JP6886818B2 - 二本鎖rnaによるグリコール酸オキシダーゼ(hao1)の特異的阻害に関する方法および組成物 - Google Patents
二本鎖rnaによるグリコール酸オキシダーゼ(hao1)の特異的阻害に関する方法および組成物 Download PDFInfo
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Description
本願は、米国特許法第119条(e)の下で、2013年12月27日に出願の「Methods and Compositions for the Specific Inhibition of Glycolate Oxidase (HAO 1) by Double−Stranded RNA」(二本鎖RNAによるグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)の特異的阻害に関する方法および組成物)という表題の米国特許仮出願番号第61/921,181号、および2014年2月10日に出願の「Methods and Compositions for the Specific Inhibition of Glycolate Oxidase (HAO 1) by Double−Stranded RNA」(二本鎖RNAによるグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)の特異的阻害に関する方法および組成物)という表題の米国特許仮出願番号第61/937,838号に対する優先権、および利益を主張する。上述の特許出願全体は、この参照により本明細書に援用される。
本発明は、グリコール酸オキシダーゼ(HAO1)遺伝子の発現および/または活性の調節に応答する特性、疾患および状態の研究、診断および処置のための化合物、組成物、および方法に関する。
本願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、「301937_94015WO_seq_listing」という表題であり、2014年12月23日に作成されたもので、サイズは2.87MBである。配列表の電子形式における情報は本願の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。
第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的であり、かつ配列番号1921〜2304のHAO1mRNA配列の5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断する、dsNA;
(a)センス領域およびアンチセンス領域であって、センス領域およびアンチセンス領域が25〜35塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、アンチセンス領域が配列番号1921〜2304の配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域;ならびに(b)0〜2つの3’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドである、3’オーバーハング領域からなるdsNA分子であって、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号1921〜2304のHAO1mRNA配列の5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断する、dsNA分子;
第1の核酸鎖および第2の核酸鎖、ならびに少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的遺伝子発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
第1の核酸鎖および第2の核酸鎖、ならびに少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、第1のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端および第2のオリゴヌクレオチド鎖の5’末端が平滑末端を形成し、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1配列と十分に相補的である、dsNA;
19〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、HAO1標的mRNA発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、核酸;
15〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列とハイブリッド形成可能である、核酸;
RNAを有する第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列とハイブリッド形成可能である、dsNA;
RNAを有する第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が少なくとも35の長さのヌクレオチドであり、任意に配列番号385〜768の少なくとも25の長さのヌクレオチドの配列を含み、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するためにリボヌクレオチドまたは第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み;第1の鎖の5’末端および第2の鎖の3’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハングおよび1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングの構造を形成し;第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハングおよび1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングの構造を形成し;第1の鎖の3’末端ヌクレオチド残基の位置24のうち少なくとも1つが、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと任意に塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと十分に塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み;第2の鎖の3’末端ヌクレオチド残基の位置24のうち少なくとも1つが、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドと任意に塩基対を形成する、デオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1の鎖(または第2の鎖)が25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖(または第2の鎖)の位置1〜23が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖(または第1の鎖)が36〜66の長さのヌクレオチド残基であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖(または第1の鎖)の少なくとも3’末端ヌクレオチドが第1の鎖(または第2の鎖)と対になっておらず、最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが第1の鎖(または第2の鎖)と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;第2の鎖(または第1の鎖)の5’末端が、第1の鎖(または第2の鎖)と対になっていない10〜30の連続したヌクレオチドを含み、それによって10〜30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第1の鎖(または第2の鎖)の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、第2の鎖(または第1の鎖)のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するため、第2の鎖のうち少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1の鎖が25〜35の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜25が少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖が30〜66の長さのヌクレオチド残基であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜25と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖の5’末端が、第1の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第1の鎖の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、第2の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第2の鎖が19〜30の長さのヌクレオチド残基であり、任意に25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第1の鎖が24〜66の長さのヌクレオチド残基(任意に30〜66の長さのヌクレオチド残基)であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端が、平滑末端、3’オーバーハングおよび5’オーバーハングの構造を含み、任意にオーバーハングは1〜6の長さのヌクレオチドであり;第1の鎖の5’末端が、第2の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第2の鎖の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、第1の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
第1の鎖および第2の鎖を有するdsNAであって、第1の鎖および第2の鎖が19〜25の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第1の鎖が、第1の鎖−第2の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む3’領域を含み、dsNAが第1の鎖の3’末端と第2の鎖の5’末端との間に不連続性をさらに含み、第1の鎖または第2の鎖が、dsNAが哺乳類細胞の中に導入される際に、HAO1標的mRNA発現を低減させるために、第1の鎖または第2の鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、dsNAが、dsNAのdicer開裂を実質的に防止するのに十分なほど多く改変され、任意にdsNAが、哺乳類細胞中でLDHmRNA発現を低減できる1つ以上の19〜23の長さのヌクレオチド鎖dsNAを得るために、非dicerヌクレアーゼによって切断される、dsNA;
外来核酸配列および配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列を持つ細胞内のin vivoハイブリッド形成複合体;ならびに
外来核酸配列および配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列を持つ細胞内のin vitroハイブリッド形成複合体。
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術的かつ科学的語句は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明で使用される多くの語句の一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed.,1988);The Glossay of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag (1991); and Hale & Maham,The Harper Collins Dictionay of Biology(1991)。本明細書で使用するように、以下の語句は、他で特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。
ある特定の実施形態では、本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼDsiRNA剤は以下の構造を持つことができる。
を含み、式中「X」=RNAであり、かつ「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインである。関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNAであり、かつ「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。関連実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである1−4RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーであり得、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、および「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜15、または任意1〜8であり、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーであり得、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が、上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖(第1の鎖)はセンス鎖であり、下鎖(第2の鎖)はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称/オーバーハング薬剤に関して上述のものと並行する改変パターンおよびDNA:DNA伸長パターンもまた、このような「平滑/ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。上記の構造は、Dicerがその第一処理後形態として、最小21マーの二本鎖を開裂するようにさせるようにモデル化されている。上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端の最後および最後から2番目の残基で2つのデオキシリボヌクレオチド残基が存在することが、的外れの効果の低減を支援する(先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の5’末端から少なくとも最後から2番目の2’−O−メチル改変が示される。例えば、米国特許公開公報第2007/0223427号を参照のこと)。
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8、または任意1〜10であり、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーであり得、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が、上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖(第1の鎖)はセンス鎖であり、下鎖(第2の鎖)はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称/オーバーハング薬剤に関して上で示したものと並行する改変パターンおよびDNA:DNA伸長パターンもまた、このような「平滑/ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
表番号:
(2)選択したヒト抗グリコール酸オキシダーゼDsiRNA剤(非対称);
(3)選択したヒト抗グリコール酸オキシダーゼDsiRNA、非改変の二本鎖(非対称);
(4)グリコール酸オキシダーゼmRNA中のDsiRNA標的配列(21マー);
(5)選択したヒト抗グリコール酸オキシダーゼ「平滑/平滑」DsiRNA;および
(6)グリコール酸オキシダーゼmRNA中のDsiRNA成分である19のヌクレオチド標的配列;
(7)>50%のノックダウン有効性を有すると予測されるヒト抗グリコール酸オキシダーゼDsiRNA(非対称);
(8)>50%のノックダウン有効性を有すると予測されるヒト抗グリコール酸オキシダーゼDsiRNAのDsiRNA標的配列(21マー);
(9)>50%のノックダウン有効性を有すると予測されるヒト抗グリコール酸オキシダーゼDsiRNAに対応する「平滑/平滑」DsiRNA;および
(10)>50%のノックダウン有効性を有すると予測されるヒト抗グリコール酸オキシダーゼDsiRNAのDsiRNA成分である19のヌクレオチド標的配列;
HAO1−1171 25/27merのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5’末端より)
HAO1−1378 25/27merのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5’末端より)
HAO1−1171mRNA標的:
25〜35ヌクレオチド、とりわけ25〜30ヌクレオチドのより長いdsRNA種(DsiRNA)が、19〜23マーsiRNA剤と比較して、活性の効力および持続期間に関して、予期せぬ効果的な結果を与えることが、実験的にわかってきた。dsRNA処理機構の根本的な理論に拘束されることを望むものではないが、より長いdsRNA種が細胞の細胞質中のDicer酵素に対する基質として働くことが考えられる。本発明のdsRNAをより短いセグメントに分割することに加えて、Dicerは、分割されたdsRNA由来の一本鎖分割産物の、標的遺伝子グリコール酸オキシダーゼ(またはグリコール酸オキシダーゼ−関連疾患もしくは障害と関連する他の遺伝子)由来の細胞質RNA(例えばグリコール酸オキシダーゼRNA)の崩壊に関与するRISC複合体内への組み込みを促進すると考えられる。先行する研究(Rossi et al.,米国特許公開公報第2007/0265220号)は、DicerによるdsRNA種(特にDsiRNA剤)の開裂性が、dsRNA種の活性の効力および持続期間の増大と一致することを示した。
二本鎖RNA(「dsRNA」)の効果を阻害する1つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるdsRNA(例えばsiRNAおよびDsiRNA)の分解である。3’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する第一ヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの3’−末端の改変が、分解を防止するために重要である(Eder et al.,1991,Antisense Res Dev,1:141−151)。RNase−Tファミリーヌクレアーゼは同定され、siRNAの制御および分解に関与する3’から5’エキソヌクレアーゼ活性を持つERI−1と呼ばれている(Kennedy et al.,2004,Nature 427:645−649;Hong et al.,2005,Biochem J,390:675−679)。この遺伝子はまた、マウスのThex1(NM_026067)またはヒトのTHEX1(NM_153332)として知られ、ヒストンmRNAの分解に関与し、またsiRNA中の3’−オーバーハングの分解を媒介するが、二本鎖RNAを分解しない(Yang et al.,2006,J Biol Chem,281:30447−30454)。したがって、本発明のDsiRNAを含む、dsRNAの3’−末端−安定化が安定性を改善すると予測することが合理的である。
知られているヒトおよびマウスのグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)cDNAおよびポリペプチド配列は、以下の:ヒトヒドロキシ酸オキシダーゼ1(HAO1)第NM_017545.2号および対応するヒトHAO1ポリペプチド配列GenBank寄託番号第NP_060015.1号;ならびにマウス野生型HAO1配列GenBank寄託番号第NM_010403.2号(Mus musculus C57BL/6 HAO1)および対応するマウスHAO1配列GenBank寄託番号第NP_034533.1号を含む。
無細胞系でのRNAiを繰り返すin vitroアッセイを使用して、グリコール酸オキシダーゼRNA配列(類)を標的化しているdsRNA構築物を評価し、したがって、dsRNAのグリコール酸オキシダーゼ特異的遺伝子阻害活性(また本明細書中でグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を指す)を評価できる。このアッセイには、グリコール酸オキシダーゼRNAに対して指向したdsRNA(例えばDsiRNA)剤との利用に適合した、Tushl et al.,1999,Genes and Development,13,3191−3197およびZamore et al.,2000,Cell,101,25−33によって記述されたシステムが含まれる。合胞体胚盤葉由来のDrosophila抽出物を、in vitroにてRNAi活性を再構築するために使用する。標的RNAは、T7 RNAポリメラーゼを用いる選択されたグリコール酸オキシダーゼ発現プラスミドからのin vitro転写を介して、または化学合成を介して産出される。センスおよびアンチセンスのdsRNA鎖(例えば各20uM)を、90℃で1分間、ついで37℃で1時間(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH、pH7.4、2mM酢酸マグネシウムのような)緩衝液中でのインキュベーションによってアニールし、ついで溶解緩衝液(例えば100mM 酢酸カリウム、pH7.4での30mM HEPES−KOH、2mM酢酸マグネシウム)中で希釈する。アニーリングをTBE緩衝液中アガロースゲル上のゲル電気泳動によってモニタし、臭化エチジウムで染色できる。Drosophila溶解物を、脱塩素化し、溶解した酵母糖蜜寒天上で回収したOregon Rハエ由来の0〜2時間齢胚を用いて調製する。溶解物を遠心し、上清を単離する。本アッセイには、50%溶解物[vol/vol]、RNA(10〜50pM最終濃度)、およびdsRNA(10nM最終濃度)を含む10%[vol/vol]溶解緩衝液を含む反応混合物が含まれる。反応混合液はまた、10mM リン酸クレアチン、10ug/mlクレアチンホスホキナーゼ、100um GTP、100uM UTP、100uM CTP、500uM ATP、5mM DTT、0.1U/uL RNasin(Promega)および100uMの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度を100mMに調節する。反応を氷上でプレアセンブルし、RNA添加する前に10分間、25℃にてプレインキュベートし、25℃にてさらに60分間インキュベートする。反応を4容量の1.25×Passive Lysis Buffer(Promega)で反応停止する。標的RNA開裂をRT−PCR解析または本技術分野で公知の他の方法によってアッセイし、dsRNAが反応より除外された対照反応と比較する。
ある特定の実施形態では、本発明は、グリコール酸オキシダーゼの阻害が、治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害(例えば、原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)などの肝疾患)を有する、またはそれらを発症させるリスクを持つ対象を治療する方法に関する。このような実施形態では、dsRNAは、グリコール酸オキシダーゼの阻害が、治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害を制御するための新規治療薬剤として働き得る。本方法は、本発明の医薬組成物を患者(例えばヒト)に投与し、それによって、グリコール酸オキシダーゼ(HAO1)RNAの発現、レベルおよび/または活性が低減することを含む。グリコール酸オキシダーゼ(HAO1)RNAによってコードされたポリペプチドの発現、レベルおよび/または活性はまた、dsRNAがグリコール酸オキシダーゼ転写産物の非コード領域に対して指向する場合(例えば標的化5’UTRまたは3’UTR配列)でさえ、本発明のdsRNAによって低減してもよい。これらの高い特異性のために、本発明のdsRNAは、任意に多型対立遺伝子が個々および/または集団内で存在する対立遺伝子特異的様式であっても、細胞および組織のグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)配列を特に標的化できる。
本発明のdsRNA剤を、直接細胞に(すなわち細胞内に)導入してよく、または空洞、間質腔内、生命体の循環中に細胞外で導入してよく、経口で導入してよく、または核酸を含む溶液で細胞または生命体を浴させることによって導入してよい。血管または血管外の循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸を導入してよい部位である。
グリコール酸オキシダーゼ(HAO1遺伝子の産物)は、ミトコンドリア/ペルオキシソームグリシン代謝経路において、グリコール酸塩をグリオキシル酸塩に変換させる要因となる酵素である。グリコール酸塩は、グリシン代謝経路の無害な中間体であるが、グリオキシル酸塩の蓄積(例えば、AGT1変異による)は、(カルシウムが最初に腎臓中に、最終的には他の臓器中に沈着して)シュウ酸塩の蓄積を亢進させ、最終的にPH1疾患をもたらす。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のdsRNA剤を含む医薬組成物を提供する。dsRNA剤試料は、好適に製剤化され、それが存在する場合に、十分な試料の一部が、遺伝子サイレンシングを誘導するために細胞内に入ることを許容する任意の方法によって細胞の環境内に導入可能である。dsRNAに関する多くの製剤は、本技術分野で公知であり、dsRNAが標的細胞内に入り、働くことができる限り使用可能である。例えば、米国特許出願公開第2004/0203145A1号および第2005/0054598 A1号を参照のこと。例えば、本発明のdsRNA剤を、リン酸緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造およびカプシドのような緩衝溶液中に製剤化できる。カチオン性脂質を備えたdsRNA剤の製剤を、dsRNA剤の細胞内へのトランスフェクションを促進するために使用可能である。例えば、リポフェクチン(米国特許第5,705,188号)のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシン(PCT国際特許公開第97/30731号)のようなポリカチオン性分子を使用できる。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン(Life Technologies)、NC388(Ribozyme PhARmaceuticals、Inc.Boulder,Colo.)、またはFuGene6(Roche)が含まれ、これら全ては製造業者の取扱説明書にしたがって使用できる。
本発明は、グリコール酸オキシダーゼ(例えばHAO1転写産物および/もしくはグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルの正常機能および/もしくは誤調節および/もしくは上昇)によって、全体としてもしくは部分的に引き起こされる、もしくはグリコール酸オキシダーゼの選択的標的化介して処置可能な疾患または障害のリスクのある(または受けやすい)対象を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。
細胞培養
本発明のdsRNA剤を、in vivoにて、例えば以下の手順を用いて、開裂活性に対して試験可能である。本発明のdsRNA剤によって標的化されたHAO1cDNA内のヌクレオド配列を、上記のHAO1配列中に示す。
RT−qPCRアッセイについて、総RNAを、例えば大規模抽出用のAmbion Rnaqueous 4−PCR精製キット、または96−ウェルプレート用のPromega SV96を用いて、DsiRNA伝達後の細胞から調製する。Taqman解析のために、二重標識化プローブを、例えば5’末端にて共有結合したレポーター色素FAMまたはVICと3’末端に共役したクエンサー色素TAMRAで合成した。PCR増幅を、例えば10uL総RNA、100nMフォワードプライマー、100mMリバースプライマー、100nM プローブ、1×TaqMan PCR反応緩衝液(PE−Applied Biosystems)、5.5mM MgCl2、100uMの各dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、0.2U RNase Inhibitor(Promega)、0.025U AmpliTaq Gold(PE−Applied Biosystems)および0.2U M−MLV逆転写酵素(Promega)からなる50uL反応液を用いて、ABI PRISM 7700配列検出器上で実施する。温度サイクル条件は、48℃にて30分間、95℃にて10分間、続いて95℃にて15秒間と60℃の40サイクル、および、および60℃で1分間からなることができる。標的HAO1mRNAレベルの定量を、段階希釈した総細胞RNA(300、100、30、10ng/rxn)から産出した標準物質に対して決定し、例えば、平行または同一のいずれかのチューブTaqMan反応におけるHPRT1 mRNAに対して正規化する。
細胞タンパク質抽出物を、標準マイクロ調製技術を用いて(例えばRIPA緩衝液を使用して)調製可能である。細胞タンパク質抽出物を、Tris−Glycineポリアクリルアミドゲル上で泳動し、膜上に移す。非特異的結合を、例えば5%不脂肪ミルクとの1時間のインキュベーションにて阻害し、続いて4℃にて16時間一次抗体でインキュベーションできる。洗浄後、二次抗体を、例えば室温にて1時間(1:10,000希釈)適用し、シグナルを、VersaDocイメージングシステム上で検出する。
抗−HAO1dsRNA剤の有効性を、動物モデルにおいて評価してよい。本技術分野で公知のようなPH1の動物モデルを、抗−HAO1dsRNAの有効性、効力、毒性などの評価のために使用可能である。抗−HAO1dsRNAの評価に有用な例示的動物モデルとしては、グリコール酸塩負荷のマウスモデルおよびPH1疾患の遺伝子組換えマウスモデルが挙げられる。このような動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための、供給源細胞または組織としても使用できる。このようなモデルはまた、治療的利用に向けてHAO1遺伝子発現の調節における、本発明のdsRNA組成物の有効性の前臨床評価のために使用できるか、または使用のために適合できる。
オリゴヌクレオチド合成および精製
DsiRNA分子は、RNAメッセージ中の種々の部位、例えば本明細書で記述したRNA配列内の標的配列と相互作用するようにデザインした。本例示の薬剤において、384のヒト標的HAO1配列を評価のために選択した(選択した384のヒト標的HAO1部位が、マウスHAO1転写配列中の対応する部位と共に保存されていることが予測された)。DsiRNA分子の1つの鎖の配列は、上述の標的HAO1部位配列と相補的であった。DsiRNA分子は、本明細書で記述した方法を用いて化学的に合成した。一般に、DsiRNA構築物を、19〜23マーsiRNAに対して記述したような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した(例えば、Usmanらの米国特許第5,804,683号;第5,831,071号;第5,998,203号;第6,117,657号;第6,353,098号;第6,362,323号;第6,437,117号;第6,469,158号;Scaringeらの米国特許第6,111,086号;第6,008,400号;第6,111,086号を参照のこと)。
一本鎖RNA(ssRNA)オリゴマーを、例えば100mM 酢酸カリウム、30mM HEPES pH7.5からなる二本鎖緩衝液中100μM濃度で、再懸濁した。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合し、例えば50μM二本鎖の最終溶液を得た。試料をRNA緩衝液(IDT)中5’間100℃まで熱し、使用の前に室温まで冷却した。二本鎖RNA(dsRNA)オリゴマーを−20℃で保存した。一本鎖RNAオリゴマーを、凍結乾燥または−80℃にてヌクレアーゼフリーの水中で保存した。
一貫性のために、以下の命名法を本明細書で使用した。二本鎖に与えた名前は、オリゴマーの長さと、オーバーハングの有無とを示唆する。「25/27」は、2−塩基3’−オーバーハングを含む、25塩基センス鎖と、27塩基アンチセンス鎖とを持つ非対称二本鎖である。「27/25」は、27塩基センス鎖と25塩基アンチセンス鎖とを持つ非対称二本鎖である。
HeLa細胞を得て、5%CO2下、37℃にて、10%ウシ胎児血清(HyClone)を含むDMEM(HyClone)中で維持した。RNAトランスフェクションのために、細胞を、Lipofectamine(商標)RNAiMAX(Invitrogen)を用いて、製造業者の取り扱い説明書にしたがって、1nMまたは0.1nMの最終濃度でDsiRNAでトランスフェクトした。簡単に記すと、例えば以下の実施例3の0.1nMのトランスフェクションでは、各DsiRNAのストック溶液の一定分量を、Opti−MEM I(Invitrogen)およびLipofectamin(商標)RNAiMAXと、150μL(0.3nM DsiRNAを備える)の容量に達するまで混合した。得られた150μL混合液を、室温にて20分間インキュベートして、DsiRNA:Lipofectamine(商標)RNAiMAX複合体を形成させた。一方、標的細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁させた。20分間の複合体形成の終わりに、ウェルあたり50uLのDsiRNA:RNAiMAX混合物を、96ウェルプレート中の3組のウェルに添加した。最後に、細胞懸濁液100μLを各ウェルに加え(最終容量150μL)、プレートを24時間インキュベーター内に配置した。
ヒトHeLa細胞中のHAO1標的遺伝子ノックダウンをレポーターアッセイによって決定した(HeLa細胞を、Psi−Check−HsHAO1プラスミドで形質転換し、ついでウミシイタケルシフェラーゼレベルを、ルミノメーターを使用して検出した)一方で、HPRTおよびRPL23ハウスキーピング遺伝子に対して、ならびに対照DsiRNAおよび/またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションに対して正規化した値を用いて、マウスHepa1−6細胞中のHAO1標的遺伝子ノックダウンをqRT−PCRによって決定した。
培地を吸引し、総RNAをSV96キット(Promega)を用いて抽出した。総RNAを、製造業者の取扱説明書にしたがって、SuperscriptII、Oligo dTおよびランダムヘキサマーを用いて逆転写した。概して、得られたcDNAを、HAO1遺伝子ならびにマウス遺伝子HPRT−1およびRPL23の両方に特異的なプライマーとプローブとを用いて、qPCRによって解析した。ABI7700を、増幅反応のために使用した。各試料を三重で試験した。相対グリコール酸オキシダーゼRNAレベルを、HPRT1およびRPL23RNAレベルに対して正規化し、トランスフェクション対照試料中で得たRNAレベルと比較した。
グリコール酸オキシダーゼを標的としているDsiRNA分子を、上述のようにデザインして合成し、阻害有効性に関してヒトHeLa細胞(あるいは、HepG2または他のヒト細胞を使用できただろう)中で試験した。トランスフェクションのために、アニールしたDsiRNAを、トランスフェクション試薬(Lipofectamine(商標)RNAiMAX、Invitrogen)と混合し、室温にて20分間インキュベートした。HeLa(ヒト)またはHepa1−6(マウス)細胞(あるいは、マウスAML12または他のマウス細胞を使用できただろう)をトリプシン処理し、培地中で再懸濁し、ウェルに加え(100μL/ウェル)、150μlの容量で、1nMの最終DsiRNA濃度を得た。各DsiRNAトランスフェクション混合液を、三重DsiRNA処理のために3つのウェルに加えた。細胞を37℃にて24時間、DsiRNAトランスフェクション混合液の継続存在下、インキュベートした。24時間の時点で、ウミシイタケルシフェラーゼレベルの検出のために、ヒト細胞でルミノメーターアッセイを実施した、またはRNAを、処理したマウス細胞の各ウェルから調製した。このようなマウス細胞については、トランスフェクション混合液を含む上清をまず除去して廃棄し、ついで細胞を溶解し、各ウェルからRNAを調製した。処理後の標的レポータールシフェラーゼレベル(ヒト)またはHAO1RNAレベル(マウス)を、対照から得られた値に対して正規化した値を用いて、HAO1標的遺伝子に対してルミノメーター(ヒト)またはqRT−PCR(マウス)によって評価した。三重のデータを平均し、%エラーを各処置に対して決定した。正規化データを表にしてグラフ化し、対照との比較で、活性DsiRNAによる標的mRNAの減少を決定した(以下の表11および図2A〜2Fを参照のこと)。
上記実験の96の非対称DsiRNA(Hs HAO1を標的とする96のうち、26はMm HAO1も標的とした)を、ついで二次アッセイで試験し(「フェーズ2」)、このようなアッセイの結果を図3A〜3Fにてヒストグラムの形態で提示した。特に、上記で試験したものから選択した96の非対称DsiRNAを、ヒトHeLa細胞の環境中1nMまたは0.1nMにて(二重アッセイで)ヒトHAO1の阻害に関して評価した(図3Aおよび3B)。これらの96非対称DsiRNAをまた、マウスHepa1−6細胞の環境中1nMまたは0.1nMにて、マウスHAO1の阻害に関して(二重に)評価した(図3C〜3F)。図3Aおよび3Bにて示すように、多くの非対称DsiRNAが、HeLa細胞の環境中でアッセイした場合、サブナノモル濃度にて有意なヒトHAO1阻害有効性を再現的に示した。
ある特定の活性HAO1標的化DsiRNAの、マウスの肝臓内でHAO1レベルを減少させる能力を試験した。本研究で用いたDsiRNAは、HAO1−1105、HAO1−1171、HAO1−1221、HAO1−1272、HAO1−1273、HAO1−1316、HAO1−1378およびHAO1−1379であり、その各々をパッセンジャー(センス)鎖改変パターン「SM107」およびガイド(アンチセンス)鎖改変パターン「M48」(パターンは上に記載)で合成した。本研究を実施するために、原発性高シュウ酸尿症モデルを、0.25mLの0.5Mグリコール酸塩の経口強制投与により、メスのC57BL/6マウス中で尿中シュウ酸塩の蓄積を引き起こして生成した。動物を無作為化し、体重に基づいて群に割り当てた。1mg/kgまたは0.1mg/kgのDsiRNAを含有する脂質ナノ粒子(LNP;ここではEnCore−2345という名称のLNP製剤を用いた)での動物の静脈内投薬を、0日目に開始した。投薬を続けて1週間に2回行い、グリコール酸塩負荷前にマウスに合計で3用量投与した。シュウ酸塩/クレアチニンレベルの評価のために、グリコール酸塩負荷の4時間後および24時間後に尿試料を収集した(実験フローチャートの図4を参照のこと)。ついで、グリコール酸塩負荷の24時間後に動物を犠牲死させた。肝臓を解剖して計量し、HAO1レベルを、RT−qPCR、ViewRNA、グリコール酸オキシダーゼのウェスタンブロットおよび/またはグリコール酸オキシダーゼ免疫組織化学を使用して評価した(ViewRNA、グリコール酸オキシダーゼのウェスタンブロットおよびグリコール酸オキシダーゼ免疫組織化学のデータは示さず)。血清試料でも、グリコール酸オキシダーゼの検出のためにELISAを実施した(データは示さず)。特に、1mg/kgで投与した場合、8つ全てのDsiRNAがHAO1の強力なノックダウンを示した(図5)。in vivoで試験した8つのDsiRNAのうち少なくとも2つ(HAO1−1171およびHAO1−1378)はまた、0.1mg/kgで投与した場合に、全ての処理動物でHAO1の強力なノックダウンも示した。図5に示すように、0.1mg/kgでのHAO1−1171−M107/M48DsiRNAの投与が、処理マウスの肝臓組織で平均70%のノックダウンを引き起こした一方で、1mg/kgでの投与は、処理マウスの肝臓組織で平均97%のノックダウンをもたらした。同様に、0.1mg/kgでのHAO1−1378−M107/M48DsiRNAの投与が、処理マウスの肝臓組織で平均53%のノックダウンを引き起こした一方で、1mg/kgでの投与は、処理マウスの肝臓組織で平均97%のノックダウンをもたらした。0.1mg/kgおよび1mg/kgの両方でのHAO−1171誘導ノックダウンを、ViewRNAのin situハイブリダイゼーションアッセイによってさらに確認した。
上記の実施例3から選択した24のDsiRNAを、「M107」パッセンジャー鎖の改変と対を形成する2’−O−メチルガイド鎖改変パターン(上に示されるように、「M17」、「M35」、「M48」および「M8」)で調製した。これらのDsiRNA配列の各々に関して、「M107」パッセンジャー鎖改変パターンと一体となった4つのガイド鎖改変パターンのM17、M35、M48およびM8の各々を有するDsiRNAを、HeLa細胞の環境において1.0nMおよび0.1nM(二重アッセイ)濃度での、ヒトHeLa細胞中のHAO1阻害についてアッセイした。図7Aが、このような二本鎖の特定の改変パターンを示す(斜線の残基は、2’−O−メチル改変を有するこれらを示す)一方で、図7Bおよび7Cは、試験した24の二本鎖配列(HAO1−65、75、77、80、83、96、1198、1480、1490、1491、1499、1501、1171、1279、1504、1549、1552、1696、1315、1316、1375、1378、1379および1393)に対応する4つの改変二本鎖の各々に対するヒトHAO1ノックダウン有効性データを示す。図7Bおよび7Cで実証されるように、試験した多くの二本鎖が、試験した高度に改変した形態の全てにわたり0.1nM濃度であっても、強力なHAO1ノックダウン有効性を有すると実証した。
実施例5で上述した24のHAO1標的化二本鎖配列の同じセットを、固定の「M48」ガイド鎖改変パターンと一体となった4つの2’−O−メチルパッセンジャー鎖改変パターン(「M107」、「M14」、「M24」および「M250」)の範囲を有するように調製した。これらのDsiRNAを、HeLa細胞の環境において1.0nMおよび0.1nM(二重アッセイ)濃度でHAO1阻害についてアッセイした。図8Aが、このような二本鎖の特定の改変パターンを示す(斜線の残基は、2’−O−メチル改変を有するこれらを示す)一方で、図8Bおよび8Cは、試験した24の二本鎖配列(HAO1−65、75、77、80、83、96、1198、1480、1490、1491、1499、1501、1171、1279、1504、1549、1552、1696、1315、1316、1375、1378、1379および1393)に対応する4つの改変二本鎖の各々に対するヒトHAO1ノックダウン有効性データを示す。図8Bおよび8Cで実証されるように、試験した追加の二本鎖の多くが、試験した高度に改変したパッセンジャー鎖(固定のガイド鎖改変パターンを有する)形態の全てにわたり0.1nM濃度であっても、強力なHAO1ノックダウン有効性を有すると実証した。
上記24のHAO1標的化二本鎖配列(HAO1−65、75、77、80、83、96、1171、1198、1279、1315、1316、1375、1378、1379、1393、1480、1490、1491、1499、1501、1504、1549、1552および1696)のパッセンジャー(センス)鎖およびガイド(アンチセンス)鎖の両方のさらなる改変パターンを、図9A〜9Dに示すように、2’−O−メチル改変パターンを有するように調製した。これらの大幅に改変したDsiRNAを、HeLa細胞(ルシフェラーゼレポーター系、すなわちPsi−Check−HsHAO1プラスミドを使用して;図9E〜9H)またはHAO1で安定にトランスフェクトしたヒトHEK293細胞(HEK293−pcDNA_HAO1細胞;図9I〜9L)のいずれかの環境において、1.0nMおよび0.1nM(二重アッセイ)濃度でHAO1阻害についてアッセイした。図9D〜9Lで実証されるように、試験した追加の二本鎖の多くが、試験した広範囲に改変した形態の全てにわたり0.1nM濃度であっても、強力なHAO1ノックダウン有効性を有すると同定した。事実、全ての標的配列に関して、両方の鎖上に広範囲な2’−O−メチル改変を有する1つ以上の二本鎖を、HAO1発現の強力な阻害剤であると同定した。さらに、これらの結果は、上記実施例の多くで用いたルシフェラーゼ系(Psi−Check−HsHAO1プラスミド)とHEK293−pcDNA_HAO1細胞の安定なトランスフェクタント系との間の一致を裏付けた。
上記24のHAO1標的化二本鎖配列のうち4つ、すなわちHAO1−1171、HAO1−1315、HAO1−1378およびHAO1−1501を、図10A〜10Kに示すように、2’−O−メチル改変パターン中に広範囲な変化を有するように調製した。これらの大幅に改変したDsiRNAを、安定にトランスフェクトしたHEK293細胞(HEK293−pcDNA_HAO1細胞;図10L〜10O)の環境において、1.0nMおよび0.1nM(二重アッセイ)濃度でHAO1阻害についてアッセイした。図10L〜10Oで実証されるように、HAO1−1171、HAO1−1315、およびHAO1−1501二本鎖の改変形態が、試験した広範囲に改変した形態の全てにわたり0.1nM濃度であっても、強力なHAO1ノックダウン有効性を有すると同定した。一方で、HAO1−1378二本鎖配列に関して、高度に改変した形態のいくつかは、他の大幅に改変した形態と比較した場合に(HAO1−1378二本鎖の、強力に活性した多数の大幅な2’−O−メチル改変形態を同定したが)、0.1nMで阻害活性の減少を示した。
M107/M48の2’−O−メチル改変パターンを有する8つのHAO1標的化二本鎖配列、すなわちHAO1−1105、HAO1−1171、HAO1−1221、HAO1−1272、HAO1−1273、HAO1−1316、HAO1−1378およびHAO1−1379を、脂質ナノ粒子(LNP)製剤(EnCore 2345)中でin vivo送達のために製剤化した。0.1または1.0mg/kgでの単回静脈内用量をマウス(n=5/群)に投与し、処理動物の肝臓を投与後24時間で採取した。処理マウスの肝臓におけるHAO1mRNAノックダウンの程度を、qPCRにより評価した。図13Aに示すように、in vivoノックダウン有効性について試験した8つ全てのHAO1標的化DsiRNAが、1.0mg/kg用量で活性であった。特に、HAO1−1171−M107/M48およびHAO1−1378−M107/M48二本鎖が、0.1mg/kg用量であっても、処理マウスの肝臓中でHAO1の強力なノックダウンを示した(それぞれ、およそ70%およびおよそ53%のノックダウンレベルを示した)。
HAO1研究における本知識体系は、HAO1活性をアッセイする方法ならびに研究、診断、および治療的使用のためにHAO1発現を制御できる化合物の必要性を示す。本明細書に記載されるように、本発明の核酸分子をアッセイで使用し、HAO1レベルに関連する疾患状態を診断することができる。加えて、核酸分子を使用し、HAO1機能性、誤調節、レベルなどに関連する疾患状態を治療することができる。
DsiRNA剤の血清安定性を、37℃での様々な時間(最大で24時間)の50%ウシ胎児血清中におけるDsiRNA剤のインキュベーションにより評価する。血清を抽出し、核酸を20%非変性PAGE上で分離して、Gelstar染色で視覚化できる。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対レベルを、DsiRNA(任意に改変し、および改変することなく)について評価する。
本発明のDsiRNA分子を、多様な診断用途、例えば多様な用途における、例えば臨床、工業、環境、農業および/または研究設定における分子標的(例えば、RNA)の同定などで使用することができる。このようなDsiRNA分子の診断的使用は、例えば、細胞溶解物または部分的に精製した細胞溶解物を使用する再構成RNAi系を利用することを含む。本発明のDsiRNA分子は、異常細胞内の遺伝的浮動および変異を試験するための診断ツールとして使用することができる。DsiRNA活性と標的HAO1RNAの構造との間の密接な関係によって、標的HAO1RNAの塩基対形成および3次元構造を変化させる、HAO1分子領域内での変異の検出が可能となる。本発明に記載される複数のDsiRNA分子を使用することにより、in vitroの、加えて細胞および組織中のRNA構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。DsiRNA分子による標的HAO1RNAの開裂を使用して、遺伝子発現を阻害し、HAO1関連疾患または障害の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義することができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要なメディエーターとして定義することができる。これらの実験は、併用療法(例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のDsiRNA分子、既知の小分子阻害剤と一体になったDsiRNA分子、またはDsiRNA分子および/もしくは他の化学分子もしくは生体分子の組み合わせによる間欠的治療)の可能性を提供することにより、疾患進行の良好な治療をもたらすだろう。本発明のDsiRNA分子の他のin vitro使用は本技術分野において周知であり、疾患または関連状態に関連するRNAの存在の検出を含む。このようなRNAを、標準的手法、例えば蛍光共鳴発光移動(FRET)を使用して、DsiRNAによる処理後の開裂産物の存在を決定することにより検出する。
Claims (23)
- 二本鎖核酸を含む、原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)を有する対象の治療のための薬剤であって、
前記二本鎖核酸が、二本鎖領域を形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖および第2のオリゴヌクレオチド鎖を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも15ヌクレオチドに沿って配列番号:1537〜1920から選択される標的HAO1mRNA配列に対して、相補的であるか、または厳密性条件下においてハイブリダイズし、かつ前記二本鎖核酸の有効量が前記対象に投与されたときにHAO1標的mRNAの発現を低減する、薬剤。 - 二本鎖核酸を含む、原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)を有する対象の治療のための薬剤であって、
前記二本鎖核酸が、二本鎖領域を形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖および第2のオリゴヌクレオチド鎖を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19の連続したヌクレオチドに沿って配列番号:1823に記載の標的HAO1mRNA配列に対して、相補的であり、かつ前記二本鎖核酸の有効量が前記対象に投与されたときにHAO1標的mRNAの発現を低減する、薬剤。 - 前記第2の鎖が21の連続したヌクレオチドに沿って配列番号:1823に記載のHAO1mRNA配列に対して100%相補的である、請求項2に記載の薬剤。
- 前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象におけるシュウ酸塩蓄積を阻害する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象の尿におけるグリコール酸塩/クレアチニン比を増加させ、および前記対象の尿におけるシュウ酸塩/クレアチニン比を減少させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象の腎臓におけるカルシウム沈着の蓄積を阻害する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記薬剤の前記対象への投与が、皮下に適用される、請求項1に記載の薬剤。
- 前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象におけるHAO1mRNAレベルを少なくとも50%減少させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象におけるHAO1mRNAレベルを少なくとも80〜90%減少させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記対象がヒト患者である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記対象が小児のヒト患者である、請求項10に記載の薬剤。
- 前記対象が、シュウ酸塩の蓄積を引き起こすAGT1変異を有している、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖および/または前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の1つまたは複数のヌクレオチドに1つまたは複数のGalNAc部分が付着した、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端ヌクレオチドに、1つまたは複数のGalNAc部分が付着した、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖が15〜66ヌクレオチドの長さであり、
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が19〜66ヌクレオチドの長さである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。 - 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖が21ヌクレオチドの長さであり、
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が23ヌクレオチドの長さである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。 - 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が2ヌクレオチドの長さの3’オーバーハングを形成する、請求項16に記載の薬剤。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖および/または前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、1つまたは複数の改変ヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記1つまたは複数の改変ヌクレオチドのそれぞれが、独立して2’−O−メチル改変ヌクレオチドまたは2’−フルオロ改変ヌクレオチドである、請求項18に記載の薬剤。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖が、第2のオリゴヌクレオチド鎖とともに形成された二本鎖領域を超えて伸長した3’領域を含み、
前記第1のオリゴヌクレオチド鎖がテトラループを含む、請求項19に記載の薬剤。 - 二本鎖核酸を含む、原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)を有する対象における腎障害の減少または予防のための薬剤であって、
前記二本鎖核酸が、二本鎖領域を形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖および第2のオリゴヌクレオチド鎖を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも15ヌクレオチドに沿って配列番号:1537〜1920から選択される標的HAO1mRNA配列に対して、相補的であるか、または厳密性条件下においてハイブリダイズし、かつ前記二本鎖核酸の有効量が前記対象に投与されたときにHAO1標的mRNAの発現を低減し、
前記第1のオリゴヌクレオチド鎖および/または前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、2’−O−メチル改変ヌクレオチドおよび2’−フルオロ改変ヌクレオチドから独立して選択される1つまたは複数の改変ヌクレオチドを含み、
前記第1のオリゴヌクレオチド鎖および/または前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の1つまたは複数のヌクレオチドに1つまたは複数のGalNAc部分が付着した、薬剤。 - 二本鎖核酸を含む、原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)を有する対象における腎障害の減少または予防のための薬剤であって、
前記二本鎖核酸が、二本鎖領域を形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖および第2のオリゴヌクレオチド鎖を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19の連続したヌクレオチドに沿って配列番号:1823に記載の標的HAO1mRNA配列に対して、相補的であり、かつ前記二本鎖核酸の有効量が前記対象に投与されたときにHAO1標的mRNAの発現を低減し、
前記第1のオリゴヌクレオチド鎖および/または前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、2’−O−メチル改変ヌクレオチドおよび2’−フルオロ改変ヌクレオチドから独立して選択される1つまたは複数の改変ヌクレオチドを含み、
前記第1のオリゴヌクレオチド鎖および/または前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の1つまたは複数のヌクレオチドに1つまたは複数のGalNAc部分が付着した、薬剤。 - 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖が21ヌクレオチドの長さであり、
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が23ヌクレオチドの長さであり、
前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が2ヌクレオチドの長さの3’オーバーハングを形成する、請求項21または22に記載の薬剤。
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