JP2017079761A

JP2017079761A - 修飾を有するｄｓＲＮＡによる遺伝子発現の特異的な阻害のための組成物および方法

Info

Publication number: JP2017079761A
Application number: JP2016240842A
Authority: JP
Inventors: ボブブラウン，; Brown Bob
Original assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2017-05-18
Also published as: EP2341943A2; DK2341943T3; PT2341943T; ES2708944T3; EP2341943B1; AU2009293636A1; CA2738625A1; JP2015221042A; JP2012504389A; WO2010033225A3; US20100331389A1; US20130041010A1; EP2341943A4; JP6295232B2; CA2738625C; WO2010033225A2

Abstract

【課題】修飾を有するｄｓＲＮＡによる遺伝子発現の特異的な阻害のための組成物の提供。【解決手段】単離された二重鎖RNA（dsRNA）であって、i）長さが19〜80ヌクレオチドのセンス鎖、及びii）長さが19〜35ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、長さが15〜35塩基対の二重鎖を形成し；前記センス鎖は、前記二重鎖に隣接するテトラループを含み、かつ前記テトラループは、2'-糖置換を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含み；前記dsRNAは、前記センス鎖の5'末端と前記アンチセンス鎖の3'末端との間に不連続を含み；及び前記dsRNAは、哺乳動物細胞における標的遺伝子発現を減少させる、単離されたdsRNA。前記テトラループは、ＵＮＣＧ、ＧＮＲＡ、ＣＵＵＧ、ｄ（ＧＮＮＡ）、ｄ（ＧＮＡＢ）、ｄ（ＣＮＮＧ）及びｄ（ＴＮＣＧ）から選択される核酸配列を有するｄｓＲＮＡ。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2008年9月22日に出願の米国仮特許出願第61/136,736号に、および2008年9月22日に出願の仮特許出願第61/136,741号に関し、かつこれらに対して米国特許法§119（e）下で優先権を主張し、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。

本発明の背景
二本鎖RNA（dsRNA）による遺伝子発現の抑制は、植物（転写後遺伝子抑圧；Napoli et al., 1990）、真菌（quelling；RomanoおよびMarcino（1992））、および線虫（RNA干渉；Fire et al., 1998）を含む多様な系において証明されている。二重鎖RNA（dsRNA）は、一本鎖RNA（ssRNA）よりもかなり安定である。たとえば、Wengel et al.に対するWO2007107162は、dsRNAを記述する。dsRNAおよびssRNAの安定性の相違は、細胞内環境において顕著である（Raemdonck et al., 2006）。しかし、修飾されていないsiRNAsは、相当にヌクレアーゼリッチな環境である血清中で迅速に分解される。化学的修飾は、有意にsiRNAを安定化すること、並びにインビトロでおよびインビボの両方における効力を改善することができる。アンチセンスおよびリボザイム分野においてなど、合成核酸がインビボで実験的または治療的な適用のために使用される適用のために、広範な医薬品化学が過去20年にわたってなされており、ヌクレアーゼ安定性を改善し、結合親和性を増大し、および時にはまた合成核酸の薬力学的特性を改善する修飾の探索において、何百もの化合物が試験されてきた（Matteucci、1997；Manoharan、2002；Kurreck、2003）。これらの修飾の多くは、すでに試験されており、従来の21mer siRNAsに使用するための修飾因子として有用性を有することが見いだされている。いくつかの総説は、21mer siRNAsおよび化学的修飾をもつ最近の経験の概要を提供している（Zhang et al., 2006；NawrotおよびSipa、2006；Rana、2007）。また、修飾パターンは、Dicer-基質siRNAsなどのより長いRNAにおける使用について、試験され、または最適化されてきた（DsiRNAs；Collingwood et al., 2008）。

本発明は、遺伝子発現を阻害するためのRNAiにおいて有用な組成物を提供し、これらの使用方法を提供する。加えて、本発明は、能力を最大にし、Dicerプロセシングを増強し、安定性を改善し、一方で免疫系を避け、かつ毒性がないようにデザインされたRNAi組成物および方法を提供する。加えて、本発明の種々の態様は、高スループットの、研究需要を満たす小スケール合成、並びに治療的適用のための大スケール製造のために適している。本発明のこれらのおよびその他の利点、並びにさらなる発明の特色は、本明細書に提供される本発明の記述から明らかだろう。

下記のように、本発明は、遺伝子の発現または活性を阻害するための組成物および方法を特徴とする。

一つの側面において、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む単離された二重鎖RNA（dsRNA）であって、センス鎖およびアンチセンス鎖は、領域Bにおいて二重鎖を形成し；センス鎖は、3'末端にて領域Eを含み、かつ領域Eは、テトラループを含み；並びにdsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間に不連続を含む二重鎖RNA（dsRNA）を提供する（図1を参照されたい）。

もう一つの側面において、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む単離された二重鎖RNA（dsRNA）であって、センス鎖およびアンチセンス鎖は、領域Hにおいて二重鎖を形成し；アンチセンス鎖は、5'末端にて領域Jを含み、かつループは、領域Jにおいてテトラループを含み；並びにdsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間に不連続を含む二重鎖RNA（dsRNA）を提供する（図2を参照されたい）。

さらにもう一つの側面において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、細胞を、参照dsRNAと比較して細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の単離された二重鎖RNA（dsRNA）と接触させることを含み、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は、領域Bにおいて二重鎖を形成し；センス鎖は、3'末端にて領域Eを含み、かつ領域Eは、テトラループを含み；dsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間に不連続を含み；並びにアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNAに対して二重鎖を形成する方法を提供する。

さらにもう一つの側面において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、細胞を、参照dsRNAと比較して細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の単離された二重鎖RNA（dsRNA）と接触させることを含み、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は、領域Hにおいて二重鎖を形成し；アンチセンス鎖は、5'末端にて領域Jを含み、かつ領域Jは、テトラループを含み；dsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖との5'末端の間に不連続を含み；並びにアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNAに対して二重鎖を形成する方法を提供する。

さらにもう一つの側面において、本発明は、被験体の細胞における標的遺伝子の発現を減少させる医薬組成物であって、参照dsRNAと比較して細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の単離された二重鎖RNA（dsRNA）および薬学的に許容される担体を含み、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は、領域Bにおいて二重鎖を形成し；センス鎖は、3'末端にて領域Eを含み、かつ領域Eは、テトラループを含み；dsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間に不連続を含み；並びにアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNAに対して二重鎖を形成する医薬組成物を提供する。

さらにもう一つの側面において、本発明は、被験体の細胞における標的遺伝子の発現を減少させる医薬組成物であって、参照dsRNAと比較して細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の単離された二重鎖RNA（dsRNA）および薬学的に許容される担体を含み、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は、領域Hにおいて二重鎖を形成し；アンチセンス鎖は、5'末端にて領域Jを含み、かつ領域Jは、テトラループを含み；dsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間に不連続を含み；並びにアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNAに対して二重鎖を形成する医薬組成物を提供する。

さらにもう一つの側面において、本発明は、長さが35〜39ヌクレオチドである第1のオリゴヌクレオチド鎖であって、3'末端からのヌクレオチド11〜16は、3'末端からヌクレオチド1〜6と二重鎖を形成し、かつ3'末端からのヌクレオチド7〜10は、テトラループを形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖；並びに長さが第1のオリゴヌクレオチド鎖よりも16ヌクレオチド短い第2のオリゴヌクレオチド鎖を含む単離された二重鎖RNA（dsRNA）であって、第2のヌクレオチド鎖の3'末端から始まる全てのヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端にて始まる同じ数のヌクレオチドと二重鎖を形成する、二重鎖RNA（dsRNA）を提供する。

さらにもう一つの側面において、本発明は、長さが37〜41ヌクレオチドである第1のオリゴヌクレオチド鎖であって、3'末端からヌクレオチド11〜16は、3'末端からヌクレオチド1〜6と二重鎖を形成し、かつ3'末端からヌクレオチド7〜10は、テトラループを形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖；並びに長さが第1のオリゴヌクレオチド鎖よりも14ヌクレオチド短く、かつ第2ヌクレオチド鎖の3'末端からの最後の2つのヌクレオチド以外は全て第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端にて始まるヌクレオチドの同じ数と二重鎖を形成する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含む単離された二重鎖RNA（dsRNA）を提供する。

さらにもう一つの側面において、本発明は、長さが37〜41ヌクレオチドである第1のオリゴヌクレオチド鎖であって、3'末端からヌクレオチド11〜16は、3'末端からヌクレオチド1〜6と二重鎖を形成し、かつ3'末端からヌクレオチド7〜10は、テトラループを形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖；並びに長さが第1のオリゴヌクレオチド鎖より16ヌクレオチド短く、かつ第2ヌクレオチド鎖の3'末端から始まる全てのヌクレオチドが第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端にて始まるヌクレオチドの同じ数と二重鎖を形成する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含む単離された二重鎖RNA（dsRNA）を提供する。

さらにもう一つの側面において、本発明は、長さが37〜41ヌクレオチドである第1のオリゴヌクレオチド鎖であって、3'末端からヌクレオチド11〜16は、3'末端からヌクレオチド1〜6と二重鎖を形成し、かつ3'末端からヌクレオチド7〜10は、テトラループを形成する第1のオリゴヌクレオチド鎖；並びに長さが第1のオリゴヌクレオチド鎖より18ヌクレオチド短く、かつ第2ヌクレオチド鎖の3'末端からの最後の2つのヌクレオチド以外は全て第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端にて始まるヌクレオチドの同じ数と二重鎖を形成する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含む単離された二重鎖RNA（dsRNA）を提供する。

さらなる側面において、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む単離された二重鎖RNA（dsRNA）であって、センス鎖およびアンチセンス鎖は、長さが22〜43塩基対である二重鎖を形成し；かつdsRNAは、センス鎖上の位置B*1、アンチセンス鎖上のB*1、センス鎖上のC*1-C*3またはアンチセンス鎖上のC*1-C*3のいずれかにて、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む二重鎖RNA（dsRNA）を提供する（図12〜17を参照されたい）。

もう一つの側面において、本発明は、参照dsRNAと比較して細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の単離された二重鎖RNAと細胞を接触させることを含む、細胞における標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は、長さが22〜43塩基対である二重鎖を形成し；dsRNAは、センス鎖上の位置B*1、アンチセンス鎖上のB*1、センス鎖上のC*1-C*3またはアンチセンス鎖上のC*1-C*3のいずれかにて、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNAに二重鎖を形成することができる方法を提供する。

さらにもう一つの側面において、本発明は、参照dsRNAと比較して細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の単離された二重鎖RNAおよび薬学的に許容される担体を含む被験体の細胞における標的遺伝子の発現を減少させるための医薬組成物であって、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は、長さが22〜43塩基対である二重鎖を形成し；dsRNAは、センス鎖上の位置B*1、アンチセンス鎖上のB*1、センス鎖上のC*1-C*3またはアンチセンス鎖上のC*1-C*3のいずれかにて、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNAに対して二重鎖形成する医薬組成物を提供する。

本発明は、遺伝子発現の特異的な阻害のための組成物および方法を提供する。本発明の側面の態様は、本明細書に定義される。本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかだろう。

図1A、1B、1Cおよび1Dは、本発明の「ニックの入ったdsRNA」の構造を示す。図1Aは、5'末端にて延長されたループをもつセンス鎖（領域E）およびセンス鎖の一本鎖部分とアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域（領域B）を含む「ニックの入ったアンチセンス」dsRNAを示す。dsRNAが二本鎖形成されるときに、不連続が存在し、ここでDicerがアンチセンス鎖を切断する（黒い矢印によって示してある）。図1Bは、5'末端にて延長されたループ（領域E）をもつセンス鎖センス鎖の一本鎖部分とアンチセンス鎖によって形成される二本鎖領域（領域B）およびアンチセンス鎖上の3フィートオーバーハング（領域F、破線の円によって示してある）を含む「ニックの入ったアンチセンス」dsRNAを示す。dsRNAが二本鎖形成されるとき、不連続が存在し、ここでDicerがアンチセンス鎖を切断する（黒い矢印によって示してある）。図1Cは、3'末端にて延長されたループをもつセンス鎖（領域J）およびセンス鎖の一本鎖部分とアンチセンス鎖によって形成される二本鎖領域（領域H）を含む「ニックの入ったセンス」dsRNAを示す。dsRNAが二本鎖形成されるとき、不連続が存在し、ここでDicerがセンス鎖を切断する（黒い矢印によって示してある）。Dicer切断部位にすぐ近接するヌクレオチドは、リボヌクレオチド（灰色）でなければならない。図1Dは、3'末端にて延長されたループをもつセンス鎖（Regoin J）およびセンス鎖の一本鎖部分とアンチセンス鎖によって形成される二本鎖領域（領域H）およびアンチセンス鎖上の3フィートオーバーハング（破線の円によって示してある領域F）を含む「ニックの入ったセンス」dsRNAを示す。dsRNAが二本鎖形成されるとき、不連続が存在し、ここでDicerがセンス鎖を切断する（黒い矢印によって示してある）Dicer切断部位にすぐ近接するヌクレオチドは、リボヌクレオチド（灰色の）でなければならない。図2Aおよび2Bは、ヌクレオチドの位置が本発明のニックの入ったdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'並びに3'末端から算出される方法を示す。図2Aは、センス鎖がテトラループをもつ延長されたループを有する（すなわち、不連続がアンチセンス鎖と同じ側のdsRNA上にある）ときに、ヌクレオチドの位置がセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'並びに3'末端から算出される方法を示す。センス鎖上のDicer切断部位を示してある（短い、黒い矢印）。図2Bは、アンチセンス鎖がテトラループをもつ延長されたループを有する（すなわち、不連続がセンス鎖と同じ側のdsRNA上にある）ときに、ヌクレオチドの位置をセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'並びに3'末端から算出する方法を示す。アンチセンス鎖上のDicer切断部位を示してある（短い、黒い矢印）。図3A〜3Cは、不連続がアンチセンス鎖（すなわち、「ニックの入ったアンチセンスdsRNA」）と同じ側のdsRNA分子上に存在する本発明のニックの入ったdsRNAの例を示す。図3Aは、ブラントエンドを有する本発明の「ニックの入ったアンチセンス」dsRNAの例を示す。図3Bは、2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する本発明の「ニックの入ったアンチセンス」dsRNAの例を示す。図3Cは、4ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する本発明の「ニックの入ったアンチセンス」dsRNAの例を示す。dsRNAが二本鎖形成されるとき、不連続が存在し、ここでDicerがアンチセンス鎖を切断する（黒い矢印）。図4A〜4Cは、不連続がセンス鎖（すなわち、「ニックの入ったセンスdsRNA」）と同じ側のdsRNA分子上に存在する本発明のニックの入ったdsRNAの例を示す。図4Aは、ブラントエンドを有する本発明の「ニックの入ったセンス」dsRNAの例を示す。図4Bは、2つヌクレオチドの3'オーバーハングを有する本発明の「ニックの入ったセンス」dsRNAの例を示す。図4Cは、4ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する本発明の「ニックの入ったセンス」dsRNAの例を示す。dsRNAが二本鎖形成されるとき、不連続が存在し、ここでDicerがセンス鎖を切断する（黒い矢印）。図5Aおよび5Bは、修飾が本発明のニックの入ったdsRNAにおいて存在してもよい位置を示す。図5Aは、分子の領域Cにおける2'-O-メチル修飾の位置（oによって示してある）を示すdsRNAを示す。図5Bは、センス鎖がテトラループをもつ延長されたループを有するdsRNAを示す（すなわち、不連続が、アンチセンス鎖と同じ側のdsRNA上にある；黒い矢印によって示してある）。図5Bに示したdsRNAにおいて、センス鎖の5'末端は、リン酸化されていてもよく（「p-」によって示してある）；ガイド鎖の5'末端は、脱リン酸化されていてもよい；アンチセンス鎖は、2'-O-メチルでアンチセンス鎖の3'末端から位置1、2および3にて修飾されていてもよく（○によって示してある）；およびアンチセンス鎖は、2'-O-メチル（oによって示してある）でアンチセンス鎖の3'末端から位置5にて始まる奇数番号をつけた位置にて修飾されていてもよい。図5Bに示したdsRNAにおいて、センス鎖は、アンチセンス鎖の3'末端から、位置11および12にてデオキシリボヌクレオチド（●によって示してある）を含んでいてもよい。図6Aおよび6Bは、修飾が本発明のニックの入ったdsRNAに存在してもよい位置を示す。図6Aは、分子の領域Cにおける2'-O-メチル修飾（○によって示してある）の位置を示すdsRNAを示す。図6Bは、アンチセンス鎖がテトラループをもつ延長されたループを有するdsRNAを示す（すなわち、不連続がセンス鎖と同じ側のdsRNA上にある；黒い矢印によって示してある）。図4Bに示したdsRNAにおいて、センス鎖の5'末端は、リン酸化されていてもよく（「p-」によって示してある）；ガイド鎖の5'末端は、脱リン酸化されていてもよく；アンチセンス鎖は、2'-O-メチルでアンチセンス鎖の3'末端から位置1、2および3にて修飾されていてもよく（○によって示してある）；およびアンチセンス鎖は、2'-O-メチル（oによって示してある）でアンチセンス鎖の3'末端から位置5にて始まる奇数番号をつけた位置にて修飾されていてもよい。図6Bに示したdsRNAにおいて、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端から位置3および4にてデオキシリボヌクレオチド（●によって示してある）を含んでいてもよい。図7は、テトラループのないdsRNAの効果、テトラループ（すなわち、UUCG）をもつdsRNAの効果、センス鎖と同じ側のニックと合わせてテトラループ（すなわち、UUCG）をもつdsRNAの効果、アンチセンス鎖と同じ側のニックと合わせてテトラループ（すなわち、UUCG）をもつdsRNAの効果およびアンチセンス鎖と同じ側のニックと合わせてもう一つのテトラループ（すなわち、GAAA）の効果を比較する実験に使用するためのdsRNA構築物を示す。dsRNAの配列は、すべてヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1（HPRT-1CC；NCBIデータベースアクセッション番号NM_000194およびGI：164518913）に基づいている。図8は、Dicerプロセシングの工程およびDicer切断の下流の工程（たとえば、Ago2相互作用、標的認識、Ago2切断）におけるRNAi経路でのこれらの効果を決定するための不連続なアンチセンス鎖を修飾する実験に使用するためのdsRNA構築物を示す。dsRNAの配列は、すべてヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1（HPRT-1CC；NCBIデータベースアクセッション番号NM_000194およびGI：164518913）に基づいている。図9は、Dicerプロセシングの工程およびDicer切断の上流の工程におけるRNAi経路でのこれらの効果を決定するための、延長されたセンス鎖を修飾する実験に使用するためのdsRNA構築物を示す。dsRNAの配列は、すべてヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1（HPRT-1CC；NCBIデータベースアクセッション番号NM_000194およびGI：164518913）に基づいている。図10は、そのように不連続の配置がDicerによって作製される切断産物を定義するかを示す。ニックの入ったdsRNA構造は、定義された21塩基アンチセンス鎖が産生されて、RISC内に挿入されるという利点をもつ独特の切断産物を指揮する。ニックを移動することにより、その他の長さのアンチセンス鎖の産生が指揮される。化学的修飾は、非21mer産物の産生を強化する。図11は、DNAテトラループおよびDNA末端がdsRNAに対するDicer活性を制御することを示す。二重鎖RNA構築物は、テトラループのないdsRNAの効果、DNAテトラループ（すなわち、d（GTTA））をもつdsRNAの効果、センス鎖と同じ側のニックと合わせてDNAテトラループ（すなわち、d（GTTA））をもつdsRNAの効果、アンチセンス鎖と同じ側のニックと合わせてDNAテトラループ（すなわち、d（GTTA））をもつdsRNAの効果およびアンチセンス鎖と同じ側のニックと合わせてもう一つのDNAテトラループ（すなわち、d（TTTT））の効果を比較する実験に使用される。dsRNAの配列は、すべてヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1（HPRT-1CC；NCBIデータベースアクセッション番号NM_000194およびGI：164518913）に基づいている。図12Aおよび12Bは、本発明のdsRNAの構造を、そのDicerとの相互作用に関して示す。図12Aは、センス鎖の5'末端およびアンチセンス鎖の3'末端によって形成されるブラントエンドをもつdsRNAの構造を示す。図12Bは、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングをもつdsRNAの構造を示す。Dicer切断部位にすぐ近接するヌクレオチドものは、リボヌクレオチド（灰色）でなければならない。図13A〜13Fは、修飾またはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAの例を示す。図13Aは、2つのブラントエンドを有する本発明のdsRNAの例を示す。図13Bは、アンチセンス鎖上に2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する本発明のdsRNAの例を示す。図13Cは、アンチセンス鎖上に4ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する本発明のdsRNAの例を示す。図13Dは、センス鎖およびアンチセンス鎖がリンカーによって接続され、かつセンス鎖の5'末端およびアンチセンス鎖の3'末端によって形成されたブラントエンドを有する本発明のdsRNAの例を示す。図13Eは、センス鎖およびアンチセンス鎖がリンカーによって接続され、かつアンチセンス鎖上に2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する本発明のdsRNAの例を示す。図13Fは、センス鎖およびアンチセンス鎖がリンカーによって接続され、かつアンチセンス鎖上に4ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する本発明のdsRNAの例を示す。「N」（灰色）によって表示されたヌクレオチドによって占められる位置は、ユニバーサルヌクレオチドを置くことができる位置を表す。図14Aおよび14Bは、それぞれ、どのようにヌクレオチドの位置が、修飾またはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'および3'末端から算出されるかを示す。図14Aおよび14Bは、それぞれ、どのようにヌクレオチドの位置が、修飾またはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'および3'末端から算出されるかを示す。図15Aおよび15Bは、それぞれ、どのようにヌクレオチドの位置が、修飾またはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'および3'末端から算出されるかを示す。図15Aおよび15Bは、それぞれ、どのようにヌクレオチドの位置が、修飾またはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'および3'末端から算出されるかを示す。図16Aおよび16Bは、それぞれ、どのようにヌクレオチドの位置が、修飾またはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'および3'末端から算出されるかを示す。図16Aおよび16Bは、それぞれ、どのようにヌクレオチドの位置が、修飾またはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の5'および3'末端から算出されるかを示す。図17は、修飾が修飾またはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAに存在していてもよい位置を示す。dsRNAにおいて、センス鎖は、位置B*1およびC*1-C*3（灰色で示した）にて、ユニバーサルヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを含み；並びにアンチセンス鎖は、位置B*1およびC*1-C*3（灰色で示した）にて、ユニバーサルヌクレオチドを含む修飾されたヌクレオチドを含む。加えて、dsRNAにおいて、センス鎖の5'末端は、リン酸化されていてもよく（「p-」によって示してある）；およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'末端から、位置1および2にて、デオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよい（●によって示してある）。Dicerは、位置C*2とC*3との間のセンス鎖で、およびアンチセンス鎖（長い矢印によって示してある）の5'末端から位置B*1とC*3との間のアンチセンス鎖でdsRNAを切断する。図18は、本発明のdsRNAの構造を、そのDicerとの相互作用に関して示す。図19は、センス鎖およびアンチセンス鎖上の位置B*1およびC*1-C*3にて位置する（「N」によって示してある）、ユニバーサルヌクレオチドを含む修飾されたヌクレオチドによる；および／または、アンチセンス鎖の5'末端から位置4〜7にアンチセンス鎖上に位置する（「N」によって示してある）、ユニバーサルヌクレオチドを含む修飾されたヌクレオチドによる、増強されたdsRNA基質のDicer切断を示す。Dicerは、センス鎖上の位置C*2とC*3との間で、およびアンチセンス鎖上の位置B*1とC*1との間でdsRNAを切断する（長い矢印によって示してある）。dsRNAにおいて、センス鎖の5'末端は、リン酸化されていてもよく（「p-」によって示してある）；アンチセンス鎖は、2'-O-メチルでアンチセンス鎖の3'末端から位置1、2および3にて修飾されていてもよく（○によって示してある）；アンチセンス鎖は、2'-O-メチルでアンチセンス鎖の3'末端から位置5にて始まる奇数番号をつけた位置にて修飾されていてもよい（oによって示してある）；およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'末端から位置1および2にてデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよい（●によって示してある）。Dicerは、センス鎖およびセンス鎖の3'末端から位置4と5との間のアンチセンス鎖で、およびアンチセンス鎖の5'末端から位置6と7との間で（長い矢印によって示してある）、dsRNAを切断する。挿入図は、dsRNA基質を、そのDicerとの相互作用に関して示す。dsRNAのDicer切断により、センス鎖上の位置C*2におけるヌクレオチドおよびアンチセンス鎖上の位置B*1におけるヌクレオチドが曝露する。dsRNAの配列は、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1（HPRT-1CC；NCBIデータベースアクセッション番号NM_000194およびGI：164518913）に基づいている。「N」（灰色）によって表示されたヌクレオチドによって占められる位置は、ユニバーサルヌクレオチドを置くことができる位置を表す。図20は、Dicer切断によりdsRNAの修飾されたヌクレオチドを曝露した後の、増強されたdsRNAとのAgo2相互作用を示す。dsRNAの切断の後、位置B*1、C*1およびC*2（センス鎖の3'末端から位置1〜3）におけるセンス鎖上の、または位置B*1（アンチセンス鎖の5'末端から位置1）にてアンチセンス鎖上の、ユニバーサル塩基を含む修飾ヌクレオチドは、増大されたAgo2と相互作用を有する。Dicerは、dsRNAを切断し（長い矢印によって示してある）、これにより、センス鎖およびアンチセンス鎖の内部の修飾されたされたヌクレオチドを曝露する。「N」（灰色）によって表示されたヌクレオチドによって占められる位置は、ユニバーサルヌクレオチドを置くことができる位置を表す。図21は、ユニバーサル塩基を含む修飾ヌクレオチドが、dsRNAのDicer切断によって作製されるアンチセンス鎖の3'末端から位置10および11に存在するときの、RNase Hドメインによる標的RNAの増強されたAgo2切断を示す。Ago2は、アンチセンス鎖の5'末端から反対位置10および11のヌクレオチドの間で標的RNAを切断する（短い矢印によって示してある）。Dicerは、dsRNAを切断し（長い矢印によって示してある）、これにより、センス鎖およびアンチセンス鎖の内部の修飾ヌクレオチドを曝露する。「N」（灰色）によって表示されたヌクレオチドによって占められる位置は、ユニバーサルヌクレオチドを置くことができる位置を表す。

発明の詳細な説明
本発明は、細胞を、細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の単離された二重鎖RNA（dsRNA）と接触させることを含む、細胞における標的遺伝子の発現を減少させる組成物および方法を提供する。本発明のdsRNAは、dsRNA安定性、有効性および／または能力を変化させることが予想される修飾を有する。

一定の側面において、本発明のdsRNAは、「ニックの入ったdsRNA」としていわれ、このようなdsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間に、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖のいずれかのDicer切断部位にて、テトラループおよび不連続を有する。ニックの入った基質は、参照dsRNAと比較すると、本発明のdsRNAのDicer切断の増加を可能にする。また、ニックの入った基質は、（たとえば、ニックを有するガイドまたはパッセンジャー鎖上の）dsRNAにおけるさらなる化学的修飾を利用する能力を提供する。

いくつかの側面において、本発明のdsRNAは、Dicer切断部位にてセンスまたはアンチセンス鎖上に修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを、並びに標的鎖がAgo2／RISCによって切断されるところと反対側のアンチセンス鎖の上に修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する。Dicer部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドは、参照dsRNAと比較すると、本発明のdsRNAのDicer切断を増大することが予想される。加えて、dsRNAのDicerプロセシングによって曝露されるアンチセンス鎖上のDicer部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドは、参照dsRNAのものと比較すると、Ago2との相互作用を増加させることが予想される。標的鎖がAgo2／RISCによって切断されるアンチセンス鎖上の修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドは、参照dsRNAのものと比較すると、Ago2／RISCによる標的RNAの切断を増強することが予想される。

本発明の「ニックの入ったdsRNA」の例を図7、8および9に示してあり、比較のための参照として対照dsRNAを含んでいる。本発明のこのようなdsRNAは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖のいずれか上のDicer切断部位にて、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間にテトラループおよび不連続を有する。本発明のこのようなdsRNAは、以下の構造を有する：センス鎖およびアンチセンス鎖；センス鎖およびアンチセンス鎖は、領域Bにおいて二重鎖を形成し；センス鎖は、3'末端にて領域Eを含み、かつ領域Eは、テトラループを含み；dsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間に不連続を含み；およびアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNAに対して二重鎖形成する。あるいは、本発明のこのようなdsRNAは、以下の構造を有する：センス鎖およびアンチセンス鎖；センス鎖およびアンチセンス鎖は、領域Hにおいて二重鎖を形成し；アンチセンス鎖は、5'末端にて領域Jを含み、かつ領域Jは、テトラループを含み；dsRNAは、センス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端との間に不連続を含み；およびアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的RNAに対して二重鎖形成する。

本発明の代わりの側面において、予測されるDicer切断の部位から置換された不連続の部位を有する「ニックの入ったdsRNA」が提供される。特に、図1AのdsRNA内で、不連続の部位は、予測されるDicer切断部位においてその位置から領域C内の代わりの位置に移されていてもよい。任意に、領域C内の不連続の部位は、Dicerがセンス鎖オリゴヌクレオチドを切断すると予測される部位の3'のままである。

修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAを図19に示してある。本発明のこのようなdsRNAは、Dicer切断部位にてセンスまたはアンチセンス鎖上の修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを、および標的鎖がAgo2／RISCによって切断されるところと反対側のアンチセンス鎖上に修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する。本発明のこのようなdsRNAは、以下の構造を有する：センス鎖およびアンチセンス鎖であって、センス鎖およびアンチセンス鎖は、長さが22〜43の塩基対である二重鎖を形成し；およびdsRNAは、センス鎖上の位置B*1、アンチセンス鎖上のB*1、センス鎖上のC*1-C*3またはアンチセンス鎖上のC*1-C*3のいずれかにて、一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む。

定義
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって共通に理解される意味を有する。以下の参照は、本発明に使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988);The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書に使用される、以下の用語は、特に明記しない限り、以下においてこれらに与えられた意味を有する。

本明細書に使用される、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖の形態の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドおよびこれらの重合体をいう。本用語は、合成の、天然に存在し、および天然に存在せず、参照核酸と同様の結合特性を有し、および参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または修飾されたバックボーン残基もしくは結合を含む核酸を包含する。このような類似体の例は、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸（PNA）を含むが、限定されない。

本明細書に使用される、「ヌクレオチド」は、当該技術分野において認識されるように、天然の塩基（標準的）および当該技術分野において周知の修飾された塩基を含むように使用される。このような塩基は、一般にヌクレオチド糖部分の1'位置に位置する。ヌクレオチドは、一般に塩基、糖およびホスフェート基を含む。ヌクレオチドは、修飾されていないこと、または糖、ホスフェートおよび／または塩基部分にて修飾されていることができ（また、ヌクレオチド類似体、修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドおよびその他とも交換可能に呼ばれる；たとえば、UsmanおよびMcSwiggen、上記；Eckstein et al., 国際PCT公開番号WO 92/07065；Usman et al、国際PCT公開番号WO 93/15187；UhlmanおよびPeymanは、上記を参照され、すべてが本明細書における参照により本明細書に援用される）。Limbach et al. Nucleic Acids Res. 22：2183、1994によって要約されるように、当該技術分野において公知の修飾された核酸塩基のいくつかの例がある。核酸分子に導入することができる塩基修飾の非限定的な例のいくつかは、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン-4-オン、ピリジン-2-オン、フェニル、プソイドウラシル、2,4,6-トリメトキシベンゼン、3-メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、5-アルキルシチジン（たとえば、5-メチルシチジン）、5-アルキルウリジン（たとえば、リボチミジン）、5-ハロウリジン（たとえば、5-ブロモウリジン）または6-アザピリミジンまたは6-アルキルピリミジン（たとえば、6-メチルウリジン）、プロピンおよびその他を含む（Burgin et al., Biochemistry 35：14090, 1996；UhlmanおよびPeyman、上記）。この側面において、「修飾塩基」は、1'位置におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはこれらの同等物を意味する。

本明細書に使用される、「二本鎖リボ核酸」または「dsRNA」は、二重鎖を形成する2つのオリゴヌクレオチド鎖を含む分子である。dsRNAは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびこれらの組み合わせを含んでいてもよい。二重鎖RNAは、RNA干渉経路におけるタンパク質およびタンパク質複合体、たとえばDicerおよびRISCのための基質である。本発明のニックの入ったdsRNAの構造を図1Aおよび1Bに示してあり、このようなdsRNAは、領域Bにおいて二重鎖および領域Cにおいて二重鎖を含む。領域Bと領域C間の境界は、アンチセンス鎖上のDicer切断部位の存在下で決定される。領域Cは、少なくとも1bp、好ましくは少なくとも2bpまたは3bpである。領域Eは、領域Cおよび領域Dを含む。また、本発明のニックの入ったdsRNAの構造を図1Cおよび1Dに示してあり、これは、領域Hにおいて二重鎖および領域Iにおいて二重鎖を含む。領域Hと領域I間の境界は、アンチセンス鎖上のDicer切断部位の存在下で決定される。領域Iは、少なくとも1bp、好ましくは少なくとも2bpまたは3bpである。領域Jは、領域Iおよび領域Dを含む。任意には、本発明のdsRNAは、領域Fを含んでいてもよい。修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAの構造を図12Aおよび12Bに示してあり、これは、領域B*において二重鎖および領域C*において二重鎖を含む。領域B*と領域C*間の境界は、アンチセンス鎖上のDicer切断部位の存在下で決定される。領域C*は、少なくとも1bp、好ましくは少なくとも2bpまたは3bpである。

本明細書に使用される、「二重鎖」は、2つの一本鎖核酸の相互作用によって形成される二重らせん構造をいう。本発明によれば、二重鎖は、センスおよびアンチセンスであるか、または標的およびアンチセンスである第1および第2の鎖を含んでいてもよい。二重鎖は、典型的には、互いに関してアンチパラレルに配置されている2つの一本鎖核酸の間の、ペアをなす塩基の水素結合（すなわち、「塩基対形成」）によって形成される。二重鎖における塩基対形成は、一般にワトソン‐クリック型塩基対によって生じ、たとえば、グアニン（G）は、DNAおよびRNAにおいてシトシン（C）と塩基対を形成し、アデニン（A）は、DNAにおいてチミン（T）と塩基対を形成し、アデニン（A）は、RNAにおいてウラシル（U）と塩基対を形成する。塩基対を形成することができる条件は、生理的または生物学的に関連した条件（たとえば、細胞内：pH 7.2、140mMカリウムイオン；細胞外pH 7.4、145mMナトリウムイオン）を含む。さらにまた、二重鎖は、隣接するヌクレオチド間のスタッキング相互作用によって安定化される。本明細書に使用される、二重鎖は、塩基対形成によって、もしくはスタッキング相互作用によって確立され、または維持され得る。二重鎖は、2つの相補核酸鎖によって形成され、これは、実質的に相補または完全に相補であり得る（下記を参照されたい）。

「相補的」または「相補性」は、核酸が従来のワトソン‐クリックまたはフーグスティーン型塩基対によって別の核酸配列と水素結合を形成することができることを意味する。本開示の核酸分子に関して、その相補配列との核酸分子のための結合自由エネルギーは、核酸の関連した機能、たとえばRNAi活性を進行させるために十分である。核酸分子のための結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野において周知である（たとえば、Turner, et al., CSH Symp. Quant. Biol. LII, pp. 123-133, 1987; Frier, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377, 1986; Turner, et al., J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785, 1987を参照されたい）。パーセント相補性は、第2の核酸配列と水素結合（たとえば、ワトソン‐クリック型塩基対）を形成することができる核酸分子における隣接する残基の割合を示す（たとえば、10ヌクレオチドを有する第2の核酸配列と塩基対形成される第1のオリゴヌクレオチドにおける合計10ヌクレオチドのうちの5、6、7、8、9または10ヌクレオチドは、それぞれ50%、60%、70%、80%、90%および100%の相補を表す）。パーセント相補性が少なくとも一定の割合であることを決定するために、第2の核酸配列と水素結合（たとえば、ワトソン‐クリック型塩基対）を形成することができる核酸分子における隣接する残基の割合を算出して、最も近い整数に四捨五入される（たとえば、23ヌクレオチドを有する第2の核酸配列と塩基対形成される第1のオリゴヌクレオチドにおける合計23ヌクレオチドのうちの12、13、14、15、16または17ヌクレオチドは、それぞれ52%、57%、61%、65%、70%および74%を表し；かつそれぞれ少なくとも50%、50%、60%、60%、70%および70%の相補性を有する）。本明細書に使用される、「実質的に相補的な」とは、これらが生物学的条件下でハイブリダイズすることができるような鎖間の相補性をいう。実質的に相補的な配列は、60%、70%、80%、90%、95%またはさらに100%の相補性を有する。加えて、2つの鎖が生物学的条件下でハイブリダイズすることができるかどうかを、これらのヌクレオチド配列を調べることによって決定する技術は、当該技術分野において周知である。

多数の塩基にわたって塩基対形成する一本鎖核酸は、「ハイブリダイズする」と言われる。ハイブリダイゼーションは、生理的または生物学的に関連した条件下で、典型的には決定される（たとえば、細胞内：pH 7.2、140mMカリウムイオン；細胞外pH 7.4、145mMナトリウムイオン）。ハイブリダイゼーション条件は、一般に一価カチオンおよび生物学的に許容される緩衝液を含み、かつ二価のカチオン、錯体アニオン、たとえばグルコン酸カリウムからのグルコナート、スクロースなどの非荷電化学種および試料における水の活性を減少させる不活性な重合体、たとえばPEGを含んでも、または含まなくてもよい。このような条件は、塩基対を形成することができる条件を含む。

ハイブリダイゼーションは、二重鎖を形成する一本鎖核酸を解離させるために必要とされる温度、すなわち（融解温度；Tm）によって測定される。また、ハイブリダイゼーション条件は、塩基対を形成することができる条件である。種々のストリンジェンシーの条件を、ハイブリダイゼーションを決定するために使用することができる（たとえば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507を参照されたい）。ストリンジェントな温度条件は、通常少なくとも約30℃の、より好ましくは少なくとも約37℃の、および最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むだろう。長さが50未満の塩基対であることが予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Tm）よりも5〜10℃低いはずであり、Tmは、以下の方程式にしたがって決定される。長さが18塩基対未満のハイブリッドについては、（Tm（℃）=2（A+T塩基の#）+4（G+C塩基の#））長さが18〜49塩基対の間のハイブリッドについては、Tm（℃）=81.5+16.6（log10［Na+］）+0.41（% G+C）-（600／N）、式中、Nは、ハイブリッドにおける塩基の数であり、かつ［Na+］は、ハイブリダイゼーション緩衝液におけるナトリウムイオンの濃度（1×SSCのための［Na+］=O.165 M）である。（ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、担体DNAの包含または除外および洗浄条件などのさらなるパラメーターの変化が当業者に周知である。）たとえば、ハイブリダイゼーション決定緩衝液を表1に示してある。

ハイブリダイゼーション条件についての有用なバリエーションが当業者にとって容易に明らかだろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、たとえば、BentonおよびDavis（Science 196：180、1977）；GrunsteinおよびHogness（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72：3961、1975）；Ausubel et al.（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience、New York, 2001）；BergerおよびKimmel（Antisense to Molecular Cloning、1987、Academic Press、New York）；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記述される。

本明細書に使用される、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド（たとえば、2'修飾をもつヌクレオチド、合成塩基類似体、その他）またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。

本明細書に使用される、「アンチセンス鎖」は、標的RNAのものに対して配列相補性を有する一本鎖核酸分子をいう。アンチセンス鎖が塩基類似体をもつ修飾ヌクレオチドを含むとき、その全長にわたって相補的である必要はないが、少なくとも標的RNAと二重鎖形成しなければならない。

本明細書に使用される、「センス鎖」は、アンチセンス鎖のものに対して配列相補性を有する一本鎖核酸分子をいう。アンチセンス鎖が塩基類似体をもつ修飾ヌクレオチドを含むとき、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長にわたって相補である必要はないが、少なくともアンチセンス鎖と二重鎖形成しなければならない。

本明細書に使用される、「ガイド鎖」は、標的RNAのものに対して相補的な配列を有し、かつ標的RNAに対する結合によってRNA干渉を生じるdsRNAの一本鎖核酸分子をいう。DicerによるdsRNAの切断の後、ガイド鎖の断片は、RISCと会合したままで、RISC複合体の成分として標的RNAに結合して、RISCによる標的RNAの切断を促進する。本明細書に使用される、ガイド鎖は、必ずしも連続した一本鎖核酸をいうわけではなく、好ましくはDicerによって切断される部位にて不連続を含んでいてもよい。ガイド鎖は、アンチセンス鎖である。

本明細書に使用される、「標的RNA」は、ターゲットされた切断または立体化学的遮断などの、アンチセンス鎖によってガイドされる調整に供されるだろうRNAをいう。標的RNAは、たとえばゲノムウイルスRNA、mRNA、プレmRNAまたは非コードRNAであることができる。好ましい標的は、ApoB、Bcl2、Hif-lalpha、SurvivinまたはH-ras、KrasもしくはN-rasなどのp21 rasなどの、疾患関連タンパク質をコードするmRNAなどの、mRNAである。

本明細書に使用される、「パッセンジャー鎖」は、ガイド鎖のものに対して相補的である配列を有するdsRNAのオリゴヌクレオチド鎖をいう。本明細書に使用される、パッセンジャー鎖は、必ずしも連続した一本鎖核酸をいうわけではなく、好ましくはDicerによって切断される部位にて不連続を含んでいてもよい。パッセンジャー鎖は、センス鎖である。

本明細書に使用される、「不連続」または「ニック」は、センス鎖またはアンチセンス鎖の単一のホスホジエステル結合における切断である。不連続は、二重鎖の1つの鎖の1つのホスホジエステル結合における切断のみをいい、1つまたは複数ヌクレオチドが失われている状況（たとえば、ギャップ）を除外する。不連続を含むセンスまたはアンチセンス鎖によって形成される二重鎖は、鎖における周囲ヌクレオチドの相互作用によって、もしくは相補鎖によって安定化され、または維持される。例示される「ニックの入ったdsRNA」二重鎖は、1つの不連続からなるが、本発明の「ニックの入ったdsRNA」二重鎖は、二重鎖がインビトロDicer基質アッセイにおいてDicer基質として働く限り、2つの、3つのまたは4つの不連続を含むことができる。

本明細書に使用される、「Dicer」は、dsRNA、たとえば二重鎖RNA（dsRNA）またはプレマイクロRNA（miRNA）を、通常3'末端に2塩基オーバーハングをもつ、長さ約20〜25ヌクレオチドの二本鎖核酸断片に切断する、RNAse IIIファミリーのエンドリボヌクレアーゼをいう。本発明のdsRNAに関して、dsRNAによって形成される二重鎖は、Dicerによって認識され、かつ二重鎖の少なくとも一方の鎖でDicer基質である。本発明の一定のdsRNA（たとえば、Dicer切断部位にてセンスもしくはアンチセンス鎖上に修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有し、および標的鎖がAgo2／RISCによって切断されるところと反対側のアンチセンス鎖上に修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有するdsRNA）については、Dicerは、センス鎖の3'末端から4番目と5番目のヌクレオチドの間でdsRNAのセンス鎖を、およびアンチセンス鎖の5'末端から6番目と7番目のヌクレオチドの間で本発明のこのようなdsRNAのアンチセンス鎖を切断する。Dicerは、RNA干渉経路における最初の工程を触媒して、結果的に標的RNAの分解を生じる。ヒトDicerのタンパク質配列は、アクセッション番号NP_085124下でNCBIデータベースにて提供され、参照として本明細書に援用される。

Dicer「切断」は、以下の通りに決定される（たとえば、Collingwood et al., オリゴヌクレオチド；18：187-200 （2008）を参照されたい）。Dicer切断アッセイにおいて、RNA二重鎖（100pmol）を1単位の組換えヒトDicer（Stratagene、La Jolla、CA）の有無において、20μｌの20mM Tris pH 8.0、200mM NaCl、2.5mM MgCl2中で、37℃にて18〜24時間インキュベートする。試料をPerforma SR 96穴プレート（Edge Biosystems、Gaithersburg、Md）を使用して脱塩させる。Dicerでの二重鎖RNA前処置および後処理のエレクトロスプレー-イオン化液体クロマトグラフィー質量分光法（ESI-LCM）を、ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェアおよびParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources, Auburn, CA）からなるOligo HTCSシステムを使用して行う（Novatia、Princeton、NJ；Hail et al., 2004）。このアッセイでは、Dicer切断が生じて、Dicer基質dsRNAの少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはさらに100%（すなわち、25〜30bp dsRNA、好ましくは26〜30bp dsRNA）が、より短いdsRNA（たとえば19〜23bp dsRNA、好ましくは21〜23 bp dsRNA）に切断される。

本明細書に使用される、「Dicer切断部位」は、DicerがdsRNAを切断する部位をいう。Dicerは、典型的にはdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖を切断する2つのRNAse IIIドメインを含む。RNAse IIIドメインとPazドメインとの間の平均距離は、それが生じる短い二重鎖核酸断片長さを決定し、この距離により、変化させることができるを（Macrae I, et al. (2006). "Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer". Science 311 (5758): 195-8.）

本明細書に使用される、「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補的領域が、相補的領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が二重鎖形成またはワトソン‐クリック型塩基対から除外される方法でハイブリダイズする、核酸の一本鎖によって形成される構造をいう。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例は、ヘアピン、ステムループまたは延長されたループなどの構造に存在する不対ヌクレオチドを含む。

本明細書に使用される、dsRNAに関して「延長ループ」は、一本鎖ループおよび加えて、1、2、3、4、5、6もしくは20までの塩基対または二重鎖形成したヌクレオチドが隣接するループをいう。たとえば、延長ループは、図1A、領域Eに、および図1B、領域Jに示してある。延長されたループにおいて、したがって、5'側でループを隣接するヌクレオチドは、3'側でループを隣接するヌクレオチド、たとえば図1Aの領域Cおよび図1Bの領域と二重鎖を形成する。延長されたヘアピンまたはステムループを形成してもよい。

dsRNAに関して、ループに隣接する塩基または二重鎖を形成するヌクレオチドはループおよび、ループを含む鎖に関するこれらの位置にしたがって、近位の、または遠位のといわれる。本明細書に使用される、「近位の」は、センス鎖の3'末端にて延長されたループ領域Eを有するセンス鎖に関して（図1A-1B、並びに5Aおよび6Aに関して）、ループに隣接する塩基対または二重鎖を形成するヌクレオチドがテトラループを形成するヌクレオチドに関して位置5'にあるときをいう（たとえば、近位ヌクレオチドは、センス鎖の領域Cの5'末端におけるヌクレオチドである）。本明細書に使用される、「近位の」は、アンチセンス鎖の5'末端にて延長されたループ領域Jを有するアンチセンス鎖に関して（図1C-1D、並びに5Bおよび6Bに関して）、ループに隣接する塩基対または二重鎖を形成するヌクレオチドがテトラループを形成するヌクレオチドに関して位置3'にあるときをいう（たとえば、近位ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の領域Iの3'末端におけるヌクレオチドである）。本明細書に使用される、「遠位の」は、センス鎖の3'末端にて延長されたループ領域Eを有するセンス鎖に関して（図1A-1B、並びに5Aおよび6Aに関して）、ループに隣接する塩基対または二重鎖を形成するヌクレオチドがテトラループを形成するヌクレオチドに関して位置3'にあるときをいう（たとえば、遠位ヌクレオチドは、センス鎖の3'末端における領域Cのヌクレオチドである）。本明細書に使用される、「遠位の」は、アンチセンス鎖の5'末端にて延長されたループ領域Jを有するアンチセンス鎖に関して（図1C〜1D、並びに5Bおよび6Bに関して）、ループに隣接する塩基対または二重鎖を形成するヌクレオチドがテトラループを形成するヌクレオチドに関して位置5'にあるときをいう（たとえば、遠位ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の5'末端において領域Iのヌクレオチドである）。

本明細書に使用される、dsRNAに関して「テトラループ」は、隣接するワトソン‐クリックハイブリダイズしたヌクレオチドの安定性に寄与する安定な二次構造を形成する4ヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）をいう。理論に限定されないが、テトラループは、スタッキング相互作用によって隣接するワトソン‐クリック塩基対を安定化さし得る。加えて、テトラループにおける4ヌクレオチドの間の相互作用には、非ワトソン‐クリック型塩基対、スタッキング相互作用、水素結合および接触相互作用を含むが、限定されない（Cheong et al., Nature. 1990 Aug 16;346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science. 1991 Juｌ 12;253(5016):191-4）。テトラループは、4つのランダムな塩基からなる単純なモデルループ配列から予想されるものよりも高い、隣接する二重鎖の融解温度（Tm）の増大を与える。たとえば、テトラループは、長さが少なくとも2塩基対の二重鎖を含むヘアピンに対して、10mM NaHPO4において少なくとも55℃の融解温度を与えることができる。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびこれらの組み合わせを含んでいてもよい。RNAテトラループの例は、テトラループ（たとえば、UUCG）、テトラループのGNRAファミリー（たとえば、GAAA）およびCUUGテトラループのUNCGファミリーを含む。（Woese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Nov;87(21):8467-71 ; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov l l ;19(21):5901-5）。DNAテトラループの例は、テトラループのテトラループ（たとえば、d（GTTA）、d（GNRA））ファミリーのd（GNNA）ファミリー、テトラループのd（GNAB）ファミリー、テトラループのd（CNNG）ファミリー、テトラループのd（TNCG）ファミリー（たとえば、d（TTCG））を含む。（Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 -14292, 2002.; SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78th; NO.2; PAGE.731 (2000)）。

本明細書に使用される、「オーバーハング」は、dsRNAの5'末端または3'末端にて2つまたは4つの遊離末端を有する二重鎖に関して、不対ヌクレオチドをいう。一定の態様において、オーバーハングは、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖上の3'または5'オーバーハングである。

本明細書に使用される、「標的」は、発現または活性が調整される任意の核酸配列をいう。詳細な態様において、標的は、RISC複合体においてアンチセンス鎖である一本鎖核酸に対して二重鎖を形成するRNAをいう。アンチセンス鎖に対する標的RNAのハイブリダイゼーションにより、RISC複合体によるプロセシングを生じる。結果的に、RRNAまたはNA、たとえばmRNAによってコードされるタンパク質の発現が減少される。

本明細書に使用される、「参照」は、標準または対照を意味する。当業者にとって明らかであるように、適切な参照は、1つの要素の効果を決定するために、1つの要素のみが変化される場合である。

本明細書に使用される、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環またはホスフェート基に対する1つまたは複数の修飾を有するヌクレオチドをいう。たとえば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジンリン酸およびシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシンモノホスフェート、デオキシグアノシンモノホスフェート、デオキシチミジンモノホスフェートおよびデオキシシチジンモノホスフェートを含むデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾は、メチルトランスフェラーゼなどのヌクレオチドを修飾する酵素による修飾によって生じる天然に存在するものを含む。また、修飾ヌクレオチドは、合成または天然に存在しないヌクレオチドを含む。ヌクレオチドにおける合成または天然に存在しない修飾は、2'修飾、たとえば2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-[2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル）］、4'チオ、4'-CH₂-O-2'-ブリッジ、4'-（CH₂）₂-O-2'-ブリッジ、2'-LNAおよびT-O-（N-メチルカルバマート）または塩基類似体を含むものを含む。本開示のために記述したような2'修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」は、2'-NH₂または2'-O-NH₂が意味され、これは、修飾され、または修飾されていないことができる。このような修飾された基、たとえばEckstein et al.,米国特許第5,672,695およびMatulic-Adamic et al.米国特許第6,248,878に記述されている。

本開示の核の分子に関して、修飾は、dsRNAの鎖上にパターンで存在していてもよい。本明細書に使用される、「交互の位置」は、全てのその他のヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドであるか、または全ての修飾されていないヌクレオチドがdsRNAの鎖の定義された長さにわたって修飾されたヌクレオチドの間にあるパターンをいう（たとえば、5'-MNMNMN-3'；3'-MNMNMN-5'；式中、Mは、修飾されたヌクレオチドであり、かつNは、修飾されていないヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書に記述された位置番号付けの慣例のいずれかにしたがって、5'または3'末端のいずれかにおける第1のヌクレオチド位置から始まる。交互の位置における修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長に伸びていてもよいが、好ましくは、それぞれ少なくとも2、3、4、5、6または7つの修飾されたヌクレオチドを含む少なくとも4、6、8、10、12、14ヌクレオチドを含む。本明細書に使用される、「交互の対の位置」は、2つの連続した修飾されたヌクレオチドがdsRNAの鎖の定義された長さにわたって2つの連続した修飾されていないヌクレオチドによって分離されるパターンをいう（たとえば、5'-MMNNMMNNMMNN-3'；3'-MMNNMMNNMMNN-5'；式中、Mは、修飾されたヌクレオチドであり、かつNは、修飾されていないヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書に記述された位置番号付けの慣例のいずれかにしたがって、5'または3'末端のいずれかにおける第1のヌクレオチド位置から始まる。交互の位置における修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長に伸びていてもよいが、好ましくは、それぞれ少なくとも4、6、8、10、12または14修飾されたヌクレオチドを含む、少なくとも8、12、16、20、24、28ヌクレオチドを含む。

本明細書に使用される、「塩基類似体」は、核酸二重鎖に組み込むことができる修飾されたヌクレオチドにおいてヌクレオチド糖部分の1'位置（または核酸二重鎖に組み込むことができるヌクレオチド糖部分置換の同等の位置）に位置する複素環式部分をいう。本発明のdsRNAにおいて、塩基類似体は、一般に共通の塩基グアニン（G）、シトシン（C）、アデニン（A）、チミン（T）およびウラシル（U）を除くプリンまたはピリミジン塩基である。塩基類似体は、dsRNAのその他の塩基または塩基類似体と二本鎖形成することができる。塩基類似体は、本発明の化合物および方法において有用なもの、たとえばBennerに対する米国特許第5,432,272号および第6,001,983号、並びにManoharanに対する米国特許公開番号20080213891に開示されており、これらは、本明細書に参照により援用される。塩基の非限定的な例は、ヒポキサンチン（I）、キサンチン（X）、3β-D-リボフラノシル-（2,6-ジアミノピリミジン；K）、3-β-D-リボフラノシル-（1-メチル-ピラゾロ［4,3-d］ピリミジン-5,7（4H,6H）-ジオン；P）、イソシトシン（イソ−C）、イソグアニン（イソ-G）、1-β-D-リボフラノシル-（5-ニトロインドール）、1-β-D-リボフラノシル-（3-ニトロピロール）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、4-チオ-dT、7-（2-チエニル）-イミダゾ［4,5-b］ピリジン（Ds）およびピロール-2-カルバルデヒド（Pa）（2-アミノ-6-（2-チエニル）プリン（S）、2-オキソピリジン（Y）、ジフルオロトリル、4-フルオロ-6-メチルベンズイミダゾール、4-メチルベンズイミダゾール、3-メチルイソカルボスチリリル、5-メチルイソカルボスチリリル、および3-メチル-7-プロピニルイソカルボスチリリル、7-アザインドリル、6-メチル-7-アザインドリル、イミダゾピリジニル、9-メチル-イミダゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル-7-アザインドリル、2,4,5-トリメチルフェニル、4-メチルインドリル、4,6-ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニルおよびこれらの構造的な誘導体を含む（Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc, 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 121 :2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc, 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc, 121 : 11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc Natl. Acad. Sci., 94: 10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans., 1 : 197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans., 1 : 1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc, 122(32):7621-7632 (2000); O'Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869- 5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc, 117: 10434-10442 (1995);および米国特許第6,218,108号）。また、塩基類似体は、ユニバーサル塩基であってもよい。

本明細書に使用される、「ユニバーサル塩基」は、修飾されたヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の位置1'に、またはヌクレオチド糖部分置換における同等の位置に位置する複素環部分をいい、核酸二重鎖に存在するときに、二重らせん構造（たとえば、ホスフェートバックボーンの構造）を変化させることなく塩基の複数のタイプの反対側に位置することができる。加えて、ユニバーサル塩基は、一本鎖核酸の、それが標的核酸に対して二重鎖形成するようにする能力を破壊しない。ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸が標的核酸と二重鎖を形成する能力は、当業者に明らかな方法（たとえば、UV吸光度、円二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性、その他）によってアッセイすることができる。加えて、二重鎖形成が観察される条件、たとえば、温度（融解温度（Tm）は、核酸二重鎖の安定性と相関するので）を変更して二重鎖の安定性または形成を決定してもよい。標的核酸に対して正確に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補核酸と形成される二重鎖よりも低いTmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。しかし、ユニバーサル塩基が単一のミスマッチを生じるように塩基で置換された参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチの塩基を有する核酸と形成された二重鎖よりも高いTmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。

いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対形成状態下でユニバーサル塩基とグアニン（G）、シトシン（C）、アデニン（A）、チミン（T）およびウラシル（U）の全ての塩基との間で水素結合を形成することによって塩基対形成することができる。ユニバーサル塩基は、1つの単一の相補塩基のみと塩基対を形成する塩基ではない。二重鎖において、ユニバーサル塩基は、二重鎖の反対鎖上のものと反対側のG、C、A、TおよびUのそれぞれと水素結合を形成しなくても、1つの水素結合を形成しても、または複数の水素結合を形成していてもよい。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二重鎖の反対鎖上のそれと反対側の塩基と相互作用しない。二重鎖において、ユニバーサル塩基間の塩基対形成は、ホスフェートバックボーンの二重らせん構造を変化させずに生じる。また、ユニバーサル塩基は、スタッキング相互作用によって同じ核酸鎖上の隣接するヌクレオチドの塩基と相互作用していてもよい。このようなスタッキング相互作用は、特にユニバーサル塩基が二重鎖の反対鎖上のそれと反対側に位置した塩基と任意の水素結合を形成しない状況で、二重鎖を安定化する。ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定の例は、イノシン、1-β-D-リボフラノシル-5-ニトロインドールおよび／または1-β-D-リボフラノシル-3-ニトロピロールを含む（Quay et al.に対する米国特許出願公開番号20070254362；Van Aerschot et al., An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11 ;23(21):4363-70; Loakes et al., 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res. 1995 Jul 11 ;23(13):2361-6; Loakes and Brown, 5-Nitroindole as an universal base analogue. Nucleic Acids Res. 1994 Oct l l ;22(20):4039-43）。

本明細書に使用される、「酵素的に合成された」dsRNAは、天然に存在する酵素（たとえば、メチルトランスフェラーゼ、切断酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、スルフリラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ）を含む酵素と核酸の反応によって産生される修飾をもつdsRNAをいう。対応して、本明細書に使用される、「酵素的」修飾は、天然に存在する酵素を含む酵素と核酸の反応によって産生されるものをいう。

本明細書に使用される、「化学的に合成された」dsRNAは、たとえば酵素を使用することなく、化学的反応を使用することにより産生されるdsRNAをいう。RNA分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において、特にVermaおよびEckstein（1998）に記載されているように、または本明細書に記述したような化学的合成方法が知られている。一般に、dsRNA構築物は、固相オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成することができる（たとえばUsman et al.,米国特許第5,804,683号；第5,831,071号；第5,998,203号；第6,117,657号；第6,353,098号；第6,362,323号；第6,437,117号；第6,469,158号；Scaringe et al.,米国特許第6,111,086号；第,008,400号；第6,111,086号を参照されたい）。

本明細書に使用される、「増加する」または「増強する」は、アッセイにおいて参照と比較して少なくとも5%までポジティブに変化させることを意味する。変化は、アッセイにおいて参照と比較して5%、10%、25%、30%、50%、75%またはさらに100%までであってもよい。「Dicer切断を増強する」は、DicerによるdsRNA分子の量のプロセシングにより、より多くのDicerで切断されたdsRNA産物を生じること、またはDicer切断反応が本開示のインビボまたはインビトロアッセイにおいて、参照dsRNAの同じ量のプロセシングと比較して、より迅速に生じることを意味する。一つの態様において、dsRNA分子の増強され、または増加されたDicer切断は、適切な参照dsRNA分子で観察されるもののレベルを上回る。もう一つの態様において、dsRNA分子の増強され、または増加されたDicer切断は、不活性または減弱された分子で観察されるもののレベルを上回る。

「Ago2との相互作用を増強する」は、DicerでプロセスされたdsRNAのAgo2との会合が、本開示のインビボまたはインビトロアッセイにおける参照dsRNAの会合と比較して、より安定であるか、またはより迅速に生じることを意味する。「Ago2／RISCによる切断を増強する」は、dsRNAのアンチセンス鎖に結合したAgo2／RISCによる標的RNA分子の量のプロセシングにより、より多くのAgo2／RISCで切断された標的RNAを生じること、または本開示のインビトロまたはインビボアッセイにおいて、Ago2／RISCによる標的RNA切断が、参照dsRNAからのアンチセンス鎖がAgo2／RISCと会合しているときのものと比較してより迅速に生じることを意味する。

本明細書に使用される、「減少させる」は、アッセイにおいて参照と比較して少なくとも5%までネガティブに変化させることを意味する。変化は、アッセイにおいて参照と比較して5%、10%、25%、30%、50%、75%またはさらに100%までであってもよい。「発現を減少させる」は、一つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現または一つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするRNA分子もしくは同等なRNA分子のレベルまたは標的遺伝子によってコードされる一つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルもしくは活性が、本開示のインビボまたはインビトロアッセイにおける核酸分子（たとえば、dsRNA分子）がない場合に観察されもの以下に減少されることを意味する。一つの態様において、dsRNA分子での阻害、ダウンレギュレーションまたは減少は、不活性または減弱された分子の存在下において観察されるレベル以下である。もう一つの態様において、dsRNA分子での阻害、ダウンレギュレーションまたは減少は、たとえばスクランブルされた配列をもつ、またはミスマッチをもつdsRNA分子の存在下において観察されるレベル以下である。もう一つの態様において、本開示の核酸分子での遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーションまたは減少は、その非存在におけるよりも核酸分子の存在下において大きい。

本明細書に使用される、「細胞」は、原核生物（たとえば、細菌）および真核生物（たとえば、哺乳動物または植物）の両方の細胞を含むことが意味される。細胞は、体細胞系列または生殖系列起源でもよく、全能性または多能性でもよく、および分裂しても、または分裂しなくてもよい。また、細胞は、配偶子もしくは胚、幹細胞もしくは完全に分化した細胞に由来することができ、または含むことができる。したがって、「細胞」という用語は、その通常の生物学的意味を保持することが意味される、たとえば、トリ、植物、並びにたとえばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコを含む哺乳類などの任意の生物体に存在することができる。一定の側面内において、「細胞」という用語は、特に本開示の1つまたは複数の単離されたdsRNA分子を含むヒト細胞などの、哺乳動物細胞をいう。特定の側面において、細胞は、標的核酸のRNA干渉を生じるdsRNAをプロセスし、RNAiのために必要とされるタンパク質およびタンパク質複合体、たとえば、DicerおよびRISCを含む。

本明細書に使用される、「動物」は、哺乳類、特にヒトを含む、多細胞の、真核生物を意味する。本発明の方法は、一般に、哺乳類、特にヒトを含む、その必要のある被験体（たとえば、動物、ヒト）に対する本明細書の式の構造の薬剤などの本明細書の薬剤の有効量の投与を含む。このような治療は、疾患またはその症候に罹患し、有して、感受性であり、またはリスクがある被験体、特にヒトに対して適切に投与されるだろう。

「薬学的に許容される担体」は、これらの所望の活性のために最も適した物理的な位置における本開示の核酸分子の有効な分布が可能な組成物または製剤を意味する。

本発明は、真核細胞における標的遺伝子の発現を減少させることができる、二重鎖RNA（「dsRNA」）を含む組成物およびこれらを調製するための方法に向けられる。

本発明の「ニックの入ったdsRNA」側面について、dsRNAの鎖の一方は、標的遺伝子から転写されるRNAの破壊を指揮することができる約15〜約22ヌクレオチドの範囲の長さを有するヌクレオチド配列の領域を含む。また、本発明のこのような「ニックの入ったdsRNA」は、テトラループを含む延長されたループを含む。一部の態様において、テトラループを含む延長ループは、センス鎖の3'末端にる。その他の態様において、テトラループを含む延長ループは、アンチセンス鎖の5'末端にある。

本発明の「ニックの入ったdsRNA」の側面は、少なくとも部分的には、それがDicer RNAse III切断に対してコンピテントである必要がないので、dsRNAにおけるニックの入った鎖が化学的修飾を受け入れるという発見に基づいている。dsRNAにおけるニックの存在により、アンチセンスまたはセンス鎖のいずれか上に、複数の目的のための修飾を可能にすることができる。限定されないが、このような有利な目的は、センス鎖をサイレンスすること、全構築物を安定化すること、送達を増強すること、薬物生体反応学、複雑製剤への充填、作用の期間を増加させること、能力、特異性を含む。本発明の「ニックの入ったdsRNA」の側面は、また、少なくとも部分的には、dsRNAにおけるニックの入った鎖が実質的に1つのDicer切断産物のみの産生を指揮することができるという発見に基づいている。dsRNAの2つのDicer RNAse III切断部位の一方の位置におけるdsRNAのニックの配置は、他方の部位にDicerを向けることによって、他方の部位におけるDicer切断を定義する。しかし、3つの一本鎖核酸から形成されるニックの入った二重鎖構造は、生理的または生物学的条件下で不安定であると予想される。したがって、本発明の一定の側面は、また、dsRNAが2つの鎖のみから形成され、ニックの入ったdsRNA基質の安定性を増大するという特色を含む。

本発明の2本鎖のニックの入ったdsRNA基質は、テトラループを含む延長されたループを含む。ニックの入ったdsRNA基質のいくつかの態様において、テトラループを含む延長されたループは、センス鎖の3'末端に配置される。ニックの入ったdsRNA基質のその他の態様において、テトラループを含む延長されたループは、アンチセンス鎖の5'末端に配置される。dsRNAの安定性は、特にテトラループの包含によって増強され、これはストリンジェントな条件（たとえば、低塩条件）下でさえ熱力学的安定性をもつ二次構造をとる。また、テトラループをもつこのようなdsRNAのさらなる利点も想定される。二重鎖核酸の「裸の」末端は、免疫系刺激を含む強力な生物学的効果を有する。最初のDsiRNA配置の末端の1つの有効な除去は、また、いくつかの適用において望ましくない免疫促進の可能性を減少させる。また、dsRNAの末端は、ヘリカーゼおよび／またはヌクレアーゼのための侵入の鍵となる点であり、したがって、テトラループを含むニックの入ったdsRNAは、両者に対してより耐性であるべきである。

テトラループを有するニックの入ったdsRNA基質に関するその他の利点は、センス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチドの修飾を想定する。不連続がアンチセンス鎖上に存在するとき、アンチセンス鎖修飾は、RNA干渉経路においてより許容される。不連続がセンス鎖上に存在するとき、センス鎖修飾は、RNA干渉経路においてより許容される。本発明は、より大きな程度のセンス鎖およびアンチセンス鎖の修飾が可能である。また、本発明は、Dicerおよび／またはAgo2によるプロセシングを妨げることなく、より多くのタイプのアンチセンス鎖の修飾が可能である。さらにまた、より許容される特定の修飾は、さらなる利点、たとえばAgo2結合の増強を有し得ると考えられる。

特異的な部位（たとえば、Dicer切断部位におけるセンスまたはアンチセンス鎖上、および標的鎖がAgo2／RISCによって切断されるところと反対側のアンチセンス鎖上）に修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAについては、dsRNAの鎖の一方は、標的遺伝子から転写されるRNAの発現を阻害することに関してアンチセンス鎖として作用することができる約22〜約47ヌクレオチドの範囲である長さを有するヌクレオチド配列の領域を含む。特に、図12、15A、15B、16A、16Bおよび17を参照し、このようなdsRNAは、センス鎖上の位置B*1、C*1-C*3またはアンチセンス鎖上の位置B*1、C*1-C*2のいずれかにおける複数の修飾されたヌクレオチド；センス鎖上の位置C*1-C*2またはアンチセンス鎖上の位置B*1のいずれかにおける複数の修飾ヌクレオチド；アンチセンス鎖上の位置B*1における修飾されたヌクレオチド；アンチセンス鎖上の位置C*9-C*12のいずれかにおけるアンチセンス鎖上のユニバーサルヌクレオチド；またはその組み合わせを含む。

本発明のこのような側面は、少なくとも部分的には、RNA干渉経路におけるタンパク質によるdRNAとの相互作用またはそのプロセシングを増強するdsRNAにおける修飾を行うことができるという発見に基づいている。本発明のこのようなdsRNA基質の利点は、Dicerによって修飾されたdsRNAの切断の増強を含む。具体的には、本発明のこのようなdsRNAにおいて、、センス鎖上の位置B*1、C*1-C*3に、またはアンチセンス鎖上の位置B*1、C*1-C*3に、1つまたは複数の修飾されたヌクレオチドが存在する。これらの位置は、dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖上の両方のDicer切断部位を包含する。特に、センス鎖上の位置B*1、C*1-C*3における、またはアンチセンス鎖上の位置B*1、C*1-C*3における修飾されたヌクレオチドは、Dicer切断のために重要である。任意の特定の理論に限定されないが、センス鎖上の位置B*1、C*1-C*3またはアンチセンス鎖上の位置B*1、C*1-C*3にて修飾されたヌクレオチドは、Dicerに対する結合を増強することまたは好ましい配列をDicerに提供することにより、DicerによるdsRNAの切断を促進する。

特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNA基質のさらなる利点は、Ago2との相互作用の増強を含む。特に、図12、15A、15B、16A、16Bおよび17を参照し、センス鎖上の位置B*1、C*1およびC*2またはアンチセンス鎖上のB*1にて修飾されたヌクレオチドは、Ago2相互作用にとって重要である。任意の特定の理論に限定されないが、センス鎖上の位置B*1、C*1およびC*2またはアンチセンス鎖上の位置B*1にて修飾されたヌクレオチドは、DicerによるdsRNAの切断の後に曝露され、DicerでプロセスされたdsRNAのAgo2に対する結合を増強する。具体的には、アンチセンス鎖上の位置B*1にて修飾されたヌクレオチドは、DicerがdsRNAをプロセスした後、Ago2との相互作用を増強した。任意の特定の理論に限定されないが、曝露されたときにアンチセンス鎖上の位置B*1にて修飾されたヌクレオチドは、Ago2の結合ポケットとの相互作用を増強した。

特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のこれらのdsRNA基質のさらなる利点は、アンチセンス鎖またはその一部がRISCに結合されるときの、標的RNAの切断の増強を含む。dsRNAは、アンチセンス鎖上の位置C*9-C*12のいずれかにアンチセンス鎖上のユニバーサルヌクレオチドを含むことができる。本発明のdsRNAにおいて、これらの位置は、また、アンチセンス鎖上のDicer切断部位から位置9〜12に対応する。任意の特定の理論に限定されないが、アンチセンス鎖上の位置C*9-C*12にて修飾されたヌクレオチドは、Ago2／RISCによる触媒作用のために必要とされるエネルギーを下げることにより、標的RNAの切断を増強する。結果的に、本発明のこのような修飾されたdsRNAは、参照dsRNAと比較して標的遺伝子発現を減少させる。

組成物
第1の側面において、本発明は、RNA干渉（RNAi）のための新規組成物を提供する。組成物は、前駆体分子である二重鎖リボ核酸（dsRNA）のいずれかを含み、すなわち、本発明のdsRNAは、インビボでプロセスされて、活性な小さな干渉核酸（siRNA）を生じる。dsRNAは、DicerによってRISC複合体に組み込まれた活性なsiRNAにプロセスされる。前駆体分子は、また、本明細書において前駆体RNAi分子とも称される。本明細書に使用される、活性なsiRNAという用語は、それぞれの鎖がRNA、RNA類似体またはRNAおよびDNAを含むdsRNAをいう。siRNAは、19〜23ヌクレオチドを含むか、または21ヌクレオチドを含む。活性なsiRNAは、siRNAの二重鎖領域が17〜21ヌクレオチドまたは19ヌクレオチドを含むように、各鎖の3'末端に2bpオーバーハングを有する。典型的には、siRNAのアンチセンス鎖は、標的遺伝子の標的配列と実質的に相補である。

二重鎖領域は、ワトソン‐クリック型塩基対か、または相補的もしくは実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖の間で二重鎖形成が可能な任意のその他の様式のいずれかにより、互いに塩基対を形成する2つの相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの領域をいう。たとえば、21ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、21ヌクレオチド単位のもう一つのオリゴヌクレオチドと塩基対形成することができ、さらにそれぞれの鎖上の19塩基のみが相補的または実質的に相補的であり、その結果「二重鎖領域」は、19塩基対からなる。残りの塩基対は、たとえば、5'および3'オーバーハングとして存在していてもよい。さらに、二重鎖領域内において、100%の相補性は必要とされず；実質的な相補性が二重鎖領域内で許容可能である。実質的な相補性は、これらが生物学的条件下でアニーリングができるような鎖の間の相補性をいう。2つの鎖が生物学的条件下でアニーリングができるかどうかを決定する技術は、当該技術分野において公知である。あるいは、2つの鎖は、合成して、これらが互いにアニールするかどうかを決定するために、生物学的状態下で共に添加することができる。

本明細書に使用される、実質的に標的mRNA配列と相補的な配列を有するsiRNAは、siRNAが配列相補性を有すること、または二重鎖を形成してRNAi機構（たとえば、RISC複合体）またはプロセスによって標的mRNAの破壊をトリガーすることを意味する。siRNA分子は、アンチセンス鎖のあらゆる残基が標的分子における残基に対して相補であるように設計することができる。ユニバーサル塩基をもつヌクレオチドが使用される場合、siRNA分子は、標的mRNAと二重鎖形成する。あるいは、置換を分子内で行って安定性を増大すること、および／または前記分子のプロセシングを増強することができる。置換は、鎖内で行うことができ、または鎖の末端の残基に対して行うことができる。

一定の本発明の側面において、dsRNA、すなわち前駆体RNAi分子は、DicerによってプロセスされてsiRNAを産生するように、十分な長さを有する。一部の態様において、本発明の適切な「ニックの入ったdsRNA」は、延長されたループを含み、かつ長さが少なくとも19ヌクレオチドおよび長さが約80ヌクレオチド未満であるセンスオリゴヌクレオチド配列を含む。延長されたループを含むこのセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約40、50、60または70ヌクレオチドであることができる。延長されたループを含むこのセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約35もしくは37ヌクレオチドまたは長さが35ヌクレオチドであることができる。その他の態様において、特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明の適切なdsRNAは、長さが少なくとも22ヌクレオチドおよび長さが約43ヌクレオチド未満であるセンスオリゴヌクレオチド配列を含む。このセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約20、30、40または50ヌクレオチドであることができる。一定の態様において、このセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約25〜30ヌクレオチドの間である。

本発明のdsRNAのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、真核細胞の原形質内のなどの生物学的条件下で、または許容される医薬品製剤の条件下で、センスオリゴヌクレオチドにアニールして二重鎖を形成する任意の配列を有することができる。一般に、センス鎖およびアンチセンス鎖の間の二重鎖は、長さが少なくとも19塩基対および約26塩基対未満である。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドと少なくとも19の相補塩基対を有するだろうし、より典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド配列と約21以上の相補塩基対または約25以上の相補塩基対を有するだろう。一定の態様において、センスオリゴヌクレオチドは、テトラループを含む延長されたループを含む。その他の態様において、dsRNAのアンチセンス鎖の3'末端は、オーバーハングを有する。特定の態様において、3'オーバーハングは、2ヌクレオチドである。また、センス鎖は、5'ホスフェートを有していてもよい。

もう一つの態様において、本発明の「ニックの入ったdsRNA」、すなわち前駆体RNAi分子は、DicerによってプロセスされてsiRNAを産生するように、十分な長さを有する。この態様によれば、適切な「ニックの入ったdsRNA」は、延長されたループを含み、かつ長さが少なくとも27ヌクレオチドおよび長さが約70ヌクレオチド未満であるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む。延長されたループを含むこのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約40、50、60または70ヌクレオチドであることができる。延長されたループを含むこのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約35もしくは37ヌクレオチドまたは長さが35ヌクレオチドであることができる。dsRNAのセンスオリゴヌクレオチドは、真核細胞の原形質内などの生物学的条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してアニールして二重鎖をする任意の配列を有することができる。一般に、センスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと少なくとも19の相補塩基対を有するだろうし、より典型的には、センスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列と約21以上の相補塩基対または約25以上の相補塩基対を有するだろう。一定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、テトラループを含む延長されたループを含む。

一定の側面において、dsRNAのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、2つの別々のオリゴヌクレオチド鎖に存在し、化学的に合成することができ、および典型的には合成される。一部の態様において、両方の鎖は、長さが26〜30ヌクレオチドである。その他の態様において、両方の鎖は、長さが25〜30ヌクレオチドである。一つの態様において、一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖は、Dicerのための基質として役に立ち得る。その他の態様において、Dicerが、遺伝子発現を阻害する際のdsRNA構造の有効性を最大にする向きでdsRNA構造に結合するのを促進する少なくとも1つの修飾が存在する。dsRNAは、一つもしくは複数のリボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）塩基置換を含むことができる。

センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることは必要とされない。実際に、一つの態様において、センス鎖の3'末端は、一つまたは複数のミスマッチまたは塩基類似体での修飾ヌクレオチドを含む。一つの側面において、約2つのミスマッチまたは塩基類似体での修飾ヌクレオチドは、センス鎖の3'末端に組み込まれる。ミスマッチまたは熱力学的安定性の減少の使用は（具体的には、3'-センス／5'-アンチセンス位置において）、おそらく、RISCへのsiRNAの侵入に伴って生じるいくつかの律速の巻き戻し工程に影響を及ぼすことにより、RISCへのアンチセンス鎖の侵入を促進するか、または選ぶことが提唱されている（Schwarz et al., 2003；Khvorova et al., 2003）。したがって、活性な21mer siRNA二重鎖を選択するための設計アルゴリズムに、末端塩基組成が含まれた（Ui−Tei et al., 2004；Reynolds et al., 2004）。この態様のdsRNAのDicer切断では、ミスマッチまたは塩基類似体で修飾されたヌクレオチドを含む小さな末端配列は、アンチセンス鎖と不対のままである（3'-オーバーハングの部分になる）か、または最終的な21mer siRNAから完全に切断されるだろう。したがって、これらのミスマッチまたは塩基類似体で修飾されたヌクレオチドは、RISCの最終的なRNA構成成分に残らない。

25〜約30ヌクレオチドの二重鎖を有する長いdsRNA種は、作用の強度および期間に関して、予想外に有効な結果を与えることが分かっている。本発明の根底にある理論によって拘束されることは望まないが、より長いdsRNA種は、細胞の原形質におけるDicer酵素のための基質として役立つと考えられる。本発明のdsRNAをより短いセグメントに切断することに加えて、Dicerは、切断されたdsRNAに由来する一本鎖の切断産物の、標的遺伝子に由来する細胞質RNAの破壊を担うRISC複合体への組み込みを促進すると考えられる。研究では、DicerによるdsRNA種の切断性がdsRNA種の作用の強度および期間の増加に一致することが示された（Collingwood et al., 2008）。

テトラループをもつ延長されたループを含むdsRNAは、dsRNA組成物を構成する2つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに応じて産生される。テトラループまたはテトラループ構造を含む延長ループは、dsRNAに対するDicer活性を遮断しないだろうし、標的遺伝子から転写されるRNAの定方向（directed）破壊を妨げないだろう。また、適切なdsRNA組成物は、化学的連結基によって、これらのアニーリング領域の外側で化学的に連結された2つの別々のオリゴヌクレオチドから形成されるセンスまたはアンチセンス鎖を含んでいてもよい。多くの適切な化学的連結基は、当該技術分野において公知であり、使用することができる。適切な基は、dsRNAに対するDicer活性を遮断しないだろうし、標的遺伝子から転写されるRNAの破壊の誘導を妨げないだろう。

一定の態様において、dsRNA、すなわち前駆体RNAi分子は、Dicerによるそのプロセシングを増強するいくつかの特性を有する。このような態様によれば、dsRNAは、Dicerによってプロセスされて活性なsiRNAを産生するように十分な長さ、および以下の特性の少なくとも1つを有する：（i）dsRNAは、非対称であり、たとえば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有する、および、（ii）dsRNAは、センス鎖上に修飾された3'末端を有し、活性なsiRNAにDicer結合の配向およびdsRNAのプロセシングを指揮する。このような態様によれば、「ニックの入ったdsRNA」に適用されル場合、dsRNAにおいて最も長い鎖は、24〜30ヌクレオチドを含む。一つの態様において、センス鎖が22〜28ヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖が24〜30ヌクレオチドを含むように、dsRNAは、非対称である。したがって、生じるdsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは、1〜3ヌクレオチド、たとえば2ヌクレオチドである。また、センス鎖は、5'ホスフェートを有していてもよい。

本発明の「ニックの入ったdsRNA」のもう一つの態様において、センス鎖は、延長されたループをもつセンス鎖の3'末端から位置11および12に、または延長されたループをもつセンス鎖の5'末端から位置2および4に位置する適切な修飾因子によるDicerプロセシングのために修飾され、すなわち、dsRNAは、Dicer結合およびプロセシングの配向を指揮するようにデザインされる。

任意の本発明の側面については、適切な修飾因子は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等などのヌクレオチドおよび蛍光分子等などの立体障害された分子を含む。アシクロヌクレオチドは、通常dNMPsに存在する2'-デオキシリボフラノシル糖を、2-ヒドロキシエトキシメチル基で置換する。一つの態様において、デオキシヌクレオチドは、修飾因子として使用される。立体障害された分子が利用されるとき、これらはアンチセンス鎖の3'末端にてリボヌクレオチドに付着される。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにより変化しない。もう一つの態様において、本発明は、アンチセンス鎖のDicerプロセシングの配向を指揮するように、dsRNAにおける2つのDNA塩基を置換することを想定する。本発明のさらなる態様において、2つの末端DNA塩基は、センス鎖の3'末端上の2つのリボヌクレオチドを置換させて、センス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端上の二重鎖のブラントエンドを形成し、2-ヌクレオチドRNAオーバーハングは、アンチセンス鎖の3'末端上に位置する。これは、ブラントエンド上にDNAおよび突出末端上にRNA塩基をもつ非対称の組成物である。

特異的な部位にて（たとえば、Dicer切断部位におけるセンスまたはアンチセンス鎖上に、および標的鎖がAgo2／RISCによって切断されるところと反対側のアンチセンス鎖上に）修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAについては、さらなる態様において、dsRNAは、Dicerによってプロセスされて活性なsiRNAを産生するように十分な長さ、および以下の特性の少なくとも1つを有する：（i）dsRNAは、非対称であり、たとえば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有する、および（ii）dsRNAは、センス鎖上に修飾された3'末端を有し、活性なsiRNAにDicer結合の配向およびdsRNAのプロセシングを指揮する。このような態様によれば、、dsRNAにおいて最も長い鎖は、19〜43ヌクレオチドを含む。一つの態様において、センス鎖が22〜43ヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖が26〜47ヌクレオチドを含むように、dsRNAは、非対称である。したがって、生じるdsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは、1〜4ヌクレオチド、たとえば2つヌクレオチドでもよい。また、センス鎖は、5'ホスフェートを有していてもよい。

さらなる態様において、図12、15A、15B、16A、16および17Bを参照し、特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有するdsRNAについては、センス鎖は、センス鎖上の位置B*1、C*1-C*3またはアンチセンス鎖上の位置B*1、C*1-C*3のいずれかに位置する適切な修飾因子により、Dicerプロセシングのために修飾される。本発明の側面のその他の種々の態様において、dsRNAは、センス鎖上の位置B*1、C*1およびC*3またはアンチセンス鎖上の位置B*1のいずれかにて複数の修飾因子を含む。本発明の側面の詳細な態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖上の位置B*1にて修飾因子を含む。さらに他の種々の態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖上の位置B*9-B*11のいずれかにて、アンチセンス鎖上にユニバーサルヌクレオチドを含む。さらなる態様において、dsRNAは、本明細書に記述した位置の任意の組み合わせにおいて修飾因子を含む。

特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNA基質の利点は、Dicerによって修飾されたdsRNAの切断の増強および最終的なDicer産物長にわたる制御の増強を含む。具体的には、本発明のこのようなdsRNAにおいて、センス鎖上の位置B*1、C*1-C*3またはアンチセンス鎖上の位置B*1、C*1-C*3にて1つまたは複数の修飾されたヌクレオチドはが存在し、これらには、dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方上にDicer切断部位を包含する。

任意の特定の理論に限定されないが、センス鎖上の位置B*1、C*1-C*3またはアンチセンス鎖上の位置B*1、C*1-C*3にて修飾されたヌクレオチドは、Dicerに対する結合を増強すること、または切断のための好ましい配列をDicerに提供することによって、DicerによるdsRNAの切断を促進する。本発明の側面の種々の態様において、dsRNAは、参照dsRNAと比較してセンスまたはアンチセンス鎖上のDicerによる切断を増強する。本発明の側面のさらなる態様において、dsRNAは、Dicer切断の位置をより正確に定義する。

特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNA基質に関するさらなる利点は、DicerによるdsRNAの切断の後、Ago2との相互作用の増強を含む。Ago2との相互作用を増強する本明細書に記述された位置のいずれかにおける修飾ヌクレオチドは、dsRNAがAgo2によってさらにプロセスされ得る前に生じるDicerプロセシングを妨げない。任意の特定の理論に限定されないが、センス鎖上の位置B*1、C*1およびC*2またはアンチセンス鎖上の位置B*1にて修飾されたヌクレオチドは、DicerによるdsRNAの切断の後に曝露され、DicerでプロセスされたdsRNAのAgo2に対する結合を増強する。加えて、理論に限定されないが、センス鎖上の位置B*1、C*1およびC*2またはアンチセンス鎖上の位置B*1にて修飾されたヌクレオチドは、DicerによるdsRNAの切断の後に曝露され、DicerでプロセスされたdsRNAの二重鎖の巻戻しを増強する。任意の特定の理論に限定されないが、アンチセンス鎖上の位置B*1にて修飾されたヌクレオチドは、曝露されたときに、Ago2の結合ポケットとの相互作用を増強した。理論に拘束されないが、この位置にて曝露されたヌクレオチドのAgo2に対する相互作用の増強は、結合ポケットにおけるチロシン残基とのスタッキング相互作用を介して生じ得る。本発明の側面の種々の態様において、dsRNAは、参照dsRNAと比較してAgo2との相互作用を増強した。

特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNA基質に関するさらなる利点は、アンチセンス鎖またはその一部がRISCに結合されるときの、標的RNAの切断の増強を含む。結果的に、dsRNAは、参照dsRNAと比較して標的遺伝子発現を減少させる。任意の特定の理論に限定されないが、アンチセンス鎖の5'末端から位置B*9-B*11における修飾されたヌクレオチドは、Ago2／RISCによる触媒作用のためのエネルギーを下げることによって、標的RNAの切断を増強する。本発明のこのようなdsRNAにおいて、これらの位置は、また、アンチセンス鎖上のDicer切断部位から位置9〜12に対応する。理論に拘束されないが、Ago2／RISCによる標的RNAの切断の間に、切断部位に隣接した塩基の1つは、二重鎖から引き抜かれ、RNA標的バックボーンを歪める。ホスフェートバックボーンの歪みは、リン酸結合の加水開裂を行うために必要なエネルギーを減少させる。本発明の側面のさらなる態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖上の位置B*10またはB*11にてユニバーサルヌクレオチドを含む。具体的態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖上のDicer切断部位から位置10または11にて、ユニバーサルヌクレオチドを含む。本発明の側面の中でその他の態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖上の位置B*10およびB*11にてユニバーサルヌクレオチドを含む。具体的態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖上のDicer切断部位から位置10および11にてユニバーサルヌクレオチドを含む。なおさらなる態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖上の位置B*10およびB*11にてアンチセンス鎖上にユニバーサルヌクレオチドを、並びにアンチセンス鎖上の位置B*9、位置B*12の任意の1つまたは位置B*9およびB*12にてユニバーサルヌクレオチドを含む。具体的態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖上のDicer切断部位から位置10および11にてユニバーサルヌクレオチドを、並びにアンチセンス鎖上のDicer切断部位から位置9、位置12の任意の1つまたは位置9および12にてユニバーサルヌクレオチドを含む。本発明の側面の種々の態様において、アンチセンス鎖は、参照dsRNAのアンチセンス鎖と比較して、Ago2／RISCによる標的RNAの切断を増強する。本発明のこのようなdsRNAの適切な修飾因子は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等などのヌクレオチドおよび蛍光分子などの立体障害された分子等を含む。

センス鎖およびアンチセンス鎖は、細胞の原形質において見いだされる条件などの生物学的条件下でアニール化される。そのほかに、dsRNAの、特にアンチセンス鎖の、配列の1つのの領域は、少なくとも19ヌクレオチドの配列長さを有し、これらヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3'末端に隣接した21ヌクレオチド領域であり、および標的遺伝子から産生されるRNAヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるか、または二重鎖形成する。

さらにこの態様によれば、dsRNA、すなわち前駆体RNAi分子は、以下のさらなる特性の1つまたは複数をまた有していてもよい：（a）アンチセンス鎖は、典型的な21merから右シフトを有する、（b）鎖は、完全に相補的でなくてもよく、すなわち、鎖は、単純なミスマッチ対形成を含んでいてもよく、並びに（c）ロックされた核酸などの塩基修飾が、センス鎖の5'末端に含まれてもよい。「典型的な」21mer siRNAは、従来の技術を使用してデザインされる。1つの技術において、様々な部位が、共通に平行して、または試薬の1つが有効だろうことが期待される同じ標的に特異的ないくつかの異なるsiRNA二重鎖を含むプールを試験される（Ji et al., 2003）。その他の技術は、活性なRNAiエフェクター分子を得る可能性を増加させるための設計則およびアルゴリズムを使用する（Schwarz et al., 2003；Khvorova et al., 2003；Ui-Tei et al., 2004；Reynolds et al., 2004；Krol et al., 2004；Yuan et al., 2004；Boese et al., 2005）。また、siRNAの高スループット選択も開発されている（米国特許出願公開番号2005/0042641 A1、参照により本明細書に援用される）。また、潜在的標的部位を二次構造予測によって解析することができる（Heale et al., 2005）。次いで、この21merを使用して、21merの5'末端上に3〜9のさらなるヌクレオチドを含むように右シフトをデザインする。これらのさらなるヌクレオチドの配列は、任意の配列を有していてもよい。一つの態様において、付加されるリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づいている。さらに本態様において、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は、必要とされない。

センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることは必要とされない。これらは、二重鎖形成するため、または生物学的条件下でアニーリングするため、および標的配列に対して十分にに相補的なsiRNAを産生するDicerのための基質を提供するためにのみ、実質的に相補であることが必要である。ロックされた核酸またはLNAは、当業者に周知である（Elman et al., 2005；Kurreck et al., 2002；Crinelli et al., 2002；BraaschおよびCorey（2001）；Bondensgaard et al., 2000；Wahlestedt et al., 2000）。一つの態様において、LNAは、センス鎖の5'末端に組み込まれる。もう一つの態様において、LNAは、アンチセンス鎖上の3'オーバーハングを含むようにデザインされた二重鎖のセンス鎖の5'末端に組み込まれる。一つの態様において、dsRNAは、35ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖および2ヌクレオチドの3'-オーバーハングをもつ21ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖をもつ、非対称の構造を有する。もう一つの態様において、dsRNAは、37ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖および2ヌクレオチドの3'-オーバーハングをもつ21ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖をもつ、非対称の構造を有する。さらにもう一つの態様において、dsRNAは、2ヌクレオチドの3'-オーバーハングをもつ35ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖および21ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖をもつ、非対称の構造を有する。さらにもう一つの態様において、dsRNAは、2ヌクレオチドの3'-オーバーハングで37ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖および21ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖をもつ、非対称の構造を有する。種々の態様において、非対称の構造を有するこのdsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端にて、2つのデオキシリボヌクレオチドをさらに含む。

本発明の側面のもう一つの態様において、dsRNA、すなわち前駆体RNAi分子は、Dicerによるそのプロセシングを増強するいくつかの特性を有する。この態様によれば、dsRNAは、Dicerによってプロセスされて活性なsiRNAを産生するように十分な長さ、および以下の特性の少なくとも1つを有する：（i）dsRNAは、非対称であり、たとえば、センス鎖上に3'オーバーハングを有する、および、（ii）dsRNAは、アンチセンス鎖上に修飾された3'末端を有し、活性なsiRNAにDicer結合の配向およびdsRNAのプロセシングを指揮する。この態様によれば、、dsRNAにおいて最も長い鎖は、35〜40ヌクレオチドを含む。一つの態様において、センス鎖は、35〜40ヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、21〜24ヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの態様において、生じるdsRNAは、センス鎖の3'末端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは、1〜4ヌクレオチドでもよい。もう一つの態様において、アンチセンス鎖は、35〜40ヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、21〜24ヌクレオチドを含む。したがって、一部の態様において、生じるdsRNAは、センス鎖の3'末端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは、1〜4ヌクレオチドでもよい。また、アンチセンス鎖は、5'ホスフェートを有していてもよい。もう一つの態様において、非対称の構造を有するこのdsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端にて、2つのデオキシヌクレオチドをさらに含む。さらにこの態様によれば、dsRNA、すなわち前駆体RNAi分子は、また、以下のさらなる特性の1つまたは複数を有していてもよい：（a）アンチセンス鎖は、典型的な21merから右シフトを有し、（b）鎖は完全に相補的ではなくてもよい、すなわち、鎖は、単純なミスマッチ対形成を含んでいてもよい。「典型的な」21mer siRNAは、上記などの従来の技術を使用してデザインされる。次いで、この21merを使用して、21merの5'末端上に1〜7のさらなるヌクレオチドを含むように右シフトをデザインする。これらのさらなるヌクレオチドの配列は、任意の配列を有していてもよい。付加されるリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列に対して相補的であってもよいが、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は、必要とされない。すなわち、結果として生じるアンチセンスsiRNAは、十分に標的配列と相補的である。第1および第2のオリゴヌクレオチドは、完全に相補であることは必要とされない。これらは、二重鎖形成するため、または生物学的条件下でアニーリングするため、および標的配列に対して十分にに相補的なsiRNAを産生するDicerのための基質を提供するためにのみ、実質的に相補的であることが必要である。

その他の態様において、特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNA組成物は、化学的連結基によってこれらのアニーリング領域の外側で化学的に連結することができる2つの別々のオリゴヌクレオチドを含む。二重鎖核酸の「裸の」末端は、免疫系刺激を含む強力な生物学的効果を有する。最初のDsiRNA配置の末端の1つの有効な除去は、また、いくつかの適用において望ましくない免疫促進の可能性を減少させる。また、dsRNAの末端は、ヘリカーゼおよび／またはヌクレアーゼのための侵入の鍵となる点であり、したがって、テトラループを含むニックの入ったdsRNAは、両者に対してより耐性であるはずである。

多くの適切な化学的連結基が当該技術分野において公知であり、使用することができる。適切な基は、dsRNAに対するDicer活性を遮断しないだろうし、標的遺伝子から転写されるRNAの破壊の誘導を妨げないだろう。あるいは、ヘアピン構造がdsNA組成物を構成する2つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに応じて産生されるように、2つの別々のオリゴヌクレオチドを第3のオリゴヌクレオチドによって連結することができる。ヘアピン構造は、dsRNAに対するDicer活性を遮断しないだろうし、標的遺伝子から転写されるRNAの破壊の誘導を妨げないだろう。詳細な態様において、ヘアピン構造は、テトラループを含む。dsRNAの安定性は、特にテトラループの包含によって増強され、これはストリンジェント条件（たとえば、10mM NaHPO₄）下でさえ熱力学的安定性をもつ二次構造をとる。また、テトラループをもつこのようなdsRNAのさらなる利点が想定される。

本発明のdsRNA組成物の1つの特色は、これらがDicerのために基質として役立つことができるということである。典型的には、本発明のdsRNA組成物は、Dicer、その他のRNAseまたはこれらを含む抽出物で処理されなかっただろう。本発明において、この種の前処理は、Dicer相互作用を防止することができる。dsRNA組成物がDicerのための基質として役に立つかどうかを決定するために、いくつかの方法が公知であり、使用することができる。たとえば、Dicer活性は、製造業者の説明書にしたがって組換えDicer酵素キット（Genlantis、San Diego、Calif.）を使用して、インビトロにおいて測定することができる。Dicer活性は、dsRNAで細胞を処理すること、およびこれらを収集する前に24時間これらを維持すること、およびこれらのRNAを単離するによってインビボで測定することができる。RNAは、製造業者の説明書にしたがってRNeasy（登録商標）Kit（Qiagen）などの標準的な方法を使用して単離することができる。単離されたRNAは、Starfire（登録商標）Oligo Labeling System (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa）などの適切な標識されたデオキシオリゴヌクレオチドで標識されたオリゴヌクレオチドでプローブすることができる標準的なRNAブロットを調製するために使用される10%PAGEゲル上で分離することができる。

dsRNAが細胞に対して有する効果は、細胞それ自体に依存し得る。いくつかの環境において、dsRNAは、1つの細胞タイプアポプトーシスまたは遺伝子サイレンシングを誘導することができ、別のものではできない。したがって、dsRNAは、1つの細胞に使用するために適し得るかもしれないし、別のものでは適していないかもしれない。「適している」と考慮すると、dsRNA組成物は、それが使用されるかもしれない全ての可能性のある環境下でない適している必要はなく、むしろ、それは、環境の特定のセット下でのみ適している必要がある。

置換および修飾
修飾は、本明細書に記述されたように、本発明のdsRNAに含めることができる。好ましくは、修飾は、修飾によりdsRNA組成物がDicerのための基質として役立つのを妨げないようになされる。

Dicer基質RNA分子への置換および修飾ヌクレオチドの導入は、外因的に送達される天然の（すなわち、標準的なヌクレオチドを有する）RNA分子に固有のインビボの安定性および生物学的利用能の潜在的な制限を克服する方法を提供する。たとえば、Dicer基質RNA分子における修飾ヌクレオチドの使用は、所与の治療的な効果のために、より低用量の特定の核酸分子を可能にさせるであろうし、これは、修飾されたヌクレオチドが血清においてより長い半減期の効果を有する場合に有利である。さらにまた、一定の置換および修飾は、特定の細胞もしくは組織をターゲットすること、またはDicer基質RNA分子の細胞の取り込みを改善することによって、Dicer基質RNAの生物学的利用能を改善することができる。したがって、本明細書に記述された修飾されたdsRNAの活性は、天然のRNA分子と比較して減少される場合であっても、分子の改善された安定性または送達のため、置換または修飾されたDicer基質RNA分子の全体の活性は、天然のRNA分子のものを上回り得る。天然の修飾されていないDicer基質RNAとは異なり、置換および修飾されたDicer基質RNAは、また、たとえばヒトにおける、インターフェロン反応またはその他の免疫調節性効果を活性化する可能性を減少させることができる。

一つの態様において、dsRNAのDicerプロセシングを増強する一つまたは複数の修飾がなされる。第二の実施態様においては、より有効なRNAi生成を生じる1つまたは複数の修飾がなされる。第3の態様において、より大きなRNAi効果を支持する1つまたは複数の修飾がなされる。第4の態様において、細胞に送達されるそれぞれのdsRNA分子当たりより大きな能力を生じる1つまたは複数の修飾がなされる。修飾は、3'末端領域、5'末端領域に、3'末端および5'末端領域の両方に、またはいくつかの例において配列内の種々の位置に組み込むことができる。上で記述した制限を意図して、任意の修飾の数および組み合わせをdsRNAに組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、これらは同じでも、または異なってもよい。塩基、糖部分、ホスフェートバックボーンおよびこれらの組み合わせに対する修飾が想定される。センス鎖の5'末端をリン酸化することができる。

ホスフェートバックボーンについて想定される修飾の例は、メチルホスホナートを含むホスホナート、ホスホロチオアートおよびアルキルホスホトリエステルなどのホスホトリエステル修飾等を含む。糖部分について想定される修飾の例は、2'-O-メチルなどの2'-アルキルピリミジン、2'-フルオロ、アミノおよびデオキシ修飾等を含む（たとえば、Amarzguioui et al., 2003を参照されたい）。塩基群について想定される修飾の例は、無塩基糖、2-O-アルキル修飾されたピリミジン、4‐チオウラシル、5‐ブロモウラシル、5-ヨードウラシルおよび5-（3-アミノアリル）-ウラシル等を含む。また、ロックされた核酸またはLNAを組み込むこともできる。多くのその他の修飾が公知であり、上記の基準を満たす限り、使用することがでる。修飾の例は、また、米国特許第5,684,143号、第5,858,988号および第6,291,438号、並びに米国特許出願公開番号2004/0203145 A1に開示されており、それぞれ参照によって本明細書に援用される。その他の修飾は、Herdewijn（2000）、Eckstein（2000）、Rusckowski et al.（2000）、Stein et al.（2001）；Vorobjev et al.（2001）に開示されている。

想定される一つまたは複数の修飾は、いずれの鎖にも組み込むことができる。DsiRNAにおける修飾の配置は、より大きな能力および安定性を与えること、毒性を減少させること、Dicerプロセシングを増強すること、および免疫応答を最小化することを含む、DsiRNAの特徴に非常に影響を及ぼし得る。

さらなる態様において、本開示にしたがってRNAiによる標的遺伝子の発現を減少する本明細書に記述した二本鎖ヌクレオチドは、一つもしくは複数の天然または合成の非標準ヌクレオシドをさらに含む。関連した態様において、非標準ヌクレオシドは、一つまたは複数のデオキシウリジン、ロックされた核酸（LNA）分子（たとえば、5-メチルウリジン、LNA）またはユニバーサル結合ヌクレオチドである。一定の態様において、ユニバーサル結合ヌクレオチドは、C-フェニル、C-ナフチル、イノシン、アゾールカルボキサミド、1-β-D-リボフラノシル-4-ニトロインドール、1-β-D-リボフラノシル-5-ニトロインドール、1-β-D-リボフラノシル〜6-ニトロインドールまたは1-β-D-リボフラノシル-3-ニトロピロールであることができる。

本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドにおいて、好ましくはアンチセンス鎖において、しかし、また任意に、センスまたは両方の鎖に存在する置換または修飾ヌクレオチドは、天然のもしくは標準的なリボヌクレオチドと同様の特性または特徴を有する本開示にしたがった修飾または置換ヌクレオチドを含む。たとえば、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドは、ノーザンコンフォメーション（たとえば、ノーザン擬回転サイクル、たとえば、Saenger、核酸構造の原理、Springer-Verlag版、1984を参照されたい）を有するヌクレオチドを含んでいてもよい。したがって、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドに、好ましくはアンチセンス鎖に、しかし、また任意に、パッセンジャー（passsenger）または両方の鎖に存在する化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に耐性であると同時に、RNAiを媒介する能力を維持する。ノーザン配置を有する例示的なヌクレオチドは、ロックされた核酸（LNA）ヌクレオチド（たとえば、2'-O,4'-C-メチレン-（D-リボフラノシル）ヌクレオチド）；2'-メトキシエチル（MOE）ヌクレオチド；2'-メチルチオエチル、2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-クロロヌクレオチド、2'-アジドヌクレオチド、5-メチルウリジンまたは2'-O-メチルヌクレオチドを含む。一定の態様において、LNAは、5-メチルウリジンLNAである。

本明細書に記述したように、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの第1および第2の鎖または本開示によって提供されるこれらの類似体は、共にアニールし、またはハイブリダイズして（すなわち、鎖間の相補性により）、約25〜約30の塩基対の長さを有する少なくとも1つの二本鎖領域を形成することができる。その他の態様において、二本鎖ヌクレオチドは、長さが約26〜約40塩基対、または約27〜約30塩基対、または約30〜約35塩基対の範囲である少なくとも1つの二本鎖の領域を有する。その他の態様において、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの2つ以上の鎖は、任意にヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共に共有結合で連結されてもよい。

一定の態様において、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドまたはこれらの類似体は、デオキシリボヌクレオチドまたは2つのデオキシリボヌクレオチド（たとえば、チミジン、アデニン）を含むオーバーハングなどの、一方または両方の3'末端上に1〜4ヌクレオチドのオーバーハングを含む。一部の態様において、二本鎖ヌクレオチドまたはこれらの類似体は、Dicer基質核酸の一端にブラントエンドを有する。一定の態様において、第1のまたは第2の鎖の5'末端がリン酸化される。本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの態様のいずれかにおいて、3'末端ヌクレオチドオーバーハングは、核酸糖、塩基もしくはバックボーンにて化学修飾されているリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの態様のいずれかにおいて、3'末端ヌクレオチドオーバーハングは、1つまたは複数のユニバーサルリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの態様のいずれかにおいて、3'末端ヌクレオチドオーバーハングは、1つまたは複数の非環式ヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの態様のいずれかにおいて、二本鎖ヌクレオチドは、5'-ホスフェート（Martinez et al., Cell. 110:563-574, 2002;およびSchwarz et al., Molec. Cell 10:537- 568, 2002を参照されたい）または5',3-ジホスフェートなどの末端ホスフェート基をさらに含むことができる。

本明細書に記載したように、たとえばRNAiによって標的遺伝子の発現が減少する本明細書に記述した二本鎖ヌクレオチドの末端構造は、ブラントエンドまたはオーバーハングを有していてもよい。一定の態様において、オーバーハングは、アンチセンス鎖の3'末端またはセンス鎖の5'末端にあってもよい。さらに、突出する配列は、標的遺伝子に対して低い特異性を有し得るので、それは、必ずしも標的遺伝子配列と相補（アンチセンス）または同一（センス）である必要はない。さらなる態様において、RNAiによって標的遺伝子の発現が減少する本明細書に記述した二本鎖ヌクレオチドは、たとえばDicer基質核酸の1つまたは複数の突出する部分にて、低分子量構造（たとえば、tRNA、rRNAもしくはウイルス核酸などの天然の核酸分子または人工核酸分子）をさらに含んでいてもよい。

さらなる態様において、本開示にしたがってRNAiによって標的遺伝子の発現が減少する本明細書に記述した二本鎖ヌクレオチドは、2'-糖置換（たとえば2'-デオキシ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル、2'-O-2-メトキシエチル、ハロゲン、2'-フルオロ、2'-O-アリルもしくはその他同種のもの、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。なおさらなる態様において、本開示にしたがってRNAiによって標的遺伝子の発現が減少する本明細書に記述した二本鎖ヌクレオチドはアルキル、無塩基、無塩基デオキシ、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、反転されたデオキシヌクレオチド部分またはこれらの任意の組み合わせなどの、第1の鎖もしくは第2の鎖の一方または両方の末端上のキャップ置換基を含む。一定の態様において、二本鎖領域内のセンス鎖の少なくとも1つまたは2つの5'末端リボヌクレオチドは、2'糖置換を有する。一定のその他の態様において、二本鎖領域内のアンチセンス鎖の少なくとも1つまたは2つの5'末端リボヌクレオチドは、2'糖置換を有する。一定の態様において、二本鎖領域内のセンス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも1つまたは2つの5'末端リボヌクレオチドは、2'糖置換を有する。

さらにその他の態様において、本開示にしたがってRNAiによって標的遺伝子（そのmRNAスプライスバリアントを含む）の発現が減少する本明細書に記述した二本鎖ヌクレオチドは、独立してホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホナート、3'-アルキレンホスホナート、5'-アルキレンホスホナート、キラルホスホナート、ホスホノアセテート、チオホスホノノーアセテート、ホスフィナート、ホスホロアミダート、3'-アミノホスホロアミダート、アミノアルキルホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ボラノホスフェート結合またはこれらの任意の組み合わせなどの少なくとも一つの修飾されたヌクレオシド環をさらに含む。

本明細書に記述されたような、修飾されたヌクレオチド間結合は、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの1つまたは複数の鎖に、たとえばアンチセンス鎖、センス鎖、両方の鎖または複数の鎖に存在することができる。本開示の本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドは、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖または両方の鎖の3'末端、5'末端または3'および5'末端の両方に、1つまたは複数の修飾されたヌクレオチド間結合を含むことができる。一つの態様において、RNAiによる標的遺伝子（その特異的または選択されたmRNAスプライスバリアントを含む）の発現を減少することができる二本鎖ヌクレオチドは、ホスホロチオアート結合など、3'末端にて1つの修飾されたヌクレオチド間結合を有する。たとえば、本開示は、1つのDicer基質核酸鎖に約1〜約8以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を有するRNAiによる標的遺伝子の発現を減少することができる二本鎖ヌクレオチドを提供する。さらにもう一つの態様において、本開示は、Dicer基質核酸鎖の両方に約1〜約8以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を有するRNAiによる標的遺伝子の発現を減少することができる二本鎖ヌクレオチド提供する。その他の態様において例示的な、本開示の二本鎖ヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖、両方の鎖または複数の鎖の5'末端にて、約1〜約5以上の連続したホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含むことができる。もう一つの例において、例示的な、本開示の二本鎖ヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖、両方の鎖または複数の鎖において、1つまたは複数のピリミジンホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含むことができる。さらに別の例では、本開示の例示的なdsRNA分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、両方の鎖または複数の鎖において、1つまたは複数のプリンホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含むことができる。

本開示のもう一つの側面において、標的mRNAに対して相補的である第1の鎖および第1の鎖に対して相補的である第2の鎖を含む、標的遺伝子の発現を減少させる二本鎖ヌクレオチドであって、第1および第2の鎖は、約25〜約30塩基対または約25〜約40塩基対の二本鎖領域を形成し；dsRNAの少なくとも1つの塩基は、塩基類似体で置換される、二本鎖ヌクレオチドが提供される。

塩基類似体はBennerに対する米国特許第5,432,272号および第6,001,983号およびManoharanに対する米国特許公開番号20080213891に開示されたものを含み、これらは、参照により本明細書に援用される。塩基の非限定的な例は、以下を含む：ヒポキサンチン（I）、キサンチン（X）、3β-D-リボフラノシル-（2,6-ジアミノピリミジン；K）、3-β-D-リボフラノシル-（1-メチルピラゾロ［4,3-d］ピリミジン-5,7（4H,6H）-ジオン；P）、イソシトシン（イソ-C）、イソグアニン（イソ-G）、1-β-D-リボフラノシル-（5-ニトロインドール）、1-β-D-リボフラノシル-（3-ニトロピロール）、５‐ブロモウラシル、2-アミノプリン、4-チオ-dT、7-（2-チエニル）-イミダゾ[4,5-d]ピリジン（Ds）およびピロール-2-カルバルデヒド（Pa）、2-アミノ-6-（2-チエニル）プリン（S）、2-オキソピリジン（Y）、ジフルオロトリル、4-フルオロ-6-メチルベンズイミダゾール、4-メチルベンズイミダゾール、3-メチルイソカルボスチリリル、5-メチルイソカルボスチリリル、および3-メチル-7-プロピニルイソカルボスチリリル、7-アザインドリル、6-メチル-7-アザインドリル、イミダゾピリジニル、9-メチル-イミダゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル-7-アザインドリル、2,4,5-トリメチルフェニル、4-メチルインドリル、4,6-ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニルおよびこれらの構造的な誘導体を含む（Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc, 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 121 :2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc, 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc, 121: 11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc Natl. Acad. Sci., 94: 10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans., 1 : 197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans., 1 : 1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc, 122(32):7621-7632 (2000); O'Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869- 5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc, 117: 10434-10442 (1995);および米国特許第6,218,108号）。また、塩基類似体は、ユニバーサル塩基であってもよい。

一定の態様において、本明細書に記述されたように、二本鎖ヌクレオチドの第1および第2番の鎖は、標的遺伝子の発現を減少させ、かつ少なくとも1つの塩基類似体を有し、共にアニールし、二重鎖形成し、またはハイブリダイズして（すなわち、鎖間の相補性による）、約25〜約30の塩基対または約25〜約40の塩基対の長さまたは組み合わせた長さを有する少なくとも1つの二本鎖領域を形成することができる。一部の態様において、二本鎖ヌクレオチドは、約25塩基対〜約30塩基対の長さの範囲である少なくとも1つの二本鎖領域を有する。その他の態様において、Dicer基質核酸は、長さが約21〜約40塩基対、または約21〜約30塩基対または約25〜約30塩基対の範囲である少なくとも1つの二重鎖領域を有する。一定の態様において、二本鎖ヌクレオチドまたはその類似体は、デオキシリボヌクレオチドまたは2つのデオキシリボヌクレオチド（たとえば、チミジン）を含むオーバーハングなど、一方または両方の3'末端上に1〜4ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一部の態様において、Dicer基質核酸分子またはその類似体は、本明細書に記述されたように、二本鎖ヌクレオチドの一方または両方の末端にてブラントエンドを有する。一定の態様において、第1または第2の鎖の5'末端がリン酸化される。

さらなる態様において、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの少なくとも1つのピリミジンヌクレオシドは、二環式糖の形態におけるロックされた核酸（LNA）であり、式中R²は、酸素であり、かつ2'-Oおよび4'-Cは、同じリボース環上のオキシメチレンブリッジを形成する。関連した態様において、LNAは、メチルウリジンLNAなどの塩基置換を有する。その他の態様において、Dicer基質核酸の第1の鎖の少なくとも1つ、少なくとも3つ、もしくは全てのウリジンは、リボチミジンもしくはリボチミジンLNAで置換されるか、またはDicer基質核酸の第2の鎖の少なくとも1つ、少なくとも3つもしくは全てのウリジンは、5-メチルウリジン、リボチミジンLNAまたはこれらの任意の組み合わせで置換される（たとえば、このような変化は、両方の鎖上で行われ、またはいくつかの置換は、1つまたは複数の5-メチルウリジンLNAと共に、リボチミジンのみ、5-メチルウリジンLNAのみまたは1つまたは複数のリボチミジンのみを含む）。

さらなる態様において、本開示に従った二本鎖ヌクレオチドまたはその類似体は、アルキル、無塩基、無塩基デオキシ、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、反転されたデオキシヌクレオチド部分またはその任意の組み合わせなどの、第1の鎖もしくは第2の鎖の一方または両方の末端上に末端キャップ置換基をさらに含む。さらなる態様において、1つまたは複数のヌクレオシド間結合は、任意に修飾することができる。たとえば、本明細書に記述された二重鎖ヌクレオチドまたはその類似体を含むものは、少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホナート、3'-アルキレンホスホナート、5'-アルキレンホスホナート、キラルホスホナート、ホスホノアセテート、チオホスホノノーアセテート、ホスフィナート、ホスホロアミダート、3'-アミノホスホロアミダート、アミノアルキルホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ボラノホスフェート結合またはこれらの任意の組み合わせである。

さらにもう一つ態様において、RNAiによって標的遺伝子の発現を減少する本明細書に記述した二本鎖ヌクレオチドは、標的mRNAに対して相補的である第1の鎖および第1の鎖に対して相補的である第2の鎖を含み、第1および第2の鎖は、約25〜約30塩基対または約25〜約40塩基対の非オーバーラップ二本鎖領域を形成する。本明細書に記述された置換または修飾のいずれも、同様にこの態様内で想定される。

本開示のもう一つの例示において、少なくとも2つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む本明細書に記述された二重鎖ヌクレオチドは、本明細書において想定される任意の化学的修飾または置換を含む塩基類似体、たとえばアルキル（たとえば、メチル）、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アルカンノーイルオキシ、アリール、アロイル、アラルキル、ニトリル、ジアルキルアミノ、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボニル、アルカノイルアミノ、カルバモイル、カルボニルアミノ、アルキルスルホンイルアミノまたはヘテロシクロ基からそれぞれ独立して選択することができる。2つ以上の修飾されたリボヌクレオチドが存在するとき、各修飾リボヌクレオチドは、塩基類似体およびフラノース環のC2位置に、同じ、もしくは異なる修飾または置換を有するように独立して修飾することができる。

その他の詳細な態様において、本開示に記述された塩基類似体をもつものを含む、1つまたは複数の修飾されたヌクレオシドは、上記の如く1つもしくは複数の複数の末端位置にて、または複数の非末端（「内部」）位置の任意の1つのもしくは組み合わせを含む、本開示の二本鎖ヌクレオチドのアンチセンスおよびセンス鎖のいずれかまたは両方上の、任意のリボヌクレオチド位置またはリボヌクレオチドの任意の組み合わせに位置することができる。この点に関しては、センスおよびアンチセンスの鎖のそれぞれは、約1〜約6以上の置換ヌクレオシドを組み込むことができる。

一定の態様において、2つ以上の修飾されたヌクレオシドが本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチド内に組み込まれるときに、修飾されたヌクレオシドの少なくとも1つは、一方もしくは両方の鎖の3'または5'末端にあるだろうし、一定の態様におけて、置換されたピリミジンヌクレオシドの少なくとも1つは、一方または両方の鎖の5'末端にあるだろう。その他の態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記述されたように、同族のmRNAをターゲットするための同種配列として構築される本明細書に記述したような修飾されていない二本鎖ヌクレオチドにおけるピリミジンの位置に対応する位置に位置する。

本明細書に記述されたように修飾ヌクレオシドを二本鎖ヌクレオチドへ置換することにより、たいてい、5'ヌクレオチド鎖分解性または3'ヌクレオチド鎖分解性の分解を含む、ヌクレオチド鎖分解性分解などの酵素的分解に対する耐性を増大させるであろう。したがって、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチドを有する対応する二本鎖ヌクレオチドと比較して、酵素的分解に対して有意な耐性を示すだろうし、これにより、生理的環境において（たとえば、真核生物標的細胞に導入されたときに）、より優れた安定性、半減期の増加およびより優れた生物学的利用能を有するだろう。ヌクレオチド鎖分解性分解に対する置換または修飾されたDicer基質RNAの耐性を増大することに加えて、本開示において記述された塩基類似体を有する1つまたは複数の修飾ヌクレオシドを組み込むことにより、本明細書に記述した二本鎖ヌクレオチドを、その他の酵素的または化学的分解プロセスに対してより抵抗性にするであろうし、したがって、置換または修飾を含まない他の同一のDicer基質RNAよりも安定であり、かつ生物が利用可能である。本開示の関連した側面において、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチド置換または修飾は、修飾されたDicer基質核酸が生物学的試料、たとえば哺乳動物細胞、細胞内コンパートメント、血清またはその他の余分の細胞の液体、組織もしくはその他のインビトロもしくはインビボの生理的コンパートメントもしくは環境と接触する研究、診断および治療方法内での使用について、修飾された二本鎖ヌクレオチドの安定性をたいてい改善するだろう。一つの態様において、診断は、単離された生物学的試料で行われる。もう一つの態様において、診断の方法は、インビトロで行われる。さらなる態様において、診断方法は、ヒトまたは動物の体に対して（直接）行われない。

本明細書に記述された、置換または修飾された二本鎖ヌクレオチドの安定性を増大させることに加えて、1つまたは複数の修飾されたヌクレオシドを、遺伝子サイレンシングのためにデザインされたDicer基質核酸における本開示において記述された塩基類似体に組み込むことにより、対応する、修飾されていない二本鎖ヌクレオチドと比較して、置換または修飾されたDicer基質核酸の融点を増加させることを含む、さらなる所望の結果を生じるだろう。したがって、二本鎖ヌクレオチド融点を増加させることにより、本置換または修飾は、置換または修飾された二本鎖ヌクレオチドの部分的な脱ハイブリダイゼーション（これは、通常生じるだろうし、修飾されていない二本鎖ヌクレオチドを一定のエキソヌクレアーゼによる分解に対してより脆弱にするだろう）の発生もしくは程度をたいてい遮断し、または減少させるだろうし、それによって、置換または修飾された二本鎖ヌクレオチドの安定性を増加させる。

本開示のもう一つの側面において、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの置換または修飾は、これらが生物学的試料と接触するときに（たとえば、潜在的な特異的および非特異的標的として存在する特異的および非特異的なmRNA種を有する標的真核細胞に導入されたときに）、置換または修飾された二本鎖ヌクレオチドの「オフターゲット効果」を減少させるだろう。関連した態様において、本開示に従った置換または修飾された二本鎖ヌクレオチドは、遺伝子サイレンシングの方法に使用され、たとえば、修飾された二本鎖ヌクレオチドが遺伝子サイレンシング活性を検出することができる条件下で曝露される、細胞またはその他の生物学的試料における標的（すなわち、相同的または同族の）遺伝子に加えて非特異的な遺伝子の活性化によって決定すると、本明細書に記述された置換または修飾された二本鎖ヌクレオチドが、対応する、修飾されていない二本鎖ヌクレオチドと比較して、オフターゲット効果の減少または除去を示す。

さらなる態様において、本開示の二本鎖ヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に相同的または対応する1つまたは複数のセンス（第2）鎖およびセンス鎖および標的遺伝子の配列に対して相補であるアンチセンス（第1）鎖を含むことができる。例示的な態様において、本明細書に記述された二重鎖ヌクレオチドの少なくとも1つは、本開示に記述された1つまたは複数の塩基類似体を組み込む（たとえば、ピリミジンが、複数のリボチミジンによって置換され、またはリボースが、2'-O-メチル置換またはその任意の組み合わせを組み込むように修飾される）。本開示に記述されたこれらのおよびその他の複数の置換または修飾は、1つまたは複数のピリミジンに、または本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドの一方もしくは両方の鎖に存在する任意の組み合わせ、かつ全てのピリミジンまでに導入することができる。

一定の側面内において、本開示は、少なくとも一方の二本鎖ヌクレオチドが二本鎖ヌクレオチド二重鎖のアンチセンス鎖のアンチコドンにおける第1、第2または第3の位置において1つまたは複数のユニバーサル結合ヌクレオチドを含み、かつ本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドが標的細胞によって発現される核酸などの標的配列に特異的に結合することができる、RNAiによって標的遺伝子の発現を減少させる二本鎖ヌクレオチド、並びに本明細書に記述された1つまたは複数の二本鎖ヌクレオチドを含む組成物を提供する。標的核酸の配列が1つまたは複数の単一ヌクレオチド置換を含む場合、ユニバーサル結合ヌクレオチドを含む二本鎖ヌクレオチドは、それが標的核酸を特異的に結合する能力を保持し、これにより、遺伝子サイレンシングを媒介し、結果としてdsRNAを媒介した遺伝子サイレンシングからの標的の逸脱を克服する。本明細書に開示された組成物および方法に適切に使用されるであろうユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例は、イノシン、1-β-D-リボフラノシル-5-ニトロインドールおよび1-β-D-リボフラノシル-3-ニトロピロールを含む。本開示の目的のためには、ユニバーサル結合ヌクレオチドは、複数のヌクレオチドタイプと水素結合されたヌクレオチド対を形成することができるヌクレオチドである。

上記の組成物のための非限定の例は、dsRNA分子のアンチセンス鎖のアンチコドン内のチロシン（AUA）またはフェニルアラニン（AAAまたはGAA）システイン（ACAまたはGCA）、ヒスチジン（AUGまたはGUG）、アスパラギン（AUUまたはGUU）、イソロイシン（UAU）およびアスパルテート（AUCまたはGUC）のためのアンチコドンを修飾することを含む。

たとえば、一定の態様内において、AUAが同族のコドンであるイソロイシンアンチコドンUAUは、第3の位置のウリジン（U）ヌクレオチドがユニバーサル結合ヌクレオチドイノシン（I）で置換されてアンチコドンUAIを生じるように修飾されていてもよい。イノシンは、アデノシン（A）、ウリジン（U）およびシチジン（C）ヌクレオチドとヌクレオチド対になることができるが、グアノシン（G）とはできない例示的なユニバーサル結合ヌクレオチドである。この修飾アンチコドンUAIは、Dicer基質核酸分子の特異的な結合能力を増加させ、したがって、Dicer基質核酸を、コーディング鎖の対応する位置にAUA、UUAおよびCUAの任意の1つを有するmRNAと対形成させ、これによりDicer基質核酸が特異的に結合され得る、利用可能な核酸分解標的の数を拡大することができる。

あるいは、アンチコドンAUAは、また、アンチコドンの3番目または2番目の位置においてユニバーサル結合ヌクレオチドに置換することにより、修飾されていてもよく、または代わりに修飾され、その結果UAI（3番目の位置の置換）またはUIU（2番目の位置の置換）によって表されるアンチコドンは、AUA、CUAおよびUUA、並びにAAA、ACAおよびAUAに特異的に結合することができるDicer基質核酸を生じる。

一定の側面において、本明細書に開示される二本鎖ヌクレオチドは、約1つのユニバーサル結合ヌクレオチドおよび約10のユニバーサル結合ヌクレオチドを含むことができる。一定の側面内において、本開示の二重鎖核酸は、標的遺伝子の配列に相同的であるセンス鎖およびセンス鎖に対して相補的であるアンチセンス鎖を含んでいてもよいが、ただし、他の相補的なDicer基質核酸二重鎖のアンチセンス鎖の少なくとも1つのヌクレオチドは、1つまたは複数のユニバーサル結合ヌクレオチドによって置換されていることを条件とする。

バックグランドによれば、サイレンシング複合体内において、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドは、標的核酸がそれとの相互作用することができるように、位置される。RISCは、任意の所与の瞬間にて典型的な細胞にある何千もの異なるRNAに遭遇するだろう。しかし、RISCにロードされる、Dicer基質核酸である、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチド鎖は、Dicer基質核酸分子のアンチセンスと近い相補性を有する標的核酸に付着するだろう。そして、ウイルスの感染に対するインターフェロン反応とは異なり、サイレンシング複合体は、高度に選択的に標的核酸を選択する。RISCは、捕獲された標的核酸鎖を2つに切断し、核酸の2つの小片を放出し（ここでは、タンパク質合成を指揮することができないようにする）、移動する。RISCそれ自体は、無処置のままであり、さらなる標的核酸分子を見いだして切断することができる。

1つまたは複数のユニバーサル結合ヌクレオチドが置換される位置に関係なく、本明細書に記述された二本鎖ヌクレオチドは、標的遺伝子およびその1つまたは複数の変異体に結合ができ、これにより、RISC複合体を介した標的遺伝子またはその変異体の分解を促進することが理解されよう。したがって、本開示の二本鎖ヌクレオチドは、標的遺伝子またはその変異体のターゲットされた転写後遺伝子サイレンシングを媒介するために、細胞に導入するのために適している。

一つの態様において、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖または両方の鎖は、一つまたは複数の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを有する。もう一つの態様において、アンチセンス鎖は、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを含む。もう一つの態様において、アンチセンススタンドは、2'-O-メチル修飾されたヌクレオチドで構成される3'オーバーハングを含む。また、アンチセンス鎖は、さらなる2'-O-メチル修飾されたヌクレオチドを含むことができる。

加えて、dsRNA構造は、Dicerの切断により産生されるオリゴヌクレオチドセグメントが、遺伝子発現を阻害する際に最も有効であるオリゴヌクレオチド一部であるだろうことを保証するように最適化することができる。たとえば、本発明の一つの態様において、遺伝子発現を阻害するだろうことが予想された21〜22bpセグメントがアンチセンス鎖の3'末端に位置する27-bpオリゴヌクレオチドのdsRNA構造が合成される。アンチセンス鎖の5'末端に位置する残りの塩基は、Dicerによって切断されて、処分されるだろう。この切断される部分は、相同的（すなわち、標的配列の配列に基づく）または非相同的であることができ、核酸鎖を延長するために付加することができる。

二重鎖RNAオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチド合成および精製の調製
DsiRNA分子は、RNAメッセージ、たとえば本明細書に記述されたRNA配列内の標的配列における種々の部位と相互作用するように設計することができる。DsiRNA分子の1つの鎖の配列は、上で記述した標的部位配列に対して相補的である。DsiRNA分子は、本明細書に記述された方法を使用して、化学的に合成することができる。制御配列として使用される不活性DsiRNA分子は、それが標的配列に対して相補的でないように、DsiRNA分子の配列をスクランブルすることによって合成することができる。

RNAは、酵素的または部分／全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。RNA分子を合成する方法、特にVermaおよびEckstein（1998）に記載されているように、または本明細書に記述されたように、化学的合成方法は、当該技術分野において公知である。一般に、DsiRNA構築物は、19-23mer siRNAsについて記述したように、固相オリゴヌクレオチド合成法を使用することによって合成することができる（たとえば、Usman et al.,米国特許第5,804,683号；第5,831,071号；第5,998,203号；第6,117,657号；第6,353,098号；第6,362,323号；第6,437,117号；第6,469,158号；Scaringe et al.,米国特許第6,111,086号；第6,008,400号；第6,111,086号を参照されたい）。

非限定的な例において、RNAオリゴヌクレオチドは、標準的な技術を使用して（DamhaおよびOlgivie、1993；Wincott et al., 1995）、固相ホスホロアミダイト化学を使用して合成され、脱保護され、およびNAP-5カラム（Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）上で脱塩される。オリゴマーは、15分工程のリニア勾配を使用するAmersham Source 15Qカラム-1.0cm。時間.25 cm；Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）でのイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（IE-HPLC）を使用して精製する。勾配は、90：10の緩衝液A：Bから52：48の緩衝液A：Bに変化し、緩衝液Aは100mM Tris pH 8.5であり、および緩衝液Bは、100mM Tris pH 8.5（1MのNaCl）である。試料は、260nmにてモニターされ、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークは、収集され、プールされ、NAP-5カラムで脱塩され、および凍結乾燥される。

各オリゴマーの純度は、Beckman PACE 5000（Beckman Coulter、Inc., Fullerton, Calif）でのキャピラリー電気泳動（CE）によって決定される。CEキャピラリーは、100umの内径を有し、ssDNA 100R Gel（Beckman-Coulter）を含む。典型的には、約0.6nmoleのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注射して、444V／cmの電界において実行して、260nmにおけるUV吸光度によって検出される。変性トリス-ホウ酸-7M-尿素泳動緩衝液は、Beckman-Coulterから購入する。以下に記述した実験に使用するための、CEによって評価すると少なくとも90%純粋であるオリゴリボヌクレオチドが得られる。化合物同一性は、製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Voyager DE.TM.Biospectometryワークステーション（Applied Biosystems、Foster City,、Calif.）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型（MALDI-TOF）質量分光法によって検証した。全てのオリゴマーの相対的な分子質量は、たいてい予想される分子質量の0.2%以内で得ることができる。

二重鎖の調製
たとえば、一本鎖RNA（ssRNA）オリゴマーは、100mM 酢酸カリウム、30mM HEPES、pH 7.5からなる二重鎖緩衝液中に100μM濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、50μM二重鎖の最終溶液を得る。試料を95℃まで5'間加熱して、使用前に室温に冷却すさせる。二本鎖RNA（dsRNA）オリゴマーは、-20℃にて保存させる。一本鎖RNAオリゴマーは、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、-80℃に貯蔵させる。

RNA干渉法における二重鎖RNA
また、RNA干渉法を本発明のdsRNAの実施に使用してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、DNA酵素を使用する配列特異的mRNAノックダウンに対する総説については、たとえば、SchererおよびRoss、Nature Biotechnology 21：1457-65（2003）を参照されたい。また、、2003年9月29日に出願され、「Cell-based RNA Interference and Related Methods and Compositions」の表題の国際特許出願PCT/US2003/030901（公開番号WO 2004-029219 A2）を参照されたい。標的遺伝子の発現の制御可能な阻害は、標的細胞（たとえば、肝癌モデルにおける肝細胞）における標的遺伝子の産物の合成を制御することによって遂行してもよい。WO2008021393。

たとえば、テトラループをもつニックの入ったdsRNAの効果を評価する際に、適切な参照には、ニックの効果およびテトラループの効果またはニックおよびテトラループの組み合わせた効果、たとえば、相乗効果をそれぞれ決定するためには、ニックおよびなしのテトラループをもつ同じヌクレオチド配列を有するdsRNA、ニックおよびなしのテトラループをもつ同じヌクレオチド配列を有するdsRNA、並びにニックなしおよびテトラループなしの同じヌクレオチド配列を有するdsRNAを含むだろう。たとえば、任意の構造的な特色、たとえばニックまたは修飾は、比較されるdsRNAの両方において対応する位置に存在するべきである。

同様に、修飾されたヌクレオチドをもつdsRNAの効果を評価する際に、適切な参照には、修飾されたヌクレオチドの効果または修飾されたヌクレオチドの組み合わせ効果、たとえば、相乗効果をそれぞれ決定するために、修飾されたヌクレオチドのものに対応する位置にて、共通のRNAまたはDNAヌクレオチド（A、C、G、T、U）をもつヌクレオチド配列を有するdsRNAを含むだろう。修飾されたヌクレオチドのものに対応する位置に参照dsRNAにおいて共通ヌクレオチド（A、C、G、T、U）を配置する際に、共通ヌクレオチドは、二重鎖のホスフェートバックボーンの二重らせん構造を保存する。上記のように、任意の構造的な特色、たとえば、オーバーハング、ニックまたはループは、比較されるdsRNAの両方の対応する位置に存在するべきである。

本発明のdsRNAを含むアッセイ、たとえば、RNA干渉の細胞培養アッセイ、インビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて、適切な参照は、また、効果が観察されないか、または観察されることが予想される実験条件を表すネガティブ対照である。たとえば、本発明のdsRNAのインビトロまたはインビボの効果を評価する際に、緩衝液単独または同じヌクレオチド組成をもつが、ヌクレオチドが配列スクランブルされている別のdsRNAでの処理は、ネガティブ対照として使用するために適している。

DsiRNA活性を評価するためのビトロアッセイにおけるRNAi
無細胞系におけるRNAiを利用するインビトロアッセイは、DsiRNA構築物を評価するためにも使用される。たとえば、このようなアッセイは、標的RNAに対して向けられたDsiRNA薬剤で使用するために適応される、Tuschl et al., 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197および Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33を含む。合胞性胞胚葉に由来するショウジョウバエ（Drosophila）抽出物は、インビトロでRNAi活性を再構成するために使用される。標的RNAは、T7 RNAポリメラーゼを使用して適切な核外遺伝子からインビトロでの転写を介して、または化学的合成を介して産生される。センスおよびアンチセンスDsiRNA鎖（たとえば、それぞれ20μM）は、90℃にて1分、続いて37℃にて1時間緩衝液（たとえば100mM酢酸カリウム、30mM HEPES-KOH、pH 7.4、2mM酢酸マグネシウム）中でインキュベーションすること、次いで溶解緩衝液（たとえば、100mM酢酸カリウム、pH 7.4にて30mM HEPES-KOH、2mM酢酸マグネシウム）に希釈することによってアニールされる。アニーリングは、TBE緩衝液におけるアガロースゲルでのゲル電気泳動および臭化エチジウムでの染色によってモニターすることができる。ショウジョウバエ（Drosophila）可溶化液は、発酵させたモラセス寒天上で収集されるOregon Rハエから0〜2時間齢の胚を使用して、これを脱塩および溶解して調製される。可溶化液をお遠心分離して、上清を単離する。アッセイは、50%の可溶化液［vol／vol］、RNA（10-50pm終濃度）および10%［vol／vol］の溶解緩衝液含むDsiRNA（10nM終濃度）を含む反応混合物を含む。また、反応混合物は、10mMクレアチンリン酸、10μg／mlのクレアチンホスホキナーゼ、100μm GTP、100μM UTP、100μM CTP、500μM ATP、5mM DTT、0.1u／μl RNAsin（Promega）および100μMの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの終濃度は、100mMに調整する。反応を氷上で予め集めて、RNAを添加する前に25℃にて10分間プレインキュベーして、2次いで5℃にてさらに60分間インキュベートする。反応を4容積の1.25×Passive溶解緩衝液（Promega）でクエンチする。標的RNA切断は、RT-PCR解析または当該技術分野において公知のその他の方法によってアッセイし、DsiRNAを反応から省いた対照反応と比較する。

あるいは、アッセイのための内部標識された標的RNAを［α-32P］CTPの存在下におけるインビトロ転写によって調製して、スピンクロマトグラフィーによってG50セファデックスカラムを通し、さらに精製することなく標的RNAとして使用する。任意に、標的RNAは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を使用して、5'-32P-末端標識する。アッセイを上記の通りに行い、標的RNAおよびRNAiによって産生される特異的なRNA切断産物は、ゲルのオートラジオグラフで視覚化する。切断の割合は、DsiRNAおよびアッセイによって産生される切断産物のない対照反応からの無処置の対照RNAまたはRNAを表すバンドのPHOSPHOR IMAGER（登録商標）（autoradiography）定量化によって決定される。

標的RNAの核酸阻害
ゲノムRNAにターゲットされるDsiRNA分子は、上記の通りに設計され、合成される。これらの核酸分子は、たとえば以下の手順を使用して、インビボでの切断活性について試験することができる。2つの形式が、DsiRNAsの有効性を試験するために使用される。第1に、試薬を、たとえばヒト肝癌（Huh7）細胞を使用して細胞培養において試験して、RNAおよびタンパク質阻害の程度を決定する。DsiRNA試薬は、本明細書に記述された標的に対して選択される。RNA阻害は、たとえば、培養された表皮ケラチノサイトに適したトランスフェクション薬剤によるこれらの試薬の送達後に、測定される。標的RNAの相対量は、増幅のリアルタイムPCRモニタリング（たとえば、ABI 7700 TAQMAN）を使用して、アクチンに対して測定する。比較は、無関係な標的に対して作製されたオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して、または同じ全長および化学であるが、各位置にてランダムに置換されたランダム化されたDsiRNA対照に対して行う。一次および二次リード試薬は、行われる標的および最適化に対して選択される。最適なトランスフェクション薬剤濃度を選択した後で、阻害のRNA時間経過をリードDsiRNA分子で行う。加えて、細胞播種形式を、RNA阻害を決定するために使用することができる。加えて、細胞播種形式は、また、RNA阻害を決定するために使用することもできる。

細胞に対するDsiRNAの送達
DsiRNAが安定してトランスフェクトされた細胞を、たとえば、トランスフェクションの前日に、96ウェルプラット化合物DMEM（Gibco）のウェル当たり、8.5×10³細胞にて播種する。DsiRNA（終濃度、たとえば、20OpM、1nM、1OnMまたは25nm）およびカチオン脂質Lipofectamine2000（たとえば、終濃度0.5μl／ウェル）をポリプロピレン微細管において37℃にて20分間Optimem（Gibco）において複合体形成させる。ボルテックス後、複合体を形成したDsiRNAを各ウェルに添加して、24〜72時間インキュベートする。

TAQMAN（登録商標）（増幅のリアルタイムPCRモニタリング）およびmRNAのLightcycler定量化
総RNAは、DsiRNAの送達後の細胞から、たとえば、大スケール抽出のためのAmbion RNAqueous 4-PCR精製キットまたは96ウェルアッセイのためのAmbion RNAqueous-96精製キットを使用して調製する。Taqman解析については、二重標識されたプローブを、たとえば、5'末端に共有結合で連結されたレポーター色素FAMまたはVICおよび3'末端に抱合されたクエンチャー色素TAMARAで合成する。ワンステップRT-PCR増幅は、たとえばABIプリズム7700配列検出器で、10μl総RNA、100nMフォワードプライマー、100mMリバースプライマー、100nMプローブ、1×TaqMan PCR反応緩衝液（pE-Applied Biosystems）、5.5mM MgCl2、100μMのそれぞれのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、0.2UのRNAse阻害剤（Promega）、0.025UのAmpliTaq Gold（pE-Applied Biosystems）および0.2UのM-MLV逆転写酵素（Promega）からなる50μl反応を使用して行った。サーマルサイクリング条件は、48℃にて30分、95℃にて10分、続いて95℃にて15秒および60℃にて1分の40サイクルからなり得る。標的mRNAレベルの定量化は、段階希釈した総細胞のRNA（300、100、30、10 ng/rxn）から作製し、かつたとえば平行した、または同じチューブのいずれかのTaqMan反応における36B4 mRNAに対して基準化した標準に対して比較して、決定する。RNA定量化については、対照遺伝子に対して特異的な適切なPCRプライマーおよびプローブが使用される。

ウェスタンブロッティング
核抽出物は、標準的マイクロ調製技術（たとえばAndrewsおよびFaller、1991、Nucleic Acids Research、19、2499を参照されたい）を使用して調製することができる。上清からのタンパク質抽出物を、たとえばTCA沈澱を使用して調製する。同容積の20%のTCAを細胞上清に添加して、氷上で1時間インキュベートして、5分間遠心することによってペレットにする。ペレットをアセトン中で洗浄して、乾燥し、水に再懸濁させる。細胞のタンパク質抽出物を10%のビス‐トリスNuPage（核抽出物）または4〜12%のTris-グリシン（上清抽出物）ポリアクリルアミドゲルで泳動して、ニトロセルロース膜に移す。非特異的結合を、たとえば、1時間の5%の脱脂乳と、続く4℃における16時間の一次抗体インキュベーションによって遮断することができる。洗浄後、二次抗体を、たとえば（1：10,000希釈）室温にて1時間適用して、シグナルをSuperSignal試薬（Pierce）で検出する。

RNAiを媒介した標的発現の阻害
DsiRNA構築物を、標的RNA発現を減少させる効率について、たとえば以下のプロトコルを使用して試験する。細胞を、トランスフェクション時に、細胞が70〜90%コンフルエントであるように、5,000〜7,500細胞／ウェル、100μl／ウェルにて96ウェルプレートに、トランスフェクションのおよそ24時間前にまく。トランスフェクションについては、アニールさせたDsiRNAsを、50μl／ウェルの容積のトランスフェクション試薬（Lipofectamine 2000、Invitrogen）と混合して、室温で20分間インキュベートする。DsiRNAトランスフェクション混合物を細胞に添加して、150μlの容積の50 pm、200 pmまたは1nMの最終的DsiRNA濃度を与える。各DsiRNAトランスフェクション混合物を、3つのDsiRNA処理のために3つのウェルに添加する。細胞を、DsiRNAトランスフェクション混合物の継続的存在下において37℃にて24時間インキュベートする。24時間にて、RNAを処理した細胞の各ウェルから調製する。トランスフェクション混合物を伴う上清を最初に除去して廃棄し、次いで細胞を溶解し、RNAを各ウェルから調製する。処理後の標的RNAレベルまたは発現を、標的遺伝子について、および規準化のための対照遺伝子（36B4、RNAポリメラーゼサブユニット）についてのRT-PCRによって評価される。3つのデータを平均して、標準偏差を処理ごとに決定する。規準化されたデータをグラフで示して、これらのそれぞれの対照DsiRNAs（たとえば、反転させた対照DsiRNAs）と比較した活性なDsiRNAsによる標的mRNAのパーセント減少を決定する。

DsiRNAsについての血清安定性
DsiRNA薬剤の血清安定性は、37℃にて種々の期間の間（24時間まで）、50%のウシ胎児血清中でのDsiRNA薬剤のインキュベーションによって評価する。血清を抽出して、核酸を20%の非変性PAGE上で分離して、Gelstar染色で視覚化する。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対的レベルを、DsiRNAs（任意に修飾を伴う、および伴わない）について評価する。

RNA干渉に基づいた療法
公知のように、RNAi法は、広く多様な微生物の広く多様な遺伝子に適用でき、開示された組成物および方法は、それぞれこれらの状況に利用することができる。開示された組成物および方法によってターゲットすることができる遺伝子の例は、細胞にとって天然である遺伝子である内因性遺伝子または通常細胞にとって天然にはない遺伝子を含む。限定されないが、これらの遺伝子は、発がん遺伝子、サイトカイン遺伝子、イディオタイプ（Id）タンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、脈管形成を誘導する分子を発現する遺伝子、細胞接着因子のための遺伝子、細胞表面受容体、転移に関与するタンパク質、プロテアーゼ、アポプトーシス遺伝子、細胞サイクル制御遺伝子、EGFおよびEGF受容体を発現する遺伝子、MDR1遺伝子などの多剤耐性遺伝子を含む。

より具体的には、本発明の標的mRNAは、細胞タンパク質（たとえば、核、細胞質、膜貫通または膜関連タンパク質）のアミノ酸配列を特定する。もう一つの態様において、本発明の標的mRNAは、細胞外タンパク質（たとえば、細胞外マトリックスタンパク質または分泌タンパク質）のアミノ酸配列を特定する。本明細書に使用される、タンパク質の「アミノ酸配列を特定する」という句は、mRNA配列が遺伝子暗号の規則にしたがってアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。以下のタンパク質のクラスを例証の目的で収載してある：発達タンパク質（たとえば、細胞接着因子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、Wingedヘリックスファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン／リンフォカインおよびこれらの受容体、成長／分化因子およびこれらの受容体、神経伝達物質およびこれらの受容体）；発癌遺伝子でコードされるタンパク質（たとえば、ABL1、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIMI、PML、RET、SRC、TALI、TCL3およびYES）；腫瘍抑制因子タンパク質（たとえば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NFI、NF2、RBI、TP53およびWTI）；および酵素（たとえば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACPデサチュラーゼおよび水酸化酵素、ADP-グルコースピロｐホリラーゼ、ATPase、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミルグルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプンシンターゼ、GTPase、ヘリカーゼ、ヘルニセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポオキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長調節剤シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ（pullanases）、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ルビスコ、トポイソメラーゼおよびキシラナーゼ）。

一つの側面において、本発明の標的mRNA分子は、病的状態と関連するタンパク質のアミノ酸配列を特定する。たとえば、タンパク質は、病原体関連タンパク質（たとえば、宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の伝達または感染の維持に関与するウイルスタンパク質）もしくは宿主への病原体の侵入、病原体もしくは宿主による薬物代謝、病原体のゲノムの複製もしくは組み込み、宿主における感染の確立もしくは伝播または病原体の次世代の構築を促進する宿主タンパク質でもよい。病原体は、レンチウイルスを含む、フラビウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、レトロウイルスなどのRNAウイルスまたはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ヘパドナウイルスもしくはその他などのDNAウイルスを含む。さらなる病原体は、細菌、真菌、蠕虫、住血吸虫およびトリパノゾームを含む。その他の種類の病原体には、哺乳動物転置因子を含むことができる。あるいは、タンパク質は、腫瘍関連タンパク質または自己免疫疾患関連タンパク質でもよい。標的遺伝子は、任意の微生物に由来されていて、または含まれていてもよい。微生物は、植物、動物、原虫、細菌、ウイルスまたは真菌でもよい。たとえば、米国特許第6,506,559号を参照されたい。これは、参照によって本明細書に組み込まれる。

医薬組成物
製剤および投与の様式
もう一つの側面において、本発明は、本発明のdsRNAを含む医薬組成物に提供する。dsRNA試料は、適切に製剤化して、十分な試料の一部が細胞に入って、それが生じる場合、遺伝子サイレンシングを誘導することができる任意の手段によって、細胞の環境に導入することができる。dsRNAのための多くの製剤が当該技術分野において公知であり、dsRNAが、それが作用することができるように標的細胞に入ることができる限り、使用することができる。たとえば、米国特許出願公開番号2004/0203145 A1および2005/0054598 A1を参照されたい。それぞれが、参照により本明細書に援用される。たとえば、dsRNAは、リン酸緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル構造およびカプシドなどの緩衝溶液中に製剤化することができる。カチオン脂質を伴うdsRNAの製剤を使用して、細胞へのdsRNAのトランスフェクションを促進することができる。たとえば、リポフェクチン（米国特許第5,705,188号、参照によって本明細書に組み込まれる）、カチオン性グリセロール誘導体およびポリリジン（公開PCT国際出願WO 97/30731、参照によって本明細書に組み込まれる）などのポリカチオン性分子などのカチオン脂質を使用することができる。適切な脂質は、Oligofectamine、リポフェクタミン（Life Technologies）、NC388（Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder、Colo.）またはFuGene 6（Roche）を含み、すべて製造業者の説明書にしたがって使用することができる。

dsRNAを細胞の環境に導入する方法は、細胞のタイプおよびその環境の構成に依存するだろうことを認識することができる。たとえば、細胞が液体内で見いだされるときに、1つの好ましい製剤は、リポフェクタミンなどの脂質製剤と共にして、dsRNAを直接細胞の液体の環境に添加することができる。いくつかの細胞培養系において、カチオン脂質は、培養において細胞に対するオリゴヌクレオチドの生物学的利用能を増強することが示されている（Bennet, et al., 1992, Mol. Pharmacology, 41, 1023-1033）。また、脂質製剤は、静脈内、筋肉内もしくは腹腔内注射によるか、または経口的に、または当該技術分野において公知である吸入またはその他の方法などにより、動物に投与することができる。製剤が哺乳類およびより具体的にはヒトなどの動物に投与のために適しているときに、製剤は、また薬学的に許容される。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は、公知であり、使用することができる。一部の場合には、卵母細胞での研究のような、緩衝液または生理食塩水溶液にdsRNAを製剤化し、細胞に製剤化したdsRNAを直接注射することが、好ましいだろう。また、dsRNA二重鎖の直接注射を行ってもよい。dsRNAを導入する適切な方法については、米国特許出願公開番号2004/0203145 A1を参照されたい。これは、参照により本明細書に援用される。

dsRNAの適切な量を導入されなければならず、これらの量は、標準的な方法を使用して決定することができる。典型的には、細胞の環境における個々のdsRNA種の有効濃度は、約50ナノモル以下もしくは10ナノモル以下であるだろうし、または約1ナノモル以下の濃度である組成物を使用することができる。その他の態様において、本方法は、約200ピコモル以下の濃度を利用し、および約50ピコモル以下の濃度さえ多くの環境に使用することができる。

本方法は、細胞が生きることができる任意の細胞外マトリックスに対するdsRNA組成物の添加によって実施することができるが、ただし、dsRNAの十分な量が細胞に入ってその効果を及ぼすことができるように、dsRNA組成物が製剤化されることを条件とする。たとえば、本方法は、液体培養または細胞成長培地などの液体における、組織外植体における、または哺乳類および特にヒトなどの動物を含む全部生物体に存在する細胞で使用するために適用できる。

標的遺伝子の発現は、現在当該技術分野において公知の、または後に開発される任意の適切な方法によって決定することができる。標的遺伝子の発現を測定するために使用される方法は、標的遺伝子の性質に依存するだろうことを認識することができる。たとえば、標的遺伝子がタンパク質をコードするときに、「発現」という用語は、遺伝子に由来するタンパク質または転写物をいうことができる。このような例において、標的遺伝子の発現は、標的遺伝子に対応するmRNAの量を測定することによって、またはそのタンパク質の量を測定することによって決定することができる。タンパク質は、染色または免疫ブロットによってなど、タンパク質アッセイにおいて、またはタンパク質が測定することができる反応を触媒する場合、反応速度を測定することによって、測定することができる。全てのこのような方法は、当該技術分野において公知であり、使用することができる。遺伝子産物がRNAである場合、種発現は、遺伝子産物に対応するRNAの量を決定することによって測定することができる。遺伝子発現を検出するためのいくつかの具体的な方法を実施例1に記述してある。測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または任意のその他の適切な供与源材料で行うことができる。

標的遺伝子の発現が減少されたかどうかの決定は、遺伝子発現の変化を確実に検出することができる任意の適切な方法によることができる。典型的には、決定は、細胞の環境に、そのdsRNAの少なくとも一部が原形質に入るこのような消化されていないdsRNAの導入すること、および次いで標的遺伝子の発現を測定することによって行われる。同じ測定を同一の未処理の細胞で行って、各測定から得られる結果を比較する。

dsRNAは、dsRNAの薬理的に有効な量および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化することができる。薬理的に、または治療的に有効な量は、意図された薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに有効なdsRNAのその量をいう。「薬理的に有効な量」および「治療的に有効な量」という句または単に「有効な量」は、意図された薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに有効なRNAのその量をいう。たとえば、所与の臨床的な治療が、疾患または障害と関連する測定可能なパラメーターの少なくとも20%の減少があるときに有効であると考慮される場合、その疾患または障害の治療のための薬物の治療上有効な量は、そのパラメーターの少なくとも20%の減少を遂行するために必要な量である。

「薬学的に許容される担体」という句は、治療的な薬剤の投与のための担体をいう。例示的な担体は、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせを含む。経口的に投与される薬物については、薬学的に許容される担体は、不活性な希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味薬、香味薬、着色剤および防腐剤などの薬学的に許容される賦形剤を含むが、限定されない。適切な不活性な希釈剤は、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、ン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、並びにラクトースを含むが、一方、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は、適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよびゼラチンを含んでいてもよく、一方、平滑剤は、存在する場合、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであるだろう。必要に応じて、錠剤は、胃腸管における吸収を遅延させるために、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなどの材料で被覆されていてもよい。開示されたdsRNA組成物の薬学的に許容される担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド（capsoids）、重合体ナノカプセルまたは重合体マイクロカプセルなどのミセル構造でもよい。

重合体ナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセル化され、または結合されたdsRNAの細胞への輸送および放出を促進する。これらは、重合体および単量体材料を含み特にポリブチルシアノクリラートを含む。材料および製作技術の概要は、公開されている（Kreuter、1991を参照されたい）。重合／ナノ粒子生成工程において単量体および／またはオリゴマー前駆体から形成される重合体材料は、重合体材料の分子重量および分子重量分布であるなど、それ自体従来技術から公知であり、ナノ粒子を製造する分野の当業者が通常の技術にしたがって適切に選択してもよい。

本発明の適切に製剤化された医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経直腸、経膣および局所的（頬側および舌下を含む）投与のを含む、非経口的経路によってなどの当該技術分野において公知の任意の手段によって投与されることができる。一部の態様において、医薬組成物は、静脈内または内部非経口注入または注射によって投与される。

投薬量
一般に、dsRNAの適切な投薬単位は、1日たりのレシピエントのキログラム体重量あたり0.001〜0.25ミリグラムの範囲、または1日たりのキログラム体重量あたり0.01〜20マイクログラムの範囲、または1日たりのキログラム体重量あたり0.01〜10マイクログラムの範囲、または1日たりのキログラム体重量あたり0.10〜5マイクログラムの範囲、または1日たりのキログラム体重量あたり0.1〜2.5マイクログラムの範囲であるだろう。dsRNAを含む医薬組成物は、1日1回投与することができる。しかし、治療的な薬剤は、また、１日の全体にわたって適切な間隔にて投与される2、3、4、5、6回以上の副用量を含む投薬量単位で投薬されてもよい。その場合、それぞれの副用量に含まれるdsRNAは、合計の1日の投薬量単位を達成するために、対応してより少なくしなければならない。投薬量単位は、また、たとえば、数日の期間にわたってdsRNAの持続され、かつ一貫した放出を提供する従来の持効性製剤を使用して、数日にわたって単一用量のために調合することができる。持効性製剤は、当該技術分野において周知である。本態様において、投薬量単位は、対応する倍数の1日量を含む。製剤に関係なく、医薬組成物は、治療される動物またはヒトにおける標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量のdsRNAを含まなければならない。組成物は、複数単位のdsRNAの合計が共に十分な用量を含むような方法で合成することができる。

ヒトのために適した投薬量範囲を製剤化するために、細胞培養アッセイおよび動物試験からデータを得ることができる。本発明の組成物の投薬量は、ほとんどまたは全く毒性のないED₅₀（公知の方法の決定に従う）を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化させてもよい。本発明の方法に使用される任意の化合物について、治療的に有効な用量は、初めに細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養において決定すると、IC_5O（すなわち、症候の最大半減阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて製剤化されていてもよい。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿におけるdsRNAのレベルは、標準的な方法によって、たとえば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。

dsRNAなどの合成核酸は、生得的免疫系を刺激すること、およびI型インターフェロン反応をトリガーすることができることが知られている（MarquesおよびWilliam、2005；Schlee et al., 2006）。インビボでは、全ての細胞タイプ（および受容体）が存在するので、特にdsRNAが脂質に基づいた送達ツールを使用して投与される場合、免疫系をトリガーするリスクがかなりある。脂質に基づいた送達アプローチは、siRNAsの免疫を担う主要分子であると思われるToll様受容体（TLRs）3、7および8が属するエンドソームのコンパートメントに対する積荷の曝露を最大にする（Heil et al., 2004；Hornung et al., 2005；Sioud、2005）。インビトロでは、免疫応答をトリガーするリスクは、使用される特異的な株化細胞におおいに依存的であり、多くの組織培養株は、siRNAsに反応するために必要な免疫受容体を欠いている。しかし、一定の細胞タイプは、本命最初に使用されるDsiRNAsなどの、21mer siRNAsに反応しないより長いdsRNAの存在を認識して、反応する受容体を発現する（Reynolds et al., 2006）。たとえば、T98G神経芽細胞腫株化細胞は、27merに反応するが、21mer dsRNAに反応しないことが示されており、この反応性が細胞質受容体RIG-Iによるより長いRNA上のブラントエンドの認識に関連すると考えられる（Marques et al., 2006）。

RNA二重鎖の化学的修飾は、インビボでさえ、通常免疫賦活性がある配列に対する免疫応答を遮断することができる（Morrissey et al., 2005b）。2'OMe UおよびG塩基は、協力に免疫認識を妨げるようであり、これは、2'OMeを含むRNAによって修飾されていないRNAを結合するTLRの直接の競合阻害を介して生じると考えられる（Judge et al., 2006；Robbins et al., 2007）。

RNAiに基づいた療法を使用する疾患治療
さらなる側面において、本発明は、標的遺伝子の発現によって生じる疾患を有するか、または疾患を発症するリスクのある被験体を治療するための方法に関する。本態様において、dsRNAは、1つまたは複数の細胞の増殖および／または分化による障害、骨代謝に関連する障害、免疫不全、造血障害、心血管障害、肝臓障害、ウイルス疾患または代謝障害のための新規の治療的な薬剤として作用することができる。本方法は、標的遺伝子の発現がサイレンスされるように、患者（たとえば、ヒト）に対して本発明の医薬組成物を投与することを含む。これらの高い特異性のため、本発明のdsRNAは、病気にかかった細胞および組織の標的遺伝子のmRNAを特異的にターゲットする。

疾患の予防において、標的遺伝子は、疾患の開始もしくは維持のために必要とされるか、または疾患を縮小する高いリスクと関連するとして同定されたものでもよい。疾患の治療において、dsRNAは、疾患を示する細胞または組織と接触させることができる。たとえば、癌と関連する変異された遺伝子または腫瘍細胞において高レベルにて発現されるもの、たとえばオーロラキナーゼの実質的に全てまたは一部と同一のdsRNAを、癌性細胞もしくは腫瘍遺伝子と接触させても、または導入してもよい。

細胞の増殖および／または分化による障害の例は、癌、たとえば癌腫、肉腫、転移性障害または造血性腫瘍障害、たとえば白血病を含む。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓起源のものを含むが、限定されない、多くの原発性腫瘍タイプから生じることができる。本明細書に使用される、「癌」、「高増殖性」および「新生物形成」という用語は、自律的な増殖のための能力を有する細胞、すなわち迅速に増殖する細胞成長によって特徴づけられる状態の異常な状態をいう。これらの用語は、侵襲性の組織病理タイプまたは段階にかかわりなく、癌性増殖または発癌性プロセス、転移組織であるまたは悪性形質転換された細胞、組織もしくは器官の全てのタイプを含むことが意味される。増殖障害は、また、たとえば、骨髄系統、リンパ様系統もしくは赤血球系統またはこれらの前駆細胞から生じる造血性起源の過形成／新生物の細胞を含む疾患を含む、造血性の腫瘍障害を含む。

また、本発明は、多様な免疫不全、特に遺伝子の過剰発現または突然変異体遺伝子の発現に関連するものを治療するために使用することができる。造血性の障害または疾患の例は、以下を含むが、限定されない：自己免疫疾患（たとえば、真性糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発硬化、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹のある皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚紅斑性狼蒼、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい反転反応、結節性紅斑ライ病、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音性聴覚、喪失、無形成性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、多発性軟骨炎、ウェジナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ‐ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎後側（uveitis posterior）および間質性肺線維症を含む）、移植片対宿主病、移植場合およびアレルギー。

もう一つの態様において、本発明は、ヒトパピローマウイルス、C型肝炎、B型肝炎、単純ヘルペスウイルス（HSV）、HIV-AIDS、ポリオウイルスおよび天然痘ウイルスを含むが、限定されない、ウイルス疾患を治療するための方法に関する。本発明のdsRNAは、発現されたウイルスの配列をターゲットし、したがって、ウイルスの活性および複製を寛解させるように、本明細書に記述されたように調製される。分子は、動物および植物の両方のウイルスの感染した組織の治療または診断に使用することができる。また、このような分子は、肝細胞性癌などのウイルス関連癌腫の治療に使用することができる。

本発明のdsRNAは、また、多剤耐性遺伝子1（「MDR1」の発現を阻害するために使用することができる。「多剤耐性」（MDR）は、無関係な化学的構造および異なる作用機構での多様な化学療法薬に対する耐性のパターンを広く指す。MDRの病因は、多くの要素からなるが、MDR薬物の輸送を媒介する膜タンパク質であるP糖タンパク質（Pgp）の過剰発現は、研究室モデルおいてMDRの根底にある最も共通した変化（alteration）のままである（ChildsおよびLing（1994））。その上、Pgpの発現は、ヒト癌において、特に白血病、リンパ腫、複数の骨髄腫、神経芽細胞腫および軟部組織肉腫においてMDRの発症にリンクしていた（Fa et al.）。最近の研究は、MDR関連タンパク質（MRP；Cole et al., 1992）、肺耐性タンパク質（LRP；Scheffer et al., 1995）およびDNAトポイソメラーゼIIの突然変異（Beck、1989）を発現する腫瘍細胞が、またMDRを与えうることを示した。

細胞培養モデル
いくつかの細胞培養系において、カチオン脂質は、培養において細胞に対するオリゴヌクレオチドの生物学的利用能を増強することを示された（Bennet et al., 1992, Mol. Pharmacology, 41 , 1023-1033）。一つの態様において、本発明のdsRNA分子は、細胞培養実験のためのカチオンの脂質と複合体形成する。dsRNA分子とカチオンとの混合脂質は、細胞に添加の直前に無血清DMEM中に調製する。DMEMプラス添加剤はを室温（約20〜25℃）に暖めて、カチオン脂質を最終的な所望の濃度に添加して、溶液を短時間ボルテックスする。DsiRNA分子を最終的な所望の濃度に添加して、溶液を短時間に再びボルテックスして室温で、10分間インキュベートする。用量反応実験において、RNA／脂質複合体を10分のインキュベーション後に、DMEMに段階希釈する。dsRNAによる遺伝子発現の阻害のレベルは、参照対照と比較したときに、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはさらに100%である。阻害のレベルは、タンパク質のレベルを調べること、タンパク質活性をアッセイすること、または表現型をアッセイすることによって測定することができる。dsRNAによる標的RNAのレベルにおける減少は、参照対照と比較したときに、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはさらに100%である。

動物モデル
疾患のマウスモデルにおけるDsiRNA有効性
種々の疾患のマウスモデルが記述されている（たとえば、癌、炎症性の疾患、アテローム硬化、肥満）。したがって、マウス疾患モデルには、流体力学的尾静脈注射を介して本発明のDsiRNA薬剤を投与する。群あたり3〜4匹のマウス（試験される特異的DsiRNA薬剤に基づいて分けられる）には、50μgまたは200μgのDsiRNAを注射する。使用されるモデルにしたがって変化する当該技術分野において認識された方法を、DsiRNAを評価するために使用する。dsRNAによる遺伝子発現の阻害のレベルは、参照対照と比較したときに、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはさらに100%である。阻害のレベルは、タンパク質のレベルを調べること、タンパク質活性をアッセイすること、または表現型をアッセイすることによって測定することができる。dsRNAによる標的RNAのレベルにおける減少は、参照対照と比較したときに、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはさらに100%である。

本発明の実施は、特に明記しない限り、化学、分子生物学、細菌学、組換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技術を使用し、これらは、当該技術分野の技術の範囲内である。たとえば、Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodic updates); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991 ; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Antisense To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use ofzebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000)を参照されたい。

その他の態様
前述の説明から、種々の使用法および条件にこれを採用するために、本明細書に記述された発明に変化および改変をおこなってもよいことは、明らかだろう。このような態様は、また以下の請求項の範囲内である。

本明細書における任意の不定の定義における要素ののリストの詳説は、収載された要素の任意の単一のエレメントまたは組み合わせ（またはサブコンビネーション）としての不定のものの定義を含む。本明細書における態様の説明は、任意の単一の態様として、または任意のその他の態様もしくはその部分と組み合わせたその態様を含む。

本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が参照により援用されることが具体的かつ個々に示されたのと同様に、本明細書に参照により援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先するだろう。加えて、材料、方法および実施例は、例証のみであふぃ、限定することは意図されない。

以下の刊行物に対する参照がなされ、これらは、本明細書に参照により援用される Amarzguioui, M. and Prydz (2004). An algorithm for selection of functional siRNA sequences. Biochem Biophys Res Commun 316:1050-1058; Amarzguioui, M. et al. (2003). Tolerance for Mutation and Chemical Modifications in a siRNA. Nucleic Acids Research 31 :589-595; Bartlett, D. W. and Davis, M. E. (2006) Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA- mediated gene silencing. Biotechnol Bioeng; Beale, S. E. et al. (2005). siRNA target site secondary structure predictions using local stable substructures. Nucl Acids Res 33:e3O (ppl-10); Beck, W. T. (1989). Unknotting the complexities of multidrug resistance: the involvement of DNA topoisomerases in drug action and resistance. J Natl Cancer Inst 81 :1683-1685; Boese, Q. et al. (2005). Mechanistic insights aid computational short intervening RNA design. Methods Enzymol 392:73-96; Bondensgaard, K. et al. (2000). 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本発明は、以下の実施例を参照することにより記述され、これらは実例として提供してあり、いずれの様式に本発明を限定することも意図されない。当該技術分野において周知の標準的技術またはいかに具体的に記述した技術を利用した。

実施例1。標的RNAの核酸阻害を評価するためのインビトロ細胞培養アッセイ
本発明のdsRNAをヒト肝癌（Huh7）細胞に投与して、その後、ターゲットされたmRNAのレベルをヒト肝癌（Huh7）細胞において測定し、ターゲットされる転写物に対する本発明のdsRNAのインビトロの有効性を評価する。

ヒト標的遺伝子ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼに特異的な二重鎖RNA（HPRT1：enBankアクセッション番号NM_000194およびGI：164518913）をヒト肝癌（Huh7）細胞における有効性について試験する。前述の標的遺伝子は、当該技術分野において認識された「ハウスキーピング」遺伝子の中から選択される。ハウスキーピング遺伝子は、標的遺伝子がヒト肝細胞において強力かつ同種の発現を有したことを保証すること、および動物間の発現レベルの変動を最小化することの二重の目的のための標的遺伝子として選択される。

例示的なニックの入ったdsRNAを、比較のための参照として使用される適切な対照dsRNAと共に、図7、8、9および11に示してある。HPRT1をターゲットするための特定のニックの入ったdsRNAは、たとえば、図7、8、9、および11に示してある。GAPDH、LMNA、HNRPA 1およびATP 1B3をターゲットするニックの入ったdsRNAの特異的な配列は、ヒト肝細胞におけるこれらのそれぞれの転写物をターゲットするためと同じように構築してもよい。

特異的な部位にて修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAについては、HPRT1をターゲットするために有用なdsRNAの例示的な構造を、図19および20において図示してある。このような修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有し、かつHPRT1、GAPDH、LMNA、HNRPA1およびATP 1B3をターゲットするdsRNAの特異的な配列は、ヒト肝細胞におけるこれらのそれぞれの転写物をターゲットするためと同じように構築してもよい。本発明に従った、およびHPRT1をターゲッティングするこのようなDsiRNAsの特異的な配列は、たとえば、以下の通りである：

レジェンド：大文字= RNA残基；X =キサントシン。

ゲノムRNAにターゲットされるDsiRNA分子は、本明細書に記述されたようにデザインして、合成する。これらの核酸分子は、たとえば以下の手順を使用して遺伝子発現を減少させる能力について、および切断活性について、インビボで試験することができる。2つの形式を、DsiRNAsの有効性を試験するために使用する。試薬を、たとえばヒト肝癌（Huh7）細胞を使用して細胞培養において試験して、RNAおよびタンパク質阻害の程度を決定する。DsiRNA試薬を、本明細書に記述された標的に対して選択する。RNA阻害は、たとえば、培養された表皮ケラチノサイトに対する適切なトランスフェクション薬剤によって、これらの試薬の送達の後に測定する。標的RNAの相対量は、増幅のリアルタイムPCRモニタリング（たとえば、ABI 7700 TAQMAN）を使用して、アクチンに対して測定する。無関係な標的に対して、または同じ全長および化学を持つが、各位置にてランダムに置換されたランダム化されたDsiRNA対照に対して作製されたオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して、比較を行う。一次および二次導出試を標的に対して選択して、最適化を行う。最適なトランスフェクション薬剤濃度が選択された後、RNA阻害の時間経過を導出DsiRNA分子で行う。そのほかに、細胞プレーティング形式を使用してRNA阻害を決定することができる。

DsiRNA構築物は、たとえば以下のプロトコルを使用して、標的RNA発現を減少させる際の有効性について試験する。細胞を、トランスフェクション時に、細胞が70〜90%コンフルエントであるように、5,000〜7,500細胞／ウェル、100μl／ウェルにて96ウェルプレートに、トランスフェクションのおよそ24時間前にまく。トランスフェクションについては、アニールさせたDsiRNAsを、50μl／ウェルの容積のトランスフェクション試薬（Lipofectamine 2000、Invitrogen）と混合して、室温で20分間インキュベートする。DsiRNAトランスフェクション混合物を細胞に添加して、150μlの容積の50 pm、200 pmまたは1nMの最終的DsiRNA濃度を与える。各DsiRNAトランスフェクション混合物を、3つのDsiRNA処理のために3つのウェルに添加する。細胞を、DsiRNAトランスフェクション混合物の継続的存在下において37℃にて24時間インキュベートする。24時間にて、RNAを処理した細胞の各ウェルから調製する。トランスフェクション混合物を伴う上清を最初に除去して廃棄し、次いで細胞を溶解し、RNAを各ウェルから調製する。処理後の標的RNAレベルまたは発現を、標的遺伝子について、および規準化のための対照遺伝子（たとえば、アクチンまたは36B4（RNAポリメラーゼサブユニット）についての定量方法（たとえば、RT-PCR、ノーザンブロット）によって評価する。あるいは、細胞を溶解し、総タンパク質を各ウェルから調製する。処理後のをウェスタンブロットによって評価して、シグナルを定量化する。3つのデータを平均して、標準偏差を処理ごとに決定する。規準化されたデータをグラフで示して、適切な対照dsRNA（たとえば、反転された対照dsRNA）と比較した本発明のdsRNAによる標的mRNAのパーセント減少を決定する。

こうして、本発明のニックの入ったdsRNAが、特に参照dsRNAと比較して、細胞において特異的標的の遺伝子発現を減少させることを示すことができる。テトラループを有するニックの入ったdsRNAは、Dicerによる切断を増強したことを示すと予想される。特定の理論に拘束されないが、本発明のdsRNAのDicerによる増強された切断は、対照dsRNAのものと比較して、siRNAのレベルの増大を生じる。また、dsRNAにおけるニックは、その鎖をDicer基質として機能させる必要を軽減することにより、化学的修飾を、ニックと同じ鎖に利用することができることが予想される。したがって、ニックの入ったdsRNAは、標的遺伝子の発現を減少させ、参照dsRNAと比較してDicerによる切断を増強する。

また、修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを含む本発明のdsRNAは、特に参照dsRNAと比較して、細胞における特異的標的の遺伝子発現を減少させることを示すことができる。このような本発明のdsRNAは、Dicerによる切断の増強、Ago2との会合の増強、および／またはAgo2／RISCによる標的RNAの切断の増強を示すことが予想される。理論によって拘束されないが、本発明のdsRNAのDicerによる増強された切断は、対照dsRNAのものと比較して、siRNAのレベルの増加を生じる。また、理論によって拘束されないが、本発明のdsRNAのsiRNAのAgo2との会合の増強またはAgo2／RISCによる切断の増強は、対照dsRNAのものと比較して、標的遺伝子発現の減少の増加を生じる。特定の理論によって拘束されないが、Ago2／RISCによる切断の増強は、対照dsRNAのものと比較して、標的遺伝子発現の減少の増加を生じる。したがって、修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを含むdsRNAは、参照dsRNAと比較して、標的遺伝子の発現を減少させ、Dicerによって切断を増強し、Ago2相互作用を増強し、および／またはAgo2／RISCによる切断を増強する。

したがって、本実施例は、本発明のdsRNAによって包含される構造を有する二本鎖RNAは,
ヒト肝癌（Huh7）細胞における標的遺伝子の発現のインビトロにおける強く有効な配列特異的な阻害剤である。

実施例2。血清安定性を評価するためのインビトロアッセイ
37℃にて種々の期間の間（24時間まで）、50%のウシ胎児血清中でのDsiRNA薬剤のインキュベーションによって評価する。血清を抽出して、核酸を20%の非変性PAGE上で分離して、Gelstar染色で視覚化する。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対的レベルを、DsiRNAs（任意に修飾を伴う、および伴わない）について評価する。

したがって、本発明のニックの入ったdsRNAは、特に参照dsRNAと比較して、特異的標的の遺伝子発現を減少させることを示すことができる。テトラループを有する本発明のニックの入ったdsRNAは、Dicerによる切断を増強したことが予想される。

実施例3。テトラループを有するニックの入ったdsRNAのインビボアッセイ
本発明は、細胞を、その必要のある被験体における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量のテトラループを有するニックの入ったdsRNAと接触させることを含む、細胞における標的遺伝子の発現を減少させる組成物を提供する。本発明のニックの入ったdsRNAは、マウスに全身投与され、その後、ターゲットされたmRNAのレベルを処理したマウスの肝臓試料において測定する。研究では、ターゲットされた転写物に対する本発明のdsRNAのインビボの有効性を評価する。

以下のマウス標的遺伝子に対して特異的なニックの入った二重鎖RNA薬剤を、マウス肝臓における有効性について試験した：ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT1；GenBankアクセッション番号NM_013556）；グリセルアルデヒド3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH；GenBankアクセッション番号NM_008084）；ラミンA（LMNA；GenBankアクセッション番号NM O19390）；不均一（heterogeneous）核リボ核タンパク質A1（HNRPA1；GenBankアクセッション番号NM_010447）およびATPase、Na+／K+輸送、β3ポリペプチド（ATP1 B3；GenBankアクセッション番号NM_007502；2つの異なる位置が、ATP1 B3 mRNA内でターゲットされる）。前述の標的遺伝子は、当該技術分野において認識された「ハウスキーピング」遺伝子の中から選択される。ハウスキーピング遺伝子は、標的遺伝子がマウス肝臓組織において強力かつ同種の発現を有したことを保証すること、および動物間の発現レベルの変動を最小化することの二重の目的のための標的遺伝子として選択される。

HPRT1、GAPDH、LMNA、HNRPA1およびATP1B3をターゲットするニックの入ったdsRNAの具体的な配列は、本発明のニックの入ったdsRNAの構造にしたがって構築することができ、このようなニックの入ったdsRNAは、これらのそれぞれの転写物をターゲットするためにアンチセンス鎖上に以下の配列のいずれか1つのを含む：

レジェンド：大文字= RNA残基。

体重およそ25グラムのマウス（CD-1雌）を購入して、収容して、処理して、屠殺する。初回用量範囲および時点選択研究を行って、ターゲットされた転写物に対するニックの入ったdsRNAのインビボの有効性を確立し、一方で、2回の独立した、初めにターゲットされる活性配列（HPRT1）について、最適なニックの入ったdsRNAの用量および試料収集時間を確立してもよい。試験されるニックの入ったdsRNAの異なる用量（50および200μg）をリン酸緩衝食塩水に溶解し（PBS；用量あたり2.5mLの容積）、尾静脈を介して一回の流体力学的注射としてマウスに投与する。肝臓試料を以下の時点にて投薬したマウスから収集する：投与の後の24、48および72時間、並びに7日。少なくとも3匹の動物を各投薬量／時点にて確実に評価することができるようにするために、群あたり合計4匹の動物をdsRNAで処理する。

また、研究は、以下の条件を使用して行ってもよい。試験されるニックの入ったdsRNAの用量（200μg）をリン酸緩衝食塩水に溶解し（PBS；用量がたり2.5mLの容積）、尾静脈を介して一回の流体力学的注射としてマウスに投与する。肝臓試料を投与の後24時間にて投薬したマウスから収集する。群あたりの合計7匹の動物をそれぞれニックの入ったdsRNA薬剤で処理する。

標的mRNAレベルを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「qRT-PCR」）を使用して評価する。cDNAをオリゴ-dTおよびランダムヘキサマープライミングの混合物を使用して合成する。qPCR反応は、三つ一組みで実行する。絶対定量化は、クローン化された直砂上アンプリコン標的に対して実行した標準曲線に対して、補外法によって行う。データを、100%として対照を使用して規準化する。データは、標的mRNA-特異的なDsiRNA薬剤を投与されていないない全てのマウスについて測定された標的mRNA発現値に対して対照遺伝子発現レベルをセットして規準化し、これは、100%の対照値を得るように平均されている（たとえば、GAPDH DsiRNAsを注射したマウスについては、HPRT1、LMNA、HNRPA1、ATP1 B3-1およびATP1B3-3マウスのセットを全て負の対照として使用して、規準化された基礎GAPDHレベルを得る。したがって、7匹の研究マウスおよび35匹の対照マウスが、それぞれの研究のアーム（arm）ごとにある）。結果の重要性を評価する際に、P値は、片側不対T検定を使用して算出する。0.05以下の値は、統計的に有意であると考えられる。

こうして、必要なターゲットされたmRNAの減少したレベルが、本発明のニックの入ったdsRNAでの処理により、処理されたマウスの肝臓試料において観察され得る。研究の結果は、HPRT1標的配列に対して向けられたニックの入ったdsRNA薬剤が、50マイクログラムおよび200マイクログラムの濃度にて投与されたときに、インビボでの標的mRNAレベルの減少に有効であり、遺伝子転写物レベルを減少させることが予想されない対照と比較したときに、投与後24時間にて少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100%の標的遺伝子転写物発現レベルの減少が観察されることを示すことが予想される。

実施例4。修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを含むdsRNAのインビボアッセイ
本発明は、細胞を、その必要のある被験体における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを含むdsRNAと接触させることを含む、細胞における標的遺伝子の発現を減少させる組成物を提供する。本発明のこのようなdsRNAをマウスに全身投与して、その後、ターゲットされたmRNAのレベルを処理したマウスの肝臓試料において測定する。研究は、ターゲットされた転写物に対する修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを有する本発明のdsRNAのインビボでの有効性を評価する。

以下のマウス標的遺伝子に対して特異的な二重鎖RNA薬剤をマウス肝臓における有効性について試験した：ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT1；GenBankアクセッション番号NM_013556）；グリセルアルデヒド3‐ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH；GenBankアクセッション番号NM_008084）；ラミンA（LMNA；GenBankアクセッション番号NM_019390）；不均一（heterogeneous）核リボ核タンパク質A1（HNRPA 1；GenBankアクセッション番号NM_010447）およびATPase、Na+／K+輸送、β3ポリペプチド（ATP 1B3；GenBankアクセッション番号NM_007502；2つの異なる位置がATP 1B3 mRNA内でターゲットされる）。上の実施例3のように、前述の標的遺伝子は、当該技術分野において認識された「ハウスキーピング」遺伝子の中から選択される。上で記述したそれぞれの配列に基づいて、HPRT1、GAPDH、LMNA、HNRPA1およびATP 1B3をターゲットする二重鎖RNAを、本発明のdsRNAの構造にしたがって構築してもよい。
本発明の構造に従った修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを含み、かつHPRT1およびGAPDHをターゲットするDsiRNAsの具体的な配列は、たとえば、以下の通りである

レジェンド：大文字= RNA残基；X =キサントシン。

体重およそ25グラムのマウス（CD-1雌）を購入して、収容して、処理して、屠殺する。

初回用量範囲および時点選択研究を行って、ターゲットされた転写物に対する修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチドを含むdsRNAのインビボの有効性を確立し、一方で、2回の独立した、初めにターゲットされる活性配列（HPRT1）について、最適なdsRNAの用量および試料収集時間を確立してもよい。試験されるdsRNAの異なる用量（50および200μg）をリン酸緩衝食塩水に溶解し（PBS；用量あたり2.5mLの容積）、尾静脈を介して一回の流体力学的注射としてマウスに投与する。肝臓試料を以下の時点にて投薬したマウスから収集する：投与の後の24、48および72時間、並びに7日。少なくとも3匹の動物を各投薬量／時点にて確実に評価することができるようにするために、群あたり合計4匹の動物をdsRNAで処理する。

また、研究は、以下の条件を使用して行ってもよい。試験されるdsRNAの用量（200μg）をリン酸緩衝食塩水に溶解し（PBS；用量がたり2.5mLの容積）、尾静脈を介して一回の流体力学的注射としてマウスに投与する。肝臓試料を投与の後24時間にて投薬したマウスから収集する。群あたりの合計7匹の動物をそれぞれdsRNA薬剤で処理する。

標的mRNAレベルを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「qRT-PCR」）を使用して評価する。cDNAをオリゴ-dTおよびランダムヘキサマープライミングの混合物を使用して合成する。qPCR反応は、三つ一組みで実行する。絶対定量化は、クローン化された直砂上アンプリコン標的に対して実行した標準曲線に対して、補外法によって行う。データを、100%として対照を使用して規準化する。データは、標的mRNA-特異的なDsiRNA薬剤を投与されていないない全てのマウスについて測定された標的mRNA発現値に対して対照遺伝子発現レベルをセットして規準化し、これは、100%の対照値を得るように平均されている（たとえば、GAPDH DsiRNAsを注射したマウスについては、HPRT1LMNA、HNRPA1、ATP1 B3-1およびATP1B3-3マウスのセットを全て負の対照として使用して、規準化された基礎GAPDHレベルを得る。したがって、7匹の研究マウスおよび35匹の対照マウスが、それぞれの研究のアーム（arm）ごとにある）。結果の重要性を評価する際に、P値は、片側不対T検定を使用して算出する。0.05以下の値は、統計的に有意であると考えられる。

こうして、必要なターゲットされたmRNAの減少したレベルが、修飾されたヌクレオチドまたはユニバーサルヌクレオチド本発明のdsRNAでの処理により、処理されたマウスの肝臓試料において観察され得る。研究の結果は、HPRT1標的配列に対して向けられた本発明のdsRNAが、50マイクログラムおよび200マイクログラムの濃度にて投与されたときに、インビボでの標的mRNAレベルの減少に有効であり、遺伝子転写物レベルを減少させることが予想されない対照と比較したときに、投与後24時間にて少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100%の標的遺伝子転写物発現レベルの減少が観察されることを示すことが予想される。

明細書において言及した全ての特許および刊行物は、本発明が属する当業者の技術のレベルを指し示す。本開示において引用した全ての参照文献は、それぞれの参照文献が参照により個々にその全体が援用されたのと同様に参照により援用される。

当業者であれば、本発明が目的を実行し、言及される目標および利点、並びにその中に固有のものを得るのに十分に適することを容易に認識するだろう。好ましい態様の現在の代表として本明細書に記述された方法および組成物は、例示的であり、本発明の範囲についての限界として意図されない。その中の変化およびその他の用途が当業者に生じるだろうし、それは、本発明の精神内に包含され、請求項の範囲によって定義される。

様々な置換および改変を本発明の範囲内で、本明細書に開示された本発明に行うことができることが、当業者には容易に明らかだろう。したがって、このようなさらなる態様は、本発明および以下の特許請求項の範囲内である。本発明は、RNAi活性を媒介するために改善された活性をもつ核酸構築物を産生することに向けた本明細書に記述された化学的修飾の種々の組み合わせおよび／または置換を試験することを当業者に教示する。このような改善された活性は、改善された安定性、生物学的利用能の改善、および／またはRNAiを媒介する細胞反応の活性の改善を含み得る。したがって、本明細書に記述された具体的態様は、限定でなく、当業者であれば、本明細書に記述された改変の特異的な組み合わせが改良されたRNAi活性をもつDsiRNA分子を同定することに向けて過度の実験なしで試験することができることを容易に認識することができる。

本明細書に適切に実例として記述された本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素または要素類、限定または限定類なく実施することができる。したがって、たとえば、本明細書におけるそれぞれの例において、「含む」、「本質的にからなる」および「からなる」という用語のいずれも、その他の2つの用語のいずれと置き換えてもよい。使用された用語および表現は、記述の用語として使用され、限定ではなく、このような用語および表現の使用において、示され、および記載された特色、またはその一部の任意の均等物を除外することは意図されないが、、種々の改変が特許請求の発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい態様によって具体的に開示したが、本明細書に開示される概念の随意の特色、改変およびバリエーションが当業者によって使用されてもよいこと、およびこのような改変およびバリエーションは、明細書および添付の特許請求の範囲によって定義されるとおり、本発明の範囲内であるものと考えられることを理解すべきである。

加えて、本発明の特色または側面は、マーカッシュ群または変形例のその他の群に関して記述されており、当業者であれば、本発明が、またマーカッシュ群またはその他の群のメンバーの任意の個々メンバーまたはサブグループに関して、これにより記述されることを認識するであろう。

「ある」および「該」、並びに本明細書に記述される状況における（特に、以下の特許請求の範囲の状況における）同様の指示物は、他に本発明において記述されるか、または状況によって明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈される。「含む」、「有する」、「含む」および「含む」は、特に明記しない限り、制限のない用語として解釈される（すなわち、「含むが、限定されない」ことを意味する）ものと解釈される。本明細書におけるある値の範囲の説明は、特に明記しない限り、範囲内に入るそれぞれ値について個々に言及するのを簡略する方法として役に立つことを単に意図し、それぞれの別々の値は、それがあたかも本明細書に詳述されるかのように、本明細書内に組み込まれる。本明細書に記述された全ての方法は、本明細書において特に明記しない限り、または状況によって明らかに否定することができない限り、任意の適切な順位で行うことができるか。本明細書に提供されるすべての例または例示的な言語（たとえば、「などの」）の使用は、他に請求されない限り、単に本発明をよりよく解釈することのみを意図し、本発明の範囲に対して限定を与えるというわけではない。明細書における言語は、本発明の実施に必須なものとして任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきでない。

本発明を実施するための発明者が知っている最良の形態を含む本発明の態様が、本明細書に記述されている。これらの態様の変異は、前述の記述を読み込むと、即座に当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこのようバリエーションを適宜使用することを予想し、本発明者らは、本発明について、本明細書に具体的に記述されたもの以外のその他のものが実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法によって可能にされるように、本願明細書に添付の特許請求の範囲に詳述された主題の全ての改変および均等物を含む。その上、その全ての可能なバリエーションの上記の要素のいずれの組み合わせも、本明細書において特に明記しない限り、または状況によって明らかに否定されない限り、本発明によって包含される。

Claims

単離された二重鎖RNA（dsRNA）であって、
i）長さが19〜80ヌクレオチドのセンス鎖、および
ii）長さが19〜35ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、長さが15〜35塩基対の二重鎖を形成し；
前記センス鎖は、前記二重鎖に隣接するテトラループを含み、かつ前記テトラループは、2'-糖置換を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含み；
前記dsRNAは、前記センス鎖の5'末端と前記アンチセンス鎖の3'末端との間に不連続を含み；および
前記dsRNAは、哺乳動物細胞における標的遺伝子発現を減少させる、単離されたdsRNA。