CN103103192A

CN103103192A - 靶向血管紧张素原的rna干扰片段、其表达载体、混合克隆细胞株及其应用

Info

Publication number: CN103103192A
Application number: CN2013100186862A
Authority: CN
Inventors: 黄志立; 张丽君; 伍丽华
Original assignee: Shenzhen Polytechnic
Current assignee: Shenzhen Polytechnic
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-05-15

Abstract

本发明涉及一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段其序列为如序列表SEQ ID NO.1，还涉及其表达载体以及用于抑制肥胖的应用。由于本发明的干扰序列siR经过克隆入载体，转入前脂肪细胞中，血管紧张素原在转录后表达水平明显下调，同时前脂肪细胞向成熟细胞的分化也明显受到抑制，因此本发明所涉及的干扰序列可以用于抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，具有降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的用途。

Description

靶向血管紧张素原的RNA干扰片段、其表达载体、混合克隆细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及RNA干扰及应用领域，更具体地说是涉及靶向血管紧张素原的RNA干扰片段、其表达载体及其应用。

背景技术

肾素－血管紧张素系统（Renin-Angiotensin System,RAS）是生理功能复杂的内分泌系统，已确定与人类心脑血管疾病、糖尿病、肝脏、肾脏疾病等有密切的关系，其源头即为血管紧张素原（angiotensinogen,AGT）。近年的研究发现机体脂肪组织中存在RAS的所有成分，提示RAS与脂肪细胞的分化和增殖有密切关系，而脂肪细胞的异常分化与增殖又是导致肥胖的直接原因。

RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）是近年来迅速发展起来的一项高效基因研究技术，在哺乳动物细胞中利用该技术成功阻断基因的表达，可实现细胞水平的基因敲除。通过干扰脂肪细胞中AGT基因的表达以抑制RAS发挥作用，达到抑制前脂肪细胞分化的效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰序列，能干扰降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。

本发明要解决的另一技术问题在于：提供一种针对血管紧张素原的RNAi片段构建的表达载体，能降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。

本发明要解决的又一技术问题在于：提供一种混合克隆细胞株，降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。

本发明要解决的再一技术问题在于：提供靶向血管紧张素原的RNA干扰片段在抑制肥胖形成中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述血管紧张素原是针对鼠前脂肪细胞内的血管紧张素原。

所述鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列NM007428，其序列表为SEQ ID NO.2。

本发明还提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，该表达载体含有所述的RNA干扰片段。

该表达载体具有图1a所示的结构。

所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，插入载体的siR结构为表1所示siR-AGT对应的结构。

本发明进一步提供一种混合克隆细胞株，能降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成，是由所述靶向血管紧张素原的RNA干扰片段构建表达载体质粒并转染前脂肪细胞株而建立的。

所述的混合克隆细胞株具体由下述步骤制得的：

步骤1：RNAi干扰片段siR的设计；

步骤2：以设计好的RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT-U6.1/NeoRNAi而构建及合成表达载体质粒PsiR；

步骤3：以表达载体质粒PsiR转染鼠前脂肪细胞3T3-L1，并建立混合克隆株。

进一步地，所述步骤2具体为：RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT-U6.1/NeoRNAi构建并合成表1的siR-AGT寡聚核苷酸单链后，再经退火成双链RNAi片段，PsiRNAT-U6.1/Neo载体经BamH I和Hind III双酶切成线性载体，最后经T4连接酶与双链RNAi片段连接构建成PsiR表达载体质粒，表达载体结构为图1a。

本发明还提供靶向血管紧张素原的RNA干扰片段用于抑制肥胖的应用。

本发明的有益效果如下：

由于本发明设计的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段siR经过克隆入载体，转入前脂肪细胞中，血管紧张素原在转录后表达水平明显下调，同时前脂肪细胞向成熟细胞的分化也明显受到抑制，因此本发明所涉及的干扰序列可以用于抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，具有降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的用途。

附图说明

图1是本发明实施例构建的重组载体质粒psiRNAT-U6.1/Neo的图谱；其中图1（a）为PsiR重组载体结构，代表插入siR干扰片段后的质粒图谱；图1（b）为PsiR0重组载体结构图，代表插入siR0干扰片段后的质粒图谱。

图2是本发明实施例的RNAi表达载体测序结果图，其中图（a）为PsiR测序结果图，图（b）为PsiR0测序结果图；框内标示分别为siR和siR0的序列，1代表碱基G、2代表碱基A、3代表T、4代表C。

图3是本发明实施例荧光定量PCR检测结果示意图，其中图（a）为AGT，β-actin real-time PCR扩增图，图（b）为AGT，β-actin real-time PCR溶解曲线；图中曲线1～4为β-actin，其中曲线1～2为转染PsiR质粒的细胞，曲线3～4为转染PsiR0质粒的细胞；曲线5～8为AGT，其中曲线5～6为转染PsiR0质粒的细胞，曲线7～8为转染PsiR。

图4是本发明实施例转染PsiR0细胞在诱导分化后的油红O染色×100倍图。

图5是本发明实施例转染PsiR沉默组细胞在诱导分化后的油红O染色×100倍图。

图6是本发明实施例3T3-L1细胞转染重组质粒后分化过程中脂质含量的变化曲线。

图7是本发明实施例转染重组质粒对鼠前脂肪细胞分化过程中GPDH活性的影响示意图，其中*表示差异显著0.01<*P<0.05。

图8是本发明实施例抑制脂肪细胞AGT表达的电泳结果检测结果图。

具体实施方式

以下具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。

本发明靶向血管紧张素原的RNA干扰序列的设计，是从NCBI数据库中查找鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列NM007428，如序列表SEQ ID NO.2，根据siRNA设计原则，从开放阅读框的起始密码（ATG）开始，寻找二个连续的腺嘌呤序列后的19个碱基序列为备选靶序列。以Ambion公司提供的在线siRNA设计软件（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）siRNA Target finder来设计靶序列。为了提高RNAi的抑制效率，筛选1条19bp长的靶序列，为避免siRNA非特异性抑制同源性较高的其它基因，利用BLAST 软件，对备选靶序列同源性分析（http://www.ncbinlm.nih.gov/blast），确保无非特异性沉默。序列如SEQ ID NO.1，结构式为：

siR：GCACTCATTTGTTCAGAGC

以上述siR的RNAi片段构建表达载体，同时还设计一条不针对任何基因的19bp的序列（siR0），作为阴性对照，序列为：

siR0：GCGCTGAGTACTTCGAAAT

以设计好的序列以及所选定的载体psiRNAT-U6.1/Neo（载体psiRNAT-U6.1/Neo购自GenScript公司）为基础，分别设计出与之互补的反向序列，正向与反向序列之间用LOOP环（TTGATATCCG）连接，确保单链分别包括BamH I酶切粘性末端互补片段、19个碱基靶序列、LOOP环、19个碱基靶序列的互补序列、终止信号以及Hind III酶切粘性末端的互补片段共六个区域，分别命名为siR-AGT和siR0-AGT，其序列请参照表1。

设计并委托上海生工生物工程有限公司合成寡聚核苷酸单链siR-AGT和siR0-AGT，用水溶解到25μmol/L，90℃加热10min，室温静置1h，使之退火成双链RNAi。PsiRNAT-U6.1/Neo载体经BamH I和Hind III双酶切成线性载体，再经T4连接酶与双链RNAi片段连接，构建成两种载体，分别命名为PsiR、PsiR0，其质粒图谱见图1，并经测序正确，测序结果见图2。其中，图1的载体质粒psiRNAT-U6.1/Neo图谱，由GenScript公司提供，图1（a）为PsiR重组载体结构，代表插入siR干扰片段后的质粒图谱，图1（b）为PsiR0重组载体结构图，代表插入siR0干扰片段后的质粒图谱。PsiR中siR基因即为本发明中所设计的靶向AGT序列的干扰序列siR－AGT，siR0基因即为本发明中所设计的非靶向AGT序列的对照序列siR0－AGT。图2是本发明实施例的RNAi表达载体测序结果图，载体质粒与干扰片段重组后，将重组载体寄至上海生工生物工程股份有限公司，使用ABI测序仪进行测序，其中图2（a）为PsiR测序结果图，图2（b）为PsiR0测序结果图；框内标示分别为siR和siR0的序列，测序结果证明所设计的靶向AGT序列的干扰序列siR－AGT及对照序列siR0－AGT已插入载体，图2中数字1代表碱基G、2代表碱基A、3代表T、4代表C。

以上述构建得到的表达载体PsiR、PsiR0，转染鼠前脂肪细胞株3T3-L1，并建立混合克隆细胞株，包括以下步骤：

1.转染：鼠前脂肪细胞3T3-L1（来源于广州中国科学院广州生物医药与健康研究所）按照2×10⁴个/孔接种于24孔板中，37℃，5%（v/v）CO₂（此处5%指二氧化碳培养箱所调节的CO₂体积比浓度，v/v）用10%（m/m）FCS（fetal bovine serum，胎牛血清）+DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基，简称DMEM）培养基培养，到细胞汇合至90%，更换无抗生素无血清FCS的DMEM培养基培养过夜。利用Lipofectamine2000试剂，将各组质粒PsiR、PsiR0分别转染入3T3-L1鼠前脂肪细胞株中。

2.建立混合克隆细胞株：为了排除未转染干扰质粒细胞的影响，转染48小时后，加入含600μg/mL G418进行筛选，10～14天后建立定点转染混合克隆细胞株。

经实验证明，本发明设计的干扰质粒PsiR、PsiR0能降低3T3-L1细胞中血管紧张素原AGT的表达，干扰减低鼠血管紧张素原mRNA表达量约46%以上,蛋白水平表达量约43.9%。同时脂肪细胞分化程度降低，这表明针对鼠血管紧张素原的RNAi序列能够抑制脂肪细胞的分化，有可能抑制脂肪的形成。

实施例1RNAi片段的设计

从NCBI数据库中查找鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列（NM007428，见序列表SEQ ID NO.2，根据siRNA设计原则，从开放阅读框的起始密码（ATG）开始，寻找二个连续的腺嘌呤序列后的19个碱基序列为备选靶序列。以Ambion公司提供的在线siRNA设计软件（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）siRNA Target finder来设计靶序列。为了提高RNAi的抑制效率，筛选1条19bp长的靶序列，命名为siR。为避免siRNA非特异性抑制同源性较高的其它基因，利用BLAST软件，对备选靶序列同源性分析（http://www.ncbinlm.nih.gov/blast），确保无非特异性沉默。此外，还设计一条不针对任何基因的19bp的序列（siR0），作为阴性对照，两条序列送由上海生工合成，具体序列见下：

siR：GCACTCATTTGTTCAGAGC

siR0：GCGCTGAGTACTTCGAAAT。

实施例2RNAi表达载体的构建

以设计好的序列以及所选定的载体psiRNAT-U6.1/Neo（购自GenScript公司）为基础，分别设计出与之互补的反向序列，正向与反向序列之间用LOOP环（TTGATATCCG）连接，确保单链分别包括BamH I酶切粘性末端互补片段、19个碱基靶序列、LOOP环、19个碱基靶序列的互补序列、终止信号以及HindIII酶切粘性末端的互补片段共六个区域。如表1：

表1插入psiRNAT-U6.1/Neo线性载体的寡聚核苷酸片段

表1中gc含量指的是一段DNA链中dGTP和dCTP所占的百分比，此处gc含量的值说明该片段设计比较合理，不会因为gc含量过高或过低影响PCR的效果。

设计并合成的寡聚核苷酸单链后，用水溶解到25μmol/L，90℃加热10min，室温静置1h，使之退火成双链。PsiRNAT-U6.1/Neo载体经BamH I和Hind III双酶切成线性载体，再经T4连接酶与双链RNAi片段连接，分别构建成PsiR、PsiR0两种载体，载体结构见图1，测序结果见图2。其中，图1中siR、siR0分别表示表1中所示的siR-AGT、siR0-AGT寡聚核苷酸片段。测序序列与设计序列同源性达到100%。测序图中PsiR结果对应表1中siR-AGT寡聚核苷酸片段，PsiR0测序结果对应表1中siR0-AGT寡聚核苷酸片段，其中图2（a）及图（b）中框内所示区域分别为siR与siR0序列。

实施例3转染鼠前脂肪细胞，并建立混合克隆株

1.转染：鼠前脂肪细胞3T3-L1（来源于广州中国科学院广州生物医药与健康研究所）按照2×10⁴个/孔接种于24孔板中，37℃，5%（体积百分数）CO₂用10%(质量百分数)FCS+DMEM培养基培养，到细胞汇合至90%，更换无抗生素无血清FCS的DMEM培养基培养过夜，目的是为了饥饿细胞，提高转染效率；另外使细胞生长同步化。利用Lipofectamine2000试剂，将各组质粒PsiR、PsiR0分别转染入3T3-L1鼠前脂肪细胞株中。

实施例4干扰效果检测

1）在转录水平检测血管紧张素原（AGT）沉默效果

筛选到稳定转染的细胞后，分别取转染对照质粒PsiR0和沉默质粒PsiR的3T3-L1鼠前脂肪细胞株，据TRIZOL提取方法提取各组细胞的总RNA，逆转录后，以β-actin作为对照，检测转染沉默质粒后，AGT在转录水平上的沉默效率。

提取总RNA：PBS清洗细胞3次，加入Trizol，冰上放置5min，枪头吹打；加入氯仿后用力振摇15Sec，15～30℃下孵育2～3min。4℃，12000rpm离心15min，小心吸取上层无色水样层（RNA），加入等体积异丙醇，混匀，15-30℃孵育10～30min，4℃，12000rpm离心10min。去上清，沉淀加入DEPC、75%乙醇，振荡30Sec，4℃，7500rpm离心5min。去上清，管内沉淀加入DEPC溶解，-70℃保存。

逆转录：将不同时段提取出的3T3-L1前脂肪细胞中的mRNA反转录为cDNA，反转录反应按表2加样（在冰上配置RT反应液）。

表2RT反应体系

反转录条件：37℃维持15min（反转录反应）；85℃保持5sec（反转录后高温使酶失活），反转录产物-20℃保存，然后进行real-time PCR。

反应：采用罗氏荧光定量PCR仪进行。实验前，将荧光定量PCR仪中的适配器置于4℃预冷2h。Real-Time PCR反应体系加样见表3。

表3荧光定量PCR反应体系

Real Time-PCR条件：DNA聚合酶热激：95℃10Sec；PCR循环：95℃变性10Sec；（退火温度见表4Ta）10Sec；72℃延伸10Sec。溶解曲线分析：温度从65℃开始，以0.1℃/Sec的速率升至95℃，并观察溶解曲线是否为单峰。溶解曲线为单峰，则Real-Time PCR反应产物为特异性扩增产物，AGT及内参β-actin引物见表4。real-time PCR结果采用Roche公司LightCycler1.5型实时荧光定量PCR仪显示见图3，图3中曲线1～4为β-actin，其中曲线1～2为转染PsiR质粒的细胞，曲线3～4为转染PsiR0质粒的细胞；曲线5～8为AGT，其中曲线5～6为转染PsiR0质粒的细胞，曲线7～8为转染PsiR。转染PsiR的前脂肪细胞株与阴性对照相比AGT mRNA水平有较明显的降低，为阴性对照组的46%。且溶解曲线分析可得AGT和β-actin都呈单峰，从而证实real-time PCR产物无非特异性扩增。

表4PCR反应引物

其中，β-actin为鼠β肌动蛋白，以它作为干扰质粒转染的空白对照。NM007393为编码该蛋白的基因序列在NCBI基因库中的编号，可根据该编号查到相应基因序列和相关信息，序列表见SEQ ID NO.3。

2）在蛋白水平检测AGT沉默效果

转染后48h后，分别收集转染对照质粒和沉默质粒的3T3-L1鼠前脂肪细胞株，采用SDS-PAGE电泳检测AGT蛋白表达情况。采用SDS－PAGE蛋白质电泳法，利用凝胶成像分析系统Bio-Rad（美国）分析电泳结果见图8所示的转染后3T3-L1细胞的SDS－PAGE电泳结果图。

经Quantity One软件进行蛋白条带灰度的相对定量分析，得出AGT蛋白条带的灰度相对量：无义转染的AGT相对含量为9.12%，阴性对照组PsiR0的AGT相对含量为7.57%，而实验组PsiR的AGT相对含量为3.32%。根据软件分析所得：沉默组AGT的相对含量是阴性对照组的43.9%。

实施例5抑制前脂肪细胞分化的检测

分别从脂质含量、细胞中GPDH酶活性两方面检测干扰质粒对脂肪细胞分化影响的程度。

沉默后3T3-L1细胞分化过程中脂质积累的变化

在24孔板中，分别在诱导分化0、2、4、6、8、10、12天，油红O染色检测不同转染组中脂质含量的变化差异。所述诱导分化已为成熟技术，是在DMEM培养基的基础上添加一定量的胰岛素、地塞米松和黄嘌呤。3T3-L1鼠前脂肪细胞株分化过程中，形成脂肪滴被染成红色，油红染色的面积和深浅都与脂滴大小和分化程度相关。在较弱的分化培养基刺激下，诱导分化初期，3T3-L1鼠前脂肪细胞株中脂质积累很少，不同组样品中脂质积累没有呈现差异。分化中后期，前脂肪组织中脂质含量不断增加，在各组细胞中脂质含量出现一定的变化。将脂肪细胞PBS冲洗3次，加入10%甲醛溶液固定30min，60%异丙醇替换，漂洗后挥干，加入300μl油红O染色工作液染色30min，PBS冲洗3次，置于倒置荧光相差显微镜（LEICA DMIRB德国）下，观察并拍摄照片如图4-5，分别为转染PsiR0和PsiR的细胞在诱导分化到第12天的油红染色图。PsiR0对照组中脂肪细胞与PsiR相比，脂质积累明显加强，视野中脂肪滴数目也增加。

转染后第0、2、4、6、8、10、12天各组3T3-L1细胞油红O染色后，其脂质含量见图6。前期油红O染色方法按上述图4-5对应的描述，将染色后的细胞再加入250μl异丙醇提取油红O，震荡10min，取200μl，利用连续光谱测定仪（Spectramax M2美国）在500nm波长处测定OD值。SPSS12.0统计软件显著性分析发现，实验组PsiR与阴性对照组PsiR0细胞从分化开始到第8天脂质含量有极显著性差异，分化第10天到第12天脂质含量均具有显著性差异。

沉默后3T3-L1细胞分化过程中GPDH酶活性的变化

转染后，分别在诱导分化第4天，8天，12天后提取各组细胞蛋白，每组三个平行样。用细胞蛋白浓度对GPDH（甘油-3-磷酸脱氢酶）活性进行标准化，即每毫克蛋白质中GPDH酶活，标准化的结果见图7。收集细胞，使用连续光谱测定仪在340nm波长处测定细胞样品中的GPDH在不同时间氧化NADH的量，再利用Bradford法，测定样品中的蛋白含量，用GPDH酶活性比上蛋白含量，即为每mgGPDH蛋白、每min氧化1.0nmol/L NADH的酶活力单位。3T3-L1鼠前脂肪细胞在分别转染PsiR0、PsiR，并加入较弱（通过调整DMEM中各种激素及刺激剂的浓度来控制）的诱导分化培养基诱导分化后，油红O染色在不同时段测定各组细胞中脂质含量发现，沉默组PsiR与阴性对照PsiR0组的细胞从分化开始到第8天脂质含量具有极显著性差异，分化第10天到第12天脂质含量均具有显著性差异；而在第4、8、12天测定各组细胞中每毫克蛋白中GPDH酶活性发现，分化到第8和12天，PsiR与对照组PsiR0存在显著性差异。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同范围限定。

<110> OrganizationName : 深圳职业技术学院

<120> Title : 靶向血管紧张素原的RNA干扰片段、其表达载体、混合克隆细胞株及其应用

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<213> OrganismName : mouse angiotensinogen

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<213> OrganismName : NCBI NM 007428

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gatagctgtg cttgtctagg ttggcgctga aggatacaca gaagcaaatg cacagatcgg 60

agatgactcc cacgggggca ggcctgaagg ccaccatctt ctgcatcttg acctgggtca 120

gcctgacggc tggggaccgc gtatacatcc accccttcca tctcctttac cacaacaaga 180

gcacctgcgc ccagctggag aaccccagtg tggagacact cccagagtca acgttcgagc 240

ctgtgcccat tcaggccaag acctcccctg tgaatgagaa gaccctgcat gatcagctcg 300

tgctggccgc cgagaagcta gaggatgagg accggaagcg ggctgcccag gtcgcaatga 360

tcgccaactt cgtgggcttc cgcatgtaca agatgctgaa tgaggcagga agtggggcca 420

gtggggccat cctctcacca ccagctctct ttggcaccct ggtctctttc taccttggat 480

ccttagatcc cacggccagc cagctgcaga cgctgctgga tgtccctgtg aaggagggag 540

actgcacctc ccgactagat ggacacaagg tcctcgctgc cctgcgggcc attcagggct 600

tgctggtcac ccagggtggg agcagcagcc agacacccct gctacagtcc attgtggtgg 660

ggctcttcac tgctccaggc tttcgtctaa agcactcatt tgttcagagc ctggctctct 720

ttacccctgc cctcttccca cgctctctgg atttatccac tgacccagtt cttgccactg 780

agaaaatcaa caggttcata aaggctgtga cagggtggaa gatgaacttg ccactggagg 840

gggtcagtac agacagcacc ctacttttca acacctacgt tcacttccaa ggaacgatga 900

gaggtttctc tcagctgcct ggagtccatg aattctgggt ggacaacagc atctcggtgt 960

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cctacaatct gcaggacctg ctggctgagg acaagctgcc cacccttttg ggtgcggagg 1260

caaatctgaa caacattggt gacaccaacc cccgagtggg agaggttctc aatagcatcc 1320

tcctcgaact caaagcagga gaggaggaac agccgaccac gtctgtccag cagcctggct 1380

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cttctaggcg gactgttact gagctgcgtt ttacaccctt tctttgacaa aacctaactt 1260

gcgcagaaaa aaaaaaaata agagacaaca ttggcatggc tttgtttttt taaatttttt 1320

ttaaagtttt tttttttttt tttttttttt tttttaagtt tttttgtttt gttttggcgc 1380

ttttgactca ggatttaaaa actggaacgg tgaaggcgac agcagttggt tggagcaaac 1440

atcccccaaa gttctacaaa tgtggctgag gactttgtac attgttttgt tttttttttt 1500

ttttggtttt gtcttttttt aatagtcatt ccaagtatcc atgaaataag tggttacagg 1560

aagtccctca ccctcccaaa agccaccccc actcctaaga ggaggatggt cgcgtccatg 1620

ccctgagtcc accccgggga aggtgacagc attgcttctg tgtaaattat gtactgcaaa 1680

aattttttta aatcttccgc cttaatactt catttttgtt tttaatttct gaatggccca 1740

ggtctgaggc ctcccttttt tttgtccccc caacttgatg tatgaaggct ttggtctccc 1800

tgggaggggg ttgaggtgtt gaggcagcca gggctggcct gtacactgac ttgagaccaa 1860

taaaagtgca caccttacct tacacaaac 1889

<212> Type : DNA

<211> Length : 1889

SequenceName : Mus musculus actin, beta (Actb)

SequenceDescription :

<210> 3

Claims

1.一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其特征在于：所述血管紧张素原是针对鼠前脂肪细胞内的血管紧张素原。

3.如权利要求2所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其特征在于：所述鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列NM007428，其序列表为SEQ ID NO.2。

4.一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，其特征在于：该表达载体含有权利要求1～3中任一项所述的RNA干扰片段。

5.如权利要求4所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，其特征在于：该表达载体具有图1a所示的结构。

6.如权利要求5所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，其特征在于：插入载体的siR结构为表1所示siR-AGT对应的结构。

7.一种混合克隆细胞株，能降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成，其特征在于：是由权利要求1～3中任一项所述靶向血管紧张素原的RNA干扰片段构建表达载体质粒并转染前脂肪细胞株而建立的。

8.如权利要求7所述的混合克隆细胞株，其特征在于：具体由下述步骤制得的：步骤1：RNAi干扰片段siR的设计；

9.如权利要求7所述的混合克隆细胞株，其特征在于：所述步骤2具体为：RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT-U6.1/NeoRNAi构建并合成表1的siR-AGT寡聚核苷酸单链后，再经退火成双链RNAi片段，PsiRNAT-U6.1/Neo载体经BamH I和Hind III双酶切成线性载体，最后经T4连接酶与双链RNAi片段连接构建成PsiR表达载体质粒，表达载体结构为图1a。

10.如权利要求1～2中任一项所述靶向血管紧张素原的RNA干扰片段用于抑制肥胖的应用。