。
在一个实施例中，配体改变向其中并入该配体的iRNA剂的分布、靶向或寿命。在优选的实施例中，与例如不存在配体的物种相比，这种配体提供针对所选靶(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室、身体组织、器官或区域))的增强的亲和力。优选的配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如人血清白蛋白 (HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、茁霉多糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精、N-乙酰半乳糖胺、或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸∶聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、 N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟聚胺、树枝状聚合物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。
配体也可以包括靶向基团，例如与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂((例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪))、人工核酸内切酶((例如EDTA)、亲脂性分子，例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、鲸蜡基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪肽偶联物(例如触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成性核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑聚类、吖啶-咪唑偶联物、四氮杂大环类的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对辅助配体具有特异亲和力的分子，或抗体，例如与指定细胞类型如肝细胞结合的抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们也可以包括非肽种类，如脂质、凝集素、糖类、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基 -半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。该配体可以是例如脂多糖，p38MAP激酶的活化剂或NF-кB的活化剂。
配体可以是可以例如通过破坏细胞细胞骨架(例如通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加iRNA剂摄入细胞中的物质，例如药物。药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin。
在一些实施例中，与如本文所述的iRNA连接的配体充当药物代谢动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲油物质、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK 调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素等。包含许多硫代磷酸酯连接基团的寡核苷酸也已知与血清蛋白结合，因此骨架中包含多个硫代磷酸酯连接基团的短寡核苷酸，例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，也服从于本发明作为配体(例如作为PK调节配体)。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适配体也适合用作本文所述的实施例中的PK 调节配体。
本发明的配体-轭合的寡核苷酸可以通过使用这样一种寡核苷酸合成，该寡核苷酸具有吊坠反应功能性，例如衍生自该寡核苷酸上的连接分子的附接物(如下所述)。该反应性寡核苷酸可以直接与可商购的配体，合成的、具有多种保护基中的任一种的配体，或具有连接部分附接于其上的配体发生反应。
在本发明的偶联物中使用的寡核苷酸可以通过固相合成的公知技术方便且常规地制备。用于这类合成的设备由多个供应商(包括例如应用生物系统公司(AppliedBiosystems)(福斯特市，加利福尼亚州))销售。可另外地或替代地使用本领域中已知的用于这类合成的任何其他装置。使用相似的技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是已知的。
在本发明的配体-偶联的寡核苷酸以及具有序列特异性连接的核苷的配体-分子中，该寡核苷酸以及寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体，或已经具有连接部分的核苷酸或核苷偶联前体，已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷偶联前体，或带有构件的非核苷配体，从而被组装到适合的DNA合成仪中。
当使用已经具有连接部分的核苷酸-偶联物前体时，典型地完成该序列特异性连接的核苷的合成，并且然后该配体分子与该连接部分反应以形成配体偶联的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过一种自动合成仪合成，除了可商购以及寡核苷酸合成中常规使用的标准亚磷酰胺以及非标准亚磷酰胺之外，该合成还使用衍生自配体-核苷偶联物的亚磷酰胺。
A.脂质偶联物
在一个实施例中，该配体或偶联物是一种脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许偶联物分布至靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加偶联物对降解的抵抗力，(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。
基于脂质的配体可以用来抑制(例如控制)偶联物与靶组织的结合。例如与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能被靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使偶联物靶向肾。
在一个优选实施例中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，它以足够的亲和力结合HSA，从而偶联物将优选地分布至非肾组织。然而，优选的是这种亲和力并不是这样强，从而HSA-配体结合不能逆转。
在另一个优选实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合 HSA，从而偶联物将优选地分布至肾。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，也可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一个方面，配体是由靶细胞(例如正在增殖的细胞)摄取的部分，例如维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如恶性或非恶性型，例如癌细胞)增殖为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括是B维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或其他维生素或由靶细胞如肝细胞摄取的养分。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
B.细胞渗透剂
在另一个方面，配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋形细胞渗透剂。优选地，该渗透剂是两亲的。一种示例性剂渗透剂是肽如tat或触角足蛋白。如果该渗透剂是肽，则它可以经修饰的，包括肽酰基模拟物、反演体、非肽键或假肽键和D-氨基酸的使用。该螺旋剂优选为α-螺旋剂，其优选具有一个亲脂性相和一个亲油性相。
该配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA剂的接合可以影响iRNA的药物代谢动力学分布，如通过增强细胞鉴别与吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长的，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代中，肽部分可以包含疏水性膜转运序列 (MTS)。一种含有疏水性MTS的示例性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：9)的RFGF。含有疏水性MTS 的RFGF类似物(例如氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：10)) 也可以是靶向部分。该肽部分可以是一个“递送”肽，其可携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸、和跨细胞膜的蛋白。例如已经发现来自 HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：11))和果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：12))的序列能够作为递送肽发挥作用。肽或肽模拟物可以由随机DNA序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(拉姆(Lam)等人，自然(Nature)，354：82-84，1991)。通过为了细胞靶向的目的并入的单体单元系至dsRNA剂的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。肽部分可以在长度上范围从约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或指导构象特性。可以利用下文描述的任何结构修饰。
用于在本发明的组合物和方法中使用的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以是修饰的，例如糖基化或甲基化以促进靶向一个或多个特定组织。含RGD的肽和肽模拟物可以包括D-氨基酸以及合成的 RGD模拟物。除了RGD之外，可使用靶向整合素配体的其他部分。该配体的优选偶联物靶向PECAM-1或VEGF。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α- 螺旋线性肽(例如LL-37或Ceropin P1)、含二硫键的肽(例如α-防卫素、β-防卫素或牛抗菌肽)、或只包含一个或两个主导性氨基酸(例如PR-39或吲哚力西丁)的肽。细胞渗透肽也可以包含核定位信号 (NLS)。例如细胞渗透肽可以是二重两亲肽，如MPG，其源自HIV-1 gp41的融合物肽结构域和SV40大T抗原的NLS(西梅奥尼(Simeoni) 等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)31：2717-2724，2003)。
C.碳水化合物偶联物
在本发明的组合物与方法的一些实施例中，iRNA寡核苷酸进一步包括一种碳水化合物。碳水化合物偶联的iRNA对于核酸的体内递送以及适合于体内治疗用途的组合物而言是有利的，如在此所描述。如本文中使用的，“碳水化合物”指以下这样一种化合物，它是一种本身由具有至少6个碳原子的一个或多个单糖单位构成的碳水化合物 (其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子；或者它是一种具有以下这样的一个碳水化合物部分作为其一部分的化合物，该碳水化合物由具有至少六个碳原子的一个或多个单糖单位构成(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖以及包含从大约4、5、6、7、8或9个单糖单位的低聚糖)，以及多糖例如淀粉、糖原、纤维素以及多糖胶。具体的单糖包括C5 以及以上的(例如AGT、C6、C7或C8)糖；二糖以及三糖包括具有两个或三个单糖单位的糖(例如AGT、C6、C7或C8)。
在一个实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物偶联物是一种单糖。在一个实施例中，该单糖是一种N-乙酰半乳糖胺，例如
Figure BDA0001214965370000841
在另一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的碳水化合物偶联物选自：
Figure BDA0001214965370000851
Figure BDA0001214965370000861
Figure BDA0001214965370000871
Figure BDA0001214965370000881
用于本文中所述的实施方案中的另一种代表性的碳水化合物偶联物包括，但不限于
Figure BDA0001214965370000891
当X或Y之一是寡核苷酸时，另一个是氢。
在一些实施方案中，碳水化合物偶联物进一步包含一个或多个如上所述的其他配体，如，但不限于，PK调节剂和/或细胞渗透肽。
适用于本发明中的其他碳水化合物偶联物(和接头)包括PCT 公开No.WO 2014/179620和WO 2014/179627中所述的那些，将每篇的完整内容按引用并入本文中。
D.接头
在一些实施例中，此处所述的偶联物或配体可以借助各种接头与 iRNA寡核苷酸连接，所述接头可以是可切割或不可切割的。
术语“接头”或“连接基团”意为一种有机部分，它连接一个化合物的两个部分，例如共价地附接一个化合物的两个部分。接头典型地包括一种直接的键或一种原子例如氧或硫，一种单位例如NR8、 C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或者一种原子链，例如但不限于经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、 N(R8)、C(O)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族的或经取代的脂肪族的。在一个实施例中，该接头是在大约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子，7-17、8-17、 6-16、7-16或8-16个原子之间。
一种可切割的连接基团在细胞外是足够稳定的，但它在进入靶标细胞时被切割以释放该接头结合在一起的两个部分。在一个优选的实施例中，该可切割的连接基团在靶标细胞中或在一个第一参考条件 (其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下的切割比在受试者的血液中或在一个第二参考条件下(其可以例如被选择为模拟或代表在该血液或血清中发现的条件)快至少大约10倍、20倍、30倍、40 倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少大约100倍。
可切割的连接基团易于受到切割因子(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。一般地，切割因子在细胞内比在血清或血液中更普遍或具有更高水平或活性。此类降解因子的实例包括：氧化还原因子，它们被选择用于具体底物或者无底物特异性，包括例如氧化或还原酶或者在细胞中出现的还原因子例如硫醇(它可以通过还原作用降解一种可氧化还原切割的连接基团)；酯酶；核内体或可以创造酸性环境的因子，例如可以导致pH为5或更低的那些；可以通过作为一种广义酸起作用而水解或降解一种酸可切割的连接基团的酶，肽酶(它可以是底物特异性的)，以及磷酸酶。
一种可切割的连锁群，例如二硫键可以对pH敏感。人血清的pH 是7.4，而平均的细胞内pH稍低，范围为大约7.1-7.3。核内体具有一个更酸的pH，范围在5.5-6.0，并且溶酶体具有一个甚至更酸的pH，在5.0左右。一些接头将具有可切割的连接基团，这些基团在一个优选的pH处被切割，由此将阳离子脂质从配体释放在细胞内，或释放进入所希望的细胞区室。
接头可以包括一种可被特定酶切割的可切割连接基团。并入接头的可切割连接基团的类型可以取决于有待被靶向的细胞。例如肝靶向的配体可以通过一种包括酯基团的接头而被连接至一种阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，并且因此与不富含酯酶的细胞相比，该接头将在肝细胞中被更有效地切割。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质以及睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(例如肝细胞与滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的接头。
总体上，一种候选的可切割连接基团的适合性可以通过测试降解因子(或条件)切割该候选的连接基团的能力来进行评估。还希望的是也测试该候选的可切割连接基团在血液中或当与其他非靶标组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定在一个第一条件与一个第二条件之间进行切割的相对敏感性，其中该第一条件被选择为指示在一个靶标细胞中的切割并且该第二条件被选择为指示在其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的切割。这些评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整个动物中的进一步评估来进行确证。在优选的实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的切割比在血液或血清(或在被选择为模拟细胞外条件的体外条件下)中的切割快至少大约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大约 100倍。
i.氧化还原可切割连接基团
在一个实施例中，可切割的连接基团是一种氧化还原可切割的连接基团，其在还原或氧化时被切割。还原地可切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定一个候选的可切割连接基团是否是一种适合的“还原地可切割的连接基团”，或者例如是否适合于与一种特定的iRNA部分以及特定的靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或本领域内已知的使用还原剂的试剂进行孵育来对一个候选者进行评估，这模拟了会在细胞(例如靶标细胞)内观察到的切割速率。还可以在被选择为模拟血液或血清条件的条件下对这些候选者进行评估。在一个实施例中，候选化合物在血液中被切割最多大约10％。在其他实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)中的降解快至少大约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大约100倍。可以在被选择为模拟细胞内介质的条件下，使用标准的酶动力学测定来确定候选化合物的切割速率，并且将其与被选择为模拟细胞外介质的条件下的速率相比较。
ii.基于磷酸酯的可切割连接基团
在另一个实施例中，可切割接头包括一种基于磷酸酯的可切割的连接基团。基于磷酸酯的可切割的连接基团通过降解或水解该磷酸酯基团的因子而被切割。一种在细胞中切割磷酸酯基团的因子的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、 -S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、 -O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、 -S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、 -S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、 -S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、 -S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一个优选的实施例是 -O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
iii.酸可切割连接基团
在另一个实施例中，可切割接头包括一种酸可切割的连接基团。酸可切割的连接基团是在酸性条件下被切割的一种连接基团。在优选的实施例中，酸可切割的连接基团在一个具有大约6.5或更低(例如大约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的pH的酸性环境中被切割，或者被多种因子(例如可以作为一种广义酸起作用的酶)被切割。在细胞中，具体的低pH细胞器(例如核内体或溶酶体)可以提供一个针对酸可切割的连接基团的切割环境。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可切割的基团可以具有通式 -C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。一个优选的实施例是当附接至酯(烷氧基基团)的氧的碳是芳基基团、经取代的烷基基团或叔烷基基团(例如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
iv.基于酯的连接基团
在另一个实施例中，可切割接头包括一种基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团通过酶(例如细胞中的酯酶与酰胺酶)而被切割。基于酯的可切割的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基以及亚炔基的酯。酸可切割的连接基团具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
v.基于肽的切割基团
在又另一个实施例中，可切割接头包括一种基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割的连接基团通过酶(例如细胞中的肽酶与蛋白酶)而被切割。基于肽的可切割的连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如二肽、三肽，等等)以及多肽的肽键。基于肽的可切割的基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。该酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的特定类型的酰胺键。该基于肽的切割基团总体上限于在在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割的连接基团具有通式 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA与RB是这两个邻接氨基酸的R基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
在一个实施例中，本发明的iRNA通过一种接头被偶联至一种碳水化合物。本发明的组合物与方法的具有接头的iRNA碳水化合物偶联物的非限制性实例包括但不限于，
Figure BDA0001214965370000941
Figure BDA0001214965370000951
Figure BDA0001214965370000961
X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在本发明的组合物和方法的特定实施方案中，配体是通过二价或三价分支接头连接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰葡糖胺)衍生物。
在一个实施方案中，本发明的dsRNA与二价或三价分支接头偶联，所述接头选自式(XXXII)-(XXXV)中任一个显示的结构：
Figure BDA0001214965370000962
其中：
q2A，q2B，q3A，q3B，q4A，q4B，q5A，q5B和q5C对于每次出现独立地表示0-20和其中重复单体可以相同或不同；P2A，P2B，P3A，P3B，P4A， P4B，P5A，P5B，P5C，T2A，T2B，T3A，T3B，T4A，T4B，T4A，T5B，T5C对于每次出现各自独立地为不存在，CO，NH，O，S，OC(O)，NHC(O)，CH2，CH2NH 或CH2O；
Q2A，Q2B，Q3A，Q3B，Q4A，Q4B，Q5A，Q5B，Q5C对于每次出现独立地为不存在、亚烃基、取代的亚烃基，其中一个或多个亚甲基可以被 O，S，S(O)，SO2，N(RN)，C(R’)＝C(R”)，C≡C或C(O)中的一个或多个中断或终止；
R2A，R2B，R3A，R3B，R4A，R4B，R5A，R5B，R5C对于每次出现独立地为不存在，NH，O，S，CH2，C(O)O，C(O)NH，NHCH(Ra)C(O)， -C(O)-CH(Ra)-NH-，CO，CH＝N-O，
Figure BDA0001214965370000971
Figure BDA0001214965370000972
或杂环基；
L2A，L2B，L3A，L3B，L4A，L4B，L5A，L5B和L5C表示配体；即，对于每次出现各自独立地为单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；和Ra是H或氨基酸侧链。三价偶联GalNAc衍生物对于与 RNAi剂一起使用来抑制靶基因表达特别有用，如式(XXXV)的那些：
Figure BDA0001214965370000973
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，如GalNAc衍生物。
合适的二价与三价分支接头基团偶联的GalNAc衍生物的实例包括但不限于在以上引用为化学式II、VII、XI、X以及XIII的结构。
教导RNA偶联物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730； 5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802； 5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046； 4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941； 4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963； 5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469； 5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、 5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,51O,475；5,512,667；5,514,785； 5,565,552；5,567,81O；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726； 5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941；6,294,664；6,320,017； 6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，每一者的全部内容特此通过引用结合于此。
给定化合物中的全部位置不必要经统一修饰，并且实际上可以在单个化合物中或甚至在iRNA内部的单个核苷处掺入多于一个前述修饰。本发明也包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中，“嵌合的”iRNA化合物或“嵌合体”是以下这样的iRNA化合物，优选是dsRNA，它们包含两个或更多个化学上不同的区域，每者由至少一个单体单元构成，即，在dsRNA化合物的情况下的一种核苷酸。这些iRNA一般含有至少一个区域，其中RNA经修饰，从而赋予iRNA增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取和/或增加的靶核酸结合亲和力。iRNA的额外区域可以充当能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交分子的酶的底物。举例而言， RNase H是一种切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内核酸酶。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶的切割，因而大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧 dsRNA相比，可以在使用嵌合dsRNA时，经常用较短的iRNA获得可比较的结果。可以常规地通过凝胶电泳并且如果必要的话联合本领域内已知的核酸杂交技术来检测该RNA靶标的切割。
在某些实例中，iRNA的RNA可以通过非配体基团来进行修饰。一些非配体分子已经被偶联至iRNA以增强该iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类偶联的程序在科学文献中是可得的。这种非配体部分已经包括脂部分如胆固醇(库博(Kubo)，T. 等人，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res. Comm.)，2007，365(1)：54-61；乐欣格(Letsinger)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acid.Sci.USA)，1989，86：6553)，胆酸(马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Biorg.Med. Chem.Let.)，1994，4：1053)，硫醚如己基-S-三苯甲基硫醇(马诺汗(Manoharan)等人，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1992， 660：306；马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报 (Biorg.Med.Chem.Let.)，1993，3：2765)，硫代胆固醇(奥博汗瑟 (Oberhauser)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1992，20：533)，脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(赛森-博和马拉 (Saison-Behmoaras)等人，EMBO杂志，1991，10：111；卡波诺 (Kabanov)等人，FEBS通讯，1990，259：327；斯伍那区克(Svinarchuk) 等人，生物化学(Biochimie)，1993，75：49)，磷脂如二-十六烷基- 外消旋-甘油或三乙铵1，2-二-O-十六烧基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯 (马诺汗(Manoharan)等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1995， 36：3651；舍阿(Shea)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1990， 18：3777)，聚胺或聚乙烯乙二醇链(马诺汗(Manoharan)等人，核苷&核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14：969)或金刚烷乙酸(马诺汗(Manoharan)等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)， 1995，36：3651)，棕榈基部分(米莎(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1995，1264：229)，或十八胺或己胺-羰基-羟胆固醇部分(克鲁克(Crooke)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1996，277：923)。教授制备这类RNA偶联物的代表性美国专利已经在上文列出。典型的偶联方案涉及在序列的一个或多个位置具有氨基接头的RNA的合成。然后使用适当的偶联剂或活化剂使该氨基基团与被偶联的分子进行反应。偶联反应可以用仍与固相支持物结合或在切割RNA后处于溶液相的RNA进行。通过HPLC纯化RNA偶联物一般提供纯的偶联物。
V.本发明的iRNA的递送
可以以各种不同的方式来实现本发明的iRNA至细胞的递送，例如，受试者体内的细胞，如人类受试者(例如，需要的受试者，如患有血管紧张素原相关疾病或病症的受试者)。例如递送可通过将细胞在体外或体内与本发明的iRNA接触来进行。也可以通过向受试者施用包含iRNA(例如dsRNA)的组合物，直接进行体内递送。可替代地，可以通过施用编码和指导iRNA表达的一种或多种载体间接地进行体内递送。这些替代方案在后文进一步论述。
通常，递送(体外或体内)核酸分子的任何方法可以适应于随本发明的iRNA使用(见例如阿赫塔尔(Akhtar)S.和朱利安(Julian)RL. (1992)细胞生物学趋势(TrendsCell.Biol.)2(5)：139-144和WO 94/02595，通过引用以其全文结合在此)。对于体内递送，为了递送 iRNA分子考虑的因子包括：例如所递送的分子的生物学稳定性、非特异性作用的防止、和所递送分子在靶组织中的积累。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入至组织中或局部施用该制剂，使iRNA 的非特异性作用最小化。局部施用至治疗位点使该药剂的局部浓度最大化，限制该药剂向全身组织的暴露，所述全身组织否则可能受该药剂损害或可能降解该药剂，并且允许较低总剂量的iRNA分子施用。几项研究已经显示在局部施用iRNA时成功敲减基因产物。例如在食蟹猴中通过玻璃体内注射眼球内递送VEGF dsRNA(托伦蒂诺 (Tolentino)，MJ.等人(2004)视网膜(Retina)24：132-138)和在小鼠中视网膜下注射(赖希(Reich)，SJ.等人(2003)分子视觉(Mol. Vis.)9：210-216)眼球内递送VEGF dsRNA均显示在年龄相关性黄斑变性的实验模型中防止血管新生。此外，在小鼠中直接肿瘤内注射 dsRNA缩减肿瘤体积(皮勒(Pille)，J.等人(2005)分子疗法(Mol. Ther.)11：267-274)并且可以延长带瘤小鼠的存活(金姆(Kim)， WJ.等人(2006)分子疗法(Mol.Ther.)14：343-350；李(Li)，S. 等人(2007)分子疗法(Mol.Ther.)15：515-523)。也已经显示通过直接注射将RNA干扰成功局部递至CNS(多恩(Dorn)，G.等人(2004) 核酸(Nucleic Acids)32：e49；丹(Tan)，PH.等人(2005)基因疗法(Gene Ther.)12：59-66；牧村(Makimura)，H.等人(2002)BMC 神经科学(BMC Neurosci.)3：18；希什吉娜(Shishkina)，GT.等人 (2004)神经科学(Neuroscience)129：521-528；塔克尔(Thakker)， ER.等人(2004)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 101：17270-17275；阿卡涅亚(Akaneya)，Y.等人(2005)神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)93：594-602并且通过鼻内施用成功递送至肺(霍华德(Howard)，KA.等人(2006)分子疗法(Mol.Ther.) 14：476-484；张(Zhang)，X.等人(2004)生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 279：10677-10684；比特科(Bitko)，V.等人(2005)自然·医学(Nat. Med.)11：50-55)。对于全身性施用iRNA以便治疗疾病，可以将RNA 修饰或可替代地使用药物递送系统递送；两种方法均起到防止dsRNA 被体内核酸内切酶和外切酶快速降解的作用。RNA或药物载体的修饰也可以允许iRNA组合物靶向靶组织并避免不想要的脱靶效应。 iRNA分子可以通过化学偶联至亲脂性基团如胆固醇进行修饰以增强细胞摄取和防止降解。例如将与亲脂性胆固醇部分偶联的针对ApoB 的iRNA全身注射至小鼠并且导致肝脏和空肠中apoB mRNA的敲减 (苏兹赫克(Soutschek)，J.等人(2004)自然(Nature)432：173-178)。 iRNA与适配体的偶联已经在前列腺癌的小鼠模型中显示抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(麦克纳马拉(McNamara)，JO.等人(2006)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)24：1005-1015)。在替代性实施例中，可以使用药物递送系统如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许iRNA由细胞高效摄取。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与iRNA 结合或被诱导以形成包装siRNA的囊泡或胶束(见例如金姆(Kim)SH.等人(2008)控制释放期刊(Journal of Controlled Release) 129(2)：107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身施用时iRNA的降解。用于制造和施用阳离子-iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如索伦森(Sorensen)，DR.等人(2003)分子生物学杂志(J.Mol.Biol)327：761-766；维尔马(Verma)，UN. 等人(2003)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)9：1291-1300；阿诺德 (Arnold)，AS等人(2007)高血压杂志(J.Hypertens.)25：197-205，通过引用以其全文结合在此)。对全身递送iRNA有用的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(索伦森(Sorensen)，DR等人 (2003)，同上；维尔马(Verma)，UN.等人，(2003)，同上)、 Oligofectamine、“固体核酸酸脂质颗粒”(齐默尔曼(Zimmermann)， TS等人(2006)自然441：111-114。)，心磷脂(简(Chien)，PY，等人(2005)癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)12：321-328；帕尔 (Pal)，A等人(2005)国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)26：1087-1091)、聚乙烯亚胺(邦尼特(Bonnet)ME等人(2008)药物研究(Pharm.Res.) 8月16日印刷版之前的电子版(Aug 16 Epub ahead of print)；爱格纳(Aigner)，A.(2006)生物医学和生物技术杂志(J.Biomed. Biotechnol.)71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(柳(Liu)，S.(2006) 分子医药(Mol.Pharm.)3：472-487)、和聚酰胺型胺类(托马利亚 (Tomalia)，DA等人(2007)生化社会事务(Biochem.Soc.Trans.) 35：61-67；由(Yoo)，H.，等人(1999)药物研究(Pharm.Res.) 16：1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身性施用的复合物。用于施用iRNA和环糊精的药物组合物的方法可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用方式完整地结合在此。
A.本发明的载体编码的iRNA
靶向AGT基因的iRNA可以从插入DNA或RNA载体中的转录单位表达(见，例如卡秋尔(Couture)，A等人，TIG.(1996)，12：5-10；思科勒尔(Skillern)，A.等人，国际PCT公开号WO00/22113，卡雷德(Conrad)，国际PCT公开号WO 00/22114，以及卡雷德(Conrad)，美国专利号6,054,299)。取决于使用的具体构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持久的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。转基因也可以如此构建以允许它作为染色体外质粒遗传(加斯曼(Gassmann)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1995)92：1292)。
iRNA的单条链或多条链可以从表达载体上的启动子转录。在两条单独的链待表达以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独表达载体共引入(例如通过转染或感染)靶细胞中。可替代地，dsRNA 的每条单独链可以由均位于相同表达质粒上的启动子转录。在一个实施例中，dsRNA表达为被一种接头多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，由此该dsRNA具有茎环结构。
iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体、优选地与脊椎动物细胞相容的那些，可以用来产生表达如本文所述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域熟知的并且从许多商业来源可获得。一般，提供这类载体，它们含有用于插入所需核酸区段的便利限制性位点。表达iRNA的载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用至从患者移植出来、随后重新引入患者的靶细胞或通过允许向所需靶细胞引入的任何其他手段。
可以将iRNA表达质粒作为与阳离子脂质载体(例如 Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如Transit-TKOTM) 的复合物转染至靶细胞中。本发明也构思了在一周或更长时间范围内用于iRNA介导的靶向靶RNA不同区域的敲减的多次脂质转染。成功地将载体引入宿主细胞可以使用多种已知的方法来监测。例如瞬时转染可以使用一种报告物来进行信号化，例如荧光标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。稳定的对离体细胞的转染可以使用以下这样的标记来进行确保：这些标记为被转染的细胞提供了对特定环境因子(例如抗生素或药物)的抗性，例如潮霉素B抗性。
可以随本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺联病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小RNA病毒载体；(i)痘病毒载体如正痘病毒，例如痘苗病毒载体或禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒；和(j)辅助病毒依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体将并入或将不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包含病毒序列以用于转染。可替代地，构建体可以并入能够发生附加体型复制的载体 (例如EPV和EBV载体)中。用于重组表达iRNA的构建体通常将需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。下文进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。
可用于递送iRNA的载体将包括足以在所需靶细胞或组织中表达 iRNA的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件以提供组成型或调节/诱导型表达。
可以精确地调节iRNA的表达，例如通过使用对某些生理调节物 (例如循环型葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调节序列(多赫替 (Docherty)等人，1994，FASEB杂志8：20-24)。适合于在细胞中或哺乳动物中控制dsRNA表达的此类可诱导的表达系统包括例如由以下项进行的调节：蜕皮激素、雌激素、黄体酮、四环素、二聚作用的化学诱导物、以及异丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途选择适宜的调节/启动子序列。
可以使用含有编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如可以使用逆转录病毒载体(见米列尔(Miller)等人，酶学方法(Meth.Enzymol.) 217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有对于病毒基因组正确包装并整合入宿主细胞DNA必需的组件。将编码iRNA的核酸序列克隆至促进该核酸递送入患者的一种或多种载体中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在例如博森(Boesen)等人，生物疗法 (Biotherapy)6：291-302(1994)找到，所述文献描述使用逆转录病毒载体递送mdr1基因至造血干细胞，以便使得干细胞对化疗更耐受。说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的其他参考文献是：克洛斯 (Clowes)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)93：644-651(1994)；基艾姆(Kiem)等人，血液(Blood)83：1467-1473(1994)；萨尔蒙斯(Salmons)和京茨堡(Gunzberg)，人类基因疗法(Human Gene Therapy)4：129-141(1993)；和格罗斯曼(Grossman)和威尔逊 (Wilson)，遗传学与发育学新观点(Curr.Opin.in Genetics and Devel.)3：110-114(1993)。构思使用的慢病毒载体例如包括基于HIV 的载体，这些载体在美国专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276 中描述，所述专利通过引用方式结合在此。
也构思腺病毒用于本发明的iRNA的递送。腺病毒是特别有吸引力的媒介物，例如用于递送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感不分裂细胞的优点。科扎斯凯(Kozarsky)和威尔逊(Wilson)，遗传学与发育学新观点(Current Opinion in Genetics and Development) 3：499-503(1993)提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。布特(Bout) 等人，人类基因疗法(Human Gene Therapy)5：3-10(1994)展示了腺病毒载体转移基因至恒河猴猴呼吸道上皮的用途。基因治疗中使用腺病毒的其他例子可以在罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，Science 252：431-434(1991)；罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，细胞(Cell) 68：143-155(1992)；马斯特伦杰利(Mastrangeli)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)91：225-234(1993)；PCT公开WO 94/12649；和王(Wang)等人，基因疗法(Gene Therapy)2：775-783(1995)中找到。用于表达本发明中表征的iRNA的合适AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在夏(Xia)H 等人，(2002)，自然生物技术(Nat.Biotech.)20：1006-1010中描述。
也可以使用腺联病毒(AAV)载体来递送本发明的iRNA(沃尔什(Walsh)等人，实验生物学与医学会会报(Proc.Soc.Exp.Biol. Med.)204：289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，iRNA可以从具有例如U6或H1 RNA启动子或细胞巨化病毒 (CMV)启动子的重组AAV载体作为两个单独的互补性单链RNA 分子表达。用于表达本发明中表征的dsRNA的合适AAV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在萨穆尔斯基(Samulski)R等人(1987)，病毒学杂志(J.Virol.)61：3096-3101；菲舍尔(Fisher)K J等人(1996)，病毒学杂志(J.Virol.)，70：520-532；萨穆尔斯基(Samulski)R等人(1989)，病毒学杂志(J.Virol.) 63：3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；和国际专利申请号WO 93/24641中描述，通过引用将其全部披露合并在此。
另一种适合于递送本发明的iRNA的病毒载体是痘病毒如痘苗病毒，例如减毒痘苗病毒如修饰的安卡拉病毒(MVA)或NYVAC、禽痘病毒如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。
病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原来对这些载体假型化而进行修饰，或者适当时通过取代不同的病毒衣壳蛋白而进行修饰。例如慢病毒载体可以是用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白进行假病毒化。可以通过将载体工程化以表达不同血清型的衣壳蛋白，使得AAV载体靶向不同的细胞；参见例如拉比诺维茨(Rabinowitz) J E等人，(2002)，病毒学杂志(J Virol)76：791-801，通过引用将其全部披露合并在此。
载体的药物制剂可以包括在一种可接受的稀释剂中的该载体，或者可以包括一种缓释基质，该基因递送媒介物被嵌入其中。可替代地，当该完全的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产出的情况下，该药物制剂可以包括产出该基因递送系统的一个或多个细胞。
VI.本发明的药物组合物
本发明还包括药物组合物和制剂，它们包括本发明的iRNA。在一个实施例中，本文中提供含有如此处所述的iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物。含有iRNA的药物组合物可用于治疗与AGT 基因的表达或活性相关的疾病或病症。此类药物组合物基于递送模式而进行配制。一个实例是经配制以便通过肠胃外递送，例如通过皮下 (SC)或静脉内(IV)递送来全身性施用的组合物。另一个实例是以下组合物，该组合物被配制用于直接递送到脑实质，例如通过输注到脑，例如通过连续泵输注。本发明的药物组合物可以按足以抑制AGT基因的表达的剂量给予。通常，本发明的iRNA的适合剂量处于每日受体每千克体重约0.001至约200.0毫克范围内，通常处于每日每千克体重约1至50mg范围内。例如dsRNA可以按每个单剂量约0.01 mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约 2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约 40mg/kg、或约50mg/kg施用。
例如可以按以下剂量给予dsRNA：大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、 2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、 3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、 4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、 6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、 7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、 9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在另一个实施例中，将该dsRNA按以下的剂量给予：约0.1至约 50mg/kg、约0.25至约50mg/kg、约0.5至约50mg/kg、约0.75至约 50mg/kg、约1至约50mg/kg、约1.5至约50mg/kg、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约 4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5 至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约 50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50 mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.1至约45mg/kg、约0.25至约45 mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/kg、约1.5至约45mg/kg、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约 3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5 至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约 45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45 mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.1至约40mg/kg、约0.25至约40mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/kg、约1.5至约40mg/kg、约2至约40mg/kg、约2.5 至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约 40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40 mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约 30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.1至约30mg/kg、约0.25至约30mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1 至约30mg/kg、约1.5至约30mg/kg、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约 20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.25 至约20mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1 至约20mg/kg、约1.5至约20mg/kg、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20 mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，可以以约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、 0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、 1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、 2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、 5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、 7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、 8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、 9.8、9.9或约10mg/kg的剂量来施用dsRNA。所述值中间的值和范围也打算是本发明的部分。
在另一个实施例中，将该dsRNA按以下的剂量给予：大约0.5 至大约50mg/kg、大约0.75至大约50mg/kg、大约1至大约50mg/kg、大约1.5至大约50mg/kg、大约2至大约50mg/kg、大约2.5至大约 50mg/kg、大约3至大约50mg/kg、大约3.5至大约50mg/kg、大约 4至大约50mg/kg、大约4.5至大约50mg/kg、大约5至大约50mg/kg、大约7.5至大约50mg/kg、大约10至大约50mg/kg、大约15至大约 50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约30至大约50 mg/kg、大约35至大约50mg/kg、大约40至大约50mg/kg、大约45 至大约50mg/kg、大约0.5至大约45mg/kg、大约0.75至大约45 mg/kg、大约1至大约45mg/kg、大约1.5至大约45mg/kg、大约2 至大约45mg/kg、大约2.5至大约45mg/kg、大约3至大约45mg/kg、大约3.5至大约45mg/kg、大约4至大约45mg/kg、大约4.5至大约 45mg/kg、大约5至大约45mg/kg、大约7.5至大约45mg/kg、大约 10至大约45mg/kg、大约15至大约45mg/kg、大约20至大约45 mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约25 至大约45mg/kg、大约30至大约45mg/kg、大约35至大约45mg/kg、大约40至大约45mg/kg、大约0.5至大约40mg/kg、大约0.75至大约40mg/kg、大约1至大约40mg/kg、大约1.5至大约40mg/kg、大约2至大约40mg/kg、大约2.5至大约40mg/kg、大约3至大约40 mg/kg、大约3.5至大约40mg/kg、大约4至大约40mg/kg、大约4.5 至大约40mg/kg、大约5至大约40mg/kg、大约7.5至大约40mg/kg、大约10至大约40mg/kg、大约15至大约40mg/kg、大约20至大约 40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约 25至大约40mg/kg、大约30至大约40mg/kg、大约35至大约40 mg/kg、大约0.5至大约30mg/kg、大约0.75至大约30mg/kg、大约 1至大约30mg/kg、大约1.5至大约30mg/kg、大约2至大约30mg/kg、大约2.5至大约30mg/kg、大约3至大约30mg/kg、大约3.5至大约 30mg/kg、大约4至大约30mg/kg、大约4.5至大约30mg/kg、大约 5至大约30mg/kg、大约7.5至大约30mg/kg、大约10至大约30mg/kg、大约15至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约20至大约 30mg/kg、大约25至大约30mg/kg、大约0.5至大约20mg/kg、大约 0.75至大约20mg/kg、大约1至大约20mg/kg、大约1.5至大约20 mg/kg、大约2至大约20mg/kg、大约2.5至大约20mg/kg、大约3 至大约20mg/kg、大约3.5至大约20mg/kg、大约4至大约20mg/kg、大约4.5至大约20mg/kg、大约5至大约20mg/kg、大约7.5至大约 20mg/kg、大约10至大约20mg/kg、或大约15至大约20mg/kg。在一个实施例中，该dsRNA是以大约10mg/kg至大约30mg/kg的剂量给予的。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，受试者例如皮下或静脉内施用单个治疗量的iRNA，如约 0.1，0.125，0.15，0.175，0.2，0.225，0.25，0.275，0.3，0.325，0.35，0.375， 0.4，0.425，0.45，0.475，0.5，0.525，0.55，0.575，0.6，0.625，0.65，0.675， 0.7，0.725，0.75，0.775，0.8，0.825，0.85，0.875，0.9，0.925，0.95，0.975，1， 1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7， 2.8，2.9，3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4，4.1，4.2，4.3，4.4， 4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8， 7.9，8，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5， 9.6，9.7，9.8，9.9，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13，13.5，14，14.5，15，15.5， 16，16.5，17，17.5，18，18.5，19，19.5，20，20.5，21，21.5，22，22.5，23， 23.5，24，24.5，25，25.5，26，26.5，27，27.5，28，28.5，29，29.5，30，31，32，33，34，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49或约 50mg/kg。所述值中间的值和范围也打算是本发明的部分。
在一些实施方案中，受试者例如，皮下或静脉内施用多个剂量的治疗量的iRNA，如约0.1，0.125，0.15，0.175，0.2，0.225，0.25，0.275，0.3， 0.325，0.35，0.375，0.4，0.425，0.45，0.475，0.5，0.525，0.55，0.575，0.6， 0.625，0.65，0.675，0.7，0.725，0.75，0.775，0.8，0.825，0.85，0.875，0.9， 0.925，0.95，0.975，1，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，2.1，2.2， 2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9， 4，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6， 5.7，5.8，5.9，6，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7，7.1，7.2，7.3， 7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9， 9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13， 13.5，14，14.5，15，15.5，16，16.5，17，17.5，18，18.5，19，19.5，20，20.5， 21，21.5，22，22.5，23，23.5，24，24.5，25，25.5，26，26.5，27，27.5，28， 28.5，29，29.5，30，31，32，33，34，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43， 44，45，46，47，48，49或约50mg/kg的剂量。多剂量方案可以包括每日施用治疗量的iRNA，如持续两天、三天、四天、五天、六天、七天或更长时间。
在其他实施方案中，受试者例如，皮下或静脉内施用重复剂量的治疗量的iRNA，如约0.1，0.125，0.15，0.175，0.2，0.225，0.25，0.275，0.3， 0.325，0.35，0.375，0.4，0.425，0.45，0.475，0.5，0.525，0.55，0.575，0.6， 0.625，0.65，0.675，0.7，0.725，0.75，0.775，0.8，0.825，0.85，0.875，0.9， 0.925，0.95，0.975，1，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，2.1，2.2， 2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9， 4，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6， 5.7，5.8，5.9，6，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7，7.1，7.2，7.3， 7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9， 9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13， 13.5，14，14.5，15，15.5，16，16.5，17，17.5，18，18.5，19，19.5，20，20.5， 21，21.5，22，22.5，23，23.5，24，24.5，25，25.5，26，26.5，27，27.5，28， 28.5，29，29.5，30，31，32，33，34，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43， 44，45，46，47，48，49或约50mg/kg的剂量。重复剂量方案可以包括规律地施用治疗量的iRNA，如每隔一天、每隔两天、每隔三天、一周两次、一周一次、每隔一周或一个月一次。在特定实施方案中，约每个月一次至约每个季度一次(即，约每三个月一次)来施用iRNA。
初始治疗方案后，可以以较低频率来施用治疗。
在特定实施方案中，例如，当本发明的组合物包含如本文中所述的dsRNA和脂质时，受试者可以施用治疗量的iRNA，如约0.01mg/kg 至约5mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约0.05mg/kg至约5 mg/kg，约0.05mg/kg至约10mg/kg，约0.1mg/kg至约5mg/kg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，约0.2mg/kg至约5mg/kg，约0.2mg/kg至约10mg/kg，约0.3mg/kg至约5mg/kg，约0.3mg/kg至约10mg/kg，约0.4mg/kg至约5mg/kg，约0.4mg/kg至约10mg/kg，约0.5mg/kg 至约5mg/kg，约0.5mg/kg至约10mg/kg，约1mg/kg至约5mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，约1.5mg/kg至约5mg/kg，约1.5mg/kg至约10mg/kg，约2mg/kg至约2.5mg/kg，约2mg/kg至约10mg/kg，约 3mg/kg至约5mg/kg，约3mg/kg至约10mg/kg，约3.5mg/kg至约5 mg/kg，约4mg/kg至约5mg/kg，约4.5mg/kg至约5mg/kg，约4 mg/kg至约10mg/kg，约4.5mg/kg至约10mg/kg，约5mg/kg至约10 mg/kg，约5.5mg/kg至约10mg/kg，约6mg/kg至约10mg/kg，约6.5 mg/kg至约10mg/kg，约7mg/kg至约10mg/kg，约7.5mg/kg至约10 mg/kg，约8mg/kg至约10mg/kg，约8.5mg/kg至约10mg/kg，约9 mg/kg至约10mg/kg或约9.5mg/kg至约10mg/kg。所述值中间的值和范围也打算是本发明的部分。
例如，可以以约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，1.1，1.2， 1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9， 3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6，6.1，6.2，6.3， 6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8， 8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7， 9.8，9.9或约10mg/kg的剂量来施用dsRNA。所述值中间的值和范围也打算是本发明的部分。
在本发明的某些实施方案中，例如，当双链RNAi剂包括修饰(例如，三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个或多个基序)(包括在 RNAi剂的切割位点处或附近包括一个这样的基序)、六个硫逐磷酸酯连接基团和配体时，这样的药剂可以以约0.01至约0.5mg/kg，约0.01至约0.4mg/kg，约0.01至约0.3mg/kg，约0.01至约0.2mg/kg，约 0.01至约0.1mg/kg，约0.01mg/kg至约0.09mg/kg，约0.01mg/kg至约0.08mg/kg，约0.01mg/kg至约0.07mg/kg，约0.01mg/kg至约0.06 mg/kg，约0.01mg/kg至约0.05mg/kg，约0.02至约0.5mg/kg，约0.02 至约0.4mg/kg，约0.02至约0.3mg/kg，约0.02至约0.2mg/kg，约0.02 至约0.1mg/kg，约0.02mg/kg至约0.09mg/kg，约0.02mg/kg至约 0.08mg/kg，约0.02mg/kg至约0.07mg/kg，约0.02mg/kg至约0.06 mg/kg，约0.02mg/kg至约0.05mg/kg，约0.03至约0.5mg/kg，约0.03 至约0.4mg/kg，约0.03至约0.3mg/kg，约0.03至约0.2mg/kg，约0.03 至约0.1mg/kg，约0.03mg/kg至约0.09mg/kg，约0.03mg/kg至约 0.08mg/kg，约0.03mg/kg至约0.07mg/kg，约0.03mg/kg至约0.06 mg/kg，约0.03mg/kg至约0.05mg/kg，约0.04至约0.5mg/kg，约0.04 至约0.4mg/kg，约0.04至约0.3mg/kg，约0.04至约0.2mg/kg，约0.04 至约0.1mg/kg，约0.04mg/kg至约0.09mg/kg，约0.04mg/kg至约 0.08mg/kg，约0.04mg/kg至约0.07mg/kg，约0.04mg/kg至约0.06 mg/kg，约0.05至约0.5mg/kg，约0.05至约0.4mg/kg，约0.05至约0.3mg/kg，约0.05至约0.2mg/kg，约0.05至约0.1mg/kg，约0.05 mg/kg至约0.09mg/kg，约0.05mg/kg至约0.08mg/kg或约0.05mg/kg 至约0.07mg/kg的剂量来施用。上述值中间的值和范围也打算是本发明的部分，例如，RNAi剂可以以约0.015mg/kg至约0.45mg/kg的剂量施用于受试者。
例如，RNAi剂，例如，药物组合物中的RNAi剂，可以以约0.01 mg/kg，0.0125mg/kg，0.015mg/kg，0.0175mg/kg，0.02mg/kg，0.0225 mg/kg，0.025mg/kg，0.0275mg/kg，0.03mg/kg，0.0325mg/kg，0.035 mg/kg，0.0375mg/kg，0.04mg/kg，0.0425mg/kg，0.045mg/kg，0.0475 mg/kg，0.05mg/kg，0.0525mg/kg，0.055mg/kg，0.0575mg/kg，0.06 mg/kg，0.0625mg/kg，0.065mg/kg，0.0675mg/kg，0.07mg/kg，0.0725 mg/kg，0.075mg/kg，0.0775mg/kg，0.08mg/kg，0.0825mg/kg，0.085 mg/kg，0.0875mg/kg，0.09mg/kg，0.0925mg/kg，0.095mg/kg，0.0975 mg/kg，0.1mg/kg，0.125mg/kg，0.15mg/kg，0.175mg/kg，0.2mg/kg，0.225mg/kg，0.25mg/kg，0.275mg/kg，0.3mg/kg，0.325mg/kg，0.35 mg/kg，0.375mg/kg，0.4mg/kg，0.425mg/kg，0.45mg/kg，0.475mg/kg 或约0.5mg/kg的剂量来施用。上述值中间的值也打算是本发明的部分。
可以在一段时间内，如在5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19，20和21，22，23，24或约25分钟时间段内，通过静脉内输注来施用药物组合物。例如，可以规律地重复施用，如每周、两周(即，每两周)，持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长时间。初始治疗方案后，可以以较低频率来给予治疗。例如，每周或两周施用三个月后，施用可以每月一次重复，持续六个月或一年或更长时间。
药物组合物可以通过皮下施用来施用。
药物组合物可以每日施用一次，或iRNA可以在一天中以合适的间隔作为两个、三个或更多个亚剂量来施用，或甚至使用连续输注或通过控释制剂来递送。在这种情况中，每个亚剂量中含有的iRNA必须相应地较少，以获得总的日剂量。也可以复合剂量单位用于在几天内递送，例如，使用常规持续释放制剂，其在几天的时间段内提供持续的iRNA释放。持续释放制剂是本领域公知的并且对于在特定部分递送药剂特别有用，如可以与本发明的药剂一起使用。在这个实施方案中，剂量单位含有相应的多个日剂量。最初可以施用较高剂量(即，负荷剂量)，接着在持续时间段内施用较低剂量。
在其他实施方案中，单个剂量的药物组合物可以是长效的，使得随后的剂量以不超过3，4或5天的间隔，或不超过1，2，3或4周的间隔来施用。在本发明的一些实施方案中，每周一次施用单个剂量的本发明的药物组合物。在本发明的其他实施方案中，每两月施用单个剂量的本发明的药物组合物。在特定实施方案中，以约每月一次至约每季度一次(即，约每三个月一次)施用iRNA。
药物组合物可以施用不定的时间段，例如，在由于肥胖正而经历血压升高的受试者中，或在存在升高的AGT水平的诱因的时间段中，例如，在妊娠诱发的高血压期间。
本领域技术人员将理解，某些因子可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因子包括(但不局限于)疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗一个受试者可以包括单一治疗或者一系列治疗。如本文中他处描述，使用常规方法或基于使用适宜动物模型的体内测试，可以估计本发明涵盖的各个iRNA的有效剂量和体内半寿期。
在小鼠遗传学方面的进展已经产生了许多用于研究人类不同疾病的小鼠模型，例如将从减少AGT表达受益的出血性障碍。这类模型可以用于iRNA的体内测试，以及用于确定治疗有效剂量。合适的小鼠模型是本领域已知的，并且包括，例如血友病A小鼠模型和血友病B小鼠模型，例如含有凝血因子基因敲除的小鼠，如在博利格尔 (Bolliger)等人(2010)血栓形成和止血杂志(Thromb Haemost) 103：1233-1238，毕(Bi)L，等人(1995)自然遗传学(Nat Genet) 10：119-21，林(Lin)等人(1997)血液(Blood)90：3962-6，昆都(Kundu) 等人(1998)血液(Blood)92：168-74，王(Wang)等人(1997)美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci U S A)94：11563-6，和金(Jin) 等人(2004)血液(Blood)104：1733所述的那些。
取决于希望局部还是系统性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(例如通过皮肤药贴)；肺的；例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；真皮下的，如通过植入设备；或颅内的，例如通过实质内的、鞘内的或心室内的给予。iRNA可以按这样的方式递送以靶向特定组织，如肝脏(例如肝脏的肝上皮实质细胞)。用于局部给予的药物组合物以及制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等等可以是必要的或希望的。包衣的安全套、手套等等也可以是有用的。适合的局部用制剂包括其中本发明中表征的 iRNA与局部用递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性物质混合的那些。适合的脂质和脂质体包括中性 (例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG) 和阳离子脂质和脂质体(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明中表征的iRNA可以封装于脂质体内部或可以与其、尤其是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，iRNA可以与脂质、尤其与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸与酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或C1-20烷基酯(例如异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部用制剂在美国专利号6,747,014中详细描述，所述专利通过引用方式结合在此。
A.包含膜性分子组件的iRNA制剂
用于在本发明的组合物和方法中使用的iRNA可以被配制成用于在膜性分子组件中递送例如脂质体或胶束。如此处使用的，术语“脂质体”是指由设置在至少一个双层(例如一个双层或多个双层)中的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。水性部分包含该iRNA组合物。该亲脂性材料从典型地不包括iRNA组合物的水性外部(尽管在一些实例中，它可能包括)分离该水性内部。脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用位点是有用的。因为该脂质体膜在结构上类似于生物膜，所以当脂质体被应用至一个组织时，这些脂质体双层与这些细胞膜的双层合并。随着脂质体的合并和细胞进程，包括该iRNA 的这些内部水性内容物被递送到该细胞中，其中该iRNA可特异地结合至一个靶RNA并且可以介导iRNA。在一些情况下，这些脂质体也是特异地靶向的，例如将该iRNA引导到特定的细胞类型。
包含iRNA剂的脂质体可以通过多种方法来制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中使得用脂质组分形成胶束。例如该脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质偶联物。该洗涤剂可具有高的临界胶束浓度并可以是非离子的。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将该iRNA 剂制剂添加到包括该脂质组分的胶束中。该脂质上的阳离子基团与 iRNA剂相互作用并在iRNA剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析将该洗涤剂除去以得到iRNA剂的脂质体制剂。
如果必要，可以在缩合反应过程中添加协助缩合的载体化合物，例如通过控制添加。例如该载体化合物可以是一种聚合物而不是一种核酸(如精胺或亚精胺)。也可以调整pH，以有利于缩合。
用于产生稳定的多核苷酸递送媒介物的方法(其结合了多核苷酸 /阳离子脂质复合物作为该递送媒介物的结构组分)进一步描述在例如 WO 96/37194中，通过引用将其全文结合在此。脂质体形成还可以包括描述于以下中的示例性方法的一个或多个方面：费尔格纳 (Felgner)，P.L.等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.， USA)8：7413-7417，1987；美国专利号4,897,355；美国专利号 5,171,678；班厄姆(Bangham)等人分子生物学方法(M.Mol.Biol.) 23：238，1965；奥尔森(Olson)等人生物化学与生物物理学报(Biochim. Biophys.Acta)557：9，1979；斯左卡(Szoka)等人美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)75：4194，1978；梅休(Mayhew)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)775：169，1984；金姆 (Kim)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta) 728：339，1983；和福永(Fukunaga)等人内分泌学(Endocrinol.)115：757， 1984。常用的用于制备用作递送媒介物的具有适当尺寸的脂质聚集体的技术包括超声处理和冻融加挤出(见例如梅耶(Mayer)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)858：161，1986)。当所希望的是一致的小的(50至200nm)和相对均匀的聚集体时，可以使用微流化(梅休(Mayhew)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)775：169，1984)。这些方法容易地适用于将iRNA剂制剂封装到脂质体中。
脂质体有两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用而形成一种稳定的复合体。该带正电荷的核酸/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化在核内体中。由于核内体内部的酸性pH，脂质体破裂，释放它们的内容物至细胞胞质中(王(Wang)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，1987，147，980-985)。
pH-敏感或带负电荷的脂质体包埋核酸而不与之复合。由于该核酸与该脂质是带类似的电荷，所以形成排斥而不是复合。然而，一些核酸包埋于这些脂质体的含水内部。pH敏感的脂质体已经用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养中的细胞单层。在靶标细胞内检测到外源基因的表达(周(Zhou)等人，控释杂志(Journal of Controlled Release)，1992，19，269-274)。
脂质体组合物的一个主要类型包括磷脂，除了天然衍生的磷脂酰胆碱。例如中性脂质体组合物可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 (DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。阴离子脂质体组合物通常可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，而阴离子融合脂质体主要形成自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。另一类型的脂质体组合物形成自磷脂酰胆碱(PC)，例如像大豆PC，蛋PC。另一个类型形成自磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物。
在体外和体内将脂质体引入细胞的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640； WO 91/16024；费尔格纳(Felgner)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 269：2550，1994；诺贝尔(Nabel)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl. Acad.Sci.)90：11307，1993；诺贝尔(Nabel)，人类基因疗法(Human GeneTher.)3：649，1992；革顺(Gershon)，生物化学(Biochem.) 32：7143，1993；和斯特劳斯(Strauss)EMBO杂志11：417，1992。
非离子型脂质体系统也已经得以检验以确定它们在递送药物至皮肤方面的实用性，特别是包括非离子型表面活性剂以及胆固醇的系统。包括NovasomeTMI(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及NovasomeTMII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体制剂用于将环孢霉素A递送入小鼠皮肤的真皮。结果表明这类非离子型脂质体系统有效促进环孢菌素A沉积至皮肤的不同层中(胡(Hu)等人，S.T.P.制药科学(S.T.P.Pharma.Sci.)， 1994，4，6，466)。
脂质体还包括“立体化学稳定的”脂质体，这个术语如在此使用的指包括一种或多种专门化脂质的脂质体，当并入脂质体中时这些脂质导致相对于缺少此类专门化脂质的脂质体而言的增加的循环寿命。立体化学稳定的脂质体的实例是以下那些：在其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分中的一部分(A)包括一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷酯GM1，或者(B)是用一种或多种亲水聚合物衍生，例如聚乙二醇(PEG)部分。虽然不希望受任何具体理论束缚，但是本领域认为，至少对于包含神经节苷酯、鞘磷脂或PEG-衍生脂质的立体化学稳定的脂质体而言，这些立体化学稳定的脂质体的增加的循环半寿期是由于进入网状内皮系统(RES)细胞的减少的摄取(艾伦(Allen) 等人，FEBS通讯，1987，223，42；吴(Wu)等人，癌症研究(Cancer Research)，1993，53，3765)。
包括一种或多种糖脂的不同脂质体在本领域内是已知的。帕帕哈都久珀罗斯(Papahadjopoulos)等人(纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad. Sci.)，1987，507，64)报道了单唾液酸神经节苷酯GM1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半寿期的能力。这些研究结果由噶碧佐(Gabizon)等人(美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.)，1988，85，6949)阐释。均为艾伦(Allen)等人的美国专利号4,837,028和WO88/04924披露了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂 GM1或硫酸半乳糖脑苷脂的脂质体。美国专利号5,543,152(韦伯 (Webb)等人)披露了包含鞘磷脂的脂质体。包含1，2-sn-二肉豆蔻磷脂酰胆碱的脂质体在WO 97/13499(利姆(Lim)等人)中披露。
在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够融合至细胞膜的优势。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与质膜融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取，并可用以递送iRNA剂到巨噬细胞中。
脂质体的另外的优势包括：获得自天然磷脂类的脂质体是生物相容性的以及生物可降解的；脂质体可以合并广泛范围的水以及脂质可溶性药物；脂质体可以保护包囊化的iRNA剂在其内部区室内免于受到代谢与降解(罗索夫(Rosoff)，于“药物剂型”(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，卷1，245页)。在制备脂质体制剂方面的重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及这些脂质体的水性体积。
可使用一种带正电荷的合成阳离子脂质，N-[1-(2，3-二油烯基氧基) 丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)以形成小的脂质体，其自发地与核酸相互作用形成脂质-核酸复合物，该复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致递送iRNA剂(参见，例如费尔格纳(Felgner)，P.L.等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl. Acad.Sci.，USA)8：7413-7417，1987和美国专利号4,897,355，关于 DOTMA以及其与DNA一起使用的说明)。
可以将一种DOTMA类似物、1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷 (DOTAP)与磷脂组合使用形成DNA络合囊泡。LipofectinTM(毕士大研究实验室，盖瑟斯堡，马里兰州)，是一种有效试剂，用于递送高度阴离子性核酸到活组织培养细胞中，这些细胞包括带正电荷的DOTMA脂质体，其自发地与带负电荷的多核苷酸相互作用以形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物的净电荷也为正。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地附接至带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并有效地递送功能性核酸到例如组织培养的细胞中。另一种可商购的阳离子脂质体1，2-双(油酰氧基)-3，3-(三甲基氨) 丙烷(“DOTAP”)(宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)，印第安纳波利斯，印第安纳州)不同于DOTMA在于该油酰基部分被酯连接而不是醚连接。
其他报道的阳离子脂质化合物包括已偶联至多个部分的那些，包括例如已偶联至两种类型的脂质中的一种的羧基精胺，并且包括化合物如5-羧基精胺基甘氨酸二辛油酰基酰胺(“DOGS”) (TransfectamTM，普洛麦格(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基-酰胺(“DPPES”)(见例如美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质偶联物包括用胆固醇(“DC-Chol”)对该脂质进行的衍生，其已被配制成脂质体与DOPE的组合(参见高(Gao)， X，和黄(Huang)，L.，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem. Biophys.Res.Commun.)179：280，1991)。脂质聚赖氨酸，通过将聚赖氨酸偶联至DOPE制成，已被报道在血清存在下是有效于转染的 (周(Zhou)，X等人，生物化学和生物物理学报(Biochim.Biophys. Acta)1065：8，1991)。对于某些细胞系，这些含有偶联阳离子脂质的脂质体据说显示出较低的毒性，并比含DOTMA组合物提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(维考(Vical)，拉霍亚(La Jolla)，加利福尼亚州)和Lipofectamine (DOSPA)(生命科技公司(Life Technology，Inc.)，盖瑟斯堡，马里兰州)。适合于寡核苷酸的递送的其他阳离子脂质在WO 98/39359 和WO 96/37194中说明。
脂质体制剂特别适用于局部给药，脂质体比其他制剂呈现若干优势。这些优势包括：减少的与所给予药物的高系统性吸收相关的副作用、在希望的靶标处所给予药物的增加的积累、以及将iRNA剂给予进入皮肤的能力。在一些实施例中，脂质体用于将iRNA剂递送到表皮细胞，并且也用以提高iRNA剂向真皮组织(例如皮肤)的渗入。例如可局部施用这些脂质体。已记录了配制成脂质体的药物向皮肤的局部递送(见例如韦纳(Weiner)等人，药物靶向杂志(Journal of Drug Targeting)，1992，第2卷，405-410和杜普莱西(du Plessis)等人，抗病毒研究(Antiviral Research)，18，1992，259-265；曼尼诺 (Mannino)，RJ和富尔德-弗格里特(Fould-Fogerite)，S.，生物技术(Biotechniques)6：682-690，1988；伊塔尼(Itani)，T.等人，基因 (Gene)56：267-276，1987；尼古劳(Nicolau)，C.等人酶学方法(Meth. Enz)149：157-176，1987；施特劳宾格(Straubinger)，RM和帕帕哈吉欧普洛斯(Papahadjopoulos)，D.酶学方法(Meth.Enz.)101：512-527， 1983；王(Wang)，C.Y.和黄(Huang)，L.，美国国家科学院院刊 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84：7851-7855，1987)。
非离子型脂质体系统也已经得以检验以确定它们在递送药物至皮肤方面的实用性，特别是包括非离子型表面活性剂以及胆固醇的系统。包括Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体制剂用于将一种药物递送入小鼠皮肤的真皮。具有iRNA剂的这样的制剂可用于治疗皮肤病学失调。
包括iRNA的脂质体可被制成高度可变形的。这样的变形可以使脂质体能够通过比该脂质体的平均半径小的孔渗透。例如传递体是一种可变形的脂质体的类型。传递体可以通过将表面边缘活化剂(通常为表面活性剂)添加到一种标准的脂质体组合物中制成。包括iRNA 剂的传递体可以例如通过皮下地感染被递送以将iRNA剂递送到皮肤中的角质形成细胞中。为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在合适的经皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每一孔具有小于50 nm的直径。此外，由于这些脂质特性，这些传递体可以是自优化的 (适应例如皮肤中的孔的形状)、自我修复性的，并且可频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。
服从本发明的其他制剂描述在2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；2008年1月2日提交的61/018,611；2008年 3月26日提交的61/039,748；2008年4月22日提交的61/047,087和 2008年5月8日提交的61/051,528中。2007年10月3日提交的PCT 申请号PCT/US 2007/080331也描述了服从本发明的制剂。
传递体(transfersome)是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集物，它们是用于药物递送媒介物的引人注目的候选者。传递体可以描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体能适应在其中使用它们的环境，例如它们是自优化性的(能适应皮肤中孔的形状)、自我修复性的、频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。为了制备传递体，可能的是将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加至一种标准的脂质体组合物。传递体已经被用于递送血清白蛋白至皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已经显示与包含血清白蛋白的溶液的皮下注射同样有效。
表面活性剂在制剂(例如乳剂(包括微乳剂)以及脂质体)中有广泛应用。对许多不同类型的表面活性剂(天然的与合成的)的特性进行分类与评级的最普通的方法是通过亲水/亲油平衡值(HLB)的使用。亲水基团(也称作“头”)的性质提供了用于对在制剂中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的手段(列赫尔(Rieger)，于药物剂型(“Pharmaceutical Dosage Forms”)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，1988，285页)。
如果该表面活性剂分子没有离子化，它被分类为一种非离子型表面活性剂。发现非离子型表面活性剂在药物与化妆品产品方面有广泛应用并且能够在广泛的pH范围使用。总体上，取决于它们的结构，它们的HLB值范围为从2至大约18。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子型烷醇酰胺以及醚(例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧化物 (例如皂)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯(例如烷基硫酸酯以及乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯以及磺基琥珀酸酯)、以及磷酸酯。该阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯以及皂类。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐以及乙氧基化胺。这些季铵盐是这一类别的最常用的成员。
如果该表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。
已经综述了表面活性物质在药品、制剂和在乳剂中的用途(列赫尔(Rieger)，于药物剂型(“Pharmaceutical Dosage Forms”)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，1988，285页)。
用于在本发明的方法中使用的iRNA也可提供为胶束制剂。“胶束”在此处定义为一种特定类型的分子组件，其中两亲性分子排列在一个球形结构中，使得这些分子的所有疏水部分向内定向，而使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。
适于通过经皮的膜递送的混合胶束制剂可通过混合该siRNA组合物的水溶液、碱金属C8-C22烷基硫酸盐、以及胶束形成化合物来制备。示例性的胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、油酸单甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧胆烷基甘氨酸和其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、及其混合物。胶束形成化合物可以在添加碱金属烷基硫酸盐的同时或之后添加。混合胶束会随着基本上任何种类的这些成分的混合(但剧烈的混合)形成，以提供更小尺寸的胶束。
在一个方法中，制备一种第一胶束组合物，其包含该siRNA组合物以及至少该碱金属烷基硫酸盐。然后将该第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合，以形成混合胶束组合物。在另一种方法中，该胶束组合物是通过将该siRNA组合物、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成的化合物混合，然后添加剩余的胶束形成化合物(剧烈混合下)来制备。
可将苯酚和/或间甲酚添加到该混合胶束组合物中以稳定该制剂并防止细菌生长。可替代地，可随着胶束形成成分一起添加苯酚和/ 或间甲酚。也可以在该混合胶束组合物形成之后加入等渗剂，如甘油。
对于作为喷雾的胶束制剂的递送，该制剂可被装入气溶剂分配器中并将该分配器用推进剂填充。在该分配器中推进剂(其在压力下) 处于液体形式。对各成分的比例进行调整，以便使该水相和推进剂相成为一体，即存在一个相。如果有两个相，有必要在分配这些内容物的部分(例如通过计量阀)之前摇动该分配器。药物试剂的分配量是从计量阀中以细雾推进。
推进剂可以包括含氢氯氟烃、含氢氟烃、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，也可以使用HFA 134a(1，1，1，2四氟乙烷)。
这些必需成分的特定浓度可以通过相对简单的实验来确定。对于经口腔的吸收，通常希望的是增加例如至少两倍或三倍的对于通过经胃肠道注射或给予的剂量。
B.脂质颗粒
本发明的iRNA，例如，dsRNA，可以完全包封在脂质制剂中，例如，LNP，或其他核酸-脂质颗粒中。
如本文中使用的，术语“LNP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。LNP 通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如， PEG-脂质偶联物)。LNP对于全身性施用非常有用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后呈现出延长的循环寿命并且在远端部位(例如，物理上与施用部位分开的位点)累积。LNP包括“pSPLP”，其包括如PCT公开No.WO 00/03683中所列的包封的缩合剂-核酸复合物。本发明的颗粒典型地具有大约50nm至大约150nm，更典型地是大约60nm至大约130nm，更典型地是大约70nm至大约110nm，最典型地是大约70nm至大约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。另外，当出现在本发明的核酸-脂质颗粒中时，这些核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒以及它们的制备方法披露于例如美国专利号5,976,567、5,981,501、6,534,484、6,586,410、6,815,432，美国公开号2010/0324120以及PCT公开号WO 96/40964中。
在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如脂质与dsRNA的比率)将处于从大约1∶1至大约50∶1，从大约1∶1 至大约25∶1，从大约3∶1至大约15∶1，从大约4∶1至大约10∶1，从大约5∶1至大约9∶1，或大约6∶1至大约9∶1的范围内。以上引用的范围的范围中间值也意在成为本发明的部分。
阳离子脂质可以是例如N，N-二油烯基-N，N-二甲基氯化铵 (DODAC)、N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2，3- 二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3- 二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、1，2-二亚油基氧基(DiLinoleyloxy) -N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚麻基氧基(Dilinolenyloxy) -N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1，2-二亚油基氨基甲酰氧基-3- 二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基) 乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷 (DLin-MA)、1，2-二亚油基酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、 1，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油基酰基 -2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油基酰基-3- 三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N，N-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇 (DLinAP)、3-(N，N-二油烯基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油基氧代-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1，2- 二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2，2-二亚油基-4- 二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、 (3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八-9，12-二烯)四氢-3aH- 环戊[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6，9，28，31-四-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、 1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基月桂基)氨基)乙基)(2-羟基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(Tech Gl)，或其混合物。该阳离子脂质可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约20mol％至大约50mol％或大约40mol％。
在另一个实施例中，化合物2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基 -[1，3]-二氧戊环可以用来制备脂质-siRNA纳米颗粒。2，2-二亚油基-4- 二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，将其通过引用结合于此。
在一个实施例中，该脂质-siRNA颗粒包括40％2，2-二亚油基-4- 二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环：10％DSPC：40％胆固醇：10％ PEG-C-DOMG(摩尔百分数)，颗粒尺寸在63.0±20nm，并且具有 0.027siRNA/脂质比率。
该可电离的/非阳离子脂质可以是一种阴离子脂质或一种中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺 (DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、 1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇，或其混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约5mol％至大约90mol％，大约10mol％，或大约58mol％。
抑制颗粒聚集的偶联脂质可以是例如一种聚乙二醇(PEG)-脂质，其包括但不限于PEG-二酰甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、 PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)，或其混合物。PEG-DAA偶联物可以是，例如PEG-二月桂基氧丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧丙基 (Ci4)、PEG-二棕榈基氧丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧丙基(C]8)。防止颗粒聚集的偶联脂质可以占从0mol％至约20mol％或约2mol％在颗粒中存在的总脂质。
在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，该胆固醇例如占该颗粒中存在的总脂质的大约10mol％到大约60mol％或大约48mol％。
在一个实施例中，利匹哆异德(lipidoid)ND98.4HCl(MW 1487) (见2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，通过引用结合在此)、胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和 PEG-神经酰胺C16(阿文蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))可以用来制备脂质-dsRNA纳米颗粒(即，LNP01颗粒)。可以如下制备每种组分在乙醇中的母液：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml， PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16 母液可以随后以例如42∶48∶10摩尔比合并。合并的脂质溶液可以与 (例如pH5乙酸钠中的)含水dsRNA混合，从而乙醇终浓度是约 35％-45％并且乙酸钠终浓度是约100-300mM。一旦混合，脂质-dsRNA 纳米颗粒一般自发形成。取决于所需的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，如Lipex挤出机(北部脂质公司(Northern Lipids，Inc))，经聚碳酸酯膜(例如100nm截值)挤出所产生的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切线流过滤实现乙醇移除和同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如约pH 7，例如约 pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3或约pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)交换。
Figure BDA0001214965370001291
LNP01制剂描述于例如国际申请公开No.WO 2008/042973中，将其按引用并入本文中。
其他示例性脂质-dsRNA制剂描述于表1中。
表1
Figure BDA0001214965370001292
Figure BDA0001214965370001301
Figure BDA0001214965370001311
Figure BDA0001214965370001321
DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-双二肉豆蔻酰甘油(C14-PEG，或PEG-C14) (平均分子量为2000的PEG)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG，或PEG-C18)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-cDMA：PEG-氨甲酰基-1，2-二肉豆蔻基氧丙胺(平均分子量为2000的PEG)
包含SNALP(1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷 (DLinDMA))的制剂描述于2009年4与15日提交的国际公开号 WO 2009/127060中，通过引用将其结合于此。
包括XTC的制剂描述于例如以下各项中：2009年1月29日提交的美国临时序列号61/148,366；2009年3月2日提交的美国临时序列号61/156,851；2009年6月10日提交的美国临时序列号；2009年7 月24日提交的美国临时序列号61/228,373；2009年9月3日提交的美国临时序列号61/239,686，以及2010年1月29日提交的国际申请号PCT/US 2010/022614，将其通过引用特此结合。
包括MC3的制剂描述于，例如2010年6月10日提交的美国公开号2010/0324120，其全部内容通过引用结合在此。
包括ALNY-100的制剂描述于例如以下中：例如，2009年11月 10日提交的国际专利申请号PCT/US 09/63933，将其通过引用特此结合。
包括C12-200的制剂描述于例如以下各项中：2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770以及2010年5月5日提交的国际申请号PCT/US 10/33777，将其通过引用特此结合。
可电离/阳离子脂质的合成
在本发明的核酸-脂质颗粒中使用的任何化合物，例如阳离子脂质等可以通过已知的有机合成技术(包括在实例中更详细描述的方法)制备。除非另外指明，否则全部取代基如下文定义。
“烷基”意味着一种直链或支链的、非环的或环的饱和脂肪族烃，包含从1至24个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、等；而不饱和环状烷基包括环丙烯基和环己烯基等。
“烯基”意味着如上定义的一种烷基，该烷基在相邻碳原子之间包含至少一个双键。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”意味着如上定义的任何烷烃或烯基，其另外包含在相邻碳之间的至少一个三键。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、 1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酰基”是指任何烷基，烯基或炔基，其中，在连接点的碳被氧代基团取代，如下所定义。例如-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基是酰基。
“杂环”意味着一个5-至7-元单环、或7-至10-元二环的杂环，它是饱和的、不饱和的或芳香族的，并且它包含独立地选自氮、氧、和硫的从1或2个杂原子，并且其中该氮和硫杂原子可以是任选地氧化的，并且该氮杂原子可以任选地是季铵化的，包括双环，其中上述杂环的任一个被稠合至一个苯环。杂环可以经任何杂原子或碳原子连接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酸胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
术语“任选取代的烷基”，“任选取代的烯基”，“任选取代的炔基”，“任选取代的酰基”和“任选被取代的杂环””是指，当取代时，至少一个氢原子被一个取代基置换。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个氢原子被置换。在这方面，取代基包括氧、卤素、杂环、 -CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、 -C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0、1 或2，Rx和Ry是相同或不同的并且独立地是氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基的每一个可以进一步由以下取代基的一种或多种取代：氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、 -NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、 -SOnRx和-SOnNRxRy。
“卤素”是指氟、氯、溴、以及碘。
在一些实施例中，本发明的方法可能需要使用保护基。保护基方法学是本领域技术人员熟知的(见例如有机合成中的保护基团 (Protective Groups in OrganicSynthesis)，格林(Greene)，T.W.等人，威利国际科学出版社(Wiley-Interscience)，纽约市，1999)。简言之，本发明上下文中的保护基是降低或消除不希望的官能团反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团以掩蔽其在某些反应过程中的反应性并且随后将其移除以暴露原始官能团。在一些实施例中，使用“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除不希望的醇官能团反应性的任何基团。保护基团可以使用本领域中公知的技术添加和去除。
式A的合成
在一些实施方案中，使用式A的阳离子脂质配制本发明的核酸- 脂质颗粒：
Figure BDA0001214965370001351
其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以一起形成任选取代的杂环。在一些实施例中，阳离子脂质是XTC(2，2-二亚油基 -4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环)。通常，可以通过以下反应方案 1或2产生以上式A的脂质，其中除非另外指明，否则全部取代基如上文定义。
方案1
Figure BDA0001214965370001352
根据方案1制备脂质A，其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3 和R4可以一起形成任选取代的杂环。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备酮1和溴化物2。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式A的脂质。式A的脂质可以用式5的有机盐转化成相应的铵盐，其中X是选自卤素、氢氧化物、磷酸根、硫酸根等的阴离子反离子。
方案2
Figure BDA0001214965370001361
可替代地，可以根据方案2制备酮1原料。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备格氏(Grignard)试剂6和氰化物7。 6和7的反应产生酮1。如方案1中所述，酮1转化成式A的相应脂质。
MC3的合成
如下制备DLin-M-C3-DMA(即，(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳 -6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6Z，9Z，28Z，31Z)- 三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-醇(0.53g)，4-N，N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N，N-二甲氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将该溶液用稀盐酸洗涤，随后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机部分在无水硫酸镁上干燥，过滤并且在旋转蒸发器上移除溶剂。使用1％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度，使残余物通过硅胶柱 (20g)。合并含有纯化产物的级分并且移除溶剂，产生无色油(0.54 g)。
ALNY-100的合成
使用以下方案3进行缩酮519[ALNY-100]的合成：
Figure BDA0001214965370001371
515的合成
在0℃在氮气氛下向双颈RBF(1L)中LiAlH4(3.74g，0.09852 mol)在200ml无水THF中的搅拌悬浮液缓慢添加514(10g，0.04926 mol)在70mLTHF中的溶液。在完成添加后，将反应混合物加温至室温并且随后加热至回流持续4小时。通过TLC监测反应的进程。在完成反应(借助TLC检测)后，将混合物冷却至0℃并且通过小心添加饱和Na2SO4溶液淬灭。将反应混合物在室温搅拌4小时并滤出。将残余物用THF充分洗涤。将滤液和洗涤液混合并用400mL二噁烷和26mL浓HCl稀释并且在室温搅拌20分钟。在真空下剥离挥发物以提供作为白色固体的盐酸盐515。产量：7.12g 1H-NMR(DMSO， 400MHz)：δ＝9.34(宽，2H)，5.68(s，2H)，3.74(m，1H)，2.66-2.60(m， 2H)，2.50-2.45(m，5H)。
516的合成
向250mL双颈RBF中化合物515在100mL无水DCM中的搅拌悬液添加NEt3(37.2mL，0.2669mol)并在氮气氛下冷却至0℃。在缓慢添加50mL无水DCM中的N-(苄氧羰氧基)-琥珀酰亚胺(20g， 0.08007mol)后，允许反应混合物加温到室温。在反应结束(通过 TLC检测2-3小时)后，将混合物用1N HCl溶液(1x 100mL)和饱和NaHCO3溶液(1x 50mL)依次洗涤。随后在无水Na2SO4上干燥有机层并且蒸发溶剂以产生粗制材料，所述粗制材料通过硅胶柱层析纯化以获得粘性物质516。产量：11g(89％)。1H-NMR(CDCl3， 400MHz)：δ＝7.36-7.27(m，5H)，5.69(s，2H)，5.12(s，2H)，4.96(br.，1H) 2.74(s，3H)，2.60(m，2H)，2.30-2.25(m，2H)。LC-MS[M+H]-232.3 (96.94％)。
517A和517B的合成
将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于单颈500mLRBF中的 220mL丙酮和水(10∶1)的溶液内，并且在室温向其中添加N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，随后添加叔-丁醇中的4.2mL 7.6％OsO4溶液(0.275g，0.00108mol)。在反应结束(约3小时) 后，将混合物通过添加固体Na2SO3淬灭并且将所产生的混合物在室温搅拌1.5小时。将反应混合物用DCM(300mL)稀释并且用水(2 x 100mL)洗涤，随后用饱和NaHCO3(1x 50mL)溶液、水(1x 30mL)并最终用盐水(1x 50mL)洗涤。在无水Na2SO4上干燥有机相并且在真空中移除溶剂。粗制材料的硅胶柱层析纯化提供了非对映异构体的混合物，所述非对映异构体由制备级HPLC分离。产量：-6 g粗制物
517A-峰-1(白色固体)，5.13g(96％)。1H-NMR(DMSO， 400MHz)：δ＝7.39-7.31(m，5H)，5.04(s，2H)，4.78-4.73(m，1H)， 4.48-4.47(d，2H)，3.94-3.93(m，2H)，2.71(s，3H)，1.72-1.67(m，4H)。LC-MS-[M+H]-266.3，[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86％。通过 X射线证实立体化学。
518的合成
使用与被描述用于合成化合物505的方法类似的方法，获得作为无色油的化合物518(1.2g，41％)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝ 7.35-7.33(m，4H)，7.30-7.27(m，1H)，5.37-5.27(m，8H)，5.12(s，2H)， 4.75(m，1H)，4.58-4.57(m，2H)，2.78-2.74(m，7H)，2.06-2.00(m，8H)， 1.96-1.91(m，2H)，1.62(m，4H)，1.48(m，2H)，1.37-1.25(br m，36H)， 0.87(m，6H).HPLC-98.65％。
用于化合物519合成的一般程序
将化合物518(1eq)在己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加至LAH在THF(1M，2当量)中的冰冷溶液中。在完成添加后，将混合物在40℃加热0.5小时，随后在冰浴上再次冷却。将混合物用饱和Na2SO4水溶液小心地水解，随后经塞里滤料(celite)过滤并缩减成油。柱层析提供作为无色油获得的纯519(1.3g，68％)。13C NMR δ＝130.2，130.1(x2)，127.9(x3)，112.3，79.3，64.4，44.7，38.3，35.4，31.5， 29.9(x2)，29.7，29.6(x2)，29.5(x3)，29.3(x2)，27.2(x3)，25.6，24.5，23.3， 226，14.1；电喷雾MS(+ve)：C44H80NO2(M+H)+的分子量计算值为 654.6，发现值为654.6。
通过标准或非挤出方法制备的制剂可以按类似的方式来表征。例如制剂典型地通过视觉检查来进行表征。它们应该是发白的半透明溶液，无聚集物或沉淀。脂质纳米颗粒的颗粒尺寸与颗粒尺寸分布可以使用例如马尔文(Malvern)Zetasizer Nano ZS(马尔文公司(Malvern)， USA)通过光散射来进行测量。颗粒应该是大约20-300nm，例如 40-100nm尺寸。颗粒尺寸分布应该是单峰。制剂中的总dsRNA浓度以及捕获的片段是使用染料排除测定来评估。配制的dsRNA的样品可以与RNA结合染料如Ribogreen(分子探针公司(MolecularProbes)) 在制剂破坏性表面活性物质(例如0.5％Triton-X100)存在或不存在下孵育。制剂中的总dsRNA可以相对于标准曲线，通过来自含有表面活性物质的样品的信号来确定。该捕获的片段是通过将“游离” dsRNA内含物(如通过在表面活性剂不存在下的信号所测量的)从该总dsRNA内含物中减去来确定。封装的dsRNA的百分比一般大于 85％。对于SNALP制剂而言，颗粒尺寸是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。合适的范围典型地是大约至少50nm至大约至少110nm、大约至少60nm至大约至少100 nm、或大约至少80nm至大约至少90nm。
用于口服给予的组合物与制剂包括粉末或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是希望的。在一些实施例中，口服制剂是以下那些：在其中本发明所表征的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂以及螯合剂结合地给予。合适的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。合适的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)以及乌索脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘油胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24，25-二氢-梭链孢酸钠以及甘油二氢梭链孢酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、一种酰基肉毒碱、一种酰基胆碱、或一种甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。在一些实施例中，渗透增强剂的组合(例如脂肪酸/盐)是与胆汁酸/盐组合使用。一个示例性的组合是月桂酸、羊蜡酸以及UDCA的钠盐。另外的渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基酯、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明表征的dsRNA可以口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的颗粒剂的形式递送，或者复合成微颗粒或纳米颗粒。dsRNA复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生化聚亚胺、短梗霉多糖纤维素和淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如p-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-异丁烯酸酯、 DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白与DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚(DL-乳酸- 共-乙醇酸(PLGA)、藻朊酸盐、以及聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制剂及其制备在美国专利6,887,906、美国公开号20030027780 和美国专利号6,747,014中详述，各自通过引用结合在此。
用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内给药的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于：渗透增强剂、载体化合物及其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体制剂。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症(例如肝癌)时靶向肝脏的制剂。
本发明的药物制剂(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些制剂是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。
本发明的组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。本发明的组合物还可以被配制为在水性、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
C.其他制剂
i.乳剂
可以将本发明的组合物制备和配制为乳剂。乳剂典型地是一种液体以液滴形式(通常直径超过0.1μm)分散在另一种中的非均匀系统 (参见安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker) (编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；布洛克(Block)于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker) (编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷2，335页；希古契(Higuchi)等人，于雷明顿氏药物科学(Remington＇s Pharmaceutical Sciences)，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，Pa.，1985，301页)。乳剂通常是双相的系统，其包含互不混溶的两个彼此紧密混合并分散的液相。通常，乳剂可以为油包水(w/o)或水包油(o/w)两种。当水相作为微小液滴细碎并分散到本体油相中时，所产生的组合物被称为油包水 (w/o)乳剂。可替代地，当油相作为微小液滴细碎并分散到本体水相中时，所产生的组合物被称为水包油(o/w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以含其他组分，活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为独立相。如果需要，也可以存在药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以为包括多于两种相的多重乳剂，例如像油包水包油(o/w/o)和水包油包水 (w/o/w)乳剂的情况。此类复合制剂通常提供某些简单的二元乳剂所不具有的优势。当多重乳剂中的o/w乳剂的各油滴还包有小水滴时，该多重乳剂形成w/o/w乳剂。同样地，在油连续相中稳定化的水滴中封装油滴的系统，构成o/w/o乳剂。
乳剂具有较小或没有热力学稳定性的特征。通常，乳剂的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或制剂的粘性保持这种形式。在乳剂状软膏基料或膏剂的情况下，乳剂的每个相都可以为半固体或固体。其他稳定乳剂的方式需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并进入到乳剂的任意相中。乳化剂可以大致分成4类：合成性表面活性物质、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
合成性表面活性物质，也称作表面活性剂，已经广泛应用于乳剂的制备并且已经在文献中综述(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；列赫尔(Rieger)，于药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，285页；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，1988，卷1，199页)。表面活性剂典型地是两亲性分子，并且包括亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水和疏水性的比值定义为亲水/亲油平衡值(HLB)，它是制剂制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性物质可以基于亲水基团的性质：非离子、阴离子、阳离子和两亲分成不同类别(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇 (Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约， NY；列赫尔(Rieger)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)， 1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1， 285页)。
乳剂制剂中使用的自然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯树胶。吸收基料具有亲水特性，所以它们能够吸收水以形成w/o乳剂并仍然保持它们的半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水凡士林。精细分散的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性制剂中使用。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、非溶胀粘土如膨润土、凹凸棒土、锂蒙脱石，高岭土、蒙脱土、胶态硅酸铝和胶态镁硅酸铝、颜料和非极性固体如碳或甘油基三硬脂酸酯。
在乳剂制剂中还包括多种非乳化材料，它们对乳剂的特性有帮助。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(布洛克(Block)于药物剂型 (Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger) 与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker， Inc.)，纽约，纽约州，卷2，335页；爱德森(Idson)，于药物剂型 (Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger) 与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
亲水胶体或水状胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物如多糖(如阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳胶、刺梧桐树胶和皇蓍胶)，纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(如卡波姆胶、纤维素醚和羰基乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或膨胀形成胶状溶液，这些胶状溶液通过在分散相小滴的周围形成强的界面膜并通过增强外相的粘度来稳定乳剂。
由于乳剂通常包含一些可以容易地支持微生物生长的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些制剂通常含有防腐剂。乳剂制剂中通常使用的防腐剂包括甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧剂加入到乳剂制剂中，以预防制剂的变质。所用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚，没食子酸烷基酯、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，或还原剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，和抗氧化剂增效剂如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
通过皮肤途径、口途径和肠胃途径途径使用乳状液制剂和制造它们的方法已经在文献中综述(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。口服递送的乳状液制剂已经非常广泛地使用，原因在于易于配制以及从吸收和生物利用率的观点看有效(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。基于矿物油的缓泻药、油溶性的维生素和高脂肪营养制剂属于经常作为o/w 乳剂口服给予的物质。
ii.微乳剂
在本发明的一个实施例中，将iRNA和核酸的组合物配制为微乳液。可以将微乳液定义为水、油和两亲分子的体系，所述体系是光学各向同性和热动力学稳定的单一液态溶液(见例如安赛尔(Ansel) 的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯 (Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；洛索夫 (Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245 页)。典型地，微乳剂是通过如下方法制备的系统：首先将油分散到表面活性剂水溶液中，然后加入足量的通常为中等链长度的醇的第四组分而形成透明系统。因此，微乳剂也被描述成由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不能混合的液体的热力学稳定的各向同性的澄清分散系(朗(Leung)与纱(Shah)，在：药物的受控释放：聚合物和聚集体系统(Controlled Release of Drugs：Polymers and AggregateSystems)，洛索夫(Rosoff)，M.编著，1989，VCH出版公司，纽约，第185-215页)。通常微乳剂通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解液的三至五种组分的组合来制备。微乳剂是为油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子的极性头部和羟基尾的结构和几何包装(斯科特(Schott)，于雷明顿氏药物科学(Remington＇s Pharmaceutical Sciences)，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)， Pa.，1985，第271页)。
已经广泛研究了利用相图的现象学方法并且对本领域技术人员，该方法已经产生怎样配制微乳液的广泛知识(见例如安赛尔(Ansel) 的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；洛索夫 (Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼 (Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245 页；布洛克(Block)于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)， 1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1， 335页)。与常规乳剂相比，微乳剂提供的优点是能将非水溶性药物溶解到自发形成的热力学稳定的液滴的制剂中。
在微乳剂的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独的或与助表面活性剂组合使用的离子表面活性剂、非离子表面活性剂、 Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、单月桂酸四甘油酯 (ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、一又二分之一油酸十甘油酯(SO750) (decaglycerol sequioleate)、十油酸十甘油酯(DAO750)。该助表面活性剂通常是短链醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通过渗透到表面活性剂膜中并由此在表面活性剂分子间产生空余空间来产生无序膜从而提高界面流动性。然而，微乳剂可以不用助表面活性剂进行制备，并且无醇的自乳化微乳剂系统是本领域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、药物的水溶液、甘油、PEG 300、PEG 400、聚甘油、丙二醇、和乙乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如多种材料，例如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯，中等链(C8-C12)的单、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolized glyceride)，饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解和增强的药物吸收方面看，微乳剂是特别令人感兴趣的。已经提出基于脂质的微乳液(o/w和w/o)以增强药物(包括肽) 的口服生物利用率(见例如美国专利号6,191,105；7,063,860； 7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人，药学研究(Pharmaceutical Research)，1994，11，1385-1390；里切尔 (Ritschel)，实验与临床药理学的方法与发现(Meth.Find.Exp.Clin. Pharmacol.)，1993，13，205)。微乳液提供以下优点：改善药物溶解、保护药物免遭酶水解、可能因表面活性物质引起的膜流动性和通透性改变而增强药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服施用、临床效力改善和毒性减少(见例如美国专利号6,191,105；7,063,860； 7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人，药学研究(Pharmaceutical Research)，1994，11，1385；霍(Ho)等人，药学科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1996，85，138-143)。通常，微乳剂的成份在环境温度下混合在一起时，它们可以自然形成微乳剂。在配制热不稳定药物、肽或iRNA时，这可以是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，微乳剂在活性组分的经皮递送中也是有效的。预期本发明的微乳液组合物和制剂将促进iRNA和核酸从胃肠道的全身性吸收增加以及改善iRNA和核酸的局部细胞摄取。
本发明的微乳液也可以含有额外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol、和改善制剂特性并增强本发明iRNA 和核酸吸收的渗透增强剂。本发明的微乳剂中使用的渗透增强剂可以分成归于五大类中的一种：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评 (CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92 页)。每个类型都已经在以上进行了讨论。
iii.微粒
本发明的iRNA剂可并入到一个颗粒，例如一个微颗粒。微颗粒可通过喷雾干燥来制备，但也可以通过其他方法，包括冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合来制备。
iv.渗透增强剂
在一个实施例中，本发明采用各种渗透增强剂来实现向动物皮肤高效递送核酸，尤其是iRNA。大多数药物以离子化和非离子化的形式两者存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或亲脂的药物易于穿过细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理要穿过的膜，甚至连非亲脂药物都可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜外，渗透增强剂还增强亲脂药物的渗透性。
可以将渗透增强剂划分为属于5大类之一，即，表面活性物质、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂(见例如马尔姆斯滕 (Malmsten)，M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(InformaHealth Care)，纽约，NY，2002；李(Lee)等人，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)。在下面对每类以上提及的渗透增强剂都详细进行了阐述。
表面活性剂(或“表面活性试剂”)为化学实体，当其溶解在水溶液中时，它能减少该溶液的表面张力或者水溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是iRNA通过粘膜的吸收得到增强。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些渗透增强剂还包括例如月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9- 月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚(参见如马尔姆斯滕(Malmsten)， M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，NY， 2002；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)；以及全氟化学乳剂如FC-43(高桥(Takahashi)等人，J.Pharm.Pharmacol.(药物药理学杂志)，1988，40，252)。
充当渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物例如包括油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如、甲基酯、异丙基酯和叔丁基酯)及其单和二甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(见例如托乌托 (Touitou)，E.等人，药物递送的增强(Enhancement in Drug Delivery)， CRC出版社，丹弗斯(Danvers)，MA，2006；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页；马尔姆斯滕(Malmsten)，M.治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems)。1990，7，1-33；El哈里里(Hariri)等人。药物药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)。1992，44，651-654)。
胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂肪维生素的分散和吸收(见例如马尔姆斯滕(Malmsten)，M.药物递送中的表面活性剂和聚合物 (Surfactants and polymers in drugdelivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，NY，2002；布鲁顿(Brunton)，第38章，引自：古德曼&吉尔曼(Goodman&Gilman)的治疗学的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)，第9版，哈德曼(Hardman) 等人编著，麦格劳希尔(McGraw-Hill)，纽约，1991，第934-935 页)。各种天然胆汁盐和它们的合成衍生物作为渗透增强剂起作用。因此术语“胆汁盐”包括胆汁中天然存在的任意成分和它们的任意合成衍生物。适合的胆盐包括，例如胆酸(或其药学上可接受的的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24，25-二氢夫西地酸钠(STDHF)、二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯 -9-月桂基醚(POE)(见例如马尔姆斯滕(Malmsten)，M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，NY，2002；李(Lee) 等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页；斯温亚德(Swinyard)，第39 章，引自：雷明顿氏药物科学(Remington＇s PharmaceuticalSciences)，第18版，真纳罗(Gennaro)编著，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，Pa.，1990，第782-783页；马尔姆斯滕(Malmsten)， M.治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1990，7，1-33；山本(Yamamoto)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1992，263，25；山下(Yamashita)等人，药学科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1990，79，579-583)。
与本发明有关使用的的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的 iRNA的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为渗透增强剂的应用，因为大多数特征化的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当DNase抑制剂的附加优势(加热特(Jarrett)，J.Chromatogr.(层析学杂志)，1993，618，315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(如水杨酸钠、5-甲氧水杨酸酯和高香草酸酯(homovanilate))、胶原质的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如凯特戴尔，A.等人，用于制药、生物技术和药物递送的赋形剂的发展(Excipient development for pharmaceutical，biotechnology，and drug delivery)，CRC出版社，丹弗斯(Danvers)，MA，2006；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页；村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems)，1990，7，1-33；布尔(Buur)等人，控制释放杂志(J.Control Rel.)，1990，14，43-51)。
如本文所用，非螯合性非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或作为表面活性剂展示不明显活性但是反而增强iRNA经消化道粘膜吸收的化合物(见例如村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems)， 1990，7，1-33)。这种类别的渗透增强剂包括例如不饱和环状脲、1- 烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)， 1991，第92页)；和非甾体抗炎药如双氯芬酸钠、吲哚美辛和保泰松(山本(Yamashita)等人，药物药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)， 1987，39，621-626)。
在细胞水平增强iRNA摄取的试剂也可以加入本发明的药物和其他组合物中。例如，阳离子脂质，如lipofectin(Junichi等，美国专利 No.5,705,188)，阳离子甘油衍生物和多聚阳离子分子，如聚赖氨酸 (Lollo等，PCT申请WO 97/30731)，也已知增强dsRNA的细胞摄取。商业上可得的转染试剂的实例尤其包括例如LipofectamineTM (InvitrogenTM；Carlsbad，CA)，Lipofectamine 2000TM(InVitrogenTM； Carlsbad，CA)，293fectinTM(InVitrogenTM；Carlsbad，CA)，CellfectinTM (InvitrogenTM；Carlsbad，CA)，DMRIE-CTM(InvitrogenTM；Carlsbad，CA)， FreeStyleTM MAX(InVitrogenTM；Carlsbad，CA)，LipofectamineTM 2000 CD(InvitrogenTM；Carlsbad，CA)，LipofectamineTM(InvitrogenTM；Carlsbad，CA)，iRNAMAX(InvitrogenTM；Carlsbad，CA)， OligofectamineTM(InVitrogenTM；Carlsbad，CA)，OptifectTM (InvitrogenTM；Carlsbad，CA)，X-tremeGENE Q2转染试剂(Roche； Grenzacherstrasse，Switzerland)，DOTAP脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse，Switzerland)，DOSPER脂质体转染试剂 (Grenzacherstrasse，Switzerland)或Fugene(Grenzacherstrasse，Switzerland)，
Figure BDA0001214965370001531
试剂(
Figure BDA0001214965370001532
Madison，WI)，TransFastTM转染试剂(
Figure BDA0001214965370001533
Madison，WI)，TfxTM-20试剂(
Figure BDA0001214965370001534
Madison，WI)，TfxTM-50试剂(
Figure BDA0001214965370001535
Madison，WI)，DreamFectTM(OZ Biosciences；Marseille，France)，EcoTransfect(OZ Biosciences； Marseille，France)，TransPassa D 1转染试剂(New England BiolabsTM； Ipswich，MA，USA)，LyoVecTM/LipoGenTM(InvitrogenTM；San Diego， CA，USA)，PerFectin转染试剂(GenlantisTM；SanDiego，CA，USA)，
Figure BDA0001214965370001536
转染试剂(GenlantisTM；San Diego，CA，USA)，
Figure BDA0001214965370001537
转染试剂(GenlantisTM；San Diego，CA，USA)，
Figure BDA0001214965370001538
2转染试剂(GenlantisTM；San Diego，CA，USA)，Cytofectin转染试剂(GenlantisTMTM；SanDiego，CA，USA)，
Figure BDA0001214965370001539
转染试剂(GenlantisTM；San Diego，CA，USA)，TroganPORTERTM转染试剂(GenlantisTM；San Diego，CA，USA)， RiboFect(BiolineTM；Taunton，MA，USA)，PlasFect(BiolineTM；Taunton， MA，USA)，UniFECTOR(B-BridgeInternationalTM；Mountain View，CA， USA)，SureFECTOR(B-Bridge InternationalTM；Mountain View，CA， USA)或HiFectTM(B-Bridge InternationalTM，Mountain View，CA，USA)。
其他试剂可以用于增强施用的核酸的渗透，包含二醇类，如乙二醇和丙二醇，吡咯类，如2-吡咯，氮酮类和萜烯类，如柠檬烯和薄荷酮。
v.载体
本发明的某些组合物还向制剂中并入了载体化合物。如本文中使用的，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但却在体内过程中被认为是核酸，例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而减少具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共施用(一般后一种物质过量)可以导致肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度缩减，假定归因于该载体化合物和该核酸之间对共同受体的竞争。例如与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4＇异硫氰酸茋-2，2＇-二磺酸共施用时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsRNA的回收可以减少(宫尾(Miyao)等人，DsRNA研究与研发(DsRNA Res. Dev.)，1995，5，115-121；高仓(Takakura)等人，DsRNA&核酸药物研发(DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.)，1996，6，177-183)。
vi.赋形剂
与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他任意药学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，并且当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于、粘合剂(例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填料(例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；和润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。
适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的制剂可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包括缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本发明的组合物另外可以包括其他本领域熟知用量的在药物组合物中常用的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包括另外的、可相容的药学上有活性的物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包括对本发明的组合物的各种剂型的物理配制有用的其他物质，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的成份的生物活性。可以将这些制剂进行灭菌并且如果希望的话与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐混合，用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该制剂中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。
水性悬浮液可以包括增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
在一些实施例中，本发明中表征的药物组合物包含(a)一种或多种 iRNA化合物和(b)通过非iRNA机制发挥作用，并且对于治疗溶血性疾病有用的一种或多种药剂。这些药剂的实例包括，但不限于抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒和/或抗纤维化剂。此外，其他常用于保护肝脏的药物，如水飞蓟素，也可以与在此描述的iRNA结合使用。其他有用于治疗肝脏疾病的药剂包括替比夫定，恩替卡韦和蛋白酶抑制剂，如特拉匹韦和例如在董(Tung)等人，美国专利申请公开号 2005/0148548、2004/0167116、和2003/0144217；以及在黑尔(Hale) 等人，美国专利申请公开号2004/0127488中披露的其他药剂。
此类化合物的毒性与治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率LD50/ED50。优选那些表现出高的治疗指数的化合物。
获得自细胞培养测定与动物研究的数据可以在配制一系列的用于在人类中使用的剂量方面使用。在本发明中表征的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的 ED50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给予途径而在该范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，该治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。可以在动物模型中配制一种剂量以实现包括化合物或(当适宜时)靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如实现所述多肽浓度减少)，其中所述血浆浓度包括如在细胞培养物中所测定的IC50(即，试验化合物的实现症状的半数最大抑制的浓度)。这种信息可以用于更准确地确定人类中有用的剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相层析。
除了给予它们之外，如在此所讨论的，还可以将在本发明中表征的iRNA与在治疗由AGT表达介导的病理学过程方面有效的其他已知试剂联合给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或本文所述的标准功效量值所观察到的结果，施用医师可以调整施用iRNA的量和时间。
VII.本发明的方法
本发明提供了治疗和预防方法，其包括将包含iRNA剂的药物组合物或包含本发明的iRNA的载体施用于患有或倾向于产生AGT相关疾病、失调和/或病症(例如，高血压)的受试者。
在一个方面中，本发明提供了治疗患有将得益于AGT表达降低的失调的受试者的方法，所述失调例如为AGT-相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压))、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠情况中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知功能障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。本发明的治疗方法(和用途)包括将治疗有效量的靶向AGT基因的iRNA剂或包含靶向AGT基因的iRNA剂的药物组合物施用于受试者，例如，人，由此治疗患有将得益于AGT表达降低的失调的受试者。
在一个方面中，本发明提供了预防患有将得益于AGT表达降低的失调的受试者中的至少一个症状的方法，所述失调例如为AGT-相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压)、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病 (包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。所述方法包括将治疗有效量的本发明的iRNA剂(例如，dsRNA)或载体施用于受试者，由此预防患有将得益于AGT表达降低的失调的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面中，本发明提供了治疗有效量的本发明的iRNA剂用于治疗受试者的用途，例如，将得益于AGT表达降低和/或抑制的受试者。
在进一步的方面中，本发明提供了靶向AGT基因的本发明iRNA 剂(例如，dsRNA)或包含靶向AGT基因的iRNA剂的药物组合物在制造用于治疗受试者的药物中的用途，例如，将得益于AGT表达降低和/或抑制的受试者，如患有将得益于AGT表达降低的失调的受试者，所述失调例如为AGT相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压)、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的iRNA(例如，dsRNA) 用于预防患有将得益于AGT表达降低和/或抑制的失调的受试者中的至少一种症状的用途，所述失调例如为AGT-相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压))、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。
在进一步的方面中，本发明提供了本发明的iRNA剂在制造用于预防患有将得益于AGT表达降低和/或抑制的失调的受试者中的至少一种症状的药物中的用途，所述失调例如为AGT-相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压)、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。
在一个实施方案中，将靶向AGT的iRNA剂施用于患有AGT相关疾病的受试者，使得将dsRNA剂施用于受试者时，例如细胞、组织、血液或受试者的其他组织或流体中的AGT水平降低至少约10％， 11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％， 35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％， 47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％， 59％，60％，61％，62％，62％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％， 71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％， 95％，96％，97％，98％或至少约99％或更高。在优选实施方案中，AGT 水平降低至少20％。
本发明的方法和用途包括施用本文中所述的组合物，使得靶AGT 基因的表达降低例如持续约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、 24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76或约 80小时。在一个实施方案中，靶AGT基因的表达降低延长的持续时间，例如，至少约两、三、四、五、六、七天或更长时间，例如，约一周、两周、三周或约四周或更长时间。
根据本发明的方法和用途的dsRNA的施用可以导致AGT相关疾病患者中的此类疾病或失调的严重性、体征、症状和/或标志物的降低。这个情况中的“降低”表示这种水平的统计学显著的降低。降低可以是，例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。在优选实施方案中，AGT水平降低至少20％。
可以评价疾病治疗或预防的功效，例如，通过测量疾病进展、疾病缓和、症状严重性、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果需要的药物剂量、疾病标志物的水平或适合于待治疗的给定疾病或针对预防合适的任何其他可测量的参数。通过测量这些参数中的任何一个或任意的参数组合来监控治疗或预防功效在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以通过周期性地监控血压来评价血脂异常性高血压的治疗功效。之后读数与初始读数的比较对医生提供了治疗是否有效的指示。通过测量这些参数中的任何一个或任意的参数组合来监控治疗或预防功效在本领域技术人员的能力范围内。结合靶向AGT的iRNA或其药物组合物的施用，“有效对抗”AGT相关疾病表示以临床上合适方式的施用对于至少统计学显著部分的患者导致有益作用，如症状的改善、治愈、疾病减轻、寿命延长、生活质量提高或熟知治疗AGT 相关疾病和相关诱因的医生通常认为正面的其他作用。
在疾病状态的一个或多个参数中存在统计学显著改善时，或通过未恶化或未产生另外将预期的症状，治疗或预防作用是明显的。例如，疾病的可测量参数至少10％的有利变化，并且优选至少20％，30％， 40％，50％或更高，可以指示有效的治疗。还可以使用本领域已知的针对给定疾病的实验动物模型来判断给定的iRNA药物或该药物的制剂的功效。当使用实验动物模型时，治疗功效在观察到标志物或症状的统计学显著降低时是明显的。合适的血管紧张素原相关疾病(例如，高血压)的动物模型包括，例如，高血压的遗传模型，例如，BPH/2 小鼠、自发性高血压大鼠(SHR)、Dahl盐敏感大鼠(DS)、其中内源性肾素已经被抑制的TGR(mREN2)27转基因大鼠和临界性高血压大鼠(BHR)、实验诱发的高血压模型，例如，实验诱发的肾高血压模型、肾诱导实验性高血压的Goldblatt模型、大部分肾切除模型和血管紧张素II诱发的高血压(参见，例如，Dornal和Silva(2011)J Biosci 36：731)。合适的妊娠相关高血压动物模型包括，例如，遗传模型，例如，临界性高血压小鼠(例如，BPH/5小鼠)、携带编码人肾素的转基因和编码人血管紧张素原的转基因的大鼠和/或小鼠及实验诱导模型，例如，sFlt-1输注模型、AT1-AA-诱导模型、降低的子宫胎盘输注压(RUPP)模型(参见，例如，McCarthy等，(2011)Placenta 32：413-419)。
受试者可以施用治疗量的iRNA，如约0.01mg/kg，0.02mg/kg， 0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.1mg/kg，0.15mg/kg，0.2mg/kg， 0.25mg/kg，0.3mg/kg，0.35mg/kg，0.4mg/kg，0.45mg/kg，0.5mg/kg， 0.55mg/kg，0.6mg/kg，0.65mg/kg，0.7mg/kg，0.75mg/kg，0.8mg/kg， 0.85mg/kg，0.9mg/kg，0.95mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg， 1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg，1.6mg/kg，1.7mg/kg，1.8mg/kg，1.9 mg/kg，2.0mg/kg，2.1mg/kg，2.2mg/kg，2.3mg/kg，2.4mg/kg，2.5 mg/kg dsRNA，2.6mg/kg dsRNA，2.7mg/kg dsRNA，2.8mg/kgdsRNA， 2.9mg/kg dsRNA，3.0mg/kg dsRNA，3.1mg/kg dsRNA，3.2mg/kg dsRNA，3.3mg/kgdsRNA，3.4mg/kg dsRNA，3.5mg/kg dsRNA，3.6 mg/kg dsRNA，3.7mg/kg dsRNA，3.8mg/kgdsRNA，3.9mg/kg dsRNA， 4.0mg/kg dsRNA，4.1mg/kg dsRNA，4.2mg/kg dsRNA，4.3mg/kgdsRNA，4.4mg/kg dsRNA，4.5mg/kg dsRNA，4.6mg/kg dsRNA，4.7 mg/kg dsRNA，4.8mg/kgdsRNA，4.9mg/kg dsRNA，5.0mg/kg dsRNA， 5.1mg/kg dsRNA，5.2mg/kg dsRNA，5.3mg/kgdsRNA，5.4mg/kg dsRNA，5.5mg/kg dsRNA，5.6mg/kg dsRNA，5.7mg/kg dsRNA，5.8 mg/kgdsRNA，5.9mg/kg dsRNA，6.0mg/kg dsRNA，6.1mg/kg dsRNA， 6.2mg/kg dsRNA，6.3mg/kgdsRNA，6.4mg/kg dsRNA，6.5mg/kg dsRNA，6.6mg/kg dsRNA，6.7mg/kg dsRNA，6.8mg/kgdsRNA，6.9 mg/kg dsRNA，7.0mg/kg dsRNA，7.1mg/kg dsRNA，7.2mg/kg dsRNA， 7.3mg/kgdsRNA，7.4mg/kg dsRNA，7.5mg/kg dsRNA，7.6mg/kg dsRNA，7.7mg/kg dsRNA，7.8mg/kgdsRNA，7.9mg/kg dsRNA，8.0 mg/kg dsRNA，8.1mg/kg dsRNA，8.2mg/kg dsRNA，8.3mg/kgdsRNA， 8.4mg/kg dsRNA，8.5mg/kg dsRNA，8.6mg/kg dsRNA，8.7mg/kg dsRNA，8.8mg/kgdsRNA，8.9mg/kg dsRNA，9.0mg/kg dsRNA，9.1 mg/kg dsRNA，9.2mg/kg dsRNA，9.3mg/kgdsRNA，9.4mg/kg dsRNA， 9.5mg/kg dsRNA，9.6mg/kg dsRNA，9.7mg/kg dsRNA，9.8mg/kgdsRNA，9.9mg/kg dsRNA，9.0mg/kg dsRNA，10mg/kg dsRNA，15 mg/kg dsRNA，20mg/kgdsRNA，25mg/kg dsRNA，30mg/kg dsRNA， 35mg/kg dsRNA，40mg/kg dsRNA，45mg/kg dsRNA或约50mg/kg dsRNA。所述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
在特定实施方案中，例如，当本发明的组合物包含本文中所述的 dsRNA和脂质时，受试者可以施用治疗量的iRNA，如约0.01mg/kg 至约5mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约0.05mg/kg至约5mg/kg，约0.05mg/kg至约10mg/kg，约0.1mg/kg至约5mg/kg，约0.1mg/kg 至约10mg/kg，约0.2mg/kg至约5mg/kg，约0.2mg/kg至约10mg/kg，约0.3mg/kg至约5mg/kg，约0.3mg/kg至约10mg/kg，约0.4mg/kg 至约5mg/kg，约0.4mg/kg至约10mg/kg，约0.5mg/kg至约5mg/kg，约0.5mg/kg至约10mg/kg，约1mg/kg至约5mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，约1.5mg/kg至约5mg/kg，约1.5mg/kg至约10mg/kg，约2mg/kg至约2.5mg/kg，约2mg/kg至约10mg/kg，约3mg/kg至约5mg/kg，约3mg/kg至约10mg/kg，约3.5mg/kg至约5mg/kg，约4mg/kg至约5mg/kg，约4.5mg/kg至约5mg/kg，约4mg/kg至约10mg/kg，约4.5mg/kg至约10mg/kg，约5mg/kg至约10mg/kg，约5.5mg/kg至约10mg/kg，约6mg/kg至约10mg/kg，约6.5mg/kg 至约10mg/kg，约7mg/kg至约10mg/kg，约7.5mg/kg至约10mg/kg，约8mg/kg至约10mg/kg，约8.5mg/kg至约10mg/kg，约9mg/kg 至约10mg/kg或约9.5mg/kg至约10mg/kg。所述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
例如，dsRNA可以以约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1， 1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7， 2.8，2.9，3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4，4.1，4.2，4.3，4.4， 4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6，6.1， 6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8， 7.9，8，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5， 9.6，9.7，9.8，9.9或约10mg/kg的剂量来施用。所述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
在其他实施方案中，例如，当本发明的组合物包含本文中所述的 dsRNA和N-酰基半乳糖胺时，受试者可以施用治疗量的iRNA，如约 0.1至约50mg/kg，约0.25至约50mg/kg，约0.5至约50mg/kg，约 0.75至约50mg/kg，约1至约50mg/kg，约1.5至约50mg/kg，约2 至约50mg/kg，约2.5至约50mg/kg，约3至约50mg/kg，约3.5至约50mg/kg，约4至约50mg/kg，约4.5至约50mg/kg，约5至约50 mg/kg，约7.5至约50mg/kg，约10至约50mg/kg，约15至约50mg/kg，约20至约50mg/kg，约20至约50mg/kg，约25至约50mg/kg，约25 至约50mg/kg，约30至约50mg/kg，约35至约50mg/kg，约40至约 50mg/kg，约45至约50mg/kg，约0.1至约45mg/kg，约0.25至约45 mg/kg，约0.5至约45mg/kg，约0.75至约45mg/kg，约1至约45 mg/kg，约1.5至约45mg/kg，约2至约45mg/kg，约2.5至约45mg/kg，约3至约45mg/kg，约3.5至约45mg/kg，约4至约45mg/kg，约4.5 至约45mg/kg，约5至约45mg/kg，约7.5至约45mg/kg，约10至约 45mg/kg，约15至约45mg/kg，约20至约45mg/kg，约20至约45 mg/kg，约25至约45mg/kg，约25至约45mg/kg，约30至约45mg/kg，约35至约45mg/kg，约40至约45mg/kg，约0.1至约40mg/kg，约0.25至约40mg/kg，约0.5至约40mg/kg，约0.75至约40mg/kg，约 1至约40mg/kg，约1.5至约40mg/kg，约2至约40mg/kg，约2.5至约40mg/kg，约3至约40mg/kg，约3.5至约40mg/kg，约4至约40 mg/kg，约4.5至约40mg/kg，约5至约40mg/kg，约7.5至约40mg/kg，约10至约40mg/kg，约15至约40mg/kg，约20至约40mg/kg，约20 至约40mg/kg，约25至约40mg/kg，约25至约40mg/kg，约30至约 40mg/kg，约35至约40mg/kg，约0.1至约30mg/kg，约0.25至约30 mg/kg，约0.5至约30mg/kg，约0.75至约30mg/kg，约1至约30 mg/kg，约1.5至约30mg/kg，约2至约30mg/kg，约2.5至约30mg/kg，约3至约30mg/kg，约3.5至约30mg/kg，约4至约30mg/kg，约4.5至约30mg/kg，约5至约30mg/kg，约7.5至约30mg/kg，约10至约 30mg/kg，约15至约30mg/kg，约20至约30mg/kg，约20至约30 mg/kg，约25至约30mg/kg，约0.1至约20mg/kg，约0.25至约20 mg/kg，约0.5至约20mg/kg，约0.75至约20mg/kg，约1至约20 mg/kg，约1.5至约20mg/kg，约2至约20mg/kg，约2.5至约20mg/kg，约3至约20mg/kg，约3.5至约20mg/kg，约4至约20mg/kg，约4.5 至约20mg/kg，约5至约20mg/kg，约7.5至约20mg/kg，约10至约 20mg/kg或约15至约20mg/kg的剂量。在一个实施方案中，当本发明的组合物包含本文中所述的dsRNA和N-酰基半乳糖胺时，受试者可以施用治疗量的约10mg/kg至约30mg/kg的dsRNA。所述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
例如，受试者可以施用治疗量的iRNA，如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5， 0.6，0.7，0.8，0.9，1，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，2.1，2.2， 2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9， 4，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6， 5.7，5.8，5.9，6，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7，7.1，7.2，7.3， 7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9， 9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13， 13.5，14，14.5，15，15.5，16，16.5，17，17.5，18，18.5，19，19.5，20，20.5， 21，21.5，22，22.5，23，23.5，24，24.5，25，25.5，26，26.5，27，27.5，28， 28.5，29，29.5，30，31，32，33，34，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43， 44，45，46，47，48，49或约50mg/kg。所述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
在本发明的特定实施方案中，例如，当双链RNAi剂包含修饰(例如，三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个或多个基序)时，包括药剂的切割位点处或附近的一个这样的基序、六个硫逐磷酸酯连接基团和配体，以约0.01至约0.5mg/kg，约0.01至约0.4mg/kg，约0.01 至约0.3mg/kg，约0.01至约0.2mg/kg，约0.01至约0.1mg/kg，约0.01 mg/kg至约0.09mg/kg，约0.01mg/kg至约0.08mg/kg，约0.01mg/kg 至约0.07mg/kg，约0.01mg/kg至约0.06mg/kg，约0.01mg/kg至约 0.05mg/kg，约0.02至约0.5mg/kg，约0.02至约0.4mg/kg，约0.02 至约0.3mg/kg，约0.02至约0.2mg/kg，约0.02至约0.1mg/kg，约 0.02mg/kg至约0.09mg/kg，约0.02mg/kg至约0.08mg/kg，约0.02 mg/kg至约0.07mg/kg，约0.02mg/kg至约0.06mg/kg，约0.02mg/kg 至约0.05mg/kg，约0.03至约0.5mg/kg，约0.03至约0.4mg/kg，约0.03至约0.3mg/kg，约0.03至约0.2mg/kg，约0.03至约0.1mg/kg，约 0.03mg/kg至约0.09mg/kg，约0.03mg/kg至约0.08mg/kg，约0.03 mg/kg至约0.07mg/kg，约0.03mg/kg至约0.06mg/kg，约0.03mg/kg 至约0.05mg/kg，约0.04至约0.5mg/kg，约0.04至约0.4mg/kg，约0.04至约0.3mg/kg，约0.04至约0.2mg/kg，约0.04至约0.1mg/kg，约 0.04mg/kg至约0.09mg/kg，约0.04mg/kg至约0.08mg/kg，约0.04 mg/kg至约0.07mg/kg，约0.04mg/kg至约0.06mg/kg，约0.05至约 0.5mg/kg，约0.05至约0.4mg/kg，约0.05至约0.3mg/kg，约0.05至约0.2mg/kg，约0.05至约0.1mg/kg，约0.05mg/kg至约0.09mg/kg，约0.05mg/kg至约0.08mg/kg或约0.05mg/kg至约0.07mg/kg的剂量来施用这种药剂。上述值中间的值和范围也意图是本发明的部分，例如，RNAi剂可以以约0.015mg/kg至约0.45mg/kg的剂量施用于受试者。
例如，RNAi剂，例如，药物组合物中的RNAi剂，可以以约0.01 mg/kg，0.0125mg/kg，0.015mg/kg，0.0175mg/kg，0.02mg/kg，0.0225 mg/kg，0.025mg/kg，0.0275mg/kg，0.03mg/kg，0.0325mg/kg，0.035 mg/kg，0.0375mg/kg，0.04mg/kg，0.0425mg/kg，0.045mg/kg，0.0475 mg/kg，0.05mg/kg，0.0525mg/kg，0.055mg/kg，0.0575mg/kg，0.06 mg/kg，0.0625mg/kg，0.065mg/kg，0.0675mg/kg，0.07mg/kg，0.0725 mg/kg，0.075mg/kg，0.0775mg/kg，0.08mg/kg，0.0825mg/kg，0.085 mg/kg，0.0875mg/kg，0.09mg/kg，0.0925mg/kg，0.095mg/kg，0.0975 mg/kg，0.1mg/kg，0.125mg/kg，0.15mg/kg，0.175mg/kg，0.2mg/kg，0.225mg/kg，0.25mg/kg，0.275mg/kg，0.3mg/kg，0.325mg/kg，0.35 mg/kg，0.375mg/kg，0.4mg/kg，0.425mg/kg，0.45mg/kg，0.475mg/kg 或约0.5mg/kg的剂量来施用。上述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
可以在一段时间内通过静脉内输注来施用iRNA，如在5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24或约25分钟的时间段内。施用可以重复，例如，规律地重复，如每周一次、两周一次(即，每两周)，持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长时间。初始治疗方案后，可以以较低频率来给予治疗。例如，每周或两周一次持续三个月的施用后，施用可以每月一次重复，持续六个月或一年或更长时间。
iRNA的施用可以将例如细胞、组织、血液、尿液或患者其他区室中的AGT水平降低至少约5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％， 13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％， 25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％， 37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％， 49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％， 61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％， 73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％， 85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％， 97％，98％，或至少约99％或更高。
在完全剂量的iRNA施用之前，患者可以施用较小剂量，如5％输注，并且监控副作用，如过敏反应。在另一个实例中，可以监控患者的不需要的免疫刺激作用，如提高的细胞因子(例如，TNF-α或 INF-α)水平。
由于对AGT表达的抑制作用，根据本发明的组合物或从其制备的药物组合物可以提高生活质量。
本发明的iRNA可以以“裸的”形式施用，其中将修饰或未修饰的iRNA剂直接悬浮于水性或合适的缓冲溶剂中，作为“游离iRNA”。在不存在药物组合物的情况下施用游离iRNA。游离iRNA可以在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可以包含醋酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任意组合。在一个实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节含有iRNA的缓冲溶液的pH和摩尔渗透压浓度，使其适于施用于受试者。
或者，本发明的iRNA可以作为药物组合物来施用，如dsRNA 脂质体制剂。
将受益于AGT基因表达的降低和/或抑制的受试者是患有如本文中所述的AGT相关疾病或失调的那些。
将受益于AGT基因表达的降低和/或抑制的受试者的治疗包括治疗性和预防性治疗。
本发明进一步提供了iRNA剂或其药物组合物结合其他药物和/ 或其他治疗方法(例如，已知的药物和/或已知的治疗方法)用于治疗将受益于AGT表达的降低和/或抑制的受试者的方法和用途，例如，患有AGT相关疾病的受试者，所述其他药物和/或其他治疗方法如，例如，目前用于治疗这些失调的那些。例如，在特定实施方案中，靶向AGT的iRNA结合例如在治疗本文中别处所述的AGT相关疾病中有用的药剂来施用。例如，适用于治疗将受益于AGT表达降低的受试者(例如，患有AGT相关疾病的受试者)的另外的治疗剂和治疗方法包括血管成形术、主动脉肾动脉分流术、肾去神经支配、经皮腔内肾动脉成形术(PTRA)和支架术、外科血管重建术、基于导管的肾交感去神经和嗜铬细胞瘤或肾素瘤的外科去除、肾上腺切除术、用利尿剂治疗，所述利尿剂例如为噻嗪类利尿剂，例如，氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、美托拉腙(metolazone)和吲达帕胺、保钾利尿剂 (potassium-sparring diuretic)，如三氨蝶呤和氨氯吡咪，袢利尿剂，例如，呋塞米、托塞米、利尿酸和布美他尼；血管紧张素转化酶(ACE) 抑制剂，例如，福辛普利、卡托普利、雷米普利、依那普利、赖诺普利和喹那普利；血管紧张素II受体拮抗剂(也称为血管紧张素受体阻滞剂)，例如，洛沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、依普罗沙坦和阿奇沙坦；β-阻滞剂，如β-1选择性β-阻滞剂，例如，阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、比索洛尔和噻吗洛尔，α-1受体β-阻滞剂，例如，拉贝洛尔、艾司洛尔和卡维地洛，内在拟交感神经β-阻滞剂，例如，醋丁洛尔和吲哚洛尔；血管扩张剂，例如，肼酞嗪、米诺地尔、硝普钠和硝化甘油；钙通道阻滞剂，例如，硝苯地平、氯维地平、氨氯地平、非洛地平、地尔硫卓、尼卡地平和维拉帕米；醛甾酮拮抗剂，如选择性醛甾酮拮抗剂，例如，依普利酮和螺内酯；α2-激动剂，如中枢作用α2- 激动剂，例如，甲基多巴、可乐定和胍法新、肾素抑制剂，例如，阿利克仑；α-阻滞剂，例如，哌唑嗪、特拉唑嗪和多拉唑嗪；外周作用肾上腺素能剂，例如，利血平；选择性D1受体部分激动剂，例如，甲磺酸非诺多泮；非选择性α-肾上腺素能拮抗剂，例如，芬妥胺；合成的甾体抗盐皮质激素剂，例如，螺内酯，或上述任意组合；和配制成药剂组合的治疗剂，例如，氨氯地平/苯那普利的组合(Lotrel)、氨氯地平/奥美沙坦(Azor)、氨氯地平/替米沙坦(Twynsta)、氨氯地平/缬沙坦(Exforge)、氨氯地平/缬沙坦/氢氯噻嗪(Exforge HCT)、氨氯地平/阿利克仑(Tekamlo)、氨氯地平/阿利克仑/氢氯噻嗪(Amturnide)、奥美沙坦/氨氯地平/氢氯噻嗪(Tribenzor)、群多普利/维拉帕米(Tarka)、苯那普利/氢氯噻唑(Lotensin HCT)、卡托普利/氢氯噻唑(Capozide)、依那普利/氢氯噻唑(Vaseretic)、福辛普利/氢氯噻唑、赖诺普利/氢氯噻唑(Prinzide，Zestoretic)、莫西普利/氢氯噻唑(Uniretic)、喹那普利/氢氯噻唑(Accuretic)、坎地沙坦/氢氯噻唑(AtacandHCT)、普罗沙坦/氢氯噻唑(Teveten HCT)、依贝沙坦/氢氯噻唑(Avalide)、洛沙坦/氢氯噻唑(Hyzaar)、奥美沙坦/氢氯噻唑(Benicar HCT)、替米沙坦/氢氯噻唑(Micardis HCT)、缬沙坦/氢氯噻唑(Diovan HCT)、阿替洛尔/氯噻酮(Tenoretic)、比索洛尔/氢氯噻唑(Ziac)、美托洛尔/氢氯噻唑(Lopressor HCT)、纳多洛尔/苄氟噻嗪(Corzide)、普萘洛尔/氢氯噻嗪、阿利克仑/氢氯噻嗪(Tekturna HCT)、可乐定/氯噻酮(Clorpres)、螺内酯/氢氯噻唑(Aldactazide)、三氨蝶呤/氢氯噻唑(Dyazide，Maxzide)、甲基多巴/氢氯噻唑和阿利克仑/氢氯噻唑，或用于治疗AGT相关疾病的其他治疗剂。
iRNA剂和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或在同一组合中施用，例如，非肠道施用，或另外的治疗剂可以作为单独组合物的部分或在单独的时间和/或通过另一种本领域已知的或本文中所述的方法来施用。
本发明还提供了使用本发明的iRNA剂和/或含有本发明的iRNA 剂的组合物来降低和/或抑制细胞中的AGT表达的方法。在其他方面中，本发明提供了用于降低和/或抑制细胞中的AGT表达的本发明的 iRNA和/或包含本发明的iRNA的组合物。在再其他方面中，提供了本发明的iRNA和/或包含本发明的iRNA的组合物用于制造用于降低和/或抑制细胞中的AGT表达的药物的用途。
所述方法和用途包括将细胞接触本发明的iRNA，例如，dsRNA，并且将细胞维持足够的时间来获得AGT基因的mRNA转录物的降解，由此抑制细胞中AGT基因的表达。
可以通过本领域已知的任何方法来评价基因表达的降低。例如，可以通过使用本领域普通技术人员常规的方法(例如，northern印迹、 qRT-PCR)测定AGT的mRNA表达水平，通过使用本领域普通技术人员常规的方法(如western印迹、免疫学技术、流式细胞术方法、ELISA)测定AGT的蛋白质水平和/或通过测定AGT的生物学活性来测定AGT表达的降低。
在本发明的方法和用途中，可以在体外或体内接触细胞，即，细胞可以在受试者体内。
适用于使用本发明的方法处理的细胞可以是表达AGT基因的任何细胞。适用于本发明的方法和用途中的细胞可以是哺乳动物细胞，例如，灵长类细胞(如人细胞或非人灵长类细胞，例如，猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类细胞(如奶牛细胞、猪细胞、骆驼细胞、美洲驼细胞、马细胞、山羊细胞、兔子细胞、绵羊细胞、仓鼠细胞、豚鼠细胞、猫细胞、狗细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狮子细胞、老虎细胞、熊细胞或水牛细胞)、鸟细胞(例如，鸭细胞或鹅细胞)或鲸鱼细胞。在一个实施方案中，细胞是人细胞，例如，人肝细胞。
细胞中的AGT表达可以被抑制至少约5％，6％，7％，8％，9％，10％， 11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％， 23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％， 35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％， 47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％， 59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％， 71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％， 83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％， 95％，96％，97％，98％，99％或约100％。在优选实施方案中，AGT水平降低至少20％。
本发明的体内方法和用途可以包括将含有iRNA的组合物施用于受试者，其中iRNA包括与待治疗的哺乳动物的AGT基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。当待治疗的生物体是人时，可以通过本领域已知的任何方式来施用组合物，包括但不限于，皮下、静脉内、口服、腹膜内或非肠道途径，包括颅内(例如，心室内、脑实质内和鞘内)、肌内、经皮、气道(气溶胶)、鼻、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。在特定实施方案中，通过皮下或静脉内输注或注射来施用组合物。
在一些实施方案中，施用是通过积存(depot)注射。积存注射可以在延长的时间段内以一致方式释放iRNA。因此，积存注射可以降低获得所需效果(例如，所需的AGT抑制或者治疗或预防效果)需要的给药频率。积存注射还可以提供更一致的血清浓度。积存注射可以包括皮下注射或肌内注射。在优选实施方案中，积存注射是皮下注射。
在一些实施方案中，施用是通过泵。泵可以是外部泵或外科手术植入的泵。在特定实施方案中，泵是皮下植入的渗透泵。在其他实施方案中，泵是输注泵。输注泵可以用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施方案中，输注泵是皮下输注泵。在其他实施方案中，泵是将iRNA递送至肝的外科手术植入的泵。
最初可以施用较高剂量(即，负荷剂量)，接着在维持时间段内施用较低剂量。
可以基于是否需要局部或全身性治疗和基于待治疗的区域来选择施用方式。可以选择施用途径和部位来增强靶向。
在一个方面中，本发明还提供了用于抑制哺乳动物(例如，人) 中AGT基因表达的方法。本发明还提供了包含靶向哺乳动物细胞中的AGT基因的iRNA(例如，dsRNA)的组合物，用于抑制哺乳动物中AGT基因的表达。在另一个方面中，本发明提供了靶向哺乳动物细胞中的AGT基因的iRNA(例如，dsRNA)在制造用于抑制哺乳动物中的AGT基因表达的药物中的用途。
所述方法和用途包括将包含靶向哺乳动物细胞中的AGT基因的 iRNA(例如，dsRNA)施用于哺乳动物，例如，人，并将该哺乳动物维持足够时间以获得AGT基因的mRNA转录物的降解，由此抑制哺乳动物中AGT基因的表达。
可以如本文中所述的通过本领域已知的任何方法，例如， qRT-PCR来评价施用iRNA的受试者的外周血样品中基因表达的降低。可以通过本文中所述的本领域已知的任何方法，例如，ELISA或 western印迹，来评价蛋白质产生的降低。在一个实施方案中，穿刺肝脏活检样品作为用于监控AGT基因和/或蛋白质表达降低的组织材料。在另一个实施方案中，血样作为用于监控AGT基因和/或蛋白质表达降低的组织材料。
在一个实施方案中，通过如本领域已知的进行5’-RACE或实验方案的改进来进行iRNA剂施用后体内RISC介导的靶标切割的证实 (Lasham A等，(2010)Nucleic Acid Res.，38(3)p-e19)(Zimmermann 等，(2006)Nature 441：111-4)。
本发明通过以下不应当认为是限制的实施例进一步说明。在整个申请中引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的完整内容，以及附图和序列表，按引用并入本文中。
实施例
实施例1.iRNA合成
试剂来源
在试剂来源没有在本文中特意给出的情况中，这样的试剂可以获自任何的分子生物学试剂供应商，所述试剂符合用于分子生物学的品质/纯度标准。
转录物
进行siRNA设计来鉴定靶向NCBI基因数据库 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中加注的人(Homo sapiens)、食蟹猴(Macaca fascicularis；此后称为“cyno”)、小鼠(Musmusculus) 和大鼠(Rattus norvegicus)AGT转录物的siRNA。设计使用来自NCBI 的以下转录物：人-NM_000029.3；猴-AB170313.1；小鼠 -NM_007428.3。使用获自肝衍生的cDNA文库的序列来延伸食蟹猴转录物。由于高等灵长类/啮齿动物的序列趋异，在单独的批次中设计siRNA双链体，包括但不限于含有匹配人与仅猴转录物以及仅小鼠转录物的双链体的批次。在每个设计批次中设计与所列的人转录物和考虑的其他物种转录物共享100％同一性的所有siRNA双链体。
siRNA设计、特异性和功效预测
从每个序列预测所有可能的19mer的预测特异性。然后选择缺乏长于七个核苷酸的重复片段的候选19mer。使用python脚本‘BruteForce.py’中实施的穷举“brute-force”算法，将这706个候选的人/猴和1815个小鼠siRNA用于针对合适的转录物组(定义为人、猴或小鼠NCBIRefseq集内的NM_和XM_记录的集合)的综合检索中。该脚本接下来解析该转录物-寡核苷酸比对，以产生基于该siRNA和任何潜在的“脱靶”转录物之间的错配的位置和数目的分数。对该脱靶分数进行加权，以强调siRNA的“种子”区域的差异，在从该分子的5′末端开始的位置2-9处。通过求和单个错配得分，每个寡转录物对从穷举检索(brute-forcesearch)被赋予了错配分数；在位置2-9的错配被计数为2.8，在切割位点位置10-11的错配被计数为1.2，并且在区域12-19中的错配被计数为1.0。通过对衍生自每个寡核苷酸的种子衍生的六聚物的七聚物和八聚物的频率做比较进行另外的脱靶预测。来自相对于5′起始的位置2-7的六聚物被用来产生2个七聚物和一个八聚物。“七聚物1”是通过将一个3′-A添加到六聚物产生的；七聚物2是通过将一个5′-A添加到六聚物产生的；该八聚物是将通过一个A添加到六聚物的5′和3′端产生的。在人类、猴或小鼠3′-UTRome 中的八聚物和七聚物的频率(定义为来自NCBI的RefSeq数据库中的转录组的子序列，其中编码区的端部，该‘CDS’，被清楚地定义) 是预先计算的。以使用来自八聚物频率的范围的中间值将八聚物频率归一化为七聚物频率。然后通过计算((3X归一化的八聚物计数) +(2X七聚物2计数)+(1X七聚物1计数))的总和来计算“mirSeedScore′。
根据计算的评分，将两条siRNA链分配至特异性类别：高于3 的评分作为高特异性的，等于3为特异性的，2.2至2.8之间为适度特异性的。通过反义链的特异性来分选双链体。选择来自人/猴和小鼠集的双链体，其反义寡聚体在第一位置缺乏GC，在位置13和14缺乏 G并且在种子区域中具有3个或更多个U或A(具有高预测效力的双链体的特征)。
通过在3’方向对反义19mer延伸四个另外的核苷酸，分别设计正义和反义链上21和23个核苷酸长的候选GalNAc偶联的双链体(保持与靶转录物完美的互补性)。将正义链指定为反义23mer的头21 个核苷酸的反向互补体。选择在全部23个核苷酸中保持与全部选择的物种转录物完美匹配的双链体。
siRNA序列选择
合成了总共人/猴来源的117个正义和117个反义和小鼠来源的 42个正义和42个反义siRNA 19mer寡聚物并且形成为GalNAc-偶联的双链体。合成了总共人/猴来源的38个正义和38个反义21/23mer 寡聚物和小鼠来源的总共26个21/23mer寡聚物并形成为GalNAc-偶联的双链体。
表3中显示了未修饰的19mer AGT正义和反义链序列的详细列表。
表4中显示了修饰的19mer AGT正义和反义链序列的详细列表。
表7中显示了未修饰的21/23mer AGT正义和反义链序列的详细列表。
表8中显示了修饰的21/23mer AGT正义和反义链序列的详细列表。
表11中显示了未修饰的19mer AGT正义和反义链序列的详细列表。
表13中显示了未修饰的21/23mer AGT正义和反义链序列的详细列表。
表15中显示了修饰的21/23mer AGT正义和反义链序列的详细列表。
siRNA合成
通用小规模和中等规模RNA合成程序
根据标准的固相寡核苷酸合成方案，使用可商购的5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3′-O-(2-氰基乙基-N，N- 二异丙基)尿苷亚磷酰胺单体、4-N-乙酰胞苷、6-N-苯甲酰基腺苷和 2-N-异丁酰基鸟苷以及相应的2′-O-甲基和2′-氟代亚磷酰胺，在 0.2-500μmol之间的规模合成RNA寡核苷酸。以0.1-0.15M浓度制备该亚酰胺(amidite)溶液并将5-乙硫基-1H-四唑(乙腈中0.25-0.6M) 用作活化剂。在合成过程中用在二甲基吡啶∶乙腈(1∶1)(v∶v) 中的0.2M苯乙酰二硫化物(PADS)或在吡啶中的0.1M 3-(二甲氨基亚甲基)氨基-3H-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)引入硫代磷酸酯骨架修饰以用于氧化步骤。在合成完成后，从固体支持物切割下这些序列，并用甲胺接着用三乙胺.3HF去保护以除去存在的任何2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基保护基。
对于5-500μmol之间合成规模和完全2′修饰的序列(2′-氟和/或 2′-O-甲基或其组合)，使用3∶1(v/v)乙醇和浓(28％-32％)氨水在35℃持续16h或在55℃持续5.5h对这些寡核苷酸进行去保护。在氨去保护之前，将这些寡核苷酸在固体支持物上用乙腈中的0.5M哌啶处理20min。通过LC-MS和阴离子交换HPLC(IEX-HPLC)分析粗制的寡核苷酸。使用：20mM磷酸盐，10％-15％ACN，pH＝8.5 (缓冲液A)以及20mM磷酸盐，10％-15％ACN，1M NaBr，pH＝8.5(缓冲液B)通过IEX HPLC，进行对这些寡核苷酸进行纯化。通过分析型HPLC分析级分纯度。将具有合适纯度的含产物的级分汇集，并于脱盐之前在旋转式蒸发器上浓缩。将样品通过尺寸排阻层析脱盐并冻干至干燥。将等摩尔量的正义和反义链在1x PBS缓冲液中退火，以制备相应的siRNA双链体。
对于小规模(0.2-1μmol)，合成在MerMade 192合成器上以96 孔版式进行。在充分地2′-修饰的序列(2′-氟和/或2′-O-甲基或其组合) 的情况下，将这些寡核苷酸使用甲胺在室温下30-60min，然后在60℃孵化30min，或用3∶1(v/v)乙醇和浓(28％-32％)氨水在室温下30-60 分钟，然后在40℃下孵化1.5小时进行去保护。然后在乙腈∶丙酮 (9∶1)的溶液中沉淀粗制的寡核苷酸，并通过离心分离并且倾析上清液。将粗制的寡核苷酸小粒重新悬浮于20mM NaOAc缓冲液并通过LC-MS和阴离子交换HPLC进行分析。在5mL HiTrap SephadexG25柱(GE卫生保健公司(GE Healthcare))上在96深孔板中将粗制的寡核苷酸序列进行脱盐。在每个孔中收集对应于一个单独的序列的约1.5mL的样品。通过LC-MS和阴离子交换层析法分析这些纯化脱盐的寡核苷酸。通过在Tecan机器人上退火等摩尔量的正义和反义序列来制备双链体。双链体的浓度被调节至在1x PBS缓冲液中10 μM。
用于体内分析的GalNAc-偶联寡核苷酸的合成
使用预先装载用于寡核苷酸合成的具有4，4′-二甲氧基三苯甲基 (DMT)保护的伯羟基的Y-形接头的固体支持物在0.2-500μmol之间的规模合成在其3′-末端与GalNAc配体偶联的寡核苷酸，并且 GalNAc配体通过系链(tether)附接。
对于在5-500μmol之间的规模合成GalNAc偶联物，对上述针对 RNA的合成方案进行了以下改编：对于基于聚苯乙烯的合成支持物，使用了甲苯中的5％二氯乙酸用于合成过程中的DMT-切割。如上所述进行自该支持物的切割和去保护。不去除最后的5′-DMT基团(“带有DMT”)合成富含硫代磷酸酯的序列(通常＞5硫代磷酸酯)，并且在如上所述的切割和去保护之后，使用于水中的50mM乙酸铵 (缓冲液A)和于80％乙腈中的50mM乙酸铵(缓冲液B)通过反相HPLC进行纯化。通过分析型HPLC和/或LC-MS分析级分纯度。将具有合适纯度的含产物的级分汇集，并在旋转式蒸发器上浓缩。使用在水中的20％-25％乙酸去除DMT基团直到完成。将样品通过尺寸排阻层析脱盐并冻干至干燥。将等摩尔量的正义和反义链在1xPBS 缓冲液中退火，以制备相应的siRNA双链体。
对于小规模合成GalNAc偶联物(0.2-1μmol)，包括具有多个硫代磷酸酯连接基团的序列，在MerMade平台上应用了如上所述用于合成RNA或完全含2′-F/2′OME的序列的方案。在含GalNAc功能化的可控孔度玻璃支持物的预填充柱上进行合成。
实施例2.siRNA双链体的体外筛选
细胞培养和96-孔转染
在通过胰蛋白酶化从平板释放之前，将Hep3B细胞(ATCC， Manassas，VA)在37℃下在5％CO2气氛中在补充了10％FBS、链霉素和谷氨酰胺(ATCC)的Eagle′s最小必需培养基(ATCC)中生长至接近汇合。将细胞洗涤并且以0.125x106细胞/ml重悬浮。在转染过程中，将细胞以约20,000细胞/孔涂布于96-孔平板上。
通过对于5μl的每种siRNA双链体将每孔14.8μl Opti-MEM加 0.2μlLipofectamine RNAiMax(InvitrogenTM，Carlsbad CA.，目录编号13778-150)96-孔平板的单个孔中来进行转染。然后将混合物在室温下孵育20分钟。然后将含有合适细胞数的不含抗生素的80μl完全生长培养基添加到siRNA混合物中。在RNA纯化前，将细胞孵育24 小时。
以10nM和0.01nM最终双链体浓度进行了单剂量实验。以10、 1.67、0.28、0.046、0.0077、0.0013、0.00021、0.000036nM最终双链体浓度来进行剂量响应实验。
细胞培养和384-孔转染
在通过胰蛋白酶化从平板释放之前，将Hep3B细胞(ATCC， Manassas，VA)在37℃下在5％CO2气氛中在补充了10％FBS、链霉素和谷氨酰胺
Figure BDA0001214965370001791
的Eagle′s最小必需培养基
Figure BDA0001214965370001792
中生长至接近汇合。将细胞洗涤并且以0.125x106细胞/ml重悬浮。在转染过程中，将细胞以约5,000细胞/孔涂布于384-孔平板上。
通过对于5μl的每种siRNA双链体将每孔4.9μl Opti-MEM加0.1 μlLipofectamine RNAiMax(InvitrogenTM，Carlsbad CA.，目录编号 13778-150)添加至96-孔平板的单个孔中来进行转染。然后将混合物在室温下孵育20分钟。然后将含有合适细胞数的不含抗生素的40μl 完全生长培养基加入siRNA混合物中。在RNA纯化前，将细胞孵育 24小时。
以10nM和0.01nM最终双链体浓度进行了单剂量实验。以10、 1.67、0.28、0.046、0.0077、0.0013、0.00021、0.000036nM最终双链体浓度来进行剂量响应实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(InvitrogenTM，部件#： 610-12)的总RNA分离-96孔分离
收集细胞并在150μl裂解/结合缓冲液中裂解，然后使用 Eppendorf Thermomixer在850rpm下混合五分钟(混合速度在整个过程中相同)。将十微升磁珠和80μl裂解/结合缓冲液混合物添加到圆底平板并混合1分钟。使用磁力架捕获磁珠并且除去上清液而不干扰珠子。除去上清液后，将裂解的细胞加入剩余的珠子中并混合5分钟。除去上清液后，用150μl洗涤缓冲液A将磁珠洗涤2次并混合1分钟。将珠子再次捕获并除去上清液。然后用150μl洗涤缓冲液B洗涤珠子，捕获并除去上清液。接着用150μl洗脱缓冲液洗涤珠子，捕获并除去上清液。使珠子干燥2分钟。干燥后，加入50μl洗脱缓冲液并在70 ℃下混合5分钟。在磁体上捕获珠子5分钟。除去40μl上清液并添加到另一个96孔平板中。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，Cat#4368813)的cDNA合成
将每个反应的2μl 10×缓冲液、0.8μl 25×dNTP、2μl随机引物、1μl 逆转录酶、1μl RNase抑制剂和3.2μl H2O的主混合物加入10μl总RNA 中。使用Bio-Rad C-1000或S-1000热循环仪(Hercules，CA)通过以下步骤来产生cDNA：25℃10min，37℃120min，85℃5秒，4℃保持。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(InvitrogenTM，部件#： 610-12)的总RNA分离-384孔提取
在50μl裂解/结合缓冲液中裂解细胞。在裂解/结合缓冲液中洗涤磁性Dynabead并重悬浮于相同缓冲液中。然后每孔添加含有2μl Dynabead的20μl裂解/结合缓冲剂。在Vibratranslator(UnionScientific) 上“7”下振荡平板10分钟，使用了自动平板洗涤系统(具有Biostacker 的Biotek EL406，和磁性捕获板)。然后以类似于针对96-孔过程描述的方式洗涤平板：用缓冲液A(90μl)洗涤两次，用缓冲液B(90μl) 洗涤两次，和用缓冲液C(100μl)洗涤两次。从平板除去最后一次洗液，并立即开始cDNA合成。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，Cat#4368813)的cDNA合成-384孔合成
将每个反应的2μl 10×缓冲液、0.8μl 25×dNTP、2μl随机引物、1μl 逆转录酶、1μl RNase抑制剂和13.2μl H2O的主混合物加入只含有提取的RNA和磁珠的384-孔平板的孔中(20μl总体积)。通过在25℃下孵育10min，37℃下120min和85℃下8分钟来产生cDNA。
实时PCR：
将2μl cDNA加入384孔平板(Roche cat#04887301001)中每孔中含有0.5μl人GAPDH TaqMan探针(Applied Biosystems Cat #4326317E)和0.5μl人AGT TaqMan探针(Applied Biosystems cat# Hs00174854ml)，2μl无核酸酶水和5μl Lightcycler 480探针主混合物(Roche Cat#04887301001)的主混合物中。在LightCycler 480实时PCR仪器(Roche)中进行qPCR。为了计算相对倍数变化，使用△△Ct方法分析数据并针对用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染细胞进行的测试标准化。
使用XLFit，采用4参数拟合模型计算IC50并针对用AD-1955转染的或模拟转染的细胞标准化。
AD-1955的正义和反义序列为：
正义：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO：13)
反义：UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO：14)
表5显示了使用所示的19mer AGT iRNA，利用96-孔方法转染的Hep3B细胞中的单剂量筛选的结果。数据表示为相对于未处理细胞剩余的mRNA的百分比。
表6显示了使用所示的19mer AGT iRNA，利用96-孔方法转染的Hep3B细胞的剂量响应。所示的IC50值表示相对于未处理细胞的 IC50值。
表9显示了使用所示的21/23mer偶联物AGT iRNA，利用384- 孔方法转染的Hep3B细胞中的单剂量筛选的结果。数据表示为相对于未处理细胞剩余的mRNA的百分比。
表10显示了使用所示的21/23mer偶联物AGT iRNA，利用384- 孔方法转染的Hep3B细胞的剂量响应。所示的IC50值表示相对于未处理细胞的IC50值。
表12显示了使用所示的19mer AGT iRNA，利用96-孔方法转染的Hep3B细胞中的单剂量筛选的结果。数据表示为相对于未处理细胞剩余的mRNA的百分比。
表14显示了在用表达hAGT的AAV载体感染的小鼠中用所示 21/23mer偶联物AGTiRNA的hAGT敲减的单剂量、剂量响应筛选的结果。
表16显示了在用表达hAGT的AAV载体感染的小鼠中用所示 21/23mer偶联物AGTiRNA的hAGT敲减的单剂量、剂量响应筛选的结果。
表2.核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。将理解这些单体当存在于寡核苷酸中时，通过5’-3’磷酸二酯键互相连接。
Figure BDA0001214965370001821
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表6.Hep3B细胞中的AGT IC50数据
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Figure BDA0001214965370002301
表9.Hep3B细胞中的AGT单剂量筛选(21/23mer)
Figure BDA0001214965370002311
Figure BDA0001214965370002321
表10-Hep3B细胞中的AGT IC50数据(21/23mer)
双链体名称 IC<sub>50</sub>(nM)
AD-60771.1 0.028
AD-60776.1 0.033
AD-60780.1 0.038
AD-60784.1 0.045
AD-60781.1 0.089
实施例2.体内AGT沉默-先兆子痫后遗症的改善
将带有完整基因组人AGT基因的转基因雌性Sprague-Dawley大鼠(例如，[TGR(hAGT)L1623](参见，例如，Bohlender J等(1996) Hypertension 27：535-540和BohlenderJ等，(2000)J Am Soc Nephrol 11：2056-2061)手术植入用于通过遥测测量血压的装置。从手术恢复后，将这些大鼠与带有完整基因组人REN基因的转基因雄性 Sprague-Dawley大鼠(例如，[TGR(hREN)L10J](参见，例如，Bohlender J等，(1997)Hypertension 29：428-434和Bohlender J等，(2000)J Am Soc Nephrol 11：2056-2061)交配。这一杂交的雌性后代(在本文中称为“PE大鼠”)是先兆子痫的模型并且产生蛋白尿和宫内生长受限(IUGR)，并且在妊娠第13天左右开始具有血压峰(参见，例如，图2A)。
在妊娠第3天开始，给妊娠PE大鼠的子集施用10mg/kg靶向 hAGT的siRNA(AD-60771)。保持妊娠PE大鼠的第二子集未处理作为对照。每隔两天给药至妊娠第15天。在大约妊娠第19天将大鼠处死，并从母体和胎儿收集血液和组织样品。
在整个实验过程中通过用于通过遥测测量血压的手术实施装置监控母体血压。图2A显示了AD-60771施用后，母体平均动脉血压显著降低。此外，如通过血清白蛋白的ELISA分析测定的，AD-60771 施用后，母体蛋白尿显著降低(图2B)。这两种病症是先兆子痫的标志。降低的血压降低了与疾病相关的心血管事件，而降低的蛋白尿是提高的肾功能的指示。
先兆子痫也与减小的胎盘大小相关，可能与差的输注相关。作为病症的结果，胎儿生长受损。然而，母体施用AD-60771后，子宫胎盘单元重量(图3A)和胎儿重量(图3B)提高，并且存在胎儿脑：肝比例的正常化(图3C)，全部指示更正常的胎盘和胎儿发育。
如通过母体肝脏和胎盘中hAGT的mRNA表达的RT-qPCR分析测定的，显示了尽管母体肝脏中存在hATG的实质性沉默(图4A)，胎盘中不存在显著沉默(图4B)。这表明缺乏iRNA至胎盘中的渗透。
此外，四个母体肝脏样品、四个胎盘样品和八个胎儿肝脏样品的分析证明了胎儿肝脏暴露于iRNA为约1.2ng siRNA/g组织(低于检测极限，1.3ng siRNA/g组织)，和母体肝脏暴露于iRNA比胎盘暴露于iRNA高约265倍(图5)。按照之前所述的(参见，例如，Landesman， Y.等，(2010)Silencel：16)，通过茎-环qPCR测定了组织暴露。
因此，用靶向hAGT的iRNA的母体治疗优于用小分子肾素-血管紧张素抑制剂(如ACE抑制剂)和血管紧张素受体阻断剂的母体治疗，因为这些化合物穿过胎盘并且是胎儿毒性的。
因为胎盘作为胎儿营养以及从胎儿废物去除的导管，其组成是重要的。因此，评价了胎盘病理(即，通过测量用于细胞角蛋白免疫组织化学染色的组织切片面积)。图6证明了尽管胎盘的母体部分(子宫肌层(mesometrial)三角；图6D)和滋养管(均匀的细胞层，其是分化的滋养层的前体；图6E)未通过AD-60771的施用改变，整体胎盘大小增加(图6B、6C和6F，并且图6A用于参照)。特别地，通过 AD-60771的母体治疗提高了迷路(labyrinth)的大小(图6G)，迷路是胎儿和母体血液之间营养交换的部位。
通过血管紧张素调控的抗血管生成的可溶性fms-样酪氨酸激酶 -1(sFLT1)和血管生成性胎盘生长因子(PLGF)在先兆子痫中起到关键作用，从胎盘释放至母体血流中，并引起内皮功能障碍。sFlt-1 主要从胎盘释放至母体血流中并引起内皮功能障碍。PLGF是胎盘来源的，并且促进血管生成。sFlt-1∶PLGF的比例是诊断性的，较高的 sFlt-1∶PLGF与更严重的疾病相关。
通过RT-qPCR分析对sFlt-1和PLGF的mRNA表达的评价证明了在母体施用AD-60771后，sFlt-1和PLGF两者的水平在母体肾脏中显著降低(分别为图7A和7B)，但在胎盘中保持未改变(分别为图7C和7D)。然而，在母体肾脏中，随着sFlt-1降低至高于PLGF 的程度，血清sFlt-1∶PLGF比例可以提高。
已经在先兆子痫女性中鉴别出I型血管紧张素II受体(AT1)的激动性抗体。将妊娠的啮齿动物暴露于AT1自身抗体时，产生了先兆子痫样症状。因为AT1的激活与血管加压素作用以及醛甾酮分泌和sFlt-1产生相关，预期AT1自身抗体的降低将减轻先兆子痫表型。因此，还可以通过生物色谱和随后分离抗体的生物测试来评价AT1 受体的激动性自身抗体(AT1-AA)的产生水平。按照已经描述的(参见，例如，Dechend等，(2005)Hypertension 45：742-746)，通过评价分离的、纯化的AT1-AA抗体对新生大鼠心肌细胞的自发搏动率的影响测量AT1-AA水平。图8证明了将AD-60771施用于妊娠PE大鼠后，存在AT1-AA水平的显著降低。
实施例3.先兆子痫的转基因大鼠模型中的体内AGT沉默
如之前实施例中所述的，测试了AD-60771双链体对于沉默妊娠 PE大鼠中的hAGT表达的能力。在妊娠第3天开始，对妊娠PE大鼠的子集施用10mg/kg靶向hAGT的siRNA(AD-60771)。在妊娠第 21天，收集肝脏和血液，并且分析hAGT和rAGT蛋白以及mRNA 的水平和与未处理的妊娠转基因大鼠、妊娠Sprague-Dawley大鼠和非妊娠Sprague-Dawley大鼠中存在的hAGT和rAGT蛋白以及mRNA 的水平进行比较。这些分析的结果显示于图9A和9B中，并且证明了与对照妊娠PE大鼠相比，用AD-60771处理的妊娠PE大鼠中循环 AT2的80％降低和循环hAT1的95％降低。与对照妊娠PE大鼠相比，用AD-60771处理的妊娠PE大鼠中也观察到约45％的大鼠AT2的降低。与对照妊娠PE大鼠相比，用AD-60771处理的妊娠PE大鼠中观察到了肝AGT mRNA的95％沉默。图9A和9B也证明了将AD-60771 施用于妊娠PE大鼠后，存在AT1和AT2的血清水平的显著降低。
Figure BDA0001214965370002361
Figure BDA0001214965370002371
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Figure BDA0001214965370002431
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Figure BDA0001214965370002461
Figure BDA0001214965370002471
Figure BDA0001214965370002481
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Figure BDA0001214965370002501
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Figure BDA0001214965370002521
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Figure BDA0001214965370002581
表12.Hep3B细胞中的AGT单剂量筛选(21/23mer)
Figure BDA0001214965370002591
Figure BDA0001214965370002601
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Figure BDA0001214965370002621
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Figure BDA0001214965370002641
Figure BDA0001214965370002651
实施例4：表达hAGT的小鼠中的体内AGT沉默
进行了一系列实验来评价从具有强烈肝向性的AAV8表达载体在表达人AGT(hAGT)的小鼠中hAGT靶敲减。简而言之，在组成型启动子的控制下，用1×1011个含有hAGT的表达构建体的AAV8 颗粒感染小鼠。感染后两周，小鼠施用单一3.0mg/kg、1.0mg/kg、 0.3mg/kg或0.1mg/kg剂量的靶向hAGT的siRNA(AD-67327.2或 AD-67335.2)，或作为对照的PBS(n＝4/组)。这些实验中评价的药剂的核苷酸序列提供于表13中。
表13.修饰的AGT dsRNA的正义和反义链序列(21/23mer)
Figure BDA0001214965370002661
在施用药剂后的第0、3、7和14天，收集血样并且制备血清来相对于hAGT的prebleed水平测定hAGT mRNA表达的水平。这些实验的结果显示于表14中。
表14.表达hAGT小鼠中的hAGT单剂量剂量响应筛选
Figure BDA0001214965370002662
Figure BDA0001214965370002671
实施例5：表达hAGT的小鼠中的体内AGT沉默
进行了一系列实验来评价具有强烈肝向性的AAV8表达载体在表达hAGT的小鼠中的hAGT靶敲减。简而言之，在组成型启动子的控制下，用1×1011个含有hAGT的表达构建体的AAV8颗粒感染小鼠。用AAV8病毒感染后两周，将小鼠施用单一1mg/k剂量的靶向 hAGT的siRNA，或作为对照的PBS(n＝3/组)。这些实验中评价的双链体的核苷酸序列提供于表15中。
表15.AGT dsRNA的修饰的正义和反义链序列(21/23mer)
Figure BDA0001214965370002672
Figure BDA0001214965370002681
Figure BDA0001214965370002691
药剂施用后七天，收集血样并且制备血清来相对于hAGT的 prebleed水平测定hAGT mRNA表达水平。这些实验的结果提供于表 16中。
表16.表达hAGT的小鼠中的hAGT单剂量剂量响应筛选
双链体 平均 SD
PBS 98.6 8.7
AD-68577 65.1 7.7
AD-68581 53.1 3.3
AD-68582 44.8 11.1
AD-67335 60.5 3.1
AD-67327 43.0 1.0
AD-68575 48.0 9.4
AD-68576 47.4 5.9
AD-68583 51.3 7.7
AD-68584 61.0 2.1
AD-67313 70.8 7.6
AD-67314 66.2 5.7
等同
本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规的实验确定，本文中所述的特定实施方案和方法的许多等价物。这样的等价物旨在包括在以下权利要求的范围中。
序列表
<110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC.
<120> 血管紧张素原（AGT）iRNA组合物及其使用方法
<130> 121301-01320
<140>
<141>
<150> 62/047,978
<151> 2014-09-09
<150> 62/001,731
<151> 2014-05-22
<160> 1050
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2587
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
atcccatgag cgggcagcag ggtcagaagt ggcccccgtg ttgcctaagc aagactctcc 60
cctgccctct gccctctgca cctccggcct gcatgtccct gtggcctctt gggggtacat 120
ctcccggggc tgggtcagaa ggcctgggtg gttggcctca ggctgtcaca cacctaggga 180
gatgctcccg tttctgggaa ccttggcccc gactcctgca aacttcggta aatgtgtaac 240
tcgaccctgc accggctcac tctgttcagc agtgaaactc tgcatcgatc actaagactt 300
cctggaagag gtcccagcgt gagtgtcgct tctggcatct gtccttctgg ccagcctgtg 360
gtctggccaa gtgatgtaac cctcctctcc agcctgtgca caggcagcct gggaacagct 420
ccatccccac ccctcagcta taaatagggc atcgtgaccc ggccggggga agaagctgcc 480
gttgttctgg gtactacagc agaagggtat gcggaagcga gcaccccagt ctgagatggc 540
tcctgccggt gtgagcctga gggccaccat cctctgcctc ctggcctggg ctggcctggc 600
tgcaggtgac cgggtgtaca tacacccctt ccacctcgtc atccacaatg agagtacctg 660
tgagcagctg gcaaaggcca atgccgggaa gcccaaagac cccaccttca tacctgctcc 720
aattcaggcc aagacatccc ctgtggatga aaaggcccta caggaccagc tggtgctagt 780
cgctgcaaaa cttgacaccg aagacaagtt gagggccgca atggtcggga tgctggccaa 840
cttcttgggc ttccgtatat atggcatgca cagtgagcta tggggcgtgg tccatggggc 900
caccgtcctc tccccaacgg ctgtctttgg caccctggcc tctctctatc tgggagcctt 960
ggaccacaca gctgacaggc tacaggcaat cctgggtgtt ccttggaagg acaagaactg 1020
cacctcccgg ctggatgcgc acaaggtcct gtctgccctg caggctgtac agggcctgct 1080
agtggcccag ggcagggctg atagccaggc ccagctgctg ctgtccacgg tggtgggcgt 1140
gttcacagcc ccaggcctgc acctgaagca gccgtttgtg cagggcctgg ctctctatac 1200
ccctgtggtc ctcccacgct ctctggactt cacagaactg gatgttgctg ctgagaagat 1260
tgacaggttc atgcaggctg tgacaggatg gaagactggc tgctccctga tgggagccag 1320
tgtggacagc accctggctt tcaacaccta cgtccacttc caagggaaga tgaagggctt 1380
ctccctgctg gccgagcccc aggagttctg ggtggacaac agcacctcag tgtctgttcc 1440
catgctctct ggcatgggca ccttccagca ctggagtgac atccaggaca acttctcggt 1500
gactcaagtg cccttcactg agagcgcctg cctgctgctg atccagcctc actatgcctc 1560
tgacctggac aaggtggagg gtctcacttt ccagcaaaac tccctcaact ggatgaagaa 1620
actatctccc cggaccatcc acctgaccat gccccaactg gtgctgcaag gatcttatga 1680
cctgcaggac ctgctcgccc aggctgagct gcccgccatt ctgcacaccg agctgaacct 1740
gcaaaaattg agcaatgacc gcatcagggt gggggaggtg ctgaacagca ttttttttga 1800
gcttgaagcg gatgagagag agcccacaga gtctacccaa cagcttaaca agcctgaggt 1860
cttggaggtg accctgaacc gcccattcct gtttgctgtg tatgatcaaa gcgccactgc 1920
cctgcacttc ctgggccgcg tggccaaccc gctgagcaca gcatgaggcc agggccccag 1980
aacacagtgc ctggcaaggc ctctgcccct ggcctttgag gcaaaggcca gcagcagata 2040
acaaccccgg acaaatcagc gatgtgtcac ccccagtctc ccaccttttc ttctaatgag 2100
tcgactttga gctggaaagc agccgtttct ccttggtcta agtgtgctgc atggagtgag 2160
cagtagaagc ctgcagcggc acaaatgcac ctcccagttt gctgggttta ttttagagaa 2220
tgggggtggg gaggcaagaa ccagtgttta gcgcgggact actgttccaa aaagaattcc 2280
aaccgaccag cttgtttgtg aaacaaaaaa gtgttccctt ttcaagttga gaacaaaaat 2340
tgggttttaa aattaaagta tacatttttg cattgccttc ggtttgtatt tagtgtcttg 2400
aatgtaagaa catgacctcc gtgtagtgtc tgtaatacct tagttttttc cacagatgct 2460
tgtgattttt gaacaatacg tgaaagatgc aagcacctga atttctgttt gaatgcggaa 2520
ccatagctgg ttatttctcc cttgtgttag taataaacgt cttgccacaa taagcctcca 2580
aaaaaaa 2587
<210> 2
<211> 2587
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
ttttttttgg aggcttattg tggcaagacg tttattacta acacaaggga gaaataacca 60
gctatggttc cgcattcaaa cagaaattca ggtgcttgca tctttcacgt attgttcaaa 120
aatcacaagc atctgtggaa aaaactaagg tattacagac actacacgga ggtcatgttc 180
ttacattcaa gacactaaat acaaaccgaa ggcaatgcaa aaatgtatac tttaatttta 240
aaacccaatt tttgttctca acttgaaaag ggaacacttt tttgtttcac aaacaagctg 300
gtcggttgga attctttttg gaacagtagt cccgcgctaa acactggttc ttgcctcccc 360
acccccattc tctaaaataa acccagcaaa ctgggaggtg catttgtgcc gctgcaggct 420
tctactgctc actccatgca gcacacttag accaaggaga aacggctgct ttccagctca 480
aagtcgactc attagaagaa aaggtgggag actgggggtg acacatcgct gatttgtccg 540
gggttgttat ctgctgctgg cctttgcctc aaaggccagg ggcagaggcc ttgccaggca 600
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ctccaagacc tcaggcttgt taagctgttg ggtagactct gtgggctctc tctcatccgc 780
ttcaagctca aaaaaaatgc tgttcagcac ctcccccacc ctgatgcggt cattgctcaa 840
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agatagtttc ttcatccagt tgagggagtt ttgctggaaa gtgagaccct ccaccttgtc 1020
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cagggagaag cccttcatct tcccttggaa gtggacgtag gtgttgaaag ccagggtgct 1260
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tgcagcgact agcaccagct ggtcctgtag ggccttttca tccacagggg atgtcttggc 1860
ctgaattgga gcaggtatga aggtggggtc tttgggcttc ccggcattgg cctttgccag 1920
ctgctcacag gtactctcat tgtggatgac gaggtggaag gggtgtatgt acacccggtc 1980
acctgcagcc aggccagccc aggccaggag gcagaggatg gtggccctca ggctcacacc 2040
ggcaggagcc atctcagact ggggtgctcg cttccgcata cccttctgct gtagtaccca 2100
gaacaacggc agcttcttcc cccggccggg tcacgatgcc ctatttatag ctgaggggtg 2160
gggatggagc tgttcccagg ctgcctgtgc acaggctgga gaggagggtt acatcacttg 2220
gccagaccac aggctggcca gaaggacaga tgccagaagc gacactcacg ctgggacctc 2280
ttccaggaag tcttagtgat cgatgcagag tttcactgct gaacagagtg agccggtgca 2340
gggtcgagtt acacatttac cgaagtttgc aggagtcggg gccaaggttc ccagaaacgg 2400
gagcatctcc ctaggtgtgt gacagcctga ggccaaccac ccaggccttc tgacccagcc 2460
ccgggagatg tacccccaag aggccacagg gacatgcagg ccggaggtgc agagggcaga 2520
gggcagggga gagtcttgct taggcaacac gggggccact tctgaccctg ctgcccgctc 2580
atgggat 2587
<210> 3
<211> 1834
<212> DNA
<213> 食蟹猴
<400> 3
aagaagctgc cattgttctg ggtactacag cagaagggta tgcagaagcg agcaccccag 60
tccgagatgg ctcctgccag cgtgagcctg agggccacca tcctctgcct cctggcctgg 120
gctggcctgg ccacaggtga ccgggtgtac atacacccct tccacctcgt catccacaat 180
gagagtacct gtgagcagct ggcaaaggcc gatgctggga agcccaaaga tcccaccttc 240
acacctgttc cgatacaggc caagacgtct cctgtggatg aaaaggccct gcaggaccag 300
ctagtgctgg ttgccgcaaa actcgacacc gaggacaagt tgagagccgc gatggtcggg 360
atgctggcca acttcttggg cttccgtata tatggcatgc acagtgagct atggggcgtg 420
gtccatgggg ccaccatcct ctccccaacg gctgtctttg gcaccctggc ctctctctac 480
ctgggagcgt tggaccacac agccgacagg ctacaggcaa tcctgggcgt cccttggaag 540
gacaagaact gcacctcccg gctggatgcg cacaaggtcc tctctgccct gcaggctgta 600
cagggcctgc tggtggccca gggcagggct gacggccagt cccagctgct gttgtccaca 660
gtggtgggtc tcttcacagc cccagatctg cacctgaagc agccgtttgt gcagggcctg 720
gctctctatg cccctgtggt cctcccacgc tctctggact tcacagacct ggaagtcgct 780
gctgagaaga ttgacaggtt catgcaggct gtgacaggat ggaagattag cagccccctg 840
acgggagcca gtgcggacag caccctggtt ttcaacacct acgtccattt ccaagggaag 900
atgagggact tcttcctgct ggctgagccc caggagttct gggtggacaa cagcacctca 960
gtgtctgtcc ccatgctgtc tggcgtgggc accttccagc actggagcga cgcccaggac 1020
aacttctcag tgactcaagt gccctttact gagagcgcct gcttgctgct gattcagcct 1080
cactacgcct ctgacctgga caaggtggag ggtctcactt tccagcaaaa ctccctcaac 1140
tggatgaaga aactgtctcc ccgggccatc cacctgacca tgccccgact ggtgctgcga 1200
ggatcttatg acctgcagga cctgcttgcc caggctgagc tgcccgccat tctgggcacc 1260
gagctgaacc tgcaaaaatt gagcaatgac aacctcaggg tggggaaggt gctgaacagc 1320
attctttttg aactcgaagc ggatgagaga gagcccacag agtctacccg acagctgaac 1380
aggcctgagt tcttggaggt gaccctggac cgcccattcc tgtttgctgt gtatgatcaa 1440
agtgccactg ccctgcactt cctgggccgt gtggccaacc cgctgagccc agcatgaggc 1500
cagggcccca gaacacagcg cctggcaagg cctctgcccc tggcctttga ggcgaaggcc 1560
agcagcagat atgtaactct ggaaaaacca gcgatttgtc acccccagtc tcccaccttt 1620
tcttctaatg agtcaacttc gagctggaaa gcagtcgttt ctccttggtc taagtggtgc 1680
tgcgtgagca gtaagaaacc tgtggcagca caaatgcgcc tcccaggttg ctgggtttat 1740
tttagagaat gggggtgggg aggcaagaac cagtgtttag cgcgggacca ccgttccaaa 1800
aagaattcca accgaccagc ttgtttgtga aaca 1834
<210> 4
<211> 1834
<212> DNA
<213> 食蟹猴
<400> 4
tgtttcacaa acaagctggt cggttggaat tctttttgga acggtggtcc cgcgctaaac 60
actggttctt gcctccccac ccccattctc taaaataaac ccagcaacct gggaggcgca 120
tttgtgctgc cacaggtttc ttactgctca cgcagcacca cttagaccaa ggagaaacga 180
ctgctttcca gctcgaagtt gactcattag aagaaaaggt gggagactgg gggtgacaaa 240
tcgctggttt ttccagagtt acatatctgc tgctggcctt cgcctcaaag gccaggggca 300
gaggccttgc caggcgctgt gttctggggc cctggcctca tgctgggctc agcgggttgg 360
ccacacggcc caggaagtgc agggcagtgg cactttgatc atacacagca aacaggaatg 420
ggcggtccag ggtcacctcc aagaactcag gcctgttcag ctgtcgggta gactctgtgg 480
gctctctctc atccgcttcg agttcaaaaa gaatgctgtt cagcaccttc cccaccctga 540
ggttgtcatt gctcaatttt tgcaggttca gctcggtgcc cagaatggcg ggcagctcag 600
cctgggcaag caggtcctgc aggtcataag atcctcgcag caccagtcgg ggcatggtca 660
ggtggatggc ccggggagac agtttcttca tccagttgag ggagttttgc tggaaagtga 720
gaccctccac cttgtccagg tcagaggcgt agtgaggctg aatcagcagc aagcaggcgc 780
tctcagtaaa gggcacttga gtcactgaga agttgtcctg ggcgtcgctc cagtgctgga 840
aggtgcccac gccagacagc atggggacag acactgaggt gctgttgtcc acccagaact 900
cctggggctc agccagcagg aagaagtccc tcatcttccc ttggaaatgg acgtaggtgt 960
tgaaaaccag ggtgctgtcc gcactggctc ccgtcagggg gctgctaatc ttccatcctg 1020
tcacagcctg catgaacctg tcaatcttct cagcagcgac ttccaggtct gtgaagtcca 1080
gagagcgtgg gaggaccaca ggggcataga gagccaggcc ctgcacaaac ggctgcttca 1140
ggtgcagatc tggggctgtg aagagaccca ccactgtgga caacagcagc tgggactggc 1200
cgtcagccct gccctgggcc accagcaggc cctgtacagc ctgcagggca gagaggacct 1260
tgtgcgcatc cagccgggag gtgcagttct tgtccttcca agggacgccc aggattgcct 1320
gtagcctgtc ggctgtgtgg tccaacgctc ccaggtagag agaggccagg gtgccaaaga 1380
cagccgttgg ggagaggatg gtggccccat ggaccacgcc ccatagctca ctgtgcatgc 1440
catatatacg gaagcccaag aagttggcca gcatcccgac catcgcggct ctcaacttgt 1500
cctcggtgtc gagttttgcg gcaaccagca ctagctggtc ctgcagggcc ttttcatcca 1560
caggagacgt cttggcctgt atcggaacag gtgtgaaggt gggatctttg ggcttcccag 1620
catcggcctt tgccagctgc tcacaggtac tctcattgtg gatgacgagg tggaaggggt 1680
gtatgtacac ccggtcacct gtggccaggc cagcccaggc caggaggcag aggatggtgg 1740
ccctcaggct cacgctggca ggagccatct cggactgggg tgctcgcttc tgcataccct 1800
tctgctgtag tacccagaac aatggcagct tctt 1834
<210> 5
<211> 1856
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 5
gatagctgtg cttgtctagg ttggcgctga aggatacaca gaagcaaatg cacagatcgg 60
agatgactcc cacgggggca ggcctgaagg ccaccatctt ctgcatcttg acctgggtca 120
gcctgacggc tggggaccgc gtatacatcc accccttcca tctcctttac cacaacaaga 180
gcacctgcgc ccagctggag aaccccagtg tggagacact cccagagtca acgttcgagc 240
ctgtgcccat tcaggccaag acctcccctg tgaatgagaa gaccctgcat gatcagctcg 300
tgctggccgc cgagaagcta gaggatgagg accggaagcg ggctgcccag gtcgcaatga 360
tcgccaactt cgtgggcttc cgcatgtaca agatgctgaa tgaggcagga agtggggcca 420
gtggggccat cctctcacca ccagctctct ttggcaccct ggtctctttc taccttggat 480
ccttagatcc cacggccagc cagctgcaga cgctgctgga tgtccctgtg aaggagggag 540
actgcacctc ccgactagat ggacacaagg tcctcgctgc cctgcgggcc attcagggct 600
tgctggtcac ccagggtggg agcagcagcc agacacccct gctacagtcc attgtggtgg 660
ggctcttcac tgctccaggc tttcgtctaa agcactcatt tgttcagagc ctggctctct 720
ttacccctgc cctcttccca cgctctctgg atttatccac tgacccagtt cttgccactg 780
agaaaatcaa caggttcata aaggctgtga cagggtggaa gatgaacttg ccactggagg 840
gggtcagtac agacagcacc ctacttttca acacctacgt tcacttccaa ggaacgatga 900
gaggtttctc tcagctgcct ggagtccatg aattctgggt ggacaacagc atctcggtgt 960
ctgtgcccat gatctccggc actggcaact tccagcactg gagtgacacc cagaacaact 1020
tctccgtgac gtgcgtgccc ctaggtgaga gagccaccct gctgctcatc cagccccact 1080
gcacctcaga tctcgacagg gtggaggccc tcatcttccg gaacgacctc ctgacttgga 1140
tagagaaccc gcctcctcgg gccatccgcc tgactctgcc ccagctggaa atccgaggat 1200
cctacaatct gcaggacctg ctggctgagg acaagctgcc cacccttttg ggtgcggagg 1260
caaatctgaa caacattggt gacaccaacc cccgagtggg agaggttctc aatagcatcc 1320
tcctcgaact caaagcagga gaggaggaac agccgaccac gtctgtccag cagcctggct 1380
caccggaggc actggatgtg accctgagca gccccttcct gttcgccatc tacgagcagg 1440
actcaggcac gctgcacttt ctgggcagag tgaataaccc ccagagtgtg gtgtgaggcc 1500
ttgtgcctag ccatggagac aaggccggtg tcggagaacc gttctgggca aaactcagtg 1560
ctgtcacccc tggctcccca tcacgccttg tagcgcggca gaggccgtct ccttggagac 1620
tgcgctgacc gagaataaat gatgagcagc agagcctcct gggatgtggg tttgtttgga 1680
tactggggtg acagccagaa gctggcactc tgcacaggac tgccactctg gaagaaattt 1740
ggaccaaaaa actgtttgtg acaccaaaaa gcaccccccc ttttttttat ttgaggacag 1800
aaattgggtt ttaacattaa aatgcacatt atccccttaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1856
<210> 6
<211> 1856
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 6
tttttttttt ttttttttaa ggggataatg tgcattttaa tgttaaaacc caatttctgt 60
cctcaaataa aaaaaagggg gggtgctttt tggtgtcaca aacagttttt tggtccaaat 120
ttcttccaga gtggcagtcc tgtgcagagt gccagcttct ggctgtcacc ccagtatcca 180
aacaaaccca catcccagga ggctctgctg ctcatcattt attctcggtc agcgcagtct 240
ccaaggagac ggcctctgcc gcgctacaag gcgtgatggg gagccagggg tgacagcact 300
gagttttgcc cagaacggtt ctccgacacc ggccttgtct ccatggctag gcacaaggcc 360
tcacaccaca ctctgggggt tattcactct gcccagaaag tgcagcgtgc ctgagtcctg 420
ctcgtagatg gcgaacagga aggggctgct cagggtcaca tccagtgcct ccggtgagcc 480
aggctgctgg acagacgtgg tcggctgttc ctcctctcct gctttgagtt cgaggaggat 540
gctattgaga acctctccca ctcgggggtt ggtgtcacca atgttgttca gatttgcctc 600
cgcacccaaa agggtgggca gcttgtcctc agccagcagg tcctgcagat tgtaggatcc 660
tcggatttcc agctggggca gagtcaggcg gatggcccga ggaggcgggt tctctatcca 720
agtcaggagg tcgttccgga agatgagggc ctccaccctg tcgagatctg aggtgcagtg 780
gggctggatg agcagcaggg tggctctctc acctaggggc acgcacgtca cggagaagtt 840
gttctgggtg tcactccagt gctggaagtt gccagtgccg gagatcatgg gcacagacac 900
cgagatgctg ttgtccaccc agaattcatg gactccaggc agctgagaga aacctctcat 960
cgttccttgg aagtgaacgt aggtgttgaa aagtagggtg ctgtctgtac tgaccccctc 1020
cagtggcaag ttcatcttcc accctgtcac agcctttatg aacctgttga ttttctcagt 1080
ggcaagaact gggtcagtgg ataaatccag agagcgtggg aagagggcag gggtaaagag 1140
agccaggctc tgaacaaatg agtgctttag acgaaagcct ggagcagtga agagccccac 1200
cacaatggac tgtagcaggg gtgtctggct gctgctccca ccctgggtga ccagcaagcc 1260
ctgaatggcc cgcagggcag cgaggacctt gtgtccatct agtcgggagg tgcagtctcc 1320
ctccttcaca gggacatcca gcagcgtctg cagctggctg gccgtgggat ctaaggatcc 1380
aaggtagaaa gagaccaggg tgccaaagag agctggtggt gagaggatgg ccccactggc 1440
cccacttcct gcctcattca gcatcttgta catgcggaag cccacgaagt tggcgatcat 1500
tgcgacctgg gcagcccgct tccggtcctc atcctctagc ttctcggcgg ccagcacgag 1560
ctgatcatgc agggtcttct cattcacagg ggaggtcttg gcctgaatgg gcacaggctc 1620
gaacgttgac tctgggagtg tctccacact ggggttctcc agctgggcgc aggtgctctt 1680
gttgtggtaa aggagatgga aggggtggat gtatacgcgg tccccagccg tcaggctgac 1740
ccaggtcaag atgcagaaga tggtggcctt caggcctgcc cccgtgggag tcatctccga 1800
tctgtgcatt tgcttctgtg tatccttcag cgccaaccta gacaagcaca gctatc 1856
<210> 7
<211> 1958
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 7
ccttgctcca tcttggctaa gcctggattc ccatggtccc ccgacctggg tcctccccca 60
gcctctgtac agagtagcct gggaatagat ccatcttcac cccctcgagt ataaataagg 120
ctgcttggtt caccagggga tagctgtgct tgtctgggct ggagctaaag gacacacaga 180
agcaagtcca cagatccgtg atgactccca cgggggcagg cctgaaggcc accatcttct 240
gcatcctgac ctgggtcagc ctgacagctg gggaccgcgt atacatccac ccctttcatc 300
tcctctacta cagcaagagc acctgcgccc agctggagaa ccccagtgtg gagacgctcc 360
cagagccaac ctttgagcct gtgcccattc aggccaagac ctcccccgtg gatgagaaga 420
ccctgcgaga taagctcgtg ctggccactg agaagctaga ggctgaggat cggcagcgag 480
ctgcccaggt cgcgatgatt gccaacttca tgggtttccg catgtacaag atgctgagtg 540
aggcaagagg tgtagccagt ggggccgtcc tctctccacc ggccctcttt ggcaccctgg 600
tctctttcta ccttggatcg ttggatccca cggccagcca gttgcaggtg ctgctgggcg 660
tccctgtgaa ggagggagac tgcacctccc ggctggacgg acataaggtc ctcactgccc 720
tgcaggctgt tcagggcttg ctggtcaccc agggtggaag cagcagccag acacccctgc 780
tacagtccac cgtggtgggc ctcttcactg ccccaggctt gcgcctaaaa cagccatttg 840
ttgagagctt gggtcccttc acccccgcca tcttccctcg ctctctggac ttatccactg 900
acccagttct tgctgcccag aaaatcaaca ggtttgtgca ggctgtgaca gggtggaaga 960
tgaacttgcc actagagggg gtcagcacgg acagcaccct atttttcaac acctacgttc 1020
acttccaagg gaagatgaga ggcttctccc agctgactgg gctccatgag ttctgggtgg 1080
acaacagcac ctcagtgtct gtgcccatgc tctcgggcac tggcaacttc cagcactgga 1140
gtgacgccca gaacaacttc tccgtgacac gcgtgcccct gggtgagagt gtcaccctgc 1200
tgctgatcca gccccagtgc gcctcagatc tcgacagggt ggaggtcctc gtcttccagc 1260
acgacttcct gacttggata aagaacccgc ctcctcgggc catccgtctg accctgccgc 1320
agctggaaat tcggggatcc tacaacctgc aggacctgct ggctcaggcc aagctgtcta 1380
cccttttggg tgctgaggca aatctgggca agatgggtga caccaacccc cgagtgggag 1440
aggttctcaa cagcatcctc cttgaactcc aagcaggcga ggaggagcag cccacagagt 1500
ctgcccagca gcctggctca cccgaggtgc tggacgtgac cctgagcagt ccgttcctgt 1560
tcgccatcta cgagcgggac tcaggtgcgc tgcactttct gggcagagtg gataaccccc 1620
aaaatgtggt gtgatgcctc ctgtgtagcc atggagacaa ggccagcgtc agagagctat 1680
cctgggcaaa aatcagtgcc ttcacccctg gcttcccgtc actccttcca gcaaggcaga 1740
ggccgtctcc ttggagatgg cgctaactga gaataaatga tgagcagcag cctcctgggg 1800
tgtgggtttg tttggacact ggggtgagag ccaggagctg gcactctgta taggaggact 1860
gccatcctgg aaaaaaaaaa tggaccaaac aactgtttgt gaaataaaaa aaaaaaaatt 1920
ccctttttat ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1958
<210> 8
<211> 1958
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 8
tttttttttt tttttttttt tttttcaaat aaaaagggaa tttttttttt tttatttcac 60
aaacagttgt ttggtccatt ttttttttcc aggatggcag tcctcctata cagagtgcca 120
gctcctggct ctcaccccag tgtccaaaca aacccacacc ccaggaggct gctgctcatc 180
atttattctc agttagcgcc atctccaagg agacggcctc tgccttgctg gaaggagtga 240
cgggaagcca ggggtgaagg cactgatttt tgcccaggat agctctctga cgctggcctt 300
gtctccatgg ctacacagga ggcatcacac cacattttgg gggttatcca ctctgcccag 360
aaagtgcagc gcacctgagt cccgctcgta gatggcgaac aggaacggac tgctcagggt 420
cacgtccagc acctcgggtg agccaggctg ctgggcagac tctgtgggct gctcctcctc 480
gcctgcttgg agttcaagga ggatgctgtt gagaacctct cccactcggg ggttggtgtc 540
acccatcttg cccagatttg cctcagcacc caaaagggta gacagcttgg cctgagccag 600
caggtcctgc aggttgtagg atccccgaat ttccagctgc ggcagggtca gacggatggc 660
ccgaggaggc gggttcttta tccaagtcag gaagtcgtgc tggaagacga ggacctccac 720
cctgtcgaga tctgaggcgc actggggctg gatcagcagc agggtgacac tctcacccag 780
gggcacgcgt gtcacggaga agttgttctg ggcgtcactc cagtgctgga agttgccagt 840
gcccgagagc atgggcacag acactgaggt gctgttgtcc acccagaact catggagccc 900
agtcagctgg gagaagcctc tcatcttccc ttggaagtga acgtaggtgt tgaaaaatag 960
ggtgctgtcc gtgctgaccc cctctagtgg caagttcatc ttccaccctg tcacagcctg 1020
cacaaacctg ttgattttct gggcagcaag aactgggtca gtggataagt ccagagagcg 1080
agggaagatg gcgggggtga agggacccaa gctctcaaca aatggctgtt ttaggcgcaa 1140
gcctggggca gtgaagaggc ccaccacggt ggactgtagc aggggtgtct ggctgctgct 1200
tccaccctgg gtgaccagca agccctgaac agcctgcagg gcagtgagga ccttatgtcc 1260
gtccagccgg gaggtgcagt ctccctcctt cacagggacg cccagcagca cctgcaactg 1320
gctggccgtg ggatccaacg atccaaggta gaaagagacc agggtgccaa agagggccgg 1380
tggagagagg acggccccac tggctacacc tcttgcctca ctcagcatct tgtacatgcg 1440
gaaacccatg aagttggcaa tcatcgcgac ctgggcagct cgctgccgat cctcagcctc 1500
tagcttctca gtggccagca cgagcttatc tcgcagggtc ttctcatcca cgggggaggt 1560
cttggcctga atgggcacag gctcaaaggt tggctctggg agcgtctcca cactggggtt 1620
ctccagctgg gcgcaggtgc tcttgctgta gtagaggaga tgaaaggggt ggatgtatac 1680
gcggtcccca gctgtcaggc tgacccaggt caggatgcag aagatggtgg ccttcaggcc 1740
tgcccccgtg ggagtcatca cggatctgtg gacttgcttc tgtgtgtcct ttagctccag 1800
cccagacaag cacagctatc ccctggtgaa ccaagcagcc ttatttatac tcgagggggt 1860
gaagatggat ctattcccag gctactctgt acagaggctg ggggaggacc caggtcgggg 1920
gaccatggga atccaggctt agccaagatg gagcaagg 1958
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注=“未知的描述：RFGF序列”
<400> 9
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注=“未知的描述：RFGF类似物序列”
<400> 10
Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒
<400> 11
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 果蝇属
<400> 12
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 13
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 14
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 15
uucuggguac uacagcaga 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 16
guacuacagc agaagggua 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 17
gugaccgggu guacauaca 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 18
cucgucaucc acaaugaga 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 19
ccacaaugag aguaccugu 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 20
cacaaugaga guaccugug 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 21
cugugagcag cuggcaaag 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 22
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<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 23
uggucgggau gcuggccaa 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 24
ucgggaugcu ggccaacuu 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 25
ggaugcuggc caacuucuu 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 26
uggccaacuu cuugggcuu 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 27
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 28
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 29
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<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 30
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<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 31
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 32
cuauggggcg ugguccaug 19
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 33
cuccccaacg gcugucuuu 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 34
uccccaacgg cugucuuug 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 35
cuuggaagga caagaacug 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 36
ccacgcucuc uggacuuca 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 37
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<210> 38
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 38
cugcugagaa gauugacag 19
<210> 39
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 39
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 40
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<210> 41
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 41
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<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 42
uugacagguu caugcaggc 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 43
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 44
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<210> 45
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 45
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 46
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 47
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 48
uggacaaggu ggagggucu 19
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 49
caagguggag ggucucacu 19
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 50
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<210> 51
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 51
cuuuccagca aaacucccu 19
<210> 52
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 52
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<210> 53
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 53
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<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 54
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<210> 55
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 55
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 56
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 57
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 58
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 59
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 60
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 65
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<400> 67
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 68
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 69
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 70
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<210> 71
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 71
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<210> 72
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 72
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<210> 73
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 73
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 74
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 75
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<210> 76
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 76
caccuuuucu ucuaaugag 19
<210> 77
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 77
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<210> 78
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 78
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 79
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 80
gcuggguuua uuuuagaga 19
<210> 81
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 81
cuggguuuau uuuagagaa 19
<210> 82
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 82
uggguuuauu uuagagaau 19
<210> 83
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 83
guuuauuuua gagaauggg 19
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 84
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<210> 85
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 85
uggggaggca agaaccagu 19
<210> 86
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 86
ggaggcaaga accaguguu 19
<210> 87
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 87
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<210> 88
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 88
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<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 89
ccaaccgacc agcuuguuu 19
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 90
ccgaccagcu uguuuguga 19
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 91
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<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 92
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<210> 93
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 93
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<210> 94
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 94
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<210> 95
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 95
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 96
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 97
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 98
ugaaacaaaa aaguguucc 19
<210> 99
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 99
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<210> 100
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 100
aaaaaguguu cccuuuuca 19
<210> 101
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 101
aaaaguguuc ccuuuucaa 19
<210> 102
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 102
uucccuuuuc aaguugaga 19
<210> 103
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 103
ccuuuucaag uugagaaca 19
<210> 104
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 104
uuucaaguug agaacaaaa 19
<210> 105
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 105
uucaaguuga gaacaaaaa 19
<210> 106
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 106
caaguugaga acaaaaauu 19
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 107
aguugagaac aaaaauugg 19
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 108
guugagaaca aaaauuggg 19
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 109
ugagaacaaa aauuggguu 19
<210> 110
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 110
gagaacaaaa auuggguuu 19
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 111
gaacaaaaau uggguuuua 19
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 112
aacaaaaauu ggguuuuaa 19
<210> 113
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 113
acaaaaauug gguuuuaaa 19
<210> 114
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 114
caaaaauugg guuuuaaaa 19
<210> 115
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 115
auuggguuuu aaaauuaaa 19
<210> 116
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 116
uuggguuuua aaauuaaag 19
<210> 117
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 117
uggguuuuaa aauuaaagu 19
<210> 118
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 118
uuuaaaauua aaguauaca 19
<210> 119
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 119
uuaaaauuaa aguauacau 19
<210> 120
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 120
uuguauuuag ugucuugaa 19
<210> 121
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 121
uguauuuagu gucuugaau 19
<210> 122
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 122
uagugucuug aauguaaga 19
<210> 123
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 123
cuugaaugua agaacauga 19
<210> 124
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 124
uugaauguaa gaacaugac 19
<210> 125
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 125
cuuaguuuuu uccacagau 19
<210> 126
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 126
ccacagaugc uugugauuu 19
<210> 127
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 127
acagaugcuu gugauuuuu 19
<210> 128
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 128
cugaauuucu guuugaaug 19
<210> 129
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 129
aaccauagcu gguuauuuc 19
<210> 130
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 130
ccauagcugg uuauuucuc 19
<210> 131
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 131
ucugcuguag uacccagaa 19
<210> 132
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 132
uacccuucug cuguaguac 19
<210> 133
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 133
uguauguaca cccggucac 19
<210> 134
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 134
ucucauugug gaugacgag 19
<210> 135
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 135
acagguacuc ucauugugg 19
<210> 136
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 136
cacagguacu cucauugug 19
<210> 137
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 137
cuuugccagc ugcucacag 19
<210> 138
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 138
agggccuuuu cauccacag 19
<210> 139
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 139
uuggccagca ucccgacca 19
<210> 140
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 140
aaguuggcca gcaucccga 19
<210> 141
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 141
aagaaguugg ccagcaucc 19
<210> 142
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 142
aagcccaaga aguuggcca 19
<210> 143
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 143
uauacggaag cccaagaag 19
<210> 144
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 144
auauauacgg aagcccaag 19
<210> 145
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 145
augccauaua uacggaagc 19
<210> 146
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 146
cugugcaugc cauauauac 19
<210> 147
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 147
auagcucacu gugcaugcc 19
<210> 148
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 148
cauggaccac gccccauag 19
<210> 149
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 149
aaagacagcc guuggggag 19
<210> 150
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 150
caaagacagc cguugggga 19
<210> 151
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 151
caguucuugu ccuuccaag 19
<210> 152
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 152
ugaaguccag agagcgugg 19
<210> 153
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 153
ugucaaucuu cucagcagc 19
<210> 154
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 154
cugucaaucu ucucagcag 19
<210> 155
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 155
ccugucaauc uucucagca 19
<210> 156
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 156
accugucaau cuucucagc 19
<210> 157
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 157
aaccugucaa ucuucucag 19
<210> 158
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 158
gccugcauga accugucaa 19
<210> 159
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 159
ucuuccaucc ugucacagc 19
<210> 160
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 160
uguuguccac ccagaacuc 19
<210> 161
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 161
ggugcuguug uccacccag 19
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 162
acugaggugc uguugucca 19
<210> 163
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 163
agacacugag gugcuguug 19
<210> 164
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 164
agacccucca ccuugucca 19
<210> 165
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 165
agugagaccc uccaccuug 19
<210> 166
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 166
aaagugagac ccuccaccu 19
<210> 167
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 167
agggaguuuu gcuggaaag 19
<210> 168
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 168
guugagggag uuuugcugg 19
<210> 169
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 169
aguugaggga guuuugcug 19
<210> 170
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 170
uccaguugag ggaguuuug 19
<210> 171
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 171
ucuucaucca guugaggga 19
<210> 172
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 172
uucuucaucc aguugaggg 19
<210> 173
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 173
aguuucuuca uccaguuga 19
<210> 174
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 174
uuuugcaggu ucagcucgg 19
<210> 175
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 175
uuuuugcagg uucagcucg 19
<210> 176
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 176
gcucaauuuu ugcagguuc 19
<210> 177
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 177
uugcucaauu uuugcaggu 19
<210> 178
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 178
auugcucaau uuuugcagg 19
<210> 179
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 179
cauugcucaa uuuuugcag 19
<210> 180
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 180
ucauugcuca auuuuugca 19
<210> 181
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 181
gucauugcuc aauuuuugc 19
<210> 182
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 182
uucagcaccu cccccaccc 19
<210> 183
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 183
ugugggcucu cucucaucc 19
<210> 184
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 184
agcaaacagg aaugggcgg 19
<210> 185
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 185
auacacagca aacaggaau 19
<210> 186
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 186
ucauacacag caaacagga 19
<210> 187
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 187
uugaucauac acagcaaac 19
<210> 188
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 188
uuugaucaua cacagcaaa 19
<210> 189
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 189
aaagguggga gacuggggg 19
<210> 190
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 190
cauuagaaga aaagguggg 19
<210> 191
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 191
ucauuagaag aaaaggugg 19
<210> 192
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 192
cucauuagaa gaaaaggug 19
<210> 193
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 193
acuuagacca aggagaaac 19
<210> 194
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 194
ucuaaaauaa acccagcaa 19
<210> 195
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 195
cucuaaaaua aacccagca 19
<210> 196
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 196
ucucuaaaau aaacccagc 19
<210> 197
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 197
uucucuaaaa uaaacccag 19
<210> 198
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 198
auucucuaaa auaaaccca 19
<210> 199
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 199
cccauucucu aaaauaaac 19
<210> 200
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 200
acccccauuc ucuaaaaua 19
<210> 201
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 201
acugguucuu gccucccca 19
<210> 202
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 202
aacacugguu cuugccucc 19
<210> 203
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 203
gguuggaauu cuuuuugga 19
<210> 204
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 204
ucgguuggaa uucuuuuug 19
<210> 205
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 205
aaacaagcug gucgguugg 19
<210> 206
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 206
ucacaaacaa gcuggucgg 19
<210> 207
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 207
uucacaaaca agcuggucg 19
<210> 208
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 208
uuucacaaac aagcugguc 19
<210> 209
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 209
uuuuguuuca caaacaagc 19
<210> 210
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 210
uuuuuguuuc acaaacaag 19
<210> 211
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 211
uuuuuuguuu cacaaacaa 19
<210> 212
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 212
acuuuuuugu uucacaaac 19
<210> 213
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 213
acacuuuuuu guuucacaa 19
<210> 214
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 214
ggaacacuuu uuuguuuca 19
<210> 215
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 215
aaaagggaac acuuuuuug 19
<210> 216
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 216
ugaaaaggga acacuuuuu 19
<210> 217
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 217
uugaaaaggg aacacuuuu 19
<210> 218
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 218
ucucaacuug aaaagggaa 19
<210> 219
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 219
uguucucaac uugaaaagg 19
<210> 220
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 220
uuuuguucuc aacuugaaa 19
<210> 221
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 221
uuuuuguucu caacuugaa 19
<210> 222
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 222
aauuuuuguu cucaacuug 19
<210> 223
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 223
ccaauuuuug uucucaacu 19
<210> 224
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 224
cccaauuuuu guucucaac 19
<210> 225
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 225
aacccaauuu uuguucuca 19
<210> 226
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 226
aaacccaauu uuuguucuc 19
<210> 227
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 227
uaaaacccaa uuuuuguuc 19
<210> 228
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 228
uuaaaaccca auuuuuguu 19
<210> 229
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 229
uuuaaaaccc aauuuuugu 19
<210> 230
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 230
uuuuaaaacc caauuuuug 19
<210> 231
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 231
uuuaauuuua aaacccaau 19
<210> 232
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 232
cuuuaauuuu aaaacccaa 19
<210> 233
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 233
acuuuaauuu uaaaaccca 19
<210> 234
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 234
uguauacuuu aauuuuaaa 19
<210> 235
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 235
auguauacuu uaauuuuaa 19
<210> 236
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 236
uucaagacac uaaauacaa 19
<210> 237
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 237
auucaagaca cuaaauaca 19
<210> 238
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 238
ucuuacauuc aagacacua 19
<210> 239
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 239
ucauguucuu acauucaag 19
<210> 240
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 240
gucauguucu uacauucaa 19
<210> 241
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 241
aucuguggaa aaaacuaag 19
<210> 242
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 242
aaaucacaag caucugugg 19
<210> 243
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 243
aaaaaucaca agcaucugu 19
<210> 244
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 244
cauucaaaca gaaauucag 19
<210> 245
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 245
gaaauaacca gcuaugguu 19
<210> 246
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 246
gagaaauaac cagcuaugg 19
<210> 247
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 247
uucuggguac uacagcagat t 21
<210> 248
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 248
guacuacagc agaaggguat t 21
<210> 249
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 249
gugaccgggu guacauacat t 21
<210> 250
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 250
cucgucaucc acaaugagat t 21
<210> 251
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 251
ccacaaugag aguaccugut t 21
<210> 252
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 252
cacaaugaga guaccugugt t 21
<210> 253
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 253
cugugagcag cuggcaaagt t 21
<210> 254
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 254
cuguggauga aaaggcccut t 21
<210> 255
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 255
uggucgggau gcuggccaat t 21
<210> 256
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 256
ucgggaugcu ggccaacuut t 21
<210> 257
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 257
ggaugcuggc caacuucuut t 21
<210> 258
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 258
uggccaacuu cuugggcuut t 21
<210> 259
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<213> 人工序列
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 260
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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cugagaagau ugacagguut t 21
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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cugcaaaaau ugagcaaugt t 21
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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uugcuggguu uauuuuagat t 21
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<213> 人工序列
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 374
aagcccaaga aguuggccat t 21
<210> 375
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 375
uauacggaag cccaagaagt t 21
<210> 376
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 376
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<210> 377
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 377
augccauaua uacggaagct t 21
<210> 378
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 378
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 379
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 380
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 382
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 383
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 384
ugaaguccag agagcguggt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 385
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 386
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 387
ccugucaauc uucucagcat t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 388
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 394
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 395
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<210> 396
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 396
agacccucca ccuuguccat t 21
<210> 397
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 397
agugagaccc uccaccuugt t 21
<210> 398
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 398
aaagugagac ccuccaccut t 21
<210> 399
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 399
agggaguuuu gcuggaaagt t 21
<210> 400
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 400
guugagggag uuuugcuggt t 21
<210> 401
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 401
aguugaggga guuuugcugt t 21
<210> 402
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 402
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<210> 403
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 405
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 406
uuuugcaggu ucagcucggt t 21
<210> 407
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 407
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<210> 408
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 408
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 409
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 410
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 412
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<211> 21
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 413
gucauugcuc aauuuuugct t 21
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<211> 21
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 414
uucagcaccu cccccaccct t 21
<210> 415
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 415
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<210> 416
<211> 21
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 416
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<210> 417
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 417
auacacagca aacaggaaut t 21
<210> 418
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 418
ucauacacag caaacaggat t 21
<210> 419
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 419
uugaucauac acagcaaact t 21
<210> 420
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 420
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<210> 421
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 421
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<210> 422
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 422
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<210> 423
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 423
ucauuagaag aaaagguggt t 21
<210> 424
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 424
cucauuagaa gaaaaggugt t 21
<210> 425
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 425
acuuagacca aggagaaact t 21
<210> 426
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 427
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<211> 21
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 428
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<211> 21
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 429
uucucuaaaa uaaacccagt t 21
<210> 430
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 430
auucucuaaa auaaacccat t 21
<210> 431
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 464
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 465
acuuuaauuu uaaaacccat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 470
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 483
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<211> 21
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 490
uccagcaaaa cucccucaac u 21
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 491
acucccucaa cuggaugaag a 21
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 492
cugaaccugc aaaaauugag a 21
<210> 493
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 493
gaaccugcaa aaauugagca a 21
<210> 494
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 494
accugcaaaa auugagcaau a 21
<210> 495
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 495
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<210> 496
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 496
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<210> 497
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 497
uguuugcugu guaugaucaa a 21
<210> 498
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 498
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<210> 499
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 499
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<210> 500
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 500
cccaccuuuu cuucuaauga a 21
<210> 501
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 501
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<210> 502
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 502
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<210> 503
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 503
accgaccagc uuguuuguga a 21
<210> 504
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 504
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<210> 505
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 505
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<210> 506
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 506
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<210> 507
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 507
uguucccuuu ucaaguugag a 21
<210> 508
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 508
aaguugagaa caaaaauugg a 21
<210> 509
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 509
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<210> 510
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 510
agaacaaaaa uuggguuuua a 21
<210> 511
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 511
gaacaaaaau uggguuuuaa a 21
<210> 512
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 512
guuuguauuu agugucuuga a 21
<210> 513
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 513
uuuguauuua gugucuugaa u 21
<210> 514
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 514
gucuugaaug uaagaacaug a 21
<210> 515
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 515
ucuugaaugu aagaacauga a 21
<210> 516
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 516
uuccacagau gcuugugauu u 21
<210> 517
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 517
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<210> 518
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 518
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<210> 519
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 519
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<210> 520
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 520
uugugcaugc cauauauacg gaa 23
<210> 521
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 521
uauggaccac gccccauagc uca 23
<210> 522
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 522
aaagacagcc guuggggaga gga 23
<210> 523
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 523
uaaagacagc cguuggggag agg 23
<210> 524
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 524
uccauccugu cacagccugc aug 23
<210> 525
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 525
agacccucca ccuuguccag guc 23
<210> 526
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 526
agugagaccc uccaccuugu cca 23
<210> 527
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 527
aaagugagac ccuccaccuu guc 23
<210> 528
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 528
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<210> 529
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 529
ucuucaucca guugagggag uuu 23
<210> 530
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 530
ucucaauuuu ugcagguuca gcu 23
<210> 531
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 531
uugcucaauu uuugcagguu cag 23
<210> 532
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 532
uauugcucaa uuuuugcagg uuc 23
<210> 533
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 533
ucauugcuca auuuuugcag guu 23
<210> 534
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 534
ugugggcucu cucucauccg cuu 23
<210> 535
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 535
uuugaucaua cacagcaaac agg 23
<210> 536
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 536
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<210> 537
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 537
auuagaagaa aaggugggag acu 23
<210> 538
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 538
uucauuagaa gaaaaggugg gag 23
<210> 539
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 539
ucgguuggaa uucuuuuugg aac 23
<210> 540
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 540
aaacaagcug gucgguugga auu 23
<210> 541
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 541
uucacaaaca agcuggucgg uug 23
<210> 542
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 542
uuuguuucac aaacaagcug guc 23
<210> 543
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 543
uuuuguuuca caaacaagcu ggu 23
<210> 544
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 544
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<210> 545
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 545
ucucaacuug aaaagggaac acu 23
<210> 546
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 546
uccaauuuuu guucucaacu uga 23
<210> 547
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 547
acccaauuuu uguucucaac uug 23
<210> 548
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 548
uuaaaaccca auuuuuguuc uca 23
<210> 549
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 549
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<210> 550
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 550
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<210> 551
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 551
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<210> 552
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 552
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<210> 553
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 553
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<210> 554
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 554
aaaucacaag caucugugga aaa 23
<210> 555
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 555
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 556
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<210> 557
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 557
uccagcaaaa cucccucaac u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 558
acucccucaa cuggaugaag a 21
<210> 559
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 559
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<210> 560
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 560
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 561
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<210> 562
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 562
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 563
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<210> 564
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 564
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 565
gaacaaaaau uggguuuuaa a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 566
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 567
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 568
uuccaaccga ccagcuuguu u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 569
ucucccaccu uuucuucuaa u 21
<210> 570
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 570
accugcaaaa auugagcaau a 21
<210> 571
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 571
guuuguauuu agugucuuga a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 572
cucuccccaa cggcugucuu u 21
<210> 573
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 573
accgaccagc uuguuuguga a 21
<210> 574
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 574
ccagcuuguu ugugaaacaa a 21
<210> 575
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 575
uuuguauuua gugucuugaa u 21
<210> 576
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 576
aguugagaac aaaaauuggg u 21
<210> 577
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 577
caagguggag ggucucacuu u 21
<210> 578
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 578
cacccccagu cucccaccuu u 21
<210> 579
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 579
ugcaggcugu gacaggaugg a 21
<210> 580
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 580
uccaaaaaga auuccaaccg a 21
<210> 581
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 581
ccuggacaag guggaggguc u 21
<210> 582
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 582
ccguauauau ggcaugcaca a 21
<210> 583
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 583
uguucccuuu ucaaguugag a 21
<210> 584
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 584
gcggaugaga gagagcccac a 21
<210> 585
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 585
gaaccugcaa aaauugagca a 21
<210> 586
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 586
aaguugagaa caaaaauugg a 21
<210> 587
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 587
ccugcaaaaa uugagcaaug a 21
<210> 588
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 588
cgggaugcug gccaacuucu u 21
<210> 589
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 589
ucuugaaugu aagaacauga a 21
<210> 590
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 590
uuccacagau gcuugugauu u 21
<210> 591
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 591
agcuaugggg cgugguccau a 21
<210> 592
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 592
ucuccccaac ggcugucuuu a 21
<210> 593
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 593
uuuuguuuca caaacaagcu ggu 23
<210> 594
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 594
uuaaaaccca auuuuuguuc uca 23
<210> 595
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 595
aguugaggga guuuugcugg aaa 23
<210> 596
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 596
ucuucaucca guugagggag uuu 23
<210> 597
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 597
ucauguucuu acauucaaga cac 23
<210> 598
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 598
uauacggaag cccaagaagu ugg 23
<210> 599
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 599
uugaaaaggg aacacuuuuu ugu 23
<210> 600
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 600
uucauuagaa gaaaaggugg gag 23
<210> 601
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 601
agugagaccc uccaccuugu cca 23
<210> 602
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 602
uugcaugcca uauauacgga agc 23
<210> 603
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 603
uuuaaaaccc aauuuuuguu cuc 23
<210> 604
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 604
uuugaucaua cacagcaaac agg 23
<210> 605
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 605
ucucaauuuu ugcagguuca gcu 23
<210> 606
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 606
aaacaagcug gucgguugga auu 23
<210> 607
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 607
auuagaagaa aaggugggag acu 23
<210> 608
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 608
uauugcucaa uuuuugcagg uuc 23
<210> 609
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 609
uucaagacac uaaauacaaa ccg 23
<210> 610
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 610
aaagacagcc guuggggaga gga 23
<210> 611
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 611
uucacaaaca agcuggucgg uug 23
<210> 612
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 612
uuuguuucac aaacaagcug guc 23
<210> 613
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 613
auucaagaca cuaaauacaa acc 23
<210> 614
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 614
acccaauuuu uguucucaac uug 23
<210> 615
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 615
aaagugagac ccuccaccuu guc 23
<210> 616
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 616
aaagguggga gacugggggu gac 23
<210> 617
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 617
uccauccugu cacagccugc aug 23
<210> 618
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 618
ucgguuggaa uucuuuuugg aac 23
<210> 619
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 619
agacccucca ccuuguccag guc 23
<210> 620
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 620
uugugcaugc cauauauacg gaa 23
<210> 621
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 621
ucucaacuug aaaagggaac acu 23
<210> 622
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 622
ugugggcucu cucucauccg cuu 23
<210> 623
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 623
uugcucaauu uuugcagguu cag 23
<210> 624
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 624
uccaauuuuu guucucaacu uga 23
<210> 625
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 625
ucauugcuca auuuuugcag guu 23
<210> 626
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 626
aagaaguugg ccagcauccc gac 23
<210> 627
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 627
uucauguucu uacauucaag aca 23
<210> 628
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 628
aaaucacaag caucugugga aaa 23
<210> 629
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 629
uauggaccac gccccauagc uca 23
<210> 630
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 630
uaaagacagc cguuggggag agg 23
<210> 631
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 631
cgggcagcag ggucagaaa 19
<210> 632
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 632
ucagaagugg cccccgugu 19
<210> 633
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 633
cccguguugc cuaagcaaa 19
<210> 634
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 634
ugcaccuccg gccugcaua 19
<210> 635
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 635
ugcauguccc uguggccua 19
<210> 636
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 636
uguggccucu uggggguaa 19
<210> 637
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 637
ggucagaagg ccuggguga 19
<210> 638
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 638
ugggugguug gccucagga 19
<210> 639
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 639
ccucaggcug ucacacaca 19
<210> 640
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 640
cacacaccua gggagauga 19
<210> 641
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 641
agggagaugc ucccguuua 19
<210> 642
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 642
ccguuucugg gaaccuuga 19
<210> 643
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 643
aaccuuggcc ccgacuccu 19
<210> 644
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 644
cgacuccugc aaacuucga 19
<210> 645
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 645
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<210> 646
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 646
uguguaacuc gacccugca 19
<210> 647
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 647
acccugcacc ggcucacua 19
<210> 648
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 648
gcucacucug uucagcagu 19
<210> 649
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 649
uucagcagug aaacucuga 19
<210> 650
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 650
aaacucugca ucgaucacu 19
<210> 651
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 651
cgaucacuaa gacuuccua 19
<210> 652
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 652
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<210> 653
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 653
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<210> 654
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 654
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<210> 655
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 655
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 656
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<210> 657
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 657
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<210> 658
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 658
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<210> 659
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 659
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 662
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 663
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 664
aucgugaccc ggccgggga 19
<210> 665
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 665
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 666
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 667
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<210> 668
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 668
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 669
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<210> 670
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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cgagcacccc agucugaga 19
<210> 671
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 671
cuccugccgg ugugagccu 19
<210> 672
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 672
ugugagccug agggccaca 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 673
gggccaccau ccucugccu 19
<210> 674
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 674
cugccuccug gccugggcu 19
<210> 675
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 675
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<210> 676
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 676
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<210> 677
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 677
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 678
uuccaccucg ucauccaca 19
<210> 679
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 679
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 680
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 681
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 682
aaagacccca ccuucauaa 19
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<220>
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 688
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 689
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 692
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 694
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 695
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 696
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 697
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 698
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 699
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<211> 19
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 700
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 701
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 702
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<210> 703
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 703
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 707
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<211> 19
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 708
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 709
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<210> 710
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 710
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<210> 711
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 712
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<210> 713
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 713
agcugcugcu guccacggu 19
<210> 714
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 714
ugggcguguu cacagccca 19
<210> 715
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 715
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 716
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 717
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 718
ugcagggccu ggcucucua 19
<210> 719
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 719
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 720
accccugugg uccucccaa 19
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 721
cuggacuuca cagaacuga 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 722
agaacuggau guugcugcu 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 723
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 724
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 725
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 726
gcugugacag gauggaaga 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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uguggacagc acccuggcu 19
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 731
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 732
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 733
gggaagauga agggcuucu 19
<210> 734
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 734
gcuucucccu gcuggccga 19
<210> 735
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 735
ccaggaguuc uggguggaa 19
<210> 736
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 736
uggguggaca acagcaccu 19
<210> 737
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 737
acagcaccuc agugucugu 19
<210> 738
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 738
ugucuguucc caugcucua 19
<210> 739
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 739
caugcucucu ggcauggga 19
<210> 740
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 740
augggcaccu uccagcacu 19
<210> 741
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 741
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<210> 742
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 742
aggacaacuu cucggugaa 19
<210> 743
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 743
ucggugacuc aagugcccu 19
<210> 744
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 744
ugcccuucac ugagagcga 19
<210> 745
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 745
ugagagcgcc ugccugcua 19
<210> 746
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 746
ccugcugcug auccagccu 19
<210> 747
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 747
auccagccuc acuaugccu 19
<210> 748
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 748
uaugccucug accuggaca 19
<210> 749
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 749
accuggacaa gguggagga 19
<210> 750
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 750
uggagggucu cacuuucca 19
<210> 751
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 751
cacuuuccag caaaacuca 19
<210> 752
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 752
aaaacucccu caacuggau 19
<210> 753
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 753
aacuggauga agaaacuau 19
<210> 754
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 754
aaacuaucuc cccggacca 19
<210> 755
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 755
ccggaccauc caccugaca 19
<210> 756
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 756
ugccccaacu ggugcugca 19
<210> 757
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 757
ugcugcaagg aucuuauga 19
<210> 758
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 758
ucuuaugacc ugcaggaca 19
<210> 759
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 759
ugcaggaccu gcucgccca 19
<210> 760
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 760
ucgcccaggc ugagcugca 19
<210> 761
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 761
ugagcugccc gccauucua 19
<210> 762
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 762
ugcaaaaauu gagcaauga 19
<210> 763
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 763
agcaaugacc gcaucagga 19
<210> 764
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 764
caucagggug ggggaggua 19
<210> 765
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 765
ggggaggugc ugaacagca 19
<210> 766
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 766
aacagcauuu uuuuugaga 19
<210> 767
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 767
uuuuugagcu ugaagcgga 19
<210> 768
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 768
agagucuacc caacagcuu 19
<210> 769
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 769
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<210> 770
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 770
caagccugag gucuuggaa 19
<210> 771
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 771
cuuggaggug acccugaaa 19
<210> 772
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 772
acccugaacc gcccauuca 19
<210> 773
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 773
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<210> 774
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 774
cacuuccugg gccgcguga 19
<210> 775
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 775
cgcguggcca acccgcuga 19
<210> 776
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 776
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<210> 777
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 777
acagcaugag gccagggca 19
<210> 778
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 778
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<210> 779
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 779
ucugccccug gccuuugaa 19
<210> 780
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 780
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<210> 781
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 781
aggccagcag cagauaaca 19
<210> 782
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 782
agauaacaac cccggacaa 19
<210> 783
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 783
ccggacaaau cagcgaugu 19
<210> 784
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 784
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<210> 785
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 785
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<210> 786
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 786
guuucuccuu ggucuaagu 19
<210> 787
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 787
agccugcagc ggcacaaau 19
<210> 788
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 788
cacaaaugca ccucccagu 19
<210> 789
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 789
accucccagu uugcugggu 19
<210> 790
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 790
ugcuggguuu auuuuagaa 19
<210> 791
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 791
caagaaccag uguuuagca 19
<210> 792
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 792
aguguucccu uuucaaguu 19
<210> 793
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 793
uucaaguuga gaacaaaaa 19
<210> 794
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 794
caaaaauugg guuuuaaaa 19
<210> 795
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 795
aaaguauaca uuuuugcau 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 796
uuuagugucu ugaauguaa 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 797
gaauguaaga acaugaccu 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 798
uguagugucu guaauaccu 19
<210> 799
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 799
uguaauaccu uaguuuuuu 19
<210> 800
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 800
uuuuuuccac agaugcuua 19
<210> 801
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 801
uuuuugaaca auacgugaa 19
<210> 802
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 802
accauagcug guuauuucu 19
<210> 803
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 803
uuauuucucc cuuguguua 19
<210> 804
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 804
ucccaccuuu ucuucuaau 19
<210> 805
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 805
ucgacuuuga gcuggaaag 19
<210> 806
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 806
cuggaaagca gccguuucu 19
<210> 807
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 807
uggucuaagu gugcugcau 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 808
gcugcaugga gugagcagu 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 809
ugagcaguag aagccugca 19
<210> 810
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 810
uuagagaaug gggguggga 19
<210> 811
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 811
ggguggggag gcaagaaca 19
<210> 812
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 812
uguuuagcgc gggacuacu 19
<210> 813
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 813
ggacuacugu uccaaaaag 19
<210> 814
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 814
agcuuguuug ugaaacaaa 19
<210> 815
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 815
aaacaaaaaa guguucccu 19
<210> 816
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 816
uuuuaaaauu aaaguauaa 19
<210> 817
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 817
uuuugcauug ccuucgguu 19
<210> 818
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 818
uucgguuugu auuuagugu 19
<210> 819
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 819
aacaugaccu ccguguagu 19
<210> 820
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 820
cagaugcuug ugauuuuua 19
<210> 821
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 821
uacgugaaag augcaagca 19
<210> 822
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 822
ugcaagcacc ugaauuucu 19
<210> 823
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 823
gaauuucugu uugaaugca 19
<210> 824
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 824
uuugaaugcg gaaccauaa 19
<210> 825
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 825
uuguguuagu aauaaacgu 19
<210> 826
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 826
auaaacgucu ugccacaau 19
<210> 827
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 827
ugccacaaua agccuccaa 19
<210> 828
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 828
uuucugaccc ugcugcccg 19
<210> 829
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 829
acacgggggc cacuucuga 19
<210> 830
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<400> 830
uuugcuuagg caacacggg 19
<210> 831
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 831
uaugcaggcc ggaggugca 19
<210> 832
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 832
uaggccacag ggacaugca 19
<210> 833
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 833
uuacccccaa gaggccaca 19
<210> 834
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 834
ucacccaggc cuucugacc 19
<210> 835
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 835
uccugaggcc aaccaccca 19
<210> 836
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 836
ugugugugac agccugagg 19
<210> 837
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 837
ucaucucccu aggugugug 19
<210> 838
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 838
uaaacgggag caucucccu 19
<210> 839
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 839
ucaagguucc cagaaacgg 19
<210> 840
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 840
aggagucggg gccaagguu 19
<210> 841
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 841
ucgaaguuug caggagucg 19
<210> 842
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 842
uuacacauuu accgaaguu 19
<210> 843
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 843
ugcagggucg aguuacaca 19
<210> 844
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 844
uagugagccg gugcagggu 19
<210> 845
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 845
acugcugaac agagugagc 19
<210> 846
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 846
ucagaguuuc acugcugaa 19
<210> 847
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 847
agugaucgau gcagaguuu 19
<210> 848
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 848
uaggaagucu uagugaucg 19
<210> 849
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 849
acacucacgc ugggaccuc 19
<210> 850
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 850
agaaggacag augccagaa 19
<210> 851
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 851
ucacaggcug gccagaagg 19
<210> 852
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 852
uuuggccaga ccacaggcu 19
<210> 853
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 853
aggguuacau cacuuggcc 19
<210> 854
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 854
ucuggagagg aggguuaca 19
<210> 855
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 855
ucugugcaca ggcuggaga 19
<210> 856
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 856
uucccaggcu gccugugca 19
<210> 857
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 857
ugauggagcu guucccagg 19
<210> 858
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 858
ucugaggggu ggggaugga 19
<210> 859
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 859
uccuauuuau agcugaggg 19
<210> 860
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 860
ugucacgaug cccuauuua 19
<210> 861
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 861
uccccggccg ggucacgau 19
<210> 862
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 862
uggcagcuuc uucccccgg 19
<210> 863
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 863
acccagaaca acggcagcu 19
<210> 864
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 864
ucugcuguag uacccagaa 19
<210> 865
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 865
ugcauacccu ucugcugua 19
<210> 866
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 866
uggugcucgc uuccgcaua 19
<210> 867
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 867
ucucagacug gggugcucg 19
<210> 868
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 868
aggcucacac cggcaggag 19
<210> 869
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 869
uguggcccuc aggcucaca 19
<210> 870
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 870
aggcagagga ugguggccc 19
<210> 871
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 871
agcccaggcc aggaggcag 19
<210> 872
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 872
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<210> 873
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 873
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<210> 874
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 874
uguggaaggg guguaugua 19
<210> 875
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 875
uguggaugac gagguggaa 19
<210> 876
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 876
uuacucucau uguggauga 19
<210> 877
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 877
uuucccggca uuggccuuu 19
<210> 878
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 878
uggucuuugg gcuucccgg 19
<210> 879
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 879
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<210> 880
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 880
auuggagcag guaugaagg 19
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 881
uucuuggccu gaauuggag 19
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 882
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 883
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<210> 884
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 884
ugguccugua gggccuuuu 19
<210> 885
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 885
agcaccagcu gguccugua 19
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 886
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<210> 887
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 887
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 892
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<210> 893
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 893
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<210> 894
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 894
agccguuggg gagaggacg 19
<210> 895
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 895
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<210> 896
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 896
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<210> 897
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 897
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 898
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 899
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<210> 901
<211> 19
<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 901
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 906
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<211> 19
<212> RNA
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<211> 19
<212> RNA
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 910
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 911
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 912
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 913
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 914
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 915
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 916
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 917
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 918
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 920
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<210> 921
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<213> 人工序列
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 925
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 927
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 928
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 929
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<212> RNA
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 932
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 933
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 934
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<212> RNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 935
uagagcaugg gaacagaca 19
<210> 936
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 936
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 937
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<212> RNA
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 945
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<212> RNA
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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acuguguucu ggggcccug 19
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 976
uucaaaggcc aggggcaga 19
<210> 977
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 977
ugcuggccuu ugccucaaa 19
<210> 978
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 978
uguuaucugc ugcuggccu 19
<210> 979
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 979
uuguccgggg uuguuaucu 19
<210> 980
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 980
acaucgcuga uuuguccgg 19
<210> 981
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 981
uuggggguga cacaucgcu 19
<210> 982
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 982
uaaagucgac ucauuagaa 19
<210> 983
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 983
acuuagacca aggagaaac 19
<210> 984
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 984
auuugugccg cugcaggcu 19
<210> 985
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 985
acugggaggu gcauuugug 19
<210> 986
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 986
acccagcaaa cugggaggu 19
<210> 987
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 987
uucuaaaaua aacccagca 19
<210> 988
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 988
ugcuaaacac ugguucuug 19
<210> 989
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 989
aacuugaaaa gggaacacu 19
<210> 990
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 990
uuuuuguucu caacuugaa 19
<210> 991
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 991
uuuuaaaacc caauuuuug 19
<210> 992
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 992
augcaaaaau guauacuuu 19
<210> 993
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 993
uuacauucaa gacacuaaa 19
<210> 994
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 994
aggucauguu cuuacauuc 19
<210> 995
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 995
agguauuaca gacacuaca 19
<210> 996
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 996
aaaaaacuaa gguauuaca 19
<210> 997
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 997
uaagcaucug uggaaaaaa 19
<210> 998
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 998
uucacguauu guucaaaaa 19
<210> 999
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 999
agaaauaacc agcuauggu 19
<210> 1000
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1000
uaacacaagg gagaaauaa 19
<210> 1001
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1001
auuagaagaa aagguggga 19
<210> 1002
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1002
cuuuccagcu caaagucga 19
<210> 1003
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1003
agaaacggcu gcuuuccag 19
<210> 1004
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1004
augcagcaca cuuagacca 19
<210> 1005
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1005
acugcucacu ccaugcagc 19
<210> 1006
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1006
ugcaggcuuc uacugcuca 19
<210> 1007
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1007
ucccaccccc auucucuaa 19
<210> 1008
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1008
uguucuugcc uccccaccc 19
<210> 1009
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1009
aguagucccg cgcuaaaca 19
<210> 1010
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1010
cuuuuuggaa caguagucc 19
<210> 1011
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1011
uuuguuucac aaacaagcu 19
<210> 1012
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1012
agggaacacu uuuuuguuu 19
<210> 1013
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1013
uuauacuuua auuuuaaaa 19
<210> 1014
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1014
aaccgaaggc aaugcaaaa 19
<210> 1015
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1015
acacuaaaua caaaccgaa 19
<210> 1016
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1016
acuacacgga ggucauguu 19
<210> 1017
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1017
uaaaaaucac aagcaucug 19
<210> 1018
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1018
ugcuugcauc uuucacgua 19
<210> 1019
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1019
agaaauucag gugcuugca 19
<210> 1020
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1020
ugcauucaaa cagaaauuc 19
<210> 1021
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1021
uuaugguucc gcauucaaa 19
<210> 1022
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1022
acguuuauua cuaacacaa 19
<210> 1023
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1023
auuguggcaa gacguuuau 19
<210> 1024
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1024
uuggaggcuu auuguggca 19
<210> 1025
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1025
ucucccaccu uuucuucuaa u 21
<210> 1026
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1026
auuagaagaa aaggugggag acu 23
<210> 1027
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1027
uguuugcugu guaugaucaa a 21
<210> 1028
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1028
uuugaucaua cacagcaaac agg 23
<210> 1029
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1029
uuccguauau auggcaugca a 21
<210> 1030
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1030
uugcaugcca uauauacgga agc 23
<210> 1031
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1031
accugcaaaa auugagcaau a 21
<210> 1032
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1032
uauugcucaa uuuuugcagg uuc 23
<210> 1033
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1033
accugcaaaa auugagcaau a 21
<210> 1034
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1034
uauugcucaa uuuuugcagg uuc 23
<210> 1035
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1035
uguuugcugu guaugaucaa a 21
<210> 1036
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1036
uuugaucaua cacagcaaac agg 23
<210> 1037
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1037
ucucccaccu uuucuucuaa u 21
<210> 1038
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1038
auuagaagaa aaggugggag acu 23
<210> 1039
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1039
cccaccuuuu cuucuaauga a 21
<210> 1040
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1040
uucauuagaa gaaaaggugg gag 23
<210> 1041
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1041
cccaccuuuu cuucuaauga a 21
<210> 1042
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1042
uucauuagaa gaaaaggugg gag 23
<210> 1043
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1043
ccagcuuguu ugugaaacaa a 21
<210> 1044
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1044
uuuguuucac aaacaagcug guc 23
<210> 1045
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1045
ccagcuuguu ugugaaacaa a 21
<210> 1046
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1046
uuuguuucac aaacaagcug guc 23
<210> 1047
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1047
aaaaaagugu ucccuuuuca a 21
<210> 1048
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1048
uugaaaaggg aacacuuuuu ugu 23
<210> 1049
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1049
aaaaaagugu ucccuuuuca a 21
<210> 1050
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1050
uugaaaaggg aacacuuuuu ugu 23

Claims (60)

1.一种用于抑制细胞中的血管紧张素原(AGT)表达的双链RNAi剂，其中所述双链RNAi剂包含形成双链区的正义链和反义链，
其中所述正义链包含SEQ ID NO:499的核苷酸序列和所述反义链包含SEQ ID NO:537的核苷酸序列，
每条链长度不超过30个核苷酸。
2.权利要求1的双链RNAi剂，其中所述正义链的不超过5个核苷酸是未修饰的核苷酸，和所述反义链的不超过5个核苷酸是未修饰的核苷酸。
3.权利要求1的双链RNAi剂，其中所述正义链与在3’-末端连接的配体偶联。
4.权利要求2的双链RNAi剂，其中所述正义链的全部核苷酸和所述反义链的全部核苷酸是修饰的核苷酸。
5.权利要求2的双链RNAi剂，其中至少一个所述修饰的核苷酸选自3’-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、构象限制核苷酸、约束乙基核苷酸、2’-氨基-修饰的核苷酸、2’-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、包含5’-硫逐磷酸酯基团的核苷酸和连接于胆固醇基或月桂酸二癸酰胺基团的末端核苷酸。
6.权利要求1-5任一项的双链RNAi剂，其中至少一条链包含至少1个核苷酸的3’悬端。
7.权利要求1-5任一项的双链RNAi剂，其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3’悬端。
8.权利要求1-3任一项的双链RNAi剂，其中所述双链区是21-30个核苷酸对长。
9.权利要求8的双链RNAi剂，其中所述双链区是21-23个核苷酸对长。
10.权利要求8的双链RNAi剂，其中所述双链区是21-25个核苷酸对长。
11.权利要求8的双链RNAi剂，其中所述双链区是23-27个核苷酸对长。
12.权利要求3的双链RNAi剂，其中所述配体是通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc配体。
13.权利要求3的双链RNAi剂，其中所述配体是
Figure FDA0002735179650000021
14.权利要求3的双链RNAi剂，其中所述配体连接于所述正义链的3’端。
15.权利要求14的双链RNAi剂，其中所述RNAi剂如以下示意图中所示的与所述配体偶联
Figure FDA0002735179650000022
其中X是O或S。
16.权利要求1-3任一项的双链RNAi剂，其中所述RNAi剂进一步包含至少一个硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。
17.权利要求16的双链RNAi剂，其中所述硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联在一条链的3’-末端。
18.权利要求17的双链RNAi剂，其中所述链是反义链。
19.权利要求17的双链RNAi剂，其中所述链是正义链。
20.权利要求16的双链RNAi剂，其中所述硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联在一条链的5’-末端。
21.权利要求20的双链RNAi剂，其中所述链是反义链。
22.权利要求20的双链RNAi剂，其中所述链是正义链。
23.权利要求16的双链RNAi剂，其中所述硫逐磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联同时在一条链的5’-和3’-末端。
24.权利要求23的双链RNAi剂，其中所述链是反义链。
25.权利要求16的双链RNAi剂，其中所述RNAi剂包含6-8个硫逐磷酸酯核苷酸间键联。
26.权利要求25的双链RNAi剂，其中所述反义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联，和所述正义链包含5’-末端或3’-末端的至少两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联。
27.权利要求1-3任一项的双链RNAi剂，其中所述反义链5’-端的1位的碱基对是AU碱基对。
28.权利要求1-3任一项的双链RNAi剂，其中所述正义链具有修饰的序列5’uscsucccAfcCfUfUfuucuucuaauL96-3’(SEQ ID NO:1037)和所述反义链具有修饰的序列5’-asUfsuagAfagaaaagGfuGfggagascsu-3’(SEQ ID NO:1038)，其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸、2’-O-甲基鸟苷磷酸和2’-O-甲基尿苷磷酸；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟代腺苷-3'-磷酸、2'-氟代胞苷-3'-磷酸、2'-氟代鸟苷-3'-磷酸和2'-氟代尿苷-3'-磷酸；
s是硫逐磷酸酯；和
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺癸酰基]-4-羟基脯氨醇。
29.一种用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的双链RNAi剂，
其中所述双链RNAi剂包含形成双链区的正义链和反义链，
其中所述正义链包含SEQ ID NO:499的核苷酸序列和所述反义链包含SEQ ID NO:537的核苷酸序列，
其中每条链长度不超过30个核苷酸，
其中所述正义链的不超过5个核苷酸是未修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰，
其中所述正义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联，
其中所述反义链的不超过5个核苷酸是未修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰，
其中所述反义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联，和
其中所述正义链在3’-末端与通过分支的二价或三价接头连接的一个或多个GalNAc配体偶联。
30.权利要求29的双链RNAi剂，其中所述正义链的全部核苷酸和所述反义链的全部核苷酸包含修饰。
31.一种含有权利要求1-3、28和29任一项的双链RNAi剂的细胞。
32.一种包含权利要求1-3、28和29任一项的双链RNAi剂的药物组合物。
33.权利要求32的药物组合物，其中双链RNAi剂在未缓冲的溶液中施用。
34.权利要求33的药物组合物，其中所述未缓冲的溶液是盐水或水。
35.权利要求32的药物组合物，其中所述双链RNAi剂用缓冲液施用。
36.权利要求35的药物组合物，其中所述缓冲液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任意组合。
37.权利要求36的药物组合物，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
38.一种在体外抑制细胞中的血管紧张素原(AGT)表达的方法，该方法包括：
(a)将所述细胞接触权利要求1-3、28和29任一项的双链RNAi剂，或者权利要求32-37任一项的药物组合物；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以获得ATG基因的mRNA转录物降解的时间，由此抑制所述细胞中ATG基因的表达。
39.权利要求38的方法，其中所述AGT表达被抑制至少50％。
40.权利要求1-3、28和29任一项的双链RNAi剂，或权利要求32-37任一项的药物组合物在制备用于治疗患有血管紧张素原(AGT)相关失调的受试者的药物中的用途，其中所述血管紧张素原相关失调选自高血压。
41.双链RNAi剂在制备用于治疗患有血管紧张素原(AGT)相关失调的受试者的药物中的用途，所述药物皮下施用于所述受试者，
其中所述双链RNAi剂包含形成双链区的正义链和反义链，
其中所述正义链包含SEQ ID NO:499的核苷酸序列，和所述反义链包含SEQ ID NO:537的核苷酸序列，
其中每条链长度不超过30个核苷酸，
其中所述反义链的不超过5个核苷酸是未修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰，
其中所述反义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联，
其中所述正义链的不超过5个核苷酸是未修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰，
其中所述正义链包含5’-末端的两个硫逐磷酸酯核苷酸间键联，和
其中所述正义链在3’末端与通过分支的二价或三价接头连接的一个或多个GalNAc配体偶联，
其中所述血管紧张素原相关疾病选自高血压。
42.权利要求41的用途，其中所述正义链的全部核苷酸和所述反义链的全部核苷酸包含修饰。
43.权利要求41或42的用途，其中所述受试者是人。
44.权利要求的40、41或42的用途，其中所述高血压选自临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压和不稳定性高血压。
45.权利要求41或42的用途，其中血管紧张素原相关失调是妊娠相关的高血压。
46.权利要求41或42的用途，其中所述双链RNAi剂以0.01mg/kg至10mg/kg或0.5mg/kg至50mg/kg的剂量施用。
47.权利要求46的用途，其中所述双链RNAi剂以10mg/kg至30mg/kg的剂量施用。
48.权利要求46的用途，其中所述双链RNAi剂以3mg/kg的剂量施用。
49.权利要求46的用途，其中所述双链RNAi剂以10mg/kg的剂量施用。
50.权利要求46的用途，其中所述双链RNAi剂每周两次以0.5mg/kg的剂量施用。
51.权利要求46的用途，其中所述双链RNAi剂每隔一周以10mg/kg的剂量施用。
52.权利要求46的用途，其中所述双链RNAi剂每周一次以0.5-1mg/kg的剂量施用。
53.权利要求46的用途，其中所述双链RNAi剂皮下施用。
54.权利要求46的用途，其中所述RNAi剂静脉内施用。
55.权利要求46的用途，其中所述RNAi剂以两个或更多个剂量施用。
56.权利要求55的用途，其中所述双链RNAi剂以选自每12小时一次，每24小时一次，每48小时一次，每72小时一次和每96小时一次的间隔施用。
57.权利要求55的用途，其中所述RNAi剂每周施用两次。
58.权利要求55的用途，其中所述RNAi剂每隔一周施用。
59.权利要求41或42的用途，进一步包括将另外的治疗剂施用于所述受试者。
60.权利要求59的用途，其中所述另外的治疗剂选自利尿剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β-阻滞剂、血管舒张剂、钙通道阻滞剂、醛固酮拮抗剂、α2-激动剂、肾素抑制剂、α-阻滞剂、外周作用肾上腺素能剂、选择性D1受体部分激动剂、非选择性α-肾上腺素能拮抗剂、合成的甾体抗盐皮质激素剂，或前述的任意组合，以及配制成药剂组合的高血压治疗剂。
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