CN109112131B - 用于抑制alas1基因表达的组合物与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向ALAS1基因的双链核糖核酸(dsRNA)组合物，和使用这类dsRNA组合物来改变(例如，抑制)ALAS1的表达的方法。

Description

用于抑制ALAS1基因表达的组合物与方法
本申请是申请日为2013年04月10日和发明名称为“用于抑制ALAS1基因表达的组合物与方法”的201380029258.8号发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请是对于2013年3月15日提交的美国申请号13/835,613的部分继续申请，并且还要求了对于2012年4月10日提交的美国临时申请号61/622,288的优先权。上述申请各自的全部内容以其整体结合在此。
发明领域
本发明涉及特异性抑制ALAS1基因的表达。
发明背景
遗传性卟啉症是血红素生物合成途径(在此还称作卟啉途径)中特异性酶的活性缺乏导致的一类失调。卟啉途径中酶的缺乏导致血红素的不充分生产并且导致卟啉前体和卟啉的累积，高浓度的卟啉前体和卟啉对组织是有毒的。
遗传性卟啉症中，急性间歇性卟啉症(AIP，例如，常染色体显性AIP)、杂斑卟啉症(variegate porphyria，VP，例如，常染色体显性VP)、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症或HCP，例如，常染色体显性HCP)、以及5’氨基乙酰丙酸(还称作δ-氨基乙酰丙酸或ALA)脱水酶缺乏卟啉症(ADP，例如，常染色体隐性ADP)被分类为急性肝性卟啉症并且表现为可能危及生命的急性神经性发作。这些急性发作特征是自主神经、外周神经和中枢神经症状，包括急性腹痛、高血压、心动过速、便秘、运动无力、瘫痪、以及抽搐。如果治疗不得当，接着可能发生四肢瘫痪、呼吸道受损、以及死亡。多种因素，包括细胞色素P450-诱导药物、饮食、以及激素变化可能通过增加肝5’-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1，血红素生物合成途径的第一以及限速酶)的活性促成急性发作。在急性卟啉症，例如，AIP、VP、HCP以及ADP中，各自的酶缺乏导致肝产生并累积一种或多种物质(例如，卟啉和/或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG)，这种或这些物质可能是神经毒的并且可能导致发生急性发作。参见，例如，巴望尼(Balwani，M)和戴斯尼克(Desnick，R.J.)，血液(Blood)，120：4496-4504，2012。
目前用于急性神经性发作的疗法是静脉给药氯化血红素(
Figure BDA0001787260730000021
灵北公司(Lundbeck)或
Figure BDA0001787260730000022
科懋公司(Orphan Europe))，这为ALAS1的负反馈抑制提供了外源血红素，并且由此降低了ALA和PBG产生。氯化血红素用于在急性发作期间进行治疗或用于预防发作，特别是对于患有急性卟啉症并在她们的月经周期中伴随激素变化经历频繁发作的女性。虽然患者总体上响应良好，但是它的效果缓慢，典型地花费二到四天或更久来使得ALA和PBG浓度朝向正常水平标准化。因为静脉内氯化血红素代谢迅速，通常需要三至四次输注以有效治疗或预防急性发作。此外，重复输注可能导致铁超负荷以及静脉炎，这可能危害外周静脉通路。尽管通过原位肝移植可治愈，这一手术具有显著的发病率和死亡率并且可用的肝供体是受限的。因此，需要更有效、作用快速且安全的替代性治疗方案。如果此类治疗可以通过皮下给药而递送，将是特别有益的，因为这将排除对输注和旷日持久的住院治疗的需求。
AIP，还称作胆色素原脱氨酶(PBGD)缺乏，或羟甲基胆素合酶(HMBS)缺乏，是最常见的急性肝性卟啉症。这是由HMBS基因突变引起的一种常染色体显性失调，这一突变将导致该酶的活性降低，例如，正常活性的一半。预先通过同源重组产生具有约30％野生型HMBS活性的AIP小鼠模型。如同人类患者一样，当给予生卟啉药(porphyrinogenic drugs)，如苯巴比妥时，这些小鼠增加肝ALAS1活性并且累积大量的血浆和尿ALA与PBG。因此，将它们用作对用于急性肝性卟啉症的新颖疗法的效力进行评估的优异模型。
发明内容
本发明描述了用于调节ALAS1基因表达的方法和iRNA组合物。在某些实施例中，使用ALAS1-特异性iRNA降低或抑制ALAS1基因的表达。这样的抑制可以有用于治疗与ALAS1表达相关的失调，如卟啉症。
因此，在此描述的是多种组合物和方法，如在细胞或在受试者中(例如，在哺乳动物如人类受试者中)，实现ALAS1基因RNA转录本的RNA-诱导的沉默复合体(RISC)-介导的切割。还描述了多种组合物和方法，用于治疗与ALAS1基因的表达相关的失调，像卟啉症，例如，X-连锁的铁粒幼细胞贫血(XLSA)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(Doss卟啉症或ADP)、急性间歇性卟啉症(AIP)、先天性红细胞生成性卟啉症(CEP)、迟发性皮肤卟啉症(PCT)、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症、或HCP)、杂斑卟啉症(VP)、红细胞生成性原卟啉症(EPP)、或婴儿暂时性红细胞卟啉症。在一些实施例中，该失调是急性肝性卟啉症，例如，ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、AIP、HCP、或VP。在某些实施例中，该失调是ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)或AIP。
在实施例中，该卟啉症是肝性卟啉症，例如，是选自以下各项的卟啉症：急性间歇性卟啉症(AIP)遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、和肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是纯合的显性肝性卟啉症(例如，纯合的显性AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是双卟啉症(dualporphyria)。
如在此使用的，术语“iRNA”、“RNAi”、“iRNA剂”、或“RNAi剂”是指包含如在此定义的术语RNA，并且例如，经由RNA-诱导的沉默复合物(RISC)路径介导RNA转录本的靶向切割的一种试剂。在一个实施例中，如在此所述的iRNA实现ALAS1在细胞或哺乳动物中表达的抑制。
包含在在此表征的组合物中的iRNA包含具有RNA链(反义链)的dsRNA，该RNA链具有一个区域，例如，该区域是30个或更少个核苷酸，通常是19-24个核苷酸的长度，该区域基本上与ALAS1基因(例如，小鼠或人ALAS1基因)的mRNA转录本(在此还称作“ALAS1-特异性iRNA”)的至少一部分互补。可替代地，或组合地，iRNAs包含具有RNA链(反义链)的dsRNA，该RNA链具有一个区域，该区域是30个或更少个核苷酸，通常是19-24个核苷酸的长度，该区域基本上与ALAS1基因(例如，人ALAS1基因的变体1或2)的mRNA转录本的至少一部分互补(在此还称作“ALAS1-特异性iRNA”)。
在实施例中，在此描述的iRNA(例如dsRNA)包括一个反义链，该反义链具有基本上与人ALAS1的一个区域互补的一个区域。在实施例中，人ALAS1具有序列NM_000688.4(SEQID NO：1)或NM_000688.5(SEQ ID NO：382)。
在其他实施例中，iRNA包含具有RNA链(反义链)的dsRNA，该RNA链具有一个区域，该区域基本上与根据表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中任意一个的ALAS1 mRNA的一部分互补。在一个实施例中，iRNA包含具有RNA链(反义链)的dsRNA，该RNA链具有一个区域，该区域基本上与ALAS1 mRNA的一部分互补，例如人ALAS1 mRNA(例如，如在SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：382中提供的人ALAS1 mRNA)。
在一个实施例中，用于抑制ALAS1基因表达的iRNA包含至少两个彼此互补的序列。iRNA包括具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包含基本上与编码ALAS1转录本的mRNA的至少一部分互补的核苷酸序列，并且该互补区域是30个或更少个核苷酸和至少15个核苷酸长度。总体上，iRNA长度是19个至24个核苷酸。
在一些实施例中，iRNA是19个至21个核苷酸长度。在一些实施例中，iRNA是19-21个核苷酸长度并且使一种脂质配制品，例如，脂质纳米颗粒(LNP)配制品(例如，LNP11制剂)。
在一些实施例中，iRNA是21个至23个核苷酸长度。在一些实施例中，iRNA是21-23个核苷酸长度并且处于共轭物的形式，例如，共轭至如在此描述的一种或多种GalNAc衍生物。
在一些实施例中，iRNA是从约15至约25个核苷酸长度，并且在其他实施例中，该iRNA是从约25至约30个核苷酸长度。一旦与表达ALAS1的细胞接触，靶向ALAS1的iRNA抑制ALAS1基因的表达至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％或更多，如通过如本文所述的方法分析时。在一个实施例中，在稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)中配制靶向ALAS1的iRNA。
在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包含选自由表2、3、6、7、8、9、14、和15的有义序列组成的组的dsRNA的第一序列以及选自由表2、3、6、7、8、9、14、和15的相应反义序列组成的组的第二序列。
在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包含选自由表2、3、6、7、8、9、14、15、18、和20的有义序列组成的组的dsRNA的第一序列以及选自由表2、3、6、7、8、9、14、15、18、和20的相应反义序列组成的组的第二序列。在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)具有选自以下如在本文实例中披露的那些的有义和/或反义序列：AD-58882、AD-58878、AD-58886、AD-58877、AD-59115、AD-58856、AD-59129、AD-59124、AD-58874、AD-59125、AD-59105、AD-59120、AD-59122、AD-59106、AD-59126、以及AD-59107。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)具有选自以下那些的有义和/或反义序列：AD-58882、AD-58878、AD-58886、AD-58877、AD-59115、AD-58856、以及AD-59129。
在此表征的iRNA分子可以包括天然存在的核苷酸或可以包括至少一个修饰的核苷酸，包括但不限于2′-O-甲基修饰的核苷酸、具有5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸和与胆甾醇基衍生物连接的末端核苷酸。可替代地，修饰的核苷酸可以选自下组：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、2′-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包含非天然碱基的核苷酸。这种修饰的序列可以基于，例如，所述iRNA的第一序列，所述第一序列选自由表2的有义序列组成的组，和第二序列，所述第二序列选自由表2的相应反义序列组成的组。
在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包括一个有义链，该有义链包括选自下组的一个序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：334、SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：346、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：362、SEQID NO：366、SEQ ID NO：376、以及SEQ ID NO：380。
在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包括一个反义链，该反义链包括选自下组的一个序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：363、SEQID NO：367、SEQ ID NO：377、以及SEQ ID NO：381。
在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包括一个有义链，该有义链包括选自下组的一个序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：172、SEQID NO：176、SEQ ID NO：186、以及SEQ ID NO：190。在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包括一个反义链，该反义链包括选自下组的一个序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、以及SEQ ID NO：191。
在一个实施例中，在此描述的iRNA靶向野生型ALAS1 RNA转录本变体，并且在另一个实施例中，iRNA靶向突变转录本(例如，携带等位变体的ALAS1 RNA)。例如，本发明中表征的iRNA可以靶向ALAS1的多态性变体，如单核苷酸多态性(SNP)。在另一个实施例中，iRNA靶向野生型和突变ALAS1转录本两者。在又另一个实施例中，iRNA靶向ALAS1的特定转录本变体(例如，人ALAS1变体1)。在又另一个实施例中，iRNA剂靶向多种转录本变体(例如，人ALAS1的变体1和变体2两者)。
在一个实施例中，本发明中表征的iRNA靶向ALAS1 RNA转录本的非编码区，如转录本的5′或3′非翻译区。
在一些实施例中，在此描述的iRNA处于共轭物(例如，碳水化合物共轭物)形式，该共轭物可以用作靶向部分和/或配体，如在此描述的。在一个实施例中，共轭物附接至dsRNA的有义链的3’末端。在一些实施例中，共轭物经由连接物附接，例如，经由二价或三价分枝的连接物。
在一些实施例中，共轭物包括一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。这样一种共轭物在此还称作GalNAc共轭物。在一些实施例中，共轭物将RNAi剂靶向特定细胞，例如，肝脏细胞(liver cell)，像肝上皮实质细胞(hepatocyte)。GalNAc衍生物可以经由连接物附接，例如，二价或三价分枝的连接物。在具体的实施例中，该共轭物是
Figure BDA0001787260730000071
在一些实施例中，RNAi剂经由连接物附接至碳水化合物共轭物，例如，如以下方案中示出的连接物，其中X是O或S
Figure BDA0001787260730000081
在一些实施例中，X是O。在一些实施例中，X是S。
在一些实施例中，RNAi剂共轭至如表1中定义且如下示出的L96
Figure BDA0001787260730000082
在一个方面中，在此提供的是一种药物组合物，用于抑制ALAS1基因在生物体(通常是人类受试者)中的表达。这种组合物一般包含本文所述的一种或多种iRNA和药学上可接受的载体或递送媒介物。在一个实施例中，该组合物用于治疗卟啉症，例如，AIP。
在一个方面中，在此提供的iRNA是用于抑制ALAS1的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括一个有义链和一个反义链(15-30个碱基对长度)，并且该反义链与SEQ ID NO：1或382中的至少15个连续核苷酸互补。
在另一个方面中，在此提供的iRNA是双链RNAi(dsRNA)，它包括与反义链互补的有义链，其中所述反义链包括与ALAS1 RNA转录本互补的一个区域，其中每条链具有约14至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi剂由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′
(III)
其中：
i、j、k、以及1各自独立地是0或1；
p、p’、q、以及q′各自独立地是0-6；
Na和Na′各自独立地表示包括0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包括0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
np、np′、nq、以及nq′各自独立地表示突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、以及Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰。
在实施例中，有义链共轭至至少一个配体。
在实施例中，i是1；j是1；或i和j两者都是1。
在实施例中，k是1；1是1；或k和l两者都是1。
在实施例中，XXX与X′X′X′互补，YYY与Y′Y′Y′互补，并且ZZZ与Z′Z′Z′互补。
在实施例中，Y′Y′Y′基序发生在该反义链从5′-端开始的位置11、12和13处。
在实施例中，Y′是2′-O-甲基。
在实施例中，双链体区域是15-30个核苷酸对的长度。
在实施例中，双链体区域是17-23个核苷酸对的长度。
在实施例中，双链体区域是19-21个核苷酸对的长度。
在实施例中，双链体区域是21-23个核苷酸对的长度。
在实施例中，核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧基、2’-羟基、及其组合。
在实施例中，核苷酸上的修饰是2′-O-甲基、2′-氟或两者。
在实施例中，配体包括碳水化合物。
在实施例中，配体经由连接物附接。
在实施例中，连接物是二价或三价分枝的连接物。
在实施例中，配体是
Figure BDA0001787260730000101
在实施例中，配体和连接物是如式XXIV所示的：
Figure BDA0001787260730000102
在实施例中，配体附接至有义链的3’末端。
在实施例中，dsRNA具有(例如，包括)选自下组的核苷酸序列，该组是表2和3中提供的序列。在实施例中，dsRNA具有选自下组的核苷酸序列，该组是表2、3、6、7、8和9中提供的序列。在实施例中，dsRNA具有选自下组的核苷酸序列，该组是表2、3、6、7、8、9、14和15中提供的序列。在实施例中，dsRNA具有选自下组的核苷酸序列，该组是表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中提供的序列。在实施例中，dsRNA具有表18中披露的核苷酸序列。在实施例中，dsRNA具有选自下组的核苷酸序列，该组是表14和15中提供的序列。
在实施例中，dsRNA具有选自下组的核苷酸序列，该组是表3和8中提供的序列。
在又一个方面中，在此提供的iRNA是用于抑制ALAS1的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括一个有义链和一个反义链，该反义链包含与ALAS1RNA转录本互补的一个区域，该反义链包含与表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中任一个列出的反义序列之一相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些此类实施例中，有义和反义序列选自以下如本文实例中披露的那些双链体：AD-58882、AD-58878、AD-58886、AD-58877、AD-59115、AD-58856、AD-59129、AD-59124、AD-58874、AD-59125、AD-59105、AD-59120、AD-59122、AD-59106、AD-59126、以及AD-59107。在实施例中，有义和反义序列选自以下那些双链体：AD-58882、AD-58878、AD-58886、AD-58877、AD-59115、AD-58856、和AD-59129。在实施例中，有义和反义序列选自以下那些双链体：AD-58632。在实施例中，有义和反义序列选自以下那些双链体：AD-59453、AD-59395、AD-59477、和AD-59492。在实施例中，有义和反义序列是在此披露的那些双链体，它们压制ALAS1 mRNA表达至少50％、60％、70％、80％、85％或90％，例如，如使用在此提供的实例中披露的测定进行评估。
在一些实施例中，dsRNA包括至少一个修饰核苷酸。
在一些实施例中，修饰的核苷酸的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：2′-O-甲基修饰的核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基的核苷酸和与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基连接的末端核苷酸。
在一些实施例中，修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、2′-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包含非天然碱基的核苷酸。
在一些实施例中，互补区域长度是至少17个核苷酸。
在一些实施例中，互补区域长度是在19个和21个核苷酸之间。
在一些实施例中，互补区域长度是19个核苷酸。
在一些实施例中，每一链的长度是不超过30个核苷酸。
在一些实施例中，至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3’突出端。
在一些实施例中，至少一条链包含具有至少2个核苷酸的3’突出端。
在一些实施例中，在此描述的dsRNA进一步包括配体。
在一些实施例中，配体是GalNAc配体。
在一些实施例中，配体将dsRNA靶向肝上皮实质细胞。
在一些实施例中，配体共轭至dsRNA的有义链的3’末端。
在一些实施例中，互补区域由选自表2或表3的反义序列组成。在实施例中，互补区域由选自表2、3、6、7、8、9、14、或15的反义序列组成。在实施例中，互补区域由选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18、或20的反义序列组成。在一些实施例中，互补区域由选自以下如在本文实例中披露的反义序列组成：AD-58882、AD-58878、AD-58886、AD-58877、AD-59115、AD-58856、AD-59129、AD-59124、AD-58874、AD-59125、AD-59105、AD-59120、AD-59122、AD-59106、AD-59126、或AD-59107。在一些实施例中，互补区域由双链体AD-58632的反义序列组成。在实施例中，互补区域由选自以下各项的反义序列组成：AD-59453、AD-59395、AD-59477、以及AD-59492。在实施例中，互补区域由选自在此披露的双链体的反义序列组成，它们压制ALAS1mRNA表达至少50％、60％、70％、80％、85％或90％，例如，如使用在此提供的实例中披露的测定进行评估。
在一些实施例中，dsRNA包含由选自表2或表3的有义链序列组成的有义链和由选自表2或表3的反义序列组成的反义链。
在一些实施例中，dsRNA包含由选自表2、3、6、7、8、9、14、或15的有义链序列组成的有义链和由选自表2、3、6、7、8、9、14、或15的反义序列组成的反义链。在实施例中，dsRNA包括一对对应的有义和反义序列，其选自表2、3、6、7、8、9、14、和15中披露的那些双链体。
在一些实施例中，dsRNA包含由选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18、或20的有义链序列组成的有义链和由选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18、或20的反义序列组成的反义链。在实施例中，dsRNA包括一对对应的有义和反义序列，其选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18、和20中披露的那些双链体的。
在一个方面中，本发明提供了包含在此表征的iRNA(例如，dsRNA)中至少一个的细胞。所述细胞通常是哺乳动物细胞，如人细胞。在一些实施例中，细胞是类红细胞。在其他实施例中，细胞是肝脏细胞(例如，肝上皮实质细胞)。
在一个方面中，在此提供的是一种药物组合物，用于抑制ALAS1基因的表达，该组合物包括在此描述的iRNA(例如，dsRNA)。
在本文描述的药物组合物的实施例中，iRNA(例如，dsRNA)在一种非缓冲溶液中进行给予。在实施例中，非缓冲溶液是盐水或水。
在本文描述的药物组合物的实施例中，iRNA(例如，dsRNA)与缓冲溶液一起给予。在实施例中，缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任意组合。在实施例中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在本文描述的药物组合物的实施例中，iRNA(例如，dsRNA)靶向肝上皮实质细胞。
在本文描述的药物组合物的实施例中，静脉内给予组合物。
在本文描述的药物组合物的实施例中，皮下给予组合物。
在实施例中，药物组合物包括在此描述的iRNA(例如，dsRNA)，该iRNA包括配体(例如，GalNAc配体)，该配体将该iRNA(例如，dsRNA)靶向肝上皮实质细胞。
在实施例中，药物组合物包括在此描述的iRNA(例如，dsRNA)，该iRNA包括配体(例如，GalNAc配体)，并且皮下给予该药物组合物。在实施例中，该配体将该iRNA(例如，dsRNA)靶向肝上皮实质细胞。
在某些实施例中，药物组合物，例如，在此描述的组合物包括脂质配制品。在一些实施例中，RNAi剂是LNP配制品，例如，MC3配制品。在一些实施例中，LNP配制品将RNAi剂靶向特定细胞，例如，肝脏细胞，例如，肝上皮实质细胞。在实施例中，脂质配制品是LNP11配制品。在实施例中，静脉内给予组合物。
在另一个实施例中，配制这种药物组合物以便根据本文所述的剂量方案给药，例如，每4周不多于1次、每3周不多于1次、每2周不多于1次或每周不多于1次。在另一个实施例中，可以维持药物组合物的给药一个月或更长时间，例如，1个、2个、3个或6个月，或1年或更长时间。
在另一个实施例中，将含有在本发明中表征的iRNA(例如，靶向ALAS1的dsRNA)的组合物随一种非iRNA治疗剂，如已知治疗卟啉症(例如，AIP)或卟啉症的症状(例如，疼痛)的药剂一起给予。在另一个实施例中，将含有在本发明中表征的iRNA(例如，靶向AIP的dsRNA)的组合物随一种非iRNA治疗方案，如氯化血红素或葡萄糖(例如，IV葡萄糖)输注一起给予。例如，在本发明中表征的iRNA可以在葡萄糖、右旋糖、或类似的用作恢复能量平衡(例如，全肠外营养)的治疗之前、之后或与其同时给予。在本发明中表征的iRNA还可以在血红素产品(例如，氯化血红素、精氨酸血红素、或白蛋白血红素)、以及任选地还与葡萄糖(例如，IV葡萄糖)或类似物组合给予之前、之后或与其同时给予。
典型地，静脉内(IV)给予用于卟啉症治疗而给予的葡萄糖。静脉内给予葡萄糖在此称作“IV葡萄糖”。然而，还包括替代性实施例，其中通过其他手段给予葡萄糖。
在一个实施例中，向患者给予ALAS1 iRNA，并且然后向该患者给予非iRNA剂或治疗方案(例如，葡萄糖和/或血红素产品)(反之亦然)。在另一个实施例中，同时给予ALAS1iRNA和非iRNA治疗剂或治疗方案。
在一个方面中，在此提供的是抑制细胞中ALAS1表达的方法，该方法包括：(a)向该细胞中引入在此描述的iRNA(例如dsRNA)并且(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段时间，该时间足以获得ALAS1基因的mRNA转录本的降解，由此抑制该细胞中的ALAS1基因的表达。
在一个方面中，在此提供的是用于降低或抑制细胞(例如，类红细胞或肝脏细胞，例如，像肝上皮实质细胞)中ALAS1基因表达的方法。该方法包括：
(a)向所述细胞引入双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括至少两个彼此互补的序列。该dsRNA具有包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链；该反义链具有基本上与编码ALAS1的mRNA的至少一部分互补的互补区域，并且其中该互补区域是30个或更少核苷酸长度，即15-30个核苷酸长度，并且总体上是19-24个核苷酸长度，并且其中一旦与表达ALAS1的细胞接触，则该dsRNA抑制ALAS1基因的表达至少10％、例如至少20％、至少30％、至少40％或更多；并且
(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段时间，该时间足以获得ALAS1基因的mRNA转录本的降解，由此降低或抑制该细胞中的ALAS1基因的表达。
在抑制细胞中ALAS1表达的前述方法的实施例中，将该细胞离体、体外、或体内地进行处理。在实施例中，细胞是肝上皮实质细胞。
在实施例中，细胞存在于需要治疗、预防和/或管理与ALAS1表达相关的失调的受试者中。
在实施例中，该失调是卟啉症。在实施例中，卟啉症是急性间歇性卟啉症或ALA-脱水酶缺乏卟啉症。
在实施例中，该卟啉症是肝性卟啉症，例如，是选自以下各项的卟啉症：急性间歇性卟啉症(AIP)遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、和肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是纯合的显性肝性卟啉症(例如，纯合的显性AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是双卟啉症。
在实施例中，ALAS1表达被抑制至少30％。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)具有在0.01-1nM范围内的IC50。
在某些实施例中，细胞(例如，肝上皮实质细胞)是哺乳动物细胞(例如，人类、非人类灵长动物、或啮齿动物细胞)。
在一个实施例中，离体、体外、或体内地处理细胞(例如，存在于受试者(例如，需要治疗、预防和/或管理与ALAS1表达相关的失调的患者)中的细胞)。
在一个实施例中，受试者是处于风险或被诊断为患有卟啉症的哺乳动物(例如，人类)，卟啉症是例如，X-连锁的铁粒幼细胞贫血(XLSA)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP或Doss卟啉症)、急性间歇性卟啉症(AIP)、先天性红细胞生成性卟啉症(CEP)、迟发性皮肤卟啉症(PCT)、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症或HCP)、杂斑卟啉症(VP)、红细胞生成性原卟啉症(EPP)、或婴儿暂时性红细胞卟啉症。在一些实施例中，该失调是急性肝性卟啉症，例如，ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、AIP、HCP、或VP。在具体实施例中，该失调是ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)或AIP。
在实施例中，该卟啉症是肝性卟啉症，例如，是选自以下各项的卟啉症：急性间歇性卟啉症(AIP)遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、和肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是纯合的显性肝性卟啉症(例如，纯合的显性AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是双卟啉症。
在一个实施例中，引入的dsRNA降低或抑制细胞中ALAS1基因的表达。
在一个实施例中，与参比细胞(例如，未处理的细胞或用非靶向对照dsRNA处理的细胞)相比较，引入的dsRNA降低或抑制ALAS1基因的表达、或一种或多种卟啉或卟啉前体(例如，δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、胆色素原(PBG)、羟甲基胆素(HMB)、尿卟啉原(protoporphrinogen)I或III、粪卟啉原I或III、原卟啉原IX、以及原卟啉IX)或卟啉产物或代谢物的水平至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。不受理论的限制，ALAS1是卟啉途径的第一酶。因此，降低ALAS1基因的表达很可能降低一种或多种卟啉前体、卟啉或卟啉产物或代谢物的水平。
在其他方面，本发明提供了用于治疗、预防或管理与ALAS1表达相关的病理过程的方法，(例如，涉及卟啉、卟啉前体或卟啉途径缺陷的病理过程，例如，像卟啉症)。在一个实施例中，该方法包括向受试者，例如需要这种治疗、预防、或管理的患者施用有效(例如，治疗或预防有效)量的在此表征的一种或多种iRNA。
在一个方面中，在此提供的是治疗和/或预防与ALAS1表达相关的失调的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者给予治疗有效量的在此描述的iRNA(例如，dsRNA)、或在此描述的包括iRNA(例如，dsRNA)的组合物。
在一个方面中，在此提供的是治疗和/或预防卟啉症的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者给予双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括一个有义链和一个反义链(15-30个碱基对长度)，并且该反义链与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：382中的至少15个连续核苷酸互补。
在一个实施例中，受试者(例如，患者)患有卟啉症。在另一个实施例中，受试者(例如，患者)处于发展卟啉症的风险中。在一些实施例中，靶向ALAS1的iRNA的给予减轻或缓解患者中与ALAS1相关的失调的至少一个症状的严重性。
在一个实施例中，受试者是处于风险或已经被诊断为患有与ALAS1表达相关的失调的哺乳动物(例如，人类)，例如卟啉症，像X-连锁的铁粒幼细胞贫血(XLSA)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(Doss卟啉症)、急性间歇性卟啉症(AIP)、先天性红细胞生成性卟啉症(CEP)、迟发性皮肤卟啉症(PCT)、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症或HCP)、杂斑卟啉症(VP)、红细胞生成性原卟啉症(EPP)、或婴儿暂时性红细胞卟啉症。在又一个实施例中，卟啉症是急性肝性卟啉症，例如，ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、AIP、HCP、或VP。在一些此类实施例中，该失调是ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)或AIP。
在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中。在实施例中，该卟啉症是肝性卟啉症，例如，是选自以下各项的卟啉症：急性间歇性卟啉症(AIP)遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、和肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是纯合的显性肝性卟啉症(例如，纯合的显性AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是双卟啉症。
在实施例中，卟啉症、卟啉症的症状、前驱症状、或卟啉症的发作通过暴露于如在此描述的诱发因素而诱导。在一些实施例中，诱发因素是化学暴露。在一些实施例中，诱发因素是药物，例如，处方药物或非处方药。在一些实施例中，诱发因素是月经周期，例如，月经周期的一个具体时期，例如，黄体期。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是在卟啉症急性发作后给予。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是在卟啉症急性发作过程中给予。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是预防性给予的以防止卟啉症的急性发作。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)被配制为LNP配制品。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)处于GalNAc共轭物的形式。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)以0.05-50mg/kg的剂量给予。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)以0.01mg/kg-5mg/kg受试者体重的浓度给予。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)被配制为LNP配制品并且是以0.05-5mg/kg的剂量给予。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)是处于GalNAc共轭物的形式并且是以0.5-50mg/kg的剂量给予。
在实施例中，该方法降低受试者中卟啉或卟啉前体的水平。
在实施例中，该水平被降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一个实施例中，该水平被降低至少30％。
在实施例中，卟啉前体是δ-氨基乙酰丙酸(ALA)或胆色素原(PBG)。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)具有在0.01-1nM范围内的IC50。
在实施例中，当将受试者暴露于诱发因素(例如，经前期或黄体期)时，在此描述的方法
(i)改善与ALAS1相关的失调(例如，卟啉症)相关联的症状
(ii)抑制受试者中的ALAS1表达，
(iii)降低受试者中卟啉前体(例如，ALA或PBG)或卟啉的水平，
(iv)减少受试者中与卟啉症相关联的症状的急性发作的频率，或
(v)减少受试者中与卟啉症相关联的症状的急性发作的发病率。
在实施例中，该方法改善疼痛和/或渐进性神经病变。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是根据剂量方案给予的。
在一些实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是在卟啉症的急性发作之前或过程中给予的。在一些实施例中，iRNA是在卟啉症的急性发作之前给予的。
在一些实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是在前驱症状过程中给予的。在实施例中，前驱症状的特征在于腹痛、恶心、心理症状(例如，焦虑)、坐立不安和/或失眠。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是在月经周期的一个具体时期过程中，例如，在黄体期过程中给予的。
在实施例中，例如，通过降低严重性、持续时间、或发作频率，该方法改善或预防卟啉症的循环发作。在实施例中，循环发作与诱发因素相关联。在实施例中，诱发因素是月经周期，例如，月经周期的一个具体时期，例如，黄体期。
在实施例中，受试者具有升高的ALA和/或PBG的水平。在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，肝性卟啉症。在实施例中，受试者是无症状的。在实施例中，如在此所述的，受试者携带有与卟啉症相关联的遗传变异(例如，基因突变)。
在实施例中，受试者具有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中并且经受疼痛(例如，慢性疼痛，例如，慢性神经性疼痛)和/或神经病变(例如，渐进性神经病变)。在实施例中，受试者不经受急性发作但是经受疼痛(例如，慢性疼痛，例如，慢性神经性疼痛)和/或神经病变(例如，渐进性神经病变)。在实施例中，疼痛是腹痛。
在实施例中，受试者(a)具有升高的ALA和/或PBG的水平并且(b)经受疼痛(例如，慢性疼痛，例如，慢性神经性疼痛)和/或神经病变(例如，渐进性神经病变)。在实施例中，疼痛是腹痛。
在实施例中，受试者具有ALA和/或PBG的升高的血浆水平和/或尿水平。在实施例中，升高的ALA和/或PBG的水平伴随有其他症状，例如，疼痛(例如，慢性疼痛，例如，慢性神经性疼痛)或神经病变(例如，渐进性神经病变)。在实施例中，疼痛是腹痛。在实施例中，受试者是无症状的。在实施例中，受试者具有与卟啉症相关联的基因突变，例如，如在此描述的突变。
在实施例中，受试者具有升高的卟啉前体，例如，ALA和/或PBG水平(例如，血浆水平或尿水平)，例如，该水平是大于、或大于或等于参比值。在实施例中，该水平是大于参比值。在实施例中，参比值是超过健康个体样本中平均水平两个标准差。在实施例中，参比值是参比上限。
在实施例中，受试者具有ALA和/或PBG的大于、或大于或等于参比上限2倍、3倍、4倍、或5倍的血浆水平和/或尿水平。如在此使用的，“参比上限”是指参比样本的95％置信区间上限的一个水平，该样本是，例如，正常(例如，野生型)或健康个体，例如，不携带与卟啉症相关联的基因突变的个体和/或不经受卟啉症的个体的样本。在实施例中，受试者具有大于参比上限2至4倍的ALA和/或PBG的尿水平。在实施例中，受试者具有大于参比上限4倍的ALA和/或PBG的尿水平。
在实施例中，血浆PBG的参比值是0.12μmol/L。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于0.12μmol/L、0.24μmol/L、0.36μmol/L、0.48μmol/L、或0.60μmol/L的血浆PBG水平。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于0.48μmol/L的PBG的血浆水平。
在实施例中，尿PBG的参比值是1.2mmol/mol肌酸酐。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于1.2mmol/mol肌酸酐、2.4mmol/mol肌酸酐、3.6mmol/mol肌酸酐、4.8mmol/mol肌酸酐、或6.0mmol/mol肌酸酐的尿PBG水平。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于4.8mmol/mol肌酸酐的PBG的尿水平。
在实施例中，血浆ALA的参比值是0.12μmol/L。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于0.12μmol/L、0.24μmol/L、0.36μmol/L、0.48μtmol/L、或0.60μtmol/L的血浆ALA水平。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于0.48umol/L的血浆ALA水平。
在实施例中，尿ALA的参比值是3.1mmol/mol肌酸酐。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于3.1mmol/mol肌酸酐、6.2mmol/mol肌酸酐、9.3mmol/mol肌酸酐、12.4mmol/mol肌酸酐、或15.5mmol/mol肌酸酐的尿ALA水平。
在实施例中，该方法降低升高的ALA和/或PBG的水平。在实施例中，该方法减少疼痛(例如，慢性疼痛，例如，慢性神经性疼痛)和/或神经病变(例如，渐进性神经病变)。在实施例中，疼痛是腹痛。在实施例中，疼痛是神经性疼痛(例如，与急性卟啉症的渐进性神经病变相关联的疼痛)。减少疼痛可以包括，例如，预防疼痛、疼痛发作延迟、疼痛频率下降、和/或疼痛严重性下降。
在实施例中，例如，通过降低严重性、持续时间、或发作频率，该方法改善或预防卟啉症的急性发作。
在实施例中，该方法减少或预防神经损伤。
在实施例中，该方法预防恶化(例如，预防畸形发展)或导致临床测量值，例如，肌肉和/或神经功能临床测量值，例如，EMG和/或神经传导速度的改善。
在实施例中，该方法对于降低ALA和/或PBG的水平(例如，ALA和/或PBG的血浆或尿水平)是有效的。在实施例中，该方法对于产生升高的ALA和/或PBG水平的预定下降是有效的。
在实施例中，该预定下降是降低至小于或等于参比值的一个值。在一些实施例中，参比值是参比上限。在一些实施例中，参比值是超过参比样本中平均水平两个标准差的一个值。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是例如，根据剂量方案重复给予的。
在实施例中，将iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物预防性给予受试者，该受试者处于发展卟啉症的风险中。在实施例中，从青春期开始预防性地给予iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物。在实施例中，受试者携带有与卟啉症相关联的基因突变和/或具有升高的ALA和/或PBG的水平(例如，ALA和/或PBG的升高的血浆或尿水平)。在实施例中，突变使得个体易于急性发作(例如，一旦暴露于诱发因素，例如，药物、饮食或其他诱发因素，例如，如在此披露的诱发因素)。在实施例中，突变是与卟啉或卟啉前体(例如，ALA和/或PBG)的升高的水平相关联的。在实施例中，突变是与慢性疼痛(例如，慢性神经性疼痛)和/或神经病变(例如，渐进性神经病变)相关联的。
在实施例中，突变是ALAS1基因的突变。在实施例中，突变是ALAS1基因启动子的突变，或是ALAS1基因上游或下游区域中的突变。在实施例中，突变是转录因子或与ALAS1相互作用的其他基因的突变。在实施例中，突变是编码血红素生物合成途径中的酶的基因的突变。
在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)或包括iRNA的组合物是皮下给予。在实施例中，iRNA是处于GalNAc共轭物的形式。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)以0.5-50mg/kg的剂量给予。
在一个方面中，在此提供地是对具有升高的ALA和/或PBG水平的受试者进行治疗的方法，该方法包括向该受试者给予双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括一个有义链和一个长度是15-30个碱基对的反义链，并且该反义链与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：382中的至少15个连续核苷酸互补。
在一个方面中，在此提供地是对具有升高的ALA和/或PBG水平的受试者进行治疗的方法，该方法包括向该受试者给予一个治疗有效量的、如在此所述的dsRNA或包含dsRNA的组合物。
在一些实施例中，在此描述的方法对于降低ALA和/或PBG的水平是有效的。在一些实施例中，降低ALA和/或PBG的水平以使得它是小于、或小于或等于参比值，例如，参比上限。在另一个方面中，本发明提供了用于降低细胞(例如，类红细胞或肝脏细胞，例如像肝上皮实质细胞)中卟啉或卟啉前体水平的方法。在一个实施例中，离体、体外、或体内地处理细胞(例如，存在于受试者(例如，需要治疗、预防和/或管理与ALAS1表达相关的失调的患者)中的细胞)。该方法包括使该细胞与有效量的一个或多个靶向ALAS1的iRNA相接触，例如，在此披露的一个或多个iRNA，由此相对于接触之前的水平，降低该细胞中卟啉或卟啉前体的水平；或降低该细胞位于其中的受试者体内的其他细胞、组织或流体中卟啉或卟啉前体的水平。可以使用此类方法来治疗与ALAS1表达相关的失调，例如卟啉症，例如，AIP或ALA脱水酶缺乏卟啉症(例如，改善其严重性)。
在一个实施例中，离体、体外、或体内地实现接触步骤。例如，该细胞可以存在于受试者中，例如，该受试者是哺乳动物(例如，人类)，处于患有卟啉症的风险中或已经被诊断为患有卟啉症。在一个实施例中，卟啉症是急性肝性卟啉症。在实施例中，该卟啉症是肝性卟啉症，例如，是选自以下各项的卟啉症：急性间歇性卟啉症(AIP)、遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、和肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是纯合的显性肝性卟啉症(例如，纯合的显性AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是双卟啉症。
在一个方面中，在此提供的是一种用于降低细胞中卟啉或卟啉前体(例如，ALA或PBG)的水平的方法，该方法包括以一个有效降低该细胞中卟啉或卟啉前体的水平的量将该细胞与iRNA(例如，dsRNA)相接触。在实施例中，细胞是肝上皮实质细胞。在实施例中，卟啉或卟啉前体是δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、胆色素原(PBG)、羟甲基胆素(HMB)、尿卟啉原I或III、粪卟啉原I或III、原卟啉原IX、或原卟啉IX。在实施例中，卟啉前体是ALA或PBG。
在一个实施例中，细胞是类红细胞。在又一个实施例中，细胞是肝脏细胞(例如，肝上皮实质细胞)。
在一个方面中，在此提供的是一种载体，该载体编码如在此描述的iRNA(例如，dsRNA)的至少一条链。
在一个方面中，在此提供的是一种编码dsRNA的至少一条链的载体，其中所述dsRNA包含与编码ALAS1的mRNA的至少一部分互补的一个区域，其中所述dsRNA长度是30个或更少碱基对，并且其中所述dsRNA靶向所述mRNA以便切割。
在实施例中，该互补区域长度是至少15个核苷酸。
在实施例中，该互补区域长度是19至21个核苷酸。在一个方面，本发明提供一种用于抑制细胞中ALAS1基因表达的载体。在一个实施例中，载体包括如在此所述的iRNA。在一个实施例中，该载体包含与核苷酸序列可操作连接的至少一种调节序列，其中所述核苷酸序列编码如本文所述的iRNA的至少一条链。在一个实施例中，载体包括ALAS1 iRNA的至少一条链。
在一个方面中，在此提供的是一种细胞，该细胞包括如在此所述的载体。在一个方面中，在此提供的是一种细胞，该细胞包括用于抑制细胞中ALAS1基因表达的载体。该载体包含与核苷酸序列可操作连接的调节序列，该核苷酸序列编码如本文所述的iRNA之一的至少一条链。在一个实施例中，细胞是肝脏细胞(例如，肝上皮实质细胞)。在另一个实施例中，细胞是类红细胞。
特别地，本发明涉及以下各项：
1.一种用于抑制ALAS1的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括一个有义链和一个长度是15-30个碱基对的反义链，并且该反义链与SEQ ID NO：1或382中的至少15个连续核苷酸互补。
2.一种用于抑制ALAS1的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括一个有义链和一个反义链，该反义链包含与ALAS1 RNA转录本互补的一个区域，该反义链包含与AD-58882(SEQ ID NO：3434)或表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中任一个列出的反义序列之一相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
3.如第1或2项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包括至少一个经修饰的核苷酸。
4.如第3项所述的dsRNA，其中所述修饰的核苷酸的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：2′-O-甲基修饰的核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基的核苷酸、以及与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基连接的末端核苷酸。
5.如第3项所述的dsRNA，其中所述经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包括非天然碱基的核苷酸。
6.如前述各项中任一项所述的dsRNA，其中该互补区域长度是至少17个核苷酸。
7.如第6项所述的dsRNA，其中该互补区域是在19个和21个核苷酸长度之间。
8.如第7项所述的dsRNA，其中该互补区域是19个核苷酸长度。
9.如前述各项中任一项所述的dsRNA，其中每条链长度是不多于30个核苷酸。
10.如前述各项中任一项所述的dsRNA，其中至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3’突出端。
11.如第10项所述的dsRNA，其中至少一条链包含具有至少2个核苷酸的3′突出端。
12.如前述各项中任一项所述的dsRNA，进一步包括一种配体。
13.如第12项所述的dsRNA，其中所述配体是GalNAc配体。
14.如第11、12或78-97中任一项所述的dsRNA，其中该配体将该dsRNA靶向肝上皮实质细胞。
15.如第11-13或78-97项中任一项所述的dsRNA，其中该配体共轭至该dsRNA的有义链的3’末端。
16.如前述各项中任一项所述的dsRNA，其中该互补区域由一个反义序列组成，该反义序列选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18、或20中披露的反义序列。
17.如前述各项中任一项所述的dsRNA，其中该dsRNA包含一个有义链和一个反义链，该有义链由一个有义序列组成，该有义序列选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18、和20中披露有义序列，该反义链由一个反义序列组成，该反义序列选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18、和20中披露的反义序列。
18.一种细胞，包含如前述各项中任一项所述的dsRNA。
19.一种用于抑制ALAS1基因表达的药物组合物，该组合物包含如第1-17项中任一项所述的dsRNA。
20.如第19项所述的药物组合物，其中dsRNA在一种非缓冲溶液中进行给予。
21.如第20项所述的药物组合物，其中所述非缓冲溶液是盐水或水。
22.如第13项或第19项所述的药物组合物，其中所述dsRNA与一种缓冲溶液一起给予。
23.如第22项所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、或磷酸盐，或其任意组合。
24.如第23项所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
25.如第19项所述的药物组合物，进一步包括一种脂质配制品。
26.如第25项所述的药物组合物，其中该脂质制剂是一种LNP配制品。
27.如第26项所述的药物组合物，其中该脂质配制品是一种LNP11配制品。
28.如第25-27项中任一项所述的药物组合物，其中该dsRNA是靶向肝上皮实质细胞。
29.如第19-28项中任一项所述的药物组合物，其中静脉内给予所述组合物。
30.如第19-28项中任一项所述的药物组合物，其中皮下给予所述组合物。
31.一种药物组合物，包含如第12项所述的dsRNA，其中皮下给予所述组合物。
32.一种抑制细胞中ALAS1表达的方法，该方法包括：
(a)向该细胞中引入第1-17或78-98项中任一项所述的dsRNA，并且
(b)维持步骤(a)的细胞一段时间，该时间足以获得ALAS1基因的mRNA转录本的降解，由此抑制该细胞中的ALAS1基因的表达。
33.如第32项所述的方法，其中将该细胞离体、体外、或体内地进行处理。
34.如第32项所述的方法，其中该细胞存在于需要治疗、预防和/或管理与ALAS1表达相关的失调的受试者中。
35.如第34项所述的方法，其中所述失调是一种卟啉症。
36.如第34项所述的方法，其中该卟啉症是急性间歇性卟啉症或ALA-脱水酶缺乏卟啉症。
37.如第32-36项中任一项所述的方法，其中该细胞是一种肝上皮实质细胞。
38.如第32-36项中任一项所述的方法，其中该细胞是一种类红细胞。
39.如第32-38项中任一项所述的方法，其中ALAS1的表达被抑制至少20％。
40.如第32-39项中任一项所述的方法，其中ALAS1的表达被抑制至少30％。
41.如第32-40项中任一项所述的方法，其中该dsRNA具有在0.01-1nM范围内的IC50。
42.一种方法，用于治疗与ALAS1表达相关的失调，该方法包括向需要此类治疗的受试者给予一个治疗有效量的
(i)如第1-17、67-72或78-98项中任一项所述的dsRNA或
(ii)如第19-31或99-111项中任一项所述的组合物。
43.一种治疗一种卟啉症的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者给予一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括一个有义链和一个长度是15-30个碱基对的反义链，并且该反义链与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：382中的至少15个连续核苷酸互补。
44.如第42或43项所述的方法，其中该受试者处于发展一种卟啉症的风险中，或被诊断为患有一种卟啉症。
45.如第44项所述的方法，其中该卟啉症是急性间歇性卟啉症或ALA-脱水酶缺乏卟啉症。
46.如第42-45项中任一项所述的方法，其中该dsRNA或包括dsRNA的组合物是在卟啉症急性发作之后给予的。
47.如第42-45项中任一项所述的方法，其中该dsRNA或包括dsRNA的组合物是在卟啉症急性发作过程中给予的。
48.如第42-45项中任一项所述的方法，其中预防性地给予该dsRNA或包括dsRNA的组合物以预防卟啉症的急性发作。
49.如第46或47项所述的方法，其中将该dsRNA配制为一种LNP配制品。
50.如第48项所述的方法，其中该dsRNA处于GalNAc共轭物的形式。
51.如第42-50项中任一项所述的方法，其中以0.05-50mg/kg的剂量给予该dsRNA。
52.如第42-50项中任一项所述的方法，其中以0.01mg/kg-5mg/kg该受试者体重的浓度给予该dsRNA。
53.如第51项所述的方法，其中将该dsRNA配制为一种LNP配制品并且以0.05-5mg/kg的剂量给予。
54.如第51项所述的方法，其中该dsRNA是处于GalNAc共轭物的形式并且是以0.5-50mg/kg的剂量给予。
55.如第42-54项中任一项所述的方法，其中该方法降低受试者中卟啉或卟啉前体的水平。
56.如第55项所述的方法，其中该水平被降低至少30％。
57.如第55或56项所述的方法，其中该卟啉前体是δ-氨基乙酰丙酸(ALA)或胆色素原(PBG)。
58.如第42-57项中任一项所述的方法，其中该dsRNA具有在0.01-1nM范围内的IC50。
59.一种用于降低细胞中卟啉或卟啉前体的水平的方法，该方法包括以一个有效降低该细胞中卟啉或卟啉前体的水平的量将该细胞与如第1-17、67-72或78-98项中任一项所述的dsRNA相接触。
60.如第59项所述的方法，其中所述细胞是一种肝上皮实质细胞。
61.如第59或60项所述的方法，其中该卟啉或卟啉前体是δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、胆色素原(PBG)、羟甲基胆素(HMB)、尿卟啉原III、粪卟啉原III、原卟啉原IX、或原卟啉IX。
62.一种载体，编码如第1-17、67-72或78-98项中任一项所述的dsRNA的至少一条链。
63.一种编码dsRNA的至少一条链的载体，其中所述dsRNA包含与编码ALAS1的mRNA的至少一部分互补的一个区域，其中所述dsRNA长度是30个或更少碱基对，并且其中所述dsRNA靶向所述mRNA以便切割。
64.如第63项所述的载体，其中该互补区域是至少15个核苷酸长度。
65.如第64项所述的载体，其中该互补区域是19个至21个核苷酸长度。
66.一种细胞，包含如第62-65项中任一项所述的载体。
67.如第1-17或78-98项中任一项所述的dsRNA，其中该dsRNA包括一个反义链，该反义链具有基本上与人ALAS1的一个区域互补的一个区域。
68.如第67项所述的dsRNA，其中所述人ALAS1具有序列NM_000688.4(SEQ ID NO：1)或NM_000688.5(SEQ ID NO：382)。
69.如第1或2项所述的dsRNA，其中该dsRNA包括一个有义链，该有义链包括选自下组的一个序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：330、SEQ ID NO：334、SEQ ID NO：342、SEQID NO：344、SEQ ID NO：346、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：362、SEQ ID NO：366、SEQ ID NO：376、以及SEQ ID NO：380。
70.如第1或2项所述的dsRNA，其中该dsRNA包括一个反义链，该反义链包括选自下组的一个序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：343、SEQID NO：345、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、以及SEQ ID NO：381。
71.如第1或2项所述的dsRNA，其中该dsRNA包括一个有义链，该有义链包括选自下组的一个序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：152、SEQID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：186、以及SEQ ID NO：190。
72.如第1或2项所述的dsRNA，其中该dsRNA包括一个反义链，该反义链包括选自下组的一个序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：153、SEQID NO：155、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、以及SEQ ID NO：191。
73.如第42-58项中任一项所述的方法，其中当将受试者暴露于一种诱发因素时，所述方法
(vi)改善与ALAS1相关的失调(例如，卟啉症)相关联的一种症状
(vii)抑制该受试者中的ALAS1表达，
(viii)降低该受试者中卟啉前体或卟啉的水平，
(ix)减少该受试者中与卟啉症相关联的症状的急性发作的频率，或
(x)减少该受试者中与卟啉症相关联的症状的急性发作的发病率。
74.如第73项所述的方法，其中该卟啉前体是δ-氨基乙酰丙酸(ALA)或胆色素原(PBG)。
75.如第73项所述的方法，其中该诱发因素是经前期。
76.如第73-75项中任一项所述的方法，其中根据剂量方案给予该dsRNA或包含该dsRNA的组合物。
77.如第76项所述的方法，其中该剂量方案是每周、每两周、或每月一次。
78.一种双链RNAi(dsRNA)，包括与一个反义链互补的一个有义链，其中所述反义链包括与ALAS1RNA转录本互补的一个区域，其中每条链具有约14至约30个核苷酸，其中所述dsRNA由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′
(III)
其中：
i、j、k、以及l各自独立地是0或1；
p、p’、q、以及q′各自独立地是0-6；
Na和Na′各自独立地表示包括0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包括0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
np、np′、nq、以及nq′各自独立地表示突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、以及Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰。
79.如第78或79项所述的dsRNA，其中该有义链共轭至至少一个配体。
80.如第78或79项所述的dsRNA，其中i是1；j是1；或i和j两者都是1。
81.如第78或79项所述的dsRNA，其中k是1；1是1；或k和1两者都是1。
82.如第78或79项所述的dsRNA，其中XXX与X′X′X′互补，YYY与Y′Y′Y′互补，并且ZZZ与Z′Z′Z′互补。
83.如第78或79项所述的dsRNA，其中Y′Y′Y′基序发生在该反义链从5′-端开始的位置11、12和13处。
84.如第83项所述的dsRNA，其中Y′是2′-O-甲基。
85.如第78或79项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是15-30个核苷酸对。
86.如第85项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是17-23个核苷酸对。
87.如第85项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是19-21个核苷酸对。
88.如第85项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是21-23个核苷酸对。
89.如第78或79项所述的dsRNA，其中这些核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧基、2’-羟基、及其组合。
90.如第89项所述的dsRNA，其中这些核苷酸上的修饰是2′-O-甲基、2′-氟或两者。
91.如第79项所述的dsRNA，其中该配体包括一种碳水化合物。
92.如第79或91项所述的dsRNA，其中该配体是经由一个连接物附接的。
93.如第92项所述的dsRNA，其中该连接物是一种二价或三价分枝的连接物。
94.如第79项所述的dsRNA，其中该配体是
Figure BDA0001787260730000341
95.如第79项所述的dsRNA，其中该配体和该连接物是如式XXIV所示的：
Figure BDA0001787260730000342
96.如第95项所述的dsRNA，其中该配体附接至该有义链的3’末端。
97.如第78或79项所述的dsRNA，其中所述dsRNA具有选自下组的核苷酸序列，该组是表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中提供的序列。
98.如第97项所述的dsRNA，其中所述dsRNA具有AD-58882的核苷酸序列。
99.一种药物组合物，包括如第67-72或78-98项中任一项所述的dsRNA。
100.如第99项所述的药物组合物，其中dsRNA剂在一种非缓冲溶液中进行给予。
101.如第100项所述的药物组合物，其中所述非缓冲溶液是盐水或水。
102.如第99项所述的药物组合物，其中所述dsRNA与缓冲溶液一起给予。
103.如第102项所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、或磷酸盐，或其任意组合。
104.如第102项所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
105.如第99-104项中任一项所述的药物组合物，其中该dsRNA是靶向肝上皮实质细胞。
106.如第99-105项中任一项所述的药物组合物，其中皮下给予所述组合物。
107.如第99项所述的药物组合物，进一步包括一种脂质配制品。
108.如第107项所述的药物组合物，其中该脂质制剂是一种LNP配制品。
109.如第26项所述的药物组合物，其中该脂质配制品是一种LNP11配制品。
110.如第107-109项中任一项所述的药物组合物，其中该dsRNA是靶向肝上皮实质细胞。
111.如第107-110项中任一项所述的药物组合物，其中静脉内给予所述组合物。
112.如第35、43或44项中任一项所述的方法，其中该卟啉症是选自以下各项的肝性卟啉症：急性间歇性卟啉症(AIP)、遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、和肝性红细胞生成性卟啉症。
113.如第35、43或44项中任一项所述的方法，其中该卟啉症是纯合的显性肝性卟啉症(例如，纯合的显性AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。
114.如第35、43或44项中任一项所述的方法，其中该卟啉症是通过暴露于化学品诱导的。
115.如第59或60项所述的方法，其中该卟啉或卟啉前体是δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、胆色素原(PBG)、羟甲基胆素(HMB)、尿卟啉原I或III、粪卟啉原I或III、原卟啉原IX、或原卟啉IX。
116.如第42-45项中任一项所述的方法，其中该dsRNA或包括dsRNA的组合物是在卟啉症急性发作之前或过程中给予的。
117.如第42-45项中任一项所述的方法，其中该dsRNA是在卟啉症急性发作之前给予的。
118.如第42-45项中任一项所述的方法，其中该dsRNA或包括dsRNA的组合物是在前驱症状过程中给予的。
119.如第118项所述的方法，其中该前驱症状的特征在于疼痛(例如，头痛和/或腹痛)、恶心、心理症状(例如，焦虑)、坐立不安和/或失眠。
120.如第117项所述的方法，其中该dsRNA或包括dsRNA的组合物是在月经周期的一个具体时期过程中，例如，在黄体期过程中给予的。
121.如第117-120项中任一项所述的方法，其中所述方法改善或预防卟啉症的循环发作。
122.如第121项所述的方法，其中该循环发作与诱发因素相关联。
123.如第122项所述的方法，其中该诱发因素是月经周期的一个具体时期，例如，黄体期。
124.如第35或42-44项所述的方法，其中该受试者具有升高的ALA和/或PBG的水平。
125.如第35或42-44项所述的方法，其中受试者具有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中并且经受疼痛(例如，神经性疼痛，例如，慢性神经性疼痛)或神经病变(例如，渐进性神经病变)。
126.如第35或42-44项所述的方法，其中该受试者(a)具有升高的ALA和/或PBG的水平并且(b)经受慢性疼痛。
127.如第124或125项所述的方法，其中来自该受试者的ALA或PBG的水平在血浆或尿中是升高的。
128.如第126项所述的方法，其中该受试者具有大于参比值的ALA或PBG的血浆水平或尿水平。
129.如第128项所述的方法，其中该参比值是超过健康个体样本中平均水平的两个标准差。
130.如第126项所述的方法，其中该受试者具有大于或等于参比上限2倍、3倍、4倍、或5倍的ALA或PBG的血浆水平或尿水平。
131.如第130项所述的方法，其中该受试者具有大于参比上限4倍的ALA或PBG的尿水平。
132.如第126或131项所述的方法，其中该受试者是人类并且具有大于或等于4.8mmol/mol肌酸酐的PBG的尿水平。
133.如第126项所述的方法，其中该受试者是人类并且具有大于或等于0.12μmol/L的血浆PBG水平。
134.如第126项所述的方法，其中该受试者是人类并且具有大于或等于1.2mmol/mol肌酸酐的尿PBG水平。
135.如第126项所述的方法，其中该受试者是人类并且具有大于或等于0.12μmol/L的血浆ALA水平。
136.如第126项所述的方法，其中该受试者是人类并且具有大于或等于3.1mmol/mol肌酸酐的尿ALA水平。
137.如第124-136项中任一项所述的方法，其中该方法降低ALA和/或PBG的升高的水平。
138.如第124-137项中任一项所述的方法，其中该方法降低或预防疼痛或神经病变。
139.如第137或138项所述的方法，其中该方法预防卟啉症的急性发作。
140.如第124-139项中任一项所述的方法，其中该方法降低或预防神经损伤。
141.如第134-140项中任一项所述的方法，其中该方法对于产生升高的ALA和/或PBG水平的预定下降是有效的。
142.如第141项所述的方法，其中该预定下降是降低至小于或等于参比值的一个值。
143.如第142项所述的方法，其中该参比值是参比上限。
144.如第138-143项中任一项所述的方法，其中该dsRNA或包含该dsRNA的组合物是重复给予的。
145.如第144项所述的方法，其中将该dsRNA或包含该dsRNA的组合物预防性给予受试者，该受试者处于发展卟啉症的风险中。
146.如第145项所述的方法，其中从青春期开始预防性地给予该dsRNA或包含该dsRNA的组合物。
147.如第145或146项所述的方法，其中该受试者携带有与卟啉症相关联的基因突变。
148.如第112-147项中任一项所述的方法，其中皮下给予该dsRNA或包含该dsRNA的组合物。
149.如第148项所述的方法，其中该dsRNA处于GalNAc共轭物的形式。
150.如第149项所述的方法，其中该dsRNA以0.5-50mg/kg的剂量给予。
151.一种对具有升高的ALA和/或PBG水平的受试者进行治疗的方法，该方法包括向该受试者给予一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括一个有义链和一个长度是15-30个碱基对的反义链，并且该反义链与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：382中的至少15个连续核苷酸互补。
152.一种对具有升高的ALA和/或PBG水平的受试者进行治疗的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的
(i)如第1-17、67-72或78-98项中任一项所述的dsRNA或
(ii)如第19-31或99-111项中任一项所述的组合物。
153.如第151或152项所述的方法，其中该方法对于降低ALA和/或PBG的水平是有效的。
154.如第153项所述的方法，其中该ALA和/或PBG的水平被降低以使其下降到低于参比值。
本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式以其全文结合。
在下文描述中叙述本发明的不同实施方案的详细内容。本发明的其他特征、目的以及优点将通过以下说明和附图以及权利要求书而清楚。
附图说明
图1描绘了血红素生物合成途径。
图2总结了与血红素新陈代谢中遗传错误相关联的某些卟啉症。
图3描绘了人ALAS1 mRNA序列转录本变体1(参比序列NM_000688.4(GI：40316942，记录日期2011年11月19日)，SEQ ID NO：1)。
图4描绘了人ALAS1 mRNA序列转录本变体2(参比序列NM_000688.5(GI：362999011，记录日期2012年4月1日)，SEQ ID NO：382)。
图5显示相对于PBS对照，siRNA AD-53558在压制小鼠ALAS1(mALAS1)mRNA中的剂量响应。还显示了针对萤虫素酶(LUC)AD-1955对照的结果。
图6显示相对于PBS对照，siRNA AD-53558在压制大鼠ALAS1mRNA中的剂量响应。还显示了针对萤虫素酶(LUC)AD-1955对照的结果。
图7显示相对于PBS对照，siRNA AD-53558对小鼠ALAS1(mALAS1)mRNA的压制的持久性。
图8显示基线处的、以及苯巴比妥处理后实验组(ALAS1 siRNA)和对照组(LUCsiRNA)中血浆ALA水平(以μM计)的平均值±标准差。
图9显示个体动物在基线处的、以及苯巴比妥处理后接受ALAS1 siRNA和对照(LUCsiRNA)处理的动物中的血浆ALA水平(以uM计)。
图10显示在基线处的、以及苯巴比妥处理后在接受ALAS1siRNA和对照(LUCsiRNA)处理的动物中的血浆PBG水平(以μM计)的平均值±标准差。
图11显示个体动物在基线处的、以及苯巴比妥处理后在接受ALAS1 siRNA和对照(LUC siRNA)处理的动物中的血浆PBG水平(以μM计)。
图12显示在基线处，以及苯巴比妥处理后在挑选出的代表性实验(ALAS1 siRNA)和对照(PBS)动物中的肝脏中的相对mALAS1 mRNA水平。
图13显示在小鼠肝脏组织中，三种GalNAc共轭的mALAS1 siRNA对mALAS1表达(相对于PBS对照)的影响。
图14显示苯巴比妥给予以及用ALAS1 siRNA或对照LUC siRNA处理之后，随时间推移的血浆ALA和PBG水平。
图15显示小鼠AIP苯巴比妥诱导模型中GalNAc共轭的ALAS1 siRNA对血浆ALA和血浆PBG水平的影响。
具体实施方式
iRNA通过已知为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。本文中描述了iRNA和使用它们抑制细胞或哺乳动物中ALAS1基因表达的方法，其中iRNA靶向ALAS1基因。还提供了用于与ALAS1表达相关的失调的多种组合物和方法，像卟啉症(例如，ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP或Doss卟啉症)、急性间歇性卟啉症、先天性红细胞生成性卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症)、杂斑卟啉症、红细胞生成性原卟啉症(EPP)、X-连锁的铁粒幼细胞贫血(XLSA)、以及婴儿暂时性红细胞卟啉症)。
卟啉症是遗传性或获得性失调，可能起因于血红素生物合成途径(在此还称作卟啉途径(参见图1))中特异性酶的降低的或增强的活性。卟啉是主要的血红素前体。卟啉和卟啉前体是δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、胆色素原(PBG)、羟甲基胆素(HMB)、尿卟啉原I或III、粪卟啉原I或III、原卟啉原IX、和原卟啉IX。血红素是血红蛋白、肌红蛋白、过氧化氢酶、过氧化物酶、以及细胞色素的基本部分，后者包括呼吸道和P450肝细胞色素。血红素是合成于大多数或全部人类细胞。大约85％的血红素在类红细胞中制成，主要用于血红蛋白。剩余血红素中大部分在肝脏中制成，其中80％用于细胞色素合成。卟啉途径中特异性酶的缺乏导致血红素的不充分生产并且还导致卟啉前体和/或卟啉的累积，高浓度的卟啉前体和/或卟啉对细胞或器官是有毒的。
卟啉症表现是神经系统并发症(“急性”)、皮肤问题(“皮肤性”)或两者。卟啉症可以依据卟啉或其前体超量产生和累积的主要部位进行分类。在肝性卟啉症中，卟啉和卟啉前体主要在肝脏中超量产生，而在红细胞生成性卟啉症中，卟啉在骨骼中的类红细胞内超量产生。急性或肝性卟啉症导致神经系统和神经表现异常，可以影响中枢和周围神经系统两者，导致多种症状，例如，疼痛(例如，腹痛和/或慢性神经性疼痛)、呕吐、神经病变(例如，急性神经病变、渐进性神经病变)、肌无力、发作、精神紊乱(例如，幻觉、抑郁焦虑、妄想症)、心律失常、心动过速、便秘、以及腹泻。皮肤或红细胞生成性卟啉症主要影响皮肤，导致多种症状，例如光过敏，光过敏可以在多个区域，例如前额引起疼痛、疱瘿、坏死、瘙痒、肿胀、以及增加的毛发生长。皮肤损害的继发感染可能导致骨骼与组织损失，连同瘢痕、毁容、以及手指或足趾损失(例如，手指、足趾)。大多数卟啉症由编码血红素生物合成途径中的酶的突变导致。血红素新陈代谢中与遗传错误相关联的卟啉症概述于图2中。
不是所有的卟啉症都是遗传性的。例如，患有肝脏疾病的患者可能发展卟啉症，这是由于肝脏异常的结果，并且暂时形式的红细胞卟啉症(婴儿暂时性红细胞卟啉症)已经被描述于婴儿中(参见克劳福德(Crawford，R.I.)等人，美国皮肤病学会杂志(J Am AcadDermatol.)1995年8月；33(2Pt 2)：333-6.)患有PCT的患者可能获得尿卟啉原脱羧酶的活性缺乏(URO-D)，这是由于具有低于正常酶活性的ORO-D酶的形成(参见菲利普斯(Phillips)等人，血液(Blood)，98：3179-3185，2001。)
急性间歇性卟啉症(AIP)(还被称作胆色素原(PBG)脱氨酶缺乏，或羟甲基胆素合酶(HMBS)缺乏)，是急性肝性卟啉症的是最常见类型。急性肝性卟啉症的其他类型包括遗传性粪卟啉症(HCP)，杂斑卟啉症(VP)，以及ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)。急性肝性卟啉症描述于，例如，巴望尼(Balwani，M)和戴斯尼克(Desnick，R.J.)，血液(Blood)，120：4496-4504，2012中。
AIP典型地是一种常染色体显性疾病，特征在于酶：胆色素原脱氨酶(PBG脱氨酶)的缺乏；这种酶还称作羟甲基胆素合酶(HMB合酶或HMBS)。PBG脱氨酶是血红素生物合成途径(参见图1)中的第三酶并且催化四个胆色素原分子头尾缩合成线性四吡咯，羟甲基胆素(HMB)。编码PBG脱氨酶不同同种型的可变剪接的转录本变体已经被描述。PBG脱氨酶基因的突变是与AIP相关联的。此类突变可能导致PBG脱氨酶的减少量和/或PBG脱氨酶的降低的活性(受累个体典型地具有约50％的PBG脱氨酶活性下降)。
存在AIP以及其他急性肝性卟啉症病理生理学的至少两种不同模型(参见，例如，林(Lin CS-Y)等人，临床神经生理学(Clinical Neurophysiology)，2011；122：2336-44)。根据一个模型，由PBG脱氨酶缺乏引起的降低的血红素导致能量衰竭以及轴突变性。根据另一个当前更受欢迎的模型，卟啉前体(例如，ALA和PBG)的逐渐累积(buildup)导致神经毒性。
已经发现AIP在某些群体中具有高达万分之一的患病率(例如，在瑞典北部；参见弗洛德拉斯(Floderus Y)，等人临床遗传学(Clin Genet.)2002；62：288-97)。估计美国与欧洲(英国除外)总群体中的患病率是约万分之一至两万分之一。仅在大约10％-15％的携带有已知与AIP相关联的突变的个体中表现临床疾病本身。然而，在具有某些突变(例如，W198X突变)的个体中，外显率高达40％。在青春期之前，AIP典型地是潜伏的。症状在雌性中比在雄性中更加常见。由于其不完全外显以及长潜伏期，该疾病的患病率很可能被低估。在美国，估计有约2000个患者已经经受至少一次发作。在法国、瑞典和英国，估计有约150个活动性、复发性案例；这些患者主要是中位年龄30岁的年轻女性。参见，例如，埃尔德(Elder)等人，遗传代谢杂志(J Inherit Metab Dis.)，在线发表，2012年11月1日。
AIP影响，例如，内脏神经系统、外周神经系统、自主神经系统、和中枢神经系统。AIP症状是可变的并且包括胃肠道症状(例如，严重和较轻的局部腹痛、恶心/呕吐、便秘、腹泻、肠梗阻)，泌尿症状(排尿困难、尿潴留/失禁、或小便黄赤)，神经性症状(例如，感觉神经病变、运动神经病变(例如，影响脑神经和/或导致上臂或下肢无力)，发作，神经性疼痛(例如，与渐进性神经病变相关联的疼痛，例如，慢性神经性疼痛)，神经精神症状(例如，精神错乱、焦虑、激动、幻觉、癔病、谵妄、冷漠、抑郁、恐怖症、精神病、失眠、嗜睡、昏迷)，自主神经系统牵连(例如导致心血管症状，像心动过速、高血压、和/或心率失常，连同其他症状，例如，升高的循环的儿茶酚胺水平、显汗、坐立不安、和/或震颤)，脱水，以及电解质异常。最常见的症状是腹痛和心动过速。此外，患者更加频繁地具有慢性神经性疼痛并发展渐进性神经病变。具有复发性发作的患者通常具有前驱症状。发生严重发作之后可能导致永久性瘫痪。从未得到迅速治疗的严重发作的恢复可能花费数周或数月。急性发作可能是致命的，例如，归因于呼吸肌瘫痪或电解质失调导致的心血管衰竭。(参见，例如，桑奈尔(Thunell S.)羟甲基胆素合酶缺乏(Hydroxymethylbilane Synthase Deficiency).2005年9月27日[2011年9月1日更新].于：佩金(Pagon RA)，波德(Bird TD)，多兰(Dolan CR)，等人，编著.GeneReviewsTM[网络版].西雅图(Seattle)(WA)：华盛顿大学，西雅图(University ofWashington，Seattle)；1993-(在下文中，桑奈尔(1993))，通过引用以其整体结合在此)。在氯化血红素治疗可得之前，多达20％患有AIP的患者死于该疾病。
在携带有AIP基因的个体中，肝细胞癌的风险增加。在具有复发性发作的那些人中，肝细胞癌的风险尤其重大：50岁之后，该风险大于总体群体接近100-倍。
急性卟啉症的发作可由内源的或外源的因素促成。此类因素诱导发作的机制可能包括，例如，对肝P450酶的增加的需求和/或肝脏中ALAS1活性的诱导。对肝P450酶的增加的需求导致下降的肝游离血红素，由此诱导肝ALAS1合成。
诱发因素包括禁食(或其他形式的减少的或不充分的热量摄入，归因于速成节食、远距离运动等)、代谢应力(例如，感染、手术、国际航空旅行以及心理应激)、内源激素(例如，黄体酮)、吸烟、脂溶性异质化学品(包括，例如，存在于烟草烟雾中的化学品、某些处方药、有机溶剂、杀生物剂、酒精饮料中的组分)、内分泌物因素(例如，生殖激素(女性在经期前可能经历恶化)、合成雌激素类、黄体酮、促排卵药物、以及激素替代疗法)。参见，例如，桑奈尔(Thunell)(1993)。
超过1000种药物是急性肝性卟啉症(例如，AIP、HCP、ADP、以及VP)中禁忌的，包括，例如，酒精、巴比妥类、卡马西平、卡立普多、氯硝西泮(高剂量)、达那唑、双氯芬酸和可能的其他NSAID、麦角(Ergot)、雌激素、乙氯戊烯炔醇、格鲁米特、灰黄霉素、美芬妥英、甲丙氨酯(也称作美布氨酯和tybutamate)、甲乙哌酮、甲氧氯普胺(Metodopramide)、苯妥英、扑米酮、黄体酮和合成黄体酮、吡嗪酰胺、吡唑啉酮(氨基比林和安替比林)、利福平、琥珀酰亚胺(乙琥胺和甲琥胺(methsuximide))、磺胺类抗生素、和丙戊酸。
AIP的体征包括急性发作期间的尿变色(尿可能显现为红色或棕红色)，以及急性发作期间尿中增加的PBG和ALA浓度。分子基因检测确认PBG脱氨酶(还称作HMBS)基因突变发生于超过98％的受累个体中。桑奈尔(Thunell)(1993)。
卟啉症的鉴别诊断可能包括通过测量发作期间尿、粪便、和/或血浆中卟啉或卟啉前体(例如，ALA、PBG)的个体水平(例如，通过层析法以及荧光测定)来确定卟啉症的类型。通过确立红细胞PBG脱氨酶活性是正常水平的50％或更低，可以确认AIP的诊断。可以在患者中或在处于危险中的家族成员中进行突变的DNA检测。AIP的诊断典型地通过DNA检测鉴别特异性致病性基因突变(例如，HMBS突变)来确认。
急性发作的治疗典型地需要住院治疗以控制并治疗急性症状，包括，例如，腹痛、发作、脱水/低钠血症、恶心/呕吐、心动过速/高血压、尿潴留/梗阻。例如，像可以使用麻醉性镇痛药治疗腹痛，可以使用发作预防措施以及可能的药物(尽管许多抗-发作药物是禁忌的)治疗发作，例如可以使用酚噻嗪治疗恶心/呕吐，并且例如可以使用β-阻断剂治疗心动过速/高血压。治疗可以包括不安全药物的取消、呼吸功能连同肌肉强度和神经状态监控。轻度发作(例如，无轻瘫或低钠血症的那些)可以用每天至少300g静脉内10％葡萄糖进行治疗，尽管渐增地氯化血红素是立即提供的。重度发作应该尽快使用静脉内氯化血红素(每天3-4mg/kg，持续4-14天)，并且在等待氯化血红素起效的同时使用IV葡萄糖进行治疗。典型地，使用IV氯化血红素持续4天并且在等待给予IV氯化血红素的同时使用IV葡萄糖来对发作进行治疗。
氯化血红素(
Figure BDA0001787260730000451
或注射用氯化血红素，先前称作羟高铁血红素)是美国批准使用的唯一的血红素产品并且是孤儿药法案(Orphan Drug Act)下第一个批准的药物。
Figure BDA0001787260730000452
是衍生自经处理的红细胞(PRBC)的氯化血红素，并且是具有氯化物配体的、含三价铁离子(血红素B)的原卟啉IX。血红素发挥作用以限制卟啉的肝和/或骨髓合成。在患有肝性卟啉症急性发作的患者中，氯化血红素产品症状改善的确切的机制尚未被阐明；然而，其作用可能归因于δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶的(反馈)抑制，该酶限制卟啉/血红素生物合成途径的速率。参见
Figure BDA0001787260730000453
产品标签，灵北公司(Lundbeck，Inc.)，2010年10月。ALA合酶的抑制将导致降低的ALA和PBG，连同卟啉和卟啉中间体的产生。
氯化血红素的缺点包括其对临床症状的延迟的影响及其不能预防发作复发。与氯化血红素给予相关联的不良反应可能包括血栓性静脉炎、抗凝、血小板减少、肾脏机能停止、或铁超负荷，这在需要多疗程氯化血红素治疗复发性发作的患者体内是尤其可能发生的。为了预防静脉炎，在患有复发性发作的患者体内需要留置静脉导管。不常报道的副作用包括发热、疼痛、不适、溶血、全身型过敏性反应、以及循环衰竭。参见，安德森(Anderson，K.E)，人类卟啉症治疗与预防法(Approaches to Treatment and Prevention of HumanPorphyrias)，于卟啉症手册：卟啉症的医学方面(The Porphyrin Handbook：MedicalAspects of Porphyrins)中，卡尔M.凯蒂丝(Karl M.Kadish)，凯文M.史密斯(KevinM.Smith)，罗杰古拉德(Roger Guilard)(2003)(在下文中，安德森(Anderson))。
难以制备用于静脉给药的稳定态的血红素。它在中性pH下是不溶解的但是可将其在pH8或更高下制备为血红素氢氧化物。安德森(Anderson)。Panhematin是一种冻干型氯化血红素制剂。当冻干型氯化血红素是针对静脉给药的增溶剂时，降解产物迅速形成；这些降解产物造成瞬时抗凝效应并且在输注部位造成静脉炎。安德森(Anderson)。血红素白蛋白和精氨酸血红素(Normosang，欧洲版氯血红素)是更稳定的并且可潜在地引起较少的血栓性静脉炎。然而，精氨酸血红素在美国是不被批准使用的。通过将其溶解在30％人血白蛋白而不是在无菌水中用于输注，Panhemin可能是稳定的；然而，白蛋白增加血管内的容积膨胀效应并且增加治疗花费连同病原体风险，因为它分离自人类血液。参见，例如，安德森(Anderson)。
急性发作的成功治疗未预防或延迟复发。由于血红素加氧酶的诱导，氯化血红素本身是否可以触发复发性发作是一个问题。尽管如此，在一些地区(尤其是法国)，具有多次复发性发作的年轻女性正在每周使用氯化血红素的治疗，其目的是实现预防。
使用肝移植进行的有限经验表明如果成功，它是针对AIP的一种有效治疗。在欧洲，在人类患者中已有将近12个移植病例是治愈的或具有不同效果。肝移植可恢复ALA和PBG的正常排泄并预防急性发作。参见，例如，达(Dar，F.S.)等人国际肝胆胰疾病杂志(Hepatobiliary Pancreat.Dis.Int.)，9(1)：93-96(2010)。此外，如果患有AIP患者的肝脏被移植到另一个患者中(“多米诺移植(domino transplant)”)，接受该移植的患者可能发展AIP。
在急性卟啉症的长期临床效应中，神经性疼痛可能是由归因于神经毒性的渐进性神经病变导致的，例如，升高的卟啉前体(例如，ALA和/或PBG)。在急性发作之前或过程中，患者可能经受神经性疼痛。年长的患者随年龄增长可能经历增加的神经性疼痛，对于他们而言，不同的麻醉性镇痛药典型地是失效的。已经在患有急性肝性卟啉症的患者中记录了肌电图异常以及降低的传导次数。值得注意地是，未经处理的、未诱导的AIP小鼠(PBG脱氨酶缺乏)发展了进行性运动神经病变，假定归因于组成性升高的卟啉前体(ALA&PBG)水平卟啉和/或血红素缺乏，该进行性运动神经病变已经显示引起进行性股四头肌神经轴突退化及丧失(林德贝格(Lindberg)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，103(8)：1127-1134，1999)。在患有急性卟啉症(例如，ADP、AIP、HCP、或VP)的患者中，在两次发作之间，卟啉前体(ALA&PBG)水平在无症状患者以及在有症状患者中通常升高。因此，预期通过降低ALAS1表达水平和/或活性来减少卟啉前体以及恢复正常血红素生物合成，从而预防和/或最小化慢性和渐进性神经病变的发展。治疗，例如，慢性治疗(例如，使用如在此所述的iRNA的周期性治疗，例如，根据如在此所述的剂量方案的治疗，例如，每周或每两周一次的治疗)可持续降低急性卟啉症患者中的ALAS1表达，这些患者具有升高的卟啉前体、卟啉、卟啉产物或其代谢物水平。如果需要的话，可以提供此类治疗来预防或降低个体患者症状(例如，疼痛和/或神经病变)的频率或严重性和/或降低卟啉前体、卟啉、卟啉产物或代谢物水平。
存在对鉴别可用于治疗卟啉症的新颖疗法的需求。如上所讨论的，现有治疗如氯化血红素具有大量缺点。例如，氯化血红素对临床症状的影响是延迟的，它是昂贵的，并且它可能具有副作用(例如，血栓性静脉炎、抗凝、血小板减少、铁超负荷、肾脏机能停止)。如在此所述的新颖的疗法可以解决这些缺点以及患者的未被满足的需求，通过，例如，作用更快，不诱导静脉炎，提供皮下施用的便利，成功预防复发性发作，预防或改善疼痛(例如，慢性神经性疼痛)和/或渐进性神经病变，和/或不产生与氯化血红素相关联的某些不良作用(例如，铁超负荷、增加的肝细胞癌的风险)。
本披露提供了用于调节ALAS1基因表达的方法和iRNA组合物。在某些实施例中，使用ALAS1-特异性iRNA减少或抑制ALAS1的表达，由此导致降低的ALAS1基因表达水平。降低的ALAS1基因的表达可以降低一种或多种卟啉前体、卟啉或卟啉产物或代谢物的水平。降低的ALAS1基因的表达，连同一种或多种卟啉前体、和/或卟啉水平的相关降低，可用于治疗与ALAS1表达相关的失调，例如，卟啉症。
在此表征的组合物的iRNA包括RNA链(反义链)，该RNA链具有一个区域，该区域是30个或更少个核苷酸长度，即，15-30个核苷酸长度，通常是19-24个核苷酸长度，该区域基本上与ALAS1基因的mRNA转录本(在此还称作“ALAS1-特异性iRNA”)的至少一部分互补。这样一种iRNA的使用使得靶向降解基因的mRNA成为可能，这些基因参与哺乳动物中与ALAS1表达相关联的病理，例如，卟啉症像ALA脱水酶缺乏卟啉症(Doss卟啉症)或急性间歇性卟啉症。非常低剂量的ALAS1-特异性iRNA可以特异性且高效地介导RNAi，导致ALAS1基因表达的显著抑制。靶向ALAS1的iRNA可以特异性且高效地介导RNAi，导致ALAS1基因表达的显著抑制，例如，在基于细胞的测定中。因此，包含这些iRNA的方法和组合物用于治疗与ALAS1表达相关的病理过程，像卟啉症(例如，X-连锁的铁粒幼细胞贫血(XLSA)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(Doss卟啉症)、急性间歇性卟啉症(AIP)、先天性红细胞生成性卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症)、杂斑卟啉症、红细胞生成性原卟啉症(EPP)、以及婴儿暂时性红细胞卟啉症)。
以下描述披露了怎样制作和使用含有iRNA的组合物以抑制ALAS1基因表达，以及用于治疗由这种基因的表达引起或调制的疾病和失调的组合物和方法。在本发明中表征的药物组合物的实施例包括具有反义链的iRNA，连同一种药学上可接受的载体，该反义链包含一个区域，该区域是30个或更少个核苷酸长度，通常是19-24个核苷酸长度，该区域基本上与ALAS1基因的RNA转录本的至少一部分互补。在本发明中表征的组合物的实施例还包括具有反义链的iRNA，该反义链具有一个互补区域，该互补区域是30个或更少个核苷酸长度，通常是19-24个核苷酸长度，该区域基本上与ALAS1基因的RNA转录本的至少一部分互补。
因此，在一些方面，本发明中表征了含有ALAS1 iRNA和一种药学上可接受的载体的药物组合物、使用这些组合物抑制ALAS1基因表达的方法、以及使用这些药物组合物来治疗与ALAS1表达相关的失调的方法。
I.定义
为方便起见，在本说明书、实例以及所附权利要求书中使用的某些术语与短语的意义提供于下。如果在本说明书中的其他部分中的术语使用与在本部分提供的该术语的定义有明显偏差，应该以在本部分中的定义为准。
“G”、“C”、“A”、“T”以及“U”每一者通常分别代表包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如，非限制性地，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明表征的的dsRNA的核苷酸序列中被一种包含例如肌苷的核苷酸所置换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别地替换为鸟嘌呤和尿嘧啶，以形成与靶mRNA的G-U摇摆碱基配对。含有这类替换部分的序列适用于本发明表征的组合物和方法。
如在此使用的，“ALAS1”(还称作ALAS-1；δ-氨基酮戊酸合酶1；δ-ALA合酶1；5’-氨基乙酰丙酸合酶1；ALAS-H；ALASH；ALAS-N；ALAS3；EC2.3.1.37；5-氨基酮戊酸合酶，非特异性的，线粒体的；ALAS；MIG4；OTTHUMP00000212619；OTTHUMP00000212620；OTTHUMP00000212621；OTTHUMP00000212622；迁移-诱导蛋白4；EC 2.3.1)是指一种核编码的线粒体酶，是哺乳动物血红素生物合成途径中的第一酶并且典型地是限速酶。ALAS1催化甘氨酸与琥珀酰-辅酶A缩合以形成δ-氨基乙酰丙酸(ALA)。人类ALAS1基因的表达无处不在，发现于染色体3p21.1，并且典型地编码640个氨基酸的一个序列。相比之下，编码一种同工酶的ALAS-2基因仅在红细胞中表达，发现于染色体Xp11.21，并且典型地编码550个氨基酸的一个序列。如在此使用的，“ALAS1蛋白”意指来自任何物种(例如，人类、小鼠、非人灵长类动物)的ALAS1的任何蛋白变体，连同保留ALAS1活性的任何突变体及其片段。类似的，“ALAS1转录本”是指自任何物种(例如，人类、小鼠、非人灵长类动物)的ALAS1的任何转录本变体。人ALAS1变体1 mRNA转录本的序列可以在NM_000688.4处找到(图3；SEQ ID NO：1)。另一种形式，人ALAS1变体2 mRNA转录本可以在NM_000688.5处找到(图4；SEQ ID NO：382)。成熟的、编码的ALAS1蛋白的水平是由血红素调节的：高水平血红素下调线粒体中成熟的酶而低血红素水平上调。迄今为止，已经鉴定了多个可变剪接的变体，这些变体编码相同蛋白。
如在此使用的，术语“iRNA”、“RNAi”、“iRNA剂”、或“RNAi剂”是指包含如在此定义的术语RNA，并且例如，经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)路径介导RNA转录本的靶向切割的一种试剂。在一个实施例中，如在此所述的iRNA实现ALAS1表达的抑制。ALAS1表达的抑制可以基于ALAS1 mRNA水平的下降或ALAS1蛋白水平的下降进行评估。如在此所使用的，“靶标序列”指的是在ALAS1基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的靶部分将至少足够地长，以充当iRNA指导在这个部分或其附近切割的底物。例如，靶标序列总体上将是从9-36个核苷酸长度，例如，15-30个核苷酸长度，包括其之间的全部子范围。作为一个非限制性实例，该靶标序列可以是从15-30个核苷酸、15-26个核苷酸、15-23个核苷酸、15-22个核苷酸、15-21个核苷酸、15-20个核苷酸、15-19个核苷酸、15-18个核苷酸、15-17个核苷酸、18-30个核苷酸、18-26个核苷酸、18-23个核苷酸、18-22个核苷酸、18-21个核苷酸、18-20个核苷酸、19-30个核苷酸、19-26个核苷酸、19-23个核苷酸、19-22个核苷酸、19-21个核苷酸、19-20个核苷酸、20-30个核苷酸、20-26个核苷酸、20-25个核苷酸、20-24个核苷酸、20-23个核苷酸、20-22个核苷酸、20-21个核苷酸、21-30个核苷酸、21-26个核苷酸、21-25个核苷酸、21-24个核苷酸、21-23个核苷酸或21-22个核苷酸。
如在此所使用的，术语“含有序列的链”是指含有由相当于使用标准核苷酸命名法描述的序列的核苷酸链的寡核苷酸。
如在此所使用的，除非另有陈述，术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，是指含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链结构的能力，如本领域技术人员所理解。此类条件可以是，例如，严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mM PIPESpH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16小时，随后洗涤。可以应用其他条件，比如可以在有机体中遇到的生理学相关条件。技术人员将能够根据杂交的核苷酸的最终应用来确定两序列互补测试的最适条件集。
在iRNA内部(例如，在如本文所述的dsRNA内部)的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整个长度范围内的碱基配对。此类序列在此可以称作相对于彼此“完全互补”。然而，在此在一个第一序列被称作相对于一个第二序列“基本上互补”的情况下，这两个序列可以是完全互补的，或者它们可以在针对高达30个碱基对的双链体杂交时形成一个或多个，但是总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如，经由RISC路径的基因表达的抑制。然而，在两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出的情况下，此类突出不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如，出于在此描述的目的，以下这样一种dsRNA也可以称作“完全互补”：该dsRNA包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸以及一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸，其中该更长的寡核苷酸包括一个与该更短的寡核苷酸完全互补的21核苷酸序列。
如在此使用的，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G：U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsRNA的有义链与反义链之间，或iRNA剂的反义链与靶标序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。
如在此使用的，与信使RNA(mRNA)的“基本上至少部分互补”的多核苷酸指与感兴趣的mRNA(例如，编码ALAS1蛋白的mRNA)的一个连续部分基本上互补的多核苷酸)。例如，如果一个多核苷酸与编码ALAS1的mRNA的一个非间断部分基本上互补，那么该序列则与ALAS1mRNA的至少一部分互补。作为另一个实例，如果一个多核苷酸与编码ALAS1的mRNA的一个非间断部分基本上互补，那么该序列则与ALAS1 mRNA的至少一部分互补。
如在此所使用的，术语“双链RNA”或“dsRNA”指的是包括具有杂合的双链体区域的RNA分子或分子的复合体的iRNA，该区域包括两条反向平行的且基本上互补的核酸链，还可将其称之为相对于靶标RNA具有“有义”和“反义”取向。该双链体区可以是允许例如，经RISC路径特异性降解所需靶标的任何长度，但是一般范围是从9至36个碱基对长度，例如，15-30个碱基对长度。就9和36碱基对之间的双链体时，双链体可以具有在这个范围内的任意长度，例如，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36和其间的任何子范围，包括但不限于15-30碱基对、15-26碱基对、15-23碱基对、15-22碱基对、15-21碱基对、15-20碱基对、15-19碱基对、15-18碱基对、15-17碱基对、18-30碱基对、18-26碱基对、18-23碱基对、18-22碱基对、18-21碱基对、18-20碱基对、19-30碱基对、19-26碱基对、19-23碱基对、19-22碱基对、19-21碱基对、19-20碱基对、20-30碱基对、20-26碱基对、20-25碱基对、20-24碱基对、20-23碱基对、20-22碱基对、20-21碱基对、21-30碱基对、21-26碱基对、21-25碱基对、21-24碱基对、21-23碱基对或21-22碱基对。细胞中通过Dicer和相似酶加工产生的dsRNA通常具有范围19-22的碱基对长度。dsDNA的双链体区的一条链包含与靶RNA的区域基本上互补的序列。形成双链体结构的两个链可以来自具有至少一个自身互补区域的单一RNA分子，或可以由两个或更多个独立RNA分子组成。当该双链体区是形成自单个分子的两条链时，该分子可以在一条链的3’-端与形成该双链体结构的各自的另一条链的5’-端之间具有由核苷酸的一个单链的链分隔开的一个双链体区(在此称为“发夹环”)。发夹环可以包含至少一个非配对的核苷酸；在一些实施例中，发夹环可以包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个非配对的核苷酸。当dsRNA的两个基本上互补的链包含分离的RNA分子时，这些分子不是必须的，但是可以共价地连接。当这两条链通过除发夹环之外的方式共价连接时，该连接结构被称为“连接物”。术语“siRNA”还可以在此用作指代以上所述的dsRNA。
在另一个实施例中，该iRNA剂可以是被引入到细胞或组织中以抑制靶标mRNA的一个“单链siRNA”。单链RNAi剂结合到RISC内切核酸酶Argonaute 2，其然后切割靶标mRNA。单链siRNA通常是指15-30核苷酸并且是化学修饰的。单链siRNA的设计和检测描述于美国专利号8,101,348中，以及利马(Lima)等人，(2012)细胞(Cell)150：883-894中，特此将它们各自的全部内容通过引用结合在此。在此描述的反义核苷酸序列中的任一个(例如，表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中提供的序列)可用作单链siRNA，如在此所述的或如通过利马等人，(2012)细胞150二：883-894中描述的进行化学修饰的。
在另一个方面中，RNA剂是一种“单链的反义RNA分子”。单链的反义RNA分子是与靶标mRNA之内的一个序列互补的。单链的反义RNA分子能以化学计量的方式通过与该mRNA碱基配对并且物理性地阻碍翻译装置来抑制翻译，参见蒂尔斯(Dias，N.)等人，(2002)分子癌症治疗学(Mol.Cancer Ther.)1：347-355。可替代地，该单链的反义分子通过杂交至靶标并通过RNaseH切割事件切割靶标来抑制靶标mRNA。单链的反义RNA分子可以是大约10至大约30个核苷酸长度并且具有与靶标序列互补的一个序列。例如，该单链的反义RNA分子可以包括以下这样一个序列：该序列是来自在此所述的反义核苷酸序列中任一个的至少大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸，如表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中的任一个中提供的序列。
熟练技术人员将意识到术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅包括自然中表达或发现的RNA分子，而且还包括包含一个或多个核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的RNA的类似物或衍生物，如在此所述的或如本领域中已知的。严格来说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，并且“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸部分的一种核糖核苷。然而，如在此使用的，术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以被认为是相等的。例如，如下文所述，可以在核碱基结构或在核糖-磷酸酯主链结构方面修饰RNA。然而，包含核糖核苷类似物或衍生物的分子必须保留形成双链体的能力。作为非限制性实例，RNA分子也可以包含至少一个修饰的核糖核苷，其包括但不限于2′-O-甲基修饰的核苷，包含5′硫代磷酸酯基的核苷、与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基连接的末端核苷、锁定核苷、非碱基核苷、2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷、2′-氨基修饰的核苷，2′-烷基修饰的核苷，吗啉代核苷、磷酰胺酯或包含非天然碱基的核苷，或其任意组合。可选地，RNA分子可以包含至少两个修饰的核糖核苷、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个修饰的核糖核苷，直到dsRNA分子的整个长度。对于RNA分子中这些多个修饰的核糖核苷中的每一个，修饰不需要是相同的。在一个实施例中，经构思用本文所述方法和组合物中的修饰RNA是具有形成所需双链体结构的能力并且经，例如RISC途径允许或介导靶RNA特异性降解的肽核酸(PNA)。
在一个方面，修饰的核糖核苷包括脱氧核糖核苷。在这种情况下，iRNA剂可以包含一个或多个脱氧核苷，包括例如脱氧核苷突出端或在dsRNA的双链部分内部的一个或多个脱氧核苷。然而，不论在何种情况下不言自明地是被术语“iRNA”，包括的双链DNA分子。
在一个方面，RNA干扰剂包括与靶RNA序列相互作用以指导靶RNA切割的单链RNA。不希望受理论约束，引入细胞中的长的双链RNA由称作Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(夏普(Sharp)等人，基因和发育(Genes Dev.)2001，15：485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)将dsRNA加工成至具有特征性双碱基3′突出端的19-23碱基对短干扰性RNA(伯恩斯坦(Bernstein)等人，(2001)自然(Nature)409：363)。这些siRNA随后掺入RNA诱导沉默复合物(RISC)中，在其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，这使得互补性反义链指导靶识别成为可能(尼坎宁(Nykanen)等人，(2001)细胞(Cell)107：309)。一旦与适宜的靶mRNA结合，RISC内部的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(巴希尔(Elbashir)等人，(2001)基因与发育(Genes Dev.)15：188)。因此，在一个方面，本发明涉及了促进实现靶基因沉默的RISC复合物形成的单链RNA。
如在此所使用的，术语“核苷酸突出”是指至少一个非配对的核苷酸，其从iRNA的双链体结构(例如，dsRNA)突出。例如，当dsRNA的一条链的3′-端延伸超过另一条链的5′-端时或反之亦然，存在核苷酸突出端。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的突出端；可替代地，该突出端可以包括至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个或更多个核苷酸。核苷酸突出端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个突出端可以处于有义链、反义链或其任意组合上。另外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的反义或有义链的5′末端、3′末端或两个末端上。
在一个实施例中，dsRNA的反义链在3′末端和/或5′末端具有一个1-10个核苷酸突出端。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3′末端和/或5′末端具有一个1-10个核苷酸突出端。在另一个实施例中，突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
关于dsRNA，在此使用的“平端”或“平末端的”是指在dsRNA的给定的末端没有非配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，没有核苷酸突出。dsRNA的一个或两个末端可以是平端。当dsRNA的两个末端都是平端，该dsRNA被称为平末端的。为了清楚起见，一个“平末端的”dsRNA是一个在其两端齐平的dsRNA，即，在该分子的任何一端都没有核苷酸突出。大多数情况下，这种分子将在其整个长度范围内是双链的。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA链，例如，dsRNA，其包括一个区域，该区域基本上与靶标序列互补。如在此所使用的，术语“互补性区域”指的是该反义链上基本上与一个序列互补的区域，例如如在此定义的一个靶标序列。其中互补区域不与靶序列完全互补的情况下，错配可以存在于分子的内部或末端区域内。通常，最耐受的错配存在于末端区域内，例如，在5′和/或3′末端的5、4、3或2个核苷酸内部。
如在此所使用的，术语“有义链”或“过客链”指的是含有与在此定义的术语反义链的一个区域基本上互补的一个区域的iRNA链。
如在此使用的，术语“SNALP”是指一种稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP代表包覆缩减的含水内部的脂质囊泡，该含水内部包含核酸如iRNA或从中转录出iRNA的质粒。SNALP例如在美国专利申请公开号20060240093、20070135372中并且在国际申请号WO2009082817中描述。这些申请以其全文通过引用结合在此。
当提及iRNA时，“引入细胞内”意思是促进或影响摄取或吸收进入该细胞，如本领域内的普通技术人员所理解的。吸收或摄取iRNA可以通过无协助扩散过程或主动细胞过程或借助助剂或装置发生。本术语的意义不限于体外细胞；iRNA还可以被“引入细胞内”，其中该细胞是活有机体的部分。在这种情况下，引入细胞中将包括递送至生物。例如，对于体内递送，可以将iRNA注射至组织部位中或全身施用。体内递送还可以通过β-葡聚糖递送系统，如美国专利号5,032,401和5,607,677以及美国公开号2005/0281781中所描述的那些，将它们通过引用以其全文结合于此。体外引入细胞内包括本领域内已知的方法，例如电穿孔以及脂质转染法。另外的方法描述下文或在本领域内是已知的。
如在此使用的，术语“调制...的表达”是指与ALAS1在对照细胞中的表达相比，至少部分“抑制”或部分“激活”ALAS1基因在用如在此所述的iRNA组合物处理过的细胞中的表达。对照细胞包括未处理的细胞或用非靶标对照iRNA处理的细胞。
术语“激活”、“增强”、“上调...的表达”、“增加...的表达”等，只要它们是指ALAS1基因，在此是指至少部分激活ALAS1基因的表达，表示为：可从ALAS1基因在其中转录的一个第一细胞或一组第一细胞(已经经过处理由此ALAS1基因的表达被增加)中分离的ALAS1mRNA的量增加，这是与一个第二细胞或一组第二细胞(对照细胞)相比，其与该一个第一细胞或一组第一细胞实质上相同，除了未经受如此的处理。
在一个实施例中，通过施用如在此描述的iRNA激活ALAS1基因表达至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，通过施用本发明中表征的iRNA激活ALAS1基因至少约60％、70％或80％。在一些实施例中，通过施用如本文所述的iRNA激活ALAS1基因表达至少约85％、90％或95％或更多。在一些实施例中，与未处理的细胞中的表达相比，ALAS1基因表达在用如本文所述的iRNA处理的细胞中增加至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多倍。通过小dsRNA激活表达例如在李(Li)等人，2006美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)103：17337-42中并且在US 20070111963和US 2005226848中描述，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。
术语“沉默”、“抑制...的表达”、“下调...的表达”、“压制...的表达”等，只要它们是指ALAS1基因，在此是指至少部分地压制ALAS1基因的表达，这是基于例如，ALAS1 mRNA表达、ALAS1蛋白表达、或与ALAS1基因表达功能性相联系的另外的参数(例如，血浆或尿中的ALA或PBG浓度)进行评估的。例如，ALAS1表达的抑制可被表示为：与对照相比，可从ALAS1基因在其中转录的一个第一细胞或一组第一细胞(已经经过处理由此ALAS1基因的表达被抑制)中分离的ALAS1 mRNA的量减少。对照可以是一个第二细胞或一组第二细胞，其与该一个第一细胞或一组第一细胞实质上相同，除了该第二细胞或该组第二细胞未经受如此的处理(对照细胞)。抑制程度通常表示为对照水平的百分比，例如，
Figure BDA0001787260730000591
可替代地，抑制程度能以与ALAS1基因表达功能性相联系的一个参数的减少而给出，例如ALAS1基因编码的蛋白的量，或一种或多种卟啉的水平。与ALAS1基因表达功能性相联系的一个参数的减少可以类似地表示为对照水平的百分比。原则上，ALAS1基因沉默可以在(组成型地或通过基因组工程化)表达ALAS1的任何细胞中通过任何合适的测定来确定。然而，当需要一个参考来确定一个给定的iRNA是否在一定程度上抑制ALAS1基因的表达并且因此被本发明所囊括时，在以下实例中提供的这些测定应该作为此参考。
例如，在某些情况下，通过施用本发明中表征的iRNA压制ALAS1基因表达至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，通过施用本发明中表征的iRNA压制ALAS1基因至少约60％、65％、70％、75％、或80％。在一些实施例中，通过施用如本文所述的iRNA压制ALAS1基因至少约85％、90％、95％、98％、99％、或更多。
如在此使用的，如在ALAS1表达的背景下，术语“治疗(treat)”“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”以及类似术语指缓解或减轻与ALAS1表达相关的病理过程(例如，涉及卟啉或卟啉途径缺陷的病理过程，例如，像卟啉症)。在本发明的上下文中，在涉及以下在此所引用的任何其他病状的范围内(除了与ALAS1表达相关的病理过程)，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”以及等等意思是预防、缓解或减轻至少一个与此病状相关联的症状，或意思是减缓或逆转这种病状的进程或预期进程。例如，在此表征的方法，当用于治疗卟啉症时，可以用于减少或预防与卟啉症相关联的一种或多种症状(例如，疼痛)，降低与卟啉症相关联发作的严重性或频率，降低一旦暴露于诱发条件将发生的、与卟啉症相关联的一种或多种症状发作的可能性，缩短与卟啉症相关联的发作，和/或降低发展与卟啉症相关联的病状(例如，肝细胞癌或神经病变(例如，渐进性神经病变))的风险。因此，除非在上下文中另外明确的指出，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”以及等等意在包含预防，例如，预防与ALAS1表达相关的失调和/或失调的症状。
在疾病标记或症状的背景下，“降低”意为此水平的统计学上或临床上的显著减少。下降可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且典型地降至作为不患这种病症的个体的正常范围内所接受的水平。
如在此所使用的，短语“治疗有效量”以及“预防有效量”指这样一个量，该量在治疗、预防或管理与ALAS1表达相关的病理过程中提供一个治疗上的益处。治疗有效的具体量可以容易地由普通医疗从业者来确定，并且可以根据本领域内已知的因素而变化，比如，例如由病理学过程的类型、患者病史以及年龄、病理学过程的阶段、以及其他试剂的给予。
如在此所使用的，“药物组合物”包括药理学有效量的iRNA以及药学上可接受的载体。如在此所使用的，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简言之的“有效量”指有效产生预期的药理学、治疗或预防结果的iRNA的量。例如，在治疗与ALAS1表达相关的失调的方法中(例如，在治疗卟啉症的方法中)，有效量包括有效地减少与卟啉症相关联的一种或多种症状的一个量，有效地降低发作频率的一个量，有效地降低一旦暴露于诱发因素将发生的、与卟啉症相关联的一种或多种症状发作的可能性的一个量，或有效地降低发展与卟啉症相关联的病状(例如，神经病变(例如，渐进性神经病变)(例如，神经病变(例如，渐进性神经病变)、肝细胞癌)的风险的一个量。例如，如果当一个与一种疾病或病症相关联的可测量的参数减少至少10％时，一个给定的临床治疗才被认为是有效的，那么一种用于该疾病或病症的治疗的药物的治疗的有效量是实现该参数至少减少10％所需要的一个量。例如，治疗有效量的靶向ALAS1的iRNA可以减少ALAS1蛋白水平任何可测量的量，例如，至少10％、20％、30％、40％或50％。
术语“药学上可接受的载体”指用于一种治疗剂的给予的载体。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、及其组合。该术语特别地排除细胞培养基。对于口服给予的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，比如惰性稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠以及碳酸钙、磷酸钠以及磷酸钙，以及乳糖，而玉米淀粉以及褐藻酸是合适的崩解剂。结合剂可以包括淀粉以及明胶，而润滑剂(如果存在的话)将通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果希望的话，可以将片剂用一种材料进行包衣，比如单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯，以延迟在胃肠道中的吸收。下文进一步描述药物制剂所包含的药剂。
当提及数字或数值范围时，术语“约”是指所提及的数字或数值范围是在一个实验变异内(或在统计实验误差内)的近似值，并且由此该数字或数值范围可以从，例如，所陈述数字或数值范围的1％与15％之间变化。
II.双链核糖核酸(dsRNA)
在此描述了抑制ALAS1基因表达的iRNA剂。在一个实施例中，该iRNA剂包括用于在细胞或受试者(例如，哺乳动物，像患有卟啉症的人类)中抑制ALAS1基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中该dsRNA包括一个具有互补性区域(该区域与在ALAS1基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补)的反义链，并且其中该互补性区域的长度小于或等于30个核苷酸，通常长度是19-24个核苷酸，并且其中该dsRNA在与表达该ALAS1基因的细胞相接触时抑制该ALAS1基因的表达至少10％，如通过例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法、或通过基于蛋白的方法(例如通过蛋白质印迹(Western blot))所测定的。在一个实施例中，该iRNA剂激活ALAS1基因在细胞或哺乳动物中的表达。可以通过测量ALAS1 mRNA水平，如通过bDNA或TaqMan测定法，或使用例如蛋白质印迹法或流式细胞技术通过测量蛋白质水平，如通过免疫荧光分析，测定细胞培养物中如COS细胞、HeLa细胞、原代肝上皮实质细胞、HepG2细胞、原代培养物细胞中或在来自受试者的生物样本中的ALAS1基因表达。
dsRNA包括两个RNA链，它们足够地互补以在其中将使用dsRNA的条件下杂交形成一个双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包括一个互补区域，该区域基本上是与衍生自ALAS1基因表达过程中形成的mRNA的序列的靶标序列互补的，通常是完全互补的。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域，从而在适合的条件下组合时，这两条链杂交并形成双链体结构。通常，该双链体结构具有15和30之间并包括15和30碱基对长度，更通常地具有18和25之间并包括18和25碱基对长度，然而更通常地具有19和24之间并包括19和24个碱基对长度，并且更通常地具有19和21个之间并包括19和21个碱基对长度。同样地，与靶标序列互补的区域具有15和30个之间并包括15和30个核苷酸长度，更通常地具有18和25个之间并包括18和25个核苷酸长度，然而更通常地具有19和24个之间并包括19和24个核苷酸长度，并且最通常地具有19和21个之间并包括19和21个核苷酸长度。在一些实施例中，dsRNA具有15和20个之间并包括15和20个核苷酸长度，并且在其他实施例中，dsRNA具有25和30个之间并包括25和30个核苷酸长度。如普通技术人员将认识，被靶向以便切割的RNA的靶向区域将最经常是较大RNA分子(往往mRNA分子)的部分。在相关的情况下，mRNA靶标的“一部分”是mRNA靶标的连续序列，其长度足够作为RNAi指导的切割的底物(即，经RISC途径的切割)。在一些情况下，具有短至9个碱基对的双链体的dsRNA可以介导RNAi指导的RNA切割。最经常地，靶标将是至少15个核苷酸长度，例如，15-30个核苷酸长度。
本领域技术人员将也认识到，双链体区是dsRNA的主要功能性部分，例如，9至36个碱基对(例如，15-30个碱基对)的双链体区。因此，在一个实施例中，为了达到被加工成导引所需RNA切割的(例如，15-30个碱基对)功能性双链体，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，随后，普通技术人员将认识到在一个实施例中miRNA是dsRNA。在另一个实施例中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施例中，用于靶向ALAS1表达的iRNA剂不是在靶标细胞中通过切割较大dsRNA产生的。
如本文所述的dsRNA可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出。该dsRNA可以通过如进一步在以下所讨论的、本领域内已知的标准方法来进行合成，例如，通过使用自动化的DNA合成仪，比如从例如生物研究公司(Biosearch)、应用生物系统公司(AppliedBiosystem公司)可商购的合成仪。在一个实施例中，ALAS1基因是人类ALAS1基因。在另一个实施例中，ALAS1基因是小鼠或大鼠ALAS1基因。在特定的实施例中，第一序列是包含表2或3中的有义序列的dsRNA的有义链，并且第二序列包含表2或3中的反义序列的dsRNA的反义链。在实施例中，第一序列是包含表2、3、6、7、8、9、14、或15中的有义序列的dsRNA有义链，并且第二序列包含表2、3、6、7、8、9、14、或15中的反义序列的dsRNA的反义链。在实施例中，第一序列是包含表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中的有义序列的dsRNA的有义链，并且第二序列包含表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中的反义序列的dsRNA的反义链。使用靶标序列和侧翼ALAS1序列，可以轻易确定靶向除在此(例如，表2或表3中)披露的dsRNA的那些序列的替代性dsRNA剂。
在一个方面中，dsRNA将至少包括有义和反义核苷酸序列，由此有义链选自表2和3中提供的序列的组，并且该有义链相应的反义链选自表2和3中提供的序列的组。在另外一个方面中，dsRNA将至少包括有义和反义核苷酸序列，由此有义链选自表2、3、6、7、8、9、14、和15提供的序列的组，并且该有义链相应的反义链选自表2、3、6、7、8、9、14、和15提供的序列的组。在另外一个方面中，dsRNA将至少包括有义和反义核苷酸序列，由此有义链选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20提供的序列的组，并且该有义链相应的反义链选自表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20提供的序列的组。在这些方面中，两个序列的一者与两个序列的另一者互补，其中这些序列中的一者与ALAS1基因表达中产生的mRNA的序列基本上互补。就这一点而论，dsRNA将包括两个寡核苷酸，其中将一个寡核苷酸描述为表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中的有义链并且将第二寡核苷酸描述为来自表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20的有义链的相应反义链。如本文中他处描述并且如本领域已知，与处在分开的寡核苷酸上相反，dsRNA的互补序列也可以作为单一核酸分子的自我互补区域包括。
熟练的技术人员将很好的意识到，具有20与23之间个碱基对(但是特别是21个碱基对)的双链结构的dsRNA被奉为是尤其有效地诱导RNA干扰(厄尔巴瑟等人，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而，其他人已经发现较短或较长的RNA双链体结构物也可以是有效的。在上文描述的实施例中，由于表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所述的dsRNA可以包括长度最小21个核苷酸的至少一条链。可以合理地预期，具有表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中的序列之一的、在一个末端或两个末端减去仅仅数个核苷酸的更短的双链体与以上描述的dsRNA相比可以类似地有效。因此，根据本发明构思这样的dsRNA，它们具有来自表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中序列之一的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的部分序列并且在它们抑制ALAS1基因表达的能力方面与包含全序列的dsRNA不同不多于5％、10％、15％、20％、25％或30％抑制。
此外，在表2和3中提供的RNA，连同在表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中提供的RNA，识别ALAS1转录本中一个易于经受RISC介导的切割的位点。就这一点而论，本发明进一步表征了靶向这类序列之一内部的iRNA。如本文所用，如果一种iRNA促进在某个特定位点内部任何地方切割RNA转录本，则称这种iRNA靶向该转录本内部的这个特定位点。这种iRNA通常将包括来自表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中提供的序列之一的至少15个连续核苷酸，所述连续核苷酸与从ALAS1基因中的选择序列保持连续的区域所取得的额外核苷酸序列连接。
尽管靶序列总体上是15-30个核苷酸长度，但是在这个范围内的特定序列指导任何给定靶RNA切割的适用性方面存在广泛变异。在此陈述的不同软件包和指南提供了用于针对任意给定基因靶标识别最优靶标序列的指南，但是还可以采取一种经验主义的方法，其中给定大小的“窗口”或“掩码”(作为一个非限制性实例，21个核苷酸)被照字面的或象征性地(包括，例如，计算机模拟)放置在靶标RNA序列上以识别可用作靶标序列的大小范围内的序列。通过移动该序列“窗口”渐进初始靶标序列位置的一个核苷酸上游或下游，可以鉴别下一个潜在的靶标序列，直到针对所选择的任何给定的靶标尺寸鉴别可能的序列的全套。这个过程(加上为了鉴定最佳执行的那些序列的所鉴定的序列的系统合成和测试(使用此处所述的或如本领域中已知的测定))可以鉴定当用一种iRNA剂靶向时介导靶基因表达的最好抑制的那些RNA序列。因此，当例如在表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中识别的序列表示有效靶标序列时，在此考虑了可以通过以下方式实现抑制效力的进一步优化：沿着给定序列的上游或下游的一个核苷酸逐步地“窗口步移”来鉴别具有相同或更好抑制特性的序列。
另外，考虑了对于例如在表2、3、6、7、8、9、14、15、18和20中识别的任何序列，可以通过以下方式实现进一步优化：系统地添加或移走核苷酸以产生较长或较短的序列，并且测试通过从该点上游于或下游于靶标RNA步移具有更长或更短尺寸的窗口所产生的那些序列。再次地，使这种方案与产生新候选物靶联系，同时在如本领域已知或如本文所述的抑制测定法中基于这些靶序列测试iRNA的有效性，可以导致效率抑制的进一步改善。再者，可以例如通过引入如本文所述或如本领域已知的修饰核苷酸、添加或改变突出端或如本领域已知和/或本文中讨论的其他修饰，调节这类优化的序列以便进一步优化该分子(例如，增加血清稳定性或循环半寿期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从内体放中等)作为表达抑制剂。
如本文所述的iRNA可以含有一个或多个相对于靶标序列的错配。在一个实施例中，如本文所述的iRNA含有不多于3个错配。如果iRNA的反义链含有相对于靶序列的错配，则优选错配区域不应当位于互补区域的中心内。如果iRNA的反义链含有相对于靶序列的错配，则优选错配区域应当局限于距互补区域5′或3′末端的最末5个核苷酸内部。例如，对于与ALAS1基因的某区域互补的23个核苷酸iRNA剂的RNA链而言，RNA链通常在中央13个核苷酸内部不含任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可以用来确定含有相对于靶序列的错配的iRNA是否有效抑制ALAS1基因表达。考虑具有错配的iRNA在抑制ALAS1基因表达方面的效率是重要的，尤其是如果ALAS1基因中的互补性具体区域已知在群体内具有多态性序列变异。
在一个实施例中，dsRNA的至少一个端具有1至4个、总体上1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸突出的dsRNA相对于它们的平末端的对应物，具备出乎意料优越的抑制性特性。在又一个实施例中，将iRNA(例如，dsRNA)的RNA化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。本发明中表征的核酸可以通过本领域充分建立的方法合成和/或修饰，如在“核酸化学实验室指南(Current protocols in nucleic acid chemistry)”，毕克奇(Beaucage，S.L.)等人(编著)，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)，美国纽约(New York，NY，USA)中描述的那些方法，所述文献因此通过引用方式结合在此。修饰包括例如(a)末端修饰，例如，5′末端修饰(磷酸化、共轭、倒置键等)、3′末端修饰(共轭、DNA核苷酸、倒置键等)，(b)碱基修饰，例如，替换为稳定性碱基、去稳定性碱基或与扩充的配偶物库发生碱基配对的碱基、移除碱基(非碱基核苷酸)、或共轭的碱基，(c)糖修饰(例如，在2′位置或4′位置)或糖的替换，以及(d)主链修饰，包括修饰或替换磷酸二酯键。在本发明中的有用的RNA化合物的具体实例包括但不限于含有修饰主链或无天然核苷间键的RNA。具有修饰骨架的RNA除其他之外包括在骨架中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的和如有时本领域中谈及，也可以将在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰RNA视为寡核苷。在具体的实施例中，修饰的RNA将在其核苷间主链中具有磷原子。
修饰的RNA主链包括例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、磷酰胺酯，包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些酯的2′-5′连接的类似物，和具有反转极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位为3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。还可以包括不同盐、混合盐以及游离酸形式。
教授制备以上含磷键的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利RE 39464，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。
其中不包含磷原子的修饰的RNA骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键的那些(部分地从一个核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲乙酰基(methylene formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。
教授制备以上寡核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。
在适合用于或构思用于iRNA的其他RNA模拟物中，将核苷酸单位的糖和核苷间键即主链替换为新基团。保持碱基单元以与适当的核酸靶标化合物杂交。一种这类寡聚化合物，已经显示具有优异杂交特性的RNA模拟物，称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架替换为含有酰胺的骨架，尤其氨基乙基甘氨酸骨架。这些核碱基得以保持并且直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教授制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此。对PNA化合物的其他教授内容可以在例如尼尔森(Nielsen)等人，科学(Science)，1991，254，1497-1500中找到。
本发明中表征的一些实施例包括具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，并且尤其上文所参考美国专利号5,489,677的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--、和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯主链表述为--O--P--O--CH2--]，和上文所参考美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施例中，在此表征的RNA具有上文所参考美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。
经修饰的RNA还可以含一个或多个经取代的糖部分。在此表征的iRNA，例如dsRNA，在2’位置包括下述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性的适合的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是从1至约10。在其他实施例中，dsRNA在2′位置包含以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善iRNA的药物代谢动力学特性的基团、或用于改善iRNA的药效特征的基团、和具有相似特性的其他取代基。在一些实施例中，该修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O--CH2CH2OCH3，也称作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(马丁(Martin)等人，瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)，1995，78，486-504)，即，一个烷氧基-烷氧基基团。另一个示例修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，如在以下实例中所描述的也称作2′-DMAOE，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2′-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2，也如在以下实例中所描述的。
其他修饰包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。也可以在iRNA的RNA上的其他位置处作出相似的修饰，尤其在3′末端核苷酸上或在2′-5′连接的dsRNA中糖的3′位置和5′末端核苷酸的5′位置。iRNA也可以具有糖模拟物，如替代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教授制备这类修饰糖结构的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，所述专利的某些由本申请共同所有，并且所述专利的每一篇通过引用方式结合在此。
iRNA还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰物或取代物。如在此所使用的，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰核碱基包括但不局限于其他合成以及天然核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基，8-氨基，8-氢硫基，8-硫烷基，8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其是5-溴，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他的核碱基包括在美国专利号3,687,808中披露的那些、在生物化学、生物技术和医药中的修饰的核苷酸(Modified Nucleosides in Biochemistry，Biotechnology andMedicine)，赫德维珍妮(Herdewijn)，P.编著.Wiley-VCH，2008中披露的那些；在聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering)，第858-859页，克洛舍维奇(Kroschwitz)，J.L编著，约翰威利父子(JohnWiley&Sons)，1990中披露的那些、由恩利施(Englisch)等人，应用化学(AngewandteChemie)，国际版，1991，30，613披露的那些和由赛格维(Sanghvi)，YS.，第15章，dsRNA研究与应用(dsRNA Research and Applications)，第289-302页，克鲁克(Crooke)，S.T.和拉布列(Lebleu)，B.编著，CRC出版社，1993披露的那些。这些核碱基中的某些对提高本发明表征的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经表明5-甲基胞嘧啶取代基提高核酸双链体的稳定性0.6℃-1.2℃(桑格威(Sanghvi)，Y.S.，克鲁克(Crooke)，S.T.以及拉布列(Lebleu)，B.编辑，dsRNA研究与应用(dsRNAResearch and Applications)，CRC出版社，波卡拉顿(Boca Raton)，1993，第276-278页)，并是示例性的碱基取代基，甚至更加特别地为当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰物组合时。
教授制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于上述的美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；5,681,941；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，所述文献的每一篇通过引用方式结合在此，和美国专利号5,750,692，其也通过引用方式结合在此。
也可以修饰iRNA的RNA以包含一个或多个锁定的核酸(LNA)。锁定的核酸是具有修饰核糖部分的核苷酸，其中所述核糖部分包含连接2′碳和4′碳的额外桥。这个结构有效地将该核糖“锁”在3′-内切结构构象中。向siRNA添加锁定的核酸已经显示增加血清中的siRNA稳定性并且减少脱靶效应(埃尔曼(Elmen，J.)等人，(2005)核酸研究(Nucleic AcidsResearch)33(1)：439-447；莫克(Mook，OR.)等人，(2007)分子癌症治疗(Mol Canc Ther)6(3)：833-843；谷万尔(Grunweller，A.)等人，(2003)核酸研究(Nucleic Acids Research)31(12)：3185-3193)。
传授锁定的核酸核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于以下美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；以及7,399,845，其每一者通过引用结合于此。
对RNA分子的末端的潜在的稳定化修饰可包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAC)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAC)、胸苷-2′-0-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二醇基(docosanoyl)-尿苷-3″-磷酸酯、反向碱基dT(idT)及其他。在PCT公开号WO 201I/005861中可以找到这种修饰的披露。
iRNA基序
在一个实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′ (I)
其中：
i和j彼此独立地是0或1；
p和q彼此独立地是0-6；
每个Na独立地表示包括0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包括0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示一个突出核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修饰；并且
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。优选地YYY全是2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施例中，Na和/或Nb包括交替模式的修饰。
在一个实施例中，YYY基序发生在有义链的切割位点处或其附近处。例如，当该RNAi剂具有17-23个核苷酸长度的双链体区域时，该YYY基序可以发生在有义链的切割位点处或其附近处(例如，可以发生在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13处)，该计数从5’-末端，从第一个核苷酸开始；或任选地，该计数从5’-末端，从该双链体区域内的第一对核苷酸开始。
在一个实施例中，i是1且j是0，或i是0且j是1，或i和j两者都是1。该有义链因此可以由以下式表示：
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Ib)；
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3′ (Ic)；或
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Id)。
当该有义链是由式(Ib)表示时，Nb表示一个寡核苷酸序列，包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na可独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链表示为式(Ic)时，Nb表示一个寡核苷酸序列，包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na可独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链表示为式(Id)时，每个Nb独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。每个Na可独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z每个可以是彼此相同的或不同的。
在其他实施例中，i是0且j是0，并且该有义链可以由下式表示：
5′np-Na-YYY-Na-nq 3′ (Ia)。
当该有义链由式(Ia)表示时，每个Na独立地可以表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5′nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)1-N′a-np′3′ (II)
其中：
k和1各自独立地是0或1；
p’和q’各自独立地是0-6；
每个Na′独立地表示包括0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb′独立地表示包括0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np′和nq′独立地表示一个突出核苷酸；
其中Nb’和Y′不具有相同的修饰；
并且
X′X′X′、Y′Y′Y′、以及Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，Na’和/或Nb’包括交替模式的修饰。
Y′Y′Y′基序发生在反义链的切割位点处或其附近处。例如，当该RNAi剂具有17-23个核苷酸长度的双链体区域时，该Y′Y′Y′基序可以发生在该反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处)，该计数从5’-末端，从第一个核苷酸开始；或任选地，该计数从5’-末端，从该双链体区域内的第一对核苷酸开始。优选地，该Y′Y′Y′基序发生在位置11、12、13处。
在一个实施例中，Y′Y′Y′基序全是2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施例中，k是1且1是0，或k是0且1是1，或k和1两者都是1。
该反义链因此可以由以下式表示：
5′nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3′ (IIb)；
5′nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3′ (IIc)；或
5′nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np，3′ (IId)。
当该反义链是由式(IIb)表示时，Nb’表示一个寡核苷酸序列，包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na’独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链表示为式(IIc)时，Nb’表示一个寡核苷酸序列，包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na’独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链表示为式(IId)时，每个Nb’独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na’独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施例中，k是0且l是0，并且该反义链可以由下式表示：
5′np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3′ (Ia)。
当该反义链由式(IIa)表示时，每个Na’独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸。
X′、Y′和Z′每个可以是彼此相同的或不同的。
该有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地由以下各项修饰：LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基、或2’-氟。例如，该有义链和反义链的每个核苷酸独立地由2’-O-甲基或2’-氟修饰。具体地，每个X、Y、Z、X′、Y′和Z′可以表示一个2’-O-甲基修饰或一个2’-氟修饰。
在一个实施例中，当该双链体区域是21nt时，该RNAi剂的有义链可以包含发生在该链的位置9、10和11处的YYY基序，该计数从5’-末端，从第一个核苷酸开始；或任选地，该计数从5’-末端，从该双链体区域内的第一对核苷酸开始；并且Y表示2’-F修饰。该有义链可以另外包含XXX基序或ZZZ基序作为在该双链体区域的相反末端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示一个2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一个实施例中，该反义链可以包含发生在该链的位置11、12和13处的Y′Y′Y′基序，该计数从5’-末端，从第一个核苷酸开始；或任选地，该计数从5’-末端，从该双链体区域内的第一对核苷酸开始；并且Y′表示2’-O-甲基修饰。该反义链可以另外包含X′X′X′基序或Z′Z′Z′基序作为在该双链体区域的相反末端处的翼修饰；并且X′X′X′和Z′Z′Z′各自独立地表示一个2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)、和(Id)中任一项表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)、和(IId)中任一项表示的反义链形成了一个双链体。
因此，用于在本发明的方法中使用的RNAi剂可以包括一个有义链和一个反义链，每个链具有14至30个核苷酸，该RNAi双链体由式(III)表示：
有义：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义：3′np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)1-Na’-nq’5′
(III)
其中：
i、j、k、以及1各自独立地是0或1；
p、p’、q、以及q′各自独立地是0-6；
每个Na和Na′独立地表示包括0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb′独立地表示包括0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
每个np’、np、nq’、和nq，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示一个突出核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、以及Z′Z′Z′各自独立地表示三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，i是0且j是0；或i是1且j是0；或i是0且j是1；或i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在另一个实施例中，k是0且1是0；或k是1且1是0；k是0且1是1；或k和1两者都是0；或k和1两者都是1。
形成RNAi双链体的该有义链和反义链的示例组合包括下式：
5′np-Na-Y Y Y-Na-nq 3′
3′np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5′
(IIIa)
5′np-Na-Y Y Y-Nb-ZZZ-Na-nq3′
3′np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’5′
(IIIb)
5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3′
3′np’-Na’-X′X′X′-Nb-Y′Y′Y′-N’a-nq’5′
(IIIc)
5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
3′np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5′
(IIId)
当该RNAi剂是由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸。
当该RNAi剂是由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含1-10个、1-7个、、1-5个或1-4个修饰的核苷酸。每个Na独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂表示为式(IIIc)时，每个Nb、Nb’独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂表示为式(IIId)时，每个Nb、Nb’独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na、Na’独立地表示包括2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’中的每一个独立地包括交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)中的每个X、Y和Z每个可以是彼此相同的或不同的。
当该RNAi剂是由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)表示时，Y核苷酸中的至少一个可以与该Y′核苷酸形成一个碱基对。可替代地，至少两个Y核苷酸与相应的Y′核苷酸形成碱基对；或全部三个Y核苷酸与相应的Y′核苷酸都形成碱基对。
当该RNAi剂是由式(IIIb)或(IIId)表示时，Z核苷酸中的至少一个可以与该Z′核苷酸形成一个碱基对。可替代地，至少两个Z核苷酸与相应的Z′核苷酸形成碱基对；或全部三个Z核苷酸与相应的Z′核苷酸都形成碱基对。
当该RNAi剂表示为式(IIIc)或(IIId)时，X核苷酸中的至少一个可以与该X′核苷酸形成一个碱基对。可替代地，至少两个X核苷酸与相应的X′核苷酸形成碱基对；或全部三个X核苷酸与相应的X′核苷酸都形成碱基对。
在一个实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z’核苷酸上的修饰、和/或X核苷酸上的修饰不同于X’核苷酸上的修饰。
在一个实施例中，当该RNAi剂是由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。在另一个实施例中，当该RNAi剂是由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰且np′＞0并且至少一个np′是经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上的。在又另一个实施例中，当该RNAi剂是由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，np′＞0并且至少一个np′是经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上的，并且有义链共轭到通过一个二价或三价分支连接物附接的一个或多个GalNAc衍生物。在另一个实施例中，当该RNAi剂是由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，np′＞0并且至少一个np′是经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上的，有义链包括至少一个硫代磷酸酯键并且该有义链共轭到通过一个二价或三价分支连接物附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个实施例中，当该RNAi剂是由式(IIIa)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，np′＞0并且至少一个np′是经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上的，有义链包括至少一个硫代磷酸酯键并且该有义链共轭到通过一个二价或三价分支连接物附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个实施例中，该RNAi剂是一种多聚体，包含至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)表示的双链体，其中这些双链体通过连接物连接。该连接物可以是可剪切的或不可剪切的。任选地，该多聚体进一步包括一种配体。这些双链体中的每一个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体中的每一个可以靶向在两个不同靶标部位的相同基因。
在一个实施例中，该RNAi剂是一种多聚体，包含三个、四个、五个、六个、或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)表示的双链体，其中这些双链体通过连接物连接。该连接物可以是可剪切的或不可剪切的。任选地，该多聚体进一步包括一种配体。这些双链体中的每一个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体中的每一个可以靶向在两个不同靶标部位的相同基因。
在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)表示的两个RNAi剂在5’末端彼此连接，并且3’末端中的一个或两个都任选地共轭至一个配体。这些试剂中的每一个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些试剂中的每一个可以靶向在两个不同靶标部位的相同基因。
iRNA共轭物
在此披露的iRNA剂能处于共轭物的形式。该共轭物可以在iRNA分子的任何适合的位置处附接，例如，在该有义或反义链的3’末端或5’末端处。该共轭物可任选地经由连接物附接。
在一些实施例中，在此所述的iRNA剂化学地连接至一个或多个配体、部分或共轭物，这可能赋予功能性，例如，通过影响(例如，增强)iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(乐欣格(Letsinger)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acid.Sci.USA)，1989，86：6553-6556)，胆酸(马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)，1994，4：1053-1060)，硫醚如beryl-S-三苯甲基硫醇(马诺汗(Manoharan)等人，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1992，660：306-309；马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)，1993，3：2765-2770)，硫代胆固醇(奥博汗瑟(Oberhauser)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1992，20：533-538)，脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(赛森-博和马拉(Saison-Behmoaras)等人，EMBO杂志，1991，10：1111-1118；卡波诺(Kabanov)等人，FEBS通讯，1990，259：327-330；斯伍那区克(Svinarchuk)等人，生物化学(Biochimie)，1993，75：49-54)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-O-十六烧基-外消旋-甘油-3-磷酸酯(马诺汗(Manoharan)等人，四面体通讯(TetrahedronLett.)，1995，36：3651-3654；舍阿(Shea)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1990，18：3777-3783)，聚胺或聚乙烯乙二醇链(马诺汗(Manoharan)等人，核苷&核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14：969-973)或金刚烷乙酸(马诺汗(Manoharan)等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1995，36：3651-3654)，十六烧基部分(米莎(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1995，1264：229-237)，或十八胺或己胺-羰基羟胆固醇部分(克鲁克(Crooke)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmaco1.Exp.Ther.)，1996，277：923-937)。
在一个实施例中，配体改变向其中并入该配体的iRNA剂的分布、靶向或寿命。在一些实施例中，与例如不存在这样一种配体的种类相比，该配体提供针对所选靶标例如，分子、细胞或细胞类型、区室(例如，细胞或器官区室、身体组织、器官或区域)的增强的亲和力。典型的配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、茁霉多糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如，合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、聚胺肽、树枝状聚合物的聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。
配体也可以包括靶向基团，例如，与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如，凝集素，糖蛋白，脂质或蛋白质，例如，抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。
在一些实施例中，该配体是包括一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc配体。GalNAc配体的另外的描述提供于标题为碳水化合物共轭物的节段。
配体的其他例子包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子，例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、鲸蜡基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪肽共轭物(例如，触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成性核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑聚类、吖啶-咪唑共轭物、四氮杂大环类的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如，糖蛋白，或肽，例如，对辅助配体具有特异亲和力的分子，或抗体，例如，与指定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们也可以包括非肽种类，如脂质、凝集素、糖类、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。该配体可以是例如脂多糖，p38MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。
配体可以是可以例如通过破坏细胞细胞骨架(例如，通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加iRNA剂摄入细胞中的物质，例如，药物。药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin。
在一些实施例中，与如本文所述的iRNA连接的配体充当药物代谢动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲油物质、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素等。包含许多硫代磷酸酯键的寡核苷酸也已知与血清蛋白结合，因此在骨架中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸，例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，也服从于本发明作为配体(例如作为PK调节配体)。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适配体也适合用作本文所述的实施例中的PK调节配体。
本发明的配体-共轭的寡核苷酸可以通过使用这样一种寡核苷酸合成，该寡核苷酸具有吊坠反应功能性，例如衍生自该寡核苷酸上的连接分子的附接物(如下所述)。该反应性寡核苷酸可以直接与可商购的配体，合成的、具有多种保护基中的任一种的配体，或具有连接部分附接于其上的配体发生反应。
在本发明的共轭物中使用的寡核苷酸可以通过固相合成的公知技术方便且常规地制备。用于这类合成的设备由多个供应商(包括例如应用生物系统公司(AppliedBiosystems)(福斯特市，加利福尼亚州))销售。可另外地或替代地使用本领域中已知的用于这类合成的任何其他装置。使用相似的技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是已知的。
在本发明的配体-共轭的寡核苷酸以及具有序列特异性连接的核苷的配体-分子中，该寡核苷酸以及寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体，或已经具有连接部分的核苷酸或核苷共轭前体，已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷-共轭物前体，或带有组块的非核苷配体，从而在适合的DNA合成仪中组装。
当使用已经具有连接部分的核苷酸-共轭物前体时，典型地完成该序列特异性连接的核苷的合成，并且然后该配体分子与该连接部分反应以形成配体共轭的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过一种自动合成仪合成，除了可商购以及寡核苷酸合成中常规使用的标准亚磷酰胺以及非标准亚磷酰胺之外，该合成还使用衍生自配体-核苷共轭物的亚磷酰胺。
脂质共轭物
在一个实施例中，该配体是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子可以典型地结合血清蛋白，例如，人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许共轭物分布至靶组织，例如，身体的非肾靶组织。例如靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如，可以使用蘩警生(neproxin)或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加共轭物对降解的抵抗力，(b)增加靶向或转运至靶标细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如，HSA)的结合。
基于脂质的配体可以用来调制，例如，控制(如，抑制)共轭物与靶组织的结合。例如与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能被靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使共轭物靶向肾。
在一个实施例中，基于脂质的配体结合HSA。例如，该配体以足够的亲和力结合HSA，从而共轭物向分布至非肾组织的分布增强。然而，典型地是这种亲和力并不是这样强，从而HSA-配体结合不能逆转。
在另一个实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合HSA，从而共轭物向肾的分布增强。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，也可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一个方面，配体是由靶标细胞(例如，正在增殖的细胞)摄取的部分，例如，维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如，恶性或非恶性型，例如，癌细胞)增殖为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括是B维生素，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或由癌细胞摄取的其他维生素或养分。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
细胞渗透剂
在另一个方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋形细胞渗透剂。在一个实施例中，该药剂是两亲的。一种示例性剂渗透剂是肽如tat或触角足蛋白。如果该渗透剂是肽，则它可以经修饰的，包括肽酰基模拟物、反演体、非肽键或假肽键和D-氨基酸的使用。该螺旋剂典型地是α-螺旋剂，并且可以具有亲脂性和疏脂性相。
该配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA剂的附接可以影响iRNA的药物代谢动力学分布，如通过增强细胞鉴别与吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长的，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代中，肽部分可以包含疏水性膜转运序列(MTS)。一种含有疏水性MTS的示例性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：3367)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：3368))也可以是靶向部分。该肽部分可以是一个“递送”肽，其可携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸、和蛋白跨细胞膜。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：3369))和果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ IDNO：3370))的序列能够作为递送肽发挥作用。肽或肽模拟物可以由随机DNA序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(拉姆(Lam)等人，自然(Nature)，354：82-84，1991)。典型地，经由一个合并的单体单元留至dsRNA剂的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。肽部分可以在长度上范围从约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或指导构象特性。可以利用下文描述的任何结构修饰。
用于在本发明的组合物和方法中使用的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以是修饰的，例如糖基化或甲基化以促进靶向一个或多个特定组织。含RGD的肽和肽模拟物可以包括D-氨基酸以及合成的RGD模拟物。除了RGD之外，可使用靶向整合素配体的其他部分。该配体的优选共轭物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可以用来靶向特定细胞类型，例如，肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(扎特曼(Zitzmann)等人，癌症研究(Cancer Res.)，62：5139-43，2002)。RGD肽可以促进dsRNA剂靶向多种其他组织(包括肺、脾或肝脏)的肿瘤(青木(Aoki)等人，癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy)8：783-787，2001)。典型地，RGD肽将促进iRNA剂靶向肾。RGD肽可以是线性或环状的，并且可以是修饰的，例如，糖基化或甲基化以促进靶向特定组织。例如，糖基化的RGD肽可以递送iRNA剂至表达αVβ3的肿瘤细胞(华博纳(Haubner)等人，核医学(Jour.Nucl.Med.)，42：326-336，2001)。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是，例如，α-螺旋形线性肽(例如，LL-37或CeropinP1)，含有二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽)，或仅含一个或两个支配性氨基酸的肽(例如，PR-39或indolicidin)。细胞渗透肽也可以包含核定位信号(NLS)。例如细胞渗透肽可以是二重两亲肽，如MPG，其源自HIV-1gp41的融合物肽结构域和SV40大T抗原的NLS(西梅奥尼(Simeoni)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)31：2717-2724，2003)。
碳水化合物共轭物
在本发明的组合物与方法的一些实施例中，iRNA寡核苷酸进一步包括一种碳水化合物。碳水化合物共轭的iRNA对于核酸的体内递送以及适合于体内治疗用途的组合物而言是有利的，如在此所描述。如在此所使用的，“碳水化合物”指以下这样一种化合物，它是一种本身由具有至少6个碳原子的一个或多个单糖单位构成的碳水化合物(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子；或者它是一种具有以下这样的一个碳水化合物部分作为其一部分的化合物，该碳水化合物由具有至少六个碳原子的一个或多个单糖单位构成(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖以及包含从大约4、5、6、7、8或9个单糖单位的低聚糖)，以及多糖例如淀粉、糖原、纤维素以及多糖胶。具体的单糖包括C5以及以上的(例如C5、C6、C7或C8)糖；二糖以及三糖包括具有两个或三个单糖单位的糖(例如C5、C6、C7或C8)。
在一个实施例中，碳水化合物共轭物包括单糖。在一个实施例中，该单糖是一种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。GalNAc共轭物描述于，例如，美国专利号8,106,022，通过引用将其全部内容结合在此。在一些实施例中，GalNAc共轭物用作将iRNA靶向特定细胞的配体。在一些实施例中，GalNAc共轭物将iRNA靶向肝脏细胞，例如，通过用作针对肝脏细胞(例如，肝上皮实质细胞)的脱唾液酸糖蛋白受体的一种配体。
在一些实施例中，碳水化合物共轭物包括一个或多个GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以经由连接物附接，例如，二价或三价分枝的连接物。在一些实施例中，GalNAc共轭物共轭至有义链的3’末端。在一些实施例中，GalNAc共轭物经由连接物(例如，在此所述的连接物)共轭至iRNA剂(例如，有义链的3’末端)。
在一些实施例中，该GalNAc共轭物是
Figure BDA0001787260730000871
在一些实施例中，RNAi剂经由连接物附接至碳水化合物共轭物，例如，如以下方案中示出的连接物，其中X是O或S
Figure BDA0001787260730000881
在一些实施例中，RNAi剂共轭至如表1中定义且如下示出的L96
Figure BDA0001787260730000882
在一些实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物共轭物是选自下组，该组由以下各项组成：
Figure BDA0001787260730000883
Figure BDA0001787260730000891
Figure BDA0001787260730000901
Figure BDA0001787260730000911
Figure BDA0001787260730000921
用于在于此描述的实施例中使用的另一个代表性碳水化合物共轭物包括但不限于，
Figure BDA0001787260730000922
当X或Y其中一者是寡核苷酸时，另一者是氢。
在一些实施例中，该碳水化合物共轭物进一步包括以上描述的一个或多个另外的配体，例如但不限于一种PK调制子和/或一种细胞渗透肽。
在一个实施例中，本发明的iRNA通过一种连接物被共轭至一种碳水化合物。本发明的组合物与方法的具有连接物的iRNA碳水化合物共轭物的非限制性实例包括但不限于，
Figure BDA0001787260730000931
Figure BDA0001787260730000941
Figure BDA0001787260730000942
当X或Y其中一者是寡核苷酸时，另一者是氢。
连接物
在一些实施例中，此处所述的共轭物或配体可以借助各种连接物与iRNA寡核苷酸附接，所述连接物可以是可切割或不可切割的。
术语“连接物”或“连接基团”意为一种有机部分，它连接一个化合物的两个部分，例如共价地附接一个化合物的两个部分。连接物典型地包括一种直接的键或一种原子例如氧或硫，一种单位例如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或者一种原子链，例如但不限于经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族的或经取代的脂肪族的。在一个实施例中，该连接物是在大约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子，7-17、8-17、6-16、7-16或8-16个原子之间。
在一个实施例中，本发明的dsRNA被共轭至一种二价或三价分支连接物，其选自在式(XXXI)-(XXXIV)的任一个中显示的结构的组：
Figure BDA0001787260730000951
其中：
各次出现的q2A、q2b、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B以及q5C独立地代表0-20，并且其中该重复单元可以是相同或不同的；
各次出现的p2A、P2B、P3A、P3B、p4A、P4B、P5A、P5B、p5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C各自独立地是：不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
各次出现的Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C各自独立地是：不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下各项中的一个或多个所中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R′)＝C(R”)、C≡C或C(O)；
各次出现的R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C各自独立地是：不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、
Figure BDA0001787260730000961
Figure BDA0001787260730000962
或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C代表配体；即各次出现时各自独立地代表：单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、低聚糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价共轭的GalNAc衍生物对于与RNAi剂一起使用以抑制靶标基因的表达是特别有用的，例如具有式(XXXV)的那些：
式XXXV
Figure BDA0001787260730000963
其中L5A、L5B与L5C代表单糖，例如GalNAc衍生物。
合适的二价与三价分支连接物基团共轭GalNAc衍生物的实例包括但不限于在以上引用为式II、VII、XI、X以及XIII的结构。
一种可切割的连接基团在细胞外是足够稳定的，但它在进入靶标细胞时被切割以释放该连接物结合在一起的两个部分。在一个优选的实施例中，该可切割的连接基团在靶标细胞中或在一个第一参考条件(其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下的切割比在受试者的血液中或在一个第二参考条件下(其可以例如被选择为模拟或代表在该血液或血清中发现的条件)快至少大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少大约100倍。
可切割的连接基团易于受到切割因子(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。一般地，切割因子在细胞内比在血清或血液中更普遍或具有更高水平或活性。此类降解因子的实例包括：氧化还原因子，它们被选择用于具体底物或者无底物特异性，包括例如氧化或还原酶或者在细胞中出现的还原因子例如硫醇(它可以通过还原作用降解一种可氧化还原切割的连接基团)；酯酶；核内体或可以创造酸性环境的因子，例如可以导致pH为5或更低的那些；可以通过作为一种广义酸起作用而水解或降解一种酸可切割的连接基团的酶，肽酶(它可以是底物特异性的)，以及磷酸酶。
一种可切割的键基团，例如二硫键可以对pH敏感。人血清的pH是7.4，而平均的细胞内pH稍低，范围为大约7.1-7.3。核内体具有一个更酸的pH，范围在5.5-6.0，并且溶酶体具有一个甚至更酸的pH，在5.0左右。一些连接物将具有可切割的连接基团，这些基团在一个优选的pH处被切割，由此将阳离子脂质从配体释放在细胞内，或释放进入所希望的细胞区室。
连接物可以包括一种可被特定酶切割的可切割连接基团。并入连接物的可切割连接基团的类型可以取决于有待被靶向的细胞。例如肝靶向的配体可以通过一种包括酯基团的连接物而被连接至一种阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，并且因此与不富含酯酶的细胞相比，该连接物将在肝细胞中被更有效地切割。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质以及睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(例如肝细胞与滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的连接物。
总体上，一种候选的可切割连接基团的适合性可以通过测试降解因子(或条件)切割该候选的连接基团的能力来进行评估。还希望的是也测试该候选的可切割连接基团在血液中或当与其他非靶标组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定在一个第一条件与一个第二条件之间进行切割的相对敏感性，其中该第一条件被选择为指示在一个靶标细胞中的切割并且该第二条件被选择为指示在其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的切割。这些评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整个动物中的进一步评估来进行确证。在优选的实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的切割比在血液或血清(或在被选择为模拟细胞外条件的体外条件下)中的切割快至少大约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大约100倍。
氧化还原可切割的连接基团
在一个实施例中，可切割的连接基团是一种氧化还原可切割的连接基团，其在还原或氧化时被切割。还原地可切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定一个候选的可切割连接基团是否是一种适合的“还原地可切割的连接基团”，或者例如是否适合于与一种特定的iRNA部分以及特定的靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或本领域内已知的使用还原剂的试剂进行孵育来对一个候选者进行评估，这模拟了会在细胞(例如靶标细胞)内观察到的切割速率。还可以在被选择为模拟血液或血清条件的条件下对这些候选者进行评估。在一个实施例中，候选化合物在血液中被切割最多大约10％。在其他实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)中的降解快至少大约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大约100倍。可以在被选择为模拟细胞内介质的条件下，使用标准的酶动力学测定来确定候选化合物的切割速率，并且将其与被选择为模拟细胞外介质的条件下的速率相比较。
基于磷酸酯的可切割连接基团
在另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于磷酸酯的可切割的连接基团。基于磷酸酯的可切割的连接基团通过降解或水解该磷酸酯基团的因子而被切割。一种在细胞中切割磷酸酯基团的因子的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一个优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
酸可切割连接基团
在另一个实施例中，可切割连接物包括一种酸可切割的连接基团。酸可切割的连接基团是在酸性条件下被切割的一种连接基团。在优选的实施例中，酸可切割的连接基团在一个具有大约6.5或更低(例如大约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的pH的酸性环境中被切割，或者被多种因子(例如可以作为一种广义酸起作用的酶)切割。在细胞中，具体的低pH细胞器(例如核内体或溶酶体)可以提供一个针对酸可切割的连接基团的切割环境。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可切割的基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。一个优选的实施例是当附接至酯(烷氧基基团)的氧的碳是芳基基团、经取代的烷基基团或叔烷基基团(例如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
基于酯的可切割的连接基团
在另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团通过酶(例如细胞中的酯酶与酰胺酶)而被切割。基于酯的可切割的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基以及亚炔基的酯。酯可切割的连接基团具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
基于肽的可切割的连接基团
在又另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割的连接基团通过酶(例如细胞中的肽酶与蛋白酶)而被切割。基于肽的可切割的连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如二肽、三肽，等等)以及多肽的肽键。基于肽的可切割的基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。该酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的特定类型的酰胺键。该基于肽的切割基团总体上限于在在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割的连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-(SEQ ID NO：13)，其中RA与RB是这两个邻接氨基酸的R基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
传授RNA共轭物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，每一者的全部内容特此通过引用结合于此。
给定化合物中的全部位置不必要一致地经修饰，并且实际上可以在单个化合物中或甚至在iRNA内部的单个核苷处掺入多于一个前述修饰。本发明也包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中，“嵌合的”iRNA化合物或“嵌合体”是以下这样的iRNA化合物，例如，dsRNA，它们包含两个或更多个化学上不同的区域，每者由至少一个单体单元构成，即，在dsRNA化合物的情况下的一种核苷酸。这些iRNA一般含有至少一个区域，其中RNA经修饰，从而赋予iRNA增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取和/或增加的靶核酸结合亲和力。iRNA的另外区域可以充当能够切割RNA：DNA或RNA：RNA杂交分子的酶的底物。举例而言，RNase H是一种切割RNA：DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶的切割，因而大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，可以在使用嵌合dsRNA时，经常用较短的iRNA获得可比较的结果。可以常规地通过凝胶电泳并且如果必要的话联合本领域内已知的核酸杂交技术来检测该RNA靶标的切割。
在某些实例中，iRNA的RNA可以通过非配体基团来进行修饰。一些非配体分子已经被共轭至iRNA以增强该iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类共轭的程序在科学文献中是可得的。此类非配体部分已经包括脂质部分例如胆固醇(库博(Kubo，T.)等人，生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，2007，365(1)：54-61；乐欣格(Letsinger)等人，美国科学院院刊，1989，86：6553)、胆酸(马诺汗(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，1994，4∶1053)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(马诺汗等人，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1992，660：306；马诺汗等人，生物有机化学与医药化学快报，1993，3：2765)、硫代胆固醇(奥博汗瑟(Oberhauser)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，1992，20：533)、脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(赛森-博和马拉(Saison-Behmoaras)等人，EMBO J.，1991，10：111；卡波诺(Kabanov)等人，FEBS Lett.，1990，259：327；斯伍那区克(Svinarchuk)等人，生物化学(Biochimie)，1993，75：49)、磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-O-十六烧基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(马诺汗等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1995，36：3651；舍阿(Shea)等人，核酸研究，1990，18：3777)、聚胺或聚乙烯乙二醇链(马诺汗等人，核苷&核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14：969)，或金刚烷乙酸(马诺汗等人，四面体通讯，1995，36：3651)、棕榈基部分(米莎(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1995，1264：229)，或十八胺或己胺-羰基-羟胆固醇部分(克鲁克(Crooke)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1996，277：923)。教授制备这类RNA共轭物的代表性美国专利已经在上文列出。典型的共轭方案涉及在序列的一个或多个位置具有氨基连接物的RNA的合成。然后使用适当的偶联剂或活化剂使该氨基基团与被共轭的分子进行反应。共轭反应可以用仍与固相支持物结合或在切割RNA后处于溶液相的RNA进行。通过HPLC纯化RNA共轭物一般提供纯的共轭物。
iRNA的递送
可以按许多不同方式实现向有需求的受试者递送iRNA。可以通过向受试者施用包含iRNA(例如dsRNA)的组合物，直接进行体内递送。可选地，可以通过施用编码和指导iRNA表达的一种或多种载体间接地进行递送。这些替代方案在后文进一步论述。
直接递送
通常，递送核酸分子的任何方法可以适应于随iRNA使用(参见例如，阿赫塔尔(Akhtar S.)和朱利安(Julian RL.)(1992)细胞生物学趋势(Trends Cell.Biol.)2(5)：139-144和WO94/02595，所述文献通过引用的方式完整结合在此)。然而，存在认为对体内成功递送iRNA分子重要的三种因素：(a)所递送分子的生物学稳定性，(2)防止非特异性作用，和(3)所递送分子在靶组织中的积累。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入至组织中(作为非限制性例子，肿瘤)或局部施用该试剂，使siRNA的非特异性作用最小化。局部施用至治疗部位使试剂的局部浓度最大化，限制该试剂向全身组织的暴露，所述全身组织否则可能受试剂损害或可能降解该试剂，并且允许较低总剂量的iRNA分子施用。几项研究已经显示在局部施用iRNA时成功敲减基因产物。例如，在食蟹猴中通过玻璃体内注射眼球内递送VEGF dsRNA(托伦蒂诺(Tolentino，MJ.)等人(2004)视网膜(Retina)24：132-138)和在小鼠中视网膜下注射(赖希(Reich，SJ.)等人(2003)分子视觉(Mol.Vis.)9：210-216)眼球内递送VEGFdsRNA均显示在年龄相关性黄斑变性的实验模型中防止血管新生。此外，在小鼠中直接肿瘤内注射dsRNA缩减肿瘤体积(派乐(Pille，J.)等人(2005)分子治疗(Mol.Ther.)11：267-274)并且可以延长带瘤小鼠的存活(金姆(Kim，WJ.)等人(2006)分子治疗14：343-350；李(Li，S.)等人(2007)分子治疗15：515-523)。也已经显示通过直接注射将RNA干扰成功局部递至CNS(多恩(Dorn，G.)等人(2004)核酸(Nucleic Acids)32：e49；谭(Tan，PH.)等人(2005)基因疗法(Gene Ther.)12：59-66；牧村(Makimura，H.)等人(2002)BMC神经科学(BMC Neurosci.)3：18；斯卡拉(Shishkina，GT.)等人(2004)神经科学(Neuroscience)129：521-528；塔克尔(Thakker，ER.)等人(2004)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)101：17270-17275；阿卡亚(Akaneya，Y.)等人(2005)神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)93∶594-602并且通过鼻内施用成功递送至肺(霍华德(Howard，KA.)等人(2006)分子疗法(Mol.Ther.)14：476-484；张(Zhang，X.)等人(2004)生物化学(J.Biol.Chem.)279∶10677-10684；比托卡(Bitko，V.)等人(2005)自然医学(Nat.Med.)11∶50-55)。对于全身性施用iRNA以便治疗疾病，可以将RNA修饰或可替代地使用药物递送系统递送；两种方法均起到防止dsRNA被体内核酸内切酶和外切酶快速降解的作用。
RNA或药用载体的修饰也可以允许iRNA组合物靶向至靶标组织并避免不想要的脱靶效应。iRNA分子可以通过化学共轭至其他基团如在此所述的脂质或碳水化合物基团以进行修饰。此类共轭物可用于将iRNA靶向特定细胞，例如，肝脏细胞(liver cell)，像肝上皮实质细胞(hepatocyte)。例如，GalNAc共轭物或脂质(例如，LNP)配制品可用于将iRNA靶向特定细胞，例如，肝脏细胞，像肝上皮实质细胞。
亲脂性基团如胆固醇以增强细胞摄取并预防降解。例如，将与亲脂性胆固醇部分共轭的针对ApoB的iRNA全身注射至小鼠并且导致肝脏和空肠中apoB mRNA的敲低(索特切克(Soutschek，J.)等人(2004)自然(Nature)432∶173-178)。iRNA与适配体的共轭已经在前列腺癌的小鼠模型中显示抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(麦克纳马拉(McNamara，JO.)等人(2006)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)24∶1005-1015)。在替代性实施例中，可以使用药物递送系统如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许iRNA由细胞高效摄取。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与iRNA结合或被诱导以形成包装siRNA的囊泡或胶束(见例如，金姆(Kim SH.)等人(2008)缓释杂志(Journal ofControlled Release)129(2)：107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身施用时iRNA的降解。用于制造和施用阳离子-iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(见例如，索伦森(Sorensen，DR.)等人(2003)分子化学杂志(J.Mol.Biol)327：761-766；维尔马(Verma，UN.)等人(2003)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)9：1291-1300；阿诺德(Arnold，AS)等人(2007)高血压杂志(J.Hypertens.)25：197-205，所述文献通过引用方式完整结合在此)。用于系统递送iRNA的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(索伦森(Sorensen，DR.)，等人(2003)，同上；维尔马(Verma，UN.)，等人(2003)，同上)、Oligofectamine，“固态核酸脂质颗粒(solid nucleic acid lipid particles)”(齐默尔曼(Zimmermann，TS.)，等人(2006)自然(Nature)441：111-114)、心磷脂(cardiolipin)(钱(Chien，PY.)，等人(2005)癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)12：321-328；帕尔(Pal，A.)，等人(2005)肿瘤学国际杂志(Int J.Oncol.)26：1087-1091)、聚乙烯亚胺(邦内特(BonnetME.)，等人(2008)药物研究(Pharm.Res.)8月16日，Aug 16先于印刷版的电子公开；艾格纳(Aigner，A.)(2006)生物医药与生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(刘(Liu，S.)(2006)分子药物学(Mol.Pharm.)3：472-487)、以及聚酰胺(托马利亚(Tomalia，DA.)，等人(2007)生化学会会报(Biochem.Soc.Trans.)35：61-67；姚(Yoo，H.)，等人(1999)药物研究(Pharm.Res.)16：1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身性施用的复合物。用于施用iRNA和环糊精的药物组合物的方法可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用方式完整地结合在此。
载体编码的iRNA
在另一个方面，靶向ALAS1基因的iRNA可以从插入DNA或RNA载体中的转录单位表达(见，例如，卡秋尔(Couture，A)等人，TIG.(1996)，12：5-10；思科勒尔(Skillern，A.)等人，国际PCT公开号WO 00/22113，卡雷德(Conrad)，国际PCT公开号WO 00/22114，和卡雷德(Conrad)，美国专利号6,054,299)。取决于使用的具体构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持续的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。转基因也可以如此构建以允许它作为染色体外质粒遗传(加斯曼(Gassmann)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1995)92：1292)。
iRNA的单条链或多条链可以从表达载体上的启动子转录。在两条单独的链待表达以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独表达载体共引入(例如，通过转染或感染)靶标细胞中。可替代地，dsRNA的每条单独链可以由均位于相同表达质粒上的启动子转录。在一个实施例中，dsRNA表达为被一种连接物多核苷酸序列连接的反向重复，由此该dsRNA具有茎环结构。
iRNA表达载体典型地是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞，例如，与脊椎动物细胞相容的表达载体，可以用来产生表达如本文所述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域熟知的并且从许多商业来源可获得。典型地，此类载体含有用于插入所需核酸区段的便利限制性位点。表达iRNA的载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用至从患者移植出来、随后重新引入患者的靶细胞或通过允许向所希望的靶细胞引入的任何其他手段。
可以将iRNA表达质粒作为与阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如，Transit-TKOTM)的复合物转染至靶标细胞中。本发明也构思了在一周或更长时间范围内用于iRNA介导的靶向靶RNA不同区域的敲减的多次脂质转染。成功地将载体引入宿主细胞可以使用多种已知的方法来监测。例如瞬时转染可以使用一种报告物来进行信号化，例如荧光标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。稳定的对离体细胞的转染可以使用以下这样的标记来进行确保：这些标记为被转染的细胞提供了对特定环境因子(例如抗生素或药物)的抗性，例如潮霉素B抗性。
可以随本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺联病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小RNA病毒载体；(i)痘病毒载体如正痘病毒，例如，痘苗病毒载体或禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒；和(j)辅助病毒依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体将并入或将不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包含病毒序列以用于转染。可替代地，构建体可以并入能够发生附加型复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。用于重组表达iRNA的构建体通常将需要调节元件，例如，启动子、增强子等，以确保iRNA在靶标细胞中的表达。下文进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。
可用于递送iRNA的载体将包括足以在所需靶细胞或组织中表达iRNA的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件以提供组成型或调节/诱导型表达。
可以精确地调节iRNA的表达，例如，通过使用对某些生理调节剂(例如，循环型葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调节序列(多赫替(Docherty)等人，1994，FASEB J.8：20-24)。适合于在细胞中或哺乳动物中控制dsRNA表达的此类可诱导的表达系统包括，例如，由以下项进行的调节：蜕皮激素、雌激素、黄体酮、四环素、二聚作用的化学诱导物、以及异丙基-β-D1-硫代半乳糖苷(IPTG)。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途选择适宜的调节/启动子序列。
在一个具体实施例中，可以使用含有编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(见米勒(Miller)等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有对于病毒基因组正确包装并整合入宿主细胞DNA必需的组件。将编码iRNA的核酸序列克隆至促进该核酸递送入患者的一种或多种载体中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在例如博恩(Boesen)等人，生物疗法(Biotherapy)6：291-302(1994)找到，所述文献描述使用逆转录病毒载体递送mdrl基因至造血干细胞，以便使得干细胞对化疗更耐受。说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的其他参考文献是：克洛斯(Clowes)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)93：644-651(1994)；凯恩(Kiem)等人，血液(Blood)83：1467-1473(1994)；萨尔蒙斯(Salmons)和古兹伯格(Gunzberg)，人类基因疗法(Human Gene Therapy)4：129-141(1993)；以及格罗斯曼(Grossman)和威尔逊(Wilson)，遗传发育新见(Curr.Opin.in Genetics and Devel.)3：110-114(1993)。构思使用的慢病毒载体例如包括基于HIV的载体，这些载体在美国专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276中描述，所述专利通过引用方式结合在此。
也构思腺病毒用于iRNA的递送。腺病毒是特别有吸引力的媒介物，例如，用于递送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染不分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，遗传与发育现行观点(Current Opinion in Geneticsand Development)3：499-503(1993))提供了腺病毒基因治疗的综述。布特(Bout)等人，人类基因疗法(Human Gene Therapy)5：3-10(1994)展示了腺病毒载体转移基因至恒河猴猴呼吸道上皮的用途。基因治疗中使用腺病毒的其他例子可以在罗森菲尔(Rosenfeld)等人，科学(Science)252：431-434(1991)；罗森菲尔(Rosenfeld)等人，细胞(Cell)68：143-155(1992)；玛莎格力(Mastrangeli)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)91：225-234(1993)；PCT公开WO 94/12649；和王(Wang)等人，基因疗法(Gene Therapy)2：775-783(1995)中找到。用于表达本发明中表征的iRNA的合适AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶标细胞中的方法在夏(Xia H)等人，(2002)，自然生物技术(Nat.Biotech.)20：1006-1010中描述。
也构思使用腺联病毒(AAV)载体(沃尔什(Walsh)等人，美国实验生物学和医学学会学报(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)204：289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，iRNA可以从具有例如U6或H1RNA启动子或细胞巨化病毒(CMV)启动子的重组AAV载体作为两个单独的互补性单链RNA分子表达。用于表达本发明中表征的dsRNA的合适AAV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶标细胞中的方法在萨穆尔斯基(Samulski R)等人(1987)、病毒学杂志(J.Virol.)61：3096-3101；费希尔(Fisher KJ)等人(1996)、病毒学杂志(J.Virol.)，70：520-532；萨穆尔斯基(Samulski R)等人(1989)、病毒学杂志(J.Virol.)63：3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；和国际专利申请号WO 93/24641中描述，所述文献的完整内容通过引用方式并入本文
另一种典型的病毒载体是痘病毒如痘苗病毒病毒，例如减毒痘苗病毒如修饰的安卡拉病毒(MVA)或NYVAC、禽痘病毒如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。
病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原来对这些载体假型化而进行修饰，或者适当时通过取代不同的病毒衣壳蛋白而进行修饰。例如慢病毒载体可以是用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白进行假病毒化。可以通过将载体工程化以表达不同血清型的衣壳蛋白，使得AAV载体靶向不同的细胞；见，例如，拉比诺维茨(Rabinowitz J E)等人，(2002)，病毒学杂志(J.Virol.)76：791-801，所述文献的完整内容通过引用方式结合在此。
载体的药物制剂可以包括在一种可接受的稀释剂中的该载体，或者可以包括一种缓释基质，该基因递送媒介物被嵌入其中。可替代地，当该完全的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产出的情况下，该药物制剂可以包括产出该基因递送系统的一个或多个细胞。
III.含有iRNA的药物组合物
在一个实施例中，本发明提供了包含如在此所描述的iRNA以及一种药学上可接受的载体的药物组合物。包含该iRNA的药物组合物对于治疗与ALAS1基因表达或活性相关的疾病或失调(例如，涉及卟啉途径的失调)而言是有用的。此类药物组合物基于递送模式而进行配制。例如，可以经配制以便通过肠胃外递送，例如，通过静脉内(IV)递送来全身性施用的组合物。在一些实施例中，在此提供的组合物(例如，LNP配制品)被配制以用于静脉内递送。在一些实施例中，在此提供的组合物(例如，包含GalNAc共轭物的组合物)被配制以用于皮下递送。
在此表征的药物组合物以足以抑制ALAS1基因表达的剂量给予。通常，iRNA的适合剂量处于每日受体每千克体重0.01毫至200.0毫克范围内，通常处于每日受体每千克体重1至50mg范围内。例如，dsRNA可以按每单剂量0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg施用。可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该iRNA在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚-剂量，或者甚至可以通过控释制剂使用连续输注或递送而给予。在这种情况下，每个亚-剂量中所含的iRNA必须相应地更少，以便实现每日总剂量。也可以将剂量单位复配用于在几天内递送，例如使用在几天时间范围内提供持久iRNA释放的常规持续释放配制品。持续释放配制品在本领域内是熟知的并且对于在特定部位递送试剂是特别有用的，由此可以与本发明的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相应的多个每日剂量。
单一剂量对ALAS1水平的影响可以长久持续，从而后续剂量以不多于3、4或5天的间距或以不多于1、2、3或4周的间距施用。
本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括(但不局限于)疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗一个受试者可以包括单一治疗或者一系列治疗。如本文中他处描述，使用常规方法或基于使用适宜动物模型的体内测试，可以估计本发明涵盖的各个iRNA的有效剂量和体内半寿期。
小鼠遗传学的进展已经产生了用于不同人类疾病研究的大量小鼠模型，例如与ALAS1表达相关的病理过程(例如，涉及卟啉或卟啉途径缺陷的病理过程，例如，像卟啉症)。这类模型可以用于iRNA的体内测试，以及用于确定治疗有效剂量和/或有效剂量方案。
适合的小鼠模型例如是含有表达人ALAS1的转基因的小鼠。具有敲入突变(例如，与人类中的急性肝性卟啉症相关联的突变)的小鼠可以用于确定治疗有效剂量和/或ALAS1siRNA给予的持续时间。本发明还包括了包含在本发明中表征的iRNA化合物的药物组合物和配制品。取决于希望局部还是系统性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(例如，通过透皮贴剂)；肺的；例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；真皮下的，例如，经由植入性器械；或颅内的，例如实质内的、鞘内的或心室内的给予。
iRNA可以按这样的方式递送以靶向特定组织，如产生红细胞的组织。例如，iRNA可以被递送至骨髓、肝脏(例如，肝脏肝细胞)、淋巴结、脾、肺(例如，肺胸膜)或脊椎。在一个实施例中，iRNA被递送至骨髓。
用于局部给予的药物组合物以及配制品可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等等可以是必要的或希望的。包衣的避孕套、手套等等也可以是有用的。适合的局部用配制品包括其中本发明中表征的iRNA与局部用递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。适合的脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子脂质和脂质体(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明中表征的iRNA可以封装于脂质体内部或可以与其、尤其与阳离子脂质体形成复合物。可选地，iRNA可以与脂质、尤其与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸与酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或C1-20烷基酯(例如，异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部用配制品在美国专利号6,747,014中详细描述，所述专利通过引用方式结合在此。
脂质体配制品
除了已经被研究过并且用于药物的配制的微乳剂之外，还存在许多有组织的表面活性剂结构。这些包括单分子层、微粒、双分子层以及囊泡。囊泡(比如脂质体)由于其特异性以及它们从药物递送方面所提供的作用持续时间而引起人们很大兴趣。如在本发明中所使用的，术语“脂质体”意为一种由以球形双分子层或双分子层排列的两亲性分子脂质构成的囊泡。
脂质体是单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。该水性部分包含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够融合至细胞壁的优势。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与细胞壁融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取。
为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适合透皮梯度的影响下通过一系列细孔，每个细孔具有小于50nm的直径。因此，希望的是使用高度可变形并且能够穿过这些细孔的脂质体。
脂质体的其他优点包括；从天然磷脂获得的脂质体是生物相容和生物可降解的；脂质体可以并入广泛类型的水溶性和脂溶性药物；脂质体可以在其内部区室中保护封装的药物免受代谢和降解(洛索夫(Rosoff)，药用剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，里格尔(Rieger)和班克(Banker)(编著)、1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，N.Y.，第1卷，第245页)。在制备脂质体配制品方面的重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及这些脂质体的水性体积。
脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用位点是有用的。因为脂质体膜在结构上类似于生物膜，所以当脂质体被应用至一个组织时，这些脂质体开始与这些细胞膜合并，并且随着脂质体的合并和细胞进程，这些脂质体的内容物被排空进入该细胞，在这里活性剂可以起作用。
脂质体配制品已经作为许多药品的递送的模型成为广泛研究的焦点。越来越多的证据表明，对于局部给予而言，脂质体呈现超出其他制剂的一些优势。这些优势包括：减少的与所给予药物的高系统性吸收相关的副作用、在希望的靶标处所给予药物的增加的积累、以及将广泛种类的药物(亲水的与疏水的两者)给予进入皮肤的能力。
一些报告已经详述了脂质体递送试剂(包括高分子量的DNA)进入皮肤的能力。已经将包括镇痛药、抗体、激素以及高分子量DNA的化合物给予至皮肤。大多数的应用导致靶向上表皮
脂质体有两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的DNA分子相互作用而形成一种稳定的复合体。该带正电荷的DNA/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化在内涵体中。由于内涵体内部的酸性pH，脂质体破裂，释放它们的内容物至细胞胞质中(王(Wang)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，1987，147，980-985)。
pH敏感的或带负电荷的脂质体捕获DNA而不是与其形成复合体。由于该DNA与该脂质是带类似的电荷，所以形成排斥而不是复合。然而，一些DNA包埋于这些脂质体的含水内部。pH-敏感脂质体已经用来递送编码胸苷激酶基因的DNA至培养的细胞单层。在靶标细胞内检测到外源基因的表达(周(Zhou)等人，控释杂志(Journal of Controlled Release)，1992，19，269-274)。
脂质体组合物的一个主要类型包括磷脂而不是天然衍生的磷脂酰胆碱。例如中性脂质体组合物可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。阴离子脂质体组合物通常可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，而阴离子融合脂质体主要形成自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。另一类型的脂质体组合物形成自磷脂酰胆碱(PC)，例如像大豆PC，蛋PC。另一个类型形成自磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物。
一些研究已经评价了脂质体药物制剂至皮肤的局部递送。将包含干扰素的脂质体应用至天竺鼠皮肤导致皮肤疱疹溃疡的减少，而通过其他手段的干扰素递送(例如，作为溶液或作为乳剂)是无效的(维纳(Weiner)等人，药物靶向杂志(Journal of DrugTargeting)，1992，2，405-410)。此外，另外的研究测试了作为脂质体配制品的一部分而给予的干扰素与使用水性系统而给予的干扰素的疗效，并且总结出该脂质体制剂优于水性给予(杜普利斯(du Plessis)等人，抗病毒研究(Antiviral Research)，1992，18，259-265)。
非离子型脂质体系统也已经得以检验以确定它们在递送药物至皮肤方面的实用性，特别是包括非离子型表面活性剂以及胆固醇的系统。包括NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将环孢霉素A递送入小鼠皮肤的真皮。结果表明此类非离子型脂质体系统在促进环孢霉素A沉积进入皮肤的不同层之内方面是有效的(胡(Hu)等人，S.T.P.药物科学(S.T.P.Pharma.Sci.)，1994，4，6，466)。
脂质体还包括“立体化学稳定的”脂质体，这个术语如在此使用的指包括一种或多种专门化脂质的脂质体，当并入脂质体中时这些脂质导致相对于缺少此类专门化脂质的脂质体而言的增加的循环寿命。立体化学稳定的脂质体的实例是以下那些：在其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分中的一部分(A)包括一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷酯GM1，或者(B)是用一种或多种亲水聚合物衍生，例如聚乙二醇(PEG)部分。虽然不希望受任何具体理论束缚，但是本领域认为，至少对于包含神经节苷酯、鞘磷脂或PEG-衍生脂质的立体化学稳定的脂质体而言，这些立体化学稳定的脂质体的增加的循环半寿期是由于进入网状内皮系统(RES)细胞的减少的摄取(阿勒(Allen)等人，FEBS Letters，1987，223，42；吴(Wu)等人，癌症研究(Cancer Research)，1993，53，3765)。
包括一种或多种糖脂的不同脂质体在本领域内是已知的。帕帕哈都久珀罗斯(Papahadjopoulos)等人(纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.，1987，507，64))报道了单唾液酸神经节苷酯GM1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半寿期的能力。这些研究结果由加布吉(Gabizon)等人(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，1988，85，6949)阐释。均为艾伦(Allen)等人的美国专利号4,837,028和WO88/04924披露了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷脂的脂质体。美国专利号5,543,152(韦伯(Webb)等人)披露了包含鞘磷脂的脂质体。包含1，2-sn-二肉豆蔻磷脂酰胆碱的脂质体在WO 97/13499(利姆(Lim)等人)中披露。
含有由一种或多种亲水性聚合物衍生化的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。熊本(Sunamoto)等人(日本化学学会公报(Bull.Chem.Soc.Jpn.)，1980，53，2778)描述包含非离子去垢剂2C1215G的脂质体，所述脂质体含有PEG部分。伊录姆(Illum)等人(FEBS Lett.，1984，167，79)报道了用聚合物二醇对聚苯乙烯颗粒的亲水包覆导致显著增长的血液半寿期。通过附接聚二醇(例如，PEG)的羧基所修饰的合成磷脂由Sears描述(美国专利号4,426,330和4,534,899)。克利巴诺夫(Klibanov)等人(FEBS Lett.，1990，268，235)描述了展示以下的实验：包含用PEG或PEG硬脂酸酯衍生化的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体具有显著增加的血液循环半寿期。布鲁姆(Blume)等人(生物化学与生物物理学学报(Biochimica et Biophysica Acta)，1990，1029，91)将这类观察结果扩展至其他PEG衍生化的磷脂，例如，由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的组合形成的DSPE-PEG。授予Fisher的欧洲专利号EP 0445131B1和WO 90/04384中描述了在它们的外表面上具有共价结合的PEG部分的脂质体。含有1摩尔％-20摩尔％用PEG衍生化的PE的脂质体组合物及其使用方法由Woodle等人(美国专利号5,013,556和5,356,633)和马丁(Martin)等人(美国专利号5,213,804和欧洲专利号EP0496813B1)描述。包含许多其他脂质聚合共轭物的脂质体在WO9I/05545和美国专利号5,225,212(均授予马丁(Martin)等人)中和在WO 94/20073(Zalipsky等人)中公开包括PEG修饰的神经酰胺脂质的脂质体描述于WO 96/10391(佐伊(Choi)等人)中。美国专利号5,540,935(宫崎(Miyazaki)等人)以及美国专利号5,556,948(田川(Tagawa)等人)描述了包含PEG的脂质体，它们可以进一步被官能部分在其表面进行衍生化。
一些包括核酸的脂质体在本领域内是已知的。授予蒂埃里(Thierry)等人的WO96/40062公开了在脂质体中封装高分子量核酸的方法。授予田川(Tagawa)等人的美国专利号5,264,221公开了结合蛋白质的脂质体并且声称这类脂质体的内容物可以包含dsRNA。授予拉赫曼(Rahman)等人的美国专利号5,665,710描述在脂质体中封装寡脱氧核苷酸的某些方法。授予洛夫(Love)等人的WO 97/04787公开了包含靶向raf基因的dsRNA的脂质体。
传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集物，它们是用于药物递送媒介物的引人注目的候选者。传递体可以描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体能适应在其中使用它们的环境，例如它们是自优化性的(能适应皮肤中孔的形状)、自我修复性的、频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。为了制备传递体，可能的是将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加至一种标准的脂质体组合物。传递体已经被用于递送血清白蛋白至皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已经显示与包含血清白蛋白的溶液的皮下注射同样有效。
表面活性剂在配制品(例如乳剂(包括微乳剂)以及脂质体)中有广泛应用。对许多不同类型的表面活性剂(天然的与合成的)的特性进行分类与评级的最普通的方法是通过亲水/亲油平衡值(HLB)的使用。亲水基团(也称作“头”)的性质提供了用于对在配制品中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的手段(列赫尔(Rieger)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，1988，285页)。
如果该表面活性剂分子没有离子化，它被分类为一种非离子型表面活性剂。发现非离子型表面活性剂在药物与化妆品产品方面有广泛应用并且能够在广泛的pH范围使用。总体上，取决于它们的结构，它们的HLB值范围为从2至大约18。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子型烷醇酰胺以及醚(例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧化物(例如皂)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯(例如烷基硫酸酯以及乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯以及磺基琥珀酸酯)、以及磷酸酯。该阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯以及皂类。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐以及乙氧基化胺。这些季铵盐是这一类别的最常用的成员。
如果该表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。
已经综述了表面活性剂在药品、配制品和在乳剂中的用途(列赫尔(Rieger)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，1988，285页)。
核酸脂质颗粒
在一个实施例中，本发明表征的ALAS1 dsRNA被完全包囊在脂质配制品中，从而例如形成一种SPLP、pSPLP、SNALP或其他核酸-脂质颗粒。如在此使用的，术语“SNALP”指一种稳定的核酸-脂质颗粒，包括SPLP。如在此使用的，术语“SPLP”指一种核酸-脂质颗粒，其包括包囊在脂质囊泡中的质粒DNA。SNALP与SPLP典型地包含一种阳离子脂质、一种非阳离子脂质以及一种阻止该颗粒聚集的脂质(例如一种PEG-脂质共轭物)。SNALP与SPLP对于合成应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端位点积累(例如在与给予位点物理分开的位点)。SPLP包括“pSPLP”，pSPLP包括一种包囊化的缩合剂-核酸复合体，如在PCT公开号WO 00/03683中所提出的。本发明的颗粒典型地具有大约50nm至大约150nm，更典型地是大约60nm至大约130nm，更典型地是大约70nm至大约110nm，最典型地是大约70nm至大约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。另外，当出现在本发明的核酸-脂质颗粒中时，这些核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒和它们制备方法在例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；和PCT公开号WO 96/40964中公开。
在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如脂质与dsRNA的比率)将处于从大约1∶1至大约50∶1，从大约1∶1至大约25∶1，从大约3∶1至大约15∶1，从大约4∶1至大约10∶1，从大约5∶1至大约9∶1，或大约6∶1至大约9∶1的范围内。
阳离子脂质可以是例如，N，N-二油烯基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、1，2-二亚油基氧基(DiLinoleyloxy)-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚麻基氧基(Dilinolenyloxy)-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1，2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油基酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油基酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油基酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N，N-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油烯基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油基氧代-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八-9，12-二烯)四氢-3aH-环戊[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七-6，9，28，31-四-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基月桂基)氨基)乙基)(2-羟基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(Tech G1)，或其混合物。该阳离子脂质可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约20mol％至大约50mol％或大约40mol％。
在另一个实施例中，化合物2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环可以用来制备脂质-siRNA纳米颗粒。2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107，998中，将其通过引用结合于此。
在一个实施例中，该脂质-siRNA颗粒包括40％2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环：10％DSPC：40％胆固醇：10％PEG-C-DOMG(摩尔百分数)，颗粒尺寸在63.0±20nm，并且具有0.027siRNA/脂质比率。
非阳离子脂质可以是一种阴离子脂质或一种中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷酸卵磷酯(DSPC)、二油酰基磷酸卵磷酯(DOPC)、二棕榈酰磷酸卵磷酯(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷酸卵磷酯(POPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇，或其混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约5mol％至大约90mol％，大约10mol％，或大约58mol％。
抑制颗粒聚集的共轭脂质可以是例如一种聚乙二醇(PEG)-脂质，其包括但不限于PEG-PEG-(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)，或其混合物。PEG-DAA共轭物可以例如是PEG-二月桂基氧丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧丙基(C]8)。防止颗粒聚集的共轭脂质可以占从0mol％至约20mol％或约2mol％在颗粒中存在的总脂质。
在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，该胆固醇例如占该颗粒中存在的总脂质的大约10mol％到大约60mol％或大约48mol％。
在一些实施例中，该iRNA被配制成一种脂质纳米颗粒(LNP)。
LNP0l
在一个实施例中，脂质ND98.4HCl(MW 1487)(见2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，所述文献通过引用的方式结合在此)、胆固醇(Sigma-Aldrich)和PEG-脑苷脂C16(Avanti极性脂质)可以用来制备脂质-dsRNA纳米颗粒(例如，LNP01颗粒)。可以如下制备每种组分在乙醇中的母液：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml，PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16母液可以随后以例如42∶48∶10摩尔比合并。合并的脂质溶液可以与(例如pH 5乙酸钠中的)含水dsRNA混合，从而乙醇终浓度是约35％-45％并且乙酸钠终浓度是约100-300mM。一旦混合，脂质-dsRNA纳米颗粒一般自发形成。取决于所需的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，如Lipex挤出机(北部脂质公司(NorthernLipids，Inc))，经聚碳酸酯膜(例如100nm截值)挤出所产生的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切线流过滤实现乙醇移除和同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如约pH 7，例如约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3或约pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)交换。
Figure BDA0001787260730001211
LNP01配制品例如在国际申请公开号WO 2008/042973中描述，将其通过引用结合在此。
另外的示例性脂质-dsRNA制剂提供于下表中。
表10：示例性脂质配制品
Figure BDA0001787260730001212
Figure BDA0001787260730001221
Figure BDA0001787260730001231
DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-双二肉豆蔻酰甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG，或PEG-C18)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-cDMA：PEG-氨甲酰基-1，2-二肉豆蔻基氧丙胺(平均分子量为2000的PEG)
包含SNALP(1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的制剂描述于2009年4与15日提交的国际公开号WO 2009/127060中，通过引用将其结合于此。
包括XTC的配制品描述于例如以下各项中：2009年1月29日提交的美国临时序列号61/148,366；2009年3月2日提交的美国临时序列号61/156,851；2009年6月10日提交的美国临时序列号；2009年7月24日提交的美国临时序列号61/228,373；2009年9月3日提交的美国临时序列号61/239,686，以及2010年1月29日提交的国际申请号PCT/US 2010/022614，将其通过引用特此结合。
包括MC3的配制品描述于例如以下各项中：2009年9月22日提交的美国临时序列号61/244,834，2009年6月10日提交的美国临时序列号61/185,800，以及2010年6月10日提交的国际申请号PCT/US 10/28224，将其通过引用特此结合。
包括ALNY-100的配制品描述于例如以下中：2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT/US 09/63933，将其通过引用特此结合。
包括C12-200的配制品描述于例如以下各项中：2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770以及2010年5月5日提交的国际申请号PCT/US 10/33777，将其通过引用特此结合。
阳离子脂质的合成
在本发明中表征的核酸颗粒中使用的任何化合物，例如，阳离子脂质等可以通过已知的有机合成技术(包括在实例中更详细描述的方法)制备。除非另外指明，否则全部取代基如下文定义。
“烷基”意味着一种直链或支链的、非环的或环的饱和脂肪族烃，包含从1至24个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、等；而不饱和环状烷基包括环丙烯基和环己烯基等。
“烯基”意味着如上定义的一种烷基，该烷基在相邻碳原子之间包含至少一个双键。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”意味着如上定义的任何烷烃或烯基，其另外包含在相邻碳之间的至少一个三键。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酰基”是指任何烷基，烯基或炔基，其中，在连接点的碳被氧代基团取代，如下所定义。例如-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基是酰基。
“杂环”意味着一个5-至7-元单环、或7-至10-元二环的杂环，它是饱和的、不饱和的或芳香族的，并且它包含独立地选自氮、氧、和硫的从1或2个杂原子，并且其中该氮和硫杂原子可以是任选地氧化的，并且该氮杂原子可以任选地是季铵化的，包括双环，其中上述杂环的任一个被稠合至一个苯环。该杂环可通过任何杂原子或碳原子而附接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酸胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
术语“任选取代的烷基”，“任选取代的烯基”，“任选取代的炔基”，“任选取代的酰基”和“任选被取代的杂环”是指，当取代时，至少一个氢原子被一个取代基置换。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个氢原子被置换。就这一点而言，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，Rx和Ry是相同或不同的并且独立地是氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基中的每一个可以进一步地被一个或多个氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy取代。
“卤素”是指氟、氯、溴、以及碘。
在一些实施例中，本发明中表征的方法可以需要使用保护基。保护基方法学是本领域技术人员熟知的(见例如，有机合成中的保护基(Protective Groups in OrganicSynthesis)，格林(Green，T.W.)等人，威利国际科学出版社(Wiley-Interscience)，纽约城(New YorkCity)，1999)。简言之，本发明上下文中的保护基是降低或消除不希望的官能团反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团以掩蔽其在某些反应过程中的反应性并且随后将其移除以暴露原始官能团。在一些实施例中，使用“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除不希望的醇官能团反应性的任何基团。保护基团可以使用本领域中公知的技术添加和去除。
式A的合成
在一个实施例中，使用式A的阳离子脂质配制本发明中表征的核酸-脂质颗粒：
Figure BDA0001787260730001261
其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以一起形成任选取代的杂环。在一些实施例中，阳离子脂质是XTC(2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环)。通常，可以通过以下反应方案1或2产生以上式A的脂质，其中除非另外指明，否则全部取代基如上文定义。
方案1
Figure BDA0001787260730001271
根据方案1制备脂质A，其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以一起形成任选取代的杂环。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备酮1和溴化物2。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式A的脂质。式A的脂质可以用式5的有机盐转化成相应的铵盐，其中X是选自卤素、氢氧化物、磷酸根、硫酸根等的阴离子反离子。
方案2
Figure BDA0001787260730001272
可选地，可以根据方案2制备酮1原料。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备格氏(Grignard)试剂6和氰化物7。6和7的反应产生酮1。如方案1中所述，酮1转化成式A的相应脂质。
MC3的合成
如下制备DLin-M-C3-DMA(即，(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-醇(0.53g)，4-N，N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N，N-二甲氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将该溶液用稀盐酸洗涤，随后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机部分在无水硫酸镁上干燥，过滤并且在旋转蒸发器上移除溶剂。使用1％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度，使残余物通过硅胶柱(20g)。合并含有纯化产物的级分并且移除溶剂，产生无色油(0.54g)。
ALNY-100的合成
使用以下方案3进行缩酮519[ALNY-100]的合成：
Figure BDA0001787260730001281
515的合成：
在0℃在氮气氛下向双颈RBF(1L)中的LiAlH4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水THF中的搅拌悬浮液缓慢添加514(10g，0.04926mol)在70mLTHF中的溶液。在完成添加后，将反应混合物加温至室温并且随后加热至回流持续4小时。通过TLC监测反应的进程。在完成反应(借助TLC检测)后，将混合物冷却至0℃并且通过小心添加饱和Na2SO4溶液淬灭。将反应混合物在室温搅拌4小时并滤出。将残余物用THF充分洗涤。将滤液和洗涤液混合并用400mL二噁烷和26mL浓HCl稀释并且在室温搅拌20分钟。在真空下剥离挥发物以提供作为白色固体的515盐酸盐。产量：7.12g 1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ＝9.34(宽，2H)，5.68(s，2H)，3.74(m，1H)，2.66-2.60(m，2H)，2.50-2.45(m，5H)。
516的合成：
向250mL双颈RBF中化合物515在100mL无水DCM中的搅拌悬液添加NEt3(37.2mL，0.2669mol)并在氮气氛下冷却至0℃。在缓慢添加在50mL无水DCM中的N-(苄氧羰氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，允许反应混合物加温到室温。在反应结束(通过TLC检测2-3小时)后，将混合物用1N HCl溶液(1x 100mL)和饱和NaHCO3溶液(1x 50mL)依次洗涤。随后在无水Na2SO4上干燥有机层并且蒸发溶剂以产生粗制材料，所述粗制材料通过硅胶柱层析纯化以获得作为粘性物质的516。产量：11g(89％)。1H-NMR(CDC13，400MHz)：δ＝7.36-7.27(m，5H)，5.69(s，2H)，5.12(s，2H)，4.96(br.，1H)2.74(s，3H)，2.60(m，2H)，2.30-2.25(m，2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94％)。
517A和517B的合成：
将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于单颈500mLRBF中的220mL丙酮和水(10：1)的溶液内，并且在室温向其中添加N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，随后添加叔-丁醇中的4.2mL7.6％OsO4溶液(0.275g，0.00108mol)。在反应结束(约3小时)后，将混合物通过添加固体Na2SO3淬灭并且将所产生的混合物在室温搅拌1.5小时。将反应混合物用DCM(300mL)稀释并且用水(2x 100mL)洗涤，随后用饱和NaHCO3(1x 50mL)溶液、水(1x 30mL)并最终用盐水(1x 50mL)洗涤。在无水Na2SO4上干燥有机相并且在真空中移除溶剂。粗制材料的硅胶柱层析纯化提供了非对映异构体的混合物，所述非对映异构体由制备型HPLC分离。产量：-6g粗制物
517A-峰-1(白色固体)，5.13g(96％)。1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ＝7.39-7.31(m，5H)，5.04(s，2H)，4.78-4.73(m，1H)，4.48-4.47(d，2H)，3.94-3.93(m，2H)，2.71(s，3H)，1.72-1.67(m，4H)。LC-MS-[M+H]-266.3，[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86％。通过X射线证实立体化学。
518的合成：
使用与被描述用于合成化合物505的方法类似的方法，获得作为无色油的化合物518(1.2g，41％)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝7.35-7.33(m，4H)，7.30-7.27(m，1H)，5.37-5.27(m，8H)，5.12(s，2H)，4.75(m，1H)，4.58-4.57(m，2H)，2.78-2.74(m，7H)，2.06-2.00(m，8H)，1.96-1.91(m，2H)，1.62(m，4H)，1.48(m，2H)，1.37-1.25(br m，36H)，0.87(m，6H)HPLC-98.65％。
用于合成化合物519的一般方法：
将化合物518(1eq)在己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加至LAH在THF(1M，2当量)中的冰冷溶液中。在完成添加后，将混合物在40℃加热0.5小时，随后在冰浴上再次冷却。将混合物用饱和Na2SO4水溶液小心地水解，随后经塞里滤料(celite)过滤并缩减成油。柱层析提供作为无色油获得的纯519(1.3g，68％)。13CNMR＝130.2，130.1(x2)，127.9(x3)，112.3，79.3，64.4，44.7，38.3，35.4，31.5，29.9(x2)，29.7，29.6(x2)，29.5(x3)，29.3(x2)，27.2(x3)，25.6，24.5，23.3，226，14.1；Electrospray MS(+ve)：对于C44H80NO2(M+H)+的分子量，计算值是654.6，发现值是654.6。
通过标准或非挤出方法制备的配制品可以按类似的方式来表征。例如配制品典型地通过视觉检查来进行表征。它们应该是发白的半透明溶液，无聚集物或沉淀。脂质纳米颗粒的颗粒尺寸与颗粒尺寸分布可以使用例如马尔文(Malvern)Zetasizer Nano ZS(马尔文公司(Malvern)，USA)通过光散射来进行测量。颗粒应该是大约20-300nm，例如40-100nm尺寸。颗粒尺寸分布应该是单峰。配制品中的总dsRNA浓度以及捕获的部分是使用染料排除测定来评估。配制的dsRNA的样品可以与RNA结合染料如Ribogreen(分子探针公司(MolecularProbes))在配制品破坏性表面活性剂(例如0.5％Triton-X100)存在或不存在下孵育。配制品中的总dsRNA可以相对于标准曲线，通过来自含有表面活性剂的样品的信号来确定。该捕获的部分是通过将“游离”dsRNA内含物(如通过在表面活性剂不存在下的信号所测量的)从该总dsRNA内含物中减去来确定。封装的dsRNA的百分比典型地大于85％。对于SNALP配制品而言，颗粒尺寸是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。合适的范围典型地是大约至少50nm至大约至少110nm、大约至少60nm至大约至少100nm、或大约至少80nm至大约至少90nm。
用于口服给予的组合物与配制品包括粉末或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是希望的。在一些实施例中，口服配制品是以下那些：在其中本发明所表征的dsRNA与一种或多种增渗剂表面活性剂以及螯合剂结合地给予。合适的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。合适的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)以及乌索脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘油胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24，25-二氢-梭链孢酸钠以及甘油二氢梭链孢酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、一种酰基肉毒碱、一种酰基胆碱、或一种甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。在一些实施例中，渗透增强剂的组合(例如脂肪酸/盐)是与胆汁酸/盐组合使用。一个示例性的组合是月桂酸、羊蜡酸以及UDCA的钠盐。另外的渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基酯、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明表征的dsRNA可以口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的颗粒剂的形式递送，或者复合形成颗粒或纳米颗粒。dsRNA复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生化聚亚胺、短梗霉多糖、纤维素和淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如p-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-异丁烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白与DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻朊酸盐、以及聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服配制品及其制备在美国专利6,887,906、美国公开号20030027780和美国专利号6,747,014中详述，各自通过引用结合在此。
用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内给药的组合物和配制品可以包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于：增渗剂、载体化合物及其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体配制品。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。
本发明中表征的药物配制品(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些配制品是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。
本发明中表征的组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型比如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。这些组合物还可以被配制为在水性或非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
另外的配制品
乳剂
本发明的组合物可以被制备或配制为乳剂。乳剂典型地是一种液体以液滴形式(通常直径超过0.1μm)分散在另一种中的非均匀系统(参见，例如，安塞尔药物剂型和药物递送系统(Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；布洛克(Block)于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷2，335页；希古契(Higuchi)等人，于雷明顿氏药物科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)中，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton，Pa.)，1985，301页)。乳剂通常是双相的系统，其包含互不混溶的两个彼此紧密混合并分散的液相。通常，乳剂可以为油包水(w/o)或水包油(o/w)两种。当水相作为微小液滴细碎并分散到本体油相中时，所产生的组合物被称为油包水(w/o)乳剂。可替代地，当油相作为微小液滴细碎并分散到本体水相中时，所产生的组合物被称为水包油(o/w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以含其他组分，并且活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为独立相。如果需要，也可以存在药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以为包括多于两种相的多重乳剂，比如像油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂的情况。此类复合配制品通常提供某些简单的二元乳剂所不具有的优势。当多重乳剂中的o/w乳剂的各油滴还包有小水滴时，该多重乳剂形成w/o/w乳剂。同样地，在油连续相中稳定化的水滴中封装油滴的系统，构成o/w/o乳剂。
乳剂具有较小或没有热力学稳定性的特征。通常，乳剂的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或配制品的粘性保持这种形式。在乳剂状软膏基料或膏剂的情况下，乳剂的每个相都可以为半固体或固体。其他稳定乳剂的方式需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并进入到乳剂的任意相中。乳化剂可以大致分成4类：合成性的表面活性剂、天然存在的乳化、吸收基质和精细分散的固体(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送系统(Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
合成性的表面活性剂，也称作表面活性试剂，已经广泛应用于乳剂的制备并且已经在文献中综述(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送系统(Ansel′s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(PopovichNG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；列赫尔(Rieger)，于药物剂型(PharmaceuticalDosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，285页；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，1988，卷1，199页)。表面活性剂典型地是两亲性分子，并且包括亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水和疏水性的比值定义为亲水/亲油平衡值(HLB)，它是配制品制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质：非离子、阴离子、阳离子和两性分成不同类别(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送系统(Ansel′s Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；列赫尔(Rieger)，于药物剂型(PharmaceuticalDosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，285页)。
乳剂配制品中使用的自然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯树胶。吸收基料具有亲水特性，所以它们能够吸收水以形成w/o乳剂并仍然保持它们的半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水凡士林。精细分散的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性制剂中使用。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、非溶胀粘土如膨润土、凹凸棒土、锂蒙脱石，高岭土、蒙脱土、胶态硅酸铝和胶态镁硅酸铝、颜料和非极性固体如碳或甘油基三硬脂酸酯。
在乳剂配制品中还包括多种非乳化材料，它们对乳剂的特性有帮助。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(布洛克(Block)于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷2，335页；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
亲水胶体或水状胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物如多糖(如阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳胶、刺梧桐树胶和皇蓍胶)，纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(如卡波姆胶、纤维素醚和羰基乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或膨胀形成胶状溶液，这些胶状溶液通过在分散相小滴的周围形成强的界面膜并通过增强外相的粘度来稳定乳剂。
由于乳剂通常包含一些可以容易地支持微生物生长的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些制剂通常含有防腐剂。乳剂配制品中通常使用的防腐剂包括甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧剂加入到乳剂配制品中，以预防配制品的变质。所用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚，没食子酸烷基酯、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，或还原剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，和抗氧化剂增效剂如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
通过皮肤途径、口途径和肠胃外途径使用乳剂配制品和制造它们的方法已经在文献中综述(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送系统(Ansel′s Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；爱德森(Idson)，于药物剂型(PharmaceuticalDosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。口服递送的乳剂配制品已经非常广泛地使用，原因在于易于配制以及从吸收和生物利用率的观点看有效(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送系统(Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(AnselHC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；爱德森(Idson)，于药物剂型(PharmaceuticalDosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。基于矿物油的缓泻药、油溶性的维生素和高脂肪营养制剂属于经常作为o/w乳剂口服给予的物质。
在本发明的一个实施例中，将iRNA和核酸的组合物配制为微乳剂。可以将微乳剂定义为水、油和两亲分子的体系，所述体系是光学各向同性和热动力学稳定的单一液态溶液(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送系统(Ansel′s Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页)。典型地，微乳剂是通过如下方法制备的系统：首先将油分散到表面活性剂水溶液中，然后加入足量的通常为中等链长度的醇的第四组分而形成透明系统。因此，微乳剂也被描述成由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不能混合的液体的热力学稳定的各向同性的澄清分散系(朗(Leung)与纱(Shah)，在：药物的受控释放：聚合物和聚集体系统(Controlled Release of Drugs：Polymers andAggregate Systems)，洛索夫(Rosoff)，M.编著，1989，VCH出版公司，纽约，第185-215页)。通常微乳剂通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解液的三至五种组分的组合来制备。微乳剂是为油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子的极性头部和羟基尾的结构和几何包装(斯科特(Schott)，于雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，麦克出版公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿(Easton)，Pa.，1985，第271页)。
已经广泛研究了利用相图的现象学方法并且对本领域技术人员，该方法已经产生怎样配制微乳剂的广泛知识(见例如，安塞尔药物剂型和药物递送系统(Ansel′sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen，LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；布洛克(Block)于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州，卷2，335页)。与常规乳剂相比，微乳剂提供的优点是能将非水溶性药物溶解到自发形成的热力学稳定的液滴的配制品中。
在微乳剂的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独的或与助表面活性剂组合使用的离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、一又二分之一油酸十甘油酯(SO750)(decaglycerol sequioleate)、十油酸十甘油酯(DAO750)。该助表面活性剂通常是短链醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通过渗透到表面活性剂膜中并由此在表面活性剂分子间产生空余空间来产生无序膜从而提高界面流动性。然而，微乳剂可以不用助表面活性剂进行制备，并且无醇的自乳化微乳剂系统是本领域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、药物的水溶液、甘油、PEG 300、PEG 400、聚甘油、丙二醇、和乙乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如多种材料，比如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯，中等链(C8-C12)的单、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolized glyceride)，饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解和增强的药物吸收方面看，微乳剂是特别令人感兴趣的。已经提出基于脂质的微乳剂(o/w和w/o)以增强药物(包括肽)的口服生物利用率(见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人，药物研究(Pharmaceutical Research)，1994，11，1385-1390；里切尔(Ritschel)，实验与临床药理学的方法与发现(Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.)，1993，13，205)。微乳剂提供以下优点：改进药物溶解、保护药物免遭酶水解、可能因表面活性剂引起的膜流动性和通透性改变而增强药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服施用、临床效力改善和毒性降低(见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人，药物研究(Pharmaceutical Research)，1994，11，1385；胡(Ho)等人，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1996，85，138-143)。通常，微乳剂的成份在环境温度下混合在一起时，它们可以自发形成微乳剂。在配制热不稳定药物、肽或iRNA时，这可以是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，微乳剂在活性组分的经皮递送中也是有效的。预期本发明的微乳剂组合物和配制品将促进iRNA和核酸从胃肠道的全身性吸收增加以及改善iRNA和核酸的局部细胞摄取。
本发明的微乳剂也可以含有另外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol、和改善制剂特性并增强本发明iRNA和核酸吸收的增渗剂。可以将本发明的微乳剂中所用的增渗剂划分为属于5大类之一--表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂(李(Lee)等人，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)。每个类型都已经在以上进行了讨论。
渗透增强剂
在一个实施例中，本发明采用各种渗透增强剂来实现向动物皮肤高效递送核酸，尤其是iRNA。大多数药物以离子化和非离子化的形式两者存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或亲脂的药物易于穿过细胞膜。已经发现，如果用增渗剂处理要穿过的膜，甚至连非亲脂药物都可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜外，渗透增强剂还增强亲脂药物的渗透性。
可以将增渗剂划分为属于5大类之一，即，表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂(见例如，马姆斯顿(Malmsten，M.)药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa HealthCare)，纽约，纽约州，2002；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，p.92)。在下面对每类以上提及的渗透增强剂都详细进行了阐述。
表面活性剂：表面活性剂：在本发明的上下文中，表面活性剂(或“表面活性试剂”)为化学实体，当其溶解在水溶液中时，它能降低该溶液的表面张力或者水溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是iRNA通过粘膜的吸收得到增强。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些增渗剂还包括例如月桂醇硫酸钠、聚氧乙烯基-9-月桂基醚和聚氧乙烯基-20-鲸蜡基醚(参见，例如，马姆斯顿(Malmsten，M.)药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants andpolymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，纽约州，2002；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems)，1991，p.92)；以及全氟化学乳剂如FC-43(高松(Takahashi)等人，药物药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)，1988，40，252)。
脂肪酸：充当增渗剂的各种脂肪酸及其衍生物例如包括油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油精(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如、甲基酯、异丙基酯和叔丁基酯)及其单和二甘油酯(即、油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(见例如，头头(Touitou，E.)等人，药物递送增强(Enhancement in Drug Delivery)，CRC出版社，丹弗斯(Danvers)，MA，2006；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems)，1991，p.92)；村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1990，7，1-33；El海瑞(Hariri)等人，药物药理学(J.Pharm.Pharmaco1.)，1992，44，651-654)。
胆汁盐：胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂肪维生素的分散和吸收(见例如，马姆斯顿(Malmsten，M.)，药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymersin drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，纽约州，2002；布鲁顿(Brunton)，第38章，古德曼&吉尔曼，治疗的药理学基础第38章中(Goodman&Gilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics)，第9版，哈德曼(Hardman)等人编著，麦格劳希尔(McGraw-Hill)，纽约，1996，第934-935页)。各种天然胆汁盐和它们的合成衍生物作为渗透增强剂起作用。因此术语“胆汁盐”包括胆汁中天然存在的任意成分和它们的任意合成衍生物。适合的胆盐包括，例如，胆酸(或其可药用的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢夫西地酸钠(STDHF)、二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(见例如，马姆斯顿(Malmsten，M.)，药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，纽约州，2002；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，92页)；斯文亚德(Swinyard)，第39章，于雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，真纳罗(Gennaro)编著，马克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton，Pa.)，1990，第782-783页；村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems)，1990，7，1-33；山本(Yamamoto)等人，药理学和实验治疗学杂志(J.Pharm.Exp.Ther.)，1992，263，25；山下(Yamashita)等人，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1990，79，579-583)。
螯合剂：与本发明有关使用的的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的iRNA的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为增渗剂的应用，因为多数特征化的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此可以被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当DNase抑制剂的附加优势(加热特(Jarrett)，层析学杂志(J.Chromatogr.)，1993，618，315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(酯)(如水杨酸钠、5-甲氧水杨酸酯和高香草酸酯)、胶原质的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，p.92；Muranishi(村西)，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems)，1990，7，1-33；布尔(Buur)等人，缓释杂志(J.Control Rel.)，1990，14，43-51)。
非螯合性非表面活性剂：如本文所用，非螯合性非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或作为表面活性剂展示不明显活性但是反而增强iRNA经消化道粘膜吸收的化合物(见例如，村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(Critical ReviewsinTherapeutic Drug Carrier Systems)，1990，7，1-33)。这类的增渗剂包括例如不饱和环脲、1-烷基烷酮衍生物和1-烯基氮杂环烷酮衍生物(李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)；以非甾体抗炎剂如双氯芬酸钠、引哚美辛和苯丁唑啉(山下(Yamashit)等人药物药理学(，J.Pharm.Pharmacol.)，1987，39，621-626)。
也可以添加在细胞水平增强摄取iRNA的物质至本发明的药物组合物和其他组合物。例如阳离子脂质，如脂质体(淳一(Junichi)等人，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子如聚赖氨酸(洛洛(Lollo)等人，PCT申请WO 97/30731)也已知增强dsRNA的细胞摄取。市售转染试剂的例子包括例如LipofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Invitrogen；Carlsbad，CA))、Lipofectamine 2000TM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、293fectinTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、CellfectinTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、DMRIE-CTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、FreeStyleTMMAX(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、LipofectamineTM 2000CD(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、LipofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、RNAiMAX(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、OligofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、OptifectTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、X-tremeGENE Q2转染试剂(罗氏公司(Roche)；格兰扎克尔街，瑞士(Grenzacherstrasse，Switzerland))、DOTAP脂质体转染试剂(格兰扎克尔街，瑞士)、DOSPER脂质体转染试剂(格兰扎克尔街，瑞士)或Fugene(格兰扎克尔街，瑞士)、
Figure BDA0001787260730001441
试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州(Promega；Madison，WI))、TransFastTM转染试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、TfxTM-20试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、TfxTM-50试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、DreamFectTM(OZ生命科学公司；马赛市，法国(OZ Biosciences；Marseille，France))、EcoTransfect(OZ生命科学公司；马赛市，法国)、TransPassa D1转染试剂(新英格兰生物实验室；伊普斯威奇市，马萨诸塞州，美国(New England Biolabs；Ipswich，MA，USA))、LyoVecTM/LipoGenTM(英杰公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国(Invivogen；San Diego，CA，USA))、PerFectin转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国(Genlantis；San Diego，CA，USA))、NeuroPORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、GenePORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、GenePORTER 2转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、Cytofectin转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、BaculoPORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、TroganPORTERTM转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、RiboFect(星谱生计公司；陶顿市，马萨诸塞州，美国(Bioline；Taunton，MA，USA))、PlasFect(星谱生计公司；陶顿市，马萨诸塞州，美国)、UniFECTOR(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国(B-Bridge International，Mountain View，CA，USA))、SureFECTOR(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国)或HiFectTM(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国)，连同其他。
其他物质可以用来增强所施用核酸渗透，包括二醇如乙二醇和丙二醇、吡咯如2-吡咯、氮酮和萜类如苧烯和薄荷酮。
载体
本发明的某些组合物还向配制品中并入了载体化合物。如在此所使用的，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但却在体内过程中被认为是核酸，能例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共施用(一般后一种物质过量)可以导致肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度缩减，假定归因于该载体化合物和该核酸之间对共同受体的竞争。例如与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4′异硫氰酸茋-2，2′-二磺酸共施用时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsRNA的回收可以减少(宫尾(Miyao)等人，DsRNA研究与研发(DsRNA Res.Dev.)，1995，5，115-121；高仓(Takakura)等人，DsRNA&核酸药物研发(DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.)，1996，6，177-183)。
赋形剂
与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他任意药学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于、粘合剂(例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填料(例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；和润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。
适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包含缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其他组分
本发明的组合物另外可以包含其他本领域熟知用量的在药物组合物中常用的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包含另外的、可相容的药学上有活性的物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包含对本发明的组合物的各种剂型的物理配制有用的其他物质，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的成份的生物活性。可以将这些配制品进行灭菌并且如果希望的话与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。
水性悬浮液可以包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
在一些实施例中，本发明中表征的药物组合物包含(a)一种或多种iRNA化合物和(b)通过非RNAi机制发挥作用的一种或多种生物试剂。此类生物试剂的实例包括干扰ALAS1与至少一个ALAS1结合配偶体的相互作用的试剂。
此类化合物的毒性与治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率LD50/ED50。典型地是那些表现出高的治疗指数的化合物。
获得自细胞培养测定与动物研究的数据可以在配制一系列的用于在人类中使用的剂量方面使用。在本发明中表征的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的ED50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给予途径而在该范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，该治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。在动物模型中可以将一个剂量配制为达到该化合物的循环血浆浓度范围，或者当适当时，一个靶标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到该多肽的一个降低的浓度)，该范围包括如在细胞培养中确定的IC50(即，测试化合物实现症状的半最大抑制时的浓度)。这种信息可以用于更准确地确定人类中有用的剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相层析。
除了给予它们之外，如在此所讨论的，还可以将在本发明中表征的iRNA与在治疗与ALAS1表达相关的疾病或失调中有效的其他已知试剂联合给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或本文所述的标准功效量值所观察到的结果，施用医师可以调整施用iRNA的量和时间。
用于治疗与ALAS1基因表达相关的疾病的方法
本发明尤其涉及靶向ALAS1的iRNA的使用，用于抑制ALAS1表达和/或治疗与ALAS1表达相关的疾病、失调、或病理过程。
如在此使用的，“与ALAS1表达相关的失调”、“与ALAS1表达相关的疾病”、“与ALAS1表达相关的病理过程”等等包括任何病况、失调、或疾病，其中ALAS1表达是被改变了的(例如，升高的)、一种或多种卟啉的水平是被改变了的(例如，升高的)、血红素生物合成途径(卟啉途径)中的一种或多种酶的水平或活性是被改变了的，或导致血红素生物合成途径病理变化的其他机制。例如，靶向ALAS1基因的iRNA、或其组合，可以用于治疗其中卟啉或卟啉前体(例如，ALA或PBG)水平升高了的病状，(例如，某些卟啉症)，或其中存在血红素生物合成途径中的酶的缺乏的病状(例如，某些卟啉症)。与ALAS1表达相关的失调包括，例如，X-连锁的铁粒幼细胞贫血(XLSA)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(Doss卟啉症)、急性间歇性卟啉症(AIP)、先天性红细胞生成性卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症)、杂斑卟啉症、红细胞生成性原卟啉症(EPP)、以及婴儿暂时性红细胞卟啉症。
如在此使用的，有待于根据在此所述的方法进行治疗的“受试者”包括人类或非人动物，例如，哺乳动物。该哺乳动物可以是，例如，啮齿类动物(例如，大鼠或小鼠)或灵长类(例如，猴)。在一些实施例中，受试者是人。
在一些实施例中，该受试者经受与ALAS1表达相关的失调(例如，已经被诊断为患有卟啉症或已经遭遇一种或多种卟啉症症状，以及是与卟啉症相关联的突变的携带者)或处于发展与ALAS1表达相关的失调(例如，具有卟啉症家族史的受试者，或是与卟啉症相关联的基因突变的携带者)的风险中。
卟啉症(包括急性肝性卟啉症)的分类描述于，例如，巴望尼(Balwani，M)和戴斯尼克(Desnick，R.J.)，血液(Blood)，120(23)，作为血液第一版论文在线发布，7月12日，102；DOI10.1182/blood-2012-05-423186。如在巴望尼和戴斯尼克(Balwain&Desnick)中所述的，急性间歇性卟啉症(AIP)遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)是常染色体显性卟啉症并且ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)是常染色体隐性的。在罕见情况下，AIP、HCP、以及VP发生为纯合的显性形式。此外，存在迟发性皮肤卟啉症(PCT)的罕见的纯合隐性形式，这是单一的肝性皮肤性卟啉症，并且还称作肝性红细胞生成性卟啉症。这些卟啉症的临床和实验室特征描述于下表11中。
表11：人肝性卟啉症：临床和实验室特征
Figure BDA0001787260730001491
AR表示常染色体隐性；AD，常染色体显性；NV，脑脊髓交感神经系统的；CP，皮肤光过敏；并且-，不适用。
*增加对于诊断可以是非常重要的。
在一些实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，肝性卟啉症，例如，AIP、HCP、VP、ADP、或肝性红细胞生成性卟啉症。
在一些实施例中，该卟啉症是急性肝性卟啉症，例如，选自急性间歇性卟啉症(AIP)、遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、以及ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)的急性肝性卟啉症。
在一些实施例中，该卟啉症是双卟啉症，例如，至少两种卟啉症。在一些实施例中，该双卟啉症包括选自急性间歇性卟啉症(AIP)遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、以及ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)的两种或更多种卟啉症。
在一些实施例中，该卟啉症是纯合显性的肝性卟啉症(例如，纯合显性的AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。在一些实施例中，该卟啉症是AIP、HCP、VP、或肝性红细胞生成性卟啉症、或其组合(例如，双卟啉症)。在实施例中，AIP、HCP、或VP是杂合显性的或是纯合显性的。
在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，ADP，并且显示ALA和/或粪卟啉III的升高的水平(例如，升高的尿水平)。在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，ADP，并且显示红细胞Zn-原卟啉的升高的水平。
在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，AIP，并且显示ALA、PBG、和/或尿卟啉的升高的水平(例如，升高的尿水平)。
在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，HCP，并且显示ALA、PBG、和/或粪卟啉III的升高的水平(例如，升高的尿水平)。在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，HCP，并且显示粪卟啉III的升高的水平(例如，升高的粪便水平)。
在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，VP，并且显示ALA、PBG、和/或粪卟啉III的升高的水平(例如，升高的尿水平)。
在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，HCP，并且显示粪卟啉III和/或原卟啉的升高的水平(例如，升高的粪便水平)。
在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，PCT，(例如，肝性红细胞生成性卟啉症)，并且显示尿卟啉和/或7-羧酸卟啉的升高的水平(例如，升高的尿水平)。在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，PCT，(例如，肝性红细胞生成性卟啉症)，并且显示尿卟啉和/或7-羧酸卟啉的升高的水平(例如，升高的粪便水平)。
与卟啉症相关联的突变包括编码血红素生物合成途径(卟啉途径)中的一种酶的基因的或改变血红素生物合成途径中基因的表达的基因的任何突变。在许多实施例中，受试者携带卟啉途径中酶的一个或多个突变(例如，ALA脱水酶或PBG脱氨酶)。在一些实施例中，受试者经受急性卟啉症(例如，AIP、ALA脱水酶缺乏卟啉症)。
在一些情况中，与健康个体相比，患有急性肝性卟啉症(例如，AIP)的患者，或携带有与急性肝性卟啉症(例如，AIP)相关联的突变但无症状的患者具有升高的ALA和/或PBG水平。参见，例如，弗洛德拉斯(Floderus，Y.)等人，临床化学(Clinical Chemistry)，52(4)：701-707，2006；沙赫(Sardh)等人，临床药代动力学(Clinical Pharmacokinetics)，46(4)：335-349，2007。在此类情况中，ALA和/或PBG的水平可以是升高的，甚至是在该患者不具有，或从未有过发作的情况下。在一些情况中，该患者否则是完全无症状的。在一些此类情况下，该患者经受疼痛，例如，神经性疼痛，这可以是慢性痛(例如，慢性神经性疼痛)。在一些情况中，该患者具有神经病变。在一些情况中，该患者具有渐进性神经病变。
在一些实施例中，有待于根据在此描述的方法进行治疗的受试者具有卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG的升高的水平。可以使用本领域中已知的方法或在此描述的方法对卟啉或卟啉前体的水平进行评估。例如，评估尿和血浆ALA和PBG水平，连同尿和血浆卟啉水平的方法披露于弗洛德拉斯(Floderus，Y.)等人，临床化学(Clinical Chemistry)，52(4)：701-707，2006；和沙赫(Sardh)等人，临床药代动力学(Clinical Pharmacokinetics)，46(4)：335-349，2007，将其全部内容以其整体通过引用结合在此。
在一些实施例中，受试者是卟啉症的动物模型，例如，卟啉症的小鼠模型(例如，如在林德贝格等人自然遗传学(Nature Genetics)，12：195-199，1996中描述的突变小鼠)。在一些实施例中，受试者是人类，例如，患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中的人类，如在此所述的。在一些实施例中，受试者是不具有卟啉症的急性发作。在一些实施例中，受试者从未有过发作。在一些实施例中，患者经受慢性痛。在一些实施例中，患者具有神经损伤。在实施例中，受试者具有EMG改变和/或神经传导速度改变。在一些实施例中，受试者是无症状的。在一些实施例中，受试者处于发展卟啉症的风险中(例如，携带有与卟啉症相关联的基因突变)并且是无症状的。在一些实施例中，受试者先前有过急性发作但是在治疗时是无症状的。
在一些实施例中，受试者处于发展卟啉症的风险中并且接受预防性治疗以防止卟啉症的发展。。在一些实施例中，受试者具有升高的水平的卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG。在一些实施例中，预防治疗开始于青春期。在一些实施例中，治疗降低卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG的水平(例如，血浆水平或尿水平)。在一些实施例中，治疗预防卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG的升高的水平。在一些实施例中，治疗预防与卟啉症相关联的症状，例如，疼痛或神经损伤的发展，或降低其频率或严重性。
在一些实施例中，卟啉或卟啉前体，例如，ALA或PBG的水平是升高的，例如，在来自该受试者的血浆或尿的样本中。在一些实施例中，基于来自该受试者的样本中的卟啉或卟啉前体，例如，ALA或PBG的绝对水平，评估受试者中卟啉或卟啉前体，例如，ALA或PBG的水平。在一些实施例中，基于来自该受试者的样本中的卟啉或卟啉前体，例如，ALA或PBG的相对水平，评估受试者中卟啉或卟啉前体，例如，ALA或PBG的水平。在一些实施例中，相对水平是相对于来自该受试者的样本中的另一种蛋白或化合物的水平，例如，肌酸酐的水平。在一些实施例中，样本是尿样本。在一些实施例中，样本是血浆样本。在一些实施例中，样本是粪便样本。
可以确定卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG的升高的水平，例如，通过显示受试者具有的卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG水平(例如，ALA和/或PBG的血浆或尿水平)是大于、或大于或等于参比值。具有治疗卟啉症经验的医师将能够确定卟啉或卟啉前体，(例如，ALA和/或PBG)的水平是否是升高的，例如，出于诊断卟啉症的目的或用于确定受试者是否是处于发展卟啉症的风险中，例如，受试者可能预先倾向于急性发作或与卟啉症相关联的病变，例如像，慢性痛(例如，神经性疼痛)以及神经病变(例如，渐进性神经病变)。
如在此使用的，“参比值”是指来当受试者不处于疾病状态时自该受试者的值，或是来自正常或健康受试者的值，或是来自参比样本或群体的值，例如，一组正常或健康的受试者(例如，不携带与卟啉症相关联的突变的一组受试者和/或不经受与卟啉症相关联的症状的一组受试者)。
在一些实施例中，参比值是相同个体的疾病前水平。在一些实施例中，参比值是参比样本或群体的水平。在一些实施例中，参比值是参比样本或群体中的平均值或中位值。在一些实施例中，参比值是超过参比样本或群体中平均值的两个标准差的值。在一些实施例中，参比值是超过参比样本或群体中平均值2.5、3、3.5、4、4.5、或5个标准差的值。
在一些实施例中，其中受试者具有卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG的升高的水平，该受试者具有的ALA和/或PBG的水平高于参比值至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一些实施例中，受试者具有卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG的升高的水平，该水平高于参比值至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。
在一些实施例中，参比值是参比上限。如在此使用的，“参比上限”是指参比样本或群体的95％置信区间上限的一个水平，该样本或群体是，例如，一组正常(例如，野生型)或健康个体，例如，不携带与卟啉症相关联的基因突变的个体和/或不经受卟啉症的个体。因此，参比下限是指相同95％置信区间下限的一个水平。
在一些实施例中，其中受试者具有卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG的升高的水平，例如，血浆水平或尿水平，该水平大于或等于参比值，例如参比上限2倍、3倍、4倍、或5倍。在一些实施例中，受试者具有大于参比上限4倍的卟啉或卟啉前体，例如，ALA或PBG的尿水平。
在一些实施例中，参比值是提供于弗洛德拉斯(Floderus，Y.)等人，临床化学(Clinical Chemistry)，52(4)：701-707，2006或沙赫(Sardh)等人，临床药代动力学(Clinical Pharmacokinetics)，46(4)：335-349，2007中的值。在一些实施例中，参比值是提供于沙赫(Sardh)等人的表1中的值。
在一些实施例中，受试者是人类并且具有大于或等于4.8mmol/mol肌酸酐的PBG的尿水平。在某些实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于约3、4、5、6、7、或8mmol/mol肌酸酐的PBG的尿水平。
在实施例中，血浆PBG的参比值是0.12μmol/L。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于0.10μmol/L、0.12μmol/L、0.24μmol/L、0.36μmol/L、0.48μmol/L、或0.60μmol/L的血浆PBG水平。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于0.48μmol/L的PBG的血浆水平。
在实施例中，尿PBG的参比值是1.2mmol/mol肌酸酐。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于1.0mmol/mol肌酸酐、1.2mmol/mol肌酸酐、2.4mmol/mol肌酸酐、3.6mmol/mol肌酸酐、4.8mmol/mol肌酸酐、或6.0mmol/mol肌酸酐的尿PBG水平。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于4.8mmol/mol肌酸酐的PBG的尿水平。
在实施例中，血浆ALA的参比值是0.12μmol/L。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于0.10μmol/L、0.12μmol/L、0.24μmol/L、0.36μmol/L、O.48μmol/L、或0.60μmol/L的血浆ALA水平。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于0.48μmol/L的血浆ALA水平。
在实施例中，尿ALA的参比值是3.1mmol/mol肌酸酐。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于2.5mmol/mol肌酸酐、3.1mmol/mol肌酸酐、6.2mmol/mol肌酸酐、9.3mmol/mol肌酸酐、12.4mmol/mol肌酸酐、或15.5mmol/mol肌酸酐的尿ALA水平。
在实施例中，血浆卟啉的参比值是10nmol/L。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于10nmol/L的血浆卟啉水平。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于8、10、15、20、25、30、35、40、45、或50nmol/L的血浆卟啉水平。受试者是人类并且具有大于、或大于或等于40nmol/L的血浆卟啉水平。在实施例中，尿卟啉的参比值是25μmol/mol肌酸酐。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或大于或等于25μmol/mol肌酸酐的尿卟啉水平。在实施例中，受试者是人类并且具有大于、或等于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、或80μmol/mol肌酸酐的尿卟啉水平。
在一些实施例中，受试者具有卟啉或卟啉前体，例如，ALA或PBG的这样一个水平，例如，血浆水平或尿水平，该水平大于健康个体样本中99％的个体的水平。
在一些实施例中，受试者具有ALA或PBG的这样一个水平，例如，血浆水平或尿水平，该水平大于超过健康个体样本中平均水平两个标准差的水平。
在一些实施例中，受试者具有的ALA的尿水平是正常受试者(例如，不携带与卟啉症相关联的突变的受试者)平均水平的1.6或更多倍。在一些实施例中，受试者具有的ALA的血浆水平是正常受试者平均水平的2或3倍。在一些实施例中，受试者具有的PBG的尿水平是正常受试者平均水平的四倍或更多倍。在一些实施例中，受试者具有的PBG的血浆水平是正常受试者平均水平的四倍或更多倍。
在一些实施例中，该方法有效降低卟啉或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG的水平。在实施例中，该方法对于产生升高的卟啉或卟啉前体，例如，ALA或PBG水平的预定下降是有效的。在一些实施例中，预定下降是降低至少10％、20％、30％、40％、或50％。在一些实施例中，预定下降是有效预防或改善症状，例如，疼痛或复发性发作的一个下降。
在一些实施例中，预定下降是至少1、2、3、或更多个标准差的一个下降，其中该标准差是基于来自参比样本，例如，如在此所述的参比样本的值确定的。
在一些实施例中，预定下降是这样一个下降，该下降使卟啉或卟啉前体水平达到小于，或达到小于或等于参比值(例如，如在此所述的参比值)的一个水平。
在一些实施例中，有待于根据在此描述的方法进行治疗的受试者经受疼痛，例如，慢性痛。在实施例中，受试者患有卟啉症或处于发展卟啉症的风险中，例如，急性肝性卟啉症，例如，AIP。在实施例中，例如，通过降低疼痛的严重性或治愈疼痛，该方法有效治疗疼痛。在实施例中，该方法有效降低或预防神经损伤。
在一些实施例中，有待于根据在此描述的方法进行治疗的受试者(a)具有升高的ALA和/或PBG的水平并且(b)疼痛，例如，慢性痛。在实施例中，该方法有效降低升高的ALA和/或PBG的水平和/或治疗疼痛，例如，通过降低疼痛的严重性或治愈疼痛。
在一些实施例中，受试者是一种动物，充当用于与ALAS1表达相关的失调的模型。
在一些实施例中，受试者是一种动物，充当用于卟啉症的模型(例如，具有一个或多个突变的基因修饰动物。在一些实施例中，卟啉症是AIP并且受试者是AIP的动物模型。在这样一种实施例中，受试者是胆色素原脱氨酶缺乏的遗传修饰的小鼠，例如像，描述于林德贝格等人，自然遗传学(Nature Genetics)，12：195-199，1996中的小鼠，或描述于安田町(Yasuda，M.)，于(Yu，C.)张(Zhang，J.)，克拉维罗(Clavero，S.)，德尔曼(Edelmann，W.)，甘(Gan，L.)，菲利普斯(Phillips，J.D.)，&德斯耐克(Desnick，R.J.)中的纯合R167Q小鼠。急性间歇性卟啉症：严重地影响的敲入小鼠，模拟人类纯合显性表型。(摘要，2011年10月14日呈递于美国人类遗传学学会(American Society of Human Genetics)；项目编号1308F；2012年4月4日开放在线访问，网址是ichg2011.org/cgi-bin/showdetail.pl？absno＝21167)；将所有参考通过引用以其整体结合在此。针对在人类中引起纯合显性AIP的突变，已经生成了若干个敲入模型。所用的突变包括，例如，PBG脱氨酶中的R167Q、R173Q、以及R173W。能存活的纯合子包括R167Q/R176Q或R167Q/R173Q，这两者都展示组成型升高的ALA和PBG水平，该水平类似于人类纯合显性的AIP中的表型；在一些实施例中，这样一种能存活的纯合AIP小鼠模型是该受试者。
在一个实施例中，有待于根据在此描述的方法进行治疗的受试者(例如，人类受试者或患者)处于发展卟啉症的风险中或已经被诊断为患有与ALAS1表达相关的失调，例如，卟啉症。在一些实施例中，受试者是经受一种或多种卟啉性症状的一次或多次急性发作的受试者。在其他实施例中，受试者是长期地经受卟啉症的一种或多种症状(例如，疼痛，例如，神经性疼痛和或神经病变，例如，渐进性神经病变)的受试者。在一些实施例中，受试者携带有在此描述的遗传变异(例如，突变)但是此外是无症状的。在一些实施例中，受试者之前接受过如在此描述的血红素产品(例如，氯血红素、精氨酸血红素、或血红素白蛋白)的治疗。
在一些实施例中，有待于根据在此描述的方法进行治疗的受试者(例如患有卟啉症，例如像，AIP的受试者)近期经历过或正在经历一种前驱症状。在一些此类实施例中，对该受试者给予组合治疗，例如，如在此所述的iRNA，以及已知有效对抗卟啉症或其相关联的症状的一种或多种另外的治疗(例如，葡萄糖和/或血红素产品像氯血红素，如在此所述的)。
在一个实施例中，将如在此所述的iRNA与葡萄糖或右旋糖组合给予。例如，可以静脉内地提供10％-20％右旋糖生理盐水。典型地，当给予葡萄糖时，每天静脉内给予至少300g的10％葡萄糖。还可以静脉内给予iRNA(例如，LNP配制品中的iRNA)，作为用于给予葡萄糖或右旋糖的相同输注的一部分，或作为葡萄糖或右旋糖给予之前、同时、或之后给予的一个单独的输注。在一些实施例中，iRNA是经由不同给予途径(例如，皮下地)给予的。在又另一个实施例中，iRNA是与全肠外营养组合给予。可以在全肠外营养给予之前、同时、或之后给予iRNA。
在一个实施例中，iRNA是与血红素产品(例如，氯血红素、精氨酸血红素、或血红素白蛋白)组合给予。在又一个实施例中，iRNA是与血红素产品和葡萄糖、血红素产品和右旋糖、或血红素产品和全肠外营养组合给予的。
如在此使用的，“前驱症状”包括受试者先前发展急性发作之前刚刚经历的任何症状。前驱症状的典型症状包括，例如，腹痛、恶心、头痛、心理症状(例如，焦虑)、坐立不安和/或失眠。在一些实施例中，受试者在前驱症状过程中经历疼痛(例如，腹痛和/或头痛)。在一些实施例中，受试者在前驱症状过程中经历恶心。在一些实施例中，受试者在前驱症状过程中经历心理症状(例如，焦虑)。在一些实施例中，受试者在前驱症状过程中变得坐立不安和/或经受失眠。
卟啉症的急性“发作”涉及一种或多种卟啉症症状的发病，典型地是在携带有与卟啉症相关联的突变(例如，编码卟啉途径中酶的基因的突变)的患者中。
在某些实施例中，ALAS1 iRNA的给予致使如在此所述的一种或多种卟啉或卟啉前体，(例如，ALA和/或PBG)的水平下降。该下降相对于任何适当的对照或参比值是可以测得的。例如，与治疗前(例如，刚刚在治疗之前)的水平相比，在一个个体受试者中可以确定一种或多种卟啉或卟啉前体的水平的下降，例如，下降至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。卟啉前体、卟啉、或卟啉代谢物水平的降低可以使用本领域中已知的任何方法测得。例如，使用瓦-施二氏试验(Watson-Schwartz test)、离子交换层析法、或高效液相层析-质谱法，可以对尿或血浆中的PBG和/或ALA的水平进行评估。参见，例如，桑奈尔(Thunell)(1993)。
在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效降低受试者中ALA和/或PBG的水平。可以在受试者中对来自该受试者的样本中的ALA或PBG的水平进行评估，例如，基于ALA或PBG的绝对水平，或基于ALA或PBG的相对水平(例如，相对于另一种蛋白或化合物的水平，例如，肌酸酐的水平)。在一些实施例中，样本是尿样本。在一些实施例中，样本是血浆样本。
在某些实施例中，靶向ALAS1的iRNA是与一种或多种另外的治疗组合给予的，例如，已知在卟啉症或卟啉症症状的治疗中有效的另一种治疗。例如，其他治疗可以是葡萄糖(例如，IV葡萄糖)或血红素产品(例如，氯血红素、精氨酸血红素、或血红素白蛋白)。这种或这些另外的治疗可以是iRNA给予之前、之后或与之一起给予的。
iRNA以及另外的治疗剂可以在相同的组合物中，例如，静脉内，组合地给予，或该另外的治疗剂可以作为一个单独的组合物的一部分或通过在此描述的另一种方法给予。
在一些实施例中，iRNA的给予，或iRNA与一种或多种另外的治疗(例如，葡萄糖、右旋糖等)的组合的给予降低急性发作的频率(例如，通过预防急性发作以使得它们不再发生，或通过减少某一时间段内发生的发作的数目，例如，每一年发生较少的发作)。在一些此类实施例中，根据常规剂量方案给予iRNA，例如，每天、每周、每两周、或每月一次。
在一些实施例中，iRNA是在卟啉症的急性发作之后给予的。在一些此类实施例中，iRNA处于一种组合物中，例如，包括一种脂质配制品，像LNP配制品的一种组合物。
在一些实施例中，iRNA是在卟啉症的急性发作过程中给予的。在一些此类实施例中，iRNA处于一种组合物中，例如，包括一种脂质配制品，像LNP配制品的一种组合物或包括GalNAc共轭物的一种组合物。
在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效减轻发作的严重性(例如，通过改善与该发作相关联的一种或多种病征或症状)。在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效缩短发作的持续时间。在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效终止发作。在一些实施例中，预防性地给予的iRNA以防止卟啉症的急性发作。在一些此类实施例中，iRNA是处于GalNAc共轭物的形式，例如，处于包括GalNAc共轭物的一种组合物。在一些实施例中，预防性给予是在暴露于或出现诱发因素之前、过程中、或之后给予的。在一些实施例中，受试者处于发展卟啉症的风险中。
在一些实施例中，siRNA是在前驱症状过程中给予的。在一些实施例中，前驱症状特征在于疼痛(例如，头痛和/或腹痛)、恶心、心理症状(例如，焦虑)、坐立不安和/或失眠。
在一些实施例中，siRNA是在月经周期的一个具体时期过程中，例如，在黄体期过程中给予的。
在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效预防发作(例如，与前驱症状和/或诱发因素相关联的复发性发作，例如，与月经周期的一个具体时期，例如，黄体期相关联)。在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效降低发作的频率。在实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效减轻发作的严重性(例如，通过改善与该发作相关联的一种或多种病征或症状)。在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效缩短发作的持续时间。在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效终止发作。
在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效预防或减少疼痛，例如，神经性疼痛的频率或严重性。
在一些实施例中，ALAS1 siRNA的给予有效预防或减少神经病变的频率或严重性
例如，通过与适当的对照相比较，可以确定ALAS1 siRNA给予的效果。例如，可以确定急性发作频率的下降，连同一种或多种卟啉或卟啉前体水平的降低，例如，在患有AIP的一组患者中，如与适当的对照相比较的频率下降。对照组(例如，一组类似的个体或处于交叉设计的同一组个体)可以包括，例如，未处理的群体，已经接受针对卟啉症的传统治疗处理的群体(例如，针对AIP的传统治疗可以包括葡萄糖、氯血红素、或两者)；已经接受安慰剂、或非靶向性iRNA处理的群体，任选地与一种或多种针对卟啉症的传统治疗(例如，葡萄糖，例如，IV葡萄糖)组合，等。
如在此使用的，处于发展卟啉症的“风险中”的受试者包括具有卟啉症家族史和/或一种或多种复发性或慢性卟啉性症状史的受试者，和/或携带有编码血红素生物合成途径中酶的基因的遗传变异(例如，基因突变)的受试者，以及携带有遗传变异(例如，已知与卟啉症相关联的突变)的受试者。
在实施例中，变异，例如突变使得个体易于急性发作(例如，一旦暴露于诱发因素，例如，药物、饮食或其他诱发因素，例如，如在此披露的诱发因素)。在实施例中，变异，例如突变是与卟啉或卟啉前体(例如，ALA和/或PBG)的升高的水平相关联的。在实施例中，变异，例如突变是与慢性疼痛(例如，慢性神经性疼痛)和/或神经病变(例如，渐进性神经病变)相关联的。在实施例中，变异，例如突变是与EMG改变和/或神经传导速度改变相关联的。
在实施例中，变异是ALAS1基因中的突变。在实施例中，变异是ALAS1基因启动子的突变，或是ALAS1基因上游或下游区域中的突变。在实施例中，变异是转录因子或与ALAS1相互作用的其他基因的突变。在实施例中，变异是一种变化，例如编码血红素生物合成途径中的酶的基因的突变。
在一些实施例中，受试者具有如在此所述的遗传变异(例如，已知与卟啉症相关联的基因突变)。在一些此类实施例中，受试者具有升高的ALA和/或PBG水平(例如，尿或血浆水平)。在一些此类实施例中，受试者不具有升高的ALA和/或PBG的水平。在实施例中，受试者具有如在此所述的遗传变异并且具有其他症状，例如，慢性痛、EMG改变、神经传导速度改变、和/或与卟啉症相关联的其他症状。在实施例中，受试者具有遗传变异但不经受急性发作。
在实施例中，受试者具有与AIP、HCP、VP、或ADP相关联的突变。
在一些实施例中，卟啉症是AIP。在一些此类实施例中，在PBG脱氨酶基因中，受试者具有变异，例如，至少一个突变。许多PBG脱氨酶突变是本领域中已知的，例如，如报道于赫德卡(Hrdinka，M.)等人生理研究(Physiological Research)，55(增刊2)：S119-136(2006)中。在一些实施例中，受试者针对PBG脱氨酶突变是杂合的。在其他实施例中，受试者针对PBG脱氨酶突变是纯合的。纯合的受试者在PBG脱氨酶基因中可以携带两个相同突变或两个不同突变。
在一些实施例中，卟啉症是HCP。在一些此类实施例中，受试者在编码粪卟啉原III氧化酶的基因中具有变异，例如，至少一个突变。
在一些实施例中，卟啉症是VP。在一些此类实施例中，受试者在编码原卟啉原氧化酶的基因中具有变异，例如，至少一个突变。
在实施例中，卟啉症是ADP，例如，常染色体隐性ADP。在一些此类实施例中，受试者在编码ALA脱水酶的基因中具有变异，例如，至少一个突变。
在此提供的治疗方法可以用于改善与卟啉症相关联的一种或多种症状，降低与卟啉症相关联发作的频率，降低一旦暴露于诱发因子将发生的、与卟啉症相关联的一种或多种症状发作的可能性，或降低发展与卟啉症相关联的病状(例如，神经病变(例如，渐进性神经病变)、肝细胞癌)的风险。此外，在此提供的方法可以用于降低一种或多种卟啉前体、卟啉和/或相关卟啉产物或代谢物的水平。卟啉前体或卟啉的水平可以在任何生物样本中测得，例如像，尿、血液、粪便、脑脊髓液、或组织样品。该样本可以存在于受试者体内或可以从该受试者获得或提取。在一些实施例中，卟啉症是AIP，并且PBG和/或ALA的水平是下降了的。在一些实施例中，卟啉产物或代谢物是卟吩胆色素、胆色素原、或尿卟啉。卟啉产物或代谢物水平的降低可以使用本领域中已知的任何方法进行测量。例如，使用瓦-施二氏试验(Watson-Schwartz test)、离子交换层析法、或高效液相层析-质谱法，可以对尿或血浆中的PBG和/或ALA的水平进行评估。参见，例如，桑奈尔(Thunell)(1993)。
在此描述的方法还可以用于降低经受卟啉症(例如，急性肝性卟啉症，例如，AIP)或处于发展卟啉症的风险中的受试者中的长期升高的卟啉前体(例如，ALA和/或PBG)水平。用于评估卟啉前体的血浆和尿水平(例如，长期升高的水平)的方法包括，例如，HPLC-质谱法以及离子交换层析术。卟啉前体的水平可以表示为相对于另一种蛋白或化合物(例如，肌酸酐)的水平。参见，例如，弗洛德拉斯(Floderus，Y.)等人，临床化学(ClinicalChemistry)，52(4)：701-707，2006；沙赫(Sardh)等人，临床药代动力学(ClinicalPharmacokinetics)，46(4)：335-349，2007
如在此使用的，“诱发因素”指的是可以诱导与卟啉症相关联的一种或多种症状的急性发作的一种内源或外源因素。诱发因素包括禁食(或其他形式的减少的或不充分的热量摄入，归因于速成节食、远距离运动等)、代谢应力(例如，感染、手术、国际航空旅行以及心理应激)、内源激素(例如，黄体酮)、吸烟、脂溶性异质化学品(包括，例如，存在于烟草烟雾中的化学品、某些处方药、有机溶剂、杀生物剂、酒精饮料中的组分)、内分泌物因素(例如，生殖激素(女性在经期前可能经历恶化)、合成雌激素类、黄体酮、促排卵药物、以及激素替代疗法)。参见，例如，桑奈尔(Thunell)(1993)。常见诱发因素包括细胞色素P450，包括药物和苯巴比妥。
与卟啉症相关联的症状可以包括腹痛或冷烫、头痛、由神经系统异常引起的后果、以及导致皮肤发疹、发疱和瘢痕(光照性皮炎)的光过敏。在某些实施例中，卟啉症是AIP。AIP症状包括胃肠道症状(例如，严重和较轻的局部腹痛、恶心/呕吐、便秘、腹泻、肠梗阻)，泌尿症状(排尿困难、尿潴留/失禁、或小便黄赤)，神经性症状(例如，感觉神经病变、运动神经病变(例如，影响脑神经和/或导致上臂或下肢无力)，发作，神经性疼痛，渐进性神经病变，头痛，神经精神症状(例如，精神错乱、焦虑、激动、幻觉、癔病、谵妄、冷漠、抑郁、恐怖症、精神病、失眠、嗜睡、昏迷)，自主神经系统牵连(例如导致心血管症状，像心动过速、高血压、和/或心率失常，连同其他症状，例如，升高的循环的儿茶酚胺水平、显汗、坐立不安、和/或震颤)，脱水，以及电解质异常。
在一些实施例中，靶向ALAS1的iRNA是与可以用于减轻上述症状中的一种或多种的另一种治疗一起给予的(例如，之前、之后、或同时)。例如，像可以使用麻醉性镇痛药治疗腹痛，像可以使用抗-发作药物治疗发作，像可以使用酚噻嗪治疗恶心/呕吐，并且像可以使用β-阻断剂治疗心动过速/高血压。
术语“降低”(或“增加”)意思是指一个可测量的变化，例如，统计学显著的变化。该变化可以是，例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更高变化(例如，降低(或增加)，这相对于参比值，例如，未提供iRNA情况下的参比)。
本发明进一步涉及iRNA或其药物组合物的用途例如，用于与其他药物和/或其他治疗方法组合治疗与ALAS1表达相关的失调，例如，与已知的药物和/或已知的治疗方法组合，例如像当前使用以用于治疗失调的那些。在一个实施例中，iRNA或其药物组合物可以连同血红素产品(例如，如在此所述的氯血红素、精氨酸血红素、或血红素白蛋白)和/或连同静脉内葡萄糖输注一起给予。在一些实施例中，预防性地使用iRNA或其药物组合物，例如，以预防或改善急性卟啉症的预期发作的症状。该预防性使用的时间可以根据受试者暴露或预期暴露于诱发因素的情况进行确定。如在此描述的，诱发因素可以是已知促成急性发作的任何内源或外源因素。例如，经前期是内源诱发因素，而细胞色素P450诱导药物是外源诱发因素。
用于治疗与ALAS1表达相关的失调(例如，卟啉症像AIP)的有效量取决于待治疗的失调的类型、症状的严重性、接受治疗的受试者、该受试者的性别、年龄和总体健康状况、给予模式等。对于任意给定情况，使用常规实验，本领域的普通技术人员可以确定一个适当的“有效量”。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测治疗或预防效果，这在本领域内的普通技术人员的能力范围之内。结合靶向ALAS1的iRNA或其药物组合物的给予，“有效对抗”与ALAS1表达相关的失调是指以临床适当的方式给予以导致有益效果，例如，针对个体患者或针对至少一部分患者，例如，统计学上显著部分的患者。有益效果包括，例如，症状的预防或减少或其他效果。例如，有益效果包括，例如，改进症状(例如，降低严重性或频率)，降低发作的严重性或频率，降低发展相关疾病的风险(例如，神经病变(例如，渐进性神经病变)、肝细胞癌)，改进的诱发因素耐受能力，改进的生命质量，降低ALAS1表达，降低卟啉或卟啉前体(例如，ALA和/或PBG)的水平(例如，血浆或尿水平)或其他通常被熟悉具体失调类型的治疗的医师认为是积极的效果。
当存在改进时，例如，一种或多种疾病状态参数的统计学上显著的改进，或症状不能恶化或发展(否则这些症状将是所预期的)，则治疗或预防效果是明显的。作为一个实例，疾病可测量参数中的至少10％的有利改变，例如，至少20％、30％、40％、50％或更多可以表示有效的治疗。也可以使用如本领域已知的给定疾病的实验动物模型，判定给定diRNA剂或这种药物的制剂的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标记(例如血浆或尿ALA或PBG)或症状的统计学上显著的降低时，证实了治疗效力。
患者可以被给予治疗量的iRNA。该治疗量可以是，例如，0.05-50mg/kg。例如，该治疗量可以是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、或2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50mg/kg dsRNA。
在一些实施例中，iRNA被配制为一种脂质配制品，例如，如在此所述的LNP配制品。在一些此类实施例中，该治疗量是0.05-5mg/kg，例如，0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、或5.0mg/kg dsRNA。在一些实施例中，静脉内给予脂质配制品，例如，LNP配制品。
在一些实施例中，通过经一段时间的静脉内输注来给予iRNA，例如，经5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、或25分钟的时间。
在一些实施例中，iRNA处于如在此所述的GalNAc共轭物的形式。在一些此类实施例中，治疗量是0.5-50mg，例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、或50mg/kg dsRNA。在一些实施例中，GalNAc共轭物是皮下给予的。
在一些实施例中，重复进行该给予，例如，定期地，像每天、两周(即，每两周)一次持续一个月、两个月、三个月、四个月或更久。在初始治疗方案之后，可以将这些治疗以一个频繁度更低的基础来进行给予。例如，两周一次持续三个月的给予之后，可以每个月一次进行重复给予，持续六个月或一年或更久。
在一些实施例中，iRNA剂是以两个或更多个剂量给予的。在一些实施例中后续剂量的数或量取决于所希望的效果的实现，例如，ALAS基因的压制，卟啉或卟啉前体(例如，ALA和/或PBG)水平的降低，或治疗性或预防性效果的实现，例如，与卟啉症相关联的一种或多种症状(例如，疼痛，例如，神经性疼痛)的减少或预防，和/或预防发作或降低与卟啉症相关联的发作的频率和/或严重性。
在一些实施例中，iRNA剂是根据一个时间表给予的。例如，可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、或每周五次给予该iRNA剂。在一些实施例中，该时间表涉及定期间隔的给予，例如，每小时、每四小时、每六小时、每八小时、每十二小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每两周、或每月一次。在实施例中，iRNA剂是每周或每两周一次给予的，以实现所希望的效果，例如，降低ALA和/或PBG的水平，减少疼痛、和/或预防急性发作。
在实施例中，该时间表涉及密集的给予，随后是一个较长的时期，在该时期过程中，不给予该试剂。例如，该时间表可以涉及在相对短时期内给予的初始剂量设置(例如，约每6小时、约每12小时、约每24小时、约每48小时、或约每72小时)，随后是一个较长的时期，(例如，约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、或约8周)，在该时期过程中，不给予iRNA剂。在一个实施例中，iRNA剂初始地按小时给予，并且随后以一个较长的时间间隔给予(例如，每天、每周、每两周、或每月一次)。在另一个实施例中，iRNA剂初始地按天给予，并且随后以一个较长的时间间隔给予(例如，每周、每两周、或每月一次)。在某些实施例中，该较长的时间间隔随着时间增加或基于所希望的效果的实现来确定。在一个具体的实施例中，iRNA剂在急性发作期间每天一次地给予，随后是每周给予(从给予的第八天开始)。在另一个具体的实施例中，iRNA剂在第一周期间每两天一次地给予，随后是每周给予(从给予的第八天开始)。
在一个实施例中，给予iRNA剂以预防或降低复发性发作的严重性或频率，例如，与诱发因素相关联的循环发作。在一些实施例中，诱发因素是月经周期。在一些实施例中，重复给予iRNA，例如，每隔一定间隔地给予以预防或降低复发性发作的严重性或频率，例如，与诱发因素(例如，月经周期，例如，月经周期的一个具体时期，例如，黄体期)相关联的循环发作。在一些实施例中，在月经周期的一个具体时期过程中、或基于接受治疗的患者的激素水平(例如，基于与月经周期的一个具体时期相关联的激素水平)给予iRNA。在一些实施例中，在月经周期的一个或多个具体天内，例如，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天或第28天(或对于具有较长月经周期的受试者而言随后的天内)给予iRNA。在一些实施例中，在黄体期过程中，例如，在月经周期的第14-28天之间的一天或多天内(或在具有超过28天的月经周期的受试者中，随后的天内)给予iRNA。在一些实施例中，对受试者的排卵进行评估(例如，使用血液或尿检，检测与排卵相关联的激素，例如，LH)并且在排卵后以预定的时间间隔给予iRNA。在一些实施例中，在排卵之后立即给予iRNA。在一些实施例中，在排卵1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18天之后给予iRNA。可任选地重复这些时间表中的任一个，持续一个或多个迭代次数。迭代数目可以取决于所希望的效果的实现，例如，ALAS1基因的压制和/或治疗性或预防性效果的实现，例如，与卟啉症相关联的一种或多种症状的减少或预防、降低与卟啉症相关联的发作的频率。
在一些实施例中，给予iRNA剂的初始剂量并对ALA或PBG水平进行检验，例如，给予初始剂量1-48小时，例如，2、4、8、12、或24小时后。在一些实施例中，如果ALA和/或PBG的水平得以降低(例如，至实现预定的降低，例如，正常)，和/或如果与卟啉症相关联的症状(例如，疼痛)得以改进(例如，以使得患者是无症状的)，不给予另外的剂量，而如果ALA和/或PBG的水平未降低(例如，未实现预定的降低，例如，未正常化)，给予ALA或PBG的另外的剂量。在一些实施例中，初始剂量12、24、36、48、60、或72小时后给予另外的剂量。在一些实施例中，如果初始剂量未有效降低ALA和/或PBG的水平，修改另外的剂量，例如，增加以实现ALA或PBG水平的所希望的降低(例如，预定的降低，例如，常态化)。
在一些实施例中，预定下降是降低至少10％、20％、30％、40％、或50％。在一些实施例中，预定下降是有效预防或改善症状，例如，疼痛、前驱症状、或复发性发作的一个下降。
在一些实施例中，预定下降是至少1、2、3、或更多个标准差的一个下降，其中该标准差是基于来自参比样本，例如，如在此所述的参比样本的值确定的。
在一些实施例中，预定下降是这样一个下降，该下降使卟啉或卟啉前体水平达到小于，或达到小于或等于参比值(例如，如在此所述的参比值)的一个水平。
如在此使用的，ALA或PBG水平的“正常”(或“正常的”或“正常化的”水平)是指ALA、或PBG、或两者的一个水平(例如，尿和/或血浆水平)，该水平在针对健康个体的预期范围之内，该个体是无症状的个体(例如，不经历疼痛和/或不经受神经病变的个体)，或不具有与卟啉症相关联的突变的个体。例如，在一些实施例中，正常化的水平是在正常平均值的两个标准差内。在一些实施例中，正常化的水平是在正常参比限制内，例如，在针对适当对照样本的95％置信区间内，例如，健康个体或不携带与卟啉症相关联的基因突变的个体的样本。在一些实施例中，每隔一段时间对受试者的ALA和/或PBG水平(例如，尿和/或血浆ALA和/或PBG水平)进行监控，当该水平增加超过参比值时，给予另外剂量的iRNA剂。
iRNA的施用可以降低例如患者的细胞、组织、血液、尿或其他区室中的ALAS1 mRNA或蛋白质水平至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。iRNA的给予可以降低与ALAS1基因表达相关联的产物的水平，例如，一种或多种卟啉或卟啉前体的水平(例如，ALA和/或PBG的水平)。iRNA剂的给予还可以抑制或预防ALAS1 mRNA或蛋白水平在AIP急性发作期间的上调。
在给予全剂量iRNA之前，可以对患者给予一个较小剂量，例如5％输注剂量，并监控不良作用，例如，过敏反应、或升高的脂质水平或血压。在另一个实例中，可以针对不希望的效果对患者进行监控。
用于调制ALAS1基因表达的方法
在又另一个方面，本发明提供了用于调制(例如，抑制或激活)ALAS1基因，例如，在细胞中或受试者中的表达的方法。在一些实施例中，细胞是离体、体外、或体内的。在一些实施例中，细胞是类红细胞或肝上皮实质细胞。在一些实施例中，细胞是在受试者(例如，哺乳动物，例如像人类)中的。在一些实施例中，受试者(例如，人类)处于与ALAS1表达相关的疾病的风险中，或被诊断为患有该疾病，如上所述。
在一个实施例中，该方法包括以一个有效降低细胞中ALAS1基因的表达的量将该细胞与如在此所述的iRNA相接触。如在此使用的，“接触”包括直接接触一个细胞，连同间接接触一个细胞。例如，当向受试者给予(例如，静脉内或皮下地)包含iRNA的组合物时，该受试者体内的细胞(例如，类红细胞或肝脏细胞像肝上皮实质细胞)可以是被接触的。
基于ALAS1 mRNA的表达水平、ALAS1蛋白、或与ALAS1基因表达水平功能性相联系的一个参数的水平(例如，卟啉的水平或与卟啉症相关的症状的发病率或严重性)，可以对ALAS1基因的表达进行评估。在一些实施例中，ALAS1的表达被抑制至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。在一些实施例中，iRNA具有以下范围内的IC50：0.001-0.01nM、0.001-0.10nM、0.001-1.0nM、0.001-10nM、0.01-0.05nM、0.01-0.50nM、0.02-0.60nM、0.01-1.0nM、0.01-1.5nM、0.01-10nM。IC50值可以相对于适当的对照值被归一化，例如，非靶向性iRNA的IC50。
在一些实施例中，该方法包括向该细胞中引入在此描述的iRNA并且维持该细胞一段时间，该时间足以获得ALAS1基因的mRNA转录本的降解，由此抑制该细胞中的ALAS1基因的表达。
在一个实施例中，该方法包括向哺乳动物给予在此描述的一种组合物，例如，包括靶向ALAS1的iRNA的组合物，以使得靶标ALAS1基因的表达被降低，如持续一个延长的时间，例如，至少两天、三天、四天或更多天，例如，一周、两周、三周、或四周或更久。在一些实施例中，在第一次给予1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、或24小时内，ALAS1表达下降是可检出的。
在另一个实施例中，该方法包括向哺乳动物给予如在此所述的组合物以使得靶标ALAS1基因的表达与未处理的动物相比，增加例如，至少10％。在一些实施例中，超过一个延长的持续时间发生ALAS1的激活，例如，至少两天、三天、四天或更多天，例如，一周、两周、三周、或四周或更久。不希望受理论约束，通过稳定ALAS1mRNA转录本，与基因组中启动子相互作用和/或抑制ALAS1表达抑制剂，iRNA可以激活ALAS1表达。
对本发明中表征的方法和组合物有用的iRNA特异性靶向ALAS1基因的RNA(初级或经加工的)。用于使用iRNA抑制ALAS1基因的表达的组合物和方法可以如在本文中其他地方描述的进行制备和执行。
在一个实施例中，该方法包括给予包含iRNA的组合物，其中该iRNA包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列与待治疗哺乳动物ALAS1基因的RNA转录本的至少一部分互补。当有待治疗的有机体是哺乳动物(比如人类)时，该组合物可以通过本领域内已知的任何手段进行给予，这些手段包括但不限于经口、腹膜内、或肠胃外途径(包括颅内(例如，心室内、实质内、鞘内)、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气溶剂)、经鼻、直肠以及局部(包括口腔与舌下)给予)。
在某些实施例中，通过静脉内输注或注射给予这些组合物。在一些此类实施例中，这些组合物包括一种脂质配制的siRNA(例如，LNP配制品，像LNP11制剂)，以用于静脉内输注。在具体实施例中，此类组合物可以用于治疗卟啉症的急性发作和/或用于预防(例如，降低发作的严重性或频率)。
在其他实施例中，皮下给予这些组合物。在一些此类实施例中，这些组合物包括共轭至GalNAc配体的iRNA。在具体实施例中，此类组合物可以用于治疗卟啉症的急性发作或用于预防(例如，降低发作的严重性或频率)。
用于降低卟啉或卟啉前体水平的方法
在另一个方面中，本发明提供了一种用于降低卟啉或卟啉前体，例如，在细胞中或受试者中的水平的方法。
在一些实施例中，细胞是离体(ex vivo)、体外(in vitro)、或体内(in vivo)的。在一些实施例中，细胞是类红细胞或肝上皮实质细胞。在一些实施例中，细胞是肝上皮实质细胞。在一些实施例中，细胞是在受试者(例如，哺乳动物，例如像人类)中的。
在一些实施例中，受试者(例如，人类)处于卟啉症的风险中，或被诊断为患有卟啉症，如在此所述。在一些实施例中，该方法有效治疗如在此所述的卟啉症(例如，通过改善与卟啉症相关联的一种或多种症状，降低与卟啉症相关联发作的频率，降低一旦暴露于诱发因素将发生的、与卟啉症相关联的一种或多种症状发作的可能性，或降低发展与卟啉症相关联的病状(例如，神经病变(例如，渐进性神经病变)、肝细胞癌)的风险。在一个实施例中，该方法包括以一个足以降低该细胞或另一个相关细胞或细胞组或该受试者中卟啉或卟啉前体(例如，ALA或PBG)的量将该细胞与如在此所述的RNAi相接触。如在此使用的，“接触”包括直接接触一个细胞，连同间接接触一个细胞。例如，当向受试者给予(例如，静脉内或皮下地)包含RNAi的组合物时，该受试者体内的细胞(例如，类红细胞或肝脏细胞像肝上皮实质细胞)可以是被接触的。如在此使用的，“另一个相关细胞或细胞组”包括其中卟啉或卟啉前体的水平由于该接触而下降的任何细胞或细胞组。例如，该细胞可以是受试者体内存在的组织的一部分(例如，受试者体内存在的肝脏细胞)，并且将该受试者体内的细胞与RNAi相接触(例如，接触受试者体内存在的一个或多个肝脏细胞)可以导致另一个相关细胞或细胞组(例如，受试者的神经细胞)或该受试者的组织或体液中(例如，该受试者的尿、血液、血浆、或脑脊髓液中)卟啉或卟啉前体水平的降低。
在一些实施例中，卟啉或卟啉前体是选自下组，该组由以下各项组成：δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、胆色素原(PBG)、羟甲基胆素(HMB)、尿卟啉原III、粪卟啉原III、原卟啉原IX、以及原卟啉IX。在一些实施例中，卟啉前体是ALA。在一些实施例中，卟啉前体是PBG。在一些实施例中，该方法降低ALA和PBG的水平。卟啉或卟啉前体的水平可以如在此所述的以及如本领域中已知的进行测量。
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明中表征的iRNA和方法，然而现在描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式以其全文结合。在矛盾的情况下，本发明说明书，包括定义，将占据主导。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。
实例
实例1.siRNA合成
试剂来源
当本文没有专门给出试剂来源时，这种试剂可以从分子生物学试剂的任何供应商获得，其质量/纯度标准符合分子生物学应用。
寡核苷酸合成。
全部寡核苷酸在AKTAoligopilot合成仪上合成。以下各项用于寡核苷酸合成：可商购的可控孔度玻璃固相支持体(dT-CPG，
Figure BDA0001787260730001731
原初合成公司(Prime Synthesis))以及具有标准保护基的RNA亚磷酰胺，5’-O-二甲氧三苯甲基N6-苯甲酰基-2’-叔-丁基二甲基甲硅烷基二甲基甲硅烷基-腺苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺、5’-O-二甲氧三苯甲基-N4-乙酰基-2’-叔-丁基二甲基甲硅烷基-胞苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺、5’-O-二甲氧三苯甲基-N2--异丁基-2’-叔-丁基二甲基甲硅烷基-鸟苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺、以及5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-叔-丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺(皮尔斯核酸技术公司(Pierce NucleicAcids Technologies))。2’-F亚磷酰胺、5’-O-二甲氧三苯甲基-N4-乙酰基-2’-氟-胞苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺以及5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-氟-尿苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺购自普洛麦格公司(Promega)。全部亚磷酰胺以乙腈(CH3CN)中的0.2M浓度使用，除了以10％THF/ANC(v/v)中的0.2M浓度使用的鸟苷之外。使用16分钟偶联/再循环时间。活化剂是5-乙基硫代四唑(0.75M，美国国际化学品公司(American International Chemicals))；对于PO-氧化，使用碘/水/吡啶并且对于PS-氧化，使用2，6-卢剔啶/ACN(1∶1v/v)中的PADS(2％)。
3′-配体共轭的链使用含有相应配体的固相支持物合成。例如，从羟脯氨醇-胆固醇亚磷酰胺实施在序列中引入胆固醇单元。胆固醇经6-氨基己酸酯键系至反式-4-羟脯氨醇，以获得羟脯氨醇-胆固醇部分。5′-末端Cy-3和Cy-5.5(荧光团)标记的iRNA从购自生物研究技术公司(Biosearch Technologies)的相应Quasar-570(Cy-3)合成。通过使用适当保护的配体-亚磷酰胺结构单元实现配体与5′-末端和或内部位置的共轭。在活化剂5-(乙基硫代)-1H-四唑存在下，延长的15分钟使无水CH3CN中的0.1M亚磷酰胺溶液偶联至固态支持物结合的寡核苷酸。使用标准碘-水如报道(1)那样，实施核苷酸间亚磷酸酯氧化成磷酸酯，或通过用叔-丁基过氧化氢/乙腈/水(10∶87∶3)以10分钟氧化等待时间共轭寡核苷酸。通过使用硫转移试剂如DDTT(购自AM Chemicals)、PADS和或Beaucage试剂将亚磷酸酯氧化成硫代磷酸酯而引入硫代磷酸酯。自行合成胆固醇亚磷酰胺并且以二氯甲烷中的0.1M浓度使用。胆固醇亚磷酰胺的偶联时间是16分钟。
脱保护I(核碱基脱保护)
在完成合成后，将支持物转移至100mL玻璃瓶(VWR)。从支持物切下寡核苷酸，同时用80mL乙醇氨的混合物[氨∶乙醇(3∶1)]在55℃持续6.5小时使得碱基和磷酸酯基团脱保护。将瓶在冰上短暂冷却并且随后将乙醇-氨混合物过滤至一只新250-mL瓶。CPG用2x 40mL份的乙醇/水(1∶1v/v)洗涤。随后通过旋转蒸发器将混合物的体积缩减至约30mL。随后混合物在干冰上冷冻并在离心真空浓缩机上在真空下干燥。
脱保护II(2′-TBDMS基团的移除)
将干燥的残余物重悬于26mL的三乙胺、三乙胺三氟化氢(TEA·3HF)或吡啶-HF和DMSO(3∶4∶6)中并且在60℃加热90分钟以除去在2′位置的叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)。反应随后用50mL的20mM乙酸钠淬灭并且调节pH至6.5。将寡核苷酸贮存在制冷器中直至纯化。
分析
在纯化之前通过高效液相层析(HPLC)分析寡核苷酸，并且缓冲溶液和柱的选择取决于序列和或共轭的配体的性质。
HPLC纯化
通过反相制备型HPLC纯化配体共轭的寡核苷酸。通过阴离子-交换HPLC在自行装填的TSK凝胶柱上纯化未共轭的寡核苷酸。缓冲液是10％CH3CN中的20mM磷酸钠(pH 8.5)(缓冲液A)和10％CH3CN，1M NaBr中的20mM磷酸钠(pH 8.5)(缓冲液B)。将含有全长寡核苷酸的级分池化、脱盐并冻干。将大约0.15OD的脱盐寡核苷酸稀释于水中至150μL，并随后吸取至CGE和LC/MS分析专用小瓶中。随后通过LC-ESMS和CGE分析化合物。
siRNA制备
对于siRNA的一般制备，将等摩尔量的有义链和反义链在1xPBS中在95℃加热5分钟并且缓慢冷却至室温。通过HPLC分析证实双链体的完整性。
下文使用标准命名并且具体是表1的缩写描述核酸序列。
表1：核酸序列描述中使用的核苷酸单体的缩写。应当理解在寡核苷酸中存在时这些单体是由5′-3′-磷酸二酯键相互连接。
Figure BDA0001787260730001761
Figure BDA0001787260730001771
Figure BDA0001787260730001781
1L96的化学结构如下：
Figure BDA0001787260730001782
实例2.ALAS1 siRNA设计与合成
实验方法
生物信息学
转录本
进行siRNA设计以鉴别对NCBI基因库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中注释的人类、恒河猴(rhesus或Macaca mulatta)、小鼠、与大鼠ALAS1转录本进行靶向的siRNA。设计使用了以下来自NCBI RefSeq集的转录本：人类-NM_000688.4(参见图3)，NM_199166.1；恒河猴-XM_001090440.2，XM_001090675.2；小鼠-NM_020559.2；大鼠-NM_024484.2.由于高等灵长类动物/啮齿动物序列趋异，以若干个单独的批次设计siRNA双链体，包括但不限于包含匹配以下各项的双链体的批次：仅人类和啮齿动物转录本；仅人类、啮齿动物、小鼠和大鼠转录本；以及仅小鼠和大鼠转录本。设计的大多数siRNA双链体与每一设计批次(见上文)中所考虑的、列出的人类转录本以及其他物种的转录本具有100％一致性。在一些情况中，(参见表8)当反义链：靶标mRNA互补碱基对是GC或CG对时，允许在第一反义(最后有义)位置处的双链体与mRNA靶标之间的错配。在这些情况下，双链体被设计为在第一反义：最后有义对处具有UA或AU对。因此这些双链体维持互补性但是相对于靶标是错配的(U∶C，U∶G，A∶C，或A∶G)。这些“UA-交换”双链体中的十八个被设计为人类/恒河猴/小鼠/大鼠集合的一部分(参见表8中的双链体，其中“C19U”、“G19U”、“C19A”、或“G19A”在位置栏中标注)。
siRNA设计、特异性以及效果预测
从每一序列预测所有可能的19mer的预测特异性。然后对缺少长于7个核苷酸的重复的候选19mer进行选择。使用测试脚本‘BruteForce.py’中实施的详尽的穷尽蛮力(“brute-force”)算法，将该1510个候选人类/恒河猴，114个人类/恒河猴/小鼠/大鼠、以及717个小鼠/大鼠siRNA用于针对适当转录组(定义为人类、恒河猴、狗、小鼠、或大鼠NCBIRefseq组中NM_和XM_记录的组)的全面搜索中。该脚本接下来解析该转录本-寡核苷酸比对，以产生基于该siRNA和任何潜在的“脱靶”转录本之间的错配的位置和数目的分数。对脱靶分数进行加权，以强调从该分子的5′末端开始，在位置2-9处，siRNA“种子”区域中的不同。通过求和单个错配得分，来自蛮力搜索(brute-force search)的每个寡转录本对被赋予了错配分数；在位置2-9的错配被计数为2.8，在切割位点位置10-11的错配被计数为1.2，并且在区域12-19中的错配被计数为1.0。通过对衍生自每个寡核苷酸的3个不同的种子衍生的六聚物的七聚物和八聚物的频率做比较进行另外的脱靶预测。使用从相对于5’起点开始的位置2-7的六聚物来产生2个七聚物和1个八聚物。我们通过添加3’A到六聚物产生‘七聚物1’；通过添加5’A到六聚物产生七聚物2；通过添加A到该六聚物的5’和3’末端产生八聚物。预计算了人类、恒河猴、小鼠或大鼠3’UTRome中八聚物与七聚物的频率(定义为来自NCBIRefseq数据库的转录组的子序列，其中编码区域的末端‘CDS’是清楚定义的)。使用来自八聚物频率范围的中值，将八聚物的频率归一化为七聚物的频率。然后通过计算((3X归一化的八聚物计数)+(2X七聚物2计数)+(1X七聚物1计数))之和，计算‘mirSeedScore’。
两种siRNA链被指定为根据计算分数的特异性分类：得分高于3为高特异性的、等于3为特异性的，并且在2.2与2.8之间为中等特异性的。我们通过该反义链的特异性进行分类。然后我们选择双链体，其反义寡核苷酸在第一位置缺乏GC，在位置13和14两者缺乏G，并且在种子区域具有3个或更多个Us或As(具有高预测效力的双链体的特征)
通过在3’方向上延伸反义19mer 4个另外的核苷酸(保留与靶标转录本的完美的互补性)，设计在有义链和反义链上分别是21和23个核苷酸长的候选GalNac-共轭双链体。将该有义链指定为反义23mer的第一个21核苷酸的反向互补体。选择全部23个核苷酸与所有所选物种的转录本维持完美匹配的双链体。
siRNA序列选择
来自人类/恒河猴的90个有义和90个反义，来自人类/恒河猴/小鼠/小鼠/大鼠的40个有义和40个反义，以及来自小鼠/大鼠siRNA19mer寡核苷酸的40个有义和40个反义全部合成并形成双链体。合成来自人类/恒河猴21/23mer寡核苷酸的总计45个有义和45个反义以获得45GalNac-共轭双链体。
经修饰的双链体的有义链和反义链的序列示于表2中，并且未经修饰的双链体的有义链和反义链的序列示于表3中。
ALAS1序列的合成
在MerMade 192合成仪上以1或0.2umol的规模合成ALAS1序列。单链用2’O-甲基修饰制造，用于使用转染试剂进行体外筛选。用采用21-23mer设计的、在有义链上包含2’F和2’-O-甲基修饰的序列制造3’GalNAc共轭物，以用于在细胞中自由摄取。对于所列出的全部21mer序列，使用如下详述的‘内发光(endolight)’化学。
·有义链中的全部嘧啶(胞嘧啶和尿苷)均含有2′-O-甲基碱基(2′O-甲基C和2′-O-甲基U)
·在反义链中，与核糖A核苷毗邻(指向5′位置)的嘧啶被它们的相应2-O-甲基核苷替换
·在有义序列和反义序列的3′末端均引入一个双碱基dTsdT延长物
·序列文件被转换成文本文件，以便使其对在MerMade192合成软件中加载具有相容性
对于GalNAc共轭的有义链和互补反义序列，将2’F和其他修饰的核苷与具有2’O-甲基核苷的核糖组合引入。在GalNAc修饰的CPG支持物上进行有义链的合成，并且在通用支持物修饰的CPG上进行反义序列的合成。
合成、切割与去保护：
使用亚磷酰胺化学，使用固相支持的寡核苷酸合成法合成ALAS1序列。对于21mer内发光(endolight)序列，使用脱氧胸苷CPG作为固相支持物，而对于GalNAc共轭物，对于有义链使用GalNAc固相支持物并且对于反义链使用通用CPG。
在96孔板中以1或0.2um的规模进行以上序列的合成。酰亚胺溶液按0.1M浓度制备并且可以乙基硫代四唑(乙腈中的0.6M)作为活化剂。
在96孔板中进行合成序列的切割与去保护，在第一步骤中使用甲胺并且在第二步骤使用氟化物试剂。对于含GalNAc和2’F核苷序列，对去保护条件进行修改。使用丙酮∶乙醇(80∶20)混合物对切割与去保护后序列进行沉淀并且将沉淀物重悬浮在0.2M乙酸钠缓冲液中。将来自每一序列的样品通过LC-MS进行分析以确证一致性、UV用于定量并且通过IEX层析选定样品集以确定纯度。
纯化与脱盐：
沉淀ALAS1序列并使用葡聚糖凝胶柱在AKTA纯化系统上(AKTA Purifier system)进行纯化。ALAS1ess在环境温度下运行。样品注射与收集在96孔板(孔深1.8mL)中进行。在洗脱液中收集到对应于全长度序列的一个单一峰。将脱盐的ALAS1序列针对浓度(通过在A260处的UV测量)以及纯度(通过离子交换HPLC)进行分析。然后将这些互补单链以1∶1化学计量比率进行组合以形成siRNA双链体。
Figure BDA0001787260730001831
Figure BDA0001787260730001841
Figure BDA0001787260730001851
Figure BDA0001787260730001861
Figure BDA0001787260730001871
Figure BDA0001787260730001881
Figure BDA0001787260730001891
Figure BDA0001787260730001901
Figure BDA0001787260730001911
Figure BDA0001787260730001921
Figure BDA0001787260730001931
实例3.针对ALAS1敲低活性，对ALAS1 siRNA双链体进行体外筛选。
针对体外敲低ALAS1表达的能力对ALAS1 siRNA双链体进行筛选。
体外筛选
细胞培养和转染
将Hep3B细胞(ATCC公司，马纳萨斯，弗吉尼亚州(Manassas，VA))在37℃在5％CO2的气氛中在MEM(ATCC公司)(补充有10％FBS)中生长至接近融合，然后通过胰酶消化从该板释放。转染通过以下进行：将14.8μl的Opti-MEM加每孔0.2μl的Lipofectamine RNAiMax(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，产品目录号13778-150)与每孔5μl的siRNA双链体添加至96孔板并且在室温孵育15分钟。然后将包含约2x 104Hep3B细胞的80μl的完全生长培养基添加至该siRNA混合物。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时或120小时。单剂量实验以10nM和0.1nM双链体终浓度进行并且剂量响应实验以10、1.67、0.27、0.046、0.0077、0.0013、0.00021、0.00004nM双链体终浓度进行。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰公司，部件#：610-12)的总RNA分离
收获细胞并且在150μl裂解/结合缓冲液中进行裂解，然后使用EppendorfThermomixer在850rpm混合5分钟(混合速度在整个过程中相同)。将十微升磁珠与80μl裂解/结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁性支座捕获磁珠并且将该上清液除去而不扰动这些珠子。在移出上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的珠子并且混合5分钟。在除去上清液后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液A(Wash Buffer A)洗涤2次并且混合1分钟。珠子再次被捕获并且去除上清液。然后将珠子用150μl洗涤缓冲液B(Wash Buffer B)进行洗涤，捕获，并且除上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液(Elution Buffer)进行洗涤、捕获并且除上清液。允许珠子干燥持续2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液(Elution Buffer)并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。去除40μl的上清液并且添加至另一96孔板中。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems))， 福斯特城(Foster City)，加利福尼亚州，Cat#4368813)的cDNA合成
将母混合物(每一反应：2μl 10×缓冲液、0.8μl 25X dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μl R Nase抑制剂以及3.2μl H2O)添加至10μl总RNA中。使用Bio-Rad C-1000或S-1000热循环仪(大力神公司，CA)通过以下步骤产生cDNA：25℃10min、37℃120min、85℃5秒、4℃保持。
实时PCR
将2μl的cDNA添加至母混合物中，该母混合物在一个384孔板(罗氏公司(Roche)产品目录号04887301001)中每一孔包含0.5μl GAPDH TaqMan探针(应用生物系统公司(Applied Biosystems)产品目录号4326317E)、0.5μl ALAS1 TaqMan探针(应用生物系统公司，产品目录号Hs00167441_m1)以及5μl Lightcycler 480探针母混合物(罗氏公司，产品目录号#04887301001)。实时PCR在罗氏LC480实时PCR系统(罗氏公司)上使用ΔΔCt(RQ)测定而完成。将每一双链体在两个独立的转染(各自具有两个生物学重复)中进行测试并且每一转染以一式两份进行测定，除非在总结表中另外指出。
为了计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析实时数据，并且将这些数据归一化为利用以下这样的细胞而进行的测定：这些细胞是转染了10nM AD-1955的细胞，或是模拟转染的细胞。使用4参数拟合模型使用XLFit计算IC50，并且将IC50归一化为在相同剂量范围内或至其自身最低剂量转染了AD-1955的细胞或原初细胞(
Figure BDA0001787260730001951
Figure BDA0001787260730001952
)。
通过ALAS1 siRNA双链体体外敲低内源ALAS1表达
表4示例了在Hep3B细胞中通过ALAS1修饰的siRNA双链体进行的ALAS1敲低(参见表2)。沉默表示为相对于阴性(萤虫素酶)对照siRNA AD-1955，剩余的RNA信使的分数。每个siRNA的10nM或0.1nM转染之后，如上所述生成数据。使用ALAS1 TaqMan探针Hs00167441_ml运行qPCR。
表4：ALAS1 siRNA转染之后，Hep3B细胞中的ALAS1表达
Figure BDA0001787260730001961
Figure BDA0001787260730001971
Figure BDA0001787260730001981
选择的ALAS1 siRNA双链体在体外筛选中的IC50
表5示例了选择的ALAS1 siRNA双链体的IC50，由内源性表达的ALAS1在Hep3B细胞系中通过ALAS1修饰的siRNA双链体进行的敲低确定(参见表2)。在每个siRNA双链体感染24或120小时后，如上所述生成数据。ALAS1的沉默表示为相对于siRNA AD-1955(用作阴性对照的非靶向性siRNA)的剩余的mRNA信使的分数。使用来自重复进行的转染实验的数据以拟合单线，从而确定IC50。若干个双链体(例如，AD-53541.1、AD-53542.1、以及AD-53547.1)具有在24小时低至大约0.03nM的IC50。大多数双链体具有在24小时低于0.1nM的IC50(例如，AD-53534.1、AD-53536.1、AD-53540.1、AD-53541.1、AD-53542.1、AD-53547.1、AD-53548.1、AD-53550.1、AD-53552.1)，并且这些中的一些还具有在120小时低于0.1nM的IC50(例如，AD-53534.1、AD-53540.1、AD-53541.1、AD-53542.1、AD-53547.1、AD-53552.1)。
表5：归一化为AD-1955的、选择的ALAS1 siRNA双链体的IC50
Figure BDA0001787260730001991
实例4.使用配制为LNP的小鼠/大鼠ALAS1 siRNA的体内沉默
修饰的双链体AD-53558的序列示于下表6中。
Figure BDA0001787260730002001
这个双链体被配制为LNP11配制品(参见上表10)。该LNP-配制的AD-53558 siRNA在小鼠(N＝25只动物；每组5只动物)和大鼠(N＝20只动物；每组4只动物)中进行体内检验并进行确认以体内沉默ALAS1 mRNA。这些结果显示在图5和图6中。
图5显示了siRNA证实了小鼠内的剂量响应效应。当siRNA以1mg/kg给予时，小鼠ALAS1(mALAS1)mRNA表达被减少约78％；当siRNA以0.3mg/kg给予时，小鼠ALAS1 mRNA表达被减少约60％；并且当siRNA以0.1mg/kg给予时，小鼠ALAS1 mRNA表达被减少约49％。这些减少是相对于PBS对照表述的。如图5中所示的，还利用了AD-1955LUC对照。
同样地，图6显示了siRNA证实了大鼠内的剂量响应效应。当siRNA以1mg/kg给予时，ALAS1RNA表达被减少约70％；当siRNA以0.3mg/kg给予时，ALAS1 mRNA表达被减少约62％；并且当siRNA以0.1mg/kg给予时，ALAS1 mRNA表达被减少约34％。
还在小鼠中检验了沉默持久性(N＝15；每个时间点3只动物。结果示于图7中，该图显示AD-53558压制mALAS1 mRNA约80％，持续至少9天。至少约50％的压制持续至少14天。
实例5.ALAS1 siRNA在AIP动物模型中的效力
AD-53558 LNP11配制品(描述于上文实例中的小鼠/大鼠ALAS1 siRNA)的效果在AIP小鼠模型中进行了研究。PBGD敲除是不可行的(-/-，0％活性)。杂合的PBGD敲除小鼠(+/-，约50％活性)是可得的但是不具有全生物化学表型并且因此不重现人类疾病表型。因此，所研发的AIP小鼠模型是具有T1/T2等位基因的复合杂合子，包括T1(+/-)启动子破坏和T2(-/-)剪接位点变更。这些小鼠已经显示具有肝残留的PBGD活性，该活性是约30％的野生型水平，并且具有正常或略微升高的基线血浆ALA和PBG水平。已经发现这些小鼠在生命早期显现正常但是随着年龄增加变得略微变慢和共济失调。在六个月时，这些小鼠已经被记录为发展了病理检查方面的受损的运动协调和肌肉性能以及轴突变性。在年老的小鼠中，小鼠模型病理学研究显示轴突变性、受损的运动协调和肌肉性能。已经发现随着连续i.p.给予苯巴比妥，尿和血浆ALA以及PBG显著增加(参见林德贝格等人，(1996)、自然遗传学(Nature Genetics)，12：195-219以及林德贝格等人，(1999)临床研究杂志(Journal ofClinical Investigation)，103：1127-34)。通过肝脏中PBGD的AAV-介导的表达拯救小鼠(安田町(Yasuda)等人(2010)，分子医学(Molecular Medicine)，1∶17-22以及尤组(Unzu)等人(2011)，分子医学，2：243-50)。
在第1天，将小鼠通过i.v.注射给予1mg/kg ALAS1 siRNA(n＝5)或LUC AD-1955对照(n＝3)。给予三次苯巴比妥注射(在第2天、第3天和第4天每天1次注射)以诱导肝ALAS1以及卟啉前体、ALA和PBG。在第5天收集血浆和过夜尿样本并通过LC-MS测量代谢水平。在血浆中通过LC-MS测量代谢水平并且还在尿中对其进行了测量。在第1天，在第一次处理之前，测量代谢的基线水平。结果示于图8-12以及表12和13中。
图8和图9显示了以μM计的血浆ALA水平。基线ALA水平低，(n＝4)，并且苯巴比妥处理在对照LUC siRNA处理的动物中诱导了显著增加的血浆ALA水平(n＝3)。使用ALAS1siRNA进行的处理抑制血浆ALA的诱导(n＝5)，如在图8中所示的。在所研究的每个个体动物中，ALAS1 siRNA持续有效于阻断血浆ALA的诱导(参见图9)。这些研究表明在这一AIP动物模型中，ALAS1 siRNA处理有效预防与苯巴比妥-诱导的急性发作相关联的血浆ALA增加。
图10和图11显示了以μM计的血浆PBG水平。基线PBG水平低(n＝4)，并且苯巴比妥处理在对照LUC siRNA处理的动物中诱导了显著增加的血浆PBG水平(n＝3)。使用ALAS1siRNA进行的处理抑制血浆PBG的诱导(n＝5)，如在图10中所示的。在所研究的每个个体动物中，ALAS1 siRNA持续有效于阻断血浆PBG的诱导(参见图11)。这些研究表明在这一AIP动物模型中，ALAS1 siRNA处理有效预防与苯巴比妥-诱导的急性发作相关联的血浆PBG增加。
表12和13示出了在LUC siRNA(n＝2)对照(CTR，是指PBS缓冲液处理的动物，n＝1)以及ALAS1 siRNA(n＝5)处理的动物中，基线处和苯巴比妥处理后尿ALA和PBG水平。
表12：来自显示预防诱导的急性发作的个体小鼠的尿数据
Figure BDA0001787260730002031
PB代表苯巴比妥。A“+”表明给予苯巴比妥。
表13：平均尿数据
Figure BDA0001787260730002032
在LUC siRNA处理的小鼠(对照)中，苯巴比妥处理诱导强增加(约25-30倍增加)尿中ALA(超过基线水平约9-倍)以及PBG(超过基线水平约19-倍)，而这样的增加在ALAS1siRNA处理的小鼠中未观察到。因此，ALAS1 siRNA阻断苯巴比妥诱导的尿ALA和PBG的增加。这些结果与血浆测试值一致并且显示在这一AIP动物模型中，ALAS1 siRNA处理有效预防与苯巴比妥-诱导的急性发作相关联的尿代谢物(ALA和PBG)的增加。
在另外的实验(图12)中，发现苯巴比妥处理诱导小鼠模型肝脏中ALAS1 mRNA表达的大的增加(约25倍)。ALAS1 siRNA给予完全阻断了ALAS1 mRNA诱导。这些结果提供了进一步的证据：ALAS1 siRNA在AIP动物模型中是有效的。
总之，在该实例中提供的结果显示ALAS1 siRNA在急性肝性卟啉症AIP的动物模型中对治疗急性发作是有效的。多个结果测量支持这一结论，包括血浆ALA水平、血浆PBG水平、尿ALA水平、尿PBG水平、以及肝脏ALAS1 mRNA表达水平。
实例6.使用GalNAc-共轭的小鼠ALAS1 siRNA的体内沉默
在该实例中描述的实验研究了三种GalNAc-共轭的siRNA的体内效力(参见表7)。使用如在实例2中描述的那些方法设计并生产这些siRNA。
表7：序列AD-57929
Figure BDA0001787260730002041
将这些小鼠(n＝40；对于每一实验条件，n＝4)分成多组：接受PBS或3mg/kg、10mg/kg、或30mg/kg剂量的siRNA的皮下给予。在给予72小时后，在肝脏细胞中确定相对于PBS对照的mALAS1/mGAPDH mRNA的水平。这些结果显示于图13中。对于siRNA AD-56211和siRNAAD-56173，不存在明显的剂量响应效应。相反地，ALAS1 siRNA AD-57929在抑制mALAS1表达中显示剂量响应效应。这些结果证明ALAS1 GalNAc共轭物有效抑制ALAS1mRNA的体内表达，并且显示了一个剂量响应效应。
实例7.人siRNAs
如在实例2中描述的，设计并生产另外的人siRNA。基于它们的预测效力，选择最高的45个siRNA。这45个siRNA的序列提供于表8中。
Figure BDA0001787260730002061
Figure BDA0001787260730002071
Figure BDA0001787260730002081
Figure BDA0001787260730002091
Figure BDA0001787260730002101
实例8.人siRNA
生成了另外的19 mer人siRNA。这些siRNA的序列提供于表9中。可以使用在此描述的方法和/或本领域中已知的方法对这些siRNA的效力进行检验。
表9：人ALAS1 siRNA有义和反义序列
Figure BDA0001787260730002111
Figure BDA0001787260730002121
Figure BDA0001787260730002131
Figure BDA0001787260730002141
Figure BDA0001787260730002151
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Figure BDA0001787260730002181
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Figure BDA0001787260730002201
Figure BDA0001787260730002211
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Figure BDA0001787260730002471
Figure BDA0001787260730002481
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Figure BDA0001787260730002771
Figure BDA0001787260730002781
实例9.在急性治疗范例中使用ALAS1 siRNA进行卟啉前体的压制
使用AIP小鼠模型(参见实例5)研究ALAS1 siRNA在急性治疗范例中是否起作用以降低已经升高了的ALA和PBG水平，该升高的水平可能是存在的，例如，当人类卟啉症患者经受急性发作时。距最后给予苯巴比妥12小时后以1mg/kg的剂量给予AD-53558LNP11配制品siRNA迅速降低小鼠血浆中ALA和PBG两者的水平，而Luc对照处理的小鼠中，这些水平继续上升(图14)。这些结果表明ALAS siRNA对于治疗急性发作是有效的。ALAS1 siRNA有效降低并预防ALA和PBG水平的进一步增加。
实例10.靶向ALAS1的siRNA
如在实例2中描述的，设计并生产靶向ALAS1 siRNA的、另外的未修饰的或修饰的siRNA序列。如下所述对这些修饰的双链体的体外活性进行检验。
方法
脂质介导的转染
对于Hep3B、PMH、以及初代猕猴肝上皮实质细胞，转染通过以下进行：将14.8μl的Opti-MEM加每孔0.2μl的Lipofectamine RNAiMax per well(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，产品目录号13778-150)与每孔5μl的各自的siRNA双链体添加至96孔板中的每一个孔中。随后将该混合物在室温下孵育20分钟。然后将80μl不含抗生素的但包含适当细胞数目的完全培养基添加至该siRNA混合物。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时。
对于GalNAc修饰的，单剂量实验以1uM、500nM、20nM、10nM和0.2nM的双链体终浓度进行。
自由摄取转染
在使用之前，立刻将低温保存的初代猕猴肝上皮实质细胞(赛西斯体外技术公司(Celsis In Vitro Technologies)，M003055-P)在37℃水浴上解冻，并且以0.26x 106细胞/ml重悬于InVitroGRO CP(接种)培养基(赛西斯体外技术公司，产品目录号Z99029)中。在转染过程中，以每孔25,000个细胞将细胞涂布在BD BioCoat 96孔胶原板(BD，356407)上并且在37℃下在5％CO2气氛中进行孵育。通过每孔添加PBS中的10μl的siRNA双链体到96孔(96w)板，进行游离摄取实验。然后将包含该细胞类型的适当细胞数目的90μl完全培养基添加至该siRNA。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时。单剂量实验以1uM、500nM、20nM、和10nM的最终双链体进行。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰公司，部件#：610-12)的总RNA分离
收获细胞并且在150μl裂解/结合缓冲液中进行裂解，然后使用EppendorfThermomixer在850rpm混合5分钟，混合速度在整个过程中相同。将十微升磁珠与80μl裂解/结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁力支座捕获磁珠并且在不扰动磁珠的情况下移出上清液。在移出上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的珠子并且混合5分钟。在除去上清液后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液A(Wash Buffer A)洗涤2次并且混合1分钟。珠子再一次被捕获，并且除去上清液。然后将珠子用150μl洗涤缓冲液B(Wash BufferB)进行洗涤并且除上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液(Elution Buffer)进行洗涤、捕获并且除去上清液。最终，允许珠子干燥2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液(Elution Buffer)并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。去除45μl的上清液并且添加至另一96孔板中。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州(Applied Biosystems，Foster City，CA))，产品目录号4368813)的cDNA合成
母混合物如所制备的：每一反应：2μl 10X缓冲液、0.8μl 25XdNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μl RNase抑制剂以及3.2μl的H2O。将相同体积的母混合物和RNA混合为用于体外筛选的样本的12μl终体积或用于体内筛选的样本的20μl终体积。使用Bio-Rad C-1000或S-1000热循环仪(大力神公司(Hercules)，CA)通过以下步骤产生cDNA：25℃10min、37℃120min、85℃5秒、4℃保持。
实时PCR
在384孔(384w)板(罗氏公司(Roche)产品目录号04887301001)的每个孔中，将2μl的cDNA添加到母混合物中，该母混合物包含：2μl的H2O、0.5μl GAPDH TaqMan探针(生命技术公司(Life Technologies)产品目录号4326317E(对于Hep3B细胞)，产品目录号352339E(对于原初小鼠肝上皮实质细胞)，或定制探针(对于猕猴原初肝上皮实质细胞))、0.5μlC5TaqMan探针(生命技术公司产品目录号Hs00167441_ml(对于Hep3B细胞)或Mm00457879m1(对于原初小鼠肝上皮实质细胞)或或定制探针(对于猕猴原初肝上皮实质细胞))以及5μlLightcycler 480探针母混合物(罗氏公司产品目录号04887301001)。实时PCR在罗氏LC480实时PCR系统(罗氏公司)上使用ΔΔCt(RQ)测定而进行。除非另外指出，对于体外筛选，使用两个生物重复对每个双链体进行检验并且每个实时PCR以一式二份技术重复而进行。对于体内筛选，在一个或多个实验(每组3只小鼠)中对每个双链体进行检验并且每个实时PCR以一式二份技术重复而进行。
为了计算ALAS1 mRNA水平变化的相对倍数，使用ΔΔCt方法分析实时数据，并且将这些数据归一化为利用以下这样的细胞而进行的测定：这些细胞是转染了10nM AD-1955的细胞，或是模拟转染的细胞。以利用XLFit的4参数拟合模型计算IC50并且针对在相同的剂量范围用AD-1955转染的细胞归一化或针对自身最低剂量归一化。
AD-1955的有义链和反义链序列是：
有义：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO：3682)
反义：UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO：3683)。
修饰的和未修饰的siRNA的单链和双链体序列分别提供于下表14和表15中。
表14：人ALAS1修饰的单链和双链体序列
Figure BDA0001787260730002811
Figure BDA0001787260730002821
Figure BDA0001787260730002831
Figure BDA0001787260730002841
Figure BDA0001787260730002851
Figure BDA0001787260730002861
表15：人ALAS1未修饰的单链和双链体序列
Figure BDA0001787260730002862
Figure BDA0001787260730002871
Figure BDA0001787260730002881
Figure BDA0001787260730002891
Figure BDA0001787260730002901
体外测定的结果提供于表16中。表16还注释了每个siRNA的靶标物种。
表16：功能测定的结果
Figure BDA0001787260730002902
Figure BDA0001787260730002911
Figure BDA0001787260730002921
Figure BDA0001787260730002931
Figure BDA0001787260730002941
表17示例了所选择的ALAS1 siRNA双链体的IC50。在每个ALAS1修饰的siRNA双链体的转染24小时后，从Hep3B细胞系中的内源性表达的ALAS1的敲低来确定IC50(参见表14)。至少七个双链体(包括AD-58882、AD-58878、AD-58886、AD-58877、AD-59115、AD-58856、和AD-59129)一致地证明IC50低于0.1nm，表明这些双链体在抑制ALAS1表达中是特别有效的。
表17：所选择的ALAS1 siRNA双链体的IC50
双链体ID 384w IC50(nM) 96w IC50(nM)
AD-58882 0.008 0.014
AD-58878 0.040 0.031
AD-58886 0.037 0.033
AD-58877 0.031 0.034
AD-59115 0.093 0.052
AD-58856 0.061 0.066
AD-59129 0.085 0.071
AD-59124 0.572 0.078
AD-58874 0.140 0.102
AD-59125 0.118 0.115
AD-59105 0.511 0.144
AD-59120 180.592 0.498
AD-59122 36.646 0.646
AD-59106 7.906 0.847
AD-59126 n/a 1.014
AD-59107 n/a 1.971
实例11.AIP苯巴比妥诱导小鼠模型中的ALAS1-GalNAc活性
使用AIP小鼠模型来研究为ALAS1-GalNAc共轭物的siRNA的效果。该siRNA具有双链体AD-58632的序列(参见表20)。
Figure BDA0001787260730002961
AIP小鼠是未处理的(基线)、或在第1天皮下注射盐水或ALAS1-GalNAc共轭物(以20mg/kg的剂量)的。在第2天、第3天、和第4天，不对它们进行处理(基线)或用苯巴比妥的IP注射对其进行处理。在第5天，采集血浆并使用LC-MS测定法测量ALA和PBG水平。如在图15中所示的，ALAS1-GalNAc共轭物钝化血浆ALA和PBG生产分别约84％和80％。这些结果表明在这个AIP动物模型中，ALAS1-GalNAc共轭物处理有效预防与苯巴比妥诱导的急性发作相关联的血浆ALA和PBG两者的增加。
实例12.靶向ALAS1并抑制ALAS1表达的另外的siRNA
如在实例2中描述的，设计并生产靶向ALAS1 siRNA的、修饰的siRNA序列。这些序列提供于表18中。如下所述对这些修饰的双链体的体外活性进行检验。
Figure BDA0001787260730002981
Figure BDA0001787260730002991
Figure BDA0001787260730003001
Figure BDA0001787260730003011
Figure BDA0001787260730003021
Figure BDA0001787260730003031
Figure BDA0001787260730003041
Figure BDA0001787260730003051
Figure BDA0001787260730003061
Figure BDA0001787260730003071
Figure BDA0001787260730003081
Figure BDA0001787260730003091
Figure BDA0001787260730003101
Figure BDA0001787260730003111
Figure BDA0001787260730003121
Figure BDA0001787260730003131
Figure BDA0001787260730003141
Figure BDA0001787260730003151
在用Lipofectamine2000作为转染剂进行转染的Hep3B细胞中，以单剂量筛选，对siRNA在压制ALAS1 mRNA中的体外活性进行了检验。单剂量实验以10nM双链体浓度进行并且通过分支DNA(bDNA)测定法进行分析。结果示于表19中并且表示为剩余mRNA百分数。
表19：通过bDNA测定法评估的ALAS1 mRNA的压制
Figure BDA0001787260730003161
Figure BDA0001787260730003171
Figure BDA0001787260730003181
Figure BDA0001787260730003191
Figure BDA0001787260730003201
Figure BDA0001787260730003211
在该单剂量测定中，所检验的232个双链体在不同程度上压制ALAS1 mRNA。根据这一测定，至少这些双链体中的四个(AD-59453、AD-59395、AD-59477、和AD-59492)压制ALAS1mRNA 85％或更高，这些双链体中的39个压制ALAS1 mRNA 80％或更高，这些双链体中的101个压制ALAS1 mRNA 70％或更高，并且这些双链体中的152个压制ALAS1 mRNA 50％或更高。相反，在这个测定中，一些双链体不显示可感知的压制。
等同物
利用不超出常规的实验，本领域技术人员将认识到，或将能够确定在此所描述的本发明具体实施例的许多等同物。此类等同物意在由以下权利要求书涵盖。

Claims (23)

1.一种用于抑制ALAS1的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:1296的序列的反义链；
(ii)包含SEQ ID NO:1295的至少15个连续核苷酸的有义链；和
(iii)长度是15-30个碱基对的双链体区域。
2.如权利要求1所述的dsRNA，其中所述dsRNA包括至少一个经修饰的核苷酸。
3.如权利要求2所述的dsRNA，其中所述至少一个经修饰的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸和2'-氟修饰的核苷酸。
4.如权利要求1所述的dsRNA，其中所述有义链和所述反义链各自是19-24个核苷酸的长度。
5.如权利要求1所述的dsRNA，其中至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3’突出端。
6.如权利要求5所述的dsRNA，其中所述3’突出端是2个核苷酸的长度。
7.如权利要求1所述的dsRNA，其还包含配体。
8.如权利要求7所述的dsRNA，其中所述配体是GalNAc配体，且其中所述GalNAc配体附接至所述有义链的3’末端。
9.如权利要求8所述的dsRNA，其中所述GalNAc配体经由连接物附接至所述有义链的3’末端。
10.如权利要求8所述的dsRNA，其中所述GalNAc配体是：
Figure FDA0003530225110000021
11.如权利要求9所述的dsRNA，其中所述配体和连接物具有以下结构：
Figure FDA0003530225110000022
12.一种分离的细胞，其包含权利要求1所述的dsRNA。
13.一种用于抑制ALAS1基因的表达的药物组合物，所述组合物包含权利要求1所述的dsRNA。
14.一种体外抑制细胞中ALAS1表达的方法，所述方法包括：
(a)向所述细胞中引入权利要求1所述的dsRNA，并且
(b)维持步骤(a)的细胞一段时间，该时间足以获得ALAS1基因的mRNA转录本的降解，由此抑制所述细胞中的ALAS1基因的表达。
15.权利要求1所述的dsRNA在制备用于在需要这样的治疗的受试者中治疗与ALAS1表达相关的失调的药物中的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述受试者处于发展卟啉症的风险中，或被诊断为患有卟啉症。
17.如权利要求15所述的用途，其中所述dsRNA是在卟啉症急性发作之前、过程中或之后给予的。
18.如权利要求15所述的用途，其中所述受试者中卟啉或卟啉前体的水平被降低。
19.如权利要求15所述的用途，其中当将所述受试者暴露于诱发因素时，所述治疗
(i)改善与ALAS1相关的失调相关联的症状，
(ii)抑制所述受试者中的ALAS1表达，
(iii)降低所述受试者中卟啉前体或卟啉的水平，
(iv)减少所述受试者中与卟啉症相关联的症状的急性发作的频率，或
(v)减少所述受试者中与卟啉症相关联的症状的急性发作的发病率。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述与ALAS1相关的失调是卟啉症。
21.一种用于体外降低细胞中卟啉或卟啉前体的水平的方法，该方法包括以有效降低该细胞中卟啉或卟啉前体的水平的量将该细胞与权利要求1所述的dsRNA相接触。
22.一种编码权利要求1所述的dsRNA的有义链和反义链的载体。
23.一种分离的细胞，其包含权利要求22所述的载体。
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