CN102260673A

CN102260673A - 靶向人血管紧张素原的rna干扰片段、表达载体与应用

Info

Publication number: CN102260673A
Application number: CN 201110194586
Authority: CN
Inventors: 张丽君; 黄志立; 吴晓明; 伍丽华
Original assignee: Shenzhen Polytechnic
Current assignee: Shenzhen Polytechnic
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2011-11-30

Abstract

本发明涉及一种针对人前脂肪细胞内血管紧张素原的RNA干扰片段，其序列为R1：TCCTGGGTGTTCCTTGGAA或R2：CTGGATGTTGCTGCTGAGA。本发明还提供一种上述RNA干扰片段的表达载体。本发明还提供利用所述RNA干扰片段抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，从而降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的应用。经实验证明，本发明设计的干扰质粒能降低HPA-v细胞中人血管紧张素原的表达，各干扰减低人血管紧张素原mRNA表达量约35%以上，蛋白水平表达量约47.6%。同时脂肪细胞分化程度降低，这表明针对人血管紧张素原的RNAi序列能够抑制脂肪细胞的分化，可抑制脂肪的形成，降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的用途。

Description

靶向人血管紧张素原的RNA干扰片段、表达载体与应用

技术领域

本发明涉及RNA干扰片段及应用领域，具体是涉及靶向人血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）的RNA干扰片段及其应用。

背景技术

肥胖是人类非常常见的病症，肥胖者体内脂肪细胞含量高出正常水平较多。而现有减肥的主要方向是降低体内脂肪含量。若能通过基因手段，抑制脂肪细胞的形成，则将有效抵制肥胖的形成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供靶向人血管紧张素原的RNA干扰片段，以抑制人前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，从而抑制肥胖的形成。

本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种针对人血管紧张素原的RNAi片段构建的表达载体。

本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种上述RNA干扰序列及其表达载体的应用，以抵制肥胖的形成。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种针对人前脂肪细胞内血管紧张素原的RNA干扰片段，其具有以下任一序列：

R1：TCCTGGGTGTTCCTTGGAA

R2：CTGGATGTTGCTGCTGAGA。

又一方面，本发明还提供一种RNA干扰片段的表达载体，该表达载体具有如上所述的RNA干扰片段。

进一步地，该表达载体具有SEQ ID NO：1或2所示的序列。

另一方面，本发明还提供以上任一项在抑制肥胖中的应用，利用所述RNA干扰片段抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，从而降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成。

本发明的有益效果如下：经实验证明，本发明设计的二种干扰质粒都能降低HPA-v细胞中人血管紧张素原的表达，各干扰减低人血管紧张素原mRNA表达量约35%以上，蛋白水平表达量约47.6%。同时脂肪细胞分化程度降低，这表明针对人血管紧张素原的RNAi序列能够抑制脂肪细胞的分化，可抑制脂肪的形成。因此本发明所涉及的干扰片段及表达载体可用于抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的用途。

附图说明

图1A~图1C分别是本发明构建的三个重组表达载体PR1、PR2、PR0的示意图。

图2分别是本发明的PR1、PR2的RNAi表达载体测序结果图，图中，曲线1、2、3、4分别代表碱基G、C、T、A。

图3是本发明的定量PCR扩增图。

图4为本发明抑制脂肪细胞AGT表达的电泳检测结果。

图5至图7显示本发明抑制脂肪细胞分化程度的检测结果。

图8是HPA-v转染重组质粒后分化过程中脂质含量的变化曲线图。

图9是本发明转染重组质粒对人前脂肪细胞分化过程中GPDH活性的影响对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实施例仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例一 RNAi片段的设计

从国际开发共享基因库（NCBI Genebank）中查找出人AGTmRNA序列（基因ID NM 000029）。然后，再根据Tuschl和Reynolds等提出的siRNA设计原则，并且借助于Ambion公司所提供的在线siRNA设计软件siRNA Target finder（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.htmL）来确定靶序列，筛选2条19bp长的靶序列，分别为R1，R2。为避免siRNA非特异性抑制同源性较高的其它基因，利用BLAST软件（http://www.ncbinlm.nih.gov/blast），对备选靶序列同源性分析，确保无非特异性沉默。此外，还设计一条不针对任何基因的19bp的序列R0，作为阴性对照。三条序列具体如下：

R1：TCCTGGGTGTTCCTTGGAA

R2：CTGGATGTTGCTGCTGAGA

R0：ACGCTGAGTACTTCGAAAT

以上三条序列均送由生工生物工程（上海）有限公司合成。

实施例二 RNAi表达载体的构建

以设计好的三条序列为基础，分别设计出与之互补的反向序列，正向与反向序列之间用LOOP环（CCACC）连接，序列两端加上与BbsⅠ酶切PsiRNA-hH1neo环状质粒互补碱基。该序列折叠时除LOOP段外，其余部分都可以形成互补的双链RNA发夹结构，确保每条单链分别包括BbsⅠ酶切后粘性末端的互补碱基、19个碱基靶序列、茎环结构（CCACC）、靶序列的互补序列、BbsⅠ酶切后粘性末端的互补碱基5个区域。

表1 插入PsiRNA-hH1neo线性载体的寡聚核苷酸片段

由上海生工按现有工艺合成的寡聚核苷酸单链，用水溶解到25μ mol/L，再在85℃退火5S成双链。PsiRNA-hH1neo载体经BbsⅠ酶切成线性载体，再经T4连接酶与双链RNAi片段连接，分别构建成PR1、PR2、PR0三种载体，三种载体的结构分别如图1A~图1C所示。而PR1寡聚核苷酸片段、PR2寡聚核苷酸片段（图中分别以虚线框标示出来）的测序结果分别如图2中A、B所示，测序序列与设计序列同源性达到100%。

实施例三转染人前脂肪细胞，并建立混合克隆株

1. 转染：将人前脂肪细胞HPA-v（购自ScienCell Research Laboratories）按照6×10⁴个/孔接种于24孔板中，37℃，5%CO₂用10%FCS+ DMEM培养基培养，到细胞汇合至80%，更换无抗生素无血清DMEM培养基培养过夜。再利用Lipofectamine 2000试剂，将各组质粒分别转染入HPA-v人前脂肪细胞株中。具体转染方法：用50 μL Opti-MEM稀释1μg质粒并混匀，再用50 μL Opti-MEM稀释的2 μL Lipofectamine2000并混匀，被稀释的质粒与Lipofectamine2000再轻轻混匀后室温静置20min，每孔加100 μL混合液，左右轻轻震荡培养板，使其与HPA-v充分并均匀接触。5％CO₂，37℃培养。6小时后更换无抗生素10%FCS+DMEM培养液继续培养1天。

2. 建立混合克隆细胞株：为了排除未转染干扰质粒细胞的影响，转染48小时后，加入含800μg/mL G418进行筛选，约两周后建立混合克隆细胞株。进一步提取细胞RNA进行分析，保证RNA的纯度。

实施例四干扰效果检测

1. 在转录水平检测AGT沉默效果

转染后48 h后，分别取转染对照质粒和沉默质粒的HPA-v人前脂肪细胞株，据TRIZOL提取方法提取各组细胞的总RNA，逆转录后，以β-actin作为对照，检测转染沉默质粒后，AGT在转录水平上的沉默效率。

提取总RNA：提取应用PR1、PR2、PR0转染后建立的混合HPA-v细胞克隆中的RNA，步骤参考Invitrogene公司RNA提取试剂盒说明。

逆转录：将不同时段提取出的HPA-v前脂肪细胞中的mRNA反转录为cDNA，反转录反应按照表2的反应体系加样（在冰上配置RT反应液）。

表2 RT反应体系

反转录条件：37℃维持15 min（反转录反应）；85℃保持5 sec（反转录后高温使酶失活），反转录产物-20℃保存，然后进行real-time PCR。

Real-Time PCR反应：采用罗氏荧光定量PCR仪进行。实验前，将荧光定量PCR仪中的适配器置于4℃预冷2h。Real-Time PCR反应体系加样见表3。

表3 荧光定量PCR反应体系

Real Time-PCR条件：DNA 聚合酶热激：95℃ 10 Sec；PCR循环：95 ℃变性10 Sec；（退火温度见表3-3）10 Sec；72℃延伸10Sec；溶解曲线分析：温度从65 ℃开始，以0.1 ℃/Sec的速率升至95 ℃，并观察溶解曲线是否为单峰。溶解曲线为单峰，则Real-Time PCR反应产物为特异性扩增产物，AGT及内参β-actin引物见表4。

表4 PCR反应引物

real-time PCR结果曲线显示见图3所示，可从图中最右侧的曲线末端来区分识别各曲线，位于上部的第1~8条结果曲线对应于β-actin，而中部的第9~17条结果曲线对应于AGT，而最下方的几乎为水平直线的第18-19条曲线为空白对照线。由上而下地，第1-2条对应转染PRO质粒的细胞，第3-6条对应转染PR1，而且第3、4两条曲线基本重叠，第7-8条对应转染PR2且基本重叠；第9-10对应转染PRO质粒的细胞，第11-15条曲线对应转染PR1，第16-17对应转染PR2。

经分析可以发现，分别转染PR1或PR2的前脂肪细胞株与阴性对照相比，AGT mRNA水平有较明显的降低，分别是阴性对照组的46%和38%（n = 3）。

2. 在蛋白水平检测AGT沉默效果

转染后48h后，分别收集转染对照质粒和沉默质粒的HPA-v人前脂肪细胞株，采用SDS-PAGE电泳检测AGT蛋白表达情况，其电泳结果见图4所示，图4中，1代表Marker，2代表无义转染，3代表阴性对照，4代表干扰质粒转染。

经过Gel-Pro Analyzer –untitled 2软件进行蛋白条带灰度的定量实验，得出AGT蛋白条带的灰度相对量：无义转染的为19039，阴性对照的为13635，而干扰质粒转染的AGT蛋白条带灰度为9061。分别转染Psi-AGT1或Psi-AGT2的人前脂肪细胞株与阴性对照相比AGT0 mRNA水平有较明显的降低，分别是Psi-AGT0阴性对照组的71.6%和47.6%。

实施例五抑制前脂肪细胞分化的检测

分别从脂质含量、细胞中GPDH酶活性两方面检测干扰质粒对脂肪细胞分化影响的程度。

1. 沉默后HPA-v细胞分化过程中脂质积累的变化

在24孔板中，分别在诱导分化0，3，6，9，12，15天，油红O染色检测不同转染组中脂质含量的变化差异。HPA-v人前脂肪细胞株分化过程中，形成脂肪滴被染成红色，油红染色的面积和深浅都与脂滴大小和分化程度相关。在较弱的分化培养基刺激下，诱导分化初期，HPA-v前脂肪细胞株中脂质积累很少，不同组样品中脂质积累没有呈现差异。分化中后期，前脂肪组织中脂质含量不断增加，在各组细胞中脂质含量出现一定的变化。图5~图7分别为转染PR0、PR1及PR2在诱导分化到第15天的油红染色图。PR0对照组中脂肪细胞与PR1和PR2相比，脂质积累明显加强，视野中脂肪滴数目也增加。

转染后第0、3、6、9、12、15天各组HPA-v细胞油红O染色后，其脂质含量见图8，SPSS 13.0统计软件显著性分析发现，转染各组质粒的HPA-v前脂肪细胞株在诱导分化不同时段脂质含量呈现上升趋势，但P>0.05，因此均无显著性差异。

2. 沉默后HPA-v细胞分化过程中GPDH酶活性的变化

转染后，分别在诱导分化第3天、9天和15天后提取各组细胞蛋白，每组三个平行样。用细胞蛋白浓度对GPDH活性进行标准化，即每毫克蛋白质中GPDH酶活，标准化的结果见图9。HPA-v人前脂肪细胞在分别转染PR0、PR1、PR2后，加入较弱的诱导分化培养基诱导分化后，油红O染色在不同时段测定各组细胞中脂质含量发现，上述三组细胞中脂质积累均无显著性差异。在第3、9、15天测定各组细胞中每毫克蛋白中GPDH酶活性发现，分化到第9和15天，PR1与对照组PR0存在显著性差异，PR2与对照组PR0有差异。

序列表

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<110> OrganizationName : 深圳职业技术学院

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<212> Type : DNA

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SequenceDescription :

Claims

1. 一种靶向人血管紧张素原的RNA干扰片段，其特征在于，具有以下任一序列：

R1：TCCTGGGTGTTCCTTGGAA

R2：CTGGATGTTGCTGCTGAGA。

2. 一种RNA干扰片段的表达载体，其特征在于，该表达载体具有如权利要求1所述的RNA干扰片段。

3. 如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，该表达载体具有SEQ ID NO：1或2所示的序列。

4. 根据权利要求1~3中任一项在抑制肥胖中的应用，其特征在于，利用所述RNA干扰片段抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，从而降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成。